JPH0285215A - Ｂ型肝炎の抗ウイルス剤による治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は動物における急性又は慢性のＢ型肝炎ウィルス
感染症を処置するに当り、抗ウイルス治療剤としてプリ
ン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド又はこのものの
調剤的に受容性のある誘導体を使用する方法に関する。

［従来の技術］ Ｂ型肝炎は世界的に分布する一般的な疾病の一つである
。そのウィルスは血液や血液調剤、静脈注射薬の正しく
ない使用者における注射針の汚染あるいは性行動により
伝播し、あるいはまた感染している母親から子供へ垂直
に伝えられる１世界的にみるならば、この病気は東南ア
ジア、アフリカ及び南米のいくつかの地域においてもっ
ともありふれた病気である。これらの地域においては幼
児期における子供への垂直の伝染によってその感染した
個体の高い割合がＢ型肝炎の慢性的保持者となっている
。子供の時期にＢ型肝炎に感染した男性の約４０％はそ
の慢性的なり型肝炎感染の結果として肝硬変または原発
性細胞癌腫によって死亡する確率を有する。誕生時に感
染した女性はＢ型肝炎感染によって同様な病因により死
亡する約１５％の確率を有する。全世界でＢ型肝炎のウ
ィルス保持者の数は２８０．０００．０００人であると
評価されている。

抗ウィルス剤による化学療法の分野は比較的新しい。ウ
ィルスの複製増殖はその宿主細胞を極めて密接に巻き込
むので、特別な抗ウィルス剤による化学療法のためのそ
れぞれのウィルスの地位を明らかにすることは非常に困
難であった。Ｂ型肝炎の慢性的ウィルス保持者を処置す
る多くの試みはほとんど成功していない、このような慢
性的ウィルス保持者を治療するのにアデニンアラビノシ
ド及びインターフェロンが用いられている。アデニンア
ラビノシドを慢性Ｂ型肝炎感染の処置において気体め薬
と比較した信頼すべき研究が三つ存在する。これらの研
究の中の二つにおいてそれにより処置された患者のアデ
ニンアラビノシドに対する応答率がコントロール群より
も明確に良好であった［　Ｂａ５ｓｅｎｄｉｎｅ等；　
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、８０゜１０１６−
１０２１　（１９８１）及びＹｏｋｏｓｕｔａ等；　Ｇ
ａ５ｔｒｏｅｎｔｅｒ。

１ｏｇｙ、　８９．２４６−２５１　（＋９８５）　１
．それらの中の第３番目の研究においてはアデニンアラ
ビノシド処置を受けた患者に同等重大な有効性がなかっ
た［）Ｉｏｏｆｎａｇｌａ等；　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅ
ｒｏｌｏｇｙ、　８６．１５（１−１５７（＋９８４）
　１．アデニンアラビノシドによる治療に先立ってその
患者に次第に減量する量のアデニソンの投与を行うこと
がよい結果をもたらすと報告されている。

［Ｐｅｒｒｉｌｌｏ、Ｒ，Ｐ、等；　Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏｌｏｇｙ、　８８．７８０−７８６　（１９８
５１］、　Ｌ／かじながら公開的で制御して行われた研
究の大部分においてその処置された患者の僅かに約３０
％がそのような治療による若干の好結果を示しているに
過ぎず、しかもこれらの結果でさえ非常に説得力がある
ものではない、加えて、アデニンアラビノシドを用いる
治療は骨髄抑圧、神経筋性疼痛及び神経毒性を伴ってい
る。慢性Ｂ型肝炎の処置のためにアデニンアラビノシド
を用いるほとんどの試みはこの抗ウィルス剤による成功
が少なくて中程度の毒性を示すために中段されてしまっ
ている。Ｂ型肝炎ウィルスによって引起される慢性活動
性肝炎をインターフェロンのみによりまたはこれとアデ
ニンアラビノシドとの組合せにより処置する試みもこれ
まで極めて制限された成功しかみられず、そして著しい
抑制を伴っている０以上のようにＢ型肝炎への有効な抗
ウィルス剤による治療方法は現在まで存在していない。

２°、３“−ジデオキシヌクレオシド類はこれまで抗ウ
ィルス剤として報告されており、そして実際に２°、３
°−ジデオキシシチジンは人の免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）を含むレトロウィルス類に対する抗ウィルス剤とし
て活発に研究されている。２°、３゛−ジデオキシチミ
ジンを除く他の２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類
は旧Ｖの強力なインヒビターであることが示されている
［Ｍｉｔｓｕｙａ等：　ＰＮＡＳ、　８２．７０９６〜
７１００頁（１９８５）並びにＭｉｔｓｕｙａ及びＢｒ
ｏｄｅｒ：ＰＮＡＳ、　８３゜１９１１−１９１５（１
９８６１１゜ Ｂｕｒｒｏｕｇｈｓ、　Ｗｅｌｌｃｏｍｓは公開された
ヨーロッパ特許出願第８６０３６６２．０号の中で、ジ
デオキシヌクレオシド類がＢ型肝炎のようなヘパＤＮＡ
ウィルス（ｈｅｐａｄｎａｖ　１ｒｕｓ）感染症を処理
するのに有用であるかも知れないということを示してい
る。しかしながら彼等はこの考えを支持するような何等
の実験的証拠をも与えておらず、そして本発明者等が発
見した予期しない事実、すなわちプリン２°、３−デオ
キシヌクレオシド類がピリミジン２°、３−ジデオキシ
ヌクレオシド類よりも更に非常に効果的であるというこ
とについては言及していない。

２゛、３−ジデオキシヌクレオシド類は抗ウィルス活性
を有することが知られているけれども、これまでに発表
されている研究はこの型の化合物がレトロウィルス類、
特にＨＩＶに対して有効であるとするものに集中してい
る。ＨＩＶに対してもっとも効果的な２°、３−ジデオ
キシヌクレオシド類は２．３−ジデオキシシチジン（ｄ
ｄｅと略記する）及び２’、３’−ジデオキシアデノシ
ン（ｄｄＡと略記する）並びにピリミジン２°、３−ジ
デオキシヌクレオシド及びプリン２″、３°−ジデオキ
シヌクレオシドであった。レトロウィルス類の２°、３
−ジデオキシヌクレオシド類に対する公知の感受性に基
いてヘパＤＮＡウィルスのこれらの化合物に対する感受
性を定性的に予想することができないことは明らかであ
る。このことはレトロウィルス類がＲＡＮウィルスであ
るのに対してヘパＤＮＡウィルス類が明確に異った類別
のＤＮＡウィルスであって異った機構により複製すると
いうことから驚くべきことではない。

本願の一つの発明態様によって、ヘパＤＮＡウィルスに
感染した動物を医学的に治療する方法が提供されるが、
この方法はそのような動物に、生物学的に重要性のある
担体と組合せて生物学的に活性のある下記式（Ｉ） Ｈ）ｌ ［但し上記式においてＸは）Ｉ　、　Ｒ，、Ｎ１３．ハ
ロゲン、ＮＨＲｌ、　Ｎ（Ｒ＋）ｚ　、ＯＨ、ＯＬ　、
　ＳＨ又はＳＲ，を表わし、ＹはＨ、Ｒ１，ＮＨｚ、ハ
ロゲン、ＮＨＲ＋、ＮＣＲ，）、　、ＯＨ、ＯＲ，、Ｓ
Ｈ又は　ＳＲ，を表わし、Ｒ３は１ないし８個の炭素原
子を有する低級アルキル基を意味し、そしてＲ２はＨ又
は生物学的に受容性のあるエステル、或いはこのエステ
ルの、生物学的に受容性のある塩を与えるような塩を表
わす］で表わされる２°、３−ジデオキシヌクレオシド
の有効旦が含まれている調剤を投与することよりなる。

以下ヘパＤＮＡウィルス感染床の治療において上記式（
１）の化合物が抗ウィルス剤として予期しない重大な有
用性を有することの発見について説明する。このような
化合物の有効性が種々の動物において極めて容易に確認
できること、そして中でもアヒルのＢ型肝炎ウィルスが
、Ｂ型肝炎ウィルスの人体における挙動と類似した挙動
をアヒルにおいて示すということが周知であることを指
摘すべきである。従って上述の化合物が予期しない有用
性を有することの証明のための試験をアヒルＢ型肝炎ウ
ィルス（ＤＨＢＶと略記する）に感染したアヒルについ
て行った。これらの化合物はヘパＤＮＡウィルス類に感
染した動物、例えば人あるいは人以外の動物において有
効であることが認められる０人以外の動物はアヒル、マ
ーモット、小型ビーチシマリス及びカンガル−を含む９
種々の抗ウィルス剤についての過去の研究においてはプ
リン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類とピリミジ
ン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類との間でそれ
らの活性に何等の区別をしていなかった。その活性の違
いはアヒルＢ型肝炎ウィルスによる本発明の系において
明瞭に示された。このプリン２°、３−ジデオキシヌク
レオシドの選択的な抗ウィルス活性の理由は未だ完全に
は明らかにされていない。

現在は前記式（Ｉ）の化合物がＤＮＡの負鎖の合成の火
付は役となるゲノム結合プロティンを結合する能力を有
すると仮定される。完全頁順は玉鎖の合成のための鋳型
の役目をする［Ｗｉｌｌ等：Ｊ、ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ
、６１．９０４−９１１（１９Ｂ７）　］ので、このＤ
ＮＡ合成の初期段階におけるブロッキングはＤＮＡの正
及び負の両端の合成をブロックするであろう。

ヘパＤＮＡウィルスの複製は他のＤＩＡウィルス類のそ
れと著しく異っている。主要な差異の一つは種々のレト
ロウィルス類においてみられるのと類似した逆転写の段
階である。ヘパＤＮＡウィルスの複製機構は最初にＳｕ
ｍｍｅｒｓ及びＭａｓｏｎによってＤ）ＩＢＶモデルに
おいて見出され［雑誌Ｃｅ１ｌ、２９゜４０３−４１５
　（１９８２１並びにＭａｓｏｎ等：　ＰＮＡＳ、　Ｕ
ＳＡ、　３９９７−４００１　（＋９８２）　］　、そ
して後にこれがＢ型肝炎におけると類似していることが
示された。　Ｂｌｕｍ等：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１３９．
８７−９６（１９８７）、Ｍｉｌｌｅｒ等：Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ。

１３９　、５３−６３　（１９８４１及びＭｉｌｌｅｒ
等：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｉ：狙。

６４−７２（１９８４）］。

ヘパＤＮＡウィルスがターゲットの細胞（肝細胞）に侵
入してしまった後でこのウィルスは被膜が除かれてその
ＤＮＡは核の中に入り込む、核の中でこのウィルスの部
分的に二重鎖となったＤＮＡは共有結合的に閉じた二重
鎖の環状に変わる。

その負鎖はこの負鎖（３，２ｋｂ）よりも大きな（３，
４ｋｂ）プレゲノムＲＮＡの合成のための鋳型となる。

このプレゲノムＲＮＡは細胞側のＲＮＡポリメラーゼに
よって合成される。このプレゲノムＲＮＡはビールス側
のＤＮＡポリメラーゼによって達成される負端ＤＮＡ合
成のための鋳型の役目をする（逆転写酵素活性）、この
負鎖の合成は共有結合的に結合した成る蛋白によって引
起こされる［Ｇｅｒｌｉｃｈ及びＲｏｂｉｎｓｏｎ：　
Ｃｅ１１．２１．８０１−８０９（１９８０）並びにＭ
ｏｌｒ（ａｒ−Ｋｉｍｂｅｒ等：　Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ。

４５．１６５−１７２（１９８４１］　、　、ｍ（７）
合成の間にプレゲノムＲＮＡはウィルス側のＤＮＡポリ
メラーゼのりボヌクレアーゼＨに類似した活性によって
分解（ｄｅｇｒａｄｅ　）される、この負鎖の合成が完
了した時に、プレゲノムＲＮＡの小片が負鎖のＤＲＩ領
域からＤＲ２領域へ移されて正順合成のための火付は役
の役目をする。　　（Ｗｉｌｌ等：　Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ、６１．９０４−９１１（＋９８７）　］　
、正鎖の合成はヌクレオカプシドで被膜されてそのウィ
ルス粒子が外部へ放出される前には完了しないであろう
、従って、ヘパＤＮＡウィルス類のピリミジン２°、３
°−ジデオキシヌクレオシド類に対する感受性に比して
のプリン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類に対す
る予想できなかった感受性の説明の、考え得る−っはプ
リン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類が負鎖合成
の火付は役となるゲノム結合蛋白に結合することである
。Ｂ型肝炎ウィルス６；おいてはその負鎖の分子配列の
５°端が５　’　−ｄ　（ＧＡＡＡＡＡＧＴ・・・・・
）である［Ｗｉｌｌ等：　Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
、６１．９０４−９１１（１９８７）］。

そしてＤ　ＩＩ　Ｂ　Ｖにおけるそれは５°−ｄ　（Ｇ
ＴＡＡＴＴＣＴＴ・・・・・）である［　Ｌｉｎｅ、　
Ｊ、Ｍ、等：　Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６１．３
８３２−３８４０．　（＋９８７］　］。両方の場合に
おいて共にその蛋白に結合する側の５°端のところのヌ
クレオチドはプリンタクレオチドである。肝細胞培養に
おける実験結果はＤ　１１　Ｂ　Ｖ、そして類推するな
らばその他のヘパＤＮＡウィルス類はピリミジン２“、
３°−ジデオキシヌクレオシド類よりも少なくとも１０
０ないしｌ０００倍プリン２°、３°−ジデオキシヌク
レオシドに対して感受性が高いということを示している
。このユニークなりＮＡ負負端合成の蛋白質による誘発
段階が上述の予期しない発見結果を説明できる可能な機
構であろう、しかしながら外の機構も働いているかも知
れないということが考えられる。いずれにしても実験結
果は前記式（１）の化合物の有効性を明瞭に示している
。

ヘパＤＮＡウィルスが宿主細胞に極めて高い濃度（１０
口ないし１０００倍）において同等明瞭なマイナスの影
響を及ぼすことなくプリン２°、３−ジデオキシヌクレ
オシトに対して予期しない感受性を有するということは
この抗ウィルス剤がウィルスの複製においであるユニー
クな段階で作用していることを示唆するものである。ウ
ィルス核酸合成の上記の蛋白質による誘発がプリン２°
、３°−ジデオキシヌクレオシト類によってブロックさ
れるという仮説は他の、核酸合成の蛋白質による誘発機
構を有することが同様に知られている例えばポリオウィ
ルス及びアデノウィルス等のような種々のウィルス類に
対しても広く当てはまる。

本発明において使用することのできる化合物は下記式（
Ｉ）で表わされるものである：［但し上記式においてＸ
はＨ、Ｒ，、ＮＨＲ、ハロゲン、ＮＩＩＲ＋　、　Ｎ（
Ｒ１）２．０１１　、　ＯＲ＋　、　ＳＨ又はＳＲ＋を
表わし、ＹはＩＩ　、　Ｒ１、ＮＨｚ、ハロゲン、ＮＨ
Ｒ，、ＮＣＲ，）２．ＤＨ、ＯＲ，、５ｔ−１又は　Ｓ
Ｒ，を表わし、Ｒ１は１ないし８個の炭素原子を有する
低級アルキル基を意味し、そしてＲ２はＨ又は生物学的
に受容性のあるエステル、或いはこのエステルの、生物
学的に受容性のある塩を与えるような塩を表わす〕上記
式の代表的な化合物は下記第１表にあげるものである。

第　　１　　表 式（１）の化合物の好ましいものは前記式（Ｉ）のアデ
ニン、グアニン、ヒボキサンチンまたは２．６−シアミ
ツプリン誘導体であり、すなわち上記式においてＸが水
素でＹがＮＨｔであるもの、ＸがＮｌｈテＹが０８テあ
るもの、Ｘが水素でＹがＯ１＋であるもの及びＸが１１
□であってＹがＯＨであるもの、並びにＸがＮＨ，でＹ
がＮＨ，であるもである、上記第１表にあげた化合物の
多くものは生体内で例えば２°、３°−ジデオキシグア
ノシンのような活性の高い２°、３゛−ジデオキシヌク
レオシドに代謝によって変えられるプロドラッグ（ｐｒ
ｏｄｒｕｇ　）として作用する。

上記の表におけるＲ雪はヒドロキシル基またはそのエス
テル、このエステルの塩類または塩自身であることがで
き、それらはすべて生物学的に重要性のあるものである
。このようなエステルは直鎖状であっても分岐鎖状であ
ってもよい、好ましくはそのエステルは１ないし４個の
炭素原子を有する短鎖長のものであるのがよい、これら
の化合物の一つまたはいくつかを５０μｇ／ｍ　ｌより
も少ない血流中有効濃度をもたらすために投与すること
ができる。好ましい投与濃度の範囲は０．１から１０．
０μｇ／ｍｌまでの範囲である。そのような配合物は通
常の、例えば経口的錠剤、液体、座薬、注射可能な液体
、エロゾル等のような形で投与することができる。

Ｂ型肝炎を治療するための有効な抗ウィルス剤が存在し
ないことによってアヒルの肝細胞の培養を用いてＤ）Ｉ
ＢＶを増殖させ、そして抗ウイルス剤活性について種々
の化学療法剤を実験することが促進された。アヒル肝細
胞培養物をＤＨＢＶの増殖のため及び種々の化学療法剤
をその抗ウイルス剤活性について試験するために用いる
。こメにあげる方法はＤ　１＋　８　Ｖの処理を論する
ものであるけれども、この処理方法は類似の機構によっ
て複製増殖する種々のウィルス類に対して有効であると
考えられる。従って以下にあげる諸実施例は特許請求の
範囲に規定する本発明の範囲に何等の制限を加えること
なく本願の各発明態様を例示することを目的とするもの
である。

［実施例］ 第１図にあげた種々のプリン２°、３”−ジデオキシヌ
クレオシド類及びピリミジン２°、３°−ジデオキシヌ
クレオシド類についての投与量応答曲線はアヒルＢ型肝
炎ウィルス（Ｄ）ＩＢＶ）で感染させた肝細胞系を用い
て求められたものである。　ＤＨＢＶで感染させた肝細
胞培養物は例１に記述するように作られた。各ジデオキ
シヌクレオシド同族体のその肝細胞培養の培養液に第２
８目に加え、そして各２日目毎に培養耕地を交換して培
養した。　１６日０にＤＮＡを細胞から抽出し、そして
３２ＰでラベルしたＤＨＢＶ試料を用いてドツトプロッ
トを行った。各ドツトの放射能をこのドツトの切抜きと
その放射能の計数とによって定量化した。投与量応答曲
線を示す第１図に用いた各略号は次の通りである。

ＤＤＡ　　　２°、３°−ジデオキシアデノシンＤＤｇ
　　　２°、３°−ジデオキシグアノシンｄｄＤＡＰＲ
２，６−ジアミツプリン２°、３°−ジデオキシリボシ
ド ｄｄ＋　　　　２°、３°−ジデオキシイノシンｄｄＴ
　　　　２°、３−ジデオキシチミジンｄｄｅ　　　　
２°、３°−ジデオキシシチジン第１図に示す結果から
、ウィルスの複製を５０％まで抑制するのに要したスフ
レオシド同族体の濃度（１０ｓ。）は２．６−ジアミツ
プリンー２°、３−ジデオキシプリンについて０．０７
Ｐｇ／ｍ　＋、２“、３゛−ジデオキシグアノシンにつ
いて０．０７Ｐｇ／ｍｌ、　２°、３°−ジデオキシア
デノシンについて０．１２Ｐｇ／ｍ　ｌ、２゛、３−ジ
デオキシイノシシについて１．５μｇ／ｍｌ、そして２
’、３’−ジデオキシシチジンについて４０μｇ／ｍｌ
であった。２“、３°−ジデオキシチミジンによっては
Ｄ　ＩＩ　Ｂ　Ｖの複製に何等の抑制作用もなかった。

例」。

新しく生れたアヒルの子にＤＨＢＶを感染させる。感染
後５ないし７日の後にそれらの子アヒルから血液を採取
して特殊なりＮＡプローブによるドットパイプリダイゼ
ーション［Ｍａｓｏｎ等：Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９．３９９７
−４００１１９８０）　参照］を用いてＤＩＩＢＶのＤ
ＮＡについて調べた。そのドツトプロット陽性の子アヒ
ルから肝臓を取り出してこれなすでに記述したようにＤ
ＩＩＢＶで感染させた一次肝細胞培養物を作るために用
いた［Ｔｕｔｔｌｅｍｅｎ等：Ｊ、ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、５８．１７−２５］。培養の２日後に各抗ウィル
ス剤をその培地に加える。各培地は各２日目毎に取換え
、そしてそれぞれ選ばれた時間に細胞を取り出して全Ｄ
ＮＡを抽出する。

そのＤＮＡを硝化綿紙の上にスポットして３Ｚｐでラベ
ルしたＤ　ＨＢ　ＶのＤＮＡプローブを用い下記の手順
に従いブロービングする。　ＤＨＢＶで感染させた肝細
胞からのＤＮＡを抽出して硝化綿濾紙の上にスポットし
た。上記の３２ｐでラベルしたものにより翻訳されたＤ
）ＩＢＶ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐＤ）Ｉ−０１０−Ｄ
）ＩＢＶ）プローブを用いた。このＤＮＡは後平板培養
の種々の時刻において６ｃｍの細胞培養皿から抽出した
。ＶＣ群においてはそれぞれ２．６，８．＋０．１４．
１８及び２０日口の細胞を取り出した。第１４．１８及
び２０日口のものについては二つづつの試料をスポット
した。薬剤処理した群においては細胞をそれぞれ第８．
１４及び２０日口の採取した。第１図においてこれは左
から右への順序である。各試験薬を後平板培養の第２日
月にその培養物に加え、そして各２日目毎の培地の交換
を行わずに保持した。第１図にはそれぞれ　２°、３゛
−ジデオキシシチジン（ｄｄｅ）　、アデニンアラビノ
シド（ａｒａＡ）、２゛、３−ジデオキシアデノシン（
ｄｄＡ）及び２’、　３’−ジデオキシグアノシン（ｄ
ｄＧｌについてその使用濃度（μｇ／ｍｌ）が示されて
いる。標準フェノール抽出法を用いて細胞から全細胞内
ＤＮＡを抽出した。直径６ｃｍのベトリ皿の中の細胞（
約５ＸｌＯ’個）をそれぞれ０．２％のＳＤＳ、ｐＨ８
，６のトリス−）ＩＣ１１５０ｍＭ、　ＥＤＴＡ　ｌ０
ｍＭ　、　ＥＧＴＡ　５ｍＭ及びＮａＣ１１５０ｍＭを
含む溶菌緩衝液中で溶解した。この細胞溶解液を０．５
ｍｇ／ｍｌのプロナーゼＥ（シグマ社から入手できる）
と共に３７℃において２時間消化させ、そしてｐｌ＋７
．５のトリス−ＨＣｌ　２０ｍＭ、０．５ｍＭのＥＤＴ
Ａ、及び０．１％の８−ヒドロキシキノリンで飽和させ
たフェノールの同容積を用いて抽出することにより蛋白
質除去を行った。その水性相に濃酢酸アンモン［ｐＨ１
７，０（２，５Ｍｌ　］　を加えて０．２５Ｍの酢酸ア
ンモン溶液を形成させ、そしてそれぞれの核酸は１００
％エタノールの２倍容積を用いて沈殿させた。核酸の小
球状化物をエタノールで洗浄して乾燥させた。

このＤＮＡをそれぞれ１２．５ｍＭのトリス−１１ＣＩ
（ｐＨ７、５）　ｌ　ＯｍＭのＥＤＴＡ、　３０％のグ
リセロール及び０、旧％のブロモフェノールブルーを含
む溶液の中に溶解させた。このＤＮＡ試料の１２分の１
をドツトプロット分析のために硝化綿の上にスポットし
た。　ｄｄＡ　、　ｄｄＧ、ｄｄＣ及びｄｄＴはＰｈａ
ｒｍａｃｉａ社から購入した。２．６−ジアミツブリン
ー２°、３゛−ジデオキシリボシド、［すなわち２．６
−ジアミツー９−　（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グ
リセロ−ペントフラノシル）−プリン］　（ｄｄＤＡＰ
Ｒ）は最近アデノシンをそのもののｄｄＡｄｏ誘導体に
効率的に変化させるのに用いられている方法［Ｒｏｂｉ
ｎｓ等：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ２５．３
６７−３６９．　（１９８４）並びにＨａｎｓｓｋｅ　
　及びＲｏｌｉｎｓ：ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ
、、２６．４２９５−４２９８．（１９８５１によって
調製することができる。結晶性ｄｄＤＡＰＲは融点１９
４−１９５℃を有し、ＭＳｍ／ｚ２５０．　＋１８０　
［Ｍ責Ｃｌ０Ｉ１１４Ｎ８０□）＝　２５０，１１７８
１　である。この系はｄ　ＩＩ　Ｂ　Ｖの２°、３゛−
ジデオキシアデノシン（ｄｄＡｌ及び２゛、３°−ジデ
オキシグアノシン（ｄｄＧ）に対する予期しない高い感
受性を示す。第１図に示すように２゛、３°−ジデオキ
シチミジン（ｄｄＴ）はｌｏμｇ／ｍｌの濃度において
さえＤ　ＨＶ　ＡのＤＮＡ合成を阻害しない。２°、３
−ジデオキシシチジンは１０μｇ／ｍ　ｌにおいて、ウ
ィルスのＤＮＡ生成を約５７％まで阻止するけれども１
μｇ／ｍｌにおいては僅かな阻止効果しか有しない、ア
デニンアラビノシドはｌｏｕｇ／ｍｌにおいてＤＩＩＶ
ＢのＤＮＡ合成を約６３％まで抑制する。しかしながら
ｄｄＡ及びｄｄＧは共に叶ＶＢのＤＮＡ合成を１μｇ／
ｍｌの濃度において９９％以上まで阻止する。これらの
結果は３度行った実験において一致していた（第２表参
照）。

第２表 プリン２°、３−ジデオキシヌクレオシドとピリミジン
ジデオキシヌクレオシドとのヘパ註＊：これら２つの化
合物についてのドツトハイブリダイゼーションは第２図
には示されていない。

上記の結果は第２０８目のドツトハイブリダイゼーショ
ンの濃度測定法的走査に基くものである。

厩ｌ サザン法によるプロット分析によってプリン−２°、３
゛−ジデオキシヌクレオ同族体の抗ウイルス効果が第２
図に示されているようにＤ　ＩＩ　Ｂ　ＶのＤＮＡに特
す 有ｆ名ということが確認される。この情報は次のように
して集められた。細胞内ウィルス性ＤＮＡのサザン法に
よるプロット分析を１．５％のアガロースゲルの上で分
離した。６ｃｍ皿の中ｌの［１ＨＢＶで感染させた肝細
胞からＤＮＡを抽出し、そして全ＤＮＡの５分の１を各
レーンの上に適用した。第２図に示すようにウィルスの
コントロールＤＮＡ　ハ第２８目（レーンｌ）、第８日
（レーン２）、第１４日（レーン３）、及び第２０日（
レーン４）に抽出した。薬剤処理した群は後平板培養の
第１４及第２０日目に試料採取した。薬剤処理した肝細
胞からのＤＮＡ試料はｄｄＡ（１０ｕ　ｇ／ｍｌ）につ
いて第１４日（レーン５）及び第２０日（レーン６）で
あり、ｄｄＡ（１μｇ／ｍｌ）につい第１４（レーン７
）及び第２０日（レーン８）であり、ｄｄＧ（１０ｕ　
ｇ／ｍｌ）について第１４日（レーン９）及び第２０日
（レーン１０）であり、そしてｄｄＧ　（１μｇ／ｍｌ
）においては第１４日（レーン１１）及び第２０日（レ
ーン１２）であった、第２図にはリラックス環状（ＲＣ
）、共有結合的に閉じた環状（ＣＣＣ）及び１本鎖（Ｓ
ＳＩＤＮＡ　ｆ＝ＪＩが示されている。サイズマーカ（
キロベース）は旧ｎｄＩＩｒで消化されたバタテリオフ
ァージのＤＮＡから得られた。リラックス環状（ＲＣ）
、共有結合的に閉じた環状（ＣＣＣ）及び１本鎖状（Ｓ
Ｓ）のそれぞれの形のＤＩＩＢＶのＤＮＡはそのＤ）Ｉ
ＢＹで感染させた肝細胞中での培養によって増加す６．
　ＤＩＩＢＶ（７）ＤＮＡ　（７）合成はｄｄＡまたは
ｄｄＧ！、：Ｊｌ：って抑制される。しかしながら３度
繰返した実験においてｄｄＧはｄｄＡよりも有効であっ
た。１μｇ／ｍｌの濃度においてｄｄＡによりＤＨＢＶ
のすべての型のＤＮＡの合成が極めて強く抑制される。

　ｄｄＡで処理された肝細胞中のＲＣＯＮ＾の僅かな上
昇力月４旧から第２０８目に存在する。他方においてｄ
ｄＧによる処理は２０日目土でＤＨＢＶのすべての型の
ＤＮＡにおける減小をもたらす、これらの実験に基いて
ｄｄＧはＤＩｌＢＶについてｄｄＡよりもより有効な抗
ウィルス剤である。しかしながらｄｄＡもｄｄＧも共に
ｄｄｅまたはｄｄＴあるいはその他の例えばアデニンア
ラビノシトのようなヌクレオシド同族体よりも極めて効
果が高い、２°、３゛−ジデオキシイノシン（ｄｄｌ）
及び２６−ジアミツプリンー２°、３−ジデオキシリボ
シド（ｄｄＡＰＲ）を用いた同様な実験はこれらのプリ
ン−２゛、３−ジデオキシヌクレオシド類がＤＩＩＢＶ
に対して同様に非常に効果の高い（ｌμｇ／ｍ　ｌにお
いて９５％以上）抗ウィルス剤であることを示した（第
１表参照）　、　ｄｄＡＰＲはアデノシンデアミナーゼ
によって脱アミンされることが知られている［Ｂａ１ｚ
ａｒｉｎｉ等：　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１４５．２６９−２７６
゜（Ｌ９８７）並びに［］ａｌｚａｒｉｎｉ等：　ｎｉ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　　１４５．２７７−２８３．
（１９８７）］　、従ってｄｄ［）ＡＰＲはｄｄＧの有
効なプロドラッグとして作用するのではないかと考えら
れる。

匠１ ２°、３゛−ジデオキシヌクレオシト同族体の細胞外に
おけるＤＩＩＢＶの形成の抑制効果を第３図に示す。

この細胞外の成熟ウィルスＤＮＡのサザン法プロット分
析を１．５％の７ガローズゲルの上で分画した。それぞ
れの培地を後平板培養の第１６日目から第２０日日まで
プールした。成熟ウィルスの小球状化物をプロナーゼに
より消化し、モしてずへての試料からのＤＮＡを各レー
ンに適用した。

第３図に示すように、コントロールのウィルス（レーン
１　）　、　ｄｄＡ　１　ｕｇ／ｍｌで処理した肝細胞
（レーン２　）　、　ｄｄＧ　ｌ　ｕｇ／ｍｌで処理し
た肝細胞（レーン３　）　、　ｄｄＴ　１　μｇ／ｍｌ
で処理した肝細胞（レーン４）及びｄｄｅ　１μｇ／ｍ
ｌで処理した肝細胞（レーン５）があげられている。第
３図にあげであるＲＣはリラックスト環状ＤＮＡである
。

細胞外ウィルス形成はｄｄＡまたはｄｄＧによってｌμ
ｇ／ｍｌの濃度において著しく減少する。しかしながら
ｄｄＴ及びｄｄｅは細胞外ウィルス生成をｌμｇ／ｍｌ
において阻止できない。

プリン−２’、３’−ジデオキシヌクレオシド類は低い
濃度において旧ＩＢＶの複製を制御する。このＤＩＩＢ
Ｖ複製のプリン−２°、３°−ジデオキシヌクレオシト
類によるピリミジン２゛、３“−ジデオキシヌクレオシ
ト類に比しての選択的な抑制の機構は知られていない、
しかしながらすでにあげたようにこの発見の背後に上記
の機構についての可能な少なくとも一つ以上の説明が存
在する。可能なそのようなき機構のもう一つは、ピリミ
ジン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類がプリン２
゛、３−ジデオキシヌクレオシド類と同程度のアヒル肝
細胞中で効果的に燐酸付加分解されないということであ
る。しかしながらプリン２°、３−ジデオキシヌクレオ
シド類の燐酸付加分解が非常に良好であると仮定したと
してもプリン２°、３−ジデオキシヌクレオシド３燐酸
塩はｄＧＴＰ及びｄＡＴＰがウィルスＤＮＡポリメラー
ゼを抑制するのと競合しなければならないであろう、こ
れらの実験において観察されたその抑制効果はプリン２
’、３’−ジデオキシヌクレオシド類についてのあるユ
ニークな作用機構を示唆する。ＨＶＢもプリン２゛、３
°−ジデオキシヌクレオシド同族体によって同様に選択
的に抑制されるものと考えられる。複製の非常に近似し
た機構に基いてＩＩＢＶはこれらの抗ウィルス剤に対し
て同様な感受性を示すであろう。この処置方法は叶ＢＶ
と同じ態様で複製する例えば人体におけるｌｌ［３Ｖの
ような種々のウィルスに対して有効であることを証明す
るものである。

式（Ｉ）の２゛、３−ジデオキシヌクレオシド同族体は
生物学的に受容性のあるエステル、このようなエステル
の塩または生物学的に受容性のある塩の形で投与するこ
とができる。本発明に従うこれらの化合物は経口投与、
直腸投与、非経口投与（静脈内注射、筋肉注射または皮
下注射等）あるいはエロゾルの吸入を含む種々の経路の
一つによって治療のために投与することができる。

プリン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類が胃内に
通常見出されるような酸性ｐＨ領域において分解されや
すいことが知られている。従って胃内の酸性ｐｌ＋を避
けることができるような経口投与用調剤が必要であろう
、これは時間をかけて放出するようなカプセルを用いる
か、またはプリン２゛、３゜ジデオキシヌクレオシド類
の経口投与に先立って胃内ｐｌ＋を中和させることによ
って達成できる。非経口的投与のためにはプリン２゛、
３−ジデオキシヌクレオシト類は滅菌された注射可能な
水性または非水性の溶液の形になっているであろう。

これらの化合物は水溶性であるので、適当な緩衝剤及び
受容可能な静菌剤の含まれた等優性の中性ｐｌ＋の水溶
液が静脈内投与のためのもっとも好ましい調剤であろう
。

ｌないし１０μｇ／ｍｌの血漿内水準を得るのが望まし
い。ある条件においてはより高い水準が要求されること
が考えられ、但し投与水準は血流中に５０μｇ／ｍｌを
超えないであろうことが予想される。

他の２°、３−ジデオキシヌクレオシド類のすでに発表
されている種々の研究に基いて、ｌないしｌＯμｇ／ｍ
ｌの比較的低い水準は上述した酸性度の変化の限度に従
う経口的経路による１〜５ｍｇ／ｋｇの投与によって容
易に達成することができる。これは例えば３°−アジド
−３゛−デオキシチミジン（ＡＺＴ）のような他のヌク
レオシド同族体を用いた公知の経験に基づいており、こ
のものはｌ　ｍｇ／ｋｇのインフュージョンまたは２　
ｍｇ／ｋｇの経口投与のあとでｌμｇ／ｍｌの血漿内ビ
ーク水準をもたらす。同様にしてｄｄｅによる］１！■
の抑制のための有効な血漿内水準は経口投与によって達
成される。

プリン２°、３°−ジデオキシヌクレオシド類の毒性は
アヒルの肝細胞及び猿の腎臓細胞において試験されてお
り（Ｖｅｒｏ）、ｄｄＡまたはｄｄＧを用いて１００μ
ｇ／ｍｌ濃度においてｌＯ日日間曝露に際して細胞成育
能の低下は検出されなかったということを示している。

知られているようにリンパ球細胞系の若干のものが２°
、３°−ジデオキシヌクレオシド類の存在のもとで成育
能及び機能について調べられている。これらの細胞系は
成育能の低下を示さず、そして１００μｓ／ｍ＋の２゛
、３°−ジデオキシヌクレオシド類に曝らされた場合で
さえ温和に抑制された免疫作用しか示していない［Ｍｉ
ｔｓｕｙａ等：ＰＮＡＳ、銘、　７０９６−７１００（
＋９８５）］。

憇Ａ 生体内活性を証明するためにいくつかに追加的な試験を
行った。　ＤＩＩＢＹによる持続感染を示した４匹のペ
ンギンタックを２．６−ジアミツブリン２゛、３°−ジ
デオキシリボシド（ｄｄＤＡＰＲ）を用いて試験した。

これらの動物に２週間にわたって毎日２回筋肉内注射に
より１０ｍｇ／ｋｇを投与した。この処理によって第５
図に示すように極めて迅速にその血清からのウィルスの
クリアランスがもたらされた。

ａ列は処理する前の５匹の動物のドツトプロット分析結
果を示す、５匹のすべての動物はＤ）ＩＢＶによる持続
性感染の証拠を有していた６動物１ないし４は薬剤処理
したものであって列すは一週間後の処理結果を示す、み
られるようにこの処理によってウィルスは１週間でそれ
らの血清から完全にクリアされた。ｂ列の処理されてい
ないアヒル（ＮＯ，５）は持続性感染を示す、Ｃ列は処
置後２週間後におけるドツトプロット分析の結果を示す
、ウィルスはそれら４匹の処理されたアヒルの血清から
クリアされた。コントロール動物（Ｎｏ、　５のもの）
は２週間後においても強い陽性のままに留まった（０列
第５ｆｔ’Ｊ）。

本発明者等はｄｄＤＡＰＲが代謝によって速やかにｄｄ
Ｇに変化することも確認している。これは全血液を用い
てｄｄＤＡＰＲのｄｄＧへの転化速度を測定することに
よって行った。本発明者等の得た結果によれば、９５％
よりも多い割合のｄｄＤＡＰＲが代謝によって５分間の
間にｄｄＧに変化することが示されている。これらのテ
ストは、ｄｄＤＡＰＲが試験管内においてのみならず生
体内においても非常に活性が高くそしてまたこれは恐ら
くはｄｄＧのプロドラッグであることの明らかな証拠を
与えるものである。

以上に本発明の好ましい諸具体例を詳細に記述したが、
この技術分野において就熟した者には本発明の範囲を逸
脱することなく多くの変法が可能であることは容易に理
解できることである。

【図面の簡単な説明】

第１図は特定のプリン及びピリミジン−２，３°−ジデ
オキシヌクレオシドの投与量応答曲線を示し、第２図は
コントロールウィルス（ＶＣ）及び薬剤処理したＤＩ−
ＩＢＶ感染肝細胞のドツトプロットハイブリダイゼーシ
ョンを示し、第３図は１．５％アガロースゲルの上で分
画された細胞内ウィルスＤＮＡのサイン法式プロット分
析を示し、第４図は１５％アガロースの上で分画された
細胞外成熟ウィルスＤＮＡのサイン法式プロット分析を
示し、そして第５図はＤ）ＩＢＶに感染した動物から抽
出された血清のドツトプロット分析を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヘパＤＮＡウィルスに感染した動物を医学的に処
   置するに当り、そのような動物に、生物学的に受容性の
   ある担体と組み合わせて生物学的に活性のある、下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［但し上記式においてＸはＨ、Ｒ＿１、ＮＨ＿２、ハロ
   ゲン、ＮＨＲ＿１、Ｎ（Ｒ＿１）＿２、ＯＨ、ＯＲ＿１
   、ＳＨ又はＳＲ＿１を表わし、ＹはＨ、Ｒ＿１、ＮＨ＿
   ２、ハロゲン、ＮＨＲ＿１、Ｎ（Ｒ＿１）＿２、ＯＨ、
   ＯＲ＿１、ＳＨ又はＳＲ＿１を表わし、Ｒ＿１は１ない
   し８個の炭素原子を有する低級アルキル基を意味し、そ
   してＲ＿２はＨ又は生物学的に受容性のあるエステル、
   或いはこのエステルの、生物学的に受容性のある塩を与
   えるような塩を表わす］で表わされる２’，３’−ジデ
   オキシヌクレオシドの有効量が含まれている調剤を投与
   することよりなる方法。
2. （２）上記動物の血液流中の有効量が１０μｇ／ｍｌよ
   りも少ない、請求項１記載の方法。
3. （３）上記ヘパＤＮＡウィルスがＢ型肝炎ウィルスであ
   る、請求項１記載の方法。
4. （４）生物学的に受容性のある担体と組み合わせて生物
   学的に活性のある、下記式 ▲数式、化学式、表等があります▼ ［但し上記式においてＸはＨ、Ｒ＿１、ＮＨ＿２、ハロ
   ゲン、ＮＨＲ＿１、Ｎ（Ｒ＿１）＿２、ＯＨ、ＯＲ＿１
   、ＳＨ又はＳＲ＿１を表わし、ＹはＨ、Ｒ＿１、ＮＨ＿
   ２、ハロゲン、ＮＨＲ＿１、Ｎ（Ｒ＿１）＿２、ＯＨ、
   ＯＲ＿１、ＳＨ又はＳＲ＿１を表わし、Ｒ＿１は１ない
   し８個の炭素原子を有する低級アルキル基を意味し、そ
   してＲ＿２はＨ又は生物学的に受容性のあるエステル、
   或いはこのエステルの、生物学的に受容性のある塩を与
   えるような塩を表わす］で表わされる２’，３’−ジデ
   オキシヌクレオシドの有効量が含まれている、ヘパＤＮ
   Ａウィルスに感染した動物の処置に有効な組成物。
5. （５）ＸとＹとが以下の各組合せよりなる、請求項１記
   載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼