JPH0315385A

JPH0315385A - 新規アルカリプロテアーゼａｐｇ５０１生産菌株

Info

Publication number: JPH0315385A
Application number: JP14492490A
Authority: JP
Inventors: Yasuto Watanabe; 渡辺　保人; Shigeyuki Takenishi; 竹西　繁行; Hirobumi Nakano; 博文中野; Shiyougo Katsushiro; 勝城　昇悟; Toshihiro Kuno; 智弘久野; Shiro Abe; 阿部　士朗
Original assignee: Gunze Ltd; Osaka City Government
Current assignee: Gunze Ltd; Osaka City Government
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 1991-01-23
Also published as: JPH0523741B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明はバチルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新
規アルカリブロテアーゼＡＰＧ５０１生産菌に関する。

発明の背景従来から種々のアルカリプロテアーゼが知られており、
繊維、洗剤、皮革加工、食品等の広範な分野で利用され
ている。

近年、繊維の分野において、絹織物の精練にこのアルカ
リブロテアーゼを用いる酵素精練法が提案され、本発明
者らは用いるアルカリプロテアーゼについて種々研究を
重ねた。その間に、バチルス属に属するある種の新菌株
が該酵素精練に適する新規なアルカリブロテアーゼＡＰ
Ｇ５０１を生産することを見出し、本発明を完成するに
いたった。

発明の開示本発明の生産菌が生産する新規アルカリプロテアーゼＡ
ＰＧ５０１は以下の理化学的性質を有する。

（ａ）アルカリ領域でプロテアーゼ作用を有する、（ｂ
）セリシンに対して特に高い特異的なプロテアーゼ作用
を有し、その至適ｐＨは８．５〜９、至適温度は６０〜
６５℃、（ｃ）４℃において、ｐＨ５．５　〜１１の範囲で安定
、（ｄ）ｐＨ　７　．　０において、５０℃まで安定、６
０℃から失活開始、７０℃で完全に失活、（ｅ）活性発
現ならびに安定化に金属イオンを必要とせず、ジイソプ
ロビルフルオロリン酸塩（ＤＦＰ）で著しく活性が阻害
される、（ｒ）超遠心法による分子量１　６３００、ゲル濾過法
による分子量１９０００，（ｇ）　７　．　５％ポリアクリルアミドゲルによるデ
ィスク電気泳動（ｐＨ９．４）において、０．Ｏｌ％プ
ロモフェノールブルー（ＢＰＢ）の移動を１とした場合
、酵素蛋白の泳動は０．１４、（ｈ）焦点電気泳動による等電点は６．９６、（ｉ）リ
ジン５、ヒスチジン３、アルギニン２、アスパラギン酸
！４、スレオニンｌ３、セリン２０、グルタミン酸６、
プロリンｌ１グリシン１７、アラニン２０、バリン１５
、メチオニン２、イソロイシン４、ロイシン８、チロシ
ン７、フェニルアラニン２、トリプトファン０、および
システインＯのアミノ酸組成を有する。

アルカリプロテアーゼＡＰＧ５０１は、ことに、セリシ
ンに対して高い特異性を有し、分子量が比較的小さく、
等電点が低い点で公知のアルカリプロテアーゼと区別さ
れる。

アルカリプロテアーゼＡＰＧ５０１の活性はつぎのよう
にして測定する。

製糸工程での絹糸屑を浴比ｌ：１８にて、１１０℃で６
０分間熱水溶出を行ない、この溶出液を２７５ｒ＋ｎ＋
における吸光度が４．０になるように水で凋整してセリ
シン溶出液を調製する。このセリシン溶出液２．　５　
＊Ｑｓ検体酵素液０　．　１　ｘ（ｌおよび０．３Ｍ炭
酸ナトリウム−０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ　１　０．０）０．５１１２を混合し、６０℃でｌＯ
分間反応させる。ついで、反応液に１０％トリクロロ酢
酸（ＴＣＡ）溶液３　．　０　＊Ｑを加えて反応を停止
させ、氷水中に３０分間放置後、遠心分離（１　７　０
　０　０Ｇ）Ｉ，、上澄液の２７５ｎ一における吸光度
を測定する。２７５ｒ＋ｍにおける吸光度１はチロシン
４．５マイクロモルに相当する。この条件下、１分間に
１マイクロモルのチロシンに相当する可溶性窒素化合物
を生成する酵素活性を１単位とする。

該新規アルカリプロテアーゼＡＰＧ５０１は、本発明の
バチルス属に属する新規な微生物により生産される酵素
である。該微生物は本発明者らにより、京都府綾部市で
採取した土壌から分離され、その代表的な菌株であるバ
チルス・エス・ピイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｐ．）９
　１　１　１　−　５　Ｂ株は、微工研菌寄第８５２０
号の下、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。

バチルス・エス・ピイ９１１１−５Ｂ株（微工研菌寄第
８５２０号）の菌学的性質を以下に示す。

形態学的特徴（１）細胞の大きさ、形栄養細胞０．３〜０．５μ麗×０．７〜１．５μｌ１短
桿菌。

（２）多形性細胞が０．５μ友Ｘ３．Ｏμ創こ伸長することがある。

（３）運動性運動性あり。

（４）鞭毛周毛を有する。

（５）胞子０．４〜０．５μＩＸ０．７〜１．２μ肩の卵形の耐熱
性胞子を細胞のほぼ中央に形成する。

（６）ダラム染色ダラム陽性である。

（７）抗酸性抗酸性なし。

種々の培地上での生育状態（１）肉汁寒天平板培養円形コロニーを形成、仮板状、縁および中心に隆起あり
（半レンズ状）。コロニーは平滑、白クリーム色で、つ
やがある。

（２）肉汁寒天斜面培養生育良好、仮根状、表面荒く、白褐色、部分的にしわを
生じる。

（３）肉汁液体培養菌膜を形成し、菌膜のすぐ下に混濁を生じる。

（４）肉汁寒天高層培養表面の生育良好、穿刺部位に生育、白褐色、しわ、水滴
有り。

（５）肉汁ゼラチン穿刺培養約１週間で層状に液化、１０日で約１　ｃａｌこ及ぶ。

菌体は表面に生育する。

（６）リトマスミルク約３０日後にミルク凝固、リトマス変色なし。

生理的性質第ｌ表に示すとおりである。

第！表＊＊：　　１６％で生育可能、！６．５％以上生育せず
。

糖分解テスト第２表に示すとおりである。表中の記号はっぎの意味を
有する。

＋：酸生成、±：部分的酸生成、一二酸生成せずなお、
いずれもガス発生は認められなかった。

＊　：　嫌気的に糖を分解。

第２表９１１１−５Ｂ株の以上の諸性質をバージエーズ・マニ
ュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー
第８版（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆＤｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．
　８　ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載されるバチルス属
の既知菌種のうちの近似するバチルス・ファーマス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｆｉｒｍｕｓ）の諸性質と比較した。

その結果（１）バチルス９１１１−５Ｂ株は嫌気性条件
下でも寒天培地上で生育できるが、バチルス・ファーマ
スは嫌気性条件下では生育できない。（２）バチルス９
１１１−５Ｂ株は５２℃で生育できるが、バチルス・フ
ァーマスは４５℃より高温では生育できない。（３）バ
チルス９１１１−５Ｂ株はｐＨ５〜ｌ２の広いｐＨ範囲
で生育できるが、バチルス・ファーマスはｐＨ　６　．
０以上でないと生育できない、という点で９１１１−５
Ｂ株はパチルス・ファーマスと明確に区別できる別異の
菌種を構成するものであり、したがって、バチルス属に
属する新菌種と判断した。

かくして、新規アルカリプロテアーゼＡＰＧ５０ｌは本
発明の新規生産菌であるバチルス・エス・ピイ９１１１
−５Ｂ株を栄養培地にて培養し、培養物中にＡＰＧ５０
１を蓄積させ、該培養物からＡＰＧ５０１を採取するこ
とにより得られる。他の細菌と同様、９１１１−５Ｂ株
は、例えば、紫外線、Ｃｏ＠１１、Ｘ線などの照射、種
々の変異誘発剤の使用などによる人工的変異手段によっ
て変異できるものであり、そのような変異株も、ＡＰＧ
５０１生産能を有する限り本発明乾囲のものである。さ
らに、９１１１−５Ｂ株およびその変異株以外の菌株で
も、ＡＰＧ５０１生産能を有する閑株であれば、いずれ
も本発明範囲のものである。

以下、代表的な例として、９１１１−５Ｂ株を用いるＡ
ＰＧ５０１の生産について説明する。

９１１１−５Ｂ株の培養本菌株の培養には液体培地を用いる通常の好気的培養法
が採用できる。培地の炭素源としては澱粉、デキストリ
ン、グルコース等の各種の糖類が単独または組み合わせ
て用いられる。窒素源としては、大豆粕、大豆粉、酵母
エキス、ミルクカゼイン、コーンスティープリカー等を
単独または組み合わせて用いることができる。その他、
適宜、無機塩類等を添加することができる。培養は、一
般に、好気的条件下、２０〜４０℃、ｐＨ７．０〜１０
．０にて、２４〜１４４時間程度行なわれる。

この培養により、培養物中にアルカリプロテアーゼＡＰ
Ｇ５０１が蓄積される。

ＡＰＧ５０１の採取　　製培養物中からのアルカリプロテアーゼＡＰＧ　５０！の
採取、精製には、微生物代謝産物をその培養物中から単
離、精製するために通常採用される方法が用いられる。

例えば、培養終了後、珪藻土などの濾過助剤を用いた濾
過または遠心分離により培養物中に存在する菌体や培地
残渣を除去し、分両分子量５０ＱＯの限外濾過で濃縮し
、液状の粗酵素を得る。この粗酵素を、必要により、さ
らに、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過で
精製し、凍結乾燥して所望の精製アルカリプロテアーゼ
ＡＰＧ５０１が得られる。

得られたアルカリプロテアーゼＡＰＧ５０１は、前記の
ごとく、セリシンに対して特に高い基質特異性を有して
おり、繊維工業において、絹織物等の酵素精製に好適に
用いられるが、ＡＰＧ５０１は、また、カゼインやヘモ
グロビン等の他の各種の蛋白に対しても同様な条件下で
プロテアーゼ作用を示し、繊維工業に限らず、洗剤、皮
革加工、食品等、公知のアルカリブロテアーゼと同様な
分野で利用することができる。なお、前記の濃縮粗酵素
液および公知の乾燥方法による粗酵素、粉体、粉粒体の
状態でも、充分なアルカリプロテアーゼ作用が得られる
ので、該粗酵素も本発明のアルカリプロテアーゼに包含
されるものである。

つぎに参考例および試験例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。

参考例！大豆カゼイン０．５％、グルコース０．５％、酵母エキ
ス０．１％、Ｋ，ＨＰ０．０．１％およびＭｇＳＱ．−
７Ｈ，０　　０．０２％を含有し、ＮａｔＣＯｓでｐＨ
９に調整した液体培地を５００１１２蓉の坂口フラスコ
にｌ００ｊＩｉ２分注し、滅菌する。この培地に９１１
１−５Ｂ株を接種し、３０℃にて５日間、１３５回／分
で振盪培養する。

培養肢を１８０００Ｇで遠心分離し、上澄液を分画分子
量ｓｏｏｏの限外濾過で濃縮して１０８単位／ｊｌ＆の
粗酵素液１５ｍｌ２を得る。

この粗酵素液をカチオン交換イオンクロマトグラフィー
、ついで、ポリビニル系のゲルによるゲル濾過に付し、
凍結乾燥を行なうことにより前記（ａ）〜（ｉ）の理化
学的性質を有する粉末状の所望の精製アルカリプロテア
ーゼＡＰＧ５０１　　１．５８抑を得る。

添付の第ｌ図および第２図に、得られたアルカリプロテ
アーゼＡＰＧ５０１の活性に対するｐｉ−１および温度
の影響を示す。これらは、前記の活性測定法に従って、
各々、ｐ｝｛および温度を変化させて活性を測定し、最
大活性を１００％とした場合の相対活性を示すグラフで
ある。第１図および第２図に示すごとく、アルカリプロ
テアーゼＡＰＧ５０　１はセリシンに対する作用至適ｐ
Ｈが８．５〜９、至適温度が６０〜６５℃である。

また、添付の第３図および第４図に得られたアルカリプ
ロテアーゼＡＰＧ５０１の酵素活性のｐＨ安定性および
温度安定性を示す。ｐ｝｛安定性はｐＨ４〜１１の範囲
で５°Ｃ：　１６時間処理した後の残存活性を、また、
温度安定性は３０〜８０℃の範囲でｐＨ７にて１０分間
処理した後の残存活性を前記の活性測定法に従って測定
した。第３図および第４図に示すごとく、アルカリブロ
テアーゼＡＰＧ５０１は４℃においてｐＨ５．５〜ｌ１
の範囲で安定であり、ｐＨ　７　．　０において５０℃
まで安定で、６０℃から失活を開始し、７０℃で完全に
失活する。

参考例２脱脂大豆粕０．５％、デキストリン１．０％、コーンス
ティープリカー０．５％、Ｋ，ＨＰ０．Ｏｌ％およびＭ
　ｇ　Ｓ　Ｏ　ａ・７Ｈ，Ｏ　　Ｏ．０２％を含有し、
ＮａｔＣＯａでｐＨ９に調整した液体培地１．３Ｑを滅
菌後、ミニジャーに入れ、９１１１−５Ｂ株を接種する
。これを、３００ｒ．ｐ劃．で撹拌下、０．３ｆ２／分
で通気しながら、３０℃にて３日間培養する。

培養液を、セライトでコートしたフィルター・プレスで
濾過し、分画分子量５０００の限外濾過で１　８．１倍
に濃縮し９３０単位／ｘｌ２の粗酵素液７２ｉＣ（酵素
収率約７０％）を得る。

得られた酵素の絹織物精練効果を試験した。

試験１３．０φＸ１９．５Ｃ１！の大型試験管を用い、未精練
の絹織物２９を、各々、液比ｌ：３０で、つぎのとおり
処理して酵素精練試験を行なった。

（１）前処理ケイ酸ナトリウム（ｌ８゜Ｂ　ｅ）　４　９／Ｑおよび
ポリオキシエチレンラウリルエーテル０　．　５　９／
＋２を含有する処理液（ｐＨｌＯ）６０村を用い、９８
゜Ｃで４０分間処理。

（２）酵素処理無水炭酸ナトリウム０　．　５　９／（１，炭酸水素ナ
トリウム３９／ＱおよびアルカリプロテアーゼＡＰＧ　
５０１　　２００００単位／Ｑを含有する処理液（ｐＨ
　９０）６０ｍｌ２を用い、６０℃で１２０分間処理。

（３）後処理炭酸水素ナトリウムｌ　９／Ｑおよびボリオキシエチレ
ンラウリルエーテル０　．　５　９／１２を含有する処
理液（ｐＨ８．０）６０ｘｆを用い、９８℃で４０分間
処理。

つぎの式に示すごとく、当初の未精練生地重量に対する
各処理後の生地重量の減量率を脱セリシン率として、各
処理後の脱セリシン率を算出したところ、前処理後は１
２．４％、酵素処理後は２５．７％、後処理後は２７．
ｌ％と、良好な精練効果を示した。

試験２４０Ｑ角型処理槽を用い、未精練の絹原反８６０９を、
各々、液比ｌ：３５で、つぎのとおり処理して酵素精練
試験を行なった。

（１）前処理試験ｌと同じ処理液３０１２を用い、自然対流撹拌下に
４０分間沸騰処理。

（２）酵素処理無水炭酸ナトリウム０　．　５　９／（１，炭酸水素ナ
トリウム３　．　５　９ＩＱおよびアルカリプロテアー
ゼＡＰＧ５０１　　２２５００単位／１２を含有する処
理液（ｐＨ９．０）３　０（ｌを用い、５１２／分のボ
ンブ循環による撹拌下、６０℃で１２０分間処理。

（３）後処理試験ｌと同じ処理液３０ｆｆを用い、自然対流撹拌下に
６０分間沸騰処理。

試験ｌと同様に脱セリシン率を算出したところ、前処理
後は１３．１％、酵素処理後は２４、３％、後処理後は
２６．５％と、良好な精練効果を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、各々、アルカリプロテアーゼＡ
ＰＧ５０１の活性に対するｐ｝｛および温度の影響を示
すグラフである。第３図および第４図は、各々、アルカ
リプロテアーゼＡＰＧ５０１の安定性に及ぼすｐＨおよ
び温度の影響を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）バチルス属に属する、以下の理化学的性質を有す
る新規アルカリプロテアーゼＡＰＧ５０１生産菌（ａ）アルカリ領域でプロテアーゼ作用を有する、（ｂ）セリシンに対して特異的なプロテアーゼ作用を有
し、その至適ｐＨは８．５〜９、至適温度は６０〜６５
℃、（ｃ）４℃において、ｐＨ５．５〜１１の範囲で安定、（ｄ）ｐＨ７．０において、５０℃まで安定、６０℃か
ら失活開始、７０℃で完全に失活、（ｅ）活性発現ならびに安定化に金属イオンを必要とせ
ず、ジイソプロピルフルオロリン酸塩（ＤＦＰ）で著し
く活性が阻害される、（ｆ）超遠心法による分子量１６３００、ゲル濾過法に
よる分子量１９０００、（ｇ）７．５％ポリアクリルアミドゲルによるディスク
電気泳動（ｐＨ９．４）において、０．０１％ブロモフ
ェノールブルー（ＢＰＢ）の移動を１とした場合、酵素
蛋白の泳動は０．１４、（ｈ）焦点電気泳動による等電点は６．９６、（ｉ）リ
ジン５、ヒスチジン３、アルギニン２、アスパラギン酸
１４、スレオニン１３、セリン２０、グルタミン酸６、
プロリン１、グリシン１７、アラニン２０、バリン１５
、メチオニン２、イソロイシン４、ロイシン８、チロシ
ン７、フェニルアラニン２、トリプトファン０、および
システイン０のアミノ酸組成を有する。
（２）バチルス・エス・ピイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ
．）９１１１−５Ｂ（微工研菌寄第８５２０号）である
前記第（１）項の生産菌。