【発明の詳細な説明】
本発明は新規なステロイド化合物に関し、さら
に詳しくは11位にヘミサクシネート−抗原性蛋白
質を有する17α−ヒドロキシプロゲステロン測定
用抗原に関する。
副腎皮質ホルモンであるコルチゾールは体内で
プロゲステロンから17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン、11−デソキシコルチゾールを経て生合成さ
れることが知られている。即ち、17α−ヒドロキ
シプロゲステロンからコルチゾールの生合成にお
いては21−水酸化酵素の存在が必要となる。
先天性副腎過形性（CAH）は小児に認められ
る副腎性器症候群の最も普遍的なものであり、副
腎皮質のコルチゾール産生系酵素の先天的欠損に
よつて起こる疾患で、副腎性男性ステロイド過剰
生成がその生因となつている。該CAHの大部分
は21−水酸化酵素欠損症であることが知られてお
り、その結果、17α−ヒドロキシプロゲステロン
から11−デソキシコルチゾールの生合成が阻害さ
れ、血中の17α−ヒドロキシプロゲステロンが増
加する。
かくして、17α−ヒドロキシプロゲステロンの
測定は、CAHを診断する上で極めて重要である。
従来、17α−ヒドロキシプロゲステロンに特異
的に反応する抗血清を製造するための抗原とし
て、17α−ヒドロキシプロゲステロン−３−カル
ボキシメチルオキシム−BSAあるいは17α−ヒド
ロキシプロゲステロン−6α−サクシネート−
BSAを用いる方法が知られていた〔ホルモンと
臨床28巻773（1980）参照〕。
しかしながら、上記の方法では、17α−ヒドロ
キシプロゲステロンの３位をオキシム化して
BSA（牛血清アルブミン）を結合した化合物、若
しくは６位にヘミサクシネート−BSAを結合し
た化合物を抗原として抗体を製造しているが、こ
れらの抗体は被検液中に含まれるプロゲステロ
ン、17α−ヒドロキシプログネノロン、20α−ヒ
ドロキシプロゲステロンなどと反応し特異性が低
いという欠点があつた。
本発明者らは上記の如き欠点をもたない17α−
ヒドロキシプロゲステロンの検出方法につき鋭意
研究を行つた結果、下記式
式中、Ｙは抗原性蛋白質を示す、
で表わされる新規な17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサキクシネート−抗原性蛋白質結
合物を抗原として使用し、17α−ヒドロキシプロ
ゲステロンを免疫学的に測定するようにすれば極
めて感度よく且つ特異的に検出・定量できること
を見出した。
本願発明で使用する17α−ヒドロキシプロゲス
テロン−11−ヘミサクシネートは公知の方法（例
えば、アメリカ特許第4013688号公報参照）によ
り製造することができる。かくして、下記式（
−ａ）で表わされる17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネートが得られる。
次いで上記式（）の17α−ヒドロキシプロゲ
ステロン−11−ヘミサクシネート−抗原性蛋白質
結合物を得るには、上記式（−ａ）の17α−ヒ
ドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネート
と抗原性蛋白質を結合せしめる。
本明細書において、「抗原性蛋白質」とは、哺
乳動物に免疫せしめた時、それに対する抗体を形
成せしめる能力のある蛋白質を意味し、例えば、
ウシ血清アルブミン（BSA）、ウサギ血清アルブ
ミン（RSA）、ヒト血清アルブミン（HSA）、卵
アルブミン（EA）等が挙げられるが、本発明で
は、中でも、BSA及びRSAが好適に使用される。
式（−ａ）のステロイド化合物をかかる抗原
性蛋白質に結合する方法は、それ自体公知であ
り、例えばB.F.Erlanger et al. J. Biol. Chem
234 1090（1959）等の公知文献に記載の方法に従
つて行なうことができる。例えば、
(1) 混合酸無水物法
式（−ａ）のステロイド化合物を先ずハロ
炭酸アルキルエステル（例：クロルギ酸イソブ
チル）で処理して11−位の側鎖のカルボキシル
基を活性化し、しかる後BSA，RSA等の抗原
性蛋白質の水−有機溶媒溶液中に滴下すること
により行なうことができる。
(2) カルボジイミド法
式（−ａ）のステロイド化合物をジメチル
ホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒に溶解し
たのち、カルボジイミド化合物（例：ジシクロ
ヘキシルカルボジイミド）及びBSA，RSA等
の抗原性蛋白質を加え、脱水縮合によりアミド
結合を形成させる。
(3) 活性エステル法
式（−ａ）のステロイド化合物をジメチル
ホルムアミド、ジオキサンなどの溶媒に溶解し
たのち、活性エステル（例：ｐ−ニトロフエノ
ール）を加えて11−位の側鎖のカルボキシル基
を活性エステル誘導体にかえた後、BSA，
RSA等の抗原性蛋白質を加え、縮合せしめる
ことにより行うことができる。
このようにして形成された17α−ヒドロキシプ
ロゲステロン−11−ヘミサクシネート−抗原性蛋
白質結合物は、次いでそれ自体公知の方法に従
い、哺乳動物に免疫して、抗血清を調製すること
ができる。
免疫用の哺乳動物としては、例えば家兎、山
羊、めん羊、モルモツト、等が挙げられ、これら
哺乳動物の上記抗原による免疫は常法に従つて行
なわれる。その際、例えばコンプリートフロイン
ドアジユバンド等のアジユバントを併用すること
により有効に抗血清をつくることができる。
得られた抗血清は、それ自体公知の方法に従
い、前記抗原をつくる際に用いたと同じ抗原性蛋
白質で吸収し、アルコール沈殿又は塩析等の手段
で分画することにより、精製することができる。
本発明においては、特に、前記式（）の抗原
を家兎又は山羊に２〜５ケ月間追加免疫をするこ
とにより得られる、抗体力価が10000〜50000、好
ましくは25000〜50000倍の範囲内で且つ抗体の結
合親和定数が103〜1011／mol、好ましくは1010
〜1011／molの範囲の抗体が好適である。
ここで「抗体力価」とは、得られた抗体を使用
したRIA法において、最適な標準曲線が得られる
至適倍数を表わし、また、「抗体の結合親和定数」
は、抗原と抗体とが結合した時の親和力を一般に
結合親和性と呼び、実験的には結合した抗原と非
結合抗原との比率が１の時の抗原の濃度をＫ値で
示したものである。
本発明により提供される上記抗体は、後記実施
例に示す如く、それぞれの親化合物との交叉反応
率がほぼ100％で且つ他の代謝物あるいは構造類
似物との交叉反応率は大体３％以下であつて、極
めて特異性の高い抗血性でありこれはそのまま或
いは適当な担体に感作乃至結合させた後、ラジオ
イムノアツセイ、免疫学的凝集阻止反応、フオト
イムノアツセイによる17α−ヒドロキシプロゲス
テロンの検出・定量のための試薬として極めて有
利に使用することができる。
これらラジオイムノアツセイ、免疫学的凝集阻
止反応、フオトイムノアツセイの操作それ自体は
いずれも周知のものであり、例えば、栃木武一
ら、ホルモンと臨床24 69（1976）；花田芳郎ら、
モルモンと臨床24 59（1976）；特公昭58−11575
号公報等の文献に記載されており、これらの方法
は本発明の抗体に対してもそのまま適用すること
ができる。
次に実施例及び参考例を掲げて本発明をさらに
説明する。
実施例 １
17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミ
サクシネート−BSAの製造
17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサ
クシネート30mgをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
0.75mlに溶解し、これに４℃以下でトリ−ｎ−ブ
チルアミン16μを添加したのち、イソブチルク
ロロカーボネート8.4μを加え30分間撹拌を続け
た。該溶液に予めBSA（牛血清アルブミン）87.8
mgを2.1mlの精製水にて溶解し、1N水酸化ナトリ
ウム液112.5μ及びジメチルホルムアミド1.5ml
を順次加え、８℃とした溶液を添加混合した。次
いでこれを８℃で撹拌し、１時間後に1N水酸化
ナトリウム液7.5μを加え、さらに3.5時間撹拌
した。次いでセフアデツクスＧ−25によるゲル
過を行い、未反応の17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート及びトリ−ｎ−ブチ
ルアミン等の低分子試薬を分離した。次いで該溶
液を精製水に対し透析したのち、凍結乾燥して
17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサク
シネート−BSAを粉末として得た。
BSA1モル当りの17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネートの結合モル数は17α
−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘミサクシネ
ート−BSA、17α−ヒドロキシプロゲステロン−
11−ヘミサクシネート及びBSAそれぞれの一定
濃度溶液の紫外部吸収スペクトルから求めた結果
28モルであつた。
参考例
抗17α−ヒドロキシプロゲステロン−11−ヘ
ミサクシネート抗体の製造
実施例１で製造した17α−ヒドロキシプロゲス
テロン−11−ヘミサクシネート−BSA2mgを１ml
の生理食塩水に溶解し、同量のコンプリートフロ
インドアジユバンドで乳化し、成熟家兎の皮下及
び足蹠に注射した。この注射を１ケ月間隔で行な
い、抗体価の上昇を確認後全採血を行ない抗血清
を得た。この抗血清を56℃30分間非働化後BSA
で吸収し、抗17α−ヒドロキシプロゲステロン−
11−ヘミサクシネート抗体を得た。
上記で得られた抗17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−11−ヘミサクシネート抗体は17α−ヒドロ
キシプロゲステロンとの交叉反応を100％とした
時、他のステロイホルモンとは交叉反応がほとん
どなく、極めて特異性の高いものである。その交
叉反応率を下記第１表に示す。また、上記抗体の
特異性を、神戸川ら（ホルモンと臨床28巻773頁、
1980年）の製造した17α−ヒドロキシプロゲステ
ロン−３−カルボキシメチルオキシム−BSA及
び17α−ヒドロキシプロゲステロン−6α−ヘミサ
クシネート−BSAを抗原として家兎に免疫して
得た抗血清と、本発明者が製造した17α−ヒドロ
キシプロゲステロン−11−ヘミサクシネート−
BSAの抗血清と比較した。その結果を第１表に
併せて表示する。
【表】
【表】
上記第１表から、11位にヘミサクシネート−抗
原性蛋白結合体を用いて製造した抗血清の方が３
位又は６位に抗原性蛋白質をつけたものより交叉
反応性が低い。特に17α−ヒドロキシプレグネノ
ロン及びプロゲステロンに対しては従来法と較べ
交叉反応が約１／２〜１／４と極めて低い。よつ
て本発明による抗血清は極めて特異性の高いもの
であり、被検液中の17α−ヒドロキシプロゲステ
ロンを正確に測定することができる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a novel steroid compound, and more particularly to an antigen for measuring 17α-hydroxyprogesterone having a hemisuccinate-antigenic protein at the 11th position. It is known that cortisol, an adrenal cortical hormone, is biosynthesized in the body from progesterone through 17α-hydroxyprogesterone and 11-desoxycortisol. That is, the presence of 21-hydroxylase is required for the biosynthesis of cortisol from 17α-hydroxyprogesterone. Congenital adrenal hypermorphism (CAH) is the most common adrenogenital syndrome observed in children, and is a disease caused by a congenital defect in the cortisol-producing enzyme in the adrenal cortex, resulting in adrenal male steroid overproduction. is the cause of this. It is known that the majority of CAH patients have 21-hydroxylase deficiency, and as a result, the biosynthesis of 11-desoxycortisol from 17α-hydroxyprogesterone is inhibited, and 17α-hydroxyprogesterone in the blood is reduced. To increase. Thus, measurement of 17α-hydroxyprogesterone is extremely important in diagnosing CAH. Conventionally, 17α-hydroxyprogesterone-3-carboxymethyloxime-BSA or 17α-hydroxyprogesterone-6α-succinate- has been used as an antigen for producing antiserum that specifically reacts with 17α-hydroxyprogesterone.
A method using BSA was known [see Hormones and Clinical Sciences 28, 773 (1980)]. However, in the above method, the 3-position of 17α-hydroxyprogesterone is converted into an oxime.
Antibodies are produced using a compound that binds BSA (bovine serum albumin) or a compound that binds hemisuccinate-BSA at the 6th position as an antigen, but these antibodies do not react with progesterone or 17α-hydroxyproglyceride contained in the test solution. The drawback was that it reacted with nenolone, 20α-hydroxyprogesterone, etc. and had low specificity. The present inventors have proposed a 17α-
As a result of intensive research on the detection method of hydroxyprogesterone, we found the following formula: 17α-hydroxyprogesterone is immunologically measured using a novel 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisaxuccinate-antigenic protein conjugate represented by: where Y represents an antigenic protein as an antigen. It has been found that detection and quantification can be carried out with extremely high sensitivity and specificity. 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate used in the present invention can be produced by a known method (for example, see US Pat. No. 4,013,688). Thus, the following formula (
17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate represented by -a) is obtained. Next, to obtain the 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate-antigenic protein conjugate of the above formula (), the 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate of the above formula (-a) and the antigenic protein are combined. As used herein, the term "antigenic protein" refers to a protein that has the ability to form antibodies against a mammal when immunized with it; for example,
Examples include bovine serum albumin (BSA), rabbit serum albumin (RSA), human serum albumin (HSA), and egg albumin (EA), among which BSA and RSA are preferably used in the present invention. Methods of binding steroid compounds of formula (-a) to such antigenic proteins are known per se, for example as described by BFErlanger et al. J. Biol. Chem
234 1090 (1959) and other known documents. For example, (1) Mixed acid anhydride method The steroid compound of formula (-a) is first treated with a halocarbonic acid alkyl ester (e.g. isobutyl chloroformate) to activate the carboxyl group of the side chain at the 11-position, and then This can be carried out by dropping an antigenic protein such as BSA or RSA into a water-organic solvent solution. (2) Carbodiimide method After dissolving the steroid compound of formula (-a) in a solvent such as dimethylformamide or dioxane, a carbodiimide compound (e.g. dicyclohexylcarbodiimide) and an antigenic protein such as BSA or RSA are added, and the amide is formed by dehydration condensation. Form a bond. (3) Active ester method After dissolving the steroid compound of formula (-a) in a solvent such as dimethylformamide or dioxane, an active ester (e.g. p-nitrophenol) is added to remove the carboxyl group in the side chain at the 11-position. After changing to active ester derivative, BSA,
This can be done by adding an antigenic protein such as RSA and condensing it. The 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate-antigenic protein conjugate thus formed can then be used to immunize a mammal with a method known per se to prepare an antiserum. Mammals for immunization include, for example, domestic rabbits, goats, sheep, guinea pigs, etc. Immunization of these mammals with the above antigens is carried out according to conventional methods. At this time, antiserum can be effectively produced by using an adjuvant such as Complete Freund's Adjuvant. The obtained antiserum can be purified by absorbing it with the same antigenic protein used to produce the antigen and fractionating it by means such as alcohol precipitation or salting out, according to a method known per se. . In the present invention, in particular, the antibody titer is within the range of 10,000 to 50,000, preferably 25,000 to 50,000 times, obtained by boosting rabbits or goats with the antigen of formula () for 2 to 5 months. and the binding affinity constant of the antibody is 10 3 to 10 11 /mol, preferably 10 10
A range of ˜10 11 /mol of antibody is preferred. Here, "antibody titer" refers to the optimal fold at which an optimal standard curve can be obtained in the RIA method using the obtained antibody, and "antibody binding affinity constant"
The affinity when an antigen and an antibody bind is generally called binding affinity, and experimentally, the K value is the concentration of antigen when the ratio of bound antigen to unbound antigen is 1. be. As shown in the Examples below, the above antibodies provided by the present invention have a cross-reactivity rate of approximately 100% with each parent compound, and a cross-reactivity rate of approximately 3% or less with other metabolites or structural analogs. 17α-Hydroxyprogesterone, which has extremely highly specific anti-blood properties, can be used as it is or after being sensitized or conjugated to an appropriate carrier by radioimmunoassay, immunological agglutination inhibition reaction, or photoimmunoassay. It can be extremely advantageously used as a reagent for the detection and quantification of The operations of these radioimmunoassays, immunological agglutination inhibition reactions, and photoimmunoassays are all well known; for example, Takeichi Tochigi et al., Hormone and Clinical Practice 24 69 (1976); Yoshiro Hanada et al.
Mormon and Clinical Studies 24 59 (1976); Special Publication Showa 58-11575
These methods can be directly applied to the antibody of the present invention. Next, the present invention will be further explained with reference to Examples and Reference Examples. Example 1 Production of 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate-BSA 30 mg of 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate was dissolved in N,N-dimethylformamide.
After dissolving the mixture in 0.75 ml and adding 16 .mu. of tri-n-butylamine at 4.degree. C. or below, 8.4 .mu. of isobutyl chlorocarbonate was added and stirring was continued for 30 minutes. Add BSA (bovine serum albumin) 87.8 to the solution in advance.
Dissolve mg in 2.1ml of purified water, 112.5μ of 1N sodium hydroxide solution and 1.5ml of dimethylformamide.
were added sequentially, and the solution was brought to 8°C and mixed. Next, this was stirred at 8°C, and after 1 hour, 7.5μ of 1N sodium hydroxide solution was added, and the mixture was further stirred for 3.5 hours. Next, gel filtration was performed using Sephadex G-25 to separate unreacted 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate and low molecular weight reagents such as tri-n-butylamine. The solution was then dialyzed against purified water and then freeze-dried.
17α-Hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate-BSA was obtained as a powder. The number of moles of 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate bound per mole of BSA is 17α
-Hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate-BSA, 17α-hydroxyprogesterone-
11-Results determined from the ultraviolet absorption spectra of fixed concentration solutions of hemisuccinate and BSA, respectively.
It was 28 moles. Reference example Production of anti-17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate antibody 1 ml of 2 mg of 17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate-BSA produced in Example 1
was dissolved in physiological saline, emulsified with the same amount of Complete Freund's Adjuvant, and injected subcutaneously and into the footpads of adult rabbits. This injection was performed at monthly intervals, and after confirming an increase in antibody titer, whole blood was collected to obtain antiserum. After inactivating this antiserum at 56℃ for 30 minutes, BSA
Absorbed by anti-17α-hydroxyprogesterone
11-hemisuccinate antibody was obtained. The anti-17α-hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate antibody obtained above has extremely high specificity, with almost no cross-reactivity with other steroid hormones when the cross-reactivity with 17α-hydroxyprogesterone is 100%. be. The cross-reactivity rate is shown in Table 1 below. In addition, the specificity of the above antibodies was determined by Kobegawa et al.
Antiserum obtained by immunizing rabbits using 17α-hydroxyprogesterone-3-carboxymethyloxime-BSA and 17α-hydroxyprogesterone-6α-hemisuccinate-BSA as antigens produced by the inventor (1980) and the antiserum produced by the present inventor. 17α-Hydroxyprogesterone-11-hemisuccinate-
compared with BSA antiserum. The results are also shown in Table 1. [Table] [Table] From Table 1 above, the antiserum produced using a hemisuccinate-antigenic protein conjugate at position 11 has a lower
It has lower cross-reactivity than those with an antigenic protein attached at position 6 or position 6. In particular, the cross-reactivity for 17α-hydroxypregnenolone and progesterone is extremely low, about 1/2 to 1/4 compared to conventional methods. Therefore, the antiserum according to the present invention has extremely high specificity and can accurately measure 17α-hydroxyprogesterone in a test fluid.