JPH03205559A - 生体試料のクロマトグラフイー分析法および液体クロマトグラフ装置 - Google Patents
生体試料のクロマトグラフイー分析法および液体クロマトグラフ装置Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、生体試料のクロマトグラフイー分析法および
液体クロマトグラフ装置に係り、特に血液試料又は髄液
試料中の生理物質をプレラベル化して測定するに好適な
分析法および分析装置に関する。
液体クロマトグラフ装置に係り、特に血液試料又は髄液
試料中の生理物質をプレラベル化して測定するに好適な
分析法および分析装置に関する。
血液や髄液などの生体液中に含まれるホルモン等の生理
物質は、含有量が微量であるが生体に与える生理的影響
が大きいので、これらの生理物質成分を分析検査して病
理学的な研究や診断に利用することが広く行われている
。
物質は、含有量が微量であるが生体に与える生理的影響
が大きいので、これらの生理物質成分を分析検査して病
理学的な研究や診断に利用することが広く行われている
。
生理物質の内のカテコールアミンやプロスタグランジン
などの局所ホルモンは、例えば血液中にピコグラム（１
０−１２ｇ）程度しか存在しないため、圧倒的に多量に
含まれる他の成分の影響を受けやすいので、液体クロマ
トグラフィーにより分離分析することや生理物質と蛍光
ラベル剤を反応させてラベル化し蛍光光度計によって測
定することが行われている。
などの局所ホルモンは、例えば血液中にピコグラム（１
０−１２ｇ）程度しか存在しないため、圧倒的に多量に
含まれる他の成分の影響を受けやすいので、液体クロマ
トグラフィーにより分離分析することや生理物質と蛍光
ラベル剤を反応させてラベル化し蛍光光度計によって測
定することが行われている。
カテコールアミン類をプレラベル法によってラベル化（
誘導体化）し、クロマトグラフィー分析する先行技術と
して、特開昭６１− ８８１４８号および特開昭６０−
１４３７６６号に記載された方法が知られている。
誘導体化）し、クロマトグラフィー分析する先行技術と
して、特開昭６１− ８８１４８号および特開昭６０−
１４３７６６号に記載された方法が知られている。
この内、特開昭６１− ８８１４８号では、試料にアル
ミナを添加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ
、吸着中にダンシル・クロリドを反応させてカテコール
アミンを誘導体化している。次いでアルミナから誘導体
化された試料を説着させ液を蒸発濃縮する。このように
して準備された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注
入して成分分離し蛍光を検出する。
ミナを添加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ
、吸着中にダンシル・クロリドを反応させてカテコール
アミンを誘導体化している。次いでアルミナから誘導体
化された試料を説着させ液を蒸発濃縮する。このように
して準備された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注
入して成分分離し蛍光を検出する。
また、特開昭６０−１４３７６６号では、血漿や尿など
の生体試料を流路内に注入したあと、その流路内に３種
の反応試薬を次々と導入し反応コイル内を流通させなが
らカテコールアミンをラベル化（誘導体化）している。
の生体試料を流路内に注入したあと、その流路内に３種
の反応試薬を次々と導入し反応コイル内を流通させなが
らカテコールアミンをラベル化（誘導体化）している。
このように処理した試料を濃縮カラムで捕捉濃縮した後
、分離カラムへ移送し戒分分離して蛍光を検出する。
、分離カラムへ移送し戒分分離して蛍光を検出する。
プロスタグランジンをプレラベル法によってラベル化し
、クロマトグラフー分析する先行技術としては、特開昭
６１− ９２５９９号および特開昭５８−１０８４５７
号に記載された方法が知られている。
、クロマトグラフー分析する先行技術としては、特開昭
６１− ９２５９９号および特開昭５８−１０８４５７
号に記載された方法が知られている。
この内、特開昭６１− ９２５９９は，高速液体クロマ
トグラフイーを用いてプロスタグランジンを分析する場
合に、試料を蛍光ラベル化しておき、その後分離カラム
で成分分離し蛍光検出器で測定する方法があることを示
唆している。特開昭６１−９２５９９にはこれ以上の詳
細な記載はない。
トグラフイーを用いてプロスタグランジンを分析する場
合に、試料を蛍光ラベル化しておき、その後分離カラム
で成分分離し蛍光検出器で測定する方法があることを示
唆している。特開昭６１−９２５９９にはこれ以上の詳
細な記載はない。
また、特開昭５８−１０８４５７では、生体試料を逆相
分配クロマトグラフイーに付して得たプロスタグランジ
ン含有液を乾固した後、溶解してカルボキシル基用蛍光
プレラベル剤と反応させ、プロスタグランジンをエステ
ル体にしている。このようにして準備された試料を液体
クロマトグラフの流路内へ注入して戒分分離し、蛍光検
出器で測定する．〔発明が解決しようとする課題〕 上述した先行技術の内、特開昭６１− ９２５９９号は
プレラベルの可能性を示唆しているだけにすぎず、特開
昭６１− ８８１４８号および特開昭５８−１０８４５
７号による方法では、液体クロマトグラフの流路内に注
入すべき試料を準備するための操作に時間がかかり、且
つ自動化が困難なために臨床検査などのルチーンワーク
には不向きである。
分配クロマトグラフイーに付して得たプロスタグランジ
ン含有液を乾固した後、溶解してカルボキシル基用蛍光
プレラベル剤と反応させ、プロスタグランジンをエステ
ル体にしている。このようにして準備された試料を液体
クロマトグラフの流路内へ注入して戒分分離し、蛍光検
出器で測定する．〔発明が解決しようとする課題〕 上述した先行技術の内、特開昭６１− ９２５９９号は
プレラベルの可能性を示唆しているだけにすぎず、特開
昭６１− ８８１４８号および特開昭５８−１０８４５
７号による方法では、液体クロマトグラフの流路内に注
入すべき試料を準備するための操作に時間がかかり、且
つ自動化が困難なために臨床検査などのルチーンワーク
には不向きである。
実用性の面に着目すれば、特開昭６０−１４３７６６号
に示されたようにプレラベル化した後生理物質を戒分分
離し蛍光測定する方法が有利である。
に示されたようにプレラベル化した後生理物質を戒分分
離し蛍光測定する方法が有利である。
プレラベル化法を利用したクロマトグラフイー分離によ
り血液試料や髄液試料中の生理物質の分析を発明者らは
試みたが、充分な測定精度が得られなかった。そのよう
な分析精度の低下は、試料中に存在する蛋白質に起因す
る。従って生理物質の高精度分析を達成するためには、
試料に対してあらかじめ除蛋白処理を施せばよいことに
なるが、沈澱分離法や限外ろ過膜法などにより試料を前
処理するには数段階の操作を必要とするため分析操作が
煩雑となる。さらに、除蛋白処理のために長時間を要す
ればその操作中に被検成分の分解や損失を生じるという
問題もある。
り血液試料や髄液試料中の生理物質の分析を発明者らは
試みたが、充分な測定精度が得られなかった。そのよう
な分析精度の低下は、試料中に存在する蛋白質に起因す
る。従って生理物質の高精度分析を達成するためには、
試料に対してあらかじめ除蛋白処理を施せばよいことに
なるが、沈澱分離法や限外ろ過膜法などにより試料を前
処理するには数段階の操作を必要とするため分析操作が
煩雑となる。さらに、除蛋白処理のために長時間を要す
ればその操作中に被検成分の分解や損失を生じるという
問題もある。
本発明の目的は、生体試料中に蛋白質が共存する状態で
生理物質の誘導体化反応を効率良く進めることができる
分析方法および分析装置を提供することにある。
生理物質の誘導体化反応を効率良く進めることができる
分析方法および分析装置を提供することにある。
本発明の他の目的は、生体試料中の生理物質の分解や損
失の少ない分析方法および分析装置を提供することにあ
る。
失の少ない分析方法および分析装置を提供することにあ
る。
本発明のもう１つの目的は、生理物質の誘導体化反応お
よび成分分離を簡便な分析操作で行うことができる分析
方法および分析装置を提供することにある。
よび成分分離を簡便な分析操作で行うことができる分析
方法および分析装置を提供することにある。
本発明においては、除蛋白処理されていない血液試料又
は髄液試料と、誘導体化試薬および希釈液が共存するよ
うに同じ容器に採取され、試料中の被検生理物質の誘導
体化反応を開始せしめる。
は髄液試料と、誘導体化試薬および希釈液が共存するよ
うに同じ容器に採取され、試料中の被検生理物質の誘導
体化反応を開始せしめる。
誘導体化反応の継続的進行は、その容器内で引き続き行
う場合と、その容器から流路内へ導入して流路内の所定
領域で引き続き行う場合とがある。
う場合と、その容器から流路内へ導入して流路内の所定
領域で引き続き行う場合とがある。
誘導体化反応のあと試料は分離カラムに導かれ、生理物
質を成分分離し、光学的検出器で検出する。
質を成分分離し、光学的検出器で検出する。
分離カラムへ導く前に除蛋白処理する場合と除蛋白処理
しない場合がある。除蛋白処理する場合は、希釈されて
いる試料を除蛋白カラムに供給し、被検生理物質を除蛋
白カラム内に吸着させながら蛋白質を排出する。除蛋白
処理しない場合は、分離カラムとして蛋白質の影響が極
めて小さい充填剤を含むものを用いる。
しない場合がある。除蛋白処理する場合は、希釈されて
いる試料を除蛋白カラムに供給し、被検生理物質を除蛋
白カラム内に吸着させながら蛋白質を排出する。除蛋白
処理しない場合は、分離カラムとして蛋白質の影響が極
めて小さい充填剤を含むものを用いる。
誘導体化反応を進める場合の試料は、希釈液によって８
〜２０倍に濃度希釈される。この場合、希釈試料中の蛋
白質の濃度は１％以下となる。誘導体化反応は、３０℃
以上であって６０℃以下の温度条件で進められる。
〜２０倍に濃度希釈される。この場合、希釈試料中の蛋
白質の濃度は１％以下となる。誘導体化反応は、３０℃
以上であって６０℃以下の温度条件で進められる。
血液試料や髄液試料のように蛋白質を５〜１０％含有す
る生体試料では、事前に除蛋白処理を施していない検体
に誘導体化試薬を加えても、カテコールアミンやプロス
タグランジンなどの生理物質の誘導体化がほとんど行わ
れない。発明者らの実験によりこの原因は、蛋白質が高
濃度に存在すると誘導体化試薬および反応促進剤が蛋白
質成分によって吸着されるためであるという知見が得ら
れた。
る生体試料では、事前に除蛋白処理を施していない検体
に誘導体化試薬を加えても、カテコールアミンやプロス
タグランジンなどの生理物質の誘導体化がほとんど行わ
れない。発明者らの実験によりこの原因は、蛋白質が高
濃度に存在すると誘導体化試薬および反応促進剤が蛋白
質成分によって吸着されるためであるという知見が得ら
れた。
一方、誘導体化試薬と生体試料が共存するときの液中の
蛋白質濃度が１％以下の場合には、生理物質の誘導体化
反応への蛋白質の影響が無視し得るほど小さくなり、誘
導体化反応が極めて効率的に行われることを発明者らは
見い出した。
蛋白質濃度が１％以下の場合には、生理物質の誘導体化
反応への蛋白質の影響が無視し得るほど小さくなり、誘
導体化反応が極めて効率的に行われることを発明者らは
見い出した。
本発明では、このような知見に基づき、誘導体化反応を
進める際に血液試料又は髄液試料を希釈液で８〜２０倍
容になるように希釈する。希釈液による希釈倍率は、検
体の種類や用いる誘導体化試薬の種類に応じて所望の値
に設定される。希釈倍率を一定に設定し得る構戒にする
ことにより、臨床検査を行う場合のように同種の検体を
多数処理するための分析装置の自動化を容易にする。
進める際に血液試料又は髄液試料を希釈液で８〜２０倍
容になるように希釈する。希釈液による希釈倍率は、検
体の種類や用いる誘導体化試薬の種類に応じて所望の値
に設定される。希釈倍率を一定に設定し得る構戒にする
ことにより、臨床検査を行う場合のように同種の検体を
多数処理するための分析装置の自動化を容易にする。
生体試料の希釈倍率を２０倍以下にするのは、試料を希
釈しすぎると含有量が微量な生理物質を測定する都合上
高い分析精度を維持し得るような高感度検出が困難にな
るためと、処理すべき液の全体容量を多すぎないように
するためである。
釈しすぎると含有量が微量な生理物質を測定する都合上
高い分析精度を維持し得るような高感度検出が困難にな
るためと、処理すべき液の全体容量を多すぎないように
するためである。
カテコールアミンやプロスタグランジンなどの生理物質
の誘導体化反応は３０〜６０℃の保温状態で進められる
。反応時の温度を３０℃以上に保つのは、室温より反応
温度を高めることにより温度制御を容易にするためと誘
導体化反応を促進させるためであり、６０℃以下にする
のは、高温にするほど蛋白質が比較的短時間で変性する
のを防止するためである。蛋白質が変性すると他の戊分
と共に共沈するため被検成分の測定値が実際の値よりも
低くなってしまうという問題がある。因に６０℃の温度
であっても保温時間が３分以下であれば蛋白質の変性は
認められなかった。
の誘導体化反応は３０〜６０℃の保温状態で進められる
。反応時の温度を３０℃以上に保つのは、室温より反応
温度を高めることにより温度制御を容易にするためと誘
導体化反応を促進させるためであり、６０℃以下にする
のは、高温にするほど蛋白質が比較的短時間で変性する
のを防止するためである。蛋白質が変性すると他の戊分
と共に共沈するため被検成分の測定値が実際の値よりも
低くなってしまうという問題がある。因に６０℃の温度
であっても保温時間が３分以下であれば蛋白質の変性は
認められなかった。
カテコールアミンをクロマトグラフイーによって分離す
ると、エピネフリン，ノルエビネフリンおよびドーパミ
ンなどの戊分の検出が可能となる。
ると、エピネフリン，ノルエビネフリンおよびドーパミ
ンなどの戊分の検出が可能となる。
また、プロスタグランジンをクロマトグラフイー分離す
ると、トロンボキサンＢｚｓプロスタグランジンＥ２，
６−ケトプロスグランジンＦｌαおよびプロスタグラン
ジンＥ１などの戒分の検出が可能となる。これらの生理
物質を誘導体化して蛍光や吸光や電導度による高感度検
出を可能にすることにより、微量成分の測定が可能にな
る。
ると、トロンボキサンＢｚｓプロスタグランジンＥ２，
６−ケトプロスグランジンＦｌαおよびプロスタグラン
ジンＥ１などの戒分の検出が可能となる。これらの生理
物質を誘導体化して蛍光や吸光や電導度による高感度検
出を可能にすることにより、微量成分の測定が可能にな
る。
生理物質を誘導体化すれば、本来の生理物質成分よりも
誘導体化威分の分子量が大きくなるので化学的安定性が
向上し、カラム充填剤への吸着性が高まる。この吸着性
の向上は、分離カラムの前段に除蛋白カラムを設けて生
理物質と蛋白質を分けるときに特に役立つ。除蛋白カラ
ムへ誘導体反応後の液を移送液で挟んで供給するように
連続的に流すと、誘導体化された生理物質は除蛋白カラ
ム内に留まるように吸着保持され、一方蛋白質は除蛋白
カラムから排出されるように流入後直ちに流出される。
誘導体化威分の分子量が大きくなるので化学的安定性が
向上し、カラム充填剤への吸着性が高まる。この吸着性
の向上は、分離カラムの前段に除蛋白カラムを設けて生
理物質と蛋白質を分けるときに特に役立つ。除蛋白カラ
ムへ誘導体反応後の液を移送液で挟んで供給するように
連続的に流すと、誘導体化された生理物質は除蛋白カラ
ム内に留まるように吸着保持され、一方蛋白質は除蛋白
カラムから排出されるように流入後直ちに流出される。
除蛋白カラムに充填される充填剤としては、内面逆相型
充填剤やイオン交換基が導入されたポリマー型充屓剤が
好適である。除蛋白カラムは、試料から蛋白質を除く機
能と共に希釈された生理物質を濃縮する機能を有してい
る。
充填剤やイオン交換基が導入されたポリマー型充屓剤が
好適である。除蛋白カラムは、試料から蛋白質を除く機
能と共に希釈された生理物質を濃縮する機能を有してい
る。
分離カラムとして蛋白質を吸着しない充填剤を充填した
ものを用いれば、分離カラムの前段に除蛋白カラムを設
けずに済む。そのような充填剤には、上述の除蛋白カラ
ムに用いた充填剤と同種のものを用いることができる。
ものを用いれば、分離カラムの前段に除蛋白カラムを設
けずに済む。そのような充填剤には、上述の除蛋白カラ
ムに用いた充填剤と同種のものを用いることができる。
この場合も生理物質を誘導体化して分子量を大きくした
ことによる有益性を生かすことができる。すな，おち、
誘導体化された生理物質と共存していた蛋白質は、導入
後速やかに分離カラムから溶出されるので、生理物質成
分と蛋白質との分離性能が向上される。
ことによる有益性を生かすことができる。すな，おち、
誘導体化された生理物質と共存していた蛋白質は、導入
後速やかに分離カラムから溶出されるので、生理物質成
分と蛋白質との分離性能が向上される。
本発明の望ましい実施例では、分析部へ注入すべき試料
を準備するためにオートサンプラが用いられる。このオ
ートサンプラは希釈液供給装置を備えており、その一構
或部分である可動ノズルが試料容器，試薬容器，標準液
容器，混合用容器，ノズル洗浄ポート，試料注入ボート
などの場所に位置づけられるように移動する。このノズ
ルは、混合用容器への試料の分注，混合用容器への誘導
体化試薬の分注，混合用容器への希釈液の分注，混合用
容器から分離分析部への混合液の供給などの働きを兼ね
るように動作制御される。
を準備するためにオートサンプラが用いられる。このオ
ートサンプラは希釈液供給装置を備えており、その一構
或部分である可動ノズルが試料容器，試薬容器，標準液
容器，混合用容器，ノズル洗浄ポート，試料注入ボート
などの場所に位置づけられるように移動する。このノズ
ルは、混合用容器への試料の分注，混合用容器への誘導
体化試薬の分注，混合用容器への希釈液の分注，混合用
容器から分離分析部への混合液の供給などの働きを兼ね
るように動作制御される。
本発明に基づく実施例では、除蛋白に先立って誘導体化
反応を行うように構成しており、例えば、カテコールア
ミンの誘導体化試薬である１，２一ジフエニルエチレン
ジアミン（ＤＰＥ）を用いて誘導体化反応を実施すると
カテコールアミン誘導体化は環状のフラグメントを４個
有する分子となる。これは誘導体化前のカテコールアミ
ンよりも環状フラグメントが３個多い分子であり、疎水
性もそれに見合って大きくなる。そのため、誘導体化さ
れた目的成分と蛋白成分とを小形のプレカラムで分離す
ることは容易になる。
反応を行うように構成しており、例えば、カテコールア
ミンの誘導体化試薬である１，２一ジフエニルエチレン
ジアミン（ＤＰＥ）を用いて誘導体化反応を実施すると
カテコールアミン誘導体化は環状のフラグメントを４個
有する分子となる。これは誘導体化前のカテコールアミ
ンよりも環状フラグメントが３個多い分子であり、疎水
性もそれに見合って大きくなる。そのため、誘導体化さ
れた目的成分と蛋白成分とを小形のプレカラムで分離す
ることは容易になる。
カテコールアミン誘導体化試薬としての蛍光ラベル剤に
は、例えば１，２−ジフェニルエチレンジアミン（ＤＰ
Ｅ）を用いることができる。準備される蛍光ラベル剤溶
液には，６０ｍＭのＤＰＥ、２ｍＭのフエリシアン化カ
リウム、４０％のアセトニトリルなどが含まれる。また
力テコールアミンを分離するために分離カラムに供給さ
れる溶離液は、例えばアセトニトリルとメタノールと水
溶液を５：２：４の割合で含む液が使用される。この場
合水溶液には、５０ｍＭの硝酸リチウムと１０ｍＭドデ
シル硫酸ナトリウムが含有される。
は、例えば１，２−ジフェニルエチレンジアミン（ＤＰ
Ｅ）を用いることができる。準備される蛍光ラベル剤溶
液には，６０ｍＭのＤＰＥ、２ｍＭのフエリシアン化カ
リウム、４０％のアセトニトリルなどが含まれる。また
力テコールアミンを分離するために分離カラムに供給さ
れる溶離液は、例えばアセトニトリルとメタノールと水
溶液を５：２：４の割合で含む液が使用される。この場
合水溶液には、５０ｍＭの硝酸リチウムと１０ｍＭドデ
シル硫酸ナトリウムが含有される。
プロスタグランジンの誘導体化試薬としての蛍光ラベル
剤には、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を用いるこ
とができる。準備される蛍光ラベル剤溶液には、６ｍＭ
のＭＤＣ，８６ｍＭのジェチルホスホロシアニテート（
ＤＥＰＣ）などが含まれる。またプロスタグランジンを
分離するための溶離液には、水とテトラヒドロフランと
アセトニトリルからなる系の液を使用することができる
。蛍光検出器の励起波長は３４０ｎｍ，蛍光波長は５２
０ｎｍが好ましい。
剤には、モノダンシルカダベリン（ＭＤＣ）を用いるこ
とができる。準備される蛍光ラベル剤溶液には、６ｍＭ
のＭＤＣ，８６ｍＭのジェチルホスホロシアニテート（
ＤＥＰＣ）などが含まれる。またプロスタグランジンを
分離するための溶離液には、水とテトラヒドロフランと
アセトニトリルからなる系の液を使用することができる
。蛍光検出器の励起波長は３４０ｎｍ，蛍光波長は５２
０ｎｍが好ましい。
以下には、単一の分離カラムを用いる例を示すが、この
場合、分離カラムを複数本用いる場合に比べて機構が簡
素で済む。本発明が好適に適用される生体試料は、血漿
，血清，髄液などである。
場合、分離カラムを複数本用いる場合に比べて機構が簡
素で済む。本発明が好適に適用される生体試料は、血漿
，血清，髄液などである。
本発明を適用したカテコールアミン自動分析装置の例を
図面を参照して以下に説明する。
図面を参照して以下に説明する。
第１図は、カテコールアミン自動分析装置の全体構成を
示す概略図である。この装置は、各種容器や分注機構を
備えた試料供給部２６と、流路系内で試料の濃縮動作や
分離動作を行う濃縮・分離部４４を有する。以下では、
試料供給部２６を便宜上オートサンプラと称し、濃縮・
分離部４４を分析部と称する。
示す概略図である。この装置は、各種容器や分注機構を
備えた試料供給部２６と、流路系内で試料の濃縮動作や
分離動作を行う濃縮・分離部４４を有する。以下では、
試料供給部２６を便宜上オートサンプラと称し、濃縮・
分離部４４を分析部と称する。
オートサンプラ２６は、非可動部又は反応処理部９ｏお
よび着脱可能なサンプルラック２７を備えている。オー
トサンプラ２６のサンプルステージ２８には、サンプル
ラツク２７が装填される。
よび着脱可能なサンプルラック２７を備えている。オー
トサンプラ２６のサンプルステージ２８には、サンプル
ラツク２７が装填される。
サンプルラツク２７は、血漿試料を収容した複数の試料
容器を保持している。またサンプルラツク２７には、蛍
光ラベリング用の反応試薬容器３０，内部標準液容器３
１，標準サンプル容器３２が配置されている。このオー
トサンプラ２６では、サンプルステージ２８に近接した
固定位置に、反応容器３３，ノズル洗浄槽３４，ドレイ
ンボート３５．注入ポート３６が設けられている。
容器を保持している。またサンプルラツク２７には、蛍
光ラベリング用の反応試薬容器３０，内部標準液容器３
１，標準サンプル容器３２が配置されている。このオー
トサンプラ２６では、サンプルステージ２８に近接した
固定位置に、反応容器３３，ノズル洗浄槽３４，ドレイ
ンボート３５．注入ポート３６が設けられている。
分注ノズル３８は、試料や試薬を反応容器３３ヘビペツ
テイングにより分注したり、反応した試料を反応容器３
３から注入ボート３６へ移す働きをする。鮭動機構３７
はＸＹＺの駈動機能を有し、分注ノズル３８を縦横上下
自在に岨動して、前記サンプラー上の容器やボートの位
置に移動させることが出来る。分注ノズル３８の上端は
プラスチックチューブなどの細管３９により三方弁４０
を介して、分注ポンプ４１．および希釈液兼洗浄液槽４
２に連結されている。分注ボンプ４１はパルスモーター
で駐動されるシリンジポンプを使用している。恒温ブロ
ック８０は反応容器３３の温度を所定の条件に保つため
に設けられている。またサンプルステージ２８にはサン
プルラツク２７上のサンプルや試薬を、分析中低温に保
つよう冷却装置が組込まれている。
テイングにより分注したり、反応した試料を反応容器３
３から注入ボート３６へ移す働きをする。鮭動機構３７
はＸＹＺの駈動機能を有し、分注ノズル３８を縦横上下
自在に岨動して、前記サンプラー上の容器やボートの位
置に移動させることが出来る。分注ノズル３８の上端は
プラスチックチューブなどの細管３９により三方弁４０
を介して、分注ポンプ４１．および希釈液兼洗浄液槽４
２に連結されている。分注ボンプ４１はパルスモーター
で駐動されるシリンジポンプを使用している。恒温ブロ
ック８０は反応容器３３の温度を所定の条件に保つため
に設けられている。またサンプルステージ２８にはサン
プルラツク２７上のサンプルや試薬を、分析中低温に保
つよう冷却装置が組込まれている。
分析部４４はサンプルの濃縮と不要物除去を行なうブリ
カラム流路系，サンプル成分の分離を行なう分離カラム
流路系、および測定演算部からなる。ブリカラム流路系
では、液槽４５の移送・洗浄液がボンプ４６により一定
流速で送液され、試料導入弁４７を経由して除蛋白カラ
ム４８に流れている。試料導入弁４７にはオートサンプ
ラの注入ボート３６から注入されたサンプル液を所定量
計量して分析部に導入するための計量管４９が設けられ
ている。
カラム流路系，サンプル成分の分離を行なう分離カラム
流路系、および測定演算部からなる。ブリカラム流路系
では、液槽４５の移送・洗浄液がボンプ４６により一定
流速で送液され、試料導入弁４７を経由して除蛋白カラ
ム４８に流れている。試料導入弁４７にはオートサンプ
ラの注入ボート３６から注入されたサンプル液を所定量
計量して分析部に導入するための計量管４９が設けられ
ている。
分離カラム流路系では溶離液槽５０の溶離液がポンプ５
１により一定流速で送液され、カラム切換弁５２を経由
して単一の分離カラム５３に流れている。カラム切換弁
５２を切換えることにより溶離液は除蚤白カラム４８を
経由して流れ、ブリカラム４８で処理されたサンプルを
分離カラム５３に移送する。測定演算部は分離カラム５
３から溶出するサンプル成分の蛍光強度を測定する蛍光
光度計５４および測定結果の演算処理および表示を行な
うためのＡ／Ｄ変換部５５，制御部５６，プリンタ５７
，ＣＲＴ５８などからなり、蛍光光度計５４にはブロー
セル５９を有する。切換弁６０．６１はポンプ４６．５
１内の液を必要時にパージ出来るよう設けられている。
１により一定流速で送液され、カラム切換弁５２を経由
して単一の分離カラム５３に流れている。カラム切換弁
５２を切換えることにより溶離液は除蚤白カラム４８を
経由して流れ、ブリカラム４８で処理されたサンプルを
分離カラム５３に移送する。測定演算部は分離カラム５
３から溶出するサンプル成分の蛍光強度を測定する蛍光
光度計５４および測定結果の演算処理および表示を行な
うためのＡ／Ｄ変換部５５，制御部５６，プリンタ５７
，ＣＲＴ５８などからなり、蛍光光度計５４にはブロー
セル５９を有する。切換弁６０．６１はポンプ４６．５
１内の液を必要時にパージ出来るよう設けられている。
生体試料の誘導体化反応を進める場合に混合用容器又は
反応容器３３へ分注する希釈液は、誘導体化反応を阻害
せず蛋白質を変性させないものを用いる。槽４２に収容
しノズル３８から吐出される希釈液は、水、０．１ Ｍ
程度の濃度の塩化ナトリウム水溶液のような中性塩水溶
液、および０．１Ｍ程度の濃度のりん酸緩衝液（約ｐＨ
７）などの中から選ばれる。容器３３への試料と誘導体
化試薬と希釈液の添加順序は、この実施例の順序でなけ
ればならないものではなく、装置構或の都合上適宜変更
してよい。誘導体化反応が試料を希釈した状態で進めら
れればよいのである。
反応容器３３へ分注する希釈液は、誘導体化反応を阻害
せず蛋白質を変性させないものを用いる。槽４２に収容
しノズル３８から吐出される希釈液は、水、０．１ Ｍ
程度の濃度の塩化ナトリウム水溶液のような中性塩水溶
液、および０．１Ｍ程度の濃度のりん酸緩衝液（約ｐＨ
７）などの中から選ばれる。容器３３への試料と誘導体
化試薬と希釈液の添加順序は、この実施例の順序でなけ
ればならないものではなく、装置構或の都合上適宜変更
してよい。誘導体化反応が試料を希釈した状態で進めら
れればよいのである。
液槽４５に収容された移送液は、計量管４９内の試料を
押し出すようにして除蛋白カラム４８へ移送するために
用いられるが、この移送液としては、０．１ Ｍ程度の
濃度の塩化ナＩ−リウム水溶液を用いる。この移送液は
、除蛋白カラム４８内の充填剤と相まって生理物質の吸
着を高め蛋白質の排出を容易にする。
押し出すようにして除蛋白カラム４８へ移送するために
用いられるが、この移送液としては、０．１ Ｍ程度の
濃度の塩化ナＩ−リウム水溶液を用いる。この移送液は
、除蛋白カラム４８内の充填剤と相まって生理物質の吸
着を高め蛋白質の排出を容易にする。
第１図の実施例のように除蛋白カラム４８を設ける場合
には、分離カラム５３内に充填される充填剤は、例えば
直鎖アルキル基を有するシリカ系充填剤又はスチレンジ
ビニルベンゼンやポリビニルアルコールやメタクリレー
ｌ・のようなポリマーゲル系充填の如き逆相型充填剤が
好適である。この場合の分離カラム５３へ供給される溶
離液は、アセトニトル（ＣＨｓＣＮ）とメタノール（Ｃ
Ｈ ａＯＨ ）と水を含む液が使用される。液槽５０に
収容される溶離液は、除蛋白カラムから吸着されている
生理物質を脱離するためにも使用される。
には、分離カラム５３内に充填される充填剤は、例えば
直鎖アルキル基を有するシリカ系充填剤又はスチレンジ
ビニルベンゼンやポリビニルアルコールやメタクリレー
ｌ・のようなポリマーゲル系充填の如き逆相型充填剤が
好適である。この場合の分離カラム５３へ供給される溶
離液は、アセトニトル（ＣＨｓＣＮ）とメタノール（Ｃ
Ｈ ａＯＨ ）と水を含む液が使用される。液槽５０に
収容される溶離液は、除蛋白カラムから吸着されている
生理物質を脱離するためにも使用される。
第１図の分析装置による分析操作は、オートサンプラ上
での試料中の生理物質の誘導体化操作，除蛋白カラムに
よる蛋白質成分の除去および生理物質の濃縮、分離カラ
ムによる生理物質戊分の分離および測定、の順序で行わ
れる。
での試料中の生理物質の誘導体化操作，除蛋白カラムに
よる蛋白質成分の除去および生理物質の濃縮、分離カラ
ムによる生理物質戊分の分離および測定、の順序で行わ
れる。
第１図のクロマトグラフイ一利用力テコールアミン分析
装置における分析操作を、第２図のフローチャートを参
照して説明する。
装置における分析操作を、第２図のフローチャートを参
照して説明する。
星息稟ｌ夫企
ステップ１０１の分析動作開始のあと、ステップ１０２
で反応容器３３が洗浄される。この際分注ノズル３８を
反応容器３３の位置まで移動し、ボンプ４１を動作させ
洗浄液槽４２からの洗浄液を反応容器へ注入する。注入
量は反応容器３３の容量より多量に注入し、余剰の洗浄
液はオーバーフローさせドレインボート３５から排出管
４３の方へ排出させる。次いで、ノズル３８を反応容器
３３の底に降下させ容器内の洗浄液を吸いあげ、ノズル
３８をドレインボート３５に移動させて吸い上げた液を
排出する。この動作に先だち吸いあげた汚れた洗浄液が
ノズル内の新鮮な洗浄液に拡散しないよう予めノズル３
８の先端に若干量の空気を吸っておく必要がある（吸引
に先だち気泡を吸って境界を作っておく作業は、後のサ
ンプルや試薬を吸いあげる場合にも必要であるが、説明
が繁雑になるので以後の説明では省略する。）。以上の
動作を複数回（例えば３回）繰り返すことにより反応容
器３３の洗浄が終る。
で反応容器３３が洗浄される。この際分注ノズル３８を
反応容器３３の位置まで移動し、ボンプ４１を動作させ
洗浄液槽４２からの洗浄液を反応容器へ注入する。注入
量は反応容器３３の容量より多量に注入し、余剰の洗浄
液はオーバーフローさせドレインボート３５から排出管
４３の方へ排出させる。次いで、ノズル３８を反応容器
３３の底に降下させ容器内の洗浄液を吸いあげ、ノズル
３８をドレインボート３５に移動させて吸い上げた液を
排出する。この動作に先だち吸いあげた汚れた洗浄液が
ノズル内の新鮮な洗浄液に拡散しないよう予めノズル３
８の先端に若干量の空気を吸っておく必要がある（吸引
に先だち気泡を吸って境界を作っておく作業は、後のサ
ンプルや試薬を吸いあげる場合にも必要であるが、説明
が繁雑になるので以後の説明では省略する。）。以上の
動作を複数回（例えば３回）繰り返すことにより反応容
器３３の洗浄が終る。
の ゞおよび
ステップ１０３では、反応容器への血液試料（サンプル
）の分注と希釈動作が行われる。ノズル３８を内部標準
液容器３１の位置に移動し、容器内に降下させて所定量
吸引し、ついで分析する試料容器２９の位置に移動し、
所定量のサンプルを吸引した後、ノズル３８を反応容器
３３の位置に移動させ、吸引保持されているサンプルと
内部標準液を反応容器３３に吐出分注する。内部標準液
は、カラムの回収率の変動などを補正するために使用さ
れる標準液である。
）の分注と希釈動作が行われる。ノズル３８を内部標準
液容器３１の位置に移動し、容器内に降下させて所定量
吸引し、ついで分析する試料容器２９の位置に移動し、
所定量のサンプルを吸引した後、ノズル３８を反応容器
３３の位置に移動させ、吸引保持されているサンプルと
内部標準液を反応容器３３に吐出分注する。内部標準液
は、カラムの回収率の変動などを補正するために使用さ
れる標準液である。
この内部標準液の添加は必ずしも必要ではない。
この後、三方弁４０を切換えて液槽４２内の希釈液を分
注ボンプ４１内に所定量吸引する。次いで三方弁４０を
再度切換えて分注ボンプ４ｌのシリンジを押し出すこと
によって、ノズル３８の先端から試料の１０倍容の希釈
液を反応容器３３内へ吐出する。この分注ポンプ４１の
動作および鄭動機構３７の動作は、制御部５６によって
制御される。この例では、採取サンプル量が０．１ｍＲ
であり、希釈液添加量が１．０ｍＱ である。希釈
液の添加によりサンプルは希釈される。
注ボンプ４１内に所定量吸引する。次いで三方弁４０を
再度切換えて分注ボンプ４ｌのシリンジを押し出すこと
によって、ノズル３８の先端から試料の１０倍容の希釈
液を反応容器３３内へ吐出する。この分注ポンプ４１の
動作および鄭動機構３７の動作は、制御部５６によって
制御される。この例では、採取サンプル量が０．１ｍＲ
であり、希釈液添加量が１．０ｍＱ である。希釈
液の添加によりサンプルは希釈される。
２仁Ｚ涛１ｂ４
ステップ１０４では、ノズル３８を洗浄する。
この場合、ノズル３８をドレインポート３５に移動し、
ノズル３８内から洗浄液を吐出して、内部標準液および
サンプルによるノズル３８の内壁の汚れを洗い出した後
、ノズルを洗浄槽３４に移動して槽内に降下させ、洗浄
液を吐出してノズル３８の先端外側を洗浄する。
ノズル３８内から洗浄液を吐出して、内部標準液および
サンプルによるノズル３８の内壁の汚れを洗い出した後
、ノズルを洗浄槽３４に移動して槽内に降下させ、洗浄
液を吐出してノズル３８の先端外側を洗浄する。
芙薬牙止監査
ステップ１０５では、反応容器３３へ誘導体化試薬を加
える。ノズル３８を試薬容器３０の位置に移動し、ノズ
ル内に誘導体化試薬液を所定量吸入保持した後、ノズル
を反応容器３３上に移動し、反応容器３３に注入し先に
注入されているサンプルおよび内部標準液と混合させる
。混合はこの他に、ノズル内に予め空気を吸引しておき
、容器内に挿入して空気を吐出する方法や、外部から機
械的または電気的に容器を振動させる方法などにより行
うこともできるが、混合しやすい液体で且つ吐出量が比
較的多量であれば高速度で吐出するだけで可能な場合も
ある。
える。ノズル３８を試薬容器３０の位置に移動し、ノズ
ル内に誘導体化試薬液を所定量吸入保持した後、ノズル
を反応容器３３上に移動し、反応容器３３に注入し先に
注入されているサンプルおよび内部標準液と混合させる
。混合はこの他に、ノズル内に予め空気を吸引しておき
、容器内に挿入して空気を吐出する方法や、外部から機
械的または電気的に容器を振動させる方法などにより行
うこともできるが、混合しやすい液体で且つ吐出量が比
較的多量であれば高速度で吐出するだけで可能な場合も
ある。
反息
ステップ１０６では、希釈されたサンプルのカテコール
アミン類に対する蛍光性物質への誘導体化が行われるよ
うに蛍光ラベリング反応を開始させる。反応容器３３内
におけるサンプル誘導体化試薬との混合液（以下サンプ
ル液と称する）を、一定温度に保温された反応容器３３
内で所定時間放置して反応を進行させ、蛍光ラベリング
を行う。
アミン類に対する蛍光性物質への誘導体化が行われるよ
うに蛍光ラベリング反応を開始させる。反応容器３３内
におけるサンプル誘導体化試薬との混合液（以下サンプ
ル液と称する）を、一定温度に保温された反応容器３３
内で所定時間放置して反応を進行させ、蛍光ラベリング
を行う。
計量管へのサンプル導入
ステップ１０７では、反応容器３３内の反応液を計量管
４９内へ導入する。反応容器３３内で実質的に反応の終
了した誘導体化されたサンプル液をノズル３８内に吸引
し、ノズルを注入ポート３６へ移動してその中に挿入し
、試料導入弁４７を第１図の如き状態にして試料計量管
４９へ希釈サンプル液を注入する。計量管４９がサンプ
ル液で満たされた後試料導入弁４７を切換えると、切換
弁４７ポートに接続されている計量管４９は、流路６２
と流路６３の間に接続され、移送液の流れにより所定量
のサンプル液が除蛋白カラム４８へ移送される。
４９内へ導入する。反応容器３３内で実質的に反応の終
了した誘導体化されたサンプル液をノズル３８内に吸引
し、ノズルを注入ポート３６へ移動してその中に挿入し
、試料導入弁４７を第１図の如き状態にして試料計量管
４９へ希釈サンプル液を注入する。計量管４９がサンプ
ル液で満たされた後試料導入弁４７を切換えると、切換
弁４７ポートに接続されている計量管４９は、流路６２
と流路６３の間に接続され、移送液の流れにより所定量
のサンプル液が除蛋白カラム４８へ移送される。
濃縮および除蛋白
ステップ１０８では、除蛋白カラム４８内への誘導体化
されたカテコールアミン類の捕捉と蛋白質成分や過剰試
薬の除去が行われ、同時にサンプル液の濃縮が行われる
。移送・洗浄液の流れにより除蛋白カラム４８にサンプ
ル液が導入されると、除蛋白カラム４８内にはサンプル
中の生理物質が吸着捕捉され蓄積される。このとき測定
の妨害となる不要物である蛋白質や過剰試薬が除蛋白カ
ラムを通過して排出口６４を経て排出される。
されたカテコールアミン類の捕捉と蛋白質成分や過剰試
薬の除去が行われ、同時にサンプル液の濃縮が行われる
。移送・洗浄液の流れにより除蛋白カラム４８にサンプ
ル液が導入されると、除蛋白カラム４８内にはサンプル
中の生理物質が吸着捕捉され蓄積される。このとき測定
の妨害となる不要物である蛋白質や過剰試薬が除蛋白カ
ラムを通過して排出口６４を経て排出される。
烹Ｚ１μ隻送
ステップ１０９では、不要物を除去されて捕捉されてい
る生理物質を除蛋白カラム４８から脱離し、分離カラム
５３へ導く。第１図に実線図示の状態から破線の状態に
カラム切換弁５２を切換えると、除蛋白カラム４８は流
路６５，６６の間に接続され、溶離液は除蛋白カラム４
８を経由して流れ，ブリカラム４８に濃縮されたサンプ
ルを解離して分離カラム５３に送り、分離が開始される
。
る生理物質を除蛋白カラム４８から脱離し、分離カラム
５３へ導く。第１図に実線図示の状態から破線の状態に
カラム切換弁５２を切換えると、除蛋白カラム４８は流
路６５，６６の間に接続され、溶離液は除蛋白カラム４
８を経由して流れ，ブリカラム４８に濃縮されたサンプ
ルを解離して分離カラム５３に送り、分離が開始される
。
全サンプルが流路６６に移動した時点で、カラム切換弁
Ｓ２を再び切換える（図示の実線状態となる）と溶離液
は除蛋白カラム４８を経由せず直接分離カラム５３に流
れ、除蛋白カラム４８には移動・洗浄液が流れ始める。
Ｓ２を再び切換える（図示の実線状態となる）と溶離液
は除蛋白カラム４８を経由せず直接分離カラム５３に流
れ、除蛋白カラム４８には移動・洗浄液が流れ始める。
允蔓
ステップ１１０では、引きつづき溶離液を分離カラム５
３に流し、カテコールアミン類の戊分分離が行われ、ノ
ルエピネフリン（ＮＥ），エピネフリン（Ｅ），ドーパ
ミン（ＤＡ）が成分バンドを形戊して分離カラムから容
出される。
３に流し、カテコールアミン類の戊分分離が行われ、ノ
ルエピネフリン（ＮＥ），エピネフリン（Ｅ），ドーパ
ミン（ＤＡ）が成分バンドを形戊して分離カラムから容
出される。
亀髪亘裏ｉ人委生
ステップ１１０のサンプル成分の分離と並行して、ステ
ップ１１１ではカラム４８に移送・洗浄液を流し、つぎ
のサンプルを受入れられる状態に復元させる。
ップ１１１ではカラム４８に移送・洗浄液を流し、つぎ
のサンプルを受入れられる状態に復元させる。
災足
ステップ１１２では、分離カラム５３からの溶出液が蛍
光光度計５４によって観測される。
光光度計５４によって観測される。
分離カラム５３により分離され溶出したサンプル成分は
順次蛍光光度計５４のフローセル５９に流れ、分離され
た各成分の蛍光強度を検出し、演算処理して各成分の濃
度を求める。
順次蛍光光度計５４のフローセル５９に流れ、分離され
た各成分の蛍光強度を検出し、演算処理して各成分の濃
度を求める。
工：ｊｊＩＬ１迅』−
ステップ１１３では、ステップ１１２で得たデータをプ
リンター５７，ＣＲＴ５８、などにより表示出力する。
リンター５７，ＣＲＴ５８、などにより表示出力する。
ステップ１１４では、オートサンプラ２６上の試料がす
べて処理されたかどうかが判断され、まだ残っていれば
ステップ１０２に戻り、すべて処理されていればステッ
プ１１５に進んで装置の分析動作が終了する。
べて処理されたかどうかが判断され、まだ残っていれば
ステップ１０２に戻り、すべて処理されていればステッ
プ１１５に進んで装置の分析動作が終了する。
以上一検体についての分析手順を説明したが、つづいて
多数検体連続処理の手順について説明する。第３図Ａお
よび第３図Ｂにその分析プログラムの一例を示す。
多数検体連続処理の手順について説明する。第３図Ａお
よび第３図Ｂにその分析プログラムの一例を示す。
図の縦軸は、先に説明した分析フローチャートの作業内
容を工程１，２．３に区別して示している。第１工程は
主としてサンプルを誘導体化するためオートサンプラ上
での作業、第２工程は除蛋白カラムよるサンプルの濃縮
と除蛋白作業、第３工程は分離カラムによるサンプル成
分の分離および測定作業であり、各工程の境界区分はそ
れぞれの工程の時間配分がプログラム上適当になるよう
区分されている。横軸は進行する分析プログラムのサイ
クル数と経過時間を示す。プログラムは１サイクル内で
第１．２．３各工程の作業がそれぞれ一巡するよう組ま
れている。
容を工程１，２．３に区別して示している。第１工程は
主としてサンプルを誘導体化するためオートサンプラ上
での作業、第２工程は除蛋白カラムよるサンプルの濃縮
と除蛋白作業、第３工程は分離カラムによるサンプル成
分の分離および測定作業であり、各工程の境界区分はそ
れぞれの工程の時間配分がプログラム上適当になるよう
区分されている。横軸は進行する分析プログラムのサイ
クル数と経過時間を示す。プログラムは１サイクル内で
第１．２．３各工程の作業がそれぞれ一巡するよう組ま
れている。
第３図Ａはｎ番目の検体の分析する状態を中心に示した
のである。実線太線がその状態を示す。
のである。実線太線がその状態を示す。
実線細線は（ｎ＋１）番目と（ｎ−１）番目の検体、鎖
線は（ｎ−２）番目と（ｎ＋２）・番目の検体の状態を
示している。第３図Ｂには切換弁の動作を示している。
線は（ｎ−２）番目と（ｎ＋２）・番目の検体の状態を
示している。第３図Ｂには切換弁の動作を示している。
試料導入弁４７の「計量」状態ａはサンプル液を注入ボ
ート３６から計量管４９に注入出来る状態すなわち、第
工図に図示された状態、「移送」状態ｂは弁が切換ゎり
計量管４９が除蛋白カラム流路に接続された状態を示す
。また、カラムの切換弁５２の「接続」状態Ｃはブリカ
ラム４８が分離カラム流路に接続された状態、「並行処
理」状態ｄは切離されて移送・洗浄液が流れている状態
すなわち第１図実線で図示された状態を示す。各切換弁
の動作も１サイクル毎の繰り返し動作を行なう。
ート３６から計量管４９に注入出来る状態すなわち、第
工図に図示された状態、「移送」状態ｂは弁が切換ゎり
計量管４９が除蛋白カラム流路に接続された状態を示す
。また、カラムの切換弁５２の「接続」状態Ｃはブリカ
ラム４８が分離カラム流路に接続された状態、「並行処
理」状態ｄは切離されて移送・洗浄液が流れている状態
すなわち第１図実線で図示された状態を示す。各切換弁
の動作も１サイクル毎の繰り返し動作を行なう。
分析操作は、第１検体（１番目に分析する検体）の分析
を第１サイクルで開始し、つづいて１サイクル毎に順次
オートサンプラ上のサンプルの分析を開始させることに
より進行する゜。第３図Ａは第ｎサイクルから第（ｎ＋
２）サイクルにおける作業状態を示している。すなわち
第ｎサイクルに第ｎ検体（ｎ番目に分析する検体）の分
析が開始し、第１工程の作業が行われる。これと並行し
て先に分析を開始している第（ｎ−１）の第２工程の作
業、および第（ｎ−２）検体の第３工程の作業が進んで
いる。次いで第（ｎ＋１）サイクルおいては、第ｎ検体
は第２工程の作業に進み、っぎの第（ｎ＋１）検体の第
１工程の作業が開始される。
を第１サイクルで開始し、つづいて１サイクル毎に順次
オートサンプラ上のサンプルの分析を開始させることに
より進行する゜。第３図Ａは第ｎサイクルから第（ｎ＋
２）サイクルにおける作業状態を示している。すなわち
第ｎサイクルに第ｎ検体（ｎ番目に分析する検体）の分
析が開始し、第１工程の作業が行われる。これと並行し
て先に分析を開始している第（ｎ−１）の第２工程の作
業、および第（ｎ−２）検体の第３工程の作業が進んで
いる。次いで第（ｎ＋１）サイクルおいては、第ｎ検体
は第２工程の作業に進み、っぎの第（ｎ＋１）検体の第
１工程の作業が開始される。
これと並行して第（ｎ−１）検体の第３工程の作業が行
われている。さらに第（ｎ＋２）サイクルにおいては第
ｎ検体の第３工程の作業、第（ｎ＋１）検体の第２工程
の作業が行われ、つぎに第（ｎ＋２）検体の第１工程の
作業が開始される。
われている。さらに第（ｎ＋２）サイクルにおいては第
ｎ検体の第３工程の作業、第（ｎ＋１）検体の第２工程
の作業が行われ、つぎに第（ｎ＋２）検体の第１工程の
作業が開始される。
以上説明した分析手順により、本装置の分析処理時間は
、一検体のみ分析する場合には第１，第２，第３工程の
合計時間すなわち３サイクルの時間が必要であるが、複
数の検体を連続して分析する場合はエサイクル毎に１検
体ずつ分析が出来る。
、一検体のみ分析する場合には第１，第２，第３工程の
合計時間すなわち３サイクルの時間が必要であるが、複
数の検体を連続して分析する場合はエサイクル毎に１検
体ずつ分析が出来る。
本実施例では１サイクルの時間が５分であるため、一検
体当りの必要時間は５分となる。
体当りの必要時間は５分となる。
カテコールアミン類のクロマトグラフイーにおいては、
１時間に１０検体以上の処理能力を持つことが望ましい
ので、１サイクルの時間は、６分以内とされる。
１時間に１０検体以上の処理能力を持つことが望ましい
ので、１サイクルの時間は、６分以内とされる。
第４図は、第１図の実施例のオートサンプラ２６の平面
図である。サンプルステージ２８上に着脱可能なサンプ
ルラツク２７には、試料容器挿入口７０が横１０個、縦
５列の計５０個所マトリックス状に設けられており、こ
れに分析すべきサンプルを収容した試料容器が装填され
て配列される。サンプルラツク２７上には、また誘導体
化試薬３０，内部標準液３１，標準サンプル３２の置き
場があり、さらに分析中緊急割込測定が出来るよう、緊
急検体容器挿入口７ １ ａ，７ ｌ ｂ，７ １ ｃ
が設けられている。またサンプルラツク２７の側方には
反応容器３３，ノズル洗浄槽３４，ドレインポート３５
，計量管４９への注入ポート３６がそれぞれ固定の位置
に設けられている。分注ノズル３８は移動体３の軸４上
を滑動し得る保持部５に保持されており、駆動機構３７
により縦，横，上下のＸ，Ｙ，Ｚ方向に自在に軛動され
、上記各容器あるいはポートの位置に随時位置づけられ
、必要な作業を行なう。
図である。サンプルステージ２８上に着脱可能なサンプ
ルラツク２７には、試料容器挿入口７０が横１０個、縦
５列の計５０個所マトリックス状に設けられており、こ
れに分析すべきサンプルを収容した試料容器が装填され
て配列される。サンプルラツク２７上には、また誘導体
化試薬３０，内部標準液３１，標準サンプル３２の置き
場があり、さらに分析中緊急割込測定が出来るよう、緊
急検体容器挿入口７ １ ａ，７ ｌ ｂ，７ １ ｃ
が設けられている。またサンプルラツク２７の側方には
反応容器３３，ノズル洗浄槽３４，ドレインポート３５
，計量管４９への注入ポート３６がそれぞれ固定の位置
に設けられている。分注ノズル３８は移動体３の軸４上
を滑動し得る保持部５に保持されており、駆動機構３７
により縦，横，上下のＸ，Ｙ，Ｚ方向に自在に軛動され
、上記各容器あるいはポートの位置に随時位置づけられ
、必要な作業を行なう。
分析操作は、上記分析すべきサンプルや試薬を配置した
サンプルラック２７をオートサンプラ２６のサンプルス
テージ２８に装着し、オペレータが操作パネル７７の分
析スタートスイッチを押すことにより開始される。
サンプルラック２７をオートサンプラ２６のサンプルス
テージ２８に装着し、オペレータが操作パネル７７の分
析スタートスイッチを押すことにより開始される。
第５図Ａ，第５図Ｂは本実施例の装置の構成配置図であ
る。このカテコールアミン分析装置は縦形で分析に必要
な各ユニットを全部組込んだ構或となっている。
る。このカテコールアミン分析装置は縦形で分析に必要
な各ユニットを全部組込んだ構或となっている。
装置は二段に仕切られ、上段にはオートサンプラ２６，
蛍光光度計５４，カラムパネル７２が配置されており，
カラムパネル７２には除蛋白カラム４８，分離カラム５
３，試料導入弁４７、およびカラム切換弁５２が配置さ
れている。分離カラム５３は分析中の温度状態を一定に
保つため，恒温ブロック７３により温度制御されている
。オートサンプラ２６へのサンプルラック２７の装着、
取出しはカバー７４を開閉して行なう。蛍光光度計５４
の上部には、測定データを記憶しておくためのフロッピ
ーディスク７５が組込まれている。
蛍光光度計５４，カラムパネル７２が配置されており，
カラムパネル７２には除蛋白カラム４８，分離カラム５
３，試料導入弁４７、およびカラム切換弁５２が配置さ
れている。分離カラム５３は分析中の温度状態を一定に
保つため，恒温ブロック７３により温度制御されている
。オートサンプラ２６へのサンプルラック２７の装着、
取出しはカバー７４を開閉して行なう。蛍光光度計５４
の上部には、測定データを記憶しておくためのフロッピ
ーディスク７５が組込まれている。
装置下段には、洗浄液槽４２，移送・洗浄液槽４５，容
離液槽５０，分注ボンプ４１，移送・洗浄液送液用のボ
ンプ４６，溶離液送液用のボンプ５工が配置され、ここ
から装置上段の分析ユニッＩ・に必要な液体の送液が行
われる。なお装置の下段後部には電源や基板類などの電
気系７６が収められている。装置上面にはプリンタ５７
，ＣＲＴ５８および本装置による分析のための入力操作
を行う操作パネル７７が配置されている。
離液槽５０，分注ボンプ４１，移送・洗浄液送液用のボ
ンプ４６，溶離液送液用のボンプ５工が配置され、ここ
から装置上段の分析ユニッＩ・に必要な液体の送液が行
われる。なお装置の下段後部には電源や基板類などの電
気系７６が収められている。装置上面にはプリンタ５７
，ＣＲＴ５８および本装置による分析のための入力操作
を行う操作パネル７７が配置されている。
次に本発明を適用した方法について図を用いて説明する
。ここでは、簡単のために目的成分がカテコールアミン
の場合を例にして述べるが、本発明の方法はこの例に限
定されるものではない。
。ここでは、簡単のために目的成分がカテコールアミン
の場合を例にして述べるが、本発明の方法はこの例に限
定されるものではない。
検体としては、カテコールアミンを含む血漿あるいは血
清が用いられる。希釈液としては水や各種緩衝液、さら
には少量の有機溶媒“含む水溶液が使用でき、特に水も
しくは低濃度の緩衝液が好適である。高濃度の有機溶媒
が含有されると検体中の蛋白戒分が変性凝集して沈殿を
生じるおそれがある。この時の希釈倍率と誘導体化反応
の達或率をカテコールアミン誘導体の蛍光強度で示すと
第６図のようであった。たて軸は、カテコールアミンの
標準液を誘導体化して得られる蛍光強度を対象として相
対蛍光強度で示してある。希釈液には水を使用し、誘導
体化反応後に限外濾過膜を用いて除蛋白処理を行なった
。
清が用いられる。希釈液としては水や各種緩衝液、さら
には少量の有機溶媒“含む水溶液が使用でき、特に水も
しくは低濃度の緩衝液が好適である。高濃度の有機溶媒
が含有されると検体中の蛋白戒分が変性凝集して沈殿を
生じるおそれがある。この時の希釈倍率と誘導体化反応
の達或率をカテコールアミン誘導体の蛍光強度で示すと
第６図のようであった。たて軸は、カテコールアミンの
標準液を誘導体化して得られる蛍光強度を対象として相
対蛍光強度で示してある。希釈液には水を使用し、誘導
体化反応後に限外濾過膜を用いて除蛋白処理を行なった
。
図により明らかなように、蛋白成分を含む検体に直接，
誘導体化反応を添加するとカテコールアミンの各成分は
蛋白成分を含まない場合に比較して蛍光強度が小さい。
誘導体化反応を添加するとカテコールアミンの各成分は
蛋白成分を含まない場合に比較して蛍光強度が小さい。
特に、ドーパミンは１／１０と小さくなっている。しか
し、検体を水で希釈していくにしたがい、強度は増加し
８倍希釈では実用上ほとんど問題にならないところまで
回復した。因みに、血中蛋白質の正常値範囲は６．６〜
８．６％である。希釈液としては水以外に、緩衝液，塩
，ＥＤＴＡ，希薄な有機溶媒を含むものが使用でき、そ
の効果は水の場合と同様であった。
し、検体を水で希釈していくにしたがい、強度は増加し
８倍希釈では実用上ほとんど問題にならないところまで
回復した。因みに、血中蛋白質の正常値範囲は６．６〜
８．６％である。希釈液としては水以外に、緩衝液，塩
，ＥＤＴＡ，希薄な有機溶媒を含むものが使用でき、そ
の効果は水の場合と同様であった。
ここで、本発明による装置を用いて血漿中のカテコール
アミンを分析した例について説明する。
アミンを分析した例について説明する。
測定条件は表１に示す通りである。
表 １
まず、蛋白成分を含む血漿を試料容器２９に入れサンプ
ルラツク２７上に複数の試料容器を配列し、送液ボンプ
４６，５１により移送・洗浄液４５，溶離液５０を１
ｍ Ｑ ／ｗｉｎの割合で除蛋白カラム４８，分離カラ
ム５３に送液した。分離カラム５３からの溶出液を蛍光
光度計５４でモニタし、ベースラインが安定した時点で
、オートサンプラ２６を動作開始した。試料容器中のサ
ンプルは分注ノズル３８により５０μａ吸引されて反応
容器５３に吐出される。さらに洗浄液４２を４５０μ悲
吸引し、同じ反応容器５３に吐出し、希釈，混合した。
ルラツク２７上に複数の試料容器を配列し、送液ボンプ
４６，５１により移送・洗浄液４５，溶離液５０を１
ｍ Ｑ ／ｗｉｎの割合で除蛋白カラム４８，分離カラ
ム５３に送液した。分離カラム５３からの溶出液を蛍光
光度計５４でモニタし、ベースラインが安定した時点で
、オートサンプラ２６を動作開始した。試料容器中のサ
ンプルは分注ノズル３８により５０μａ吸引されて反応
容器５３に吐出される。さらに洗浄液４２を４５０μ悲
吸引し、同じ反応容器５３に吐出し、希釈，混合した。
次に、誘導体化試薬３０を４００μＱ、内部標準液３１
を５０μα反応容器３３内に添加し、分注ノズル３８で
吸引，吐出を繰返して混合し、３分間放置した。この時
、反応容器の温度は５０℃に保温した。３分経過後、反
応容器内の誘導体化された試料５００μ藍を分注ノズル
３８で吸引し、計量管４９に注入ボート３６から注入し
た。試料導入弁４７を切換えて、移送液４５が計量管４
９を通るようにし、蛋白成分を含むサンプルを除蛋白カ
ラム４８に通過させる。この時、サンプル中に含まれる
誘導体化されたカテコールアミンはこのカラム４８内に
吸着されてとどまり、蛋白成分は排出口６４より排出さ
れる。約３分間、除蛋白カラム４８に移送・洗浄液４５
を通過した後、流路切換弁５２を切換えて、溶離液５０
が除蛋白カラム４８を経由して分離カラム５３に流れる
ようにし、この時、同時にプリンタ５７をスタートさせ
た。
を５０μα反応容器３３内に添加し、分注ノズル３８で
吸引，吐出を繰返して混合し、３分間放置した。この時
、反応容器の温度は５０℃に保温した。３分経過後、反
応容器内の誘導体化された試料５００μ藍を分注ノズル
３８で吸引し、計量管４９に注入ボート３６から注入し
た。試料導入弁４７を切換えて、移送液４５が計量管４
９を通るようにし、蛋白成分を含むサンプルを除蛋白カ
ラム４８に通過させる。この時、サンプル中に含まれる
誘導体化されたカテコールアミンはこのカラム４８内に
吸着されてとどまり、蛋白成分は排出口６４より排出さ
れる。約３分間、除蛋白カラム４８に移送・洗浄液４５
を通過した後、流路切換弁５２を切換えて、溶離液５０
が除蛋白カラム４８を経由して分離カラム５３に流れる
ようにし、この時、同時にプリンタ５７をスタートさせ
た。
こうして得られたクロマトグラムを第７図に示す。この
検体はカテコールアミンの濃度として、５０〜１５０ｐ
ｇであり、感度的にも実用上問題はない。また、分離に
要する時間も４分以内であり、並行処理による高速分離
を行う上でも全く問題はない。また、除蛋白カラムにお
ける除蛋白率は約９５％以上であり、分離カラムの寿命
に与える影響も小さい。
検体はカテコールアミンの濃度として、５０〜１５０ｐ
ｇであり、感度的にも実用上問題はない。また、分離に
要する時間も４分以内であり、並行処理による高速分離
を行う上でも全く問題はない。また、除蛋白カラムにお
ける除蛋白率は約９５％以上であり、分離カラムの寿命
に与える影響も小さい。
カテコールアミン３成分と内部標準物質の回収率は、そ
れぞれ９８％以上であった。
れぞれ９８％以上であった。
本発明に基づく他の実施例を第８図に示す。この例では
、除蛋白カラム４８と流路切換弁５２で構或されるカラ
ムスイッチング機構がない点で、第１図に示す実施例と
異なる。第１図の例と同様の機能を有する構或部分には
、同じ符号を付してある。
、除蛋白カラム４８と流路切換弁５２で構或されるカラ
ムスイッチング機構がない点で、第１図に示す実施例と
異なる。第１図の例と同様の機能を有する構或部分には
、同じ符号を付してある。
第８図において、希釈状態で誘導体化されたサンプルは
、反応容器３３からノズル３８によって注入ボート３６
へ運ばれ、ポンプ４１の押し出し動作により分析部４４
の流路系へ導入される。サンプル量は計量管４９を満た
した所定量だけ分離カラム１００へ導入される。この例
では、除蛋白カラム設けていないので、分離カラム１０
０内に充填される充填剤は第１図の例とは異なる種類の
ものが採用される。
、反応容器３３からノズル３８によって注入ボート３６
へ運ばれ、ポンプ４１の押し出し動作により分析部４４
の流路系へ導入される。サンプル量は計量管４９を満た
した所定量だけ分離カラム１００へ導入される。この例
では、除蛋白カラム設けていないので、分離カラム１０
０内に充填される充填剤は第１図の例とは異なる種類の
ものが採用される。
分離カラム１００内の充填剤は、蛋白質成分のような分
子量の巨大な成分は速やかに溶出し、カテコールアミン
誘導体のように蛋白質に比べて比較的分子量が小さく、
且つ疎水性の強い成分は吸着する性質を有するものが選
定される。このような分離カラムの例では、Ｒｅｇｉｓ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから販売されてい
るＯＦＦ−８５−８０パックドカラムの如き内面逆相型
カラムがある。このカラムの充填剤の粒度は５μｍであ
り、カラム内径４．６ ｎｗｎ、長さが１５ｃｍである
。分離カラム１００として用い得るもう１つの例は、Ｓ
ｕｐｅｌｃｏ社から販売されている疎水性ボリマー型カ
ラム（商品名： ｝Ｉｉｓｅｐ）である。このカラムに
はネットワークで保護されたシリカ基材の充填剤（粒度
は５μｍ）が充填されている。
子量の巨大な成分は速やかに溶出し、カテコールアミン
誘導体のように蛋白質に比べて比較的分子量が小さく、
且つ疎水性の強い成分は吸着する性質を有するものが選
定される。このような分離カラムの例では、Ｒｅｇｉｓ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから販売されてい
るＯＦＦ−８５−８０パックドカラムの如き内面逆相型
カラムがある。このカラムの充填剤の粒度は５μｍであ
り、カラム内径４．６ ｎｗｎ、長さが１５ｃｍである
。分離カラム１００として用い得るもう１つの例は、Ｓ
ｕｐｅｌｃｏ社から販売されている疎水性ボリマー型カ
ラム（商品名： ｝Ｉｉｓｅｐ）である。このカラムに
はネットワークで保護されたシリカ基材の充填剤（粒度
は５μｍ）が充填されている。
第９図には、本発明に基づくもう１つの実施例を示す。
この例によるカテコールアミン分析装置の流路構成は、
基本的には第１図の実施例と同様であるが、第９図では
除蛋白カラム４８および分離カラム５３の流路系を省略
してある。第９図の例では、試料導入弁４７の動作タイ
ミングおよび分注ノズル３８の吸排タイミングが第１図
の実施例とは相違するので、制御部５６は以下に示す操
作を行い得るような動作プログラムに従って駆動機構３
７，分注ポンプ４１，試料導入弁４７を動作制御する。
基本的には第１図の実施例と同様であるが、第９図では
除蛋白カラム４８および分離カラム５３の流路系を省略
してある。第９図の例では、試料導入弁４７の動作タイ
ミングおよび分注ノズル３８の吸排タイミングが第１図
の実施例とは相違するので、制御部５６は以下に示す操
作を行い得るような動作プログラムに従って駆動機構３
７，分注ポンプ４１，試料導入弁４７を動作制御する。
第９図の分析装置では、第１図の反応容器３３の代りに
混合容器８２を用いる。計量管４９および分離カラム５
３は、空気恒温槽９５内に配置されており、３０℃以上
であって６０℃以下の温度に保温される。必要に応じて
試料導入弁４７を恒温槽９５内に収納してもよい。恒温
槽９５内を所定温度に保持するために、恒温槽９５には
加熱用ヒータ９０と温度センサ９１を配設し、温度セン
サ９１の検出信号に応じてヒータ９０のオン，オフを制
御する。
混合容器８２を用いる。計量管４９および分離カラム５
３は、空気恒温槽９５内に配置されており、３０℃以上
であって６０℃以下の温度に保温される。必要に応じて
試料導入弁４７を恒温槽９５内に収納してもよい。恒温
槽９５内を所定温度に保持するために、恒温槽９５には
加熱用ヒータ９０と温度センサ９１を配設し、温度セン
サ９１の検出信号に応じてヒータ９０のオン，オフを制
御する。
第９図の例では、計量管４９が反応部となる。
計量管４９内に収容された液は、流路切換弁４７が実線
の状態となっているので他の流路系とは連通状態が遮断
されており、開閉弁８５を閉状態にして誘導体化反応を
進行させる間中移動停止される。まず混合容器８２内に
除蛋白処理されていない血液試料２９と誘導体化試薬３
０と希釈液４２が分注ノズル３８によって加えられ混合
されて誘導体化反応が開始された直後に、混合液をノズ
ル３８によって吸入保持し注入ポート３６から計量管４
９内へ、分注ボンプ４１の動作によって押し込み、計量
管４９内を混合液で満たす。このときの試料導入弁４７
は第９図の実線状態となっているので、計量管内にあっ
た移送液および混合液の最初の部分は開閉弁８５を経て
ドレイン８６へ排出される。次いで開閉弁８５を閉状態
に切り換え混合液を計量管４９内で移動停止し、３０〜
６０℃の内の一定温度で所定時間の間試料に含有されて
いたカテコールアミンの誘導体化反応を進行せしめる。
の状態となっているので他の流路系とは連通状態が遮断
されており、開閉弁８５を閉状態にして誘導体化反応を
進行させる間中移動停止される。まず混合容器８２内に
除蛋白処理されていない血液試料２９と誘導体化試薬３
０と希釈液４２が分注ノズル３８によって加えられ混合
されて誘導体化反応が開始された直後に、混合液をノズ
ル３８によって吸入保持し注入ポート３６から計量管４
９内へ、分注ボンプ４１の動作によって押し込み、計量
管４９内を混合液で満たす。このときの試料導入弁４７
は第９図の実線状態となっているので、計量管内にあっ
た移送液および混合液の最初の部分は開閉弁８５を経て
ドレイン８６へ排出される。次いで開閉弁８５を閉状態
に切り換え混合液を計量管４９内で移動停止し、３０〜
６０℃の内の一定温度で所定時間の間試料に含有されて
いたカテコールアミンの誘導体化反応を進行せしめる。
誘導体化反応が終了したあと、試料導入弁４７を実線状
態にし移送液４５によって誘導体化された試料バンドを
挾むようにして除蛋白カラムへ導入する。このあとの試
料処理は、第１図の実施例と同様である。第９図の実施
例によれば、混合容器８２を保温せずに済むので、分析
装置を第１図の装置より簡素化できる。
態にし移送液４５によって誘導体化された試料バンドを
挾むようにして除蛋白カラムへ導入する。このあとの試
料処理は、第１図の実施例と同様である。第９図の実施
例によれば、混合容器８２を保温せずに済むので、分析
装置を第１図の装置より簡素化できる。
本発明によれば、除蛋白処理を事前に行なっていない生
体試料であっても、蛋白質による悪影響を受けることな
く被検生理物質の誘導体化反応を効率良く進めることが
でき、高精度分析を実現できるので、実用上の効果が大
きい。
体試料であっても、蛋白質による悪影響を受けることな
く被検生理物質の誘導体化反応を効率良く進めることが
でき、高精度分析を実現できるので、実用上の効果が大
きい。
第１図は本発明の一実施例の全体構或を示す概略構成図
、第２図は第１図の実施例における分析操作のフローを
示す図、第３図Ａおよび第３図Ｂは第１図の実施例にお
ける各部の動作タイミングを示す動作プログラム例の図
、第４図は第１図におけるオートサンプラ部の平面図、
第５図Ａは第１図の装置の正面外観図、第５図Ｂは第５
図Ａの側方から見た配置概念図、第６図は血液試料の希
釈倍率と相対蛍光強度の関係を示す図、第７図は第１図
の装置を用いてカテコールアミンを分析したときの測定
結果例を示す図、第８図は本発明の他の実施例の概略構
成を示す図、第９図は本発明のもう１つの実施例の要部
構或を示す概略図である。 ２６・・・オートサンプラ、２９・・・試料容器、３０
・・・誘導体化試薬容器、３３・・・反応容器、３６・
・・注入ポート、３８・・・分注ノズル、４２・・・希
釈液槽、４７・・・試料導入弁、４８・・・除蛋白カラ
ム、４９・・・計量管、５２・・・流路切換弁、５３，
１００・・・分離カラム、 ５４・・・蛍光光度計、 ５６・・・制御部、 ８２ 第 ２ 図 第 ３ 図Ａ 第 ３ 図 Ｂ 第 ４ 図 第 ５ 図Ａ 第 ６ 図Ｂ 第 ６ 図 希 釈 イ含 率 （倍） 第 了 図 保持時間（分） 第 ８ 図 第 ９ 図
、第２図は第１図の実施例における分析操作のフローを
示す図、第３図Ａおよび第３図Ｂは第１図の実施例にお
ける各部の動作タイミングを示す動作プログラム例の図
、第４図は第１図におけるオートサンプラ部の平面図、
第５図Ａは第１図の装置の正面外観図、第５図Ｂは第５
図Ａの側方から見た配置概念図、第６図は血液試料の希
釈倍率と相対蛍光強度の関係を示す図、第７図は第１図
の装置を用いてカテコールアミンを分析したときの測定
結果例を示す図、第８図は本発明の他の実施例の概略構
成を示す図、第９図は本発明のもう１つの実施例の要部
構或を示す概略図である。 ２６・・・オートサンプラ、２９・・・試料容器、３０
・・・誘導体化試薬容器、３３・・・反応容器、３６・
・・注入ポート、３８・・・分注ノズル、４２・・・希
釈液槽、４７・・・試料導入弁、４８・・・除蛋白カラ
ム、４９・・・計量管、５２・・・流路切換弁、５３，
１００・・・分離カラム、 ５４・・・蛍光光度計、 ５６・・・制御部、 ８２ 第 ２ 図 第 ３ 図Ａ 第 ３ 図 Ｂ 第 ４ 図 第 ５ 図Ａ 第 ６ 図Ｂ 第 ６ 図 希 釈 イ含 率 （倍） 第 了 図 保持時間（分） 第 ８ 図 第 ９ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、除蛋白処理されていない血液試料又は髄液試料と希
釈液と誘導体化試薬液とを同じ容器に採取して試料中の
被検生理物質の誘導体化反応を開始させること、上記容
器から採取された液を除蛋白カラムに導き、この除蛋白
カラム内に誘導体化された生理物質を吸着させると共に
上記除蛋白カラムから蛋白質を排出すること、および上
記除蛋白カラムに吸着されていた生理物質を脱離して分
離カラムに導き、生理物質を成分分離することを特徴と
する生体試料のクロマトグラフィー分析法。 ２、請求項第１項記載の分析法において、上記誘導体化
反応は３０℃以上であつて６０℃以下の温度に保たれた
状態で行われることを特徴とする生体試料のクロマトグ
ラフィー分析法。 ３、請求項第１項記載の分析法において、上記希釈液の
使用量は上記試料の使用量の８〜２０倍容であることを
特徴とする生体試料のクロマトグラフィー分析法。 ４、除蛋白処理されていない血液試料又は髄液試料と誘
導体化試薬と希釈液とを共存させ、その液中の蛋白質の
濃度が１％以下となるように試料が希釈された状態で生
理物質の誘導体化反応を進めること、誘導体化された生
理物質を含む反応液を除蛋白カラムに導き、上記生理活
性物質を上記除蛋白カラム内に吸着させながら上記除蛋
白カラムから蛋白質を排出すること、および上記除蛋白
カラムに吸着されていた生理物質を脱離して分離カラム
に導き、生理物質を成分分離することを特徴とする生体
試料のクロマトグラフィー分析法。 ５、請求項第４項記載の分析法において、上記生理物質
はカテコールアミンであり、上記誘導体化試薬は１，２
−ジフェニルエチレンジアミンであることを特徴とする
生体試料のクロマトグラフイー分析法。 ６、除蛋白処理されていない血液試料又は髄液試料とそ
の試料の量の８〜２０倍容の希釈液と誘導体化試薬とを
同じ容器に採取して共存させること、上記容器内の共存
液を反応流路内に導入し、この反応流路内における液の
移動を停止させた状態で所定時間誘導体化反応を進行せ
しめること、および誘導体化された生理物質を含む反応
液を内面逆相型充填剤又はネットワーク保護型シリカ基
材充填剤を有する分離カラムに導き、生理物質を成分分
離することを特徴とする生体試料のクロマトグラフィー
分析法。 ７、請求項第６項記載の分析法において、上記生理物質
はカテコールアミンであり、上記誘導体化試薬は１，２
−ジフェニルエチレンジアミンであることを特徴とする
生体試料のクロマトグラフィー分析法。 ８、除蛋白処理されていない生体試料と誘導体化試薬と
希釈液とを混合し、この混合液中の蛋白質濃度が１％以
下となるように生体試料が希釈された状態で生理物質の
誘導体化反応を進めること、および誘導体化された生理
物質を含む液を内面逆相型充填剤又はネットワーク保護
型シリカ基板充填剤を有する分離カラムに導き、生理物
質を成分分離することを特徴とする生体試料のクロマト
グラフィー分析法。 ９、生体試料を成分分離する分離カラムおよび分離され
た成分を検出する検出器を有する分離分析部と、この分
離分析部へ生体試料を供給するオートサンプラ部とを備
えた液体クロマトグラフィー装置において、上記オート
サンプラ部には試料混合容器へ試料採取容量の８〜２０
倍容希釈液を供給する希釈液供給装置を設け、上記希釈
液供給装置の一部を形成している可動ノズルによつて、
試料容器から上記試料混合容器への試料の分注、試薬容
器から上記試料混合容器への試薬の分注、および上記試
料混合容器から上記分離分析部への混合液の供給を行う
ように上記オートサンプラ部の動作を制御する制御装置
を設けたことを特徴とする液体クロマトグラフ装置。 １０、請求項第９項記載の装置において、上記分離カラ
ムの前段に生理活性物質は吸着するが蛋白質は排出する
除蛋白カラムを設けたことを特徴とする液体クロマトグ
ラフ装置。 １１、請求項第１０項記載の装置において、上記除蛋白
カラムは内面逆相型充填剤又はイオン交換基が導入され
たポリマー型充填剤を有するのであることを特徴とする
液体クロマトグラフ装置。 １２、請求項第１０項記載の装置において、上記分離カ
ラムは逆相型充填剤を含むものであることを特徴とする
液体クロマトグラフ装置。 １３、請求項第９項記載の装置において、上記試料混合
容器を３０〜６０℃に保温する保温装置を設けたことを
特徴とする液体クロマトグラフ装置。 １４、試料中の生理物質を試薬と反応せしめる反応部と
、この反応部から導入された試料を成分分離する分離カ
ラムとを備えた液体クロマトグラフ装置において、３０
℃以上であつて６０℃以下の温度に保持される恒温部を
設け、この恒温部によつて上記分離カラムと上記反応部
を保温するように構成したことを特徴とする液体クロマ
トグラフ装置。 １５、請求項第１４項記載の装置において、上記反応部
は、液体流路の入口ポートと上記分離カラムとの間に液
の移動停止可能に形成された流路領域であることを特徴
とする液体クロマトグラフ装置。 １６、請求項第１４項又は第１５項記載の装置において
、試料と希釈液と誘導体化試薬とを含む混合液を上記反
応部へ導入する装置を設けたことを特徴とする液体クロ
マトグラフ装置。
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