JPH03210160A - 氷晶形成促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、食品等の生物材料の冷凍に際しての氷晶形成
、およびこのような氷晶形成の促進に有用な添加物に関
する。

食品等の生物材料を大きな氷の結晶の形成を最小限にし
て冷凍することは、大きな氷の結晶が一般的に解凍後の
材料のきめまたは状態に悪影響を与えるので重要である
。冷凍を氷の形成を促進する多数の核の存在下に行うと
、存在する水はすべて小さな結晶の型で凍結させること
ができる。しかしながら、食品に添加できる物質には厳
重な制限があり、氷晶形成添加物はこれまであまり用い
られていない。

最近、食品に、氷晶形成が可能な天然の蛋白質をもつＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓ　ｒｉｎ　ｉａｅの細胞を添
加することが提案されている。この生物は広く分布し、
ブドウ、イチゴ、馬鈴薯、トマト植物等の生育中の植物
の未成熟凍結において現実にその原因となっている。Ｐ
、ｓ　ｒｉｎ　ｉａｅの細胞は氷晶形成を促進できるこ
と、そして凍結時に食品中に存在すると小さい氷の結晶
の形成が起こることが見出されている。さらに、米国特
許第４２（１０２２８号には雪の製造にこ゛のような微
生物を使用する方法が記載されている。また、国際特許
出願ＷＯ３３１（１３８３１号には、過冷却を阻止する
ために用いられる微生物物質を製造するための、氷晶形
成蛋白質をコードするＤＮＡによるある種の宿主微生物
の形質転換が記載されている。

上述の方法には可能な宿主として酵母および他のかび類
も考慮されてはいるが、大腸菌およびムシ」力■山」−
のような天然の微生物のみがとくに記述されているにす
ぎない。すなわち、食品のような食用生物材料への添加
物として実際に使用できるような宿主微生物にはとくに
触れられていない。

Ｐ、ｓ　ｒｉｎ　１ａｅ−はシュードモナス属のメンバ
ーである。この属の一部の種は病原体であり、たとえば
−ＬＪｙＪｌｂ旦迂−はヒトの病原体である。Ｐ、ｓｙ
ｒｉｎｇｉａｅのある株はまた、ある種の植物に対する
病原体としても知偽れている。同様に、大腸菌のある株
はよく知られたヒト病原体である。したがって、これら
の食品添加物への使用は実用的ではない。殺滅した細胞
の形で使用するとしても、常に不完全な殺滅、生存した
微生物が食品の保存および解凍の段階での増殖の危険を
伴うものであり、このような微生物は、ＧＲＡＳ　（Ｇ
ｅｎｅｒａｌｌｙ　Ｒｅｇａｒｄｅｄａｓ　５ａｆｅ　
）に指定された生物の一覧表（Ｕ、Ｓ、Ｃｏｄｅｏｆ　
Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　、第２１巻、
１７０〜１９９頁、１９８６年４月、米国政府印刷局刊
行）には含まれていない。本発明は、Ｐ、ｓ　ｒｉｎ　
１ａｅ−および他の生物中で氷晶形成蛋白質を発現させ
る遺伝子を単離し、これを適当なベクター中で、食品ま
たは他の摂取生物材料に対する添加物として、生存また
は殺滅型のいずれでも食品に使用できるＧＲＡＳに掲載
された生物の形質転換に使用するという考え方に基づ（
ものである。

本発明の一態様によれば、本発明は、氷晶形成を促進で
きる蛋白質からなる０℃以下の温度における食用生物材
料中の氷晶形成添加物であって、上記蛋白質はその発現
をコードする１種または２種以上の遺伝子をもつベクタ
ーによって形質転換されたＧＲＡＳ微生物またはその微
生物の分画に含まれている添加物を提供するものである
。

本発明はさらに他の態様によれば、本発明の添加物１種
または２種以上を添加された食用生物材料を提供する。

本発明によって有利に処理できる食品には、野菜、果物
、魚、肉、調理冷凍食品、アイスクリーム、冷凍パン生
地、冷凍ジュース、凍結乾燥食品が包含される。興味あ
る凍結乾燥物質には、医薬製品および低温型沈殿物のよ
うな血液分画が包含される。

本発明はさらに他の態様として、食用生物材料を本発明
の添加物１種または２種以上で処理して、その材料中に
おける氷晶形成を促進する方法を提供する。

本発明のさらに他の態様として、食用生物材料を本発明
の添加物１種または２種以上で処理し、その温度を凍結
が起こるように低下させる食用生物材料の冷凍方法を提
供する。この場合の温度は５℃〜−２０℃の範囲とする
ことが有利である。

本明細書で用いられるＧＲＡＳＯ語は、上述のＵ、Ｓ。

Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎに示された意味
を有する。このような微生物には、酵母たとえば影匹旦
０工庄吐μリーｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは９杜帥肛■
旦鎚、乳酸菌類、たとえばＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１
ａｃｔｉｓ　、　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ匝ｎ鉦に
川　等、ビネガ細菌およびある種の糸状菌たとえばＡｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　　種が包含される。

微生物は全細胞としてまたはその分画として使用するこ
とができる。氷晶形成蛋白質が細胞内に保持されている
場合でも、全細胞は有効であることが示されている。し
かしながら、ある場合には、細胞を断片化して活性蛍白
質をもつ分画たとえば細胞壁フラグメントのみを使用す
ることが有利である。

微生物は目的に適したベクターによって形質転換される
。−船釣に、原核生物宿主たとえば細菌を形質転換する
場合にはプラスミドが用いられる。

酵母はプラスミドで形質転換できるが、この場合にはプ
ラスミドを、活性遺伝子が染色体ＤＮＡ内に挿入される
ように設計する。

氷晶形成蛋白質をコードするＤＮＡは天然に存在する生
物たとえばＰ、ｓ　ｒｉｎ　ｉａｅ　、　Ｐ、ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｓ＋Ｐ、ｃｏｒｏｎａｆａｓｃｉｅｎｓ　
、　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ
または　ｗ’ｎ’ａ　　ｒ　ｉｃｏ　ａから得ることが
できる。

別法としてＤＮＡは、すでに配列が決定されている遺伝
子、たとえばＩ　Ｎ　ＡＷ　（Ｒ，Ｌ、Ｇｒｅｅｎ　＆
　Ｇ。

Ｊ、Ｗａｒｒｅｎ　、　Ｎａｔｕｒｅ　、　Ｖｏｌ、　
３１７　＋６４５〜６４８゜１９８５）およびＩ　ＮＡ
　Ｚ　（Ｇ、Ｊ、Ｗａｒｒｅｎ　ら、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、、　Ｖｏｌ、　　１４．　Ｎｏ、２０．
　８０４７〜８０６０．１９８６）または本明細書に記
載する遺伝子配列に基づいて合成することもできる。

単離された遺伝子には、意図された宿主に適当なベクタ
ー中に挿入できるように、適当な末端制限部位を付与す
ることができる。

すなわち、意図された宿主が酵母たとえばＹＰ４２であ
る場合には、適当なプラスミドヘクターはｐＤＰ３４　
（欧州特許８９８１０２９７．５）であり、たとえば、
大腸菌ベクターｐＵｃ１９、完全酵母２ミクロンプラス
ミドおよび酵母を選択可能にする栄養要求マーカーたと
えば容易な形質転換と酵母中でのプラスミドの低コピー
数選択のためのＵＲＡ３遺伝子、および高コピー数を誘
発するためのＬＥＵ２遺伝子のｄＬＥＵ２対立遺伝子か
ら構成されるプラスミドに有利に改良される。

酵母は常に、翻訳の開始には見出された最初のＡＴＧを
使用するので、開始コドンは最初のＡＴＧであることを
確認し、「実際の、ＡＴＧの５“にＡＴＧがあれば必要
に応じてそれを切り出さねばならないことに注意すべき
である。

プラスミドはついで適当な酵母株の形質転換に使用され
、栄養要求マーカーの存在によって選択される。

本発明者らは、上述のようにして形質転換された酵母株
が必ずしも受は入れられる形で氷晶形成蛋白質を産生し
ないこと、そしてその蛋白質が細胞表面を標的とするよ
うな酵母シグナル配列を包含させることが望ましいこと
を見出した。このような配列にはたとえば、ＰＨ０５シ
グナル配列（Ｂ、Ｗａｊｅｅｈ　ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　Ｖｏｌ、　　１２゜Ｎｏ、２０．７
７２１〜７７３９．１９８４）またはα因子プレプロリ
ーダー配列（Ｊ、Ｋｕｒｊａｎ　＆　Ｉ。

Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　、　Ｃｅ１ｌ　、　　３０　：
　９３３〜９４３゜１９８２）がある。本発明者らはさ
らに、α因子リーダー配列を使用する場合、プレプロペ
プチド配列と問題の遺伝子の間にリンカ−配列たとえば
天然のα因子における８アミノ酸リンカ−を置くことが
好ましいことを見出した。

氷晶形成蛋白質を細胞内の特定のオルガネラ、たとえば
液胞にむけることもできる。この目的では、液胞への指
向性が知られているカルボキシペプチダーゼＹ　（ＣＰ
Ｙ）のプレプロ配列を導入することができる。

Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃＬｉｓはとくに安全で
、食品用に受は入れられる微生物であり、たとえばＬ　
ＭＯ２３０株がある。この生物の形質転換に使用するの
に適したプラスミドには、大腸菌ベクターｐＵｃ１Ｂ、
プラスミドｐＶＡ８Ｂ（以下の参考文献１）参照）から
の非誘導性エリスロマイシン抵抗性遺伝子、およびり、
　１ａｃｔｉ４プラスミド複製起源から構成されるｐｓ
ｃ１２ＶＮがある。しかしながら、これは問題の遺伝子
に加えてプロモーターの挿入を必要とし、本発明らは改
良ｔａｃ　Ｉｆプロモーターがとくに有用であることを
見出した。Ｌ、　１ａｃｔｉｓ内での発現にもっと直接
的なアプローチは、Ｌ、１ａｃｔｉｓ遺伝子のプロモー
ターたとえば２２６８株のホスホノ−β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のプロモーターの使用である（参考文献２） １　）　Ｂ、Ｂｒ１ｇ１ｔｔｅｅ　ら、Ｇｅｎｅ　、６
２　：　２４９〜２６１．１９８８ ２　）　Ｆ、Ｌ、Ｍａｃｒｉｎａ　ら、Ｇｅｎｅ、１９
．３４５〜３５３．１９８２ 以下の微生物は１９８９年１０月２４日に、Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ
　ａｎｄ　ＭａｒｉｎｅＯｒｇａｎｉｓＩｍｓ　、　Ａ
ｂｅｒｄｅｅｎ　、　５ｃｏｔｌａｎｄに下記の受入番
号で寄託されている。

Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　　Ｙ　Ｐ　４２　　　ＮＣ
ＩＭＢ　４０２１５Ｌ、　１ａｃｔｉｓ　　　　Ｌ　Ｍ
Ｏ２３０ＮＣｌｌ１Ｂ　４０２１６Ｅ、ｃｏｌｉ　　　
　　Ｂ　Ｚ　２３４　　ＮＣＩＭＢ　４０２１７（ｐＵ
ｃ２１ＥＮＡ３） 上記Ｅ、ｃｏｌｉ　ＮＣＩＭＢ　４０２１７は以下に述
べるプラスミドｐＵｃ２１ＥＮＡ３で形質転換された。

以下の実施例は本発明を例示するだけのためのものであ
る。

葉と花約１５ｇのサンプルをＮｅ５ｔｌｅ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈＣｅｎｔｅｒ　、　Ｖｅｒｓ−ｃｈｅｚ−１ｅｓ
−Ｂｌａｎｃに隣接した森の植物から採取し、滅菌した
５（１０ｍｆの振盪フラスコに入れた。滅菌ペプトン（
０，１％）、リン酸塩（５０ｍＭ、　ｐＨ７）緩衝液１
（１０ＩＩ１１．を加え、フラスコを３０℃，３（１０
ｒｐｎ＋で１時間振盪した。

液体を取り出し、細胞層と細菌を１０．（１０Ｏｒｐｍ
で５分間遠心分離してペレットとした。上澄液を捨て、
ペレットを１０ｓ＋ｊ！のペプトン／リン酸塩緩衝液に
再懸濁した。この０．０４ｍｊ！のサンプル５個を、４
０μｇ／ｌａｎのシクロヘキシイミドおよび０．１％の
セトリミドを補充したＫｉｎｇｓ寒天プレート上に置き
、室温で４８時間インキュベートした。このプレートは
重要でほぼＰｓｅｕｄｏａ＋ｏｎａｓ特異的である（シ
クロヘキシイミドがかびまたはその発芽胞子を破壊し、
セトリミドは細菌界面活性剤で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓを除く大部分の細菌を殺滅する）。

プレートには２種の基本的タイプのコロニーを含有した
。第一のものは小さく、個々のコロニのパックグランド
を形成したが、この上に第二の大きなコロニーが重なっ
ていた（したがって、大きなコロニーに小さなコロニー
が夾雑していないということはできない）。

２個のプレートについて、プレートの細胞を５１１１１
のペプトン／リン酸塩緩衝液で洗浄し、それらについて
小滴凍結検定で試験を行い、氷晶形成活性（Ｉ　ＮＡ）
の−船釣存在を調べた。これにはパラフィンでコートし
たアルミニウムのボートが必要である（キシレン中パラ
フィン！Ｊｉ　（固体）　（７）１％溶液をアルミニウ
ムの表面に流し、キシレンを蒸発させて調製）。プレー
ト洗浄液１０μｌの小滴を、対照とともに一９℃でアル
ミニウムボート上に置き、凍結を評価した。いずれのプ
レート洗浄液もこれらの条件下には３０秒以内で再現性
よく凍結したのに対し、対照はすべてではないにしても
時々しか凍結しなかった。この試験をもっと厳格な一５
℃の条件で実施したところ、この場合もプレート洗浄液
は急速に再現性よく凍結したが、この温度では対照は全
く凍結しなかった。これにより、この単離体にはＩＮＡ
細菌の存在することが確認された。

残りのプレートから、３（１０の各コロニーを滅菌つま
楊子でマイクロタイタープレートに採取し、室温で３日
間増殖させた。ｌＯμｌの小滴をついでマルチチャネル
ピペットでパラフィンコートアルミニウムボートに移し
、−５℃に置いた。これから１０のＩＮＡ細菌が同定さ
れ、１個は弱い活性を示した。これらの中の２個、ｌＮ
Ａ３とｌＮＡ７について、細胞を単一コロニーにプレー
トアウトすることにより明らかなように純粋培養に精製
し、５０のクローンを無作為にとって、−５℃での氷晶
形成活性を調べた。

！　　ゝ １０μ！容量の小滴５０個をパラフィンコートアルミニ
ウムボート上に並べ、これを予め選択された温度のアル
コール浴の表面上に置いた。ボート上の１分後の凍結小
滴数を記録した。これをこの温度での小滴凍結百分率と
して表した。水（Ａ）Ｍ１７メジウム（Ｂ）、Ｍ１７１
７メジウムラスミドＰＳＣ１２ｖＮをもつＬＭＯ２３０
（Ｃ）およびＭ１７メジウム＋プラスミドｐＤＰ１３５
をもつＬＭＯ２３０（Ｄ）で得られた結果の比較を第１
図に例示する。図中、小滴凍結百分率を縦軸に、横軸の
温度に対してプロットする。

？　　　　　・／Ｘ・パ これは、氷晶形成物質の定量のためのＧ、Ｖａｌｉの計
算法（Ｊ、Ａｔｍｏｓ、　Ｓｃｉ、　　２８．　４０２
〜４０９゜１９７１）に基づいている。標準検定では、
培養液１　ｍｌを取り、２分間遠心分離して細胞をペレ
ット化する。培養メジウムを捨て、細胞をＴＥ（１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，０
）　１　ｒａｎに再懸濁した。この懸濁液からＴＥ中１
０−’までの希釈系列を調製する。各希釈液から１０滴
をピペットでパラフィンコートアルミニウムボート上に
取り、ついでボートを予め選択された０℃以下の温度で
アルコール水浴上に置いた。３分後に凍結小滴数とその
希釈系列における位置を記録する。

その温度における氷核数はＶａｌｉの式（式中、Ｎ（ｔ
）は与えられた温度における氷核数；ｆは凍結小滴の分
画；Ｄは系列における希釈数；■は小滴の容量ＩＩｌで
ある）によって計算できる。

次にこれを細胞濃度に対して正規化し、最終的にこの数
の対数として表す。これは氷晶形成物質についての定量
的計算であり、希釈系列における順序凍結、すなわち温
度の低下に従って、最初に非希釈小滴が凍結し、ついで
１０−１希釈系列が、以下同様に凍結することに基づい
ている。これは、はぼ無作為過程である純水の凍結の定
量化には容易に使用できない。したがってこれらの非氷
晶形成溶液には定性的検定が使用される。

ＤＮＡの 、　Ｋｉｎｇｓ培地１（１０ｍｆにｌＮＡ３およびｌＮ
Ａ７を接種し、３０℃で一夜生育させた。細胞を１０．
（１０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄液を捨てた。

細胞を５　ｍｌの、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　　５０ｍ
ＭＥＤＴＡ　　ｐＨ８，ｏ、　０．５　ｍｌの２５０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ中リゾチーム１０■／ｍｌの新鮮溶液ｐ
）１８．０中に再懸濁し、氷上で４５分間インキュベー
トした。これに１　　ｍｌの５ＴＥＰ　（０，５％ＳＤ
Ｓ、　　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　。

ｐＨ７，５、０，４Ｍ　ＥＤＴＡおよび１■／ｍｌプロ
テナーゼＫ）を加え、６０℃で３時間インキュベートし
た。これを７　ｎｕの１：１フ工ノール／クロロホルム
混合物で２回抽出し、遠心分離して相を分離した。エタ
ノール１５ｍｆｆ１を加えてＤＮＡを沈殿させ、液体を
注意深く傾瀉した。ＤＮＡを５　ｍｌの、１０　ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１ｍ
ｇ／　ｍｌ　ＲＮａｓｅに溶解し、６０℃で２〜３時間
時間インキュトート（これは可溶化とＲＮａｓｅ処理を
同時に行っている）。ＤＮＡを再び１０ｍｆのエタノー
ルてま沈殿させ、ＤＮＡを巻き取った（大部分のＤＮＡ
は試験管の側部につま楊子をこすりつけてその周囲に巻
きつけて除去できた）。このＤＮＡを５　ｎ／２のｌ　
ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５、０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ
に溶解して、約１ｍｇ／＋＋／２の溶液を得た。

Ｉ　ＮＡ”　　　　のクローニング ０１ｉｇｏ　１７は８個のアミノ酸の単位の反復配列に
基づく混合オリゴヌクレオチドであり、ＩＮＡＺおよび
ＩＮＡＷ　（Ｐ、ｓ　ｒｉｎ　ｉａｅについてはＲ，Ｌ
、Ｇｒｅｅｎ　＆Ｇ、Ｊ、Ｗａｒｒｅｎ　、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　＋　Ｖｏｌ。３１７，６４５〜６４８　、　　ｌ
　９８５　、　Ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓについては
Ｇ。

Ｊ、Ｗａｒｒｅｎら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、、　Ｖｏｌ、　１４　、　Ｎｏ。

２０．８０４７〜８０６０．１９８６）の両者で保存さ
れていて、各場合はぼ３０回反復していた（以下参照）
。

ＡＧＹＧＳＴＱＴ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇ
ｉｎ　ＴｈｒＴ　　Ｔ　　Ｔ　　Ｔ　　Ｔ　　Ｔ　　Ａ
　　　　　２３ｍｅ’ｒ。

５”ＧＣＣＧＧＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧ　Ａ
Ｃ３゜ＧＧ　　　　Ｇ　　　　Ｇ　　　　　　１０２４
ｍ１ｘＡ　　　　　Ａ　　　　　　　　　　７Ａ　　　
　　　　　　　　Ａ分析的制限消化はｌＮＡ３およびｌ
ＮＡ７の両ＤＮＡについて実施し、フラグメントをアガ
ロースゲル電気泳動で分離した。ついでこれをＺｅｔａ
ｐｒｏｂｅナイロン膜上に移し、放射性キナーゼ処理し
たＯｌｉｇｏ　　１７とハイブリダイズさせた（　Ｔｏ
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、　　八　Ｌａｂｏｒａ　ｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ
　、　ＮＹ＋　　１９８２　）。

洗浄後、濾紙を一７０℃で増悪スクリーンを用い６時間
オートラジオグラフィーに付した。オートラジオグラフ
はわずかなバックグランド、非特異的ハイブリダイゼー
ションを示したが、また良好なシグナルも認められた。

最初は、ｌＮＡ３もｌＮＡ７も同じである。フラグメン
トのサイズは次の通りである（カッコ内はＩＮＡＺ）；
５ａｃ１７ｋｂ　（？）　、　Ｓａｃ　＋Ｂｇｌ　ＩＩ
　６ｋｂ　（３，４ｋｂ）　、　Ｂｇｌ　　ｌ１１６〜
１９ｋｂ（きわめて大！　）　、　Ｂｇｌ　ＩＩ　＋Ｅ
ｃｏＲＩ５ｋｂ　（５ｋｂ）　、　ＥｃｏＲＩ　９ｋｂ
　（２３ｋｂ）　、　ＥｃｏＲＩ　＋ＰｖｕＩ７ｋｂ　
（３，７５ｋｂ）　、　Ｐｖｕ１８ｋｂ　（５ｋｂ）　
、　ＥｃｏＲＩ　９ｋｂ　（２３ｋｂ）　、　ＥｃｏＲ
Ｉ　＋Ｐｖｕｌ　７ｋｂ　（３，７５ｋｂ）Ｐｖｕ１８
ｋｂ（？）および５ａｉｌ　１　ｋｂ　（１ｋｂ）　、
したがって、ＥｃｏＲＩ　＋Ｂｇｌ　　Ｕおよび５ａｌ
Ｉは同一であるが、大部分の他の制限消化体は異なって
いる。

５　ｋｂＢｇｌ　Ｕ　＋ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＵ
Ｃベクターにクローン化し、Ｏｌｉｇｏ　１７でスクリ
ーニングすることに決定した。ｌＮＡ３ＤＮＡ６０μｇ
を制限酵素Ｂｇｌ　ｎおよびＥｃｏＲＩで消化し、フラ
グメントを０．７％アガロースゲル上で分離した。フラ
グメントサイズ４．４〜５．５ｋｂを含有するゲルの領
域をゲルから切り取り、電気溶出した。この混合物をＪ
）ＵＣ２１プラスミド［ｐＵＣ１９（Ｃ。

Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ　、３３　
：　ｌ　Ｏ３〜１１９゜１９８５）を基本にしたプラス
ミド、ＢａｍＨＩ−Ｓａｃｌ消化ｐＵｃ１９に合成オリ
ゴヌクレオチドで創製した別のクローニングアレーがク
ローン化されている）に次のようにクローン化した（Ｌ
ａｃＺ遺伝子の成熟アミノ酸配列が上のラインに、ＤＮ
Ａ配列およびその相補体が中央の２つのラインに、制限
酵素認識部位が下のラインに示されている。合成オリゴ
ヌクレオチｐは大文字で示す）。

茫Ｉ：ヨ勺り乙桝： ０．４　ｐｍｏｌｅ　　（１ｕ　１　）　Ｂｇｌ　Ｉ［
−ＥｃｏＲＩ消化ｐＵｃ２　１゜ １、５　ｐｍｏｌｅ　　（３ｕ　Ｅ　）精製Ｂｇｌ　　
ＩＩ　−ＥｃｏＲＩ　ｒＮＡ５フラグメント １３μｆ　　ＴＥ緩衝液 微遠沈管中でよく混合し、ついで５６℃に２時間加熱 ２μｌの１０ｘＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５；５０ｍＭ　？ＩｇＣ１；５０
ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）；　１０ｍＭアデノ
シン−５゛−三リン酸（ＡＴＰ）；２（１０μｇ／ｍｌ
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））添加１μｚ＝ｉ単位の
７’４ＤＮＡリガーゼ添加よく混合し、４℃で３〜４時
間インキュベートＥ、ｃｏｌｔコンビー−ン １（１０ｍｊ！のＸＴ培地（８ｍｇ／　ｍ　Ｉ　Ｂａｃ
ｔｏ　）リプトン；５■／　ｍｌ　Ｂａｃｔｏ酵母エキ
ス；５■／ｍｆｆ１Ｎａｃｆｆｉ）にＢＺ２３４細胞の
新鮮な一夜培養液１　ｍｌ２を接種 培養液を３７℃でＯＤ、。。＝０．４に達するまマイン
キュヘート １０．（１０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して細胞をペレ
。

ト化 上澄液を捨て、ペレットを等容の滅菌５０ｍ〜ＣａＣｆ
に４℃で再懸濁 氷上で２０分間インキュベート １０．（１０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離して細胞をペレ
・）ト化 上澄液を捨て、元の容量の１／１０の５０ｍＭＣａ（Ｊ
、２０％グリセロールに再懸濁これらのＥ、ｃｏｌｉ細
胞はコンピーテントであり、直ちに使用するか、将来の
使用のため一７０℃ｋ凍結する。

彰１転盪 コンピーテント細胞のサンプル１（１０μｌを１め冷却
した滅菌ガラス管に取る。

上述のリゲーション反応液をこれに加え、よく混合する 氷上で２０分間インキュベート ２分間４２℃に加熱 これらの細胞は選択プレート上で直接平板培養するか（
アンピシリン選択の場合）、またはＹＴ培地５（１０μ
２を加え、３７℃で２時間インキュベートする（カナマ
イシンおよびエリスロマイシン選択の場合） これらの選択形質転換プレートから、８個のマイクロタ
イタープレートのコロニー（７６８）を採取した。これ
らを、アンピシリン補充ＹＴアガールプレート上に置い
たＺｅｔａρｒｏｂｅナイロン濾紙に複製し、３７℃で
一夜生育させた。コロニーは濾紙上で直接溶解させ、放
射性キナーゼ処理０１１ｇ。

１７とハイブリダイズさせた。洗浄後、濾紙を室温で４
５分間オートラジオグラフィーに付すと、１０個のハイ
ブリダイズしたコロニーが同定された。

Ｅ　Ｎ　Ａ　＝Ｅ、ｃｏｌｉ氷晶形成活性プレート　　
　　位　置　　　　ＥＮＡＩ　　　　　　Ｆｌ　　　　
　　　１ １　　　　　Ｆ２　　　　　２ ３　　　　　Ｆ９　　　　　３ ５　　　　　Ｄ５　　　　　４ ５　　　　　Ｆ６　　　　　５ ６　　　　　Ａ３　　　　　６ ６　　　　　Ｃ８７ ７Ｃ６８ ７ＥＩＯ９ ８Ｂｌ　　　　　　１０ これらのコロニーはすべて一５℃で、通常は２０〜３０
秒間内で凍結することを示したが、対照は１０分後にも
凍結しなかった。すべての１０ツクローンから小規模な
りＮＡプレバレージョンを作成し、このＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩおよびＢｇｌ　　ＩＩで消化した（遺伝子のクロー
ニングに使用した酵素で、独特の４．５ｋｂ挿入体と２
．７ｋｂプラスミドベクターを放出するはずである）。

ＥＮＡ４および１０は２本のインサートバンドの存在を
示したので別にした。分析的消化により、ｌＮＡｌと６
はプラスミドの混合物を含有することがわかった。これ
らのデータから、ＥＮＡ３をさらに分析するために選ん
だ。プラスミドｐＵＣ２１／ＥＮＡ３を第２Ａ図に模式
的に示す。第２図はＥＮＡ３遺伝子の制限酵素地図であ
る。

プラスミドＥＮＡ３の広範な制限酵素地図を出発点とし
て構築した。これは、ＥＮＡ３挿人体とＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇｉａｅからの報告されるＩＮＡ
Ｚ遺伝子の間には、かなりの、ただし完全ではない相同
性が認められた。制限酵素地図を用いてＥＮＡ３挿入体
の広範なサブクローニングを行い、ついでこれらのサブ
クローンのＤＮＡ配列分析を行った。

完全なりｇｌ　Ｉ［）ＥｃｏＲＩフラグメントの配列決
定を行ったところ、４４４６ｂｐを含有し、報告された
ＩＮＡＺ遺伝子より１２塩基対短いことがわかった。２
個のマイナーな挿入／１ヌクレオチドの欠失があるが、
いずれも蛋白質コード配列の外側である。ＥＮＡ３遺伝
子中のｂｐ５９４にＧの挿入とｂｐ４３９６のヌクレオ
チドの欠失がある。さらに重要な欠失がｂｐＨ６８〜１
１７９の付近に起こり、１２塩基対が欠失しているが、
蛋白質の読み取り枠は保存されている（４個のアミノ酸
の欠失）。これは“ＡＡＣＧＣＣ”の４回反復配列単位
に起こっている。これらの反復が多分、欠失の原因であ
ろう。

２種のＰ、ｓ　ｒｉｎ　１ａｅ−配列は、ＤＮＡのレベ
ルで全体として約９３％のホモロジーを示しくＵＷＧＣ
ＧのＢｅ５ｔｆｉｔプログラムによって測定）、大部分
は通常のＴ−＋ＣおよびＧ→Ａの変化である。蛋白質レ
ベルでのホモロジーは約９８％に上がる。

変化は４個のアミノ酸欠失と３７個のアミノ酸置換で、
その１３個のみが保存性である。

ＥＮＡ３氷晶形成遺伝子の発現の重要な第一工程は、実
際の“ＡＴＧ”　のすぐ５°側（１４ｂｐおよび８ｂｐ
）にある２個の°ＡＴＣ’の除去である。

これは酵母が、ｍＲＮＡ開始後に見出した最初の“ＡＴ
Ｇ’を常に取り上げ、この場合は長さが４個のアミノ酸
のペプチドを生じ、氷晶形成蛋白質はほとんど産生され
ないことから必要である。第二の考慮点は、酵母のプロ
モーターおよび／またはシグナル配列の付加に有用な制
限部位を設けることである。

ＥＮＡ３−ｔｅｒｍの プラスミドＥＮＡ３を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、５
′の突出をレフノウ酵素で満たした。これをついでＢｇ
Ｉ　ｎとＰｖｕ　　Ｉで消化し、次にＤＮＡフラグメン
トをアガロースゲル上で分割した。４．５ｋｂフラグメ
ントを切り出し、電気溶出した。プラスミドＰ　ＵＣ２
１／　ＬＹＳ　２−ｔｅｒｍ２　　（Ｒ，Ｄ、Ｐｒｉｄ
ｍｏｒｅ。

未発表結果）は酵母ＬＹＳ２二方向性ターミネータ−を
含むＥ、ｃｏｌｉバクターｐＵｃ２１である（　Ｕ、Ｎ
、Ｆｌｅｉｇら、Ｇｅｎｅ４６　：　２３７〜２４５゜
１９８６）。このプラスミドをＮｈｅ　　Ｉで消化し、
５゛の突出をフレノウで修復した（Ｍａｎｉａｔｉｓら
）。

これを次にＰｓｔｌで消化し、フラグメントを２％アガ
ロースゲル上で分離した。１９０ｂｐフラグメントを切
り出し、電気溶出した。これらの２つのフラグメントを
ＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化したｐＫｌ９（Ｒ，Ｄ、Ｐ
ｒｉｄｍｏｒｅ　、　Ｇｅｎｅ５６．　３０９〜３１２
゜１９８７）ベクターと混合し、リゲーションを行った
。形質転換体はまず、氷晶形成活性の試験に付した。こ
れらのひとつについて制限酵素分析によってさらに特性
を調ベプラスミド１）Ｋ１９／ＥＮ＾３−　ｔｅｒｍを
確認した。このプラスミドを第３Ａ図に模式的に示す。

第３Ｂ図にはＥＮＡ３−ｔｅｒｍの制限酵素地図を示す
。地図中ＬＹＳ２Ｔは酵母ＬＹＳ２二方向性ターミネー
タ−を表す。

このプラスミドをついで制限酵素ＡａｔＵと５ａｃＩで
消化し、５ｋｂフラグメントをゲル精製し、脱リン酸化
した（　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら）。このフラグメントは
将来のプロモーター−ＥＮＡ３　５’の構築に備えて製
造した。

ＤＰ１０５の ｐＤＰ１０５の構築には、ＥＮＡ３遺伝子の“ＡＴＧ”
から約＋８ｂｐのＴａｑ制限部位に始まり約＋１８５ｂ
ｐのＳｐｈ　Ｉ制限部位までのフラグメントの単離を行
う。“ＡＴＧ’　とＥＮＡ３遺伝子のＴａｑ　Ｉ制限部
位までのＤＮＡ配列は合成オリゴヌクレオチドで置換さ
れ、これはまた、新たな制限酵素部位ＥｃｏＲＩと’Ａ
ＴＧ’のＮｄｅ　Ｉ　５　’を付加する。

プラスミドＥＣＩは、プロモーターと　ＡＴＧ’をカバ
ーする７　５０ｂｐ　Ｓｐｈ　Ｉフラグメントを含有す
るＥＮＡ３サブクローンである。ＥＣＩは制限酵素ｓｐ
ｈ　ＩおよびＴａｑ　Ｉで消化し、フラグメントを２％
アガロースゲル上で分離し、１８０ｂｐフラグメントを
切り出し、電気溶出した。このフラグメントを合成オリ
ゴヌクレオチド１２４および１２５と混合し、ｓｐｈ　
ＩとＥｃｏＲＩで消化したｐＵｃ１９クローニングベク
ターにリゲートした。正しい挿入体をもつプラスミドを
制限酵素分析によって同定し、最終的にはＤＮＡ配列決
定分析で確認した。これはＥｃｏＲＩとＮｄｅ　Ｉ制限
部位５゛と重複した“ＡＴＧ’をもつ。

ＥＮＡ３遺伝子の’ＡＴＧ“の周辺のＤＮＡ配列にはＴ
ａｑ　Ｉ制限部位が認められ、Ｔａｑ　１ ７５ｂＰ ５”ＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴＧＡＡＴＡＴＣＧＡＣＡＡＡ
３°　−３ｔ　ＴＡＣＧＡＣＡＴＴＩ匡ＴＴＡＴＡＧＣ
ＴＧＴＴＴｓ、−−−−−−−−−Ｓｐｈ　！リンカー
として用いられたオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は次
の通りである。

＜Ｎｄｅｌ＞　　Ｔａｑｌ ＜ＥｃｏＲＩ　＞ ”　ＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴ”３・ＧＴＡＴＡ
ＣＴＴＡＴＡＧＣｓ・ ＧＡＰＤＨプロモー　の ２種のＧＡＰＤＨプロモータ構築体を調製し試験した。

完全ＧＡＰＤＨ遺伝子（Ｊ、Ｐ、Ｈｏ１ｌａｎｄ　＆Ｍ
、Ｊ、）（ｏｌｌａｎｄ　＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｗ、　Ｖｏｌ、　２５８　、　Ｎα１９．９８３９〜９
８４５．１９７９）を含む２ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍフラグ
メントはＣ１ｂａ　Ｇｅ１ｇ３１から供給された。この
遺伝子をＨｉｎｄ　ｍで切り出し、Ｅ、ｃｏｌｉベクタ
ーｐＫ１９に移した。このプラスミドをＳｍａＩ（ｐＫ
１９リンカ−アレー内で切断）およびＳｎａ　Ｂｌ　　
（ｂｐ４２４　）または５ｓｐｌ　（ｂｐ６４６）で消
化してプロモーターを短縮する２個の欠失を構築すると
、すべての酵素が適合性のプラント末端を与え、すべて
自己リゲートした。これは、ｐＫｌ　９／ＧＡＰＤＨ−
ｄＳｎａおよびｐＫ１９／ＧＡＰＤＨ−ｄＳｓｐ用の長
さがそれぞれ６（１０ｂｐおよび４（１０ｂｐのＧＡＰ
ＤＨプロモーターを与えた。

ｄＳｎａおよびｄＳｓｐプロモーターは以下のようにし
て単離した。プラスミドを制限酵素Ａｓｕ■で消化し、
５“の突出をフレノウ酵素で満たした。これをついでＳ
ａｃ　Ｉで消化し、生成物を１％アガロースゲル上で分
離した。正しいサイズのＤＮＡバンドを切り出し、ゲル
フラグメントからＤＮＡを電気溶出した。

ｐＤＰ１５プラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、
５゛突出をフレノウ酵素で満たした。これをついでｓｐ
ｈ　Ｉで消化し、フラグメントを２％アガロースゲル上
で分離した。正しい２（１０ｂｐフラグメントをゲルか
ら切り出し、電気溶出した。

ｐＤＰ１０５ＥＮＡ３　５°ＤＮＡフラグメントを２個
のプロモーターにリゲートすると同時に、Ｓａｃ　Ｉと
ｓｐｈ　Ｉで消化したＥ、ｃｏｌｉヘクターｐＵＣ１９
中に連結した。これにより、プラスミドｐＤＰ１０６　
（ｄｓｓｐ）およびｐＤＰ　１０７　（ｄＳｎａ）が得
られた。

プラスミドｐＤＰ１０６およびｐＤＰ１０７を制限酵素
Ｓｐｈ　ＩおよびＳａｃ　Ｉで消化し、フラグメントを
アガロースゲル上で分離した。５５０ｂｐおよび７５０
ｂｐのフラグメントをそれぞれ、ゲルから切り出し、電
気溶出した。プラスミドＥＮＡ３を制限酵素ＡａｔＵお
よびｓｐｈ　Ｉで消化し、フラグメントをアガロースゲ
ル上で分離した。１．３　ｋｂフラグメントをゲルから
切り出し、電気溶出した。

このＥＮＡ３　５’　１．３ｋｂ　ＡａｔＩＩ　−５ｐ
ｈｌフラグメントを、別個にｐＤＰ１０６およびｐＤＰ
１０７単離フラグメントおよび先に調製したｐ　ｋ　１
９／ＥＮＡ３−ｔｅｒｍ　ＡａｔＩＩ　−５ａｃＩ　５
ｋｂフラグメントと混合してリゲートした。これからプ
ラスミドｐＤＰ１０８およびｐ　Ｄ　Ｐ　１０９　カッ
ｈ　ソｈｆｒｆｉ　Ｌ’２された。

ＧＡＰＤＨＣＡＴプロモー プロモーターの第二の系、酵母ＧＡＰＤＨプロモーター
とＥＮＡ３遺伝子の間にＥ、ｃｏｌｉプロモーターをも
つ系も構築した。これは、構築体の活性のスクリーニン
グを容易にするため、酵母内にトランスホームする前に
実施した。選択されたＥ、ｃｏｌｉプロモーターは、Ｔ
ｎ９のクロラムフェニコール抵抗性遺伝子のプロモータ
ーであった（Ｎ。

Ｋ、Ａｌｔｏｎ　＆　Ｄ、Ｖａｐｎｅｋ　、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２８２．　８６４〜８６９．１９７９）。構築体
に望ましくないＥ、ｃｏｌｉ配列が導入されるのを回避
するため、プロモーターを合成し、ＧＡＰＤＨプロモー
ターとＥＮＡ３遺伝子の間のリンカ−として次のように
使用した。

へ 大文字はそれらが合成されたことを、上列は０１ｉｇｏ
　１４１、下列はＯｌｉｇｏ　１４２を示す。オリゴヌ
クレオチドは常法によって精製し、ついで乾燥し、１　
ｍｌあたり３（１０　ｐｍｏｌｅの濃度で再溶解した。

各オリゴヌクレオチド３（１０　ｐｍｏｌｅを容量１０
μ！のハイブリダイゼーション緩衝液（１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣｊ２　、　１（１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０
および１ｍＭ　ＥＤＴＡ　）中に混合した。ついでこれ
を９５℃に５分間加熱し、次に一夜５５℃でインキュベ
ートして２個の相補性オリゴヌクレオチドをハイブリダ
イズさせた。

以下のＤＮＡフラグメントも単離した。プラスミドｐ　
ｋ　１９／ＧＡＰＤＨ−ｄ　Ｓ　ｓ　ｐおよび−ｄＳｎ
ａを制限酵素Ａｓｕ　ＩＩおよびＳａｃ　Ｉで消化し、
フラグメントをアガロースゲル上で分離した。

４（１０ｂｐおよび５ｏｏｂｐのフラグメントを切り出
し、電気溶出した６プラスミドｐＤＰ１０８を制限酵素
Ｅ、ｃｏＲＩおよびＡａｔＩＩで消化し、１．５　ｋｂ
　ＤＮＡフラグメントがゲルから単離された。この１．
５　ｋｂｐＤｌ　０８フラグメントを２種のＡｓｕ　ｎ
　−５ａｃ　ＩＧＡＰＤＨフラグメントと個別に混合し
、ｐｋ１９／ＥＮＡ３−ｔｅｒｍ　５　ｋｂ　　５ａｃ
ｌ　−ＡａｔＩ［精製フラグメントおよび八ｓｕ　ｆＪ
−Ｅ、ｃｏＲＩリンカ−（ＣＡＴプロモーター）を加え
てリゲートした。形質転換は、小規模のＤＮＡプレバレ
ージョンの制限酵素ＤＮＡ分析、氷晶形成活性とＤＮＡ
配列決定の両者で試験した。これらは正確に相当し、プ
ラスミドｐＤＰ１１０　（ｄＳｓｐ）およびｐＤＰｌ　
１１（ｄＳｎａ）が得られた。

ブースミドへの これらの構築体の試験に用いられた酵母発現プラスミド
は、Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙの遺伝子工学部門から供与さ
れた。このプラスミドは、ｐＤＰ３４Ｘｈｏ　（ｐＤＰ
３４．欧州特許出願第８９８１０２９７．５号参照。Ｘ
ｈｏ修飾はｐＤＰ３４をＳａｃ　ＩとＢａｍ旧で消化し
、ｐＵｃ２１を作成するために使用されたオリゴヌクレ
オチドを加えるものである。９頁参照）で、Ｅ、ｃｏｌ
ｉベクターｐＵｃ１９、完全酵母２ミクロンプラスミド
および酵母を選択可能な２種の栄養要求マーカーから構
成される。第一のものは、形質転換を容易にし、酵母中
でのプラスミドの低コピー数選択を可能にするＵＲＡ３
遺伝子であり、第二のものは高コピー数を誘導するＬＥ
Ｕ２遺伝子のｄＬＥＵ２対立遺伝子である。

プラスミドｐＤＰ３４−Ｘｈｏを制限酵素５ａｃＩおよ
びＭｌｕ　ｌで消化した。プラスミドｐＤＰ１０８．１
０９，１１０および１１１も制限酵素Ｓａｃ　Ｉおよび
Ｍｌｕ！で消化した。ｐＤＰ３４プラスミドを４種のプ
ラスミド消化体と別個にリゲートさせ、Ｅ、ｃｏｌｉに
形質転換した。トランスホーマントは、アンピシリンプ
レート上でｐＤＰ３４プラスミドに対して選択した。制
限酵素分析により、プラスミドｐＤＰ１１２　（ｐＤＰ
１０８からのＥＮＡ３構成分を含有）、ｐＤＰ１１３　
（１０９）ｐＤＰｌ　１４　（１１０）およびｐＤＰ、
１１５（１１１）が確認された。プラスミドｐ　Ｄ　Ｐ
１１４゜ｐＤＰ１１５およ６　ｐ　Ｄ　Ｐ　３４　Ｘ　
ｈ　ｏはそれぞれ第４Ａ、５Ａおよび６図に模式的に示
す、ＥＮＡｌｌｏ（ｐＤＰｌｌｏから）およびＥＮＡＩ
　１１（ｐＤＰｌｌｌから）の制限酵素地図は第４８お
よび５Ｂ図に示す。地図中、ＰはプロモーターＴはター
ミネータ−を表す。

鼠五形ｉ虹撓 酵母細胞をＹＰＤ培地（１％Ｂａｃｔｏ酵母エキス、２
％Ｂａｃ　ｔｏペクトン、２％デキストロース）中の一
夜培養液から接種し、３０℃で一夜生育させた。

培養液をＯＤ、。。が約２（１０で取り出す。

細胞懸濁液５０ｍ１を３．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠心分
離してペレット化する。

上澄液を捨て、細胞を５０ｍ１Ｏ）ＴＥ緩衝液で洗浄す
る。

細胞を１Ｍ酢酸リチウム（ＴＥ中）２Ｏｎ＋４！に再懸
濁する。

穏やかに振盪しなから３０℃で９０分間インキュベート
する。

細胞を３．ＯＯＯｒｐｍ、５分間でペレット化する。

上澄液を捨てＩ　Ｍ　Ｌｉ０Ａｃｌ　ｌ１ｌｌ中に再懸
濁する。

コンヒート細胞の２（１０μ！サンプルにＤＮＡ１８ｇ
を加える。

３０℃で１０分間インキュベートする。

５０％ＰＥＧ溶液（ＴＥ中）　ｌ　ｍｌ！を加える。

混合し、３０℃で６０分間インキュベートする。

４２℃で５分間熱シヨツクを与える。

細胞を微小遠沈管中で５秒間回転させてペレット化する
。

上澄液を捨てる。

細胞を８（１０ｍＭソルビトール中に再懸濁し、選択プ
レート上で平板培養する。

でのＥＮＡ３　　　　の プラスミドｐＤＰ１１２．ｐＤＰｌ　１３．ｐＤＰ１１
４およびｐＤＰ１１５を上述のようにして、酵母ＹＰ４
２株（ゲッタイブ；α、　ｕｒａ　３−５２゜ｈｉｓ４
　５８０．　１ｅｕ２）にトランスホームした。

トランスホーマントを、ヒスチジン（２０■／ｌ）およ
びロイシン（３０■／ｊ２）を補充した５Ｄ（０，６７
％Ｂａｃ　ｔｏ酵母窒素ベース、アミノ酸を含まない、
２％デキｌストロース）最小アガー小プレート上、３０
℃で選択した。トランスホームされたコロニーを単一コ
ロニーについて２個の同じ選択プレート上にかき取り、
トランスホーマントを精製した。各プラスミド構築体か
らのコロニーをＹＰＤ培地培地中法養液種に使用し、攪
拌下に３０℃で生育させた。これらを初期対数期、ＯＤ
６゜。

約１．０まで生育させ、細胞をペレット化し、以下同様
に処理した。ＹＰ４２プラスプラスミドｐＤＰ１１４お
よびｐＤＰ１１５の氷晶形成スペクトルを第７図および
第８図に図式的に示す。これらの図では、縦軸にｌｏｇ
　（氷核／細胞）を横軸にＹＰＤメジウム中での過冷却
（−”Ｃ）をとりプロットした（０）。

ＹＰ４２＋プラスミドｐＤＰ１１４およびｐｏｐ１１５
はまたＳＤ２メジウム（０゜６７％Ｂａｃｔｏ酵母窒素
ベース、アミノ酸なし、０．５％カサミノ酸、２％デキ
ストロースおよび５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６，
０）中、攪拌下に３０℃で生育された。

ＳＤ２メジウムでの相当する凍結スペクトルを第７図お
よび第８図に示す（・）。

ＤＰ１４０の プラスミドｐＤＰ１３５については後に述べる。

このプラスミドを制限酵素Ｍｌｕ　ＩおよびＳａｃ　Ｉ
で消化し、ＭｌｕＩおよびＳａｃ　Ｉで消化したｐＤＰ
３４Ｘｈｏと混合し、リゲートした。これをコンピーテ
ントＥ、ｃｏｌｉ細胞にトランスホームし、トランスホ
ーマントをアンピシリン補充ＹＴプレート上で選択した
。コロニーを凍結および制限酵素分析でスクリーニング
するとプラスミドＰＤＰ１４０が得られた。これを第９
Ａ図に模式的に示す。第９Ｂ図はＥＮＡ１３３　（ｐＤ
Ｐ１３３から）の制限酵素地図を示し、地図中Ｐはプロ
モーター、Ｔはターミネータ−を表す。　　撹乱 ｐＤＰ１４０を上述のようにＹＰ４２にトランスホーム
した。コロニーをＳＤ２メジウム中、攪拌しなから３０
℃で培養した。ＹＰ４２＋プラスミドｐＤＰ１４０の凍
結スペクトルを第１Ｏ図に示す。図はｌｏｇ（氷核／細
胞）を過冷却（−”Ｃ）に対してプロットしたものであ
る。

ＵＢＩ４プロモー　−プレバレージョンおよび付加 出発原料は、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＫＳ＋（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ
　、　Ｕ　Ｓ　Ａ）のＳａｃ■部位にＵＢＩ４遺伝子（
Ｅ、０ｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯＪ。

Ｖｏｌ　　６．Ｎ（Ｌ５．　１４２９〜１４３９．　１
９８７）がクローン化されて含まれる野生型酵母５２８
８Ｃ株からの６ｋｂゲノムＳａｃ　Ｉフラグメントより
構成されるＣ１ｂａ　ＧｅｉｇｙのプラスミドＫＳ＋／
ＵＢ　Ｉ　４である。プラスミドＫＳ＋／ＵＢ　Ｉ　４
を制限酵素旧ｎｄＩ［［およびＢｇｌＩ！で消化し、フ
ラグメントをアガロースゲル上で分割し、ｌｋｂバンド
を切り出して電気溶出した。プラスミドＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　、　Ｕ　Ｓ　Ａ）を制限酵素旧ｎｄ
ｎｌおよびＢｇｌ　Ｉｔで消化した。２個のＤＮＡフラ
グメントを互に混合し、リゲートし、コンピーテントＬ
ｊ旦Ｕ２細胞中にトランスホームした。トランスホーマ
ントをアンピシリン補充ＹＴプレート上で選択し、制限
酵素消化で分析し、プラスミドＢＡＩを同定した。プラ
スミドＢＡＩを含有するＥ、ｃｏｌｉ株をＳ　ｔｒａ　
ｔａｇｅｎｅの指示書に従ってヘルパーファージＭ１３
／ＫＯ７に感染させ、上澄液からＢＡＩの一本鎖型を回
収した。これをその後の使用のために精製した。

ＵＢＩ４プロモーターを、オリゴヌクレオチド特定部位
の突然変異によって修飾し、ＵＢＩ４遺伝子の“ＡＴＧ
”の直前のＥｃｏＲＹ制限部位に、次のように導入した
。

”　ａｃｔｔｔａａｃｔａａｔａｇａｔｔＡＴＧｃａｇ
ａｔｔｔｔｃｇｔｃａａ”３・ＡＡＣＴＡＡＴＡＧＡＴ
ＡＴＣＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＧＳ・〈　　　　〉 ＥｃｏＲＹ 上部の配列は“ＡＴＧ”　（大文字で示した）の周辺の
ゲノムＵＢＩ４遺伝子であり、下部の配列（大文字で示
した）は突然変異に使用した０１１ｇ。

１６６である（新たなＥｃｏＲＹ制限部位を下に示した
）。突然変異は「オリゴヌクレオチド特定１ｎｖｉｔｒ
ｏ突然変異システム、バージョン２」　（＾ｍｅｒｓｈ
ａｍ、ＵＫ）を用い、製造者の指示に従って実施した。

トランスホーマントはアンピシリン補充ＹＴプレート上
で選択し、制限酵素ＥｃｏＲＹで分析し、プラスミドＳ
　Ｋ　＋／　Ｕ　Ｂ　Ｉ　４−ＥｃｏＲＹを確認した。

プラスミドｐＤＰ１０Ｂは制限酵素Ｎｄｅ　Ｉで消化し
、突出はフレノウ酵素で満たした。これをついで制限酵
素ＡａｔＵで消化し、フラグメントをアガロースゲル上
で分割した。１．５ｋｂＤＮＡフラグメントをゲルから
切り出し、電気溶出した。プラスミドヘクターｐ　ＧＥ
　７　（Ｐｒｏｍｅｇａ　、　　ＵＳＡ）を制限酵素旧
ｎｄｎＩおよびＡａｔｌｌで消化した。ｐＧＥＭ　７ヘ
クター、ＵＢＩ４プロモーターおよびｐＤＰ１０８５″
　ＥＮＡ３ＤＮＡフラグメントを混合し、リゲートした
。このリゲーシゴン液をコンピーテントＥ　ｃｏｌｉ細
胞にトランスホームし、アンピシリン補充ＹＴプレート
上で平板培養した。トランスホーマントを分析し、プラ
スミドＢＦＩを同定した。

プラスミドＢＦＩを制限酵素Ｓａｃ　ＩおよびＡａｔ■
で消化し、フラグメントをアガロースゲル上で分割し、
２ｋｂフラグメントを電気溶出した。これを前述の５ｋ
ｂｐＫｌ　９／ＥＮＡ３−ｔｅｒｍ　、　５ａｃＩ−Ａ
ａｔｎ精製、脱リン酸化フラグメントと混合し、リゲー
トし、コンビ−テントＥ、ｃｏｌｉ細胞にトランスホー
ムした。トランスホーマントをカナマイシン補充ＹＴプ
レート上で選択し、制限酵素消化、凍結およびＤＮＡ配
列決定によって分析して、プラスミドｐＤＰ１１８を得
た。ｐＤＰ１１８のＥＮＡ３インサートをついで酵母発
現ベクターｐＤＰ３４に移すとプラスミドｐＤＰ１２０
が得られた。プラスミドｐＤＰ１２０を第１１Ａ図に図
式的に示す。第１１Ｂ図はＥＮＡ−１１８（ｐＤＰ１１
８から）の制限酵素地図であり、地図中ＰおよびＴはそ
れぞれプロモーターおよびターミネータ−を示す。

ｐＤＰ１２０を上述の場合と同様にしてＹＰ４２中にト
ランスホームした。コロニーをＳＤ２培地中、攪拌しな
から３０℃で培養した。ＹＰ４２プラスｐＤＰ１２０の
凍結スペクトルを第１２図に示す。図はｌｏｇ　（氷核
／細胞）を過冷却（−”Ｃ）に対してプロットしたもの
である。

のＥＮＡ３　　　　の 氷晶形成蛋白質の標的性、ならびにおそらくはその表現
型発現を改善するために、ＥＮＡ３蛋白質のアミノ末端
に融合した天然酵母シグナル配列をもつ構築体を作成し
た。２種類を選択した。すなわち、ｐＨ０５シグナル配
列（Ｂ、Ｗａｊｅｅｈら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、　Ｖｏｌ、　　１２．　Ｎ（１２０，７７２１〜
７７３９．１９８４）およびα因子プレプロリーダー配
列（Ｊ、Ｋｕｒｊａｎ　＆　１．Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ
　、　Ｃｅ１ｌ　。

３０．９３３〜９４３．１９８２）である。

ＰＨ０５ジグ　ル　ｌ ＰＨ０５シグナル配列は、リンカ−として作用する２種
の相補性オリゴヌクレオチドを合成し、一方以下の要求
アミノ酸配列を含有するように作成した（合成オリゴヌ
クレオチドは大文字で示す）Ｅ、ｃｏＲＩ　　ｍｅｔ　
ｐｈｅ　ｌｙｓ　ｓｅｒ　ｖａｌ　ｖａｌ　ｔｙｒ　ｓ
ｅｒ　ｉｌｅ　ｌｅｕ　ａｌａ　ａｌａｇＡＡＴＴＣＡ
　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　
ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＧＣＣＧＣＴｃｔｔ
ａａＧＴ　ＴＡＣＡＡＡ　ＴＴＴ　ＡＧＡ　ＣＡＡ　Ｃ
ＡＡ　ＡＴＡ　ＡＧＴ　ＴＡＡ　ＡＡＴ　ＣＧＧ　ＣＧ
Ａシグナル切断部位 ｓｅｒ　ｌｅｕ　ａｌａ　ａｓｎ　ａｌａ　ｇｌｙ　Ｍ
ＥＴＴＣＴ　ＴＴＧ　ＧＣＣＡＡＴ　ＧＣＡ　ＧＧｔ　
ａｔｇ”ＡＧＡ　ＡＡＣＣＧＧ　ＴＴＡ　ＣＧＴ　ＣＣ
Ａ　Ｔａｃｓ。

ＮＡ３ 遺伝子 上方のオリゴヌクレオチドはＯｌｔｇｏｌ　７４　（５
９マー）で、下方はＯｌｉｇｏｌ　７５　（５７マー）
である。これらのオリゴヌクレオチドのほぼ等モル量を
一緒に混合し、塩高濃度溶液中でハイブリダイズした。

これらのハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを以下
のフラグメント：前述のｐＫ１９／巳ＮＡ３−ｔｅｒｍ
５ｋｂ　、　５ａｃＩとＡａｔ　ｎで消化し、ゲル精製
、脱リン酸化したフラグメント；５ａｃＩとＥｃｏＲＩ
で消化しゲル精製したｐＤＰｌｌｌの７（１０ｂｐフラ
グメント；およびＮｄｅ　ＩとＡａｔ　ＩＩで消化し、
ゲル精製したｐＤＰｌｌｌの１．４５ｋｂフラグメント
と混合した。これをリゲートし、ｈｃｏｌｉ中にトラン
スホームした。トランスホーマントをまずＥ、ｃｏｌｉ
中それらの活性で、次に制限酵素分析によって選択する
とプラスミドｐＤＰ１１７およびｐＤＰ３４中プラスミ
ドｐＤＰ１２０が得られた。ＤＮＡ配列分析によりＰＨ
０５シグナル配列の一部分は重複していた。′で印をし
た（上記参照）８アミノ酸は重複し、以下のシグナル配
列を与えた。

＼ プラスミドｐＤＰ２２１は第１３Ａ図に図式的に示す。

第１３Ｂ図はＥＮＡ−１１７（ｐＤＰ１１７から）の制
限酵素地図であり、Ｐ、ＳＳおよびＴはそれぞれプロモ
ーター、シグナル配列およびターミネータ−を示す。

プラスミドｐＤＰ１２１を酵母ＹＰ４２株中にトランス
ホームし、コロニーをＳ　Ｄ　＋ＨＩＳ　＋ＬＥｔｌプ
レート上で選択した。トランスホーマントの培養液をＳ
Ｄ２培地中で生育させ、氷晶形成活性を検定した。ＹＦ
３２＋ｐＤＰ　１２１の凍結スペクトルを第１４図に示
す。この図はｌｏｇ（氷核／細胞）を過冷却（−”Ｃ）
に対してプロットしたものである。

旦Ｚ旨巳駈Σれ二 プレプロα因子リーダーの出発材料は、ＣｉｂａＧｅｉ
ｇｙのｐＵＣ／ＰＨ０５−α因子リーダープラスミドで
ある。これは、Ｅ、ｃｏＲＩ制限部位、８ｂｐのＰＨ０
５プロモーター、それに続いて“ＡＴＣ“およびα因子
リーダーを含有するように修飾された。プレプロ切断領
域も修飾され、ＫＥＸ２切断部位にＢｇｌＩ［制限部位
、およびこの６ｂｐ前にＰｖｕ■制限部位を包含させた
（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐ、修飾）。

プラスミドｐＵｃ／ＰＨ０５−α因子リーダーを制限酵
素Ｅ、ｃｏＲＩおよび旧ｎｄＩ［［で消化し、フラグメ
ントをアガロースゲル上で分離した。３（１０ｂｐフラ
グメントを切り出し、電気溶出した。プラスミドｐＤＰ
１１１を制限酵素Ｅ、ｃｏＲＩおよびＳａｃ　１で消化
し、フラグメントをアガロースゲル上で分離した。６５
０ｂｐフラグメントを切り出し、電気溶出した。α因子
リーダーのこれらの２つの成分とＣ，ＡＰＯＨ−ｄＳｎ
ａ−ＣＡＴプ０モーターをそれぞれ、制限酵素Ｓａｃ　
Ｉおよび旧ｎｄｌ［［で消化したＰＵＣ１９と一緒に混
合し、リゲートし、Ｅ、ｃ。

ｕ中にトランスホームした。トランスホーマントを分析
し、プラスミドｐＵＣ／ＧＡＰＤＨ−ｄＳｎａＣＡＴ−
α因子リーダーを確認した。

プラスミドｐ　ＵＣ／ＧＡＰ　ＤＨ−３ｄ　ｎ　ａ　−
ＣＡＴ−α因子リーダーを制限酵素Ｂｇｌ　ＩＩで消化
し、５°の突出をフレノウ酵素で充填した。これをつい
で制限酵素Ｓａｃ　Ｉで消化し、フラグメントをアガロ
ースゲル上で分離した。９４０ｂｐフラグメントを切り
出し、電気溶出した。プラスミドｐＤＰ１１１は制限酵
素Ｎｄｅ　Ｉで消化し、５“の突出をフレノウ酵素で充
填した。これを制限酵素ＡａｔＩＩで消化し、フラグメ
ントをアガロースゲル上で分離した。１４（１０ｂｐフ
ラグメントを切り出し、電気溶出した。これらの２種の
精製フラグメントを、ｐ　Ｋ　１９／ＥＮＡ３−ｔｅｒ
ｍ５ｋｂをＳａｃ　１とＡａｔＩＩで消化しゲル精製、
脱リン酸化を行ったフラグメントと混合し、リゲートし
、Ｅ、ｃｏｌｉにトランスホームした。トランスホーマ
ントをまず氷晶形成活性で、次に制限酵素分析、最後に
ＤＮＡ配列分析でスクリーニングし、プラスミドｐＤＰ
１２６を同定した。このインサートを酵母での試験のた
めにｐＤＰ３４中に移し、プラスミドｐＤＰ１２９を得
た。これを第１５Ａ図に図式的に示す。

第１５Ｂ図はＥＮ、Ａ−１２６（ＰＤＰ１２６から）の
制限酵素地図であり、Ｐ、ＴおよびＬはそれぞれプロモ
ーター、ターミネータ−およびリーダーを表す。プラス
ミドｐＤＰ１２９を上述のようにして、酵母ＹＰ４２株
中にトランスホームした。

トランスホーマントをＳＤ２培地の培養液への接種に用
い、撹拌しながら３０℃でインキュベートした。ＹＰ４
２＋プラスミドｐＤＰ１２９の凍結スペクトルを第１６
図に図式的に示す。この図はｌｏｇ　（氷晶／細胞）を
過冷却（−’Ｃ）に対してプロットしたものである。

α　　ブース１−− 酵母での組換え蛋白質の産生のためのα因子リーダーの
使用に関する最近の情報では、さらに別の要求が示唆さ
れている。天然のα因子では、プレプロペプチドに続い
て８アミノ酸リンカ−があり、ついでα因子ペプチドと
なっている。リンカー−α因子配列は遺伝子内では５回
反復され、α因子のプロセッシングの間にリンカ−は除
去される。情報は、リンカ−をプレプロリーダーの後、
問題の遺伝子の前に添加すべきことを示唆している。こ
れは、必要なアミノ酸を挿入するためにリンカ−として
合成オリゴヌクレオチドを用いることによって行われた
。

プラスミドｐＵＣ，／ＧＡＰＤＨ−ｄｓｎａＣＡＴ−α
因子リーダーを制限酵素Ｓａｃ　ＩおよびＢｇｌＩＩで
消化し、フラグメントをアガロースゲル上で分離した。

９４０ｂｐフラグメントを切り出し、電気溶出した。プ
ラスミドｐＤｐＨ１を制限酵素Ｎｄｅ　ＩおよびＡａｔ
ＩＩで消化し、フラグメントをアガロースゲル上で分離
した。１４（１０ｂｐフラグメントを切り出し、電気溶
出した。２種の精製フラグメントを２つのハイブリダイ
ズしたオリゴヌクレオチド２０８および２０９、ならび
に上述のＰ　Ｋ　１９／　ＥＮＡ３−ｔｅｒｍ　５ａｃ
ｌ　−ＡａｔＩＩフラグメントと混合し、リゲートし、
Ｅ、ｃｏｌｉにトランスホームした。トランスホーマン
トを、制限酵素消化およびＤＮＡ配列分析でスクリーニ
ングして、プラスミドｐＤＰ１２７を同定した。これは
氷晶形成活性も示す。挿入体を酵母発現プラスミドｐＤ
Ｐ３４中に移入し、プラスミドｐＤＰ１３０を得た。こ
れを第１７Ａ図に示す。第１７Ｂ図は、ＥＮＡ−１２７
（ｐＤＰ１２７から）の制限酵素地図であり、Ｐ、Ｔお
よびＬはそれぞれプロモーター、ターミネータ−および
リーダー＋リンカ−を示す。プラスミドｐＤＰ１３０を
上述のようにしてＹＰ４２中にトランスホームした。ト
ランスホーマントを用いてＳＤ２メジウムの培養液に接
種し、攪拌しながら３０℃で生育させた。ＹＰ４２＋プ
ラスミドｐＤＰ１３０の凍結スペクトルを第１８図に示
す。この図はｌｏｇ（氷晶／細胞）を過冷却（−”Ｃ）
に対してプロットしたものである。

への　−　　　　ｔｏｒ　ｅｔ 上記のケースは、ネイティブな酵母のシグナル配列（ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ）をそのＥＮＡ３蛋白質に加えるだけで
あり、おそらく小胞体を経ての膜への蛋白質のターゲツ
ティングにおける目的としても良く又目的としなくても
良い。蛋白質が小胞体に入れば、この欠失のある経路は
、細胞外の分泌のものであり、おそらく、我々のケース
では、外層膜への進入の経路であろう。ここで、我々は
、例えば、液胞のような細胞内の特異的なオルガネラへ
のＥＮＡ３蛋白質をターゲットとする。

蛋白　カルボキシ−ペプチダーゼＹ　（ＣＰＹ）は、プ
ロテイナーゼＢ　（ＰＥＰ４遺伝子の産物）によって、
液胞内で製造されるプレープロ型（ｐｒｅ−ｐｒ。

ｆｏｒｍ）の液胞に関する。

ターゲットに必要な配列はプレプロリーダー配列（ｐｒ
ｅ−ｐｒｏ　１ｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）内に
局在化していることが知られている。それ放牧々は、こ
れをＥＮＡ３蛋白質の前に挿入した。

出発物質は、チバガイギーのｐＢＲ３２２／ＰＨ０５−
プレプロＣＰＹプラスミドである。合成オリゴヌクレオ
チドは、このＧＡＰＤ、Ｈ／ＣＡＴプロモーターとナチ
ュラルなＳｔｕ　Ｉ制限部位との間、このＣＰＹプレ蛍
白質の３５ｂｐ中に入ったところで、特異的なリンカ−
として必要とされる。

、５ｔｕｌ。

ＥｃｏＲＩ　　　　ＭｅｔＬｙｓＡ１ａＰｈｅＴｈｒＳ
ｅｒＬｅｕＬｅｕＣｙｓＧ１ｙＬｅｕＧｌｙＬｅｕ５°
　ｇＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＣＡＣＣＡ
ＧＴＴＴＡＣＴＡＴＧＴＧＧＡＣＴＡＧＧｃｃ　ｔｇ　
３３−　　ｃｔｔａａＧＴＡＴＡＣＴＴＴＣＧＴＡＡＧ
ＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＡＴＣＣｇｇ
ａｃｒ合成オリゴヌクレオチドは、大文字で示され、且
つオリゴ２０６（上）及びオリゴ２０７（下）である。

プラスミドｐＢＲ３２２／ＰＨ０５−プレプロＣＰＹは
、制限酵素旧ｎｄＩ［［及びＳｔｕ　Ｉで消化し、この
断片をアガロースゲル上で分離した。

この８（１０ｂｐ断片を切断し、電気溶出（ｅｌｅｃｔ
ｒｏ−ｅｌｕｄｅ）　シ、ハイブリッドしたオリゴ２０
６及び２０７と混合し、ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［［で
ｐＵｃ１９プラスミドを消化し、リゲート（ｌｉｇａｔ
ｅ）　　した。

これをＥ、ｃｏｌｉ中にトランスフオーム（ｔｒａｎｓ
　ｆｏｒｍ）し、この形質転換体を制限酵素分析によっ
てスクリーンして、プラスミドｐ　ＵＣ１９／ＣＰＹ　
（Ｐ−ｐ）を得た。プラスミドｐＵｃ１９／ＣＰＹ（ｐ
−ｐ）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｃｌｌで切断し、
断片をアガロースゲルでリソルブ（ｒｅｓｏｌｖｅ）　
Ｌ／、この３４０ｂｐ断片を分け、電気溶出（ｅｌｅｃ
ｔｒｏ−ｅｌｕｄｅ）　Ｌ／た。この断片をＥｃｏＲＩ
及び旧ｎｃｎと混合し、ｐＵｃ１８を切断し、リゲート
し、コンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）なＥ、ｃｏｌ
ｉに形質転換した。コロニーをスクリーンして、プラス
ミドｐ　ＵＣ１８／プレプロ−ＣＰＹを同定した。

プラスミドｐＵｃ１８／プレプロ−ＣＰＹを制限酵素Ｅ
ｃｏＲｒ及び旧ｎｄｌｌｌで切断し、生成物をアガロー
スゲル上でリソルブ（ｒｅｓｏｌｖｅ）　した。この３
５０ｂｐ断片を分けて（ｃｕｔ　ｏｕｔ）電気溶出（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｅｌｕｄｅ）　　した。これにプラスミド
ｐＤＰ１１０からのゲル精製６８０ｂｐ　Ｓａｃ　Ｉ　
　ＥｃｏＲＩＧＡＰＤＨｄＳｎａ／ＣＡＴプロモーター
を添加し、Ｓａｃ　Ｉ及び旧ｎｄＩ［ＩでｐＵｃ１９を
切断し、コンピーテントＥ、ｃｏｌｉに形質転換した。

コロニーをスクリーンし、プラスミドＰ　Ｕ　Ｃ１８／
ＧＡＰＤＨｄＳｎａ−ＣＡＴ−ル−プローＣＰＹを同定
した。プラスミドＰ　ＵＣ１８／ＧＡＰＤＨｄＳｎａ　
−ＣＡＴ−プレープローＣＰＹを制限酵素５ａｉｌで切
断し、このオーバハングをクレノー（Ｋｌｅｎｏｉｖ）
酵素で満たした。

これをそれからＳａｃ　Ｉで切断し、この断片をアガロ
ースゲルで分離した。７５０ｂＥｌ断片が得られ、電気
溶出した。プラスミドｐＤＰ１０８を制限酵素Ｎｄｅ　
Ｉで切断し、オーバハングをクレノー（にＩｅｎｏｗ）
酵素で満たした。これをそれがらＡａｔ■で切断し、断
片をアガロースゲルでリソルプした。１５（１０ｂｐ断
片を分けて、電気溶出（ｅｌｅｃｔｒ。

ｅｌｕｄｅ）　Ｌ／た。これら２つの分離した断片を前
述したｐ　Ｋ１９／ＥＮＡ３−ｔｅｒｎ＋５ｋｂと混合
し、Ｓａｃ　１及びＡａｔｎで切断し、ゲル精製し、脱
リン酸し、リゲー）　（ｌｉｇａｔｅ）　　Ｌ、コンピ
ーテントなＥ　ｃｏｌｉに形質転換した。コロニーを制
限酵素分析及び凍結によって、スクリーンし、それらの
両方とも同一のプラスミドｐｉＤＰ１３６を同定した。

このプラスミドｐＤＰ１３６の挿入を酵母発現（ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ）プラスミドｐＤＰ３４に形質転換して
、プラスミドｐＤＰ１４３　（添付の第１９Ａ図に示す
）を得た。第１９Ｂ図はＥＮＡ−１３６（ｐ　Ｄ　Ｐ１
３６からの）の制限酵素地図を示す（ここで、ＰとＴは
それぞれプロモーター及びターミネータ−を現す）。

プラスミドｐｌｉ）Ｐ１４３を上述したＹＰ４２に形質
転換した。形質転換体をＳＤ２培地で攪拌しながら３０
″Ｃで培養した。ＹＰ４２プラスプラスミドｐＤＰ１４
３の凍結スペクトルを添付の第２０図に示す。ここでｌ
ｏｇ（氷咳／細胞）は、過冷却（ｓｕｐｅｒｃｏｏｌｉ
ｎｇ）　　（−”Ｃ）に対してプロットしている。

ネーテイブ（ｎａｔｉｖｅ）なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
由来のＥＮＡ３遺伝子の表現は、たとえ、その要部の３
５及び−１０領域がＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔ
ｉｓホスホ−β−ガラクトシダーゼプロモーター（Ｂ、
Ｂｏｉｚｅｔ等、ジーン（ｇｅｎｅ）　　６２　、　１
９８８　、　２４９−２６１）（データ示さず）と極め
て類似しているとしても、これまでは成功してなかった
（データ示さず）。しかし、　“ＡＴＧ’で始まる直前
の６０−６５の塩基対のｍＲＮＡリーダー（１ｅａｄｅ
ｒ）が存在しうることが重要と思われる。我々は、ＥＮ
Ａ３プロモーター由来の−３５及び−１０シークエンス
とホスホ−β−ガラクトシダーゼプロモーター由来の潜
在的なリーダー（ｌｅａｄｅｒ）とからハイブリッドプ
ロモーターを構築することによって、これを試験した。

以下に示す合成オリゴヌクレオチドを使用することによ
って、これを行なった。

Ａｓｕｒｌ　　　　−３５−１０ ＜　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏｌｉｇｏ　　１
８６５“ｔｔＣＧＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＡＡＧＴＧＣＧ
ＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＧＧＡＴ３・ａａｇｃ
ＴＴＡＣＧＡＡＣＴＡＴＴＣＡＣＧＣＧＡＣＧＡＡＡＡ
ＴＡＡＡＴＴＴＣＣＴＡ＜　　　、Ｏ１ｉｇｏ１８７ １０　　　　２０　　　　３０　　　　４０＞＜　　　
　　　　Ｏｌｉｇｏ　　２１４　　　　　　＞＜ＣＴＡ
ＧＧＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＴＴＴＣ
ＡＧＡＡＣＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＣＣＴＴＡＡ八八ＧＧ
ＴＡＡＡＧＧＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＣＴＴＧＴＧＴＣＴ
ＴＡ＞＜　　　　　　　、　　Ｏｌｉｇｏへへ１？５０
　　　　　　６０　　　　　　７０　　　　　　８Ｏｄ
ｅＩ ０１ｉｇｏ　２１５　　　　　　　　ｐ　　＞ＣＴＣＧ
ＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＡＡＧＧＡＣ
ＴＴＡＣＡＣＡ　ｔａ　ｔｇ　”ＧＡＧＣＡＧＡＧＴＴ
ＴＡＣＧＡＡＡＡＡ＾ＡＣＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＴＧ
ＴＡＴａｃｓ・、　　　＞＜　　　　、０１ｉｇｏ　２
１６．　　　　　　＞　　。

９０　　　　　　１（１０　　　　　１１０　　　　　
１２０即ち、対ｌから４５は、修正された（ｍｏｄｉｆ
ｉｅｄ）ＥＮＡ３プロモーターである。塩基対４６から
１１５は、ホスホ−β−ガラクトシダーゼ遺伝子由来の
対応する配列である。

塩基対１４６から１２０は、制限酵素Ｎｄｅ　Ｉに対す
る認識部位（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）であ
り、ＥＮＡ３遺伝子に対する“ＡＴＧ”を含む。合成オ
リゴヌクレオチドは大文字で示す。

オリゴヌクレオチドを、記載している通り、互いにキナ
ーゼで処理し、ハイブリッド化した。プラスミドｐＤＰ
１０Ｂを、制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ及びＡａｔＩ［で消化し
、断片をアガロース・ゲル上で分離させた。

ＥＮＡ３遺伝子の５”末端を含む１．５ｋｂの断片を切
り出し、電離させた。このＤＮＡ断片を、上記の合成オ
リゴヌクレオチド、前述のｐＫ１９／ＧＡＰＤＨ−ｄＳ
ｎａ由来のＳａｃ　Ｉ　−Ａｓｕ　ＩＩ　６（１０ｂｐ
酵母プロモーターの断片及びＰ　Ｋ　１９／ＥＮＡ３−
末端由来の精製及びリン酸化した５ｋｂＳａｃＩ−Ａａ
ｔｎ断片とともに混合し、ライゲートした。

このライゲーションを反応能のある大腸菌細胞へと形質
転換させ、カナマイシンを補ったＹＴプレート上で平板
培養した。形質転換体を、制限酵素による消化、アイス
・ヌクレエーション活性及びＤＮＡ配列によってスクリ
ーニングし、プラスミドｐＤＰ１３３であることが分か
った。

プラスミドｐＤＰ１３３を、制限酵素Ａｓｕ　ＩＩ及び
Ｘｂａ　Ｉ、アガロース・ゲル上に分離された断片並び
に切り出しかつ電離した３、５ｋｂの断片を用いて消化
させた。プラスミドＰＳＣ１２ｖＮは、チハ・ガイギー
社の研究所で分離された大腸菌ベクターｐＵｃ１８、プ
ラスミドｐ　ＶＡ８３　Ｂ　（Ｆ、Ｌマクリナ共著、遺
伝子第１９号、１９８２年刊、３４５頁から３５３頁収
載）由来の非誘導性エリスロマイシン抵抗性の遺伝子及
び立ス上且工友スニフ文デ４　Ｘ　（Ｌａｃｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ）プラスミドを起源とするその複
製からなる。Ｉ）ＳＣ１２ｖＮは、制限酵素Ｃ１ａ　Ｉ
及びＸｂａ　Ｉで消化させ、アルカリン・フォスフェタ
ーゼで処理し、このベクターの再ライゲート化を不能に
した。

ＩＮＡＺ−βＧＡＬ−ＥＩ’ＪＡ３　　ＤＮＡ断片及び
Ｃ１ａ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉで消化させたＰＳＣ１２ｖＮ
を混合し、ライゲート化させた。これを、大腸菌及び、
制限酵素分析並びにアイス・ヌクレエーション活性によ
ってスクリーニングしたコロニーで形質転換させた。こ
れは、プラスミドｐＤＰ１３５であることが分かった。

プラスミドｐｓｃ１２νＮ及びｐＤＰ１３５を、添付し
た図面中の第２１図及び第２２Ａ図に示す。その図中の
り、ラクテイス０は、区立を至土久プラスミド起源の複
製を表す。第　２２Ｂ図は、Ｐ及びＴがそれぞれプロモ
ーター及びターミネータ−を表している（ｐＤＰ１３３
由来の）ＥＮＡ−１３３の制限地図である。

Ｌ立久元ニスＬＭＯ２３０をＭ１７Ｃ，（Ｍ１７培地に
０．５％グルコースを加えたもの）で−晩培養したもの
を、新鮮なＭｌ　７Ｇ培地の１％接種材料に使用した。

これを、光学密度（ＯＤ、０゜）が約０．４になるまで
３０℃で培養し、１０，（１００回転／分で５分間遠心
分離することにより細胞をペレ・ノド化した。上澄みを
捨て、細胞を同容量のＰＳ緩衝液（７ｍＭリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ６，６，０，５モルのショ糖）中で４℃で再
懸濁した。

細胞を更にペレット化し、最終的には１／１（１０容量
のＰＳ緩衝液中で再懸濁し、使用するまで氷上に（反応
能のある細胞を）保存した。形質転換は、バイオラッド
・ジーン・パルサー（登録商標）をパルス・コントロー
ラー及び電極の間隔を０．２　ＣＴ＋とったジーン・パ
ルサー・キュベツトとを併せ使用することにより成し遂
げられた。反応能のある細胞１（１０μ２を、水もしく
はＴＥ緩衝液中に１−４μｌのＤＮＡとともに混合し、
予め冷却しておいたキュベツトの底部にピペットで入れ
た。

試料を、４（１０オームの抵抗値かつ２．（１００ボル
トで脈動させた。そして、試料をキュベツトから滅菌し
たマイクロＪフユージチューブへと取り除き、氷上に置
いた。最終的に、細胞を１分間マイクロ・フユージでペ
レット化し、３（１０μｌのＭ１７Ｇ培地で再懸濁し、
３０℃で１時間培養した。それから、細胞を４μｇ／ｒ
１．のエリスロマイシンで補ったＭｌ　７Ｇプレート上
で平板培養し、３０℃で一晩培養した。

プラスミドｐＤＰ１３５を、上記の通りり、ラフ１１λ
株ＬＭＯ２３０へ形質転換させた。形質転換体を、４μ
ｇ／ｍｊ２のエリスロマイシンを補い、ＯＤ、。。が約
１．０になるまで攪拌しなから２０℃で培養したＭｌ　
７Ｇ培地の培養物を接種するのに使用した。これらの培
養物を、記載した通り、試験し、結果を表にした。プラ
スミドｐＤＰ１３５を加えたＬＭＯ２３０の冷凍スペク
トラムは、添付の図面中の第２３図に示してあり、その
図中では適冷（−”Ｃ）に対する対数（アイス・ヌクレ
エーション／細胞）が示されている。

Ｐ−−Ｇａｌプロモー　− り、−０−ｘ７における外来遺伝子の発現へのもっと直
接的なもう一つのアプローチは、既知の区立Ｌｉ王王道
遺伝子プロモーターを使用することである。そのような
遺伝子の１つが、７２６８株のフォスフオーβ−ガラク
トシダーゼ遺伝子である。

その合成は、 以下の通りである。

６つのオリゴヌクレオチドは、通常のやり方で合成し、
精製した。各オリゴヌクレオチドの１（１０Ｐモルをマ
イクロフユージ・チューブ中で混合し、酵素Ｔ４ポリヌ
クレオチド・キナーゼ及びリン酸供与体としてＣｒ−３
２Ｐ）ＡＴＰを使用し、リン酸５“を加えた。これらの
オリゴヌクレオチドは、記載した通り、互いにハイブリ
ッド化した。プラスミドｐ　ＪＤＣ９（Ｊ−Ｄ、　Ｃｈ
ｅｎ及びり、八、モリソン著、遺伝子第６４号、１９８
８年刊、第１５５−１６４頁収載）を、制限酵素Ｓａｃ
　Ｉ及び旧ｎｄｌ［［を用いて消化させ、アルカリン・
フォスフエターゼでも処理した。プラスミドｐＤＰ１０
８を制限酵素Ｎｄｅ　Ｉ及び旧ｎｄＩＩ［で消化し、断
片をアガロース・ゲル上に分散させ、３．８５ｋｂのコ
ンビ−テントＥＮＡ３遺伝子を含む断片及びＬＹＳター
ミネータ−を分けて電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｄ
ｅ）　Ｌ／た。

このＤＮＡ断片を旧ｎｄＩ［［５ａｃｌで切断されたｐ
ＪＤＣ９、オリゴヌクレオチド混合物及びｐＫ１９／Ｇ
ＡＰＤＨ−ｄｓｎａ由来の以前に精製された５ａｃＩ　
−ＡｓｕＩ［６（１０ｂｐ酵母プロモ一ター断片と混合
し、リゲート（Ｉｉｇａｔｅ）　　した。これをその後
コンピーテントＥ、ｃｏｌｉ細胞中に形質転換し、５（
１０μｌの新鮮ＹＴ培地で３７℃２時間発現させ、１（
１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを加えたＹＴプレー
ト上に乗せ、３７℃で一晩培養した。

まず、制限酵素分析で、氷核化活性（ｉｃｅ　ｎｕｃｌ
ｅａｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）のためにスクリーニ
ングし、最後にＤＮＡシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ）を用いた。

配列プロモーター（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ｐｒｏｍｏｔ
ｏｒ　、＃で示す、上記参照）内の塩基対の２つの欠失
（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を含むプラスミドｐＤＰ１３７を
得た。

プラスミドｐＤ１３７を制限酵素Ａｓｕ　ＩＩ及びＸｂ
ａ■で切断し、このＤＮＡ断片をアガロースゲルで分離
した。３．９５ｋｂ断片を分けて、ＤＮＡを電気溶出（
ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）　シた。この断片を上述し
たＸｂａ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉ断片ｐｓｃ１２ｖＮプラス
ミドと混合し、リゲート（ｌｉｇａｔｅ）　シ、コンピ
ーテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ、ｃｏｌｉ中に形質
転換した。コロニを氷核化活性（ｉｃｅ　ｎｕｃｌｅａ
ｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖｉｔい及び制限酵素分析によって
スクリーニングして、添付の４゜ 第２４Ａ図に示すプラスミドｐＤＰ１４８を同定した。

この図において、Ｌ、１ａｃｔｉｓ　ｏは、Ｌ、　１ａ
ｃｔｉｓ起源のプラスミド複製を現す。第２４Ｂ図は、
ＥＮＡ−１３７（ｐＤＰ１３７由来）の制限酵素地図を
示す。ここで、Ｐ及びＴは、それぞれプロモーター及び
ターミネータ−を表す。

プラスミドｐＤ１４８を上記したＬＭＯ２３０中に形質
転換した。形質転換体は、４μｇ／ｍ１！のエリスロマ
イシン添加Ｍ１７Ｇ培地で、攪拌下２０℃で培養した。

ＬＭＯ２３０プラスプラスミドｐＤＰ１４Ｂの凍結スペ
クトルを添付の第２５図に示す。ここで、ｌｏｇ（氷核
／細胞）は過冷却（ｓｕｐｅｒ　ｃｏｏｌｉｎｇ　）　
　（”Ｃ）に対して示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、水、Ｍ１７培地、ＬＭＯ２３０十ＰＳＣ１２
ｖＮおよびＬＭ２３０＋ｐＤＰ１３５゜Ｍ１７−Ｅｍの
各小滴の各種温度（−℃）での凍結百分率を示す。 第６図は、ｐＤＰ３４Ｘｈｏの地図を示す。 第７図は、ＹＰ４２＋ｐＤＰ１１４、 第８図は、ＹＰ４２＋ｐＤＰ１１５、 の過冷却に対する氷核／細胞のｌｏｇのプロットを示す
。 第９図Ａは、ｐＤＰ１４０の地図、ＢはＥＮＡ１１３の
制限酵素地図を示す。 第１０図は、ＹＰ＋ｐＤＰ１４０ＳＤ２培地での過冷却
に対する氷核／細胞のｌｏｇをプロットしたもの。 第１１図Ａは、ｐＤＰ１２０の地図、ＢはＥＮＡ−１１
８の制限酵素地図を示す。 第１２図は、ＹＰ４２＋ｐＤＰ１２０ＳＤ２培地での過
冷却対ｌｏｇ氷核／細胞の関係を示す。 第１３図Ａは、ｐＤＰ１２１の地図、同Ｂは、ＥＮＡ−
１１７の制限酵素地図を示す。 第１４図は、ＹＤ４２＋ｐＤＰ１２１ＳＤ２培地におけ
る過冷却対ｌｏｇ　（氷核／細胞）の関係を表す。 第１５図Ａは、ｐＤＰ１２９の地図、Ｂは、ＥＮＡ−１
２６の制限酵素地図を示す。 第１６図は、ＹＰ４２＋ｐＤＰ１２９ＳＤ２培地におけ
る過冷却対ｌｏｇ　（氷核／細胞）の関係を示す。 第１７図Ａ　　ｐＤＰ１３０の地図、Ｂは、ＥＮＡ−１
２７の制限酵素地図を示す。 第１８図は、ＹＰ１４２＋ｐＤＰ１３０ＳＤ２培地にお
ける過冷却対ｌｏｇ　（氷核／細胞）の関係を示す。 第１９図Ａは、ｐＤＰ１４３の地図、Ｂは、ＥＮＡ−１
３６の制限酵素地図を示す。 第２０図は、ＹＤ４２＋ｐＤＰ１４３ＳＤ２培地での過
冷却対ｌｏｇ　（氷核／細胞）の関係を示す。 第２１図は、ｐｓｃ１２ｖＮの地図を示す。 第２２図Ａは、ｐＤＰ１３５の地図、ＢはＥＮＡ　−１
３３の制限酵素地図を示す。 第２３図は、ＬＭＯ２３０＋ｐＤＰ１３５Ｍ１７Ｇｌｕ
／Ｅｍにおける過冷却対ｌｏｇ　（氷核／細胞）の関係
を示す。 第２４図Ａは、ｐＤＰ１４Ｂの地図、ＢはＥＮＡ１３７
の制限酵素地図を示す。 第２５図は、ＬＭＯ２３０＋ｐＤＰ１４ＢＭ１１Ｇｌｕ
／Ｅｓにおける過冷却対ｌｏｇ　（氷核／細胞）の関係
を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）氷晶形成を促進できる蛋白質からなる０℃以下の
   温度における食用生物材料中の氷晶形成添加物であって
   、上記蛋白質はその発現をコードする１種または２種以
   上の遺伝子をもつベクターによって形質転換されたＧＲ
   ＡＳ微生物またはその微生物の分画に含まれ、上記ベク
   ターは正しい読み取り枠でクローニングベクターと氷晶
   形成を促進できる上記蛋白質をコードするＤＮＡ、およ
   び酵母微生物の場合には実質的に完全な酵母２ミクロン
   プラスミド、酵母の選択を可能にする少なくとも１種の
   栄養要求マーカーとＬＥＵ遺伝子のｄＬＥＵ２対立遺伝
   子、ならびに乳酸菌科ＧＲＡＳ微生物の場合にはさらに
   非誘導性エリスロマイシン抵抗性遺伝子と乳酸菌プラス
   ミドプロモーターおよび複製起源からなるプラスミドで
   ある添加物 （２）クローニングベクターは大腸菌クローニングベク
   ターである請求項（１）記載の添加物 （３）酵母ＧＲＡＳ微生物の場合ベクターは酵母細胞表
   面を標的とした融合蛋白質を産生するための酵母シグナ
   ル配列を包含する請求項（１）または（２）に記載の添
   加物 （４）酵母シグナル配列はＰＨ０５またはα因子プレプ
   ロリーダー配列である請求項（３）記載の添加物 （５）α因子配列は氷晶形成蛋白質をコードするＤＮＡ
   とリンカー配列によって分離されている請求項（４）記
   載の添加物 （６）ベクターは￥Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥ＮＣＩ
   ＭＢ４０２１５株に含有されるプラスミドｐＤＰ１４３
   である請求項（１）記載の添加物 （７）乳酸菌ＧＲＡＳ微生物の場合のベクターは￥Ｌ．
   ｌａｃｔｉｓ￥遺伝子のプロモーターを含有する請求項
   （１）記載の添加物 （８）乳酸菌科ＧＲＡＳ微生物の場合、ベクターは￥Ｌ
   ．ｌａｃｔｉｓ￥ＮＣＩＭＢ４０２１６株に含有される
   プラスミドｐＤＰ１４８である請求項（１）記載の添加
   物（９）正しい読み取り枠でクローニングベクター、０
   ℃以下の温度で氷晶形成を促進できる蛋白質をコードす
   るＤＮＡ、実質的に完全な酵母２ミクロンプラスミド、
   酵母を選択できる少なくとも１種の栄養要求マーカー、
   およびＬＥＵ２遺伝子のｄＬＥＵ２対立遺伝子からなる
   、ＧＲＡＳ酵母株の形質転換用プラスミド （１０）プラスミドｐＤＰ１４３ （１１）プラスミドｐＤＰ１４３で形質転換された￥Ｓ
   ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥ＮＣＩＭＢ４０２１５株（１
   ２）クローニングベクター、０℃以下の温度で氷晶形成
   を促進できる蛋白質をコードするＤＮＡ、非誘導性エリ
   スロマイシン抵抗性遺伝子および乳酸菌プラスミドプロ
   モーターからなる、ＧＲＡＳ乳酸菌科微生物の形質転換
   用プラスミド （１３）プラスミドｐＤＰ１４８ （１４）プラスミドｐＤＰ１４８で形質転換された￥Ｌ
   ．ｌａｃｔｉｓ￥ＮＣＩＭＢ４０２１６株（１５）プラ
   スミドｐＵＣ２１ＥＮＡ３ （１６）大腸菌ＮＣＩＭＢ４０２１７株 （１７）クローニングベクターは大腸菌クローニングベ
   クターである請求項（９）または（１２）記載のプラス
   ミド （１８）請求項（１）記載の添加物１種または２種以上
   が添加された食用生物材料 （１９）請求項（１）記載の添加物１種または２種以上
   が添加された野菜、果物、魚、肉、調理冷凍食品、アイ
   スクリーム、冷凍パン生地、冷凍ジュース、凍結乾燥食
   品、凍結乾燥医薬品および血液低温型沈殿物 （２０）食用生物材料を請求項（１）記載の添加物１種
   または２種以上で処理する食用生物材料にちおける氷晶
   形成を促進する方法 （２１）食用生物材料を請求項（１）記載の添加物で処
   理し、その温度を凍結が起こる温度まで低下させる食用
   生物材料の冷凍方法 （２２）温度は−５℃〜−２０℃の範囲の温度に低下さ
   せる請求項（２１）記載の方法