JPH0291100A

JPH0291100A - ヒトホスホリパーゼａ↓２阻害蛋白

Info

Publication number: JPH0291100A
Application number: JP63242556A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Imaizumi; 厚今泉; Yorimasa Suwa; 頼正諏訪; Masahiro Okada; 岡田　昌宏; Yoji Suzuki; 洋二鈴木; Ichiro Kudo; 一郎工藤; Keizo Inoue; 圭三井上
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-09-29
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1990-03-30

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、ヒト補体Ｃ３を酵素処理して得られる起炎性
ホスホリパーゼＡ２阻害活性を有する蛋白に関する。

〈従来の技術および発明が解決しようとする課題〉ステロイド剤は全身性エリテマトーデス、多発性筋炎、
慢性関節リウマチ、気管支喘息等の種々の炎症性、アレ
ルギー性疾患の治療薬として今日、最も有効性の高い薬
剤のひとつとして幅広く用いられている。有効性が高い
反面、副作用として消化器潰瘍、副腎萎縮、満月顔、易
感染等の多くの副作用が知られており、臨床での使用に
は十分な注意が必要とされている。副作用が少なく主作
用、例えば抗炎症作用の強いステロイド剤の開発が望ま
れてきたが、いまだこの問題は十分には解決されていな
い。

近年、ステロイド剤の作用メカニズムが解明されつつあ
るが、その過程で、ステロイドの作用がＲＮＡ合成阻害
剤、あるいは蛋白合成阻害剤で処理すると消失すること
から、蛋白合成を介することが明らかになっている。そ
の中で、抗炎症効果の発現は、炎症メデイエータ−の１
つであるロイコトリエンやプロスタグランジンの前駆体
であるアラキドン酸の遊離を抑制することであるとされ
ている。具体的にはステロイドはアラキドン酸をリン脂
質から直接切り出す酵素、即ちホスホリパーゼＡ２（Ｐ
ＬＡ２）を阻害する蛋白を生成することにより、アラキ
ドン酸の遊離を抑制し、抗炎症作用を発揮するとされて
いる（　Ｆｌｏｗｅｒ。

Ｎａｔｕｒｅ　２７８　：　　４５６．１９７９）　。

この仮説にもとづいて、ステロイドで誘導され、ＰＬＡ
２を阻害する蛋白の探索が数多くなされてきた。種々の
細胞や組織から目的蛋白が単離された。例えばウサギ好
中球からはリボモジュリンと呼ばれる蛋白が単離された
。同様にラットマクロファージからはマクロコルチン、
ラット腎臓髄質の間質細胞からはレノコルチンが単離さ
れた。これら一連の蛋白はその性状が研究された結果、
免疫学的にお互いに交差することから、１９８３年にリ
ボコルチンと総称されることとなった。現在、リボコル
チンは一群の性質が類似している蛋白としてすでに多く
のものでその遺伝子の構造も判明しており、リボコルチ
ンファミリーとして６種類の分子種が知られている。そ
の主な蛋白化学的性質は、Ｃａ＋“及びホスホリピッド
結合部位をもつことである。このためこれらを通じて、
４０〜４５％のアミノ酸レベルでのホモロジーが各分子
種間で観察されている。

リボコルチンはこのような性質上、直接Ｐ　ＬＡ２との
結合により、ＰＬＡ２活性を阻害するのではなく、ｉｎ
　ＶｉｔｒＯでの酵素反応ではＣａ　”　”　、リン脂
質と直接に結合し、結果的に酵素の活性が抑制されるこ
とが判った。従って基質濃度を高めると阻害作用が消失
することも判明した。

一方、リボコルチンの探索に於ける評価系の問題も指摘
されている。即ち、リボコルチンの探索にはブタ膵臓由
来のＰＬＡ２が用いられている。

−膜内に膵ＰＬＡ２は消化酵素的役割を果すと考えられ
ており、この酵素が、炎症に関与するロイコトリエン、
プロスタグランジンといった物質の前駆体であるアラキ
ドン酸を切り出す酵素と同じか否かは明らかでない。近
年２種々の実験動物やヒト疾患の炎症部位に強いＰＬＡ
２活性が検出され、病態との関連が注目されてきた。拝
上らは力げイン投与時のラット腹腔中に見い出されるＰ
ＬＡ２を単離・精製し、その性質を調べている（生化学
、ＶＯ１５８，Ｎα８．　７６６、１９８６＞。それに
よれば精製酵素をラット背部皮肉に接種すると、あらか
じめ静脈投与したエバンスブルーが漏出し、局所での血
管透過性が冗進していることを観察している。一方膵臓
由来のＰＬＡ２は同一条件ではこの活性を示さないこと
も確認されている。少なくともここに於いてこの酵素は
膵臓由来のＰＬＡ２より起炎的に働くものと思われる。

またＶ　ａｄａｓらはリウマチ患者の関節内ＰＬＡ２活
性が亢進じていることを報告しており、更にその酵素は
ヒト膵臓由来のＰＬＡ２の抗体とは反応しないことを見
い出している（　Ｊ　、　Ｂ　＋ｏｃｈｅｍ、１００．
１２９７１３０３、１９８６）。このように各種炎症部
位に活性の認められるＰＬＡ２を単離・精製し、Ｎ末端
配列の解析が次々に行なわれるようになって次のことが
判ってきた。（１）本酵素群は互いに一次構造上、類似
の点が多い。また膵臓由来のＰＬＡ２とはホモロジーが
低い。（２塩基性アミノ酸を多く含み、ヘパリンに高い
親和性を持つ。（３）基質としてはホスファチジルエタ
ノールアミンやホスファチジルセリンをホスファチジル
コリンにくらべてよく加水分解する。

従来ホスホリパーゼＡ２は外分泌性の酵素を中心に構造
研究が行なわれてきており、分子内のジスルフィド結合
の違いにより、二つに分類されてきた。すなわち哺乳類
の膵臓由来の酵素やコブラ汚由来の酵素はグループエ、
マムシ蛇やクサリヘビ由来の酵素はグループ■と分類さ
れている。高等動物の炎症局所に見い出された細胞外Ｐ
ＬΔ２はこの分類ではグループ■に属する全く新しい構
造を持った酵素であることも判明し、益々炎症との係り
でこのＰＬＡ２は注目される。

このような観点から、本発明者らは、ラット起炎性ＰＬ
Ａ２を特異的に阻害する蛋白を、ステロイドで誘導した
ラット腹腔浸出液より鋭意探索し、すてに“起炎性フォ
スフォリハーゼＡ２阻害活性を有する蛋白″特願昭６２
−７９６９３号として、目的蛋白を見い出している。本
蛋白はりボコルチンファミリーとは次の点で異なる。す
なわち（１）本蛋白はグループエに属する膵Ｐ　Ｌ　Ａ
　２を阻害せず、グループ■に属するラット腹腔浸出液
由来のＰ　Ｌ　Ａ　２を阻害する、また（２リボコルチ
ンとはホモロジーがない。一方、（３）補体のＣ３フラ
グメントと高いホモロジーがある、（４）基質濃度を上
昇させても効率よく阻害する等であり、これらの点より
リボコルチンファミリーとは明らかに異なっている。ま
た作用機作も直接、酵素に働いているものと思われる。

更に本発明者らは、ヒト由来のＰＬＡ２として膵臓由来
ＰＬＡ２以外の酵素を直接ヒトの疾患での炎症部位から
単離・精製することを試みた。即ち、ヒトリウマチ患者
、関節液中に高いＰ　ＬＡ２活性を認め、この指標をも
とに、ＰＬＡ２を単離精製した。更にＮ末端のアミノ酸
配列を調べたところ、全く新しい構造を有するＰＬＡ２
であったことより、すてに゛新規なヒトホスホリパーゼ
Ａ２及びそのフラグメントペプチド″特願昭６２３２５
２５５号として本Ｐ　Ｌ　Ａ　２を見い出している。本
Ｐ　Ｌ　Ａ　２はヒトでは初めて見い出されたグループ
■に属するＰＬＡ２であった。

これらの知見より、更にヒトグループ■に属するＰＬＡ
２を特異的に阻害する蛋白を見い出せば、ヒトの炎症疾
患に於けるグループ■に属するＰＬＡ２の役割を解明す
る一助となり、更には目的蛋白は抗炎症作用を有するこ
とが推測され、新規医薬品としての開発が期待される。

以上の観点よりヒトリウマチ関節液由来ＰＬＡ２の活性
を特異的に阻害する目的蛋白の探索を鋭意行った。

その結果、ヒト補体Ｃ３を酵素処理することにより、本
酵素に阻害作用を示すフラグメントを得、本発明に到っ
た。

く課題を解決するための手段〉即ち本発明は、ヒト補体Ｃ３を酵素処理して得られる起
炎性ホスホリパーゼＡ２阻害活性を有する蛋白である。

特に好ましいのは、ヒト補体Ｃ３を酵素としてトリプシ
ン又はエラスターゼを用いて処理して得られる、Ｎ端部
のアミノ酸配列がＮＨ２−ｘ−Ｌ　ｅｕ−ｌ１ｅ−Ｖａ
ｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ｙｒある起炎性ボスホリバーゼＡ
２阻害活性を有する蛋白である。ここでＸはアミノ酸が
同定できなかったものを示す。

次に本発明の蛋白の単離・精製方法について述べる。本
発明の蛋白は、ヒト補体Ｃ３を酵素処理し、ヒトリウマ
チ関節液由来のＰＬＡ２を阻害する活性を指標にして、
例えばゲル濾過高速液体クロマトグラフィーに標品をア
プライし、ＵＶ２８０ｎｍで測定し蛋白として３つのピ
ークが得られ、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（Ｐ
ＡＧＥ）で調べたところ、ビークエが未切断のＣ３，ｎ
が部分分解物、■がＣ３ｄフラグメントであると考えら
れた。このビーク■及び■のフラクションの各画分の起
炎性ＰＬＡ２阻害活性を測定し、阻害活性を有するビー
ク■フラクションをＰＢＳに透析後ベブチドシークエン
サーにアプライしてＮ端部のアミノ酸配列を決定した。

以上、ヒト補体Ｃ３をトリプシン処理して得られる起炎
性ホスホリパーゼＡ２阻害活性を有する蛋白を、精製す
る方法を中心に説明したが、酵素としてエラスターゼを
用いても同様にして起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害活性
を有する蛋白を得ることができる。更に本発明は、ヒト
補体Ｃ３自体に限らず、ヒト補体Ｃ３を含有する血清あ
るいは炎症部位周辺から抽出される体液を酵素処理して
得られる起炎性ホスホリパーゼＡ２阻害活性を有する蛋
白も包含するものである。また遺伝子工学的手法で微生
物あるいは動物細胞から製造してもヒト補体Ｃ３を酵素
処理して得られる蛋白と同じ起炎性ＰＬ△２阻害活性を
有する限り、本発明に含まれるものである。

本発明において用いられた各種試験、測定法は以下の通
りである。

（１）　　ヒトホスホリパーゼＡ２阻害活性の測定法酵
素としてヒト慢性リウマチ患者関節液より単離精製した
ホスホリパーゼＡ２を用い、基質としては＋４　Ｃ−酢
酸と共に培養したＥ、Ｃｏ１１より抽出、精製したｌ４
Ｃ−ホスファチジルエタノールアミン（約２，０００ｄ
ｐｍ／ｍｍｏｌ、　２　ｍＭ）を用いた。

酵素反応は、５０μ文の０．５Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ　−Ｃ
Ｉ（ｐＨ９，０）　、　２５．ｃｌの４０　ｍＭ　　Ｃ
ａ　Ｃ１２，２５μ文の基質にサンプルおよび水を加え
て総量２４０μすとして混合し最後に１０μ文の酵素液
（０，０１μｇ／　ｕ　ｌ　、　　１．５ｘ　１０５Ｕ
　ｎ１ｔｓ／！Ｉ１ｇ・蛋白）を加えた。

３７℃にて１０分間反応させたのち、Ｄｏｌｅ　’　ｓ
試薬を加えて反応を停止し、Ｄｏｌｅの方法に従って生
成した１４Ｃ−脂肪酸を抽出し、液体シンチレーション
・カウンターで測定した。

＋２１８ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動およびウェ
スタン・プロッティング酵素処理またはＨＰＬＣにより得られたサンプルに１／
１０聞の色素液（０，１％ＢＰＢ、ＸＣ，１０％５ＤＳ
）を加え、１００℃５分間熱処理後、１２．５％ポリア
クリルアミドゲルにアプライし１％ＳＤＳ存在下、１５
−２５ｍＡで１．５時間電気泳動した。

還元状態での解析のためにはサンプルに２−メルカプト
エタノール（２ＭＥ）を加えた。泳ａ後、蛋白の検出の
ためにＣＢＳで染色した。

また、同様に泳動した後Ｂｉｏ−Ｒａｄ社エレクトロブ
ロッティング装置を用いて、蛋白をゲルからニトロセル
ロース・フィルターに移した。抗ヒトＣ３ｄヒツジ血清
（Ｄａｋｏ、）、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ結合抗
ヒツジＩｏＧ抗体（Ｑ　ｏｏｐｅｒ３　ｉｏｍｅｄｉｃ
ａｌ　）および基質として４−クロロ−１ナフトール（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、酵素抗体染色法によりＣ３ｄ
のバンドを検出した。

（３）　　蛋白Ｎ末端アミノ酸配列の決定法気相プロテ
ィン・シークエンサー（アプライド・バイオシステム４
７７Ａ　）およびＨＰＬＣ（アプライド・バイオシステ
ム１２０Ａ　）を用いた。

即ち、ＰＢＳに溶解したサンプル１００μｐを、上記気
相プロティンシーケンサ−にアプライした。

自動的にエドマン分解されたＰＴＨ（フェニルチオヒダ
ントイン）アミノＭｍ導体は、その後、高速液体クロマ
トグラフィーにて各アミノ酸として分析された。

以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例（１）　　ヒトＣ３のトリプシン処理酵素はアガ
ロースに固定したトリプシン（ブタ膵臓由来Ｓ　ｉｇｍ
ａ　　Ｔ　−１７６３＞を５０ｕｎｉｔｓ　／ｍｅとな
るように保存液（０，００１Ｎ　　Ｈ（Ｊ　−１０ｍＭ
　　ＣａＣＮ２）に懸濁した。

５００μｆｌのヒトＣ３（１＃＋９／＃Ｌｉ！５０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−Ｃｊ、　　ｐ）−１８，０）に０．５Ｍ
　　ＮａＣｆ　３５０μｍを加えて、３７℃で数分間加
温した後、酵素液１５０μ文を加えて反応を開始した。

振とうしながら１０分間反応後、遠心分離により固定化
酵素を沈殿させ、上清をただちに凍結して保存した。

部をとって５ＤＳ−ＰＡＧＥで解析すると２ＭＥ非存在
下で、高分子のバンドと約３３ＫＤａのバンドが主にみ
られた。さらにこれをウェスタン・プロッティング後、
抗ヒトＣ３ｄ血清で染色すると３３１（［）ａバンドの
みが検出された。また２ＭＦ存在下ではα鎮の１１５Ｋ
Ｄａ、β鎖の７５１（［）ａのバンドと３Ｏ−４０ＫＤ
ａに数本のバンドがみられた。以上のことから、トリプ
シン処理液には未反応のＧ３．部分分解物及びＣ３ｄフ
ラグメントが含まれていると考えられた。第１図にこの
５ＤＳ−ＰＡＧＥを示した。

実施例［２１Ｃ３トリプシン処理液のゲル濾過ＨＰＬＣ
による分離上記実施例（１）の反応液（１ｄ）をＨＰＬＣゲル濾過
カラム（ＴＳＫａｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ）　Ｉ、−７１
ライした。溶出バッファーは２０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　
−（Ｊ。

１）８７．５−ＩＭ　　ＮａＣｊ、流速０．５ｄ／ｍｉ
ｎとし、蛋白の溶出をＬＩ　Ｖ　２８０ｎｍで検出した
。結果を第２図に示した。第２図から、蛋白は３つのピ
ーク１〜■とじて溶出したが、これらの５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（第３図）の解析によりピークエが未切断の０３、■
が部分分解物、■がＣ３ｄフラグメントであると考えら
れた。

実施例（３）　Ｇ３トリプシン分解物のＰＬＡ２阻害活
性ゲル濾過ＨＰＬＣのピークＩＩ　（＃１９−２１）およ
びピークＩ［［（＃２７．２８）のフラクションをそれ
ぞれ集め、Ｐ　Ｄ　１０カラムにて脱塩した。得られた
サンプルを用いてＰ　Ｌ　Ａ　２阻害活性を測定し、第
４図及び第５図に示した。サンプルはいずれもヒト慢性
リウマチ患者関節液由来ＰＬＡ２を容量依存的に阻害し
た。

また、ビーク■より得られたサンプルを用いてラット血
小板分泌性ＰＬＡ２及び毒由来Ｐ　ＬＡ２活性を測定し
、結果を第５図に示したが、このサンプルはラット血小
板分泌性ＰＬＡ２に対しても阻害活性を示したが、Ｎａ
ｊａＮａｊａ毒由来ＰＬＡ２に対しては全く阻害を示さ
なかった。これらの結果から、このサンプルの阻害活性
は“グループＩＩ　１１に属する炎症由来ＰＬＡ２に特
異的なものと考えられた。なお、未切断のＣ３には阻害
活性は検出されなかった。

実施例（４）トリプシン処理フラグメントのＮ端部アミ
ノ酸配列実施例（′２Ｊのビーク■フラクション（２ｄ）をＰＢ
Ｓ　（５０ｆｆ１Ｍ　　Ｐｈ０３Ｄｈａｔｅ、　　ＤＨ
７，５−１５０１１１ＭＮａ（Ｊ）に対して透析後、Ｃ
ｅｎｔｒｉ（Ｏｎｌｏにて濃縮して　１００μ磨とした
後、ペブチドシークエンサーにアプライしてＮ端部アミ
ノ酸配列を決定した。

その結果、以下の様な配列が同定された。

Ｎ　Ｈ２−Ｘ　−Ｌｅｕ−１１ｅ　−Ｖａｌ−Ｔｈｒ　
−Ｐｒｏ−（Ｘは同定できず）これはすでに報告されているＣ３ｄのＮ末端配列と全く
一致していた。この結果、ビーク■にはＣ３ｄのみが含
まれていることが確められた。

実施例（５１Ｇ３部分分解物のエラスターゼ処理実施例
（２）のビーク■フラクシコン（１ｄ）を２０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ　−Ｃ１，ｐＨ７，５−１５０ｍＭ　　ＮａＣ
ｊに対して透析後、エラスターゼ（ブタ膵臓由来３　ｉ
ｇｍａ　　　　　）を０．００１％（Ｗ／Ｖ　）となる
ように加え、３７℃で２ｈｒ反応させた。実施例（１）
と同様に５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン・ブロッティ
ングした結果を第６図に示した。第６図を解析すると、
やはり３３ＫＤａの付近にＣ３ｄのバンドが検出された
。したがってこの方法でも活性フラグメントが取得でき
たと考えられた。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト補体Ｃ３をトリプシン処理して得られたも
のの５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。第２図は、ゲル濾過ＨＰＬＣを用いた目的蛋白の溶出パ
ターンを示す。第３図は、ゲル濾過ＨＰＬＣで溶出した蛋白の５Ｏ８−
ＰＡＧＥを示す。第４図は、ゲル濾過ＨＰＬＣで溶出した蛋白のヒト慢性
リウマチ患者関節液由来ＰＬＡ２阻害活性を示す。第５図は、ゲル濾過ＨＰＬＣで溶出蛋白のヒト慢性リウ
マチ患者由来ＰＬＡｚ　　（ＯＯ）、ラット血小板分泌
性ＰＬＡｚ　　（Δ−−Δ）、ＮａｊａＮａｊａ（：ｌ
ブラ）毒由来ＰＬＡ２　　（×−−−Ｘ）阻害活性を示
す。第６図は、ヒト補体Ｃ３部分分解物のエラスターゼ処理
によって得られた蛋白の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＣＢＢ染
色）及びウェスタンブロッティング（酸素抗体染色）を
示す。 λ１−ＩＥ（−ｉ）１叩（−）フラフション小汗名文料の廊壌斥（ｌｏ戸／悲）ひフ工ｚＨ町シ非Ｂ（−）Ｃαら耗）２ＭＥ（−）（邸東椅芋乳）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト補体Ｃ３を酵素処理して得られる起炎性ホス
ホリパーゼＡ＿２阻害活性を有する蛋白。
（２）酵素としてトリプシンを用いることを特徴とする
請求項（１）記載の起炎性ホスホリパーゼＡ＿２阻害活
性を有する蛋白。
（３）酵素としてエラスターゼを用いることを特徴とす
る請求項（１）記載の起炎性ホスホリパーゼＡ＿２阻害
活性を有する蛋白。
（４）Ｎ端部のアミノ酸配列がＮＨ＿２−Ｘ−Ｌｅｕ−
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−である請求項（１）
記載の起炎性ホスホリパーゼＡ＿２阻害活性を有する蛋
白。