JPH0260589A - バクテリオファージｍ１３の遺伝子□ｄ２プロモーターを使用した大腸菌中での外来タンパクの高レベル産生 - Google Patents
バクテリオファージｍ１３の遺伝子□ｄ２プロモーターを使用した大腸菌中での外来タンパクの高レベル産生Info
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- JPH0260589A JPH0260589A JP63212333A JP21233388A JPH0260589A JP H0260589 A JPH0260589 A JP H0260589A JP 63212333 A JP63212333 A JP 63212333A JP 21233388 A JP21233388 A JP 21233388A JP H0260589 A JPH0260589 A JP H0260589A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
１弧へ氷１
本発明は、バクテリオファージ８１３の遺伝子Ｌ（以下
、単に「遺伝子１」ともいう、）のフラグメントと外来
タンパクをコードする配列のフラグメントとをバクテリ
オファージ８１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロー
ル下に含む発現ベクターに係る。
、単に「遺伝子１」ともいう、）のフラグメントと外来
タンパクをコードする配列のフラグメントとをバクテリ
オファージ８１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロー
ル下に含む発現ベクターに係る。
より詳細には本発明は、バクテリオファージＭ１３の遺
伝子Ｌプロモーターのコントロール下の前記発現ベクタ
ーを使用することによって大腸菌中で外来タンパク、特
にＢ型肝炎つィルスＸ（ＩＩＩ３Ｖ Ｘ）タンパクを高
レベルで産生ずる方法に係る０本発明によって産生され
るＨＢＶＸタンパクは多量に精製することが容易であり
、動物中で抗Ｘ抗体を誘発すべく使用され得る。ＨＢＶ
Ｘタンパク及び抗ＸｆＡ体の双方がＨＢＶ感染患者の
診断試薬として有用である。
伝子Ｌプロモーターのコントロール下の前記発現ベクタ
ーを使用することによって大腸菌中で外来タンパク、特
にＢ型肝炎つィルスＸ（ＩＩＩ３Ｖ Ｘ）タンパクを高
レベルで産生ずる方法に係る０本発明によって産生され
るＨＢＶＸタンパクは多量に精製することが容易であり
、動物中で抗Ｘ抗体を誘発すべく使用され得る。ＨＢＶ
Ｘタンパク及び抗ＸｆＡ体の双方がＨＢＶ感染患者の
診断試薬として有用である。
１朋１］Ｕ［
Ｂ型肝炎ウィルス（ＩＩＢＶ）は急性及び慢性の肝炎を
誘発しヒトの原発性肝細胞癌と深い因果関係をもツ（Ｂ
ｅａｓｌｙ、Ｒ，Ｐ、等、Ｌａｎｃｅｔ ２ （１９８
１） １１２９〜１１３２）。
誘発しヒトの原発性肝細胞癌と深い因果関係をもツ（Ｂ
ｅａｓｌｙ、Ｒ，Ｐ、等、Ｌａｎｃｅｔ ２ （１９８
１） １１２９〜１１３２）。
ＩＩ ８ Ｖゲノムは、ヌクレオチド配列解析によって
同定された４つの読取枠（ＯＲＦ）を含み、これらは領
域ｓ、 ｃ、 ｐ及びＸと命名されている（Ｔｉｏｌｌ
ａｉｓ、Ｐ。
同定された４つの読取枠（ＯＲＦ）を含み、これらは領
域ｓ、 ｃ、 ｐ及びＸと命名されている（Ｔｉｏｌｌ
ａｉｓ、Ｐ。
等、Ｎａｔｕｒｅ ３１７ （１９８５） ４８９〜４
９５）。Ｓ領域及びＣ領域の遺伝子産物及びそれらの関
連抗体がＩＩＢＶ感染患者の血清中で検出され、 １Ｉ
ＢＶｉ染のマーカーとして使用されてきた。Ｘ遺伝子は
、推定された４つのＯＲＦうちで最小であり、１５４１
固のアミノ酸を含むポリペプチドをコードすることがで
きる。最近、ＩＩＢＶ ＤＮＡが組み込まれたヒト肝細
胞癌（Ｍｏｒｉａｒ−ｔｙ、＾１Ｍ０等、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２２７ （１９８５） ４２！Ｊ−４３３）または
二量体ＨＢＶ ＤＮＡでトランスフェクトされたヒト肝
細胞癌（Ｃｈａｎｇ、 Ｃ１等、ＥＭｆｌＯＪ、６ （
１９８７） ６７５〜６８０）の細胞系中にＸタンパク
が存在することがいくつかの系統て証明された。更に、
大腸菌中で合成されたＸ融合タンパクを使用して肝細胞
癌患者の血清中で抗Ｘ抗体が検出された（Ｋａｙ、３０
等、 ｆ＆出；Ｅｌｆａｓｓｉ、Ｅ、等、後出；Ｍｅｙ
ｅｒｓ、 Ｍ、Ｌ、等、後出：Ｐｆａｆｆ、 Ｅ、等、
後出）、シかしながら、ＩＩ Ｂ ｘ Ａ ｇまたは抗
Ｘ゛抗体の存在が肝細胞癌の増殖に関連するが否かに関
してはまだ判っていない。
９５）。Ｓ領域及びＣ領域の遺伝子産物及びそれらの関
連抗体がＩＩＢＶ感染患者の血清中で検出され、 １Ｉ
ＢＶｉ染のマーカーとして使用されてきた。Ｘ遺伝子は
、推定された４つのＯＲＦうちで最小であり、１５４１
固のアミノ酸を含むポリペプチドをコードすることがで
きる。最近、ＩＩＢＶ ＤＮＡが組み込まれたヒト肝細
胞癌（Ｍｏｒｉａｒ−ｔｙ、＾１Ｍ０等、５ｃｉｅｎｃ
ｅ ２２７ （１９８５） ４２！Ｊ−４３３）または
二量体ＨＢＶ ＤＮＡでトランスフェクトされたヒト肝
細胞癌（Ｃｈａｎｇ、 Ｃ１等、ＥＭｆｌＯＪ、６ （
１９８７） ６７５〜６８０）の細胞系中にＸタンパク
が存在することがいくつかの系統て証明された。更に、
大腸菌中で合成されたＸ融合タンパクを使用して肝細胞
癌患者の血清中で抗Ｘ抗体が検出された（Ｋａｙ、３０
等、 ｆ＆出；Ｅｌｆａｓｓｉ、Ｅ、等、後出；Ｍｅｙ
ｅｒｓ、 Ｍ、Ｌ、等、後出：Ｐｆａｆｆ、 Ｅ、等、
後出）、シかしながら、ＩＩ Ｂ ｘ Ａ ｇまたは抗
Ｘ゛抗体の存在が肝細胞癌の増殖に関連するが否かに関
してはまだ判っていない。
Ｘタンパクの役割とＩＩＢＶ感染に対するその関係とを
研究するためには、患者の標本を大量にスクリーニング
できる十分な量のＸタンパクが！ｇ・要である。今日ま
で、原核細胞及び真核細胞の双方の遺伝子の発現宿主と
して大腸菌の使用が最も普及している。この大腸菌使用
に際して、いくつかの高レベル発現プロモーター、例え
ばｌａｃ、ｔｒｐ、 ｔａｃ及びファージλＰＬプロモ
ーターが開発された（Ｙｏｕｎｇ、Ｊ、Ｆ、等、Ｐｒｏ
ｃ 、Ｎａｔ ｌ 、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、（Ｉｓ＾８０
（１９８３） ６１０５〜６１０９；Ｃｏｕｒｔｎｅ
ｙ、Ｍ、等、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ
、ＩＪｓＡ８１ （１９８４） ６６９〜６７３）。大
腸菌の単鎧ＤＮ＾バクテリオファージＭ１３は、主にヌ
クレオチド配列決定という目的のために組換えＤＮＡ技
術で広く使用されている（Ｋｉｅｎｙ、 Ｍ、Ｐ、等、
Ｇｅｎｅ ２６ （１９８３） ９１〜９９；Ｙａｎｉ
ｓｃｂ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，等、Ｇｅｎｅ ３３ （１
９８５） １０３〜１１９）。しかしながら、外来遺伝
子を発現させるためにＭ１３プロモーターを使用するこ
とを開示した従来技術はない。
研究するためには、患者の標本を大量にスクリーニング
できる十分な量のＸタンパクが！ｇ・要である。今日ま
で、原核細胞及び真核細胞の双方の遺伝子の発現宿主と
して大腸菌の使用が最も普及している。この大腸菌使用
に際して、いくつかの高レベル発現プロモーター、例え
ばｌａｃ、ｔｒｐ、 ｔａｃ及びファージλＰＬプロモ
ーターが開発された（Ｙｏｕｎｇ、Ｊ、Ｆ、等、Ｐｒｏ
ｃ 、Ｎａｔ ｌ 、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、（Ｉｓ＾８０
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、ＩＪｓＡ８１ （１９８４） ６６９〜６７３）。大
腸菌の単鎧ＤＮ＾バクテリオファージＭ１３は、主にヌ
クレオチド配列決定という目的のために組換えＤＮＡ技
術で広く使用されている（Ｋｉｅｎｙ、 Ｍ、Ｐ、等、
Ｇｅｎｅ ２６ （１９８３） ９１〜９９；Ｙａｎｉ
ｓｃｂ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ，等、Ｇｅｎｅ ３３ （１
９８５） １０３〜１１９）。しかしながら、外来遺伝
子を発現させるためにＭ１３プロモーターを使用するこ
とを開示した従来技術はない。
Ｋａｙ 、＾３等は、ｒＴｈｅ ＨＢＶ ｆｌＢｘ ｇ
ｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ｉｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ
ｓｅｒａｆｒｏｍ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎ
ｔｓ」、ＥＭＤＯＪ、４ （１９８５）１２８７〜１２
９２において、ＬａｃＺプロモーターを使用して大腸菌
中でＨＢＶＸ遺伝子が、βガラクトシダーゼの８個のア
ミノ酸とＨＢＶ Ｘ遺伝子によってコードされる１４５
個のアミノ酸とを含む融合タンパクとして発現されたこ
とを開示している。 Ｍｅｙｅｒ、Ｍ、Ｌ。
ｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ｉｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ
ｓｅｒａｆｒｏｍ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎ
ｔｓ」、ＥＭＤＯＪ、４ （１９８５）１２８７〜１２
９２において、ＬａｃＺプロモーターを使用して大腸菌
中でＨＢＶＸ遺伝子が、βガラクトシダーゼの８個のア
ミノ酸とＨＢＶ Ｘ遺伝子によってコードされる１４５
個のアミノ酸とを含む融合タンパクとして発現されたこ
とを開示している。 Ｍｅｙｅｒ、Ｍ、Ｌ。
等は、ｒｔｌｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｐｏ
ｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｘ：ｅｘ−ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉ
ｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａ−ｔｉｏｎ ｏｆ ５ｐｅｃｉｆ
ｉｃ ａｎＬｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ５ｅｒａ
ｆｒｏｍ ｈｅｐａＬｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ−
ｉｎｆｅｃｊｅｄ ｈｕｍａｎｓＪ＋Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、
５７（１９８６） １０１〜１０９において、Ｌａ
ｃＺプロモーターを使用して大腸菌中でＨＢＶ Ｘ遺伝
子が、ＩＩＢＶ Ｘ遺伝子によってコードされる１４５
個のアミノ酸とβガラクトシダーゼの８個のアミノ酸と
を含む融合タンパクとして発現されたことを開示してい
る。Ｅｌｆａｓｓｉ、Ｅ、等は、’Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓＸ ｐ
ｒｏｄｕｃｔ ｕＳｉｎｇ ａｎ ｏｐｅｎ
ｒｅａｄ：ｎＢ ｆｒａｍｅ Ｅｓｃｈｅ−ｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏ
ｒ」、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ八ｃａへ、ｓｃｉ、Ｕｓ八へ
３ （１９８６） ２２１９〜２２２２において、ｂｌ
ａプロモーターを使用して大腸菌中でＨＢＶＸ遺伝子が
、ＨＢＶ Ｘ遺伝子によってコードされる１３３個のア
ミノ酸と細菌ｏｍｐＦ及びβガラクトシダーゼ遺伝子の
部分とを含む融合タンパクとして発現されたこ′とを開
示している。Ｐｆａｆｒ、Ｅ、等は、ｒｓｙｎｔｈｅｓ
：ｓｏｆ ｔｈｅ Ｘ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉ−ｔｒｏ
ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−Ｘ ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｕｍａｎ ５ｅｒａ」、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ １５８ （１９８７） ４５６〜４６
０において、ＳＰ６プロモーターを使用して大腸菌中で
１１ｆｌＶＸ遺伝子がＭＳ−Ｘ融合タンパクとして発現
されたことを開示している。
ｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｘ：ｅｘ−ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉ
ｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａ−ｔｉｏｎ ｏｆ ５ｐｅｃｉｆ
ｉｃ ａｎＬｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ５ｅｒａ
ｆｒｏｍ ｈｅｐａＬｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ−
ｉｎｆｅｃｊｅｄ ｈｕｍａｎｓＪ＋Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、
５７（１９８６） １０１〜１０９において、Ｌａ
ｃＺプロモーターを使用して大腸菌中でＨＢＶ Ｘ遺伝
子が、ＩＩＢＶ Ｘ遺伝子によってコードされる１４５
個のアミノ酸とβガラクトシダーゼの８個のアミノ酸と
を含む融合タンパクとして発現されたことを開示してい
る。Ｅｌｆａｓｓｉ、Ｅ、等は、’Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓＸ ｐ
ｒｏｄｕｃｔ ｕＳｉｎｇ ａｎ ｏｐｅｎ
ｒｅａｄ：ｎＢ ｆｒａｍｅ Ｅｓｃｈｅ−ｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏ
ｒ」、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ八ｃａへ、ｓｃｉ、Ｕｓ八へ
３ （１９８６） ２２１９〜２２２２において、ｂｌ
ａプロモーターを使用して大腸菌中でＨＢＶＸ遺伝子が
、ＨＢＶ Ｘ遺伝子によってコードされる１３３個のア
ミノ酸と細菌ｏｍｐＦ及びβガラクトシダーゼ遺伝子の
部分とを含む融合タンパクとして発現されたこ′とを開
示している。Ｐｆａｆｒ、Ｅ、等は、ｒｓｙｎｔｈｅｓ
：ｓｏｆ ｔｈｅ Ｘ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ｈｅｐ
ａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｖｉ−ｔｒｏ
ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ−Ｘ ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎｈｕｍａｎ ５ｅｒａ」、Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ １５８ （１９８７） ４５６〜４６
０において、ＳＰ６プロモーターを使用して大腸菌中で
１１ｆｌＶＸ遺伝子がＭＳ−Ｘ融合タンパクとして発現
されたことを開示している。
本発明によれば、Ｘタンパクが、８１３の遺伝子上プロ
モーターによってコントロールされる遺伝子［の末端の
２９個のアミノ酸をもつ融合タンパクとして総細胞タン
パクの１０％〜２０％のレベルで有効に産生されること
が知見された。この発現レベルは、ＳＰ６プロモーター
（ＰｆａＨ，Ｅ笠、既出）によってコントロールされる
レベルよりやや高（、ＬｎｃＺプロモーター及びｂｌａ
プロモーター（Ｋａｙ、＾９等、既出、Ｍｅｙｅｒ、
Ｍ、Ｌ、等、既出、Ｅｌｆａｓｓｉ、Ｅ、等、既出）に
よってコントロールされるレベルよりはるかに高い。
モーターによってコントロールされる遺伝子［の末端の
２９個のアミノ酸をもつ融合タンパクとして総細胞タン
パクの１０％〜２０％のレベルで有効に産生されること
が知見された。この発現レベルは、ＳＰ６プロモーター
（ＰｆａＨ，Ｅ笠、既出）によってコントロールされる
レベルよりやや高（、ＬｎｃＺプロモーター及びｂｌａ
プロモーター（Ｋａｙ、＾９等、既出、Ｍｅｙｅｒ、
Ｍ、Ｌ、等、既出、Ｅｌｆａｓｓｉ、Ｅ、等、既出）に
よってコントロールされるレベルよりはるかに高い。
１１へ１１
本発明の目的は、遺伝子ＩＩのフラグメントと外来タン
パクをコードする配列のフラグメンｊ・とをバクテリオ
ファージＭ１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロール
下に含む発現ベクターを提供することである。本発明の
目的はまた、前記発現ベクターを使用して大腸菌中で外
来タンパクを高レベル産生ずる方法を提供することであ
る。該方法は、前記発現ベクターを大腸菌に導入し、温
度約２０℃〜４０℃の増殖培地で培養する段階を含む。
パクをコードする配列のフラグメンｊ・とをバクテリオ
ファージＭ１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロール
下に含む発現ベクターを提供することである。本発明の
目的はまた、前記発現ベクターを使用して大腸菌中で外
来タンパクを高レベル産生ずる方法を提供することであ
る。該方法は、前記発現ベクターを大腸菌に導入し、温
度約２０℃〜４０℃の増殖培地で培養する段階を含む。
領域Ｘは、Ｂ型肝炎ウィルスの４つの読取枠の１つであ
り１５４個のアミノ酸のポリペプチドをコードしている
。１４５個のアミノ酸をコードする、読取枠Ｘの主要部
を含むＩＩＢＶ ＤＮＡの５８４ｂｐのＢａｍ１ｌｌ！
ＭＩＩフラグメントをバクテリオファージ閂１３の遺伝
子上の内部のむヱ■部位に挿入する。この挿入の結果、
遺伝子１プロモーターのコン）へロール下に１７４個の
アミノ酸を含む同−読取枠（１ｎ−ｐｈａｓｅ）遺伝子
Ｌ−Ｘ融合タンパクが得られる。上記構築物ニ由来（７
） ７” ラスミドｐＨＬαＸ、５９及びｐＨＬＸ．１
２ｄを組み込んだ細胞は、大腸菌中で総細胞タンパクの
１０％〜２０％のレベルの１９−ｋＤａ融合タンパクを
過剰産生じた。融合タンパクは抗Ｘ抗体によって認識さ
れた。
り１５４個のアミノ酸のポリペプチドをコードしている
。１４５個のアミノ酸をコードする、読取枠Ｘの主要部
を含むＩＩＢＶ ＤＮＡの５８４ｂｐのＢａｍ１ｌｌ！
ＭＩＩフラグメントをバクテリオファージ閂１３の遺伝
子上の内部のむヱ■部位に挿入する。この挿入の結果、
遺伝子１プロモーターのコン）へロール下に１７４個の
アミノ酸を含む同−読取枠（１ｎ−ｐｈａｓｅ）遺伝子
Ｌ−Ｘ融合タンパクが得られる。上記構築物ニ由来（７
） ７” ラスミドｐＨＬαＸ、５９及びｐＨＬＸ．１
２ｄを組み込んだ細胞は、大腸菌中で総細胞タンパクの
１０％〜２０％のレベルの１９−ｋＤａ融合タンパクを
過剰産生じた。融合タンパクは抗Ｘ抗体によって認識さ
れた。
遺伝子１１−Ｘ融合タンパクを利用してＨＢＶ感染患者
の血清中の抗Ｘ抗体の存在をスクリーニングし、抗遺伝
子Ｌ−ｘ融合タンパク抗体を利用して１ＩＩ３Ｖ感染肝
生検中のＸ遺伝子産生物の存在を同定する。
の血清中の抗Ｘ抗体の存在をスクリーニングし、抗遺伝
子Ｌ−ｘ融合タンパク抗体を利用して１ＩＩ３Ｖ感染肝
生検中のＸ遺伝子産生物の存在を同定する。
従って本発明の目的は、遺伝子ＩＩのフラグメンｌ〜と
外来タンパクをコードする配列のフラグメントとをバク
テリオファージＭ１３の遺伝子Ｌプロモーターのコント
ロール下に含む発現ベクターを提供することである。
外来タンパクをコードする配列のフラグメントとをバク
テリオファージＭ１３の遺伝子Ｌプロモーターのコント
ロール下に含む発現ベクターを提供することである。
本発明の別の目的は、遺伝子ＩＩのフラグメントと外来
タンパクをコードする配列のフラグメントとをバクテリ
オファージＭ１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロー
ル下に含む発現ベクターを使用し、該発現ベクターを大
腸菌に導入し、温度２０℃〜４０℃の増殖培地で培養す
るステップを含むことを特徴とする大腸菌中での外来タ
ンパクの高レベル産生方法を提供することである。
タンパクをコードする配列のフラグメントとをバクテリ
オファージＭ１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロー
ル下に含む発現ベクターを使用し、該発現ベクターを大
腸菌に導入し、温度２０℃〜４０℃の増殖培地で培養す
るステップを含むことを特徴とする大腸菌中での外来タ
ンパクの高レベル産生方法を提供することである。
本発明の別の目的は、＋１ Ｂ Ｖ ｉ染患者中のｆｌ
Ｂ ｘ Ａ ｇの存在をスクリーニングするために、
本発明によって産生されたＩＩＢＶ Ｘタンパクを用い
て免疫することによって抗Ｘ抗体を提供することである
。
Ｂ ｘ Ａ ｇの存在をスクリーニングするために、
本発明によって産生されたＩＩＢＶ Ｘタンパクを用い
て免疫することによって抗Ｘ抗体を提供することである
。
本発明の上記及びその他の目的、特徴及び利点は、添付
図面に基づく本発明の好適実施例に関する以下の記載よ
り明らかにされるであろう。この記載は例示的なもので
あって限定的なものでなく、本発明の範囲は特許請求の
範囲によって定義されることを理解されたい。
図面に基づく本発明の好適実施例に関する以下の記載よ
り明らかにされるであろう。この記載は例示的なもので
あって限定的なものでなく、本発明の範囲は特許請求の
範囲によって定義されることを理解されたい。
ＬＬＬ太燵
本発明によれば、多量の外来タンパク、即ち総細胞タン
パクの１０％〜２０％の外来タンパク特にＨＢＶ Ｘタ
ンパクを合成するためにファージ８１３の遺伝子Ｌプロ
モーターを含む発現ベクターを大腸菌中で使用すること
が可能である。
パクの１０％〜２０％の外来タンパク特にＨＢＶ Ｘタ
ンパクを合成するためにファージ８１３の遺伝子Ｌプロ
モーターを含む発現ベクターを大腸菌中で使用すること
が可能である。
本発明は、遺伝子ＩＩのフラグメントと外来タンパクを
コードする配列のフラグメントとをバクテリオファージ
８１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロール下に含む
発現ベクターを提供する。
コードする配列のフラグメントとをバクテリオファージ
８１３の遺伝子Ｌプロモーターのコントロール下に含む
発現ベクターを提供する。
本発明は更に、遺伝子ＩＩのＮ末端の２９個のアミノ酸
をコードする配列と外来タンパクをコードする配列のフ
ラグメントとをバクテリオファージＭ１３の３１！（天
子Ｌプロモーターのコントロール下に含む発現ベクター
を提供する。
をコードする配列と外来タンパクをコードする配列のフ
ラグメントとをバクテリオファージＭ１３の３１！（天
子Ｌプロモーターのコントロール下に含む発現ベクター
を提供する。
本発明は更に、遺伝子ＩＩのＮ末端の２９個のアミノ酸
をコードする配列とＩＩＢＶ Ｘタンパクをコードする
配列の［Ｊａｍｔｌ Ｉ−ｊｉｚｇｊｌフラグメントと
をバクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩプロモーター
のコントロール下に含む発現ベクターを提供する。
をコードする配列とＩＩＢＶ Ｘタンパクをコードする
配列の［Ｊａｍｔｌ Ｉ−ｊｉｚｇｊｌフラグメントと
をバクテリオファージＭ１３の遺伝子ＩＩプロモーター
のコントロール下に含む発現ベクターを提供する。
本発明はまた、前記発現ベクターを使用し、該発現ベク
ターを大腸菌に導入し、温度約２０〜４０℃の増殖培地
で培養することを特徴とする大腸菌中での外来タンパク
の高レベル産生方法を提供する。
ターを大腸菌に導入し、温度約２０〜４０℃の増殖培地
で培養することを特徴とする大腸菌中での外来タンパク
の高レベル産生方法を提供する。
１つの実施態様によれば本発明は、遺伝子上のフラグメ
ントと）ＩＢＶ Ｘ遺伝子とをバクテリオファージＭ１
３の遺伝子上プロモーターのコンｌ−ロール下に含むプ
ラスミドを発現ベクターとして使用し、（ａ）ｔｌＢＶ
ＸＲ伝子のフラグメントをクローンから単離し、 （ｂ）前記（ａ）で得られたフラグメントをプラスミド
ｐＯＴＳＩＩのＢａｍ１１１部位に挿入し、（ｃ）更に
、遺伝子Ｌプロモーターを含むバクテリオファージＭ１
３に由来のＢａ＋ｎｌｌ Ｉ−ｈ又■ＤＮ＾フラグメン
トを前記（ｂ）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、（ｄ）前記
（ｃ）からＨｉｎｄＩ［Ｉ ＤＮＡフラグメントを欠
失させて前記（ａ）で得られたフラグメントを遺伝子Ｌ
プロモーターのコントロール下に含むプラスミドを作製
し、 （ｅ）前記（ｄ）で得られたプラスミドを大腸菌に導入
し、 （ｆ）前記（ｅ）で得られた大腸菌を温度約２０℃〜４
０℃の増殖培地で培養するステップ分含む大腸菌中での
ｌｌ［ｌＶＸタンパクの高レベル産生方法を提供する。
ントと）ＩＢＶ Ｘ遺伝子とをバクテリオファージＭ１
３の遺伝子上プロモーターのコンｌ−ロール下に含むプ
ラスミドを発現ベクターとして使用し、（ａ）ｔｌＢＶ
ＸＲ伝子のフラグメントをクローンから単離し、 （ｂ）前記（ａ）で得られたフラグメントをプラスミド
ｐＯＴＳＩＩのＢａｍ１１１部位に挿入し、（ｃ）更に
、遺伝子Ｌプロモーターを含むバクテリオファージＭ１
３に由来のＢａ＋ｎｌｌ Ｉ−ｈ又■ＤＮ＾フラグメン
トを前記（ｂ）のＢａｍＨＩ部位に挿入し、（ｄ）前記
（ｃ）からＨｉｎｄＩ［Ｉ ＤＮＡフラグメントを欠
失させて前記（ａ）で得られたフラグメントを遺伝子Ｌ
プロモーターのコントロール下に含むプラスミドを作製
し、 （ｅ）前記（ｄ）で得られたプラスミドを大腸菌に導入
し、 （ｆ）前記（ｅ）で得られた大腸菌を温度約２０℃〜４
０℃の増殖培地で培養するステップ分含む大腸菌中での
ｌｌ［ｌＶＸタンパクの高レベル産生方法を提供する。
発現ベクターの構築戦略を第１図に示す。第１八図にお
いて、白枠部分Ｐは、ＰＬ、 ｎｕｔＬ、ｎｕｔＲ，Ｌ
Ｒ及びｃ ［Ｒ８５（リボンーム結合部位）を含むファ
ージλ調節領域を示す。黒色部分は、ＩＩＢＶ ｘ３１
！伝子をコードする領域を示す。斑点部分は、ｌ ａｃ
Ｚα遺伝子分示す。斜線部分は、プロモーター領域とＮ
末端の２９個のアミノ酸残基をコードする配列とを含む
Ｍ１３の遺伝子り領域を示す。各構築物の主要制限部位
は、略号Ｂａ＝ Ｂａｍ１ｌ Ｉ 、ｈ−ムエｎ 、Ｅ
ｃ＝ Ｅｃ。
いて、白枠部分Ｐは、ＰＬ、 ｎｕｔＬ、ｎｕｔＲ，Ｌ
Ｒ及びｃ ［Ｒ８５（リボンーム結合部位）を含むファ
ージλ調節領域を示す。黒色部分は、ＩＩＢＶ ｘ３１
！伝子をコードする領域を示す。斑点部分は、ｌ ａｃ
Ｚα遺伝子分示す。斜線部分は、プロモーター領域とＮ
末端の２９個のアミノ酸残基をコードする配列とを含む
Ｍ１３の遺伝子り領域を示す。各構築物の主要制限部位
は、略号Ｂａ＝ Ｂａｍ１ｌ Ｉ 、ｈ−ムエｎ 、Ｅ
ｃ＝ Ｅｃ。
Ｒｌ 、 ）Ｉｄ−１！１ｎｄｌｌｌで示す。矢印は指
定制限酵素による消化を示す。矢印だけのものは関連断
片の連結を示す。第１Ｂ図は、ｐＭＬＸ 、９及びｐＭ
ＬαＸ、５９ノクロ一ニング接合配列及び翻訳開始領域
を示す、配列下方の数字はコードされたポリペプチドの
アミノ酸の個数を示す。
定制限酵素による消化を示す。矢印だけのものは関連断
片の連結を示す。第１Ｂ図は、ｐＭＬＸ 、９及びｐＭ
ＬαＸ、５９ノクロ一ニング接合配列及び翻訳開始領域
を示す、配列下方の数字はコードされたポリペプチドの
アミノ酸の個数を示す。
この実施ＲｔＭにおいては、コントロール下の外来遺伝
子を過剰発現せしめるバクテリオファージλに由来のＰ
ｔ、プロモーターとＴｏターミネータとの転写調節シグ
ナルを含むという理由で、プラスミドｐＯＴＳ１（Ｄｅ
ｖａｒｅ−Ｓ、Ｇ、等、Ｃｅ１ｌ ３６ （１９８４
） ４３〜４９）をＨＢＶ Ｘ遺伝子発現のために選択
した（Ｙｏｕｎｇ、 Ｊ、Ｅ。
子を過剰発現せしめるバクテリオファージλに由来のＰ
ｔ、プロモーターとＴｏターミネータとの転写調節シグ
ナルを含むという理由で、プラスミドｐＯＴＳ１（Ｄｅ
ｖａｒｅ−Ｓ、Ｇ、等、Ｃｅ１ｌ ３６ （１９８４
） ４３〜４９）をＨＢＶ Ｘ遺伝子発現のために選択
した（Ｙｏｕｎｇ、 Ｊ、Ｅ。
等、既出；Ｃｏｕｒｔｎｅｙ＋Ｍ等、既出、Ｆｅｒｇｕ
ｓｏｎ、Ｂ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４ （１９８４
） １３４３〜１３４６）。
ｓｏｎ、Ｂ、等、５ｃｉｅｎｃｅ ２２４ （１９８４
） １３４３〜１３４６）。
Ｘ領域をコードする配列の主要部（コドン１０〜１５４
）を含む５８４ｂｐのｂ！＋１ ■−レヱ■ＤＮ＾フラ
グメントをＨＢＶクローンｐＴＷＬ１（Ｌｅｅ、 Ｙ、
）１．Ｗ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
）を含む５８４ｂｐのｂ！＋１ ■−レヱ■ＤＮ＾フラ
グメントをＨＢＶクローンｐＴＷＬ１（Ｌｅｅ、 Ｙ、
）１．Ｗ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ｓｃｉ、Ｃｏｕｎｃ、Ｂ、ＲＯＣ９（１９８５） １１
０〜１１８；Ｌｏ、 Ｓ、Ｊ、笠、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、 １２９ （１
９８５） ７９７〜８０３）から切除し、ｐＯＴＳｌの
非反復Ｂａｍ１（Ｉ部位に挿入した。Ｘタンパクをコー
ドする配列をλＰＬプロモーターのコントロール下に含
むプラスミドを単離し、ｐＨＬＸ．９と命名した。しか
しながら、ｐＨＬＸ．９細胞中では、Ｘ遺伝子産物の１
４５個のアミノ酸を示す１６ｋＤａで測定される有意な
バンドは検出されなかった（第２図、レーン５及び６）
。
０〜１１８；Ｌｏ、 Ｓ、Ｊ、笠、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、 １２９ （１
９８５） ７９７〜８０３）から切除し、ｐＯＴＳｌの
非反復Ｂａｍ１（Ｉ部位に挿入した。Ｘタンパクをコー
ドする配列をλＰＬプロモーターのコントロール下に含
むプラスミドを単離し、ｐＨＬＸ．９と命名した。しか
しながら、ｐＨＬＸ．９細胞中では、Ｘ遺伝子産物の１
４５個のアミノ酸を示す１６ｋＤａで測定される有意な
バンドは検出されなかった（第２図、レーン５及び６）
。
１、ａ ｃ Ｚのα−ペプチド配列と転写調節エレメン
トと遺伝子りをコードする２９個のアミノ酸配列とを順
次コードするＭ１３ｍｐ１８に由来の６８３ｂｐのＢａ
ｍｔｌＩｊｌｌｌ ＤＮＡフラグメントを、ｐＭＬＸ
、９（’） Ｂａｍ１ｌ １ 部位に挿入した。得ら
れたプラスミドｐＨＬαＸ、５９は２つの新しいＯＲＦ
、即ち、λＰＬプロモーターによってコントロールされ
るＬａｃＺα−ペプチド配列（１５７個のアミノ酸残基
）と、遺伝子Ｌプロモーターによってコンｌ−ロールさ
れる遺伝子上−ｘ融合配列（１７４個のアミノ酸残基）
とを再生した。
トと遺伝子りをコードする２９個のアミノ酸配列とを順
次コードするＭ１３ｍｐ１８に由来の６８３ｂｐのＢａ
ｍｔｌＩｊｌｌｌ ＤＮＡフラグメントを、ｐＭＬＸ
、９（’） Ｂａｍ１ｌ １ 部位に挿入した。得ら
れたプラスミドｐＨＬαＸ、５９は２つの新しいＯＲＦ
、即ち、λＰＬプロモーターによってコントロールされ
るＬａｃＺα−ペプチド配列（１５７個のアミノ酸残基
）と、遺伝子Ｌプロモーターによってコンｌ−ロールさ
れる遺伝子上−ｘ融合配列（１７４個のアミノ酸残基）
とを再生した。
次に、完全λＰＬプロモーターとα−ペプチドのＮ末端
をコードする配列とを含む１．９ｋｂのｔｌｉｎｄｌＤ
Ｎ＾フラグメントをｐＭＬαｘ、５９から欠失させ、プ
ラスミドｐＨＬＸ．１２ｄを得た。
をコードする配列とを含む１．９ｋｂのｔｌｉｎｄｌＤ
Ｎ＾フラグメントをｐＭＬαｘ、５９から欠失させ、プ
ラスミドｐＨＬＸ．１２ｄを得た。
第２図のレーン３．４及び７で示すごとく、ｐＭＬαＸ
、５９及びｐＨＬＸ．１２ｄの双方が、１９ｋＤａのタ
ンパクを合成した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の相対染
色濃度から判断すると該タンパクは総細胞タンパクの１
０％〜２０％に相当する。この１９−ｋＤａポリペプチ
ド中にＸタンパクが存在することは、合成Ｘペプチドに
対する抗体を使用したイムノブロッＩ・分析（Ｍｏｒｉ
ａｒｔｙ、へ１Ｍ１等、既出）またはＭＳ２／Ｘ融合タ
ンパク（Ｐｆａｆｆ、 Ｅ、等、既出）によって確認さ
れた。
、５９及びｐＨＬＸ．１２ｄの双方が、１９ｋＤａのタ
ンパクを合成した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の相対染
色濃度から判断すると該タンパクは総細胞タンパクの１
０％〜２０％に相当する。この１９−ｋＤａポリペプチ
ド中にＸタンパクが存在することは、合成Ｘペプチドに
対する抗体を使用したイムノブロッＩ・分析（Ｍｏｒｉ
ａｒｔｙ、へ１Ｍ１等、既出）またはＭＳ２／Ｘ融合タ
ンパク（Ｐｆａｆｆ、 Ｅ、等、既出）によって確認さ
れた。
プラスミドｐＯＴＳ１、ｐＭＬαＸ、５９＊ タハｐＨ
ＬＸ．９ヲ組み込んだＮ５１５１（λｃ Ｉ Ｔａ２０
５）細胞を、２８℃で増殖させる（レーン１．３及び５
）かまたは２８℃で１晩増殖させ４２℃で１時間誘発し
た（レーン２．４及び６ ＞、 ｐＨＬＸ．１２ｄを組
み込んだ）［ｌ３１０１ｉ胞を４２℃で誘発させずに３
７℃で増殖させた。種々のプラスミドを組み込んだ細胞
の総細胞タンパクを、０．１％５ＤＳ−１５％ＰＡＧＥ
で分析し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
ＬＸ．９ヲ組み込んだＮ５１５１（λｃ Ｉ Ｔａ２０
５）細胞を、２８℃で増殖させる（レーン１．３及び５
）かまたは２８℃で１晩増殖させ４２℃で１時間誘発し
た（レーン２．４及び６ ＞、 ｐＨＬＸ．１２ｄを組
み込んだ）［ｌ３１０１ｉ胞を４２℃で誘発させずに３
７℃で増殖させた。種々のプラスミドを組み込んだ細胞
の総細胞タンパクを、０．１％５ＤＳ−１５％ＰＡＧＥ
で分析し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。
結果を第２図に示す、レーン１及び２は、プラスミドｐ
ＯＴＳ１を組み込んだ細胞の総細胞タンパクの分析を示
し、レーン３及び４はプラスミドｐＭＬαｘ、５９を組
み込んだ細胞の総細胞タンパクを示し、レーン５及び６
はプラスミドｐＭＬＬＸ、９を組み込んだ細胞の総細胞
タンパクを示し、レーン７はプラスミドｐＨＬＸ．１２
ｄを組み込んだ細胞ＨＢ １０ＩＩの総細胞タンパクを
示す。両端の数字はタンパク訃標準（ｘ １０−’）、
ホスホリラーゼ９４０００、ウシ血清アルブミン６７０
００、オバルブミン４３０００、カルボニックアンヒド
ラーゼ３００００、大豆トリプシンインヒビター２００
００、α−ラクトアルブミン１４４００を示す。
ＯＴＳ１を組み込んだ細胞の総細胞タンパクの分析を示
し、レーン３及び４はプラスミドｐＭＬαｘ、５９を組
み込んだ細胞の総細胞タンパクを示し、レーン５及び６
はプラスミドｐＭＬＬＸ、９を組み込んだ細胞の総細胞
タンパクを示し、レーン７はプラスミドｐＨＬＸ．１２
ｄを組み込んだ細胞ＨＢ １０ＩＩの総細胞タンパクを
示す。両端の数字はタンパク訃標準（ｘ １０−’）、
ホスホリラーゼ９４０００、ウシ血清アルブミン６７０
００、オバルブミン４３０００、カルボニックアンヒド
ラーゼ３００００、大豆トリプシンインヒビター２００
００、α−ラクトアルブミン１４４００を示す。
ム ンパク
アンビシリンを添加した３７℃の１００ｘＩＩのルリア
（Ｌｕｒｉａ）ブイヨンで増殖したｐＨＬＸ．１２ｄを
含むＩＩ ８１０１細胞を、まずＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００で溶菌し、ｒｓｕｒｆａｃｅＢｏｔｅｉｎｓ ｏ
ｆ Ｍ ｃｏ ｌａｓｍａ ｈ ｏ ｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ ｉｄｅｎｔｉ−ｆｉｅｄ ｆｒｏｍ
ａｎ Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ−ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ １ｉｂｒａｒＨ１Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、Ｃｏｕｎｃ、Ｂ、ＲＯＣ９（
１９８５） １１０〜１１８に開示されたＫ１１ｎｋｅ
ｒＬ、Ｍ、Ｑ等の尿素法で抽出した。最終７Ｍ尿素溶液
中のタンパクを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｕ、に、等、Ｎａｔｕｒｅ ２２７（１９７０） ６
８０〜６８５）で分離した。１９−ｋＤａの遺伝子−■
−Ｘ融合タンパクを含むゲル切片をホモジナイズし、こ
れを抗原として使用してウサギを免疫した。
（Ｌｕｒｉａ）ブイヨンで増殖したｐＨＬＸ．１２ｄを
含むＩＩ ８１０１細胞を、まずＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００で溶菌し、ｒｓｕｒｆａｃｅＢｏｔｅｉｎｓ ｏ
ｆ Ｍ ｃｏ ｌａｓｍａ ｈ ｏ ｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ ｉｄｅｎｔｉ−ｆｉｅｄ ｆｒｏｍ
ａｎ Ｅｓｃｂｅｒｉｃｌ＋ｉａ ｃｏｌｉ−ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ １ｉｂｒａｒＨ１Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、Ｃｏｕｎｃ、Ｂ、ＲＯＣ９（
１９８５） １１０〜１１８に開示されたＫ１１ｎｋｅ
ｒＬ、Ｍ、Ｑ等の尿素法で抽出した。最終７Ｍ尿素溶液
中のタンパクを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｕ、に、等、Ｎａｔｕｒｅ ２２７（１９７０） ６
８０〜６８５）で分離した。１９−ｋＤａの遺伝子−■
−Ｘ融合タンパクを含むゲル切片をホモジナイズし、こ
れを抗原として使用してウサギを免疫した。
免疫したウサギ血清の特異性を試験するために、合成Ｘ
ペプチドに対する抗体を用いたウェスターンプロット試
験を同時に行なった。これらの結果によれば第３図に示
すように、本発明の誘発抗体は抗合成Ｘ−ペプチド抗体
と同様に１９−ｋ Ｄ ａ ３ｆｉ伝子ＬＸ融合タンパ
クを認識するがその池の細菌タンパクを認識しないこと
が判明した。
ペプチドに対する抗体を用いたウェスターンプロット試
験を同時に行なった。これらの結果によれば第３図に示
すように、本発明の誘発抗体は抗合成Ｘ−ペプチド抗体
と同様に１９−ｋ Ｄ ａ ３ｆｉ伝子ＬＸ融合タンパ
クを認識するがその池の細菌タンパクを認識しないこと
が判明した。
Ｘ のイムノプロット
プラスミドｐＵｃ１９、ｐＯＴＳｌ、ｐＨＬＸ．９まり
ＬｔｐＭＬαＸ。
ＬｔｐＭＬαＸ。
５９を含むＮ５１５１（λｃ Ｉｔｓ８５７）細胞の総
細胞タンパクを、０．１％５ＤＳ−１５％Ｐ＾旺で前記
のごとく分離した。溶解したタンパクを、Ｔｏｗｂｉｎ
、ｔｌ、等（Ｐｒｏｃ 。
細胞タンパクを、０．１％５ＤＳ−１５％Ｐ＾旺で前記
のごとく分離した。溶解したタンパクを、Ｔｏｗｂｉｎ
、ｔｌ、等（Ｐｒｏｃ 。
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃ ｉ 、ＵＳＡ７６ （１９
７９） ４３５０〜４３５４）及びＧｅｒｓｈｏｎｉ
、 Ｊ、Ｍ、等（八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２４
（１９８２） ３９６〜４０５）に記載の方法で電
気泳動的にニトロセルロースシートに移し、１ ： １
０００希釈の（ａ＞ウサギコントロール血清、（ｂ）Ｍ
Ｓ２／Ｘ融合タンパクに対するウサギ抗血清、及び（ｃ
）合成Ｘペプチドに対するウサギ抗血清とハイブリダイ
ズさせた。抗原結合抗体をウサギ免疫グロブリンに対す
るペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体で検出し、複合体を３
．３°−ジアミノベンジジンで発色させた。結果を第３
図に示す。
７９） ４３５０〜４３５４）及びＧｅｒｓｈｏｎｉ
、 Ｊ、Ｍ、等（八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１２４
（１９８２） ３９６〜４０５）に記載の方法で電
気泳動的にニトロセルロースシートに移し、１ ： １
０００希釈の（ａ＞ウサギコントロール血清、（ｂ）Ｍ
Ｓ２／Ｘ融合タンパクに対するウサギ抗血清、及び（ｃ
）合成Ｘペプチドに対するウサギ抗血清とハイブリダイ
ズさせた。抗原結合抗体をウサギ免疫グロブリンに対す
るペルオキシダーゼ結合ヤギ抗体で検出し、複合体を３
．３°−ジアミノベンジジンで発色させた。結果を第３
図に示す。
レーン１はｐＵｃ１９のＸ遺伝子発現の分析を示ず。レ
ーン２及び４はｐＨＬＸ．９の分析を示す。レーン３は
ｐＭＬαＸ、５９の分析を示す。レーン５はｐＯＴＳｌ
の分析を示す。第２図に特定したタンパクＭｒ標準を右
端に示す（Ｋ＝ｋＤａ）。
ーン２及び４はｐＨＬＸ．９の分析を示す。レーン３は
ｐＭＬαＸ、５９の分析を示す。レーン５はｐＯＴＳｌ
の分析を示す。第２図に特定したタンパクＭｒ標準を右
端に示す（Ｋ＝ｋＤａ）。
ｐＨＬＸ．１２ｄを含むＨＤＩＯＩ細胞の細胞タンパク
を０．１％５ＤＳ−１５％ＰＡＧＥで分離した。１．５
０希釈の（ａ）ウサギコントロール血清、（ｂ）合成Ｘ
ペプチドに対するウサギ抗血清及び（ｃ）遺伝子１１−
Ｘ融合タンパクに対するウサギ抗血清を使用して前記同
様のウェスターンプロットを行なった。結果を第４図に
示す。
を０．１％５ＤＳ−１５％ＰＡＧＥで分離した。１．５
０希釈の（ａ）ウサギコントロール血清、（ｂ）合成Ｘ
ペプチドに対するウサギ抗血清及び（ｃ）遺伝子１１−
Ｘ融合タンパクに対するウサギ抗血清を使用して前記同
様のウェスターンプロットを行なった。結果を第４図に
示す。
レーン１は総タンパクの反応性を示す。レーン２はｐＨ
ＬＸ．１２ｃｌを含むＩＩ Ｂ １０１細胞がら７Ｍ尿
素によって抽出されたタンパクの反応性を示す。レーン
３は陰性コントロールであり、ｐＯＴＳｌを含むＮ５１
５１（λｃ Ｉ Ｔａ２０５）細胞の総タンパクの反応
性を示す。
ＬＸ．１２ｃｌを含むＩＩ Ｂ １０１細胞がら７Ｍ尿
素によって抽出されたタンパクの反応性を示す。レーン
３は陰性コントロールであり、ｐＯＴＳｌを含むＮ５１
５１（λｃ Ｉ Ｔａ２０５）細胞の総タンパクの反応
性を示す。
第２図と同じタンパクＭｒ標準が右端に示されている（
Ｋ；ｋＤａ）。
Ｋ；ｋＤａ）。
これらの結果は、Ｍ１３の遺伝子Ｌプロモーターが遺伝
子Ｌ−ｘ融合タンパクを多量に産生するための強力なプ
ロモーターとして作用し得ることを示す。我々の知る限
りこれは大腸菌中で外来遺伝子を発現させるためにＭ１
３遺伝子［プロモーターを使用した最初の成功例である
。
子Ｌ−ｘ融合タンパクを多量に産生するための強力なプ
ロモーターとして作用し得ることを示す。我々の知る限
りこれは大腸菌中で外来遺伝子を発現させるためにＭ１
３遺伝子［プロモーターを使用した最初の成功例である
。
遺１云子Ｕ−Ｘ融合タンパクは、ＩＩ Ｂ Ｖ感染患者
の血清中の抗Ｘ抗体の存在をスクリーニングするために
使用され得る。また、抗遺伝子１１−Ｘ融合タンパク抗
体は、１Ｉｒ３Ｖ感染肝生検でＸ遺伝子産物の存在を検
出し同定するために有用である。
の血清中の抗Ｘ抗体の存在をスクリーニングするために
使用され得る。また、抗遺伝子１１−Ｘ融合タンパク抗
体は、１Ｉｒ３Ｖ感染肝生検でＸ遺伝子産物の存在を検
出し同定するために有用である。
本発明を特定の実施態様に基づいて前記に説明した。し
かしながら、これらの記載の多数の変形、修正及び変更
が可能であるこことは当業者に明らかであろう。
かしながら、これらの記載の多数の変形、修正及び変更
が可能であるこことは当業者に明らかであろう。
ｐＭ［、Ｘ、１２ｄの構築戦略及び構造の説明図、第２
図は、種々のプラスミドを組み込んだ細胞の総細胞タン
パクを０．１％５ＯＳ−１５％ＰＡＧＥで分析しクーマ
シーブリリアントブルーで染色した結果得られた粒子構
造の写真、第３図は、Ｘ遺伝子発現のイムノプロット分
析の結果得られた粒子構造の写真、第４図は、組換えｐ
ＨＬＸ．１２ｄによるＸ遺伝子産物と合成Ｘベブチド及
び遺伝子１１−Ｘ融合タンパクに対する抗血清との反応
性を示す説明図（写真）である。
図は、種々のプラスミドを組み込んだ細胞の総細胞タン
パクを０．１％５ＯＳ−１５％ＰＡＧＥで分析しクーマ
シーブリリアントブルーで染色した結果得られた粒子構
造の写真、第３図は、Ｘ遺伝子発現のイムノプロット分
析の結果得られた粒子構造の写真、第４図は、組換えｐ
ＨＬＸ．１２ｄによるＸ遺伝子産物と合成Ｘベブチド及
び遺伝子１１−Ｘ融合タンパクに対する抗血清との反応
性を示す説明図（写真）である。
Claims (26)
- （１）バクテリオファージＭ１３の遺伝子￥II￥のフラ
グメントと外来タンパクをコードする配列のフラグメン
トとをバクテリオファージＭ１３の遺伝子￥II￥プロモ
ーターのコントロール下に含むことを特徴とする発現ベ
クター。 - （２）前記遺伝子￥II￥のフラグメントが、バクテリオ
ファージＭ１３の遺伝子￥II￥のＮ末端の２９個のアミ
ノ酸をコードする配列を含むことを特徴とする請求項１
に記載の発現ベクター。 - （３）前記外来タンパクが、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ
）Ｘタンパクであることを特徴とする請求項１に記載の
発現ベクター。 - （４）前記外来タンパクをコードする配列が、ＨＢＶＸ
タンパクをコードする配列の￥Ｂａｍ￥Ｈ I −￥Ｂｇ
ｌ￥IIフラグメントであることを特徴とする請求項１に
記載の発現ベクター。 - （５）バクテリオファージＭ１３の遺伝子￥II￥のＮ末
端の２９個のアミノ酸をコードする配列とＨＢＶＸタン
パクをコードする配列の￥Ｂａｍ￥Ｈ I −￥Ｂｇｌ￥
IIフラグメントとをバクテリオファージＭ１３の遺伝子
￥II￥プロモーターのコントロール下に含むことを特徴
とする請求項１に記載の発現ベクター。 - （６）プラスミドｐＭＬＸ．１２ｄであることを特徴と
する請求項５に記載の発現ベクター。 - （７）請求項１、２、３、４、５または６のいずれか一
項に記載の発現ベクターを使用し、該発現ベクターを大
腸菌に導入し、温度約２０℃〜４０℃の増殖培地で培養
することを特徴とする大腸菌中での外来タンパクの高レ
ベル産生方法。 - （８）前記外来タンパクがＨＢＶＸタンパクであること
を特徴とする請求項７に記載の方法。 - （９）前記発現ベクターを組み込んだ前記大腸菌を、ア
ンピシリンを添加した３７℃のルリアブイヨンで培養す
ることを特徴とする請求項７に記載の方法。 - （１０）産生される外来タンパクが、総細胞タンパクの
１０％〜２０％のレベルであることを特徴とする請求項
７に記載の方法。 - （１１）前記外来タンパクが遺伝子￥II￥融合タンパク
であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。 - （１２）前記遺伝子￥II￥融合タンパクが遺伝子￥II￥
−Ｘ融合タンパクであることを特徴とする請求項１１に
記載の方法。 - （１３）前記遺伝子￥II￥融合タンパクが、バクテリオ
ファージＭ１３の遺伝子￥II￥のＮ末端の２９個のアミ
ノ酸を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。 - （１４）前記遺伝子￥II￥融合タンパクが、バクテリオ
ファージＭ１３の遺伝子￥II￥のＮ末端の２９個のアミ
ノ酸を含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。 - （１５）前記遺伝子￥II￥−Ｘ融合タンパクが、遺伝子
￥II￥のＮ末端の２９個のアミノ酸及びＨＢＶＸタンパ
クの１４５個のアミノ酸を含むことを特徴とする請求項
１２に記載の方法。 - （１６）動物に抗Ｘ抗体を誘発するための請求項７に記
載の方法で産生されたＨＢＶＸタンパクの使用。 - （１７）ＨＢＶ感染患者の診断試薬としてのＨＢＶＸタ
ンパク及び請求項１６に記載の抗Ｘ抗体の使用。 - （１８）バクテリオファージＭ１３の遺伝子￥II￥のフ
ラグメントとＨＢＶＸ遺伝子とをバクテリオファージＭ
１３の遺伝子￥II￥プロモーターのコントロール下に含
むプラスミドを発現ベクターとして使用し、 （ａ）ＨＢＶＸ遺伝子のフラグメントをクローンから単
離し、 （ｂ）前記（ａ）で得られたフラグメントをプラスミド
ｐＯＴＳ１の￥Ｂａｍ￥Ｈ I 部位に挿入し、 （ｃ）更に、遺伝子￥II￥プロモーターを含むバクテリ
オファージＭ１３に由来の￥Ｂａｍ￥Ｈ I −￥Ｂｇｌ
￥IIＤＮＡフラグメントを（ｂ）の￥Ｂａｍ￥Ｈ I 部
位に挿入し、（ｄ）前記（ｃ）から￥Ｈｉｎｄ￥IIIＤ
ＮＡフラグメントを欠失させて、前記（ａ）で得られた
フラグメントを遺伝子￥II￥プロモーターのコントロー
ル下に含むプラスミドを作製し、 （ｅ）前記（ｄ）で得られたプラスミドを大腸菌に導入
し、 （ｆ）前記（ｅ）で得られた大腸菌を温度約２０℃〜４
０℃の増殖培地で培養するステップを含むことを特徴と
する大腸菌中でのＨＢＶＸタンパクの高レベル産生方法
。 - （１９）前記発現ベクターが、バクテリオファージＭ１
３の遺伝子￥II￥のＮ末端の２９個のアミノ酸をコード
する配列とＨＢＶＸ遺伝子の￥Ｂａｍ￥Ｈ I −￥Ｂｇ
ｌ￥IIフラグメントとをバクテリオファージＭ１３の遺
伝子￥II￥プロモーターのコントロール下に含むことを
特徴とする請求項１８に記載の方法。 - （２０）前記発現ベクターがプラスミドｐＨＬＸ．１２
ｄであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。 - （２１）前記発現ベクターを組み込んだ前記大腸菌を、
アンピシリンを添加した３７℃のルリアブイヨンで培養
することを特徴とする請求項１８に記載の方法。 - （２２）産生されるＨＢＶＸタンパクが、総細胞タンパ
クの１０％〜２０％のレベルであることを特徴とする請
求項１８に記載の方法。 - （２３）前記ＨＢＶＸタンパクが遺伝子￥II￥−Ｘ融合
タンパクであることを特徴とする請求項２２に記載の方
法。 - （２４）前記遺伝子￥II￥−Ｘ融合タンパクが、遺伝子
、￥II￥のＮ末端の２９個のアミノ酸とＨＢＶＸタンパ
クの１４５個のアミノ酸とを含むことを特徴とする請求
項２３に記載の方法。 - （２５）動物に抗Ｘ抗体を誘発するための請求項１８に
記載の方法で産生されたＨＢＶＸタンパクの使用。 - （２６）ＨＢＶ感染患者の診断試薬としてのＨＢＶＸタ
ンパク及び請求項２５に記載の抗Ｘ抗体の使用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63212333A JPH0260589A (ja) | 1988-08-26 | 1988-08-26 | バクテリオファージｍ１３の遺伝子□ｄ２プロモーターを使用した大腸菌中での外来タンパクの高レベル産生 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63212333A JPH0260589A (ja) | 1988-08-26 | 1988-08-26 | バクテリオファージｍ１３の遺伝子□ｄ２プロモーターを使用した大腸菌中での外来タンパクの高レベル産生 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0260589A true JPH0260589A (ja) | 1990-03-01 |
Family
ID=16620801
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63212333A Pending JPH0260589A (ja) | 1988-08-26 | 1988-08-26 | バクテリオファージｍ１３の遺伝子□ｄ２プロモーターを使用した大腸菌中での外来タンパクの高レベル産生 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0260589A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61502094A (ja) * | 1984-03-08 | 1986-09-25 | スクリツプス クリニツク アンド リサ−チ フアウンデ−シヨン | 発現マ−カ−としてのＨＢｘＡｇを含むＳＶ４０発現ベクタ− |
-
1988
- 1988-08-26 JP JP63212333A patent/JPH0260589A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61502094A (ja) * | 1984-03-08 | 1986-09-25 | スクリツプス クリニツク アンド リサ−チ フアウンデ−シヨン | 発現マ−カ−としてのＨＢｘＡｇを含むＳＶ４０発現ベクタ− |
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