JPH03133935A - ヒト天然型インターロイキン６組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明はヒト線維芽細胞からヒトインターフェロンβ
を産生させるためのスーパーインダクション法で同時産
生された天然型のヒトインターロイキン６に関する。本
発明に係るヒト天然型インターロイキン６は、免疫不全
症、骨髄移植後などの骨髄抑制、血小板減少症等に汎く
治療築として利用しうる有用な物質である。また、血中
などのインターロイキン６濃度を測定するための標準品
としても有用である。

［従来の技術］ 抗原刺激を受けたＢ！ｊＡ胞が、抗体産生細胞にまで分
化するのにＴ細胞由来の分化誘導因子が必要であること
が知られている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｎ、Ｂｉｏｌ、２３７
゜１５（１９７２））。Ｂ細胞を抗体産生細胞に分化さ
せる因子の総称はＢ　ＣＤ　Ｆ　（Ｂ　ｃｅｌｌ　ｄｉ
ｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｅｒ）と呼ばれて
いる。そしてこのＢＣＤＦはヒトの末梢血、扁桃などよ
り密度勾配遠心等でリンパ球を分離し、Ｅｐｓｔｅｉｎ
−ｎａｒｒ　Ｖｉｒｕｓを用イテヒトＢ細胞を形質転換
し、ヒトＢＣＤＦ産生Ｂ細胞株を樹立し、これを培養す
ることにより得られることがわかっている（特開昭６Ｏ
−１６９４２４）。また、リンパ球混合反応中細胞、マ
イトゲン刺激Ｔ細胞、Ｔ細胞ハイブリドーマなどを培養
することによって活性部位に糖鎖をもっＢＭＪ胞分化囚
子（ＴＲＴｉ’１）と糖鎖をもたないＢ細胞因子（ＴＲ
Ｆ２）が得られることがわかっている（特開昭６０−２
３７０２２　）。さらにＢ細胞分化囚子蛋白品として人
Ｔ細胞白血病ウィルスにより形質転換された大細胞によ
り生産されたＢ細胞分化因子が提唱された（特開昭６１
−１１５０２５　）。またｈｕｍａｎ　　Ｔ　　ｌｙｍ
ｐｈｏｔｒｏｐｉｃｖｉｒＬｌｓ　　ｔｙｐｅ　　Ｉで
形質転換させたヒトＴ細胞株の培養上清から分離したＢ
ＣＤＦ活性を有する分子１２１ｋｄの蛋白質はＢＳＦ−
２と呼ばれていた（Ｔ、ｌ１ｉｒａｎｏら、　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２．５４０
０（１９８５））。以上のようにＢ細胞やＴ細胞のよう
なリンパ球系の細胞が産生ずるＢ細胞分化因子が報告さ
れている。

その後、遺伝子操作技術のめまぐるしい進歩により、二
〇Ｂ細胞分化因子（ＢＳＦ−２）をコードする遺伝子の
ＤＮＡ配列、および蛋白質のアミノ酸配列が決定された
（特願昭６１−１８４８５８、特開昭（ｉ３−１５７９
９０　）。さらにこの遺伝子を用いて原核生物の細胞内
で複製可能なベクターＤＮＡよりなる組み換えＤＮＡに
より形質転換された原核生物細胞を培地中にて培養し、
生産されたヒトＢＣＤＦを採取することも可能となった
（特開昭６３−１５７９９６）。そして、このヒトＢＣ
ＤＦを有効成分とする免疫療法剤が癌・原発性・二次性
免疫不全症及びこれから′生じる各種感染症に対して有
効であることが見いだされた（特開昭６４−６３５２４
）。

一方、肝細胞の急性期蛋白を誘導する蛋白質としてＨＳ
　Ｆ　（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　　ｓｔｉｍｕｌａｔｉ
ｎｇ　　ｆａｃｔｅｒ）が知られていた（Ａｎｎ、Ｎ、
Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、４０８．９０（１９８３））。

二〇Ｈ８Ｆも研究の結果、機能的にはＢＣＤＦ　（ＢＳ
Ｆ−２）と同じであることが分かった（　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４．７２５１（
１９８７））。

また、インターフェロン活性をもつといわれる■ＦＮ−
β２　（ヨーロッパ公開特許Ｎ　ｏ、　　０２２０５７
４、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、
７７．７１５２（１９８０））や２６ｋｄ　　ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ｔｌＳＡ、７２．２７０８（１９８２））およびハイプ
リドーマ／プラズマサイトーマの増殖因子であるＨＰＧ
Ｆも同じ物質である゛ことがわかった（　５ｃｉｅｎｃ
ｅ、３２４．４１５（１９８６）　、　ＥＭＢＯ、Ｊ、
６．１２１９（１９８７）　、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１
６５，９１４．（１９８７）　）。

このように別々の活性で単離された蛋白質が実は同一物
質でありインターロイキン６と呼ぶことが提唱された（
Ｎａｔｕｒｅ、３２４．　７３（１９８６）、　　ＥＮ
ＩｌＯ，Ｊ、。

６．１２１９（１９８７））。

インターロイキン６は様々な細胞が産生ずることがわか
っている。上述のリンパ球のほかにヒト線維芽細胞をＰ
ｏ１ｙ（Ｉ）・Ｐｏ１ｙ（Ｃ）とシクロへキシミドを刺
激することで産生ずることが報告されている（Ｅｕｒ、
Ｊ、口ｉｏｃｈｅｍ、、１５９，６２５．（１９８６）
　）。誘導物質は多岐にわたりＩＬ−１，ＴＮＦ、ＰＤ
ＧＦ。

ＩＦＮ−β、ＬＰＳ、　　ウ゛イルスなども知られてい
る。また、ヒト血管内皮細胞、マクロファージ、ヒトグ
リオブラストーマなどが産生ずることも報告されている
。　（Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４２，１４４．（１９８９
）、　　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４１，１５２９．（１９８８）、
特開昭８３−２９６６８８）　）。

ところで、遺伝子組換え大腸菌によるヒトＢＣＤＦ　（
ＩＬ−６）の生産が可能になってから（特開昭６３−１
５７！３９６　）その生物活性や他細胞への作用といっ
た生物学的知見は多く得られたものの、これは糖鎖を持
たないこともあり、実際にヒト細胞が産生ずる天然型の
インターロイキン６と同等であるのか、その他の生物活
性についてもどうが、という疑問が残されたままであっ
た。これは、大腸菌などの原核動物を用いた遺伝子組み
換え型では特定蛋白質の生産性が非常にすぐれるのに対
し、ヒト細胞゛では生産性が劣るというのが原因の１つ
でありヒト天然型インターロイキン６を一定の品質で大
量に入手することが不可能であった。また、ヒト天然型
インターロイキン６のアミノ酸配列や糖鎖構造などの物
理化学的知見が少ないのもこのことが原因の１つである
。

ＢＣＤＦをコードする遺伝子を組み込んで形質転換した
原核生物細胞を用いて生産したヒトＢＣＤＦのＮ末端ア
ミノ酸はＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒ。

−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ＝　・・とＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−・・・などが知られている（特開昭６
３−１５７９９０　）。天然型についてはインターロイ
キンｌ″′Ｃ誘導をかけた線維芽細胞由来のインターロ
イキン６のＮ末端アミノ酸はＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｙｓ−Ａｓｐ−Ｖａｌ　・・・とＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−−・・の混合物であることが報告されている（Ｊ、
Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１６５，９１４（１９８７））。ま
た、白血球由来の天然型インターロイキン６のＮ末端ア
ミノ酸も同様にＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ　・・・とＶａｌ−（Ｐｒｏ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ　・・・（Ｄ混合物であるとされている（Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、、１４０．１５３４（１９８８）　　）。

　また、　Ｆ　−Ｄ　Ｉ　Ｆ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−
ｄｅｒｉｖｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｉ
ｎｄｕｃｉｎｇ　ｆａｃｔｅｒ）のＮ末端アミノ酸はＶ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ　・と報告されており、
インターロイキン６とホモロジーが高い（Ｔｈｅ　ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓ
ｙｓｔｅｍ　１９８８．ｐ３９５）。以上のように様々
な報告がなされているが、産生細胞の種類や、誘導物質
の種類などで天然型インターロイキン６の構造等物理化
学的性状が変化することが示唆される。このことは、分
子量、等電点、糖鎖構造などについても同様なことが言
える。たとえば、線維芽細胞からインターロイキン１で
産生させたＨ　Ｇ　Ｆ　（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｇｒｏ
ｗｔｈ　ｆａｃｔｅｒ）の分子量は、２３ｋｄと２４ｋ
　ｄであるが（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１６５，９１
４（１９８７））、単球が産生したヒトインターロイキ
ン６の分子量は２１．５，２３．５．２４，２６，２８
ｋｄと（ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ５，２４７，３２３（
１９８９））様々である。ヒトインターロイキン６の分
子量の多様性は糖鎖構造（Ｏ−グリコシド型とＮ−グリ
コシド型）とリン酸化が原因基よると予想されている（
ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ３，２４７，３２３（１９８９
）、　　Ｉｌｏｉｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍｕｎ、、１５２．１１４４（１９８８））。　
以上のようにヒト天然型インターロイキン６については
依然として解明されていない点が多く、またその細胞の
種類や誘導物質などの違いによる活性、構造等も未知で
ある。

ヒト線維芽細胞をスーパーインダクション法で産生させ
たヒト天然型インターロイキン６については完全に精製
した例がなく、Ｎ末端アミノ酸や、糖鎖構造に関しても
報告がない。

［発明が解決しようとする課題］ 従って本発明の目的は、ヒト線維芽細胞からスーパーイ
ンダクション法で産生させたヒト天然型インターロイキ
ン６を精製し、インターロイキン６を物質として提供す
るものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者等は上記問題点を解決するために鋭意研究を重
ねた結果、ヒト線維芽細胞からヒトインターフェロンβ
を産生させるために用いられるスーパーインダクション
法で産生された培養液からヒトインターロイキン６を精
製する手法を確立し、かくして得られたインターロイキ
ン６標品の構造を明らかにすることで、既に知られてい
るものとは異なる線維芽細胞由来のヒトインターロイ上
２６組成物を提供することを達成し、本発明を完成に至
らしめた。以下に本発明の詳細な説明する。

さて、本発明者等はヒト線維芽細胞を合成核酸であるボ
リエ：ボリＣと蛋白合成阻害剤であるシクロへキシミド
で処理することによりＩＬ−６を産生させる方法に着目
した。本誌はヒト天然型インターフェロンβの産生方法
であるスーパーインダクション法と共通するものであり
、この方法によってヒト綜維芽細胞が多量に抗ウィルス
活性を有するとも云われる工ＦＮ−β２（２６ｋｄ　　
ｐｒ。

ｔｅｉｎ、　　Ｉ　Ｌ　−６）を産生じているとの報告
に注目した（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
、７９．　２７６８．　　（１９８２））。

この産生方法は既に知られているヒト天然型インターフ
ェロンβのものと全く同一（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、ｓｃｉ、　、　６７、４６４（１９７０）　、　
Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　、５６．７８（１９７０）
）の方法でよい。

本発明者らはスーパーインダクション法を用いた線維芽
細胞培養液中にはヒト天然型インターロイキン６とヒト
天然型インターフェロンβを含有されていることをＥＬ
ＩＳＡ法およびＨＧＦ活性測定で確認した。本スーパー
インダクションによって産生された有用物質ＩＦＮ−β
は゛プル−セファロース°”等のブルー色素結合の不溶
性担体（ブルー担体）および金属キレート担体で精製す
ることができる（特公昭６４−１２７００．ＵＳＰ−４
５４１９５２）。

好都合にもヒトＩＦＮ−β２（ＩＬ　　６）はブルー担
体にあまり吸着しないことが知られている（ＥＮｌｌｏ
、Ｊ、　、５．２５２９（１９８６））が、既報告では
ＩＬ−６を抗ウイルス活性物質ととらえているので本発
明で述べるような抗ウィルス活性を持たないＩＬ−６の
挙動を示すものではない。ここで用いられるブルー担体
の量は実質的にインターフェロンβを結合するのに足り
る量が使用されるので通常１〜５％程度のヒト天然型イ
ンターフェロンβがブルー担体に未吸着で残る。本条件
においては９０％以上のヒト天然型インターロイキン６
が非特異吸着画分に残ることが明らかにされた。次にこ
のブルー担体素通り上清よりヒト天然型インターロイキ
ン６を回収するためには、公知の方法に従って粗ヒト天
然型インターロイキン６を含む液をシリカ系吸着剤（シ
リカ担体）に接触させて吸着することができる。シリカ
担体とはたとえば、ＣＰＧ　（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　
ｐｏｒｅ　ｇｌａｓｓ　）やシリカゲルなどがある。シ
リカ系担体を用いた濃縮方法はＣＰＧ（ｃ。

ｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐａｒｅ　ｇｌａｓｓ　）でバッチ
吸着し酸で回収する方法が知られている（Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、１６５，９１４（１９８７））。また、イン
ターロイキン６と同じアミノ酸配列を有し、同一物質と
推定されている線維芽細胞由来分化誘導因子（Ｆ−ＤＩ
Ｆ）の精製にはマイクロビーズシリカゲルを用いるバッ
チ吸着方法が知られている（Ｔｈｅ　Ｉｌｉｏｌｏｇｙ
　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｎｔｅｒｆｅｒａｎ　Ｓｙｓｔｅｍ
　１９８８．ｐ、３９５　）。本発明では、シリカ担体
を粗ヒト天然型インターロイキン６液中に投入するバッ
チ吸着でも、あるいはシリカ担体をカラムに充填し、そ
の中に粗ヒト天然型インターロイキン６液を流すカラム
吸着法のいずれでもよい。

用いるシリカ担体の細孔径は７〜１１００ｎ、好ましく
は１０〜５０ｎｍのものがよい。吸着条件は中性付近、
好ましくはｐＨ６，５〜８でよい。

カラム吸着法を行なう場合には、粗ヒト天然型インター
ロイキン６液中に残存する不溶化した蛋白質や核酸、細
胞の保護効果のために投入しである水溶性高分子（メチ
ルセルロースなど）の除去のためにシリカ担体のカラム
の前段にプレカラムを設置してもよい。プレカラムには
少量のシリカ担体、または工Ｌ−６を結合しないブルー
担体など不溶化担体であるならばいずれでも良い。シリ
カ担体からヒト天然型インターロイキン６を溶出させる
前にＩＬ−６を溶出させない溶液（中性または弱酸性バ
ッファー）で洗浄することが望ましい。

これによって担体に吸着していた一部夾Ｍ蛋白質などを
除去することができる。洗浄後、ヒト天然型インターロ
イキン６を脱着可能な回収液で回収する。この場合の回
収液は公知の酸性溶液が望ましい。具体的にはグリシン
−塩酸バッファー（ｐＩ（２）やｐＨ１〜″３の塩酸、
硫酸などの鉱酸または有機酸が用いられる。また、これ
らの回収剤にエチレングリコールやグリセリンなど適宜
加えることもできる。

シリカ担体にはヒト天然型インターフェロンβも親和性
があり、酸で回収した濠には、夾雑蛋白質やヒト天然型
インターフェロンβも濃縮されている。シリカ系担体か
ら酸性条件下で回収したインターロイキン６およびイン
ターフェロンβを含む液からインターロイキン６を分離
精製する方法としては、中和／抗粗インターロイキン６
ボリクローナル抗体カラム／ゲルろ過／強酸性イオン交
換クロマトグラフィー／逆相クロマトグラフィーを組み
合わせた方法（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｌｌｉｏｃｈｅｍ、、　
１６８，５４１（１９８７））のうち強酸性イオン交換
クロマトグラフィーで分離すると報告されているが、操
作が煩雑であり、分離度も明確でない。

本発明者らは、これらの問題を解決するために鋭意検討
を重ねた結果、塩析法と疎水性クロマトグラフィーを組
み合わせることが極めて高い効果をもたらすことを見い
だした。具体的に述べる。

まずヒト天然型インターロイキン６が安定である酸性条
件（ｐＨ１〜６）で塩析することで夾雑蛋白質と分離で
きることを見いだした。つまりヒト天然型インターロイ
キン６を液相中に残し、他の夾雑蛋白質などを沈殿させ
る方法である。塩析に使用する塩としては硫酸アンモニ
ウム、硫酸ナトリウム、リン酸１ナトリウム、塩化ナト
リウム、塩化カリウムなどが用いられるが好ましくは硫
酸アンモニウムか硫酸ナトリウムが良い。たとえば硫酸
アンモニウム１０％〜６０％飽和硫安として添加し、遠
心分離機で沈殿を除去することで上清中のヒト天然型イ
ンターロイキン６の純度を飛躍的に上昇させることがで
きることを見いだした。

塩折接のヒト天然型インターロイキン６を含む上清中に
は多量の塩類を含有する。一方、疎水的クロマトグラフ
ィーは蛋白質の疎水性を利用して、吸着、脱着を行い、
精製する有効な手法として用いられている（　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　、
４９．３８３（１９７２））。特に塩類の濃度が高くな
っている状態ではそのまま接触させることで蛋白質を吸
着ままあるいは一部希釈して疎水的クロマトグラフィー
に接触でき、効率よくヒト天然型インターロイキン６を
吸着できる。吸着方法はカラム法でもバッチ法でも良い
。また、上記の塩析において、インターロイキン６を含
有する上清に対しさらに硫安を添加して６５％〜７０％
飽和硫安とする沈澱物を４０％以下の飽和硫安液で溶解
し、疎水性条件下、上記疎水性クロマトグラフィーにて
吸着させ精製することもできる。ここに用いる疎水的ク
ロマトグラフィーはアルキル基（Ｃ＋〜Ｃｌ８）、フェ
ニル基などが担体骨格に化学的に結合されたものならば
いずれでも良い。骨格担体としてはセルロース、アガロ
ースなどを材料とする多糖類系および合成高分子系等の
不溶性担体を用いることが出来る。本性の疎水性条件下
、塩析上清液中のインターロイキン６およびインターフ
ェロンβの大部分が疎水性担体に吸着される。吸着済担
体は常法に従ってグラジェント方式またはステップ的に
塩濃度を下げた液を通液して目的蛋白質を溶出させるこ
とが出来た。また、塩濃度を変える他にｐＨや温度を変
えても良い。本疎水性クロマトグラフィーによれば、た
とえば、ｐ　Ｉ（５〜９で塩濃度を下げた液を流すと驚
くべきことにヒト天然型インターロイキン６は効率よく
溶出され、さらに精製されたインターロイキン６が得ら
れるが、−方ヒト天然型インターフェロンβは担体に吸
着したままで溶出されずインターフェロンβの完全分離
が可能となった。さらにヒト天然型インターロイキン６
を純化するためには、逆相クロマトグラフィーを用いる
ことで達成された。１例を示すならば、ＯＤ　Ｓ　（Ｃ
＋ｅ）−カラム高速液体クロマトグラフィー法でトリフ
ロロ酢酸を含む水とトリフロロ酢酸を含むアセトニトリ
ルのグラジェントでヒト天然型インターロイキン６のピ
ークを分取することにより、純度を上昇させ、実質的に
純化されたＩＬ−６標品を得ることが可能である。逆相
クロマトグラフィー担体としては疎水性クロマトグラフ
ィーと同じくアルキル基またはフェニル基を結合した担
体が好ましく用いられる。

なお本発明にかかるヒト天然型インターロイキン６の定
量は、ヒトインターロイキン６の生物活性を強く中和す
るモノクローナル抗体（ｐ　１１２８２３７）を使った
エンザイムイムノアッセイやヒトＢＣＤＦに反応して工
ｇＭを産生ずるヒトＢ細胞株ＣＬ　４　（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、８２．５４９０．（１
９８５））などを用いることで達成される。

本発明にかかる純化されたヒト天然型インターロイキン
６の構造解析を行なった結果、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法で分
子量は２１〜２５ｋｄにその９０％以上が存在し、少成
分が２７〜３０ｋｄに存在していた。電気泳動法にて等
電点は５．０〜６．５にその８０％が存在していること
がわがった。これらの物性は既知のヒトインターロイキ
ン６と合致した。また、Ｎ末端アミノ酸分析では、Ｎ末
端がＡ　１　ａ、　　Ｐ　ｒ　ｏ、　　Ｖ　ａ　１のそ
れぞれからなるものの混合物であることがわかった。す
なわち下記の３種のヒトインターロイキン６の混合物で
ある。

■　Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ− ■　Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−Ａｓｐ−Ｓｅｐ−Ｌｙｓ− ■　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ　ｕ−Ａｓ
ｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ− また、上記■、■、■の混合割合は約３７　５：　　２
である。ヒト線維芽細胞由来のインターロイキン６のＮ
末端アミノ酸として、これら３種のＮ末端アミノ酸のペ
プチド混合物は本発明によって初めて得られたものであ
る。また、このヒト天然型インターロイキン６の糖組成
分析からそのほとんどが（８０％以上）０−グリコシド
型糖鎖（ムチン型）でありさらにその１０分の１以下が
Ｎ−グリコシ型糖鎖も有していることが明らかになった
。

また、本発明で得られたヒト天然型インターロイキン６
はたとえば安定化剤としてヒト血清アルブミンなどを添
加し、常法に従って透析またはＲｊａ塩川ゲ用クロマト
グラフィーなどによって注射剤として適した溶液に置換
することが出来る。さらに適当に希釈・分注し、必要に
応じ、凍結乾燥することにより製剤化することが出来る
。

以上のようにヒト線維芽細胞からＩＦＮ−βの産生のた
めのスーパーインダクション法で産生させたｆｉ　ｌｆ
ｊ造を持つヒトインターロイキン６は本発明にかかるヒ
ト天然型インターロイキン６である。

［実施例］ 以下に実施例に従って本発明を具体的に説明する。

実施例１ ２１のガラス製培養槽に１１の５％のＮＣ５を含むイー
グルＭＥＭ培地中で、細胞数が１０６／ｍ１になるよう
にヒト線維芽細胞をビーズ培養した（ビーズ：゛サイト
デックスｌパ　　（ファルマシア社）、３７°Ｃ）。そ
の後、培地を少量のカルボキシメチルセルロースを含む
無血清イーグルＭＥＭ培地１１に交換し、プライミング
として１０万゛単位／１のヒト天然型インターフェロン
βを添加した。翌日さらにポリ■：ボリＣ３０ｍｇ／ｌ
。

シクロへキシミド１０　ｍ　ｇ　／　１　添加した。そ
の４時間後、アクチノマイシンＤを４　ｍ　ｇ　／　１
投入し、そして、さらに１時間後、産生培地として少量
のメチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換し
、スーパーインダクション処理をおこなった。

その後２日間そのまま培養を続けた（３７°Ｃ）。

を別の攪拌装置付き容器に移した。この産生液に滅菌し
た”ブルーセファロースＣＬ　−６Ｂ　Ｆ　Ｆ　”（フ
ァルマシア社）を投入し、１５°Ｃ，４日間撹拌しなが
らバッチ吸着させた。撹拌停止後、ブルー担体を沈降さ
せ上清を別の容器に移した。シリカ担体は、リン酸ナト
リウム！１衝液中で高圧蒸気滅菌（１２１″Ｃ１３０分
）したのち、４ｍｌずつ２本のカラムに充填して直列に
接続させた。これに、ブルー担体の素通り上清を流速２
０　ｍ　１　／　ｈｒで流した。全量流した接、２本の
カラムを別々に精製した。それぞれリン酸ナトリウム緩
衝液２５ｍ１を流した後、２０ｍＭ塩酸を流してインタ
ーロイキン６含有画分１０ｍ１を回収した。この塩酸回
収液にさらに硫酸アンモニウムを１．３３Ｍになるよう
に？戯加し、４°Ｃ，１晩ゆるやかに撹拌した。沈殿物
を３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離しく４°Ｃ）、除去
した。分離した上清を疎水性クロマトグラフィー用担体
である°”ブチルトヨパール６５０Ｍ”１ｍ１（東ソー
社）を充填したカラムに流し、吸着さぜた。このカラム
を１．３３Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ塩酸、
１゜３３Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸ナ
トリウム！１衝液で洗浄した後、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液で回収した。その後、逆相系のクロマトグラ
フィーであるＯＤＳカラム（Ｃ＋ｓ）（ＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ　　ＯＤＳ　　Ａ−３１２Ｓ−５１２０Ａ、ＹＭＣ社
）を装着した高速液体クロマトグラフィー（島？ｊｔ　
Ｌ　Ｃ−４Ａ　）を用いて、Ｏ０１％トワフロロ＃酸を
含有する水と０．１％トリフロロ酢酸を含有するアセト
ニトリルのグラジェント溶出させヒト天然型インターロ
イキン６ビークを分取した。こうして得られたヒト天然
型インターロイキン６を゛セファデックスＧ−２５゛°
（ファルマシア社）で５ｍＭギ酸を溶媒としてゲル濾過
しアセトニトリルを含まないインターロイキン６溶液を
得た。

なお、ヒト天然型インターロイキン６の濃度の測定は、
９６穴プレートを用いたＥＬＩＳＡ法を使った。すなわ
ち抗インターロイキン６抗体ｌＧ６１（モノクローナル
抗体）を１μｇ　／　ｍ　１の濃度でプレートにコート
した。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，０、洗浄バッファー）でブロッ
キングした後、２次抗体として別の抗インターロイキン
６抗体（■Ｃ６７）をビオチン標識したものを１０Ｍｇ
／ｍ１．５０μｌをまずプレートにのせ、さらに濃度既
知のインターロー１’−’Ｆン６標準品と未知濃度のイ
ンターロイキン６液をそれぞれ５０μｍ加え、１時間振
盪しながら反応させた。洗浄バッファーで３回洗浄した
後、洗浄バッファーで２０００倍希釈した゛°ストレプ
トアビジンーＨＲＰコンジュゲート°’　　（ＢＲＬ社
）を１００μｍ添加し、３０分反応させた。洗浄バッフ
ァーで３回洗浄した後、オルトフェニレンジアミンと過
酸化水素を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）を１００
μｍ添加し発色反応させた。３０分ｉ＆４　、５　Ｎ硫
酸で反応停止し、各ウェルの発色量をマイクロプレート
用光度計（゛マルチスキャン　ＣＭ”：　フローラボラ
トリー社製）を用い、４９２−６９０ｎｍで測定した。

各精製の精製収率、純度を表１に示す。

（以下余白） 二の精製収率は４８％で５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による精製純度は９０
％以上であった。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ／クーマシーブリリアントブルー染色
法で、分子量は２３０００±２０００ダルトン（９０％
以上）と小量成分２７０００±１０００ダルトンとを求
められた。

等電点電気泳動から求めた等電点けｐ■　５．０〜６．
５の範囲に数本存在していた。

実施例２ ヒト天然型インターロイキン６のＮ末端アミノ酸配列を
決定するために実施例１で得られた２０μｇの精製ヒト
天然型インターロイキン６をまず非還元条件下で５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル（４〜２０％、テフコ社製）
電気泳動を行なった。

ついでこれをＰ　Ｖ　Ｄ　Ｆ　膜にプロッティングした
後、クマシー染色し、２２〜２４ｋｄのメインバンドを
明りだしてアミノ酸シーケンサ−（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｄ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ型）にかけ、回収された
ＰＴＨ−アミノ酸はその３分の１ｆｆｌを用いてＩＩＰ
ＬＣ（ＡＰｐｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　１
２０Ａ型、ＰＴＨアナライザー）で同定、定量された。

サイクルごとに同定されたアミノ酸量を表２に示す。同
一サイクルに３または２種のアミノ酸が同定された。ま
たＶａｌ、Ｐｒｏ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、　　Ｇ　１　ｕ、
　　Ａ　ｓ　ｐ、　　Ｓ　ｅ　ｒのアミノ酸がそれぞれ
連続して３サイクル検出されること、およびインターロ
イキン６についてのｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配
列と比較することによりヒト天然型インターロイキン６
のＮ末端アミノ酸の配列は次の３種類からなることがわ
かった。また、Ｎ末端アミノ酸分析値よりその比は約３
：　　５：　２であった。

■　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒ。

−Ｇｌｙ−、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ　−■　Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−８
ｅｒ−Ｌｙｓ　−■　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ｇｌ　ｕ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ　−（以
下余白） 実施例３ ヒト天然型インターロイキン６の構成糖を高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定した。

■中性糖の分析 サンプルに２Ｎのトリフロロ酢酸１ｍｌを添加し、１０
０°Ｃ１６時間加水分解した。内部標準物質にラムノー
ス５００ｎｇ加え、減圧乾固し蒸留水に溶解した。こう
して調製したサンプルをＨＰＬＣ分析した。カラムは”
ＴＳＫ−ｇｅｌ　　Ｓｕｇｅｒ　　ＡＸＧ”　（東ソー
社）、移動相には０５Ｍホウ酸カリウムｐＨ８，１を用
いた。ボストカラム標識には反応試薬に１％アルギニン
／３％ホウ酸を用い、検出波長は、ＥＸ：　　３２０ｎ
ｍ。

ＥＭ：　　４３０ｎｍとした。

■アミノ糖の分析 サンプルに４Ｎ塩酸１ｍｌを添加し、１００°Ｃ１６時
間加水分解した。内部標準物質にマンノサミン５００ｎ
ｇ加え、減圧乾固し蒸留水に溶１７した。こうして調製
したサンプルをＨＰＬＣ分析した。カラムは”ＴＳＫ−
ｇｅｌ　　ＳＣＸ”（東ソー社）、移動相には０．１６
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，６を用いた。ボスト
カラム標識の反応試薬に１％アルギニン／３％ホウ酸を
用い、検出波長は、ＥＸ：　３２０ｎｍ、ＥＭ：　４３
０ｎｍとした。

■シアル酸の分析 サンプルに０．０５Ｎ硫酸０．２ｍｌを添加し、８０°
Ｃ１１時間加水分解した。これに内部標準物質にＮ−７
セチルマンノサミンｌμｇ加えた。こうして調製したサ
ンプルをＨＰＬＣ分析した。カラムは°’　Ｇｅ１ｐａ
ｋ　　Ｃ−６２０−１０”　　（Ｈ＋型）（日立化成柱
）、移動相には０．３％リン酸を用いた。ボストカラム
標識の反応試薬に０．１％マロノニトリルを用い、検出
波長は、ＥＸ：３６０ｎｍ、ＥＭ：　　４３０ｎｍとし
た。

各構成糖の組成分析結果を表３に示す。

（以下余白） この結果からヒト天然型インターロイキン６の糖組成は
そのほとんどが式 （ ） ％式％ ド型構造を持つことが推定され、 さらにその約１ ０％以下のものが式（ＩＩ） のＮ−グリコシド型溝 造を有していると推定される。

−０−Ｇ　ａ　１ Ａｃ ・　Ｎ−Ｇ　ａ　ｌ−Ｎ　ｅ　ｕ ・　Ａｃ （ ■ ） （以下余白） ｕｃ Ａｃ Ｍａｎ−［ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ−（Ｎｅｕ）、］ｃＮ
Ａｃ−Ｇａｌ−（Ｎｅｕ）、１ Ａｃ ｙ＝Ｑ ｒｌ ｎ＝１ ｒ２ （ＩＩ　） ［発明の効果］ 本発明のヒト天然型インターロイキン６の応用は非常に
多面的である。第１にヒト天然型インターロイキン６と
抗インターロイキン６抗体によるイムノアッセイ系を用
いて免疫学的な病態の解析に用いることが出来る。第２
にＣｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、２１、１２２５（１
９８９）に示されるような生理活性の多様性を利用して
各種疾患の治療にも応用できる。また第３には、ハイブ
リドーマなどの増殖培地に加えることにより、その増殖
を高めることも出来る。

このようにヒト天然型インターロイキン６は非常に広範
囲に有効な物質である。

また、本発明により高品質のヒト天然型インターロイキ
ン６が大量に提供できるようになった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト線維芽細胞由来で下記３種のＮ末端アミノ酸
   配列を有するヒトインターロイキン６の混合物からなる
   ヒト天然型インターロイキン６組成物。 ［１］Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
   ｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ− ［２］Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
   ｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ− ［３］Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓ
   ｐ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−