JPH03167288A - 界面活性剤によるエクオリンの増感発光法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、エクオリン若しくはその誘導体からなる生物
発光反応系に界面活性剤を共存させることを特徴とする
エクオリンの増感発光法に関する． ［従来の技術とその問題点］ 発光蛋白エクオリンは、発光オワンクラゲより単離され
たカルシウム結合蛋白質で、自然界においては蛋白部分
のアポエクオリンと、基質部分のセレンテラジンが、分
子状酸素を介して複合体を形成している．この複合体に
カルシウムが結合するととじより発光する．この発光を
利用してカルシウム濃度を測定できる． 本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲよりアポエクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、
その一次構造を明らかにした（特間昭６１−１３５，５
８８）， 次いで、このｃＤＮＡを利用して大腸菌を宿主とし、菌
体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産に威功し（特
開昭６２−１７１，６９５、特開昭６３−１０２．８９
５），その精製法を確立した（特開平１　−１３２．３
９７）． さらに、機能遺伝子と結合したエクオリン遺伝子を作製
し、その融合蛋白質の生産に戒功し（特開昭６４−３９
，９９０、特願昭６３−３０８，４２４）、その精製法
を確立した　（特願平１　−６９．８６２）．そして、
これらのエクオリン及びその融合蛋白を用いた金属検出
法及び免疫測定法を開発した（特開昭６２−２６１　，
９４２、特願平１　−７４，７４２），本発明は、界面
活性剤によるエクオリンの増感発光法に関する報告であ
る． ところで、エクオリンの有用性は当業者に周知であり、
エクオリンの発光を利用して、各種物質を検出すること
ができる．すなわち、免疫測定法やＤＮＡブローブ、バ
イオセンサーなどのあらゆる測定検出系に応用できるも
のであり、上述した機能から診断薬等の検査薬として有
用であることが予測される． 本発明者は、上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果
、界面活性剤によるエクオリンの増感発光法を開発する
ことができた．以上の説明から明らかなように、本発明
の目的はエクオリンをより超高感度な測定法に応用する
ための発光増感技術を提供することである． ［問題点を解決するための手段］ 本発明は、下記（１１〜（４）の構成を有する．（１）
エクオリン及びその誘導体を用いる発光法において界面
活性物質を共存させることを特徴とする増感発光法． （２）界面活性物質として陰イオン界面活性剤、陽イオ
ン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、
天然界面活性剤、高分子界面活性剤若しくは特殊界面活
性剤を用いる前記第１項に記載の増感発光法． （３）エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エク
オリン若しくは半合成変異エクオリンである前記第１項
社記載の増感発光法． （４）エクオリンに界面活性剤を共存させることを特徴
とする再生エクオリンの安定な保存方法．本発明の構成
と効果につき以下に詳述する．本発明は界面活性剤の触
媒効果によるエクオリンの増感発光法であり、たとえば
後述の実施例に示す方法で行うことができる． 本発明の方法において、後述するジオキセタン類とは、
第１図に示すような四員環ベルオキシド構造を有する化
合物で、セレンテラジンとは、第２図に示すような構造
を有する化合物で、エクオリンとは、第３図に示すよう
な構造を有する複合体で、エクオリン誘導体とは、例え
ばアポエクオリン部分が変異アポエクオリンに置換した
変異エクオリン、セレンテラジン部分がセレンテラジン
誘導体に置換した半合成エクオリンやその両方ともが置
換した半合成変異エクオリンである．また、界面活性剤
としては後述第１表に示す化合物等があげられる．増加
付与剤として期待しうる蛍光物質としては、下記第２表
に示す物質等が考えられる． 第 １ 表 種々の界面活性剤 第１表のつづき 第２表 （種々の蛍光物質） 注．ＮＢＤ：７−ニトロベンゾフラザン誘導体．ＳＢＤ
＝７−スルホニルベンゾフラザン誘導体本発明の方法は
、例えば次のように行う．エクオリン若しくはエク才リ
ン誘導体の水溶液の一定量に対して、Ｔｒｌｓ　ＨＣＩ
　ＥＤＴＡバッファおよびセレンテラジンのメタノール
溶液および２−メルカブトエタノールの夫々所要量を混
合し、最後に水で希釈して所要量とし、インキエベート
用の溶液を調製する。

上述の調製において、例えばアポエクオリン（１０ｎｇ
／μぶ）水溶液５０μｌを使用した場合には、２００ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　１００ｍＭ　ＥＤＴ＾バッフｙ
−２０〜１００μぶ、セレンテラジン（２００ｍｇ／ｍ
ｊ！　）のメタノール溶液２〜２０μぶおよび還元剤と
しての２−メルカプトエタノール２〜２０μ角を混合し
、水で希釈して２００〜２，０００μｉ（希釈液）とす
る．以上の混合希釈操作は、０℃〜Ｎ　ｔｍで開放雰囲
気中で５分〜１時間で行う． 次に希釈液のインキエベートは、好ましくは０℃〜１５
℃の間の一定温度で５〜ｉｏｏ時間好ましくは１０〜４
０時間行う．該インキュベート後の希釈液を所定量（例
えば５０μＩｌ）づつチューブに採り、所定濃度に希釈
した所定の界面活性剤を添加混合し、Ｏ℃〜室温の一定
温度（例えば４℃）で所定の時間毎にサンプリング（例
えば１０μｉ）Ｌ、該サンプルについて、適当量のＣａ
”源（例えば３０ｍＭＣａｌｌ２３０ｍＭ　Ｔｒ１ｓ　
ＨＣＩ（ｐＨ７．６）水溶１夜１００ｕ　ＩＩ　）を加
えて発光量測定機（ルくフォトメーター）を用いて発光
量（すなわちエクオリン活性）を測定する． なお、上述の界面活性剤の添加において使用する該界面
活性剤の種類は限定されず、上述第１表に記載された■
陰イオン界面活性剤、■陽イオン界面活性剤、■両性界
面活性剤、■非イオン界面活性剤、■天然界面活性剤、
■高分子界面活性剤および特殊界面活性剤のいづれも使
用可能である． なお、界面活性剤の選択は、使用するエクオリン又はエ
クオリン銹導体の種類、緩衝液の種類および使用量、還
元剤の種類および使用量ならびにインキュベーシ日ンの
条件に適合するように予備試験した上で選択すべきであ
る． また、上記発光量についての相対活性は、上述の発光量
測定試料の調製において界面活性剤を添加しない以外は
同様に実施して測定した試料の０時間（注、経過時間ゼ
ロ）のエクオリン活性を１００とした％で示した（注、
後述第３表参照）．本発明の方法（前述（４）の発明）
は、また、再生エクオリンに界面活性剤を添加すること
による再生エクオリンの安定な保存方法である．再生エ
クオリンとは、例えば上述のようにアポエクオリンとセ
レンテラジンとをｍｌ溶液中で反応させて得られるエク
オリンをいう。再生エクオリン（ｔａ液）に界面活性剤
を添加する方法および該添加物に界面活性剤を添加する
方法も上述と同様である，後述の第４表から明らかなよ
うに、再生エクオリンをそのま）の状態（注、反応で再
生させた溶液状態）で適温に保存してもエクオリン活性
（注、発光能力）が最高能力に到達するには、比較的長
時間を要する（注、１０〜２０時間若しくはそれ以上）
．これに対し、本発明の方法によれば、再生エクオリン
に通常の界面活性剤（　０．０１〜ｌＯｍｇ／ｆＬ好ま
しくは０．１〜１　　ｅｒｇ／１２　）を添加すること
によりエクオリン活性を急速に向上させることができ、
好ましい添加条件によれば２〜４時間で相対活性１００
％の状態になり、その後も相対活性は向上して好ましい
添加条件の下では、３００〜７００％にも達する．この
事実は、該活性に対する界面活性剤の増感的効果を示唆
している．［発明の効果］ 本発明のエクオリンの増感発光に関する方法の有用性は
、当業者に自明である．また、適当な蛍光物質を共存せ
しめることにより、エクオリンの発光の増感が可能にな
る．このような物貢自体は、当業者に周知である． 上記の開示により、当業者は、特許請求された本発明を
実施できる．しかし、この技術の理解を増すために，本
発明に重要なエクオリンの増感発光に使われる手順を実
施例によって明らかにする． ［実施例］ 実施例１［界面活性剤の共存下におけるエクオリン増感
発光の時間経過］ アポエクオリン（１０ｎｇ／　ａ　１　）水溶液ｓｏμ
ｘ，２００ＩＩＩＭ　Ｔｒｌｓ　ＨＣＩ　　（ｐ｝１７
．６）　　１００ｍｌＪ　ＥＤＴ＾バッファ−５０μ角
、セレンテラジン（２００ｍｇ／ｓｊ！　）メタノール
液５μｌ、２−メルカブトエタノール５μぶを混合し、
＆後に水で５００μぶとした。

混合後４℃下に２６時間インキエベートした．５０μ角
ずつ別のチューブに分取し、それぞれのチューブに界面
活性剤（商品名）　Ｔｗｅｅｎ　（２０、４０、６０、
８０、８５）の各種濃度の水溶液５０μ℃を添加し、混
合し赴後、氷水中にインキエベートした．所定の時間ご
とにｌＯμぶサンプリングし、該サンプルについてルミ
フォトメーター（　ＴＤ４０００）にて、３０１Ｍ　Ｃ
ａＣ１ｚ、３０ｍＭ　丁ｒｌｓ　｝ＩＣＩ　（ｐｌｌ７
．６）水溶液をｌＯＯμ角添加後の発光量（エクオリン
活性）を測定した．その結果を第３表に示す． 第 ３ 表 実施例２［界面活性剤の共存下にお廖ナるエクオリン再
生の時間経過］ 実施例！のエクオリン再生系に極々濃度の界面活性剤（
　Ｔｗｅｅｎ　２０、４０，６０、８０、８５）を共存
させ、氷水中で再生した． 所定の時間後にサンプリングし、ル主フォトメーター（
ＴＤ４０００）にて，３０ｍＭ　ｌ：ａｃ１ｍ、３０ｍ
Ｍ　ＴｒＩｓＭＣＩ　（ｐ｝１７．８）水溶液を１００
μ℃添加後の発光量（エクオリン活性）を測定した． その結果を下記第４表に示す，　　Ｏ．ｌｉｇ／ｍｊ！
の濃度では、全てのＴｗａｅｎにおいてエクオリン発光
の増感がみられたが、再生速度の増加はないようであっ
た， 以上のことから界面活性剤は、エクオリン再生前であっ
ても再生後であっても、エクオリン発光を増強し、エク
オリンの安定な状態を維持することがわかった。

また、第２表に示すような蛍光物質の共存により、さら
にエクオリン発光が増感されることが期待できる．さら
に、第４図に示すようにエクオリンの発光はジオクセタ
ン中間体を経由して生ずることから、ジオキセタン類や
セレンテラジンの化学発光反応においても同様な界面活
性剤の増感効果が生ずると予想される。

【図面の簡単な説明】

第１〜４図は、本発明の説明図である．第１図は、ジオ
キセタンの化学構造を示す．第２図はセレンテラジンの
化学構造を示す。第３図はエクオリンの構造の概略図を
示す．第４図はエクオリンの発光、再生のメカニズムを
示す．以上 特許 出 願人 チッソ株式会社

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　エクオリン及びその誘導体を用いる発光法にお
   いて界面活性物質を共存させることを特徴とする増感発
   光法。
2. （２）　界面活性物質として陰イオン界面活性剤、陽イ
   オン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤
   、天然界面活性剤、高分子界面活性剤若しくは特殊界面
   活性剤を用いる特許請求の範囲第１項に記載の増感発光
   法。
3. （３）　エクオリン誘導体が変異エクオリン、半合成エ
   クオリン若しくは半合成変異エクオリンである特許請求
   の範囲第１項に記載の増感発光法。
4. （４）　エクオリンに界面活性剤を共存させることを特
   徴とする再生エクオリンの安定な保存方法。