JPH0274865A - 体液中のリンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 体液中のリンの構成の測定は、リンの貯留を生じる尿毒
症や慢性腎疾患のような疾患の診断を可能にするので、
体液中たとえば血清または尿中のリンの徴の定量は重要
である。

体液中のリンの定量的測定は従来、モリブデンブルー反
応を用いて光学的に行われてきた（１．Ｈ。

にｏｌｔｈｏＨ＆　Ｐ、口、Ｅｌｖｉｎｇ編、第■部、
第Ｖ＠、第３１７〜４０２頁、１９６１年）。この反応
は、リンモリブデンＷ！１′＃１合体の生成、ついでイ
のフェニルヒドラジン、アスコルビン酸、アミノナフト
ールスルホン酸または他の還元剤からなる群より選ばれ
る還元剤による還元を包含する。還元によって異種多酸
の青色複合体が生成し、この複合体の吸収を約７００ｎ
−で測定するものである。

体液中のリンを定量的に測定するこの慣用方法にはいく
つかの欠点である。第一に、この試験を実施するために
は蛋白質を含まない血清サンプルが必要で、このような
蛋白質を含まない血清サンプルの調製は繁雑である。第
二に、この試験の感磨は低い。Ｒｇｉに、この試験を実
施するためには試薬を２回連続して添加する必要がある
。すなわら、最初にリンモリブデン酸複合体を生成させ
、ついで上述のように還元する。このような２工程方法
のためにリンの定ｆｉ試験のスピードは遅くなる。多く
の試験について迅速かつ正確な完了のための努力がなさ
れていることから、最後に挙げた欠点はとくに重要であ
る。

この最後の欠点の克服の試みとしては、非還元リンモリ
ブデン酸複合体を約３４０ｎ−で測定するリンの定量を
開示した米国特許第３．７９５，４８４＠がある。

さらに詳しくは、この米国特許第３．７９５゜４８４号
の方法は、次の各工程からなるものである。

（ａ）リン含有液体とモリブデン酸アンモニウム溶液の
混合物の生成、 （ｂ）上記混合物生成後２秒以内に３４０ｎｓにＪ３け
る第一の吸収の読みの、遠心分離分析光度計による測定 （ｃ）上記混合物生成後１０分以内に３４０１における
第二の吸収の読みの測定 （ｄ）吸収の差を、既知濃度のリンを含有する液体から
同時に同一条件で得られた少なくとも１つの他の吸収の
差の比較 （ｅ）リン含有液体中のリンの計の決定この方法にもい
くつかの欠点がある。第一に、この方法は最初の吸収の
読みを、試薬と体液サンプルの混合模２秒以内に測定し
なければならない。

このような制限が従来方法の実施を繁雑なものとしてい
る。第二に、蛋白質基質サンプル（たとえば血清）と水
基質サンプルの間には、タンパク質ＭＷサンプルの方が
水性サンプルよりも速やかに反応が起こるという差があ
るため、この従来技術では、水性サンプルの体液たとえ
ば尿と、蛋白質サンプルの体液たとえば血清とでは、リ
ンの定量のために別個の較正が必要である。

本発明の目的は、体液ナンブル中のリンをモリブデンＭ
？Ｕ合体生成反応を光学的に測定するリンの定量方法に
おいて、反応の進行を、２回の読み取りの最初の読み取
りを試薬と試験すべき体液のＵ合接１０秒までとゆっく
り行えるＪ：うに十分緩徐にした方法を提供することに
ある。

本発明の他の目的は、尿のような水性体液または［Ｉｉ
ｌ清のような蛋白質基質体液のいずれを試験する場合で
も同じ較正が使用できるような体液中のリンの定量方法
を提供することにある。このような方法の提供により、
水性および血清サンプルのリンの定量を同時に行うこと
が可能になる。

本発明は、界面活性剤、強酸、式 ％式％ 酸アンモニウム、重金属キレート剤、抗酸化剤、所望に
より消泡剤、および脱イオン水からなる体液中のリンの
定量のための試薬およびそれを用いる方法に関する。本
発明の方法および試薬キットににれば、２回、光吸収を
読み取ることにＪ：るリンの定量方法が与えられる。、
最初の読み取りは、体液と試薬の混合後１０秒までに行
えばよい。また、本発明の方法によれば、尿のような水
性体液でも、また血清のような蛋白質基質体液でも較正
を変えないで実施できる体液中のリンの定撮手段が提供
される。

本発明は、体液中のリンの定量方法に関する。

本発明はまな、体液中のリンの定量を実施するための試
薬に閏する。本発明によれば、試薬は、リンの光学約定
ｍ方法の従来技術に比べてリンＬリプデン酸複合体の生
成が著しく駁徐になるように選ばれているので、体液と
試薬の混合後１０秒までとゆっくり第一の吸収の読み取
りを行えばＪ：い、リンモリブデンＭ複合体の生成によ
って生じる吸収を光学的に読み取るリンの定量方法が提
供される。

本発明はまた、尿のような水性体液でも、血清のような
蛋白質基質体液でも、いずれも同じ較正を用いて測定で
きる体液中のリンの足ののための方法および試薬を提供
する。

体液中のリンの定量的測定は、リンの貯留が起こる尿毒
症や慢性腎疾患のようないくつかの疾患の診断にｍ要で
ある。

本発明の試薬では、体液中のいわゆる無機リンＭｌのみ
が測定される。本明細書において、リンの濃度または量
といった場合には、これらの無機リン酸中のリンを意味
するものである。

有機リン、たとえばリン脂質、リン酸エステルおよびリ
ン酸ヌクレオチドの変動の意義は実際、臨床的闇題に容
易には結びつかない。

本発明の試薬は、以下に述べるように構成される。与え
られた濃度は、試薬が完全に処方されたのちの特定の成
分の濃度である。約０．０１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの
界面活性剤、約０．００１％ｗ／Ｖ〜約０．５％ｗ／Ｖ
の重金属キレート剤であるＮ−ヒドロキシエチルエチレ
ンジアミン三酢酸、および約０．０００１％ｗ／ｖ〜約
０．０１％ｗ／ｖの抗酸化剤としてのブチル化ヒト［］
キシアニソールを脱イオン水中に含有する溶液に、約０
．６７５Ｍ〜約１．２５Ｍの濃度の硫酸を添加する。こ
れに、約１．７５１ｍＭ〜約６．２５ｇＨの濃度のモリ
ブデン酸アンモニウムを加え、ついで所望により、最後
に約０．００１％〜０．１％ｗ／Ｖの範囲の消泡剤を添
加する。

本明細書において用いられるＭは１１あたりのモルを、
ｍＭは１１あたりのｍＭを、％ｗ／Ｖは溶液１００ＩＩ
Ｉ中のダラムを意味する。同様に、溶液１００Ｉｄｌ中
０．５ｇは０．５％ｗ／Ｖである。

本発明の試薬の界面活性剤は、同じリン濃度の血液およ
び水性体液で同じ吸収の読みを与えるような界面活性剤
でな番ノればならない。本発明の試薬の界面活性剤は、
試験される体液からの蛋白質の沈殿も防止するものでな
ければならない。このような界面活性剤の例には、化学
式 Ｃト１　（ＯＣＨ２ＣＨ２）２３０ト１を有する非イオ
ン界面活性剤、ポリオキシエチレン〈２３）ラウリルエ
ーテルがある。とくに好ましい界面活性剤は、化学式Ｃ
Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）２ｏＯＨを有する非イオン界面活
性剤、ポリＡ４ニジエチレン（２０＞；ルーイルエーテ
ルである。

重金属キレ−１へ化合物の例には、クエン酸、ざらに特
定ずれば、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢
酸である。

本発明の試薬の抗酸化剤は、界面活性剤の酸化を防止で
きる任意の抗酸化剤である。とくに好ましい抗酸化剤と
してはブチル化ヒドロキシアニソールがある。

本発明の試薬の強酸は、水溶液中でほぼ完全にイオン化
する大部分の酸であってよい。強酸の例としては、アル
キルおよび芳香族スルホン酸、とくにメタンスルホン駿
Ｊヌよびエタンスルホン酸のようなアルニ１ルスルホン
酸ならびにフェニルスルホン ールスルホン酸を挙げることができる。トリニトロ安息
香酸のような安息香酸も゛使用できる。その他の強酸に
は、塩酸、トリフル３口酢酸、フルオホウ酸、ヨウ化水
帽り硫酸、コード酸、過ヨード酸、セレン酸、シュウ酸
、マレイン酸、ジクロロ酢酸およびシクロプロパン−１
．１−ジカルボン酸が包含される。本発明の試薬におけ
る強酸としては硫酸がとくに好ましい。

本発明の特定の試薬は次のように製造された。

１１の試薬は、約５００ｄの脱イオン水に、まず７ｇの
Ｂｒｉｊ■９９、プヂル化ヒト０キシアニソール０．０
１ｇおよびＮ−ヒドロキシエヂルエチレンジアミン三酢
ｆｆｉ０．１５ｇを溶解することにより調製した。これ
に、１硫Ｍ４１．７−を加えた。２．５！Ｍのモリブデ
ン酸アンモニウムをついで試薬に溶解し、最後に１００
μｌの消泡剤、Ｃｏｌｌｏｉｄ　１　０　１　０を溶か
した。試薬の総容温が１Ｊ！になるように、十分の脱イ
オン水を追加した。

上記例の調製に用いた界面活性剤、 Ｂｒｉｊ０９９は、化学式 ％式％ エチレン（２０）オレイルエーテルで、分子ｍ１１４９
、５６、融点２５〜３０℃である。

Ｃｏｌｌｏｉｄ　１　０　１　０はＣｏｌｌｏｉｄ，　
　Ｉｎｃ．　　（　３　９　４、ｒｒｅｌｉｎｇ　　ｈ
ｕｙｓｅｎ　　Ａｖｅｎｕｅ，　　Ｎｅｗａｒｋ，　　
Ｎ．Ｊ、　　０　７　１　１４）から販売されている。

Ｃｏｌｌｏｉｄ　１　０　１　０は、以下の性質を有す
るシリコン基剤の発泡抑υｌ剤である。

外観：不透明安定な液体 色：白色 種類：安定な乳化液 非揮発性残分く１０５℃、％）：１５．０比重（２５℃
、％）：１．０ シリコン液含量％：１０．０ 発泡による問題を回避するため、本発明の試薬の好まし
い態様では消泡剤が包含される。

本発明の試薬は、以下の濃度の試薬で処方することがで
きる。与えられた濃度は、試薬が完全に処方されたのち
の特定の成分のｍ度である。

約０．０１％ｗ／■〜約５％ｗ／ｖの界面活性剤、約０
．００１％ｗ／■〜約０．５％ｗ／ｖのＮ−ヒドロキシ
エチルエチレンジアミン三酢酸、および約０、０００１
％ｗ／ｖ〜約０．０１％ｗ／ｖのブチル化ヒドロキシア
ニソールを脱イオン水中に含有する溶液に、硫酸を１１
度約０．６７５Ｍ〜約１、２５Ｍに加える。これに、モ
リブデン酸アンモニウムを濃度的１．７５ｓＮ〜約６．
２５Ｍを加え、ついで最後に、所望により、約ｏ．ｏｏ
ｉ％ｗ／Ｖ〜約０．１％ｗ／Ｖの範囲の消泡剤を加える
。

本発明の試薬の利点は次の通りである。すなわち、本発
明の試薬は、従来技術の２種試薬混合物に対して、単一
試ａ混合物である。したがって、本発明の試薬は、定量
に際して混合の必要がない。

さらに、サンプルと本発明の試薬の反応は従来技術の試
薬の場合よりある程度遅いので、最初の吸収の読み取り
を行うまでに１０秒までが経過してもよい。したがって
、米国特許第３．７９５。

４８４号のように、最初の吸収の読み取りを、試薬とサ
ンプルの混合物の生成後２秒以内に行ってリンの測定値
を得る従来技術に比べて便利である。

上述したように、本発明においては、最初の吸収の読み
は試薬とサンプルの混合後１０秒までに行えばよく、好
ましくは最初の吸収の読みは試薬とサンプルを混合して
から約４．５秒模に行われる。

最後に、従来技術に比して本発明の決定的な利点は、水
性および血清の両ザンブルが、水性または血清標準のい
ずれにも使用できる唯一の較１１を心上とするのみで一
緒に検定できることである。

等濃度の水性および血清サンプルの反応速度はわずかに
相違するが、本発明の試薬ではリン濃度が等しい水性お
よび血清サンプルの吸収の変化は同じだからである。

本発明の試薬は任息の非遠心分離または遠心分離分析光
度計、とくにＣＯＢ　Ａ　Ｓ　”＃所シスデムＢＩＯＦ
ＡＲＡ■およびＭＩＲＡ■に使用で■ きるように設計されている。

体液中のリン借は、本発明の方法により、体液、希釈用
脱イオン水および試薬の混合物を生成させることによっ
て定石的に測定される。体液と希釈液プラス試薬の容聞
比は約１：１２５〜１：３０の範囲に変化させることが
でき、約１：５０が好ましい。ついで最初の３４０ｎｍ
での吸収の読み取りを行う。最初の吸収の読み取りは、
混合物の生成から１０秒後までに行う。この吸収の読み
取りは、非遠心分離、または好ましくは遠心分離分析光
度計によって行われる。

第二の吸収の読み取りは混合物の生成後１０分以内に行
われる。本発明の試薬の場合、体液と試薬の反応は比較
的遅いので、この最初の吸収の読み取りはサンプルブラ
ンクとして役立つ。

次に、２回の吸収の読みの間の差を既知瀧爪の液体の吸
収と比較して、試験体液中のリンの槍を定量する。

本発明の試薬の効力を明らかにする以下の試験では、サ
ンプル５μ１１希釈液（１Ｂ２イＡン水）５０μ１１プ
ラス試ａ２００ｕｌを、Ｃ０ＢＡＳＢＩＯｏ遠心分離分
析計のキュベットロータ二Ｆそれぞれの各コンパートメ
ントに平行して添加した。ついで、反応を３４０ｎｍで
モニタリングした。

最初の吸収の読み取りは、混合後４．５秒に実施した。

この時点では、反応はわずかじか起こっておらず、した
がってこの読みはサンプルブランクとして用いることが
できる。第二の読み取りは、反応がほぼ完了した混合模
３分に行われた。最後と最初の吸収の読みの差に、既知
リン濃度の標準から計粋された較正ファクターを乗じる
ことによって、リンの濃度が計算された。

反応の初期に読み取った吸収の値は自動サンプルブラン
クを提供し、これは検定される血脂性、黄門性および溶
血ナンプルについても妨害のない正確な値を与える。

本発明の試薬のサンプル盲検能を示す　験この試験には
以下の材料を使用した。

１）　水性標準−無機リン（３５６および１２ａｌｊ／
ｄ７のリン）を含む水性標準 ２）正常ヒト血清−（熱不活化、濾過、０．１％アジド
）−ＫＨＰＯ４（リン酸カルシウム）を補充しリン１．
５．４．６．８．１０．１２．１４．１６および１８Ｊ
ＩＩＦ／ａ差を含有するサンプルを調製 ３）血脂性および溶血サンプル ４）以下に記載の無機リン用試薬−（サンプルブランク
との２試薬系） ５）本発明の１試薬系 最初に、血脂性および溶血患考サンプルをサンプルブラ
ンクを与えることが知られている２試桑系を用いて検定
した。２試薬系では、サンプルを、０．３６モル／Ｉの
硫酸を含有する第一の試薬と混合し、サンプルブランク
吸収の測定を３４０ｎｌで行う。ついで５．４ミリモル
／Ｉのモリブデン酸アンモニウムを含む第二の試薬を加
え、１５秒後に第二の吸収測定を３４０ｒｖで行う。第
二の吸収の読みから第一の吸収の読みを差し引くと、サ
ンプル中に存在するリンによる正味の吸収変化が得られ
る。次に同じサンプルを用いて、本発明の１試薬系を用
いて定量を行った。

結果： 第１表は、上述の２試薬系および本発明の１試薬系の両
者で、脂血性および溶血サンプルからほぼ等しい結果が
得られ、本発明の１試薬系が、１ナンブルブランク吸収
の測定を包含する、確立された従来技術のリン検定法と
、その正確さにおいて匹敵するものであることを示して
いる。第１表には、本発明の試薬のサンプル盲検能を示
す。

第１表 脂血性 溶血 ２．８■／ ４．５ ４．１ ３．１ １７．２ １４．１ ３．５ ２．８ ３．９ ｄｉ　　２．３ｊＩ！ｙ／　　ｄｊ２ ４．４ ３．９ ３．６ １６．９ １４．３ ３．０ ２．９ ３．８ この試験では以下の材料を使用１ノた。

１）無機リン（３５６および１２ｑ／ｄｉのリン）を含
有する水性標準 ２）水性サンプル−蒸留水にリン酸カリウムを補給し、
リン１．５．４．６．８．１０，１２．１４．１６およ
び１８η／ｄＪのサンプルを与え３）自消サンプル〜正
常ヒト血清（熱不活化、濾過、０．１％アジド）にリン
酸カリウムを添加し、リン１．５．４．６．８．１０．
１２．１４．１６および１８ａｙ／ｄＪのサンプルを得
る４）上述の無機リンに対する試薬−（サンプルブラン
クと２試薬系） ５）本発明の１試薬系 結果： 同じリン濃度の水性および血清サンプルを上述の２試薬
系および本発明の１試薬系の両者で、装置の較正には水
性Ｉ！準のみを用い、Ｃ０ＢＡＳＢ■Ｏｏで測定した。

第■表には、較正に用いた水性標準のリン濃度、ならび
にこの検量曲線に対して検定した水性および血清サンプ
ルのリン濃度を示す。各リン濃度の次は、最初の４．５
秒後の読みから最後の３分後の読みへの３４０ｎ１１の
吸収の変化である。同じまたは類似のリン濃度の水性お
よび血清サンプルにおける変化は等しいかまたは比例し
、水性および血清サンプルの反応速度は異なるにもかか
わらず、較正には水性標準のみを用い、本発明の試薬で
、水性および１ａｌ清ナンプルを定損できることが明ら
かである。

０．２７ ０．５３ １．０３ １．６ ３．７ ５．８ ８．３ １０．２ １１．７ １３．６ １５．３ １７．３ ０．１４ ０．３２ ０．５１ ０．７３ ０．９０ １．０３ １．２０ １．３５ １．５２ １．６ ３．７ １．８ ９．９ １１．９ １３．８ １５．１ １７．６ ０．１４ ０．３３ ０．５１ ０．６９ ０．８１ １．０５ １．２１ １．３８ ΔＡ＝Ａ　　　　−Ａ ３分　　　４．５秒 水性および血清サンプルが水性または血　　準この試験
には以下の材料を使用した。

１）リン（３５６および１２ｑ／ｄＩのリン）を含有す
る水性標準 ２）既知リンレベルのヒト血清サンプル３）正常ヒト血
清（熱不活化、濾過、０．１％アジド）にリン酸カリウ
ムを添加し、リン１．５．４．６．８．１０．１２およ
び１４１９／ｄＪの令ナンブルを得る ４）脱イオン水で１＝１０に希釈した尿サンプル５）正
常および脂血性ヒト血清サンプルこの試論の実施に際し
ては、サンプルを最初、上述の２試薬系で、較正には水
性標準を用いて検定した。同じサンプルを本発明の１試
薬系で、最初水性標準による較正で、次にｔ１１清標準
による較正で検定した。

第１表には３種の異なる検定は、サンプルが正常血清、
脂血性血清または尿のいずれであっても、結果がよく相
関することを示している。本発明の１試薬系に対する較
正ファクターは、 水性または 第 表 血清標準のいヂれを用いてもほぼ同じであった。

結果： 補充正常血清 尿 正常血清サンプル 脂血性血清サンプル 較正ファクター ９．９ １１．３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）約０．０１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖの範囲の界面
   活性剤、約０．６７５Ｍ〜約１．２５Ｍの範囲の強酸、
   約１．７５ｍＭ〜約６．２５ｍＭの範囲のモリブデン酸
   アンモニウム、重金属キレート剤、抗酸化剤および脱イ
   オン水からなる体液中のリンの定量用組成物（２）界面
   活性剤は化学式 Ｃ＿１＿８Ｈ＿３＿５（ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２）＿２＿０
   ＯＨのポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルで
   ある特許請求の範囲１項に記載の組成物 （３）強酸は硫酸である特許請求の範囲第１項に記載の
   組成物 （４）重金属キレート剤は約０、００１％ｗ／ｖ〜約０
   ．５％ｗ／ｖの範囲のＮ−ヒドロキシエチルエチレンジ
   アミン三酢酸であり、抗酸化剤は約０．０００１％ｗ／
   ｖ〜０．０１％ｗ／ｖの範囲のブチル化ヒドロキシアニ
   ソールである特許請求の範囲第３項に記載の組成物 （５）化学式Ｃ＿１＿８Ｈ＿３＿５（ＯＣＨ＿２ＣＨ＿
   ２）＿２＿０ＯＨのポリオキシエチレン（２０）オレイ
   ルエーテル約７ｇ／ｌ，濃硫酸約４１．７ｍｌ／ｌ、モ
   リブデン酸アンモニウム約２．５５ｇ／ｌ、Ｎ−ヒドロ
   キシエチルエチレンジアミン三酢酸約０．１５ｇ／ｌ、
   ブチル化ヒドロキシアニソール約０．０１ｇ／ｌ、消泡
   剤約１００μｌ／ｌ、および残部の脱イオン水からなる
   特許請求の範囲第１項に記載の組成物 （６）リン含有体液とモリブデン酸アンモニウム溶液の
   混合物を界面活性剤の存在下に生成させ、遠心分離また
   は非遠心分離アナライザーを用いてリン含有体液中の水
   性または血清リンを定量する方法において、界面活性剤
   として化学式 Ｃ＿１＿８Ｈ＿３＿５（ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２）＿２＿０
   ＯＨのポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルを
   、抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシアニソールを、重
   金属キレート剤としてＮ−ヒドロキシエチルエチレンジ
   アミン三酢酸を使用する改良 （７）（ａ）体液と、約０．０１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／
   ｖの範囲の界面活性剤、約０．６７５Ｍ〜約１．２５Ｍ
   の範囲の強酸、約１．７５ｍＭ〜約６．２５ｍＭの範囲
   のモリブデン酸アンモニウム、重金属キレート剤、抗酸
   化剤および脱イオン水からなる組成物との混合物を生成
   させ、 （ｂ）工程（ａ）の混合物の生成後１０秒以内に、光度
   計を用いて３４０ｎｍにおける第一の吸収を読み取り、 （ｃ）工程（ａ）の混合物の生成後１０分以内に３４０
   ｎｍにおける第二の吸収を読み取り、 （ｄ）２つの吸収の読みの差を既知リン濃度の液体から
   の吸収の読みと比較して体液中のリンを定量的に測定す
   ることを特徴とする体液中のリンの定量方法 （８）界面活性剤は化学式 Ｃ＿１＿８Ｈ＿３＿５（ＯＣＨ＿２ＣＨ＿２）＿２＿０
   ＯＨのポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルで
   ある特許請求の範囲第７項に記載の方法 （９）強酸は硫酸である特許請求の範囲第８項に記載の
   方法 （１０）金属キレート剤は約０．００１％ｗ／ｖ〜約０
   ．５％ｗ／ｖの範囲のＮ−ヒトキロジエチルエチレンジ
   アミン三酢酸であり、抗酸化剤は約 ０．０００１％ｗ／ｖ〜約０．０１％ｗ／ｖの範囲のブ
   チル化ヒドロキシアニソールである特許請求の範囲第９
   項に記載の方法