JPH03198785A - Ｌ・アルファ・アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ、産業上の利用分野 本発明は、５・置換のヒダントインから、Ｌ・アルファ
・アミノ酸を製造する微生物の酵素による方法に関する
ものである。

Ｌ・アルファ・アミノ酸は、飼料と栄養剤並びに医薬品
を製造するための添加剤として及び、化学合成の中間生
成物として利用される。

ｂ、従来の技術 西ドイツ特許第３７１２５３９　Ｃ２号によると、Ｌ・
アルファ・アミノ酸は、５・置換のヒダントインか、又
は、Ｎ・カルバモイル・アルファ・アミノ酸から微生物
による生化学の置換を通して入手可能である。

本特許明細書中に記載される株を利用した最善の実験に
よると、増加及び酵素による合成は、グルコーゼと硫酸
アンモニウムと酵母エキスを媒質に添加することにより
好都合に影響を受けるということが示されている。酵素
の固有の活性が高いという特徴は、確かに媒質中にマン
ガンイオンと然るべき誘導体が存在していることと関係
している、と言うのは、然るべき誘導体の影響を受ける
と、初めて有機体は、ヒダントイン・ラセマーゼ、ヒダ
ントイナーゼ及びＬ−Ｎ−カルバモイラーゼのような置
換に酸化させられる酵素の形成を始めるからである。西
ドイツ特許第３７１２５３９　Ｃ２号によると、Ｄ、Ｌ
−３’−メチレンインドリル−５−ヒダントインは誘導
体としても、炭素供給源としても役立っている。

Ｃ１発明が解決しようとする課題 しかし、だからといってバッチ法の場合、この誘導体を
始めに媒質に加えるだけでは十分とは言えない、なぜな
らば、その作用は時間の経過と共に弱まるからである。

改めて追加配量を行なうと、ようやく活性は再び高まる
ことになる。後からのこの上昇期中に同じく誘導体を追
加配量すると、４〜５時間以上上首尾に行くことが立証
されている。しかしそれにもかかわらず、これはありが
たくないほど多量の誘導体消費のあることを意味してい
る。殊に、増加を抑制するべく作用し、その上、媒質を
可視的に染色する生成物が生じる。形成されたし・アル
ファ・アミノ酸を分離するため、この分解生成物は補足
的に分離されなければならず、これには洗浄費のかさむ
ことが条件付けられる。

この誘導体の場合、培地に例えば、ポリエチレングリコ
ールのような有機溶剤を使用しなくてはならないことは
、さらに欠点である。

従って本発明の目的は、公知となっているＬ・アルファ
・アミノ酸の製造方法を、微生物による置換中にはなる
べく分解されず、増加と酵素の活性を抑制する生成物を
全くつくらず、反応混合物を再処理する場合に付加的な
洗浄費を全く必要とせず、その上、補足的な溶剤なしで
Ｌ・アルファ・アミノ酸を多量につくることのできる誘
導体を準備することにより改良することにある。

６１課題を解決するための手段 本目的は、特許請求の範囲第１項ないし第４項に記載さ
れている方法により解決される。

！■ という構造を有する化合物であって、特にＲ９とＲ２が
等しいか異なっており、即ち、Ｒ１−水素か１〜４の炭
素・原子つきのアルキル基、Ｒ２−１〜４の炭素・原子
つきのアルキル基または下記の残基、即ち、＝５ −６＝ 及び、Ｘ−＞Ｎ−Ａｎまたは：）ｃＨ−ＡＩｋまたは）
ｃｌＩ２であって、その際、Ａｌｋは１〜４の炭素原子
つきの分岐又は非分岐のアルキル鎖を示している化合物
が効き目の高い誘導体として使用可能であることが発見
された。

驚いたことに、これらの化合物は、その十分な誘導作用
にもかかわらず、培養中には目につくほど分解されない
。分解生成物を添加することによる増加の抑制は始まら
ず、又、同時に誘導体の需要は著しく減らされる。さら
に本発明に係る誘導体を利用すると、手順の簡素化が達
成される、なぜならば、誘導体は、生物培養の開始又は
進行中に１回添加されると、その活性は最後まで維持さ
れるからである。

それにもかかわらず、同時に、酵素の活性のかなり高い
ことも確認せざるを得ない。

ｅ、　実施例 表１中には、Ｄ、Ｌ−３’−メチレンインドリル５−ヒ
ダントイン及び、３−Ｎ−メチル−Ｄ、　　Ｌ１２−メ
チレンインドリル−５−ヒダントインに関する誘導体の
影響について比較されている。

培養は、例１に記載される通り、バイオリアクター中で
、無機塩の媒質中に１６時間にわたってグルコーゼが存
在すること及びグルコーゼを追加配量することによって
行なわれた。

酵素の活性は、例２に記載される通り、培養中のさまざ
まな時点で測定された。Ｄ、Ｌ−３’−メチレンインド
リル−５−ヒダントイン・誘導の細胞に比べて、３−Ｎ
−メチルＬ、Ｌ、−３’−メチレンインドリル−５−ヒ
ダントイン・誘導の細胞は、５倍はど高目の固有の活性
を有していた。

Ｔｒｐ＝Ｌ・トリプトファン ＣＴｒｐ　＝　Ｎ−カルバモイル−Ｄ、Ｌ−トリプトフ
ァン− Ｘ−乾燥したバイオマス（ｇ／ｌ） μ−固有の増加（１／時間） 栄養剤の中に１．０ｇ／ｌの３−Ｎ−メチル−〇，Ｌー
３′ーメチレンインドリル−５−ヒダントインを一回だ
け前もって加えると、２９ｇ／ｌの乾燥したバイオマス
（ＢＴＭ）の場合、０．３５２（ｍｍｏｌ／ｇ　ＢＴＭ
ｘｈ）のＴｒｐ固有の活性、０．０３９（ｍｍｏｌ／ｇ
　ＢＴＭｘｈ）のＣＴｒｐ固有の活性並びに０．３９０
ｍｍｏｌ／ｇ　ＢＴＭｘｈ）のＴｒｐ　＋ＣＴｒｐに固
有の活性が２９時間入手される。

この新しい誘導体の濃度は、この全期間を通じて一定で
ある。これに反し、誘導体としてり，Ｌ−３’メチレン
インドリル−５−ヒダントインを用いると、０．１０７
（ｍｍｏｌ／ｇ　ＢＴＭｘｈ）のＴｒｐ固有の活性、０
．０２５（ｍｍｏｌ／ｇ　ＢＴＭｘｈ）のＣＴｒｐ固有
の活性並びに０．　１３２（ｍｍｏｌ／ｇ　ＢＴＭｘｈ
）のＴｒｐ　＋　ＣＴｒｐに固有の活性が達成されるだ
けである。

１−Ｎ−メチル−Ｄ，Ｌ−３’−メチレンインドリル−
５−ヒダントインを誘導体として使う場合、３ないし５
倍も高い酵素の活性が達成され、又生産関係は明らかに
トリプトファン形成のために支えられる。本発明による
と使用可能な誘導体は、−船釣な構造 の化合物であり、ここにおいて、Ｒ１とＲ２は同−又は
異なっており、Ｒ＝水素又は１〜４個の炭素・原子つき
のアルキル基を示しており、Ｒ２−１〜４個の炭素・原
子つきのアルキル基又は下記の残基、即ち、１０ ロピルー、ｎ−ブチルー１ｉ−ブチル−のような低アル
キル基及び第３ブチル基である。

位置５では１回又は２回置換が行なわれ、その際、置換
物Ｒ１及びＲ２は、メチル−、エチル−２ｎ−プロピル
−ｉ−プロピル−１ｎ−ブチル−１ｉ−ブチルのような
同じ低アルキル基及び第３ブチル基であるか、或いは、
Ｒ１は水素又は低アルキル基、そしてＲ２は、次の構造
、即ち、 を指しており、又、Ｘ＝＞Ｎ−ｔ＋Ｉｋまたは）ｃ＋＋
−八＋ｋまたは＞Ｃ１，であって、ここにおいてＡｌｋ
は１〜４個の炭素原子つきの分岐又は非分岐のアルキル
鎖を示している。

従って３−位置でも、５−位置でも置換されているのは
ヒダントイン或いはジケトピロリジンである。

３−位置での置換基として考えられるものは、例えば、
メチル−、エチル−２ｎ−プロピル−ｉ−プ１ ２− を有する基である。

特に良好とされる誘導体は、５−位置にアルキル残基を
有する３−位置でアルキル化されたヒダントインである
。これらの誘導体は微生物の培養を始める前か、或いは
その培養中に１回だけ０．１ないし２．０ｇ／ｌの量と
して培地に添加される。

微生物の培養及び生化学のヒダントイン分解は、例えば
西ドイツ特許筒３７１２５３９　Ｇ２中に記載される通
り、それ自体公知の方法により行なわれる。

本発明に記載の方法によると、置換されたヒダントイン
を所望の方法で、この様なヒダントインを対称選択して
（ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｋｔｉｖｅ）然るべきＬ・形
に分解すると特に好ましい全ての微生物を使うことがで
きる。この分解は間接細菌、フラボバクテリアとプソイ
ドモナスの類の微生物の場合も知られている。

５・置換のヒダントインであって、それ自体公知の方法
により入手されるものは全部、本発明に記載の方法に従
って入手可能である。

本発明に記載の微生物により、Ｎ−カルバモイル・アル
ファ・アミノ酸を経てＬ−アルファ・アミン酸に加水分
解され得る５・置換・ヒダントインの例は表２中に記載
されている。しかし本発明は、これらの例に限定される
ことにはならない。

表２ ５・置換されたヒダントイン及び分解生成物本発明に従
って使用される微生物により、Ｌ−アルファーアミノ酸
へ分裂可能とされるＮ−カルバモイル−アルファーアミ
ノ酸の例は、表３中に記載サレる。

３ ４ 表３ 基質 生成物 例 例１ 培養条件 西ドイツ特許筒３７１２５３９　Ｃ２号により、後に記
載される株（ＤＳＭ　３７４７）の有機体の予備培養が
行なわれる。主要な培養に関し、下記の条件が与えられ
ている、即ち、 呈示されたグルコーゼ：　　　　２０　　ｇ／ｌ追加し
て添加のグルコーゼ：　　３．６　ｇ／ｌ　ｈ〜１１０
時間目の時間基降 技術的なイースト抽出物：１．Ｏｇ／ＩＫＨｚＰＯ４：
　　　　　　　　　　　３．４　　ｇ／ＩＮａｚＨＰ０
４Ｘ２Ｈ２０：　　　　　　　４．４１　ｇ／ｌクエン
酸ｘｌＨｚｏ　：　　　　　　　０．６４　ｇ／１Ｍｇ
ＳＯ４Ｘ７ＨｚＯ： ＣａＣ１ｚ　　Ｘ２１１ｚＯ： ＦｅＳＯ４Ｘ７１（ｚＯ： ＭｎＣＩｚ　　Ｘ４Ｈ２０： （ＮＨ４）２Ｓ０４　： 誘導体”： 温度： 培養期間： ０．４０　ｇ／１ ０．０４　ｇ／１ ０．０４　ｇ／１ ０．０４　ｇ／１ ６．５　　ｇ／１ １．０　　ｇ／１ ３０　℃ １５ないし３０時間 例２ 酵素活性テスト サンプルは培養中の決められた時点に抽出された遠心分
離機で分離される。

１００ｍｇの湿ったバイオマスが、５１１１Ｉにつき０
．１Ｍのグリシン−緩衝剤又は０．０５Ｍの燐酸塩緩衝
剤（ｐＨ８，５）としての１０ｍ１の密閉されたフラス
コ中に懸濁させら５ ＝１６ れ、さらに、５ｍｇのり、Ｌ−５−ＩＭＨが加えられ、
２７°ＣのＮ２−雰囲気中で２時間攪拌される。

ＩＭＨ，Ｎ−カルバモイルトリプトファン及びＬ−トリ
プトファンの濃度は、上ずみ液に基づき、ＨＰＬＣ（Ｒ
Ｐ８−柱、ゼルファ、ハイデルベルク：　５０ｍＭ　Ｋ
Ｈ２ＰＯ，／２５％のメタノールを溶媒として並びに、
２８０ｎｍの場合のＵＶ・検出：フロー率１．Ｑｍｌ／
分）により測定される。

保留時間は、即ち、 Ｔｒｐの場合：６．１分 ＣＴｒｐの場合：８．５分 ■旧の場合：　　１６．７分 例３ 生体触媒は、例１に記載される通り、それぞれの誘導体
を使って引き寄せられ、２０時間後には遠心分離機で分
離される。

１２０ｇの湿ったバイオマスは２リツトルの炭酸緩衝塩
（０，１ｎ　、　ｐＨ８，５に調整されたもの）中で、
又、２０．０ｇ（８７，２ミリモル）のり、Ｌ−５−Ｉ
門■は基質として、１回だけＮ２−燻蒸してから、５０
°Ｃの下で攪拌される。

ａ）　　Ｄ、　　Ｌ−５−ＩＭＨ−置換された細胞は３
時間後、完全にり、Ｌ−５−ＩＭＨを置換する。その途
中、２時間以上にわたりＣＴｒｐが反応生成物としては
っきり現われ、言い換えると、完全な置換は行なわれな
い、と言うのは、第２段階の反応において、Ｌ−Ｎ−カ
ルバモイラーゼが限定するように作用するからでなる（
表４）。

ｂ）　　３　　Ｎ　　ＣＨｓ　　Ｄ、　　Ｌ　　５　　
Ｉ旧を１時間以内に置換する。第２段階の反応において
、Ｌ−Ｎ−カルバモイラーゼは明らかによりスピーデイ
に経過してしまう（表４）。

表４ ７ ８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）５・置換のヒダントインを微生物により分解するこ
   とによる、Ｌ・アルファ・アミノ酸の製造方法において
   、酵素の活性のための誘導体として、次の構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する化合物が使用され、そこにおいてＲ＿１とＲ＿
   ２は等しいか異なっており、 該Ｒ＿１＝水素或いは１〜４個の炭素原子を有するアル
   キル基であって、 該Ｒ＿２＝１〜４個の炭素原子つきのアルキル基あるい
   は下記の残基、即ち、 ▲数式、化学式、表等があります▼ であって、又、Ｘ＝＞Ｎ−Ａｌｋまたは＞ＣＨ−Ａｌｋ
   または＞ＣＨ＿２であり、その際、Ａｌｋは、１〜４個
   の炭素原子つきの分岐又は非分岐のアルキル鎖であるこ
   とを特徴とするＬ・アルファ・アミノ酸の製造方法。 ２）誘導体として次の構造 ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物が使用され、そこにおいて、Ｒ＿１、Ｒ＿２及
   びＡｌｋは前記特許請求の範囲第１項に記載の意味を有
   していることを特徴とする、特許請求の範囲第１項に記
   載のＬ・アルファ・アミノ酸の製造方法。 ３）誘導体として３−Ｎ−メチル−Ｄ，Ｌ−３′−メチ
   レンインドリル−５−ヒダントインが使われることを特
   徴とする、特許請求の範囲第１項または第２のいずれか
   に記載のＬ・アルファ・アミノ酸の製造方法。 ４）前記誘導体は、前記微生物を培養する際に１回だけ
   添加されることを特徴とする、特許請求の範囲第１項か
   ら第３項のいずれか１項に記載のＬ・アルファ・アミノ
   酸の製造方法。