JPH02501533A - ポリペプチド製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチド製造 発明の分野 本発明は、組替えＤＮＡ技術に関し、ポリペプチド、特に免疫グロブリンＦｖ断 片及びその誘導体の如き、免疫機能的免疫グロブリン断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ） の製造方法に関する。

発明の背景 最近何年か、組替えＤＮＡ技術は、広い範囲の有用な蛋白質及びポリペプチド生 成物の製造に適用されてきた。

例えば、組替えＤＮＡ遺伝子操作の技術によって、異種遺伝子で宿主細胞有機体 の形質転換を行うことができる。

次に、形質転換された宿主有機体細胞は、異種遺伝子暗号（コード）による蛋白 質又はポリペプチドを生ずることができる。そのような変性即ち形質転換された 宿主細胞は、工業的発酵技術を用いたポリペプチド又は蛋白質の大規模生産のた めの再現可能な培養源を与える。

組替えＤＮＡ技術が適用される生成物の多くは、ヒト又は動物ホルモンの如きポ リペプチドである。ポリペプチドは、比較的小さな大きさで、例えば、アミノ酸 の数が約１５０より少ない長さのものであり、例えば、メチオニンポリペプチド 生成物の如く直接発現生成物として生成物が製造される場合、わずかな濃度のポ リペプチド生成物しか宿主細胞中に蓄積しないことが判明している。

そのようなわずかな生成物の蓄積は、時間がかかり費用特表平？−５０１５３３ Ｃ２） のかかる必要な精製工程と一緒になって、商業的操作を非経済的にしている。こ の生成物の蓄積が少ないことは、少なくとも一つには、宿主細胞による異種生成 物の蛋白質分解回転によると思われる。

異種生成物の収率を増大させるために、そのような生成物は、ポリペプチド生成 物が融合して宿主有機体中に蓄積することが知られている一層大きな蛋白質へ融 合された融合蛋白質として製造されてきた。これは、正しい読取りフレーム中に 希望の生成物のための遺伝子暗号を持ち、停止コドンを介在させることなく、選 択された宿主有機体に豊富に生成することが知られている蛋白質のための遺伝子 暗号を連結することにより達成することができる。そのような豊富に生成する蛋 白質の例には、アントラニレート　シンテターゼ（Ｔｒｐ遺伝子生成物）、β− ガラクトシダーゼ（ＩａｃＺ３１！伝子生成物）、及びクロラムフェニコール　 アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）である、そのような融合蛋白質は希望の ポリペプチドを回復するためには分裂しなければならない、一般に、そのような 融合蛋白質の回収及び精製、及び融合蛋白質からの希望の生成物の回収に用いら れる手段は複雑であり、コストがかかる。更に、希望のポリペプチドを有する融 合蛋白質を形成するのに用いられる上述の蛋白質は、典型的なポリペプチド生成 物と比較して大きい、従って、希望のポリペプチドは、形質転換された宿主細胞 によって生成した融合蛋白質のほんのわずがな割合しがならず、従って、製造工 程の効率は低い、比較的小さな大きさのポリペプチドを製造するのに関し、組替 えＤＮＡ技術を使用することの限界は、特に組替えＤＮＡ技術を免疫機能的免疫 グロブリン断片、特に免疫グロブリンＦｖ断片の製造に適用する場合に感じられ てきた。

本記載の目的から、用語「免疫機能的免疫グロブリン断片」とは、対応する抗原 決定基に対する特定の結合親和性を有する免疫グロブリンを意味する。

最近、組替えＤＮＡ技術は、免疫グロブリン（Ｉｇ）生成物、即ち抗体及びその 部分の製造に適用されてきた。

例えば、完全なＨ及びＬＩｇ鎖のためのＤＮＡ配列暗号は細菌中に発現（ｅｘｐ ｒｓｓｉｏｎ）され、完全なＨ及びＬＭはインビトロで再構成され、免疫機能的 分子を与えている〔ボス及びその他、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅｒ ｃｈ　（１９８４）、　Ｖｏｌ。

１２、　Ｎｏ、９．　ｐｐ、３７９１−３８０６及びキャビンーその他、Ｐｒｏ ｃ　。

Ｎａｔｌ、＾ｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８４）、　Ｖｏ、８１．　ｐｐ 、３２７３−３２７７　）。

組替えＤＮＡ技術を１ｇ製造に適用することは工学的（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ） 　Ｉ　ｇ又はＩｇ断片を生成させる可能性を開いてきた０例えば、マウス可変部 及びヒト定常部アミノ酸配列からなる［キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ａｎｔ ｉｂｏｄｙ）」は製造されている〔欧州特許出願公開Ｅ　Ｐ　−Ａ−０１７１４ ９６、研究開発会社（日本）、欧州特許出願公開Ｅ　Ｐ　−Ａ　−０１７３４９ ４、スタッフォード大学、及び国際特許出願公開ＷＯ８６１０１５３３、セルチ ク（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ））　、また、定常部ドメインが酵素の如き異なった機能 のポリペプチドで置き換えられた「交代（ａｌｔｅｒｅｄ）抗体」も製造されて いる（ｔＥｌ際特許出願公開Ｗ０８６１０１５３３、セルチク）、更に、マウス 単クローン抗体の超可変／補足性決定部がヒト抗体の可変骨格（ｆ　ｒａｍｅｗ ｏｒｋ）部中にグラフトされている「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｓｅｄ）」抗体が製 造されている（欧州特許出願公開Ｅ　Ｐ　−Ａ−０２３９４００、ウィンター） 。

更に、Ｆａｂ”及びＦ（ａｂ’　）２　（欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１２５ ０２３、ゲネンテク）及びＦｖ（欧州特許出願公開Ｅ　Ｐ　−Ａ−０００８９９ ４、シェリング）断片を含む免疫機能的Ｉｇ断片を、組替えＤＮＡ技術により製 造することが提案されている。そのような抗体断片は潜在的治療的用途をもって いる。それらはエフェクター機能を欠いており、免疫性が低く、一層可溶性であ り、全抗体分子よりも潜在的に細胞膜を通って移動し易い、また、それらは、断 片が調製され、他の機能的ポリペプチド、例えば酵素、毒素等に、例えば遺伝子 のレベルで融合ＤＮＡ配列の発現によって融合された交代抗体分子を製造するの に用いることができる。

更に、抗体断片を製造し易いことは、種々の科学的研究を可能にする０例えば、 成る範囲の突然変異抗体断片を調製して、−次構造と結合部位特異性との間の関 係を研究及び分析することができる。また、抗体断片は抗体の構造研究のために 用いることができる。Ｆｖは全抗体分子よりも結晶し易く、従って、Ｘ線結晶学 によって構造を決定することができる。また、ＮＭＲ分析も小さな抗体断片では 一層簡呈になる。

欧州特許出願公開Ｅ　Ｐ　−Ａ−０００８９９４（シエリング社）は、免疫機能 的Ｆｖを製造するのに組替えＤＮＡ技術を用いることを提案している。この特許 出願には、予め定められたリガンドに特異的なＩｇのＬ又はＨｇの可変部即ち１ 、のための遺伝情報を与えるが、その可変部に余分なアミノＭ残基のためのヌク レオチド暗号を欠いている二重ストランドＤＮＡ配列を製造することが記載され ている。　Ｅ、　ｃｏｌｉ宿主細胞中のそのようなりＮＡ配列の発現が記載され ており、ＦｖＨ及びＬ錯生成物が溶解した宿主細胞の遠心分離後に得られた上澄 み液から分離されることが示唆されている９しかし、生成物収率の結果或は免疫 機能的Ｆｖの再構成については記載されていない。

これまで細菌でのし及びＨｇｉ可変ポリペプチドの発現を含めた組替えＤ　Ｎ　 Ａ技術を用いた免疫機能的Ｆｖの製造に成功したことを記載した文献は報告され ていない。

従って、細菌で免疫機能的Ｆｖｓを製造する問題に対する満足すべき解決法はま だ得られていないと思われる。

今度、全く思いがけず、免疫機能的Ｆｖｓの如き比較的小さなポリペプチド生成 物を、細菌宿主細胞中にそのポリペプチド生成物の遺伝子暗号を直接発現させる ことにより、満足すべき水準まで蓄積させることができることが見出された。

杢」１匹ぷり」カー 従って、第一の態様として、本発明は、細菌宿主細胞中にポリペプチドを直接発 現させることからなるポリペプチドの製造方法において、誘導発現系をプロテア ーゼ欠失細菌宿主株と組合わせて用いることを特徴とするポリペプチド製造方法 が与えられる。

本発明の方法は、一般にポリペプチドの製造に適用出来るが、特に比較的小さな ポリペプチドの製造に有利である。そのような比較的小さなポリペプチドは、通 常アミノ酸の数が約１４０より少ない長さをもち、特にアミノ酸の数が約２０〜 約６０の長さをもつことを特徴とする。

本発明の方法によって製造することができる比較的小さなポリペプチドの例には 、カルシトニン（例えば、ヒトカルシトニン、３３のアミノ酸）、カルシトニン 遺伝子関連ペプチド（例えば、ｈＣＧ　ＲＰ、３７のアミノ酸）及び表皮成長因 子（例えば、ｈＥ　Ｇ　Ｆ、３５のアミノ酸）が含まれる。他の比較的小さなポ リペプチドは、細胞表面レセプターのポリペプチド断片を含めた、比較的大きな ポリペプチド及び蛋白質のポリペプチド断片からなっていてもよい、特に、本発 明は、抗体断片、特に免疫機能的抗体断片の製造に適用することができる。

従って、第二のＢ様として、本発明は、補足可変ドメインを有するＨ及びＬ鎖ポ リペプチドの発現、好ましくは再構成からなる免疫機能的抗体断片の製造方法に おいて、誘導発現系をプロテアーゼ欠失細菌宿主株と組合わせて用いることを特 徴とする抗体断片の製造方法を与える。

本発明の方法は、一般に抗体断片の製造に適用することができるが、但しその断 片は対応する抗原決定基のための結合特異性を有するものとする。また、Ｈ及び Ｌ鎖ポリペプチドはへテロニ量体分子の会合を可能にするのに充分な異好性をも つのが好ましいことが認められるであろう、従って、本方法は（Ｆａｂ’　）２ 及びＦａｂ’抗体断片の製造に用いてもよい、抗体断片はＦｖ断片であるのが好 ましい。

抗体断片は、天然抗体断片、キメラ抗体断片（即ち抗体の一つの種及び綱から誘 導された可変ドメイン及び１、の別の種又は綱から誘導された残りの１．配列） 、交代抗体断片（即ち可変１ｇドメイン＋異なった非Ｉｇ機能例えば、酵素又は 毒素を有する付加的ポリペプチド配列）、「ヒト化」抗体断片（即ち■８配列が 、一つの種、例えば、マウスからの超可変／補足性決定部で他の種、例えばヒト の骨格部内にグラフトされたものからなる場合）、及び「工学的（ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｅｄ）抗体断片〔即ち、１．アミノ酸配列が、例えば、分子の特性例えば抗 原結合親和性又は特異性を、ロバートその他によりＮ　ａｔｕｒｅ（１９８７＞ に記載されている線に沿って変える観点から、例えば、特定部位法により自然配 列から変化されている場合〕からなっていてもよい、抗体断片は上述の種類の抗 体断片の適当な組合わせからなっていてもよい、典型的には、抗体断片は、一つ 又は二つ以上の種から誘導された実質的に完全なＨ及びＬＭ可変ドメインからな る。

抗体断片はどんな希望の抗原特異性をもっていてもよい０例えば、抗体断片は例 えば、腫瘍標識、Ｔ細胞標識等細胞特異抗原のための特異性をもっていてもよい 、或はまた断片は、治療的又は分析的関係の化合物、例えば、フィブリン又はホ ルモン等のための特異性をもっていてもよい、特に好ましいＢ様として、抗体断 片は、Ｆｖ／酵素断片、例えば、抗フィブリンＦｖ／ｗｉＩ維素溶解性酵素断片 、或は抗腫瘍Ｆｖ／酵素断片からなる。酵素断片の特異性は、自然抗体、ヒト化 抗体又は工学的抗体の特異性であってもよい。

本発明の方法で用いられる誘導発現系は、ベクターコピー数、好ましくは希望の ポリペプチド又はポリペプチドのためのＤＮＡ暗号°の発現も、温度又は代謝物 の如き外部からの影響によって誘導される系である０例えば、その発現系は英国 特許Ｇ　Ｂ　−Ｒ−１５５７７７４明細書くアルフレッド　ベンゾン　Ａ／Ｓ） に記載されている一般的種類のランナウェイ複製ベクターを含んでいてもよい、 しかし、発現系は、英国特許出願Ｇ　Ｂ　−Ａ−２１３６８１４明細書に記載さ れている種類のデユアルオリジン（ｄｕａｌ　ｏｒｉｇｉｎ）ベクターからなる のが好ましい、デユアルオリジンベクターは二つの複製系からなるベクターであ る；複製の第一オリジンは低コピー数及びベクターの安定な遺伝をもたらし、第 ニオリジンは高コピー数で、その第ニオリジンでの複製を制御する自然ベクター 順序（一種又は多種）のＤＮＡ操作による複製又は交代の結果として複製が直接 制御できる複製のオリジンである。

従って、第三の態様として、本発明は、比較的小さなポリペプチド、又はＤＮＡ Ｒ序が直接発現生成物として発現されるようなベクター内に位置する比較的小さ なポリペプチド、のためのＤＮＡ順序暗号を含む誘導細菌発現ベクターを与える 。

ベクターは、夫々実質的な完全な可変ドメインからなるＨ及びＬ鎖ポリペプチド のいずれか又は両方のためのＤＮＡ順序暗号からなるのが好ましい、最も好まし くは、Ｈ及びＬＭポリペプチドは、可変ドメインポリペプチド、即ちＶＨ及びｖ Ｌポリペプチドであり、それらは同じベクターから発現しても、しなくてもよい 、Ｈ及びＬ鎖ポリペプチドのためのＤＮＡ暗号は別々の発現系になっていてもよ い、Ｈ及びＬＭポリペプチドの両方のためのＤＮＡ暗号は、同じ発現系に含まれ 、同時に発現されるのが好ましい、特徴として、ポリペプチドは直接、即ちメチ オニン　ポリペプチドとして発現される。

ポリペプチドの発現は、適当なベクター調節により最適にすることができる。出 発コドンについてのリポソーム結合部位の長さ及び順序はポリペプチド発現のた めに最適にすることができる。また、シャインーダルガルノ配列−ＡＴＧ（ＳＤ −ＡＴＧ）距離も、発現水準を最適にするように調節することができる０例えば 、我々は、比較的長いリポソーム結合部位配列（９ヌクレオチド）はＨｆａ可変 ポリペプチドの発現の増大した水準を与えることを見出だしている。また我々は 、５より大きな、好ましくは１０〜１４のヌクレオチドの長さの５Ｄ−ＡＴＧ距 離が望ましいことを見出だしている。

本発明の方法で用いられるプロテアーゼ欠失細菌宿主株は、典型的には、構造的 にプロテアーゼ欠失であり、特に構造的にＥ、ｃｏｌｉのプロテアーゼ欠失様で ある。

我々は、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｂ宿主細胞が本発明の方法で用いるには不満足なもの であることを見出している。　Ｅ、　ｅｏｌｉＢでは、不満足な水準のポリペプ チド生成物しが宿主細胞中に蓄積しない、他のプロテアーゼ欠失様が満足すべき 水準のポリペプチド生成物を蓄積することができることは、驚くべき発見である 。

Ｅ、ｅｏｌｉＢ株は、「自然には」１ｏｎ−であり、そのようなものとしてそれ らはポリペプチド生成のための宿主株として適切であるようには見えないことは 認められるであろう、最近の研究では、Ｉｏｎ遺伝子はＥ、　ｅｏｌｉ　Ｂ株の 中に存在し、熱ストレスの如き成る条件の下で発現できることが示されている。

このように、Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｂ株は、必ずしもプロテアーゼ欠失ではなく、幾 らかのプロテアーゼ活性を維持しているのであろう。

本発明で用いられるプロテアーゼ欠失様は、Ｉｏｎ−株、又は好ましくはｈｔｐ Ｒ−株、例えば、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　ＣＡ　Ｇ４５６からなっていてもよい、特 に、多重プロテアーゼ欠失様、例えば、特にＥ　、　ｃｏｌｉ　ＣＡ　Ｇ６２９ スは同様な株の如きｈｔｐＲ−及びＩｏｎ−の両方である株を含めた、二重欠失 法が用いられる。

従って、第四の態様として、本発明は、本発明の第三の態様によるベクターで形 質転換されたプロテアーゼ欠失細菌宿主細胞を与える。

発現に続きポリペプチド生成物は回収され、更に希望に従って処理してもよい０ 発現に続き、Ｈ及びＬ鎖断片を回収し、当分野で知られた方法（例えば、ボスそ の他による上記引用文献；キャビンーその他による上記引用文献）と同じか又は それに似た方法を用いてインビトロで再構成してもよい、ポリペプチド生成物は 不溶性封入体の形で宿主細胞の中に典型的に蓄積されることが見出されている。

ポリペプチド生成物は、細胞溶解後手溶性部分の一部として回収することができ る。グアニジンＨＣ１又はリソチーム処理又はフレンチプレスを含めた適当な方 法を用いて細胞を溶解してもよい０回収後、不溶性ポリペプチド生成物は、例え ば英国特許ＧＢ−Ｂ−２１３８００４明細書に記載の如く、カオトロピック剤に よる処理及び続く透析、及び（又は）アルカリによる処理及び続く中和を含めた 当分野でよく知られた方法を用いて可溶化、変性及び復元してもよい。

好ましい態様として、同時発現されたＨ及びＬＭ断片、即ちベクターから発現さ れた断片は、インビボで再構成されることも意図されている。

本発明によれば、発現系とプロテアーゼ欠失細菌宿主細胞との組合わせが、比較 的小さなポリペプチド生成物の満足すべき水準の蓄積をもたらすことが見比され ている。

好ましくはプロテアーゼ欠失宿主細胞は、夫々実質的に完全な可変ドメインから なるＨ及びＬ鎖ポリペプチドのいずれか又は両方のためのＤＮＡ配列暗号を有す るベクターで形質転換される。一層好ましくは、Ｈ及びＬ鎖ポリペプチドは可変 ドメインポリペプチド、即ちＶＨ４及びｖＬポリペプチド（それらが同じベクタ ーから発現されようとしまいと）である。

本発明によれば、誘導発現系とプロテアーゼ欠失細菌宿主細胞との組合わせが、 免疫機能的１ｇ断片の再構成を可能にするのに充分な水準のし及びＨ鎖ポリペプ チドの蓄積をもたらすことが見出されている。

本発明を、付図に言及した次の実施例で、単に例示として更に記述する。実施例 には、組替えＨ及びＬＭ免疫グロブリン可変部ポリペプチド断片の製造が記載さ れている。しかし、本発明は、一般に比較的小さなポリペプチドの製造に広く適 用できることは認められるであろう。

図面の簡単な説明 本発明を更に、例示のため、付図に言及した次の実施例で更に記述する０図中、 第１図は全長Ｇ１００Ｇ＋２クローンからのｒＦｖ遺伝子の構成を例示している ；突然変異は二重ストランドＤＮＡ中のブラックボックスで示されている。陰を つけた領域はシグナル配列、ｖｈｇ　２を表している。Ｈ鎖は、オリゴヌクレオ チド３１塩基長さを用い、ＴＧＡ停止コドン及び３”ＥｃｏＲ１部位を創り出す ことによって２＋２塩基変化を生ずる可変部（１）の３′端で突然変異された。

ｖｈｇ２を含むＥｃｏＲ１断片は切り比され、ｐＡ　Ｔ　１５３中へサブクロー ンされた。存在する８ｇ１２−Ｐｖｕ２断片は、暗号配列及び制限部位を復元し 、Ｅ　、　ｃｏｌｉ　ｖ１ｇ２のホルミル−Ｍｅｔに暗号を与えるＡＴＧ出発コ ドンを含むリンカ−（２）で置換されている：　可変暗号配列の５′及び３′端 で３５Ｉ体及び３３Ｉ体を用いた二重ＳＤＭは、夫々８及び３＋４塩基変化を与 えている。成長ホルモンＧＨはその５’Ｂｇ１２及び３’ＥｃｏＲ１部位によっ てｐＭＧ９３９から切り出され、ｖｈｇ２又はｖ１ｇ２　Ｂ　ｇｌ　２−Ｅ　ｃ ｏＲ１断片によって置換され、夫々ｐＭＧ、ＨＦ２又はｐＭＧ、ＬＦ９を与えた 。　ｐＰＷ、ＨＦ　２は９ｂｐＳＤを含んでいるが、その他の点ではｐＭＧ、Ｈ Ｆ２と同じである；第２図は、Ｅ、ｃｏｌｉ中のｒＦｖ遺伝子の発現を例示して いる。プロテアーゼ欠失の無い細胞（Ｉ８３７３）中の生合成ラベリングによる ｖＨ及びＶＬの検出、２分間ラベルした非誘導（Ｕ）又は誘導（Ｉ）細胞の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ（１５％）オートラジオグラフ処理、ｖＬの分解は２分後でも明ら かである； 第３図は、９−ｂｐシャインーダルガルノ配列９ＳＤでｖＨの収率を増大するこ とを例示している：　（Ａ）　４ｂｐＳＤによるｐＭＧ９３９　９ＧＨＱ、ｐＭ Ｇ、ＨＦ’２から（４）、及び９ｂｐｓｄによるｐＰＷ、ＨＦ２からのインビト ロ翻訳生成物の１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥのオートラジオグラム：インビトロｐＰ Ｗ、ＨＦ２（Ｂ）から３０分間でｖＨ生成物は生じなかった、１５％５ＤＳ−Ｐ Ａゲルで電気泳動した全細胞のウェスターンプロット法による分析：　誘導後４ ．５時間でＣＡ　Ｇ　５２９で生じたｐＭＧ、ＨＦ２（４）及びｐＰＷ、ＨＦ　 ２（９）、（Ｃ）ＣＡＧ６２９中にｐＭＧ、ＨＦ２（４）及び９ＰＷ、ＨＦ２（ ９）を誘導した後、６時開後のＩ　Ａ　Ｉｏｏｎｌ１１試料のクーマシーブルー 染色１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ、（Ｄ）ｐＭＧ、ＬＦ９で形質転換したＩＡｓｏ＠ ｎ−細胞のクーマシープルー染色１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ：　Ｕ＝誘導後時間Ｏ ；　誘導後６時間：　６２９＝宿主株ＣＡＧ６２９；４５６＝宿主株ＣＡ　Ｇ４ ５６；　Ｐ　＝ｈｔｐＲ’親株、Ｓ　Ｃ１２２゜ｖＬは、ＣＡ　Ｇ　８２９で見 られた水準の半分までＣＡ　０４５６中に蓄積した； 第４図は、ヘテロ二量体ｒＦｖ複合体のデモンストレーションを例示している； ｒＦｖ含有再構成（上）及び宿主細胞再構成（下）のスペロース（Ｓ　ｕｐｅｒ ｏｓｅ）１２からＡ２．。ｎＩＩ＋溶出プロファイル（下）を、ｒＦｖ及び対照 について各フラクションについて得られたＰ　ｅｐ−１結合活性（一番上）と比 較されている：■Ｈ及びｖＬは別々に成長ホルモン（ＧＨ）及び宿主細胞（ＧＨ ）を再構成した。蛋白質濃度はｖＨ及びｖＬに関し、２のファクター内である。

マーカーの溶出位置と比較されたい；　ｂｏｖｉｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｉｎ 　（Ｂ　５Ａ）６６ｋＤａ、成長ホルモン（Ｇ　Ｈ）２２．５ｋＤ　ａ、大豆ト リプシン阻害物質（Ｓ　Ｂ　Ｔ　Ｉ　）２０．１ｋＤａ、及びチトクロムｃ（Ｃ ＹＴＣ）１２．４ｋＤａ、モノマー活性度の殆どは再構成されたｖＨに存在した ； 第５図は、ｒＦ　ｖ（Ｇ　Ｉｏｏｐ２　）の精製の最終段階を例示している；　 （Ａ　）　ｐＨ６，３４（２０−Ｍトリス）でＤＥＡＥから溶出するフラクショ ン、空腔（ＶＯＩＤ）中へ高純度で溶出するｒＦｖに続くフラクション、及び後 の洗浄（ＷＳＨ）中一層ゆっくりと溶出するフラクションの銀染色１５％５ＤＳ −ＰＡＧＥ、Ｖ、は銀染色上期るい黄色に見えたのに対し、ＶＬは暗かった。フ ラクションは、０〜０．２Ｍ塩化ナトリウム勾配で溶出し、プールしたくレーン １．２及び３で表されている）、（Ｂ）精製したｒＦｖフラクションのクーマシ ーブルー染色１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ（レーン１．２．２は洗浄からのｒＦｖと １５＋＋＋Ｍ）リスｐＨ７，５でｙ７０ｍＭＮａＣＩでＤＥＡＥから溶出したフ ラクションとの混合物である）、レーン３及び４は成分Ｈ及びＬ鎖中へ分離され た２μｇ及び５μｇの全Ｇｌｏｏｐ２を示している。ｒＦｖは同様にその成分ｖ Ｈ及びＶＬへ分離され、夫々１１．５及び９ｋＤａの見掛けのＭｒで移動した。

第６図は、精製されたｒＦｖ及びその活性度をＧｌｏｏｐ２及びＦ　ａｂ’　（ Ｇ　Ｉｏｏｐ２　）と比較して例示している；　各々の点で２度の四分割決定を 含む８つの点の平均値である。

棒は得られた最高及び最低値を示している。　Ｋｄはパラメトリック及び非パラ メトリック分析を用いたコンピュータープログラムによって得られている。示さ れたＫｄ値はこれらの数値の平均値である。ムリンＩｇＧ（シグマ−）対照はＰ 　ｅｐ　１結合を示さなかっな：　値は全ての濃度でシ１００％であった（図示 されていない）；第７図は、分別したＦ　ｖ（Ｇ　１ｏｏｐ２　）再構成を例示 している。　Ｓ　ｕｐｅｒｏｓｅ１２分別Ｆ　ｖ（Ｇ　Ｉｏｏｐ２　）再構成か らのフラクション１４及び１５（それらのフラクションはＰａｐｌ結合活性を示 している）は、ファスト（Ｐｈａｓｔ）ゲル系（Ｐ　ｈａｒ＋＊ａｃｉａ）で電 気泳動された。リソチームを用いて（Ｖｘ）、又リソチームを用いずに（Ｖ、） 調製したＦｖからのフラクション１４及び１５を、生及び還元（ｒｅｄｕｃｉｎ ｇ）の両方を用いて成長ホルモン（ＧＨ）又は細胞を含む細胞の分別再構成から の対照フラクション１４及び１５と比較した。

Ｇ１００Ｉ）２を表すバンドが明らかに生のＰＡＧＥに存在する。それは高分子 量で移動し、それが、成長ホルモンの大きさに近いがそれより小さな大きさをも つ二量体であることと一致していた＜２２．５ｋＤ　ａで）、還元５ＤＳ−ＰＡ ＧＥは、約１４ｋＤａの分子量に一致した位置で移動する特性ダブレットとして 、これらＰｅｐｌ結合フラクション中にｖＨ及びｖＬが存在することを示してい た；第８図は、Ｈ及びＬポリペプチド鎖の両方の製造を例示している；　全細胞 のクーマシーブルー染色１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥを、誘導（時間＝０）後、種々 の時間でサンプリングした。Ｂ７２．３ＶＨ及びｖＬ（ｐＭＧ、ＲＯＨ４、ｐＭ Ｇ、ＲＯＨ９、ｐＭＧ、ＲＯＬ５及びｐＭＧ、ＲＯＬｌｏ）について二つの同じ 構造体を宿主株Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＣＡＧ６２９中へ形質転換し、蛋白質合成の誘 導をしな、サンプリングの時間は、０．２．４．６及び１５時間の順序であった （ｉ＆後の過程については４時間の試料を省略した）、　ＶＨ及びＶＬは両方共 ６時間後に最大の水準へ蓄積した。

Ｇ　１ｏｏｐ　２　Ｖ　Ｈ及びＶＬがら得られた水準の間の中間で、はぼ等モル 量が合成された； 第９図は、宿主細胞の不溶性フラクション中にｖＨ及びｖＬポリペプチドが現れ ることを例示している；　細胞の不溶性フラクションを２％トリトンｘ１００（ 緩衝液）でよく洗い、７．６Ｍグアニジン緩衝液で可溶化したくキャビンーその 他、１９８４参照）、これらは、順次Ｂ　７２．３Ｖ、、ＶＬ及びＧ　１ｏｏｐ ２　Ｖ　Ｈ及びｖＬを種々の量で含むクーマシーブルー染色１５％５ＤＳ−ＰＡ ＧＥによって評価されたように、ポリペプチドｖＨ及びＶＬを含んでいる。リソ チーム８７２．３の例で、Ｂ　７２．３ＣＨよりもわずかに高い位置に移動した ；　及び 第１０図は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ中の不溶性物貰として発現した 組替えＧＩｏｏｐ２ＶＨ及びＶＬを示すクーマシーブルー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥ （１５％）を示している；ｃ　＝Ａ　＠。。細胞、ｉ＝不溶性物質、Ｓ＝可溶性 フラクション、智＝ペレット（ｉ）洗浄物からの上澄み液、Ｈ＝ＶＨ及びＬ＝Ｖ Ｌ　。

、　についての詳細ｆ口述 実施例１ 鶏卵リソチーム（ＨＥＬ）の特性化エピトープのための特異性を有する抗体のＦ ｖ断片を、Ｅ、ｃｏｌｉ中のＨ可変（ＶＨ）及びＬ可変（Ｖｔ、）ポリペプチド の発現により製造し、インビトロ再構成した。

５つのムリンモノクロナール、Ｇｌｏｏｐｌ〜５のパネルを、充分特性化したエ ピトープ、鶏卵リソチーム（ＨＥＬ）のループへ上げた（Ｍ、Ｊ、ダースリー及 びＡ、Ｒ，リース（１９８５ａ））　、　Ｇ　Ｉｏｏｐ２　（Ｉ　ｇＧ　２　ｂ 、　ｋ）のＨ及びＬｉについての遺伝子暗号をクローンし、この抗体のＨＥＬと の相互作用の性質を特定部位突然変異生成（Ｓｌ！１Ｍ）と、既知の結晶構造の 補足性決定部（ＣＤＲ）ホモロジーがら誘導されたコンピューターモデルと組合 わせた方法により分析したＣＰ、デラパズ、Ｂ、Ｊ、サトン、Ｍ、Ｊ、ダースレ イ及びＡ、Ｒ，リース、（１９８６）：　Ｓロパーツ及びＡ。

Ｒ，リース（１９８６）　、及びＳロパーツその他（１９８７）　）クローンＧ Ｉｏｏｐ２Ｈ及びＬＭ遺伝子の操作で、γ２ｂの５′末端からの二つのアミノ酸 コドンをＨ鎖可変部遺伝子（ｖｈｇ２）中に含ませた；　ｖ１ｇ２は、ＬＭ可変 部配列単独からなっていた。転写信号は、発現のために選択された親二重オリジ ンベクター（ｐＭ　Ｇ　９３９）中に存在していた。親ベクターはママリアン成 長ホルモンのための遺伝子を含み、温度誘導発現及びＰ　ｅｐ−１結合活性の再 構成のための対照として用いられた。そのベクターは９ＭＧ４１１から誘導され た（ライトその他、１９８６）。

Ｇｌｏｏｐ２遺伝子の特定部位突然変異生成はカーターその他（１９８５）の方 法により行なわれた。但し二重突然変異生成（ｖ１ｇ２）のために、２つの突然 変異性質及び選択オリゴヌクレオチドを、記載の濃度に等しい全濃度まで等モル 量で含有させた。

オリゴヌクレオチドは、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｔｅｒ− ｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ型３８１ＡＤＮＡ合成器で作られ、ロバーツ及びリー ス（１９８６）によって記載されているように精製された。

全ｖ１ｇ　２配列は、サンガーその他（１９７７）の方法を用いて確認され、ｖ ｈｇ２の配列はダイトキシ及びマクシアム及びギルバート配列により確認された 。

ｖｈｇ２の５′末端でのリンカ−挿入＜ｐＡ　Ｔ　１５３中）は、１７量体及び １３量体オリゴヌクレオチドを用い、プラント（ｂｌｕｎｔ）部位の所だけで燐 酸塩化した。オリゴヌクレオチド対ベクター断片の１００倍のモル比が用いられ た。連結反応は、マニアティスその他（１９８２）により記載された如くであっ た。リンカ−の存在は、カーターその他（１９８４）によって記載されているよ うにラジオラベルされた１７量体を用いてスクリーンされ、周囲の温度で一晩密 封袋中でプレヒブリド化を行った。非常に強い信号を示す頃には、マクシアム及 びギルバート＜１９７７）の方法により配列された。

両方のｒＦｖ遺伝子は、Ｂ　ｇ１２及びＥｃｏＲｌで切り出され、マニアティス その他（１９８２）の方法により、低溶融アガロースから精製された後、ｐＭ　 Ｇ　９３９からの同様に精製されたＢ　ｇ１２−Ｅ　ｃｏＲ１ベクタ一断片連結 され、連結は制限分析により評価された。

Ｇｌｏｏｐ２ＶＨ及びＶＬポリペプチドは、Ｅ、ｅｏｌｉのひどくプロテアーゼ 欠失した株、即ちｈｔｐＲ−１ｌｏｎ−中に直接発現された。これらのホルミル メチオニン誘導体は、ｖＨ及びＶＬの各々に対し、１１６及び１０９アミノ酸が らなっていた。Ｇｌｏｏｐ２ポリペプチドの発現は、インビボ生合成ラベリング により分析された。

Ｅ、ｅｏｌｉ株１Ｂ３７３の激しい成長で、両方のポリペプチドが精製したが、 ２分後、ｖＬだけが高水準で存在していた。クーマシー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥに よって評価して、この株または自然９，１ｏｎ−株Ｂ及びＢ　／　ｒ中にはポリ ペプチドは蓄積してぃながった（図示されていない）。

蓄積は熱シヨツク応答を欠いたＥ、ｃｏｌｉの宿主株、即ちｈｔｐＲ−株中にだ け検出された（ベーカーその他、１９８４）（第３Ｃ，Ｄ図）、この背景でＩｏ ｎ−突然変異（ＣＡ　Ｇ　６２９）は、一層蓄積を大きくシ（第３Ｄ図）、従っ て、このような宿主は製造株として用いられた。

それらの小さな大きさ及び疎水性によりｖＨ及びｖＬホルミルメチオニン誘導体 は、熱シヨツクプロテアーゼに対し、傷を受け易くする。恐らく熱シヨツク系を 活性化するストレスにより発生した細胞間信号に似ているがらである。Ｉｏｎ− により暗号を受けたＬａは、特に小さな又は異常なポリペプチドの存在でそのス カベンジャー性のためによく知られている（ワックスマン及びゴールドバーブ、 １９８２）　；　それはｈｔｐＲｉＰＪ節の下で、熱シヨツク蛋白質である（ボ ッその他、１９８４）、　ｈｔｐＲ−宿主株は、８．５ｋＤａ補足ファクターＣ ３ａ（マンデキその他、１９８６）及び７０アミノ酸スマトメジンーＣ（ブエル その他、１９８５）の如き他の小さな蛋白質のための生成物蓄積を可能にしてい る。ＭｐＲ遺伝子は、熱シヨツク応答の正の調節体にコアーＲＮＡのための３２ −ｋＤａσファクターをコード伝達し、熱シヨツクプロモーターのための特異性 を与える。

これ及び他のファクター（ジマリノ及びＷｕ、１９８７）の連続的存在は、温度 又は異常なポリペプチドであろうと（ブルドン、１９８６）、ｖＨ及びＶＬが熱 シヨツク誘導に続いて生じた時に観察される刺激に体する迅速な応答を確実にす る。プロテアーゼＴｉの補足活性（フウアングその他、１９８７）はＩｏｎ−株 中の■蓄積の欠如を説明できる。

ｖＨ発現は、一層長いシャインーダルガルノ配列によって改善される。ＶＨの製 造は、９塩基対（ｂｐ）シャインーダルガルノ配列（５’　−ＡＡＧＧＡＧＧＴ Ａ）をｔｒｐリポソーム結合部位（ベクターｐｐｗ、ＨＦ２）中へ挿入すること により２倍に増大する。インビトロ合成ラベリングによる分析は、ＣＡ　Ｇ　６ ２９中のｖＨの蓄積の増大をもたらした（第３Ｂ、及び０図）回収された発現を 示した（第３Ａ図）、ＶＬについては製造水準に大きな変化は認められなかった が、もしあったとしても発現は減少した（フィールド、１９８８）　。

長いシャインーダルガルノ配列は、一層安定な成長ホルモンの生成に効果をもた ないが、成る小さなポリペプチド（例えば、≦１４．５ｋＤ　ａ）の生成には有 用であることが判明している。別のＳＤ及びリーダー配列は、前に発現を強める ため用いられている（グリーンフィールドその他、１９８６．　サングその他、 １９８６）、　１６ＳリポソームＲＮＡオモツ塩基対ヘメツセージを与える能力 のコンピューター分析は、長いシャインーダルガルノが、元のｔｒｐプロモータ ーよりも適切なリポソームＲＮＡ配列へ一層安定な結合を確立することを示して いた。これは、メツセンジャーＲＮＡのためのリポソームの親和性が効果的な翻 訳にとって重要であることを示す他の研究と一致している（コールマンその他、 １９８５．　ヤコブその他、１９８７）。

リポソーム結合部位の二次構造の影響は遺伝子配列それ自体に依存する。従って 、ｖＬ発現（インビトロ発現は減少した）のために認められる改良の欠如は、好 ましくない二次構造がこの部分に入ることにより説明できるであろう。

遺伝子発現に与える開始後ＡＵＧ配列の影響はよく報告されるようになってきて いる（ルーマンその他、１９８７゜キルツノ−その他、１９８７）、　Ａ　Ｕ　 Ｇスタートコドン距離に対するシャインーダルガルノの操作も合成に影響を与え ることが知られている（フジサワその他、１９８５）、　Ｌかし、１４〜１２． １１又は１０の塩基対の数の減少は、ｐＭＧ。

ＨＦ２からのｖＨ生成にま著な影響はもたないが、この距離が一度５ｂｐへ減少 すると、発現は著しく低下する（フィールド、１９８８）　、コンピューターに よる研究も、ＶＬが、大きくなったメツセンジャー安定性により高水準で発現し たことを示していた：　メツセンジャーＲＮＡの３′末端での内部ホモロジーの 部分は、安定な二次構造の偏向３′→５′作用エクソリボヌクリアーゼを形成す ると仮定されている（グラス、１９８２）　、この内部ホモロジーはｖｈｇ　２ にはない（フィールド、１９８８）。

ミクロパックス　プログラムＢＥＳＴＦＩＴ及びＣＯＭＰＡＲＥを、ホモロジー の分析に用いた。ＦＯＬＤはメツセンジャーＲＮＡの二次構造を調べるのに用い た。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　１６ＳリポソームｒＥＮＡのための配列は、ＵＩＣデーターベ ースのファイルｅｃｏｔｇｉｘ、　ｓｅｑ＋から取った（ライスコンシン大学） 。

形質転換された細胞ラインは、１００μｇ、ｍｌ−’のアンピシリンを、またＣ 　Ａ　Ｇ　６２９に対しては１０μｇ、ｍｌ−’のテトラサイクリンを含むし一 ブイ、ヨンの中で一晩３０℃で成長させた。適当な薬品を含む５０＋ｓ　ＩのＬ −ブイヨンに０．０８Ａｓｏｏｎｌ＠で接種し、３０℃で成長させ、ｃａ、　２ ００ｒｐｍで振り、０．４又はｈｔｐＲ−株に対しては１．０のＡ６゜。にし、 ４５〜５０℃の水浴へ移し、４２℃フラッシュ誘導し、屡々振った０次に培養基 を３７℃で６時間まで成長させ、生成物を蓄積させた。他の体積、例えば１１又 は１０ｍ１の培養基を、同じ吸収度で接種及び誘導し、成長させた。

ｖＨ及びｖＬの両方共、宿主細胞の不溶性フラクション、封入体（ＩＢｓ）中に 見出されたくフィールド、その他、１９８Ｂ）、　ｖ、、及びＶＬのＭｒ’は同 様で、１度１４ｋＤａより少なかった。過剰の疎水性は、ホフマンその他（１９ ７３）により生成されたＦｖポリペプチドについて認められているように、この 明らかに減少したＭｒの原因であろう。

細胞抽出物の可溶性及び不溶性物質（封入体、ＩＢ）への分別は、シューメイカ ーその他（１９８５）の方法を次のように変えて用いで行なった：　細胞を１０ ０輸ＭトリスＨＣｌｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ及び２７０μｇ、ａｍｌ−’ リソチームを含む緩衝液中に溶解し、氷上５分間１．２＋ｓＭ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ をインキュベートした。ナトリウム　デオキシクロレートを記載の如く添加し、 氷上で５分間インキュベートした：　氷上５分間の最終インキュベーションは、 ０．００４μｇ、ｍｌ°’　Ｄ　Ｎ　ａｓｅ　Ｉ及び１０＋ｓＭ　Ｍ　ｇＣｌ　 ２用をいた。

ｒＦｖ及び対照の再構成及び部分的精製は、細胞溶解物からの再構成によるキャ ビンーその他（１９８４）のプロトコルに従って行うか、又はＩＢを上述の如き リソチームで細胞溶解により抽出するか、又はその他のＩＢをフレンチプレス細 胞溶解して抽出した（成長ホルモン及び宿主細胞対照の場合のソニケーション） 、操作の各段階で（グアニジン中に可溶化する前）、５０μｌ　１１００ａ　フ ェニルメチルスルホニル　フルオリド（Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　）及び３５μｍのプロ テアーゼ阻害物質混合物（１ａＭ　ＥＤＴＡ７１０μｇ。

難１−ロイブチン／−１０μｇ、＋＋＋１−’ペプスタチン／２００μｇ。

−１−１バシトラシン７１−Ｍベンザマシン−ＨＣｌ１０．１ａＭＰＭＳＦ／２ ０μｇ、＋ａｌ−’大豆トリプシン阻害物質）を添加した。ベレットを２％トリ トンＸ１００で２度、水で１度洗浄し、７．６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０＋ｓ Ｍ）リスＭＣＩｐＨ８，１輪Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　−０，１Ｍ　β）ルカブトエ タノールに溶解し、３７℃で１時間インキュベートした。

抽出物を希釈して、８Ｍグアニジン−ＨＣ−ＨＣｌ７５ＯリスＨｅ　ｌ　ｐ　Ｈ ８／　１　ｓｅ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ中４：ｌ：５０μｇ、＋＋＋Ｉ−’（７） ポテンシャルｒＦｖ含有量を与えた。成長ホルモン及び宿主細胞対照抽出物をほ ぼ同じ宿主細胞蛋白質含有量まで添加しながら、ｖＨ及びｖＬも別々に再構成し 、５０μｇ。

ｍｌ−で混合した。これらは夫々側々にキャビンーその他（１９８４）の方法に 従って再構成した。但し１ｍｌのプロテアーゼ阻害物質を最終燐酸塩緩衝塩水透 析媒体へ添加した。

全ての再構成体は、セントリコン１０（アミコン）を用いて濃縮し、スペローズ １２（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）によるファーストプロティン液体クロマトグラフ ィー（ＦＰＬＣ）を用いてゲルろ過により分裂した。

その方法は、規模を大きくし、均質への精製を行った。

２１のｖＨ培養及び０．６！のｖＬ培養を、プロテアーゼ阻害物質（上記）を含 む３０１１及び１０１１Ｉｌのリソチーム溶解緩衝液中に溶解した。溶解した細 胞を１２００ｇで１ｏ分間３０＋＋＋　１コルテツクス管で遠心分離し、次に１ ００ｍＭ）リスＨＣｌｐＨ７，５／ＳｍＭ　ＥＤＴＡ中の２％ト！Ｊ）ンＸ１０ ０で３回洗浄し、各回にプロテアーゼ阻害物質を添加した。ペレットを２０鎮１ 及び１０翰１の６Ｍグアニジン緩衝液（上述の如きもの）の中に再懸濁させた。

抽出物を、６ＭグアニジンＨＣＩ　／　５０ａ＋　Ｍ　トリＸＨＣｌｐＨ８，０ ／　５　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　／　１　ｍＭ　β−メルカプトエタノール中に 平衡させた３００餉１（１，５ｎ）セファクリルＳ−２００（Ｐ　ｈａｒｍａｃ ｉａ）カラムで分別した。ＶＨ−及びｖＬ−含有フラクションを別々にプールし た。２００μｇ、ｍｌ−’のポテンシャルｒＦｖ濃度を、６２５ｍ　ｌ尿素緩衝 液出たり１透析袋当たり３０ｓ　Ｉを用いて、上述の如く再構成した。ＹＭ５Ｍ （アミコン）を用いて限外ろ過により濃縮した後、再構成物をＰＢＳ中に平衡さ せた同じセファシルＳ−２００カラムで更に分別した。ｒＦｖフラクションをプ ールし、２（１＋＋Ｍトリスｐ８６．３４中へ透析し、同じ緩衝液で平衡させた １３ｍｌ（２０ｃｍ）　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　（Ｄ　Ｅ　−５２、ウオットマンΣカ ラム上へ導入した。ｒＦｖをボイド中に溶出した。希釈による再生のため、グア ニジン溶解物をＰＢＳ　ｐＨ７，５で５Ｍから２Ｍグアニジンへ希釈し、混合し 、次に更に０．６Ｍグアニジンへ希釈した。上述の如く透析により調製した対照 のＰ　ｅｐ−１結合を比較した。

部分的に精製した材料中のｒＦｖへテロ二重鎖の再構成を例示するため、洗浄Ｉ Ｂ又は凍結宿主細胞ベレットを可溶化し、再構成した。Ｐｅｐ−１への結合ルー プアンチゲン（及びそれへＧｌｏｏｐが上昇されていた）を含むＨＥＬ蛋白質分 解性断片を、下に記載の競争評価により試験し、推定ｒＦｖを含む再構成でのみ 見出され、同様に調製した宿主細胞、親ベクターを有する宿主細胞（組替え成長 ホルモンを発現）、又はｖＨ及びｖＬ単独（図示されていない）からなる対照に は見出されなかった。

これらの再構成体をスペロース−１２によりゲルろ過により部分的に精製した（ 第４図）、ＶＨ及びＶＬ再構成体中のＰ　ｅｐ−１結合複合体を、二量体の見掛 けのＭｒ（−２１，０００）ｓ一致した保持時間で溶出した。この位置で、Ａ２ 、。ｎｍ溶出プロファイル上のピークは、ｒＦｖ含有断片を推定するのに独特の ものであり、成長ホルモン（Ｍｒ’２２．５００）の位置に近く溶出した。　Ｍ ｒ’　＝−１２，０００モノマーと一致した保持時間で溶出するｖＨ又は■Ｌ単 独の再構成からＰｅｐｌ結合が得られた（フラクション１７中）、従って、ｖＨ 及びＶＬは単独二量体を形成せず、ｒＦｖはへテロニ量体でなければならない。

結合評価は、Ｐ　Ｂ　Ｓ　１０．０２％ナトリウム　アジド又は被覆緩衝液（０ ，０５Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸塩、ｐＨ９，６１０，０２％ナトリウム　アジ ド）中の１０μｇ、ｍｌ−’親和性精製ヤギアンチマウスＩｇＧの５０μｌ／ウ エルを、４℃で一晩又は周囲温度で４時間マイクロタイター板へ結合することか らなっていた。洗浄後、０．５（−２）μｇ、＋ａｌ−のＧｌｏｏｐ２を洗浄緩 衝液中に第二抗体層として添加し、周囲温度で４時間又は４℃で一晩インキユベ ートした。ウェルを洗浄し、試験試料を連続的に、２５μｍのＰＢＳ／アジドへ 三重に（部分的に精製したｒＦｖ／対照に対し）希釈し、又は純粋ｒＦｖ評価（ ２５１スベロース−１２フラクシヨンは二重に試験した）に対しては四重に希釈 した。洗浄緩衝液中＋　２ＳＩラベル下Ｐ　ｅｐ　ｌを５０μＩの最終体積へ添 加した。ラベル下Ｐｅｐｌだけをウェルへ添加することにより１００％の値が得 られた；　１０（ｌμｇ、ｍｌ−’　Ｇ　Ｉｏｏｐ２を熱いＰｅｐｌと共に添加 することにより非特異性結合（０％）が得られた。２３℃で一晩平衡にした後、 板を洗浄し、個々のウェルを切り取り、ＬＫＢクリニガンマー　カウンターで数 えた。結合データーのコンピューター分析は、プログラムＳ　Ａ　Ｎ　ＣＯＬ　 （Ｒリャン、１９８８）を用いた。

蛋白質濃度をＢＣＡ評価（ピアス〉を用いて決定し、純度をＢＡＣ及び秤量によ り評価し、濃度トレースをジョイスＭＫＩ［［Ｃ８二重ビーム記録マイクロ濃度 計を用いて行った。アミノ酸分析は、ピコ　タグ（Ｔ　Ｍ　）装置（ウォターズ ・アソシエーツ社）を用いて行った。

第５図に示した精製の最終工程に続きＧｌｏｏｐ２ｒＦｖをアミノ酸分析にかけ た（表１）、正しいアミノ酸組成及び９８％より大きな純度が示された。純度は 、銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。

表１ 制ｒＦｖのアミン　組 アミノ酸　理論的組成　観察された組成（アミノ　モル　ｒＦｖ１モル Ａｌａ　１８　１４．９ Ａ　ｒｇ　１３　１２．８ Ａｓｘ　９　９．０ ＊Ｃｙｃ　４　１．６ Ｇｌｘ　２５　２２．８ Ｇ　ｌｙ　１９　１７．５ Ｈｉｓ　Ｏ０，２ Ｉ　ｌｅ　９　９．４ Ｌｅｕ　２２　２３．０ ＋Ｌｙｓ　１２　１８．２ Ｍｅｔ　４　３．２ Ｐ　ｈｅ　８　１０．４ Ｐｒｏ　６　５．７ ＊　Ｓｅｒ　３２　２７．６ ＊　Ｔ　ｈｒ　２２　２０．３ Ｔｒｐ　４ ＋Ｔｙｒ　１３　１５．２ 表１＝　精製したｒＦｖのアミノ酸組成は・、ピコ　タグ分析により得られた。

得られた量の単位はｎｍｏｌｅである。

値はＡｓｘに対し標準化した。＊誤差は、酸化（決定されていない）のためにＣ ｙｓ、　Ｓ　ｅｒ、　Ｔ　ｈｒで起きることが知られている；　＋Ｔｙｒ及びＬ ｓｙはトリスのピーク（過大に評価される）によって隠されることがある：　一 層信頼性ある評価としては２％の範囲の誤差である。

ｒＦｖの抗原（Ｐｅｐｌ）結合を、Ｆ　ａｂ′（Ｇ　１ｏｏｐ２　）及び全ＭＡ Ｒのそれと比較した（第６図）、この種の実験の限界内で、Ｋｄは、全Ｇｌｏｏ ｐ２については２１ｎＭ、　Ｆａｂ′（ＧＩｏｏｐ２）については１７ｎＭ及び ｒＦ　ｖ（Ｇ　Ｉｏｏｐ２　）については９ｎＭでよく一致していた。

消衰係数、ε、は実験的に３８３００Ｍ−’ａｍ−’　（Ａ　ｚｓｏミ２６μＭ ）であることが決定され、Ｔｒｐ及びＴｙｒ消衰係数の付加によって得られた３ ５６２０の理論的値と比較された。

無変化の単クローン性抗体で観察される結合親和性を維持している生成されたｒ Ｆ　ｖ（Ｇ　１ｏｏｐ２　）は、抗原・抗体の研究で起きる問題の幾つかに対し 回答を与えるであろう、研究は、蛋白質抗原・抗体（Ｆａｂ’）共結晶の生成速 度が低いことにより妨害される。多量の抗原結合断片を入手できることにより、 物理的研究を行うことができるようになるであろう。

老じし 工　ＦｖＶＶ（−％　声％ 細胞ｖ、、　（２１１）　３５．５　１００　２ＶＬ　（１／３．５４り　４０ ．０　１００　７封入体　＞２６−３０　＞９０　７−１２Ｓ−２００７グアニ ジン　２５−４０　７５−１００　１３−３０再構成　４．８車　６３１ Ｓ−２００／Ｐ　Ｂ　Ｓ　３．８　５　４２ＤＥＡＥ　１．６　１．９　＞９８ 表２：　記載した精製プロトコル中得られたｒＦｖ又はその成分の収率を記載し た。再構成中、ＢＳＡはキャリヤーとして添加した。＊この数字は透析中の蛋白 質の損失を表している：８０％の損失はこの段階で記録された。

■Ｈ及びＶＬの活性Ｆｖへの再構成はそれ自体効果的な過程である。

■ＨとＶ［の発現レベルを、それぞれ全バクテリア蛋白の２％及び７％で評価し た。再構成用のキャブリーのプロトコール及び前記した他の分画化方法を用いて 、現する０、３１から純度９８％の０．７嗜のｒＦｖが得られた。これは出発物 質の１．９％に相当する（表２参照）。この低収量は主に再構成での蛋白ロスに よ、るものであり、ここでＶポリペ１チドの８０％以上が失なわれる。■ポリペ プチドをグアニジンからリン酸緩衝化食塩水ＤＨ７，５で簡単に希釈して行なう 再構成により、この問題は軽減された。

１（ＯＣｈＩａｎら（１９７３）は、変換ドメインの再構成は非常に効果的であ り元来の結合活性の８７％が回収されることを証明している。これは、十分に変 性したポリペプチドからＦａｂ’活性の１７％が回収されたことに匹敵する（Ｈ ａｒｂｅｒ、　１９６４　）。第２ドメインの存在により、インタードメイン相 互作用による有効な再構成が妨害される（　Ｔｓｕｎｅｎａｇａら、１９８７） 。

更に、培養液をベンチレベルで得られる細胞密度の４０倍まで工業的に培養しく 得られる０Ｄ６００ｎ■は−１，５であった）、ｖＮ及び■Ｌ発現細胞のそれぞ れ１１から１ＩＩＩｒＦｖｌｏａｙが産生されることが予想された。

Ａｉｅｒｓｈａｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの原核細胞翻訳キットを用いた 方法でｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳を次いで実施し、　Ｉ−Ｍｅｔラベル化化成物を５ ＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフイーにより分析した０分子ｍ蛋白マーカ ー＋、ｔ、Ｃ（Ａｍｅｒｓｈａｓ）でラベル化するか又はあらかじめ染色した（ Ｑ　ｉ　ｂｃｏ−ＢＲＬ）。

ウェスタンブロッティング実験で、蛋白を６０Ｖで３時間又は３０Ｖで１晩１０ −１５％ＰＡゲルカ翫ら移し、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　（１９８１）の変法を用いて フィルターをプローブした。この変法は次の点が変更されたものである。

ゲルと０．１μ園ポアサイズのニトロセルロース（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５Ｃ ｈＶｅｌ＋　）を含むホワットマン３ＭＭの２つからプロットサンドイッチを作 成した。電極液番よ、２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩、１９２鵬Ｍグリシン及び２０％ メタノールを含んでいた。０．９％食塩水、２０ａＭＴｒｉｓ　ｐＨ７、６，０ ，０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００及び０．５％力ゼインハマーステイン（Ｂ ＤＨ）でブロックし、室温で１時間で４回実流した。１−のブロッキングバッフ ァー中に広げることによって抗■Ｉ＋又はＶＬ血清（下記）を適用し、加湿チャ ンバー中で空温で１時間インキュベートした。カゼインを含まないバッファーで ４回洗浄し、抗血清の場合と同様にして２−４μＣｉ　１−ラベル化ブ０ティン Ａを加えた。空温で１時間インキュベーション後、１　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃｊ！　、 　２０　ｉＭ　Ｔｒｉｓ　ｐ）１７．６及び０．４％Ｎ−ラウロイルザルコシン を含む高温洗浄バッファーでＶ温で４回洗浄し、風乾し、次もＸでオートラジオ グラフィーに付した。

ラビット抗血清をｙ４整するために、Ｃ末端で■■又はＶ［と融合したクロラム フェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をＥ、ｃｏｌｉ中にて産生 せしめた。ベクターｐＣ”ｒ２０２を用いて、ＣＡ　Ｔ−Ｖ。及びＣＡＴ−■、 を発現するベクターを構築した。両者の組換え体について不溶性物質を調整し、 Ｂ１０ｔｒａｐ系（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｖｅｌ！　）を用いた分離用 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（クーマシー染色とともに又はなしで）に付した後、電気溶 出させた。ＰＢＳに対して透析後、蛋白濃度を評価し、以下の方法により注射し た。完全フロインドアジュバント１ｄ中の一６０μ９を背と首すじに皮肉注射し 、１６日後に不完全フロインドアジュバント０、８ｄ中の１３０μ９を腰部に筋 肉注射し、３８時間後にＰＢＳ中の５０μ９を腰部と首すじに注射し、次の日に ＰＢＳ中の２００μ９を耳の静脈中に注射した。１週間後に、耳の静脈から採血 した。

加熱ショックプロテアーゼ欠損宿主株及び誘導ベクターを用いてＥ、ｃｏｌｉ中 で直接ポリペプチドを発現させる方法が、他の関係のないｒｌ”ｖの産生には有 効であった。

例　２ 胸カルシノーマ抗原のカーポハイドレートエピトープ（Ｃｏ１ｃｈｅｒら、１９ ８１）に対して特異性を示す抗体のＦＶフラグメントを、Ｅ、ｃｏｌｉ中にて重 鎮変換ポリペプチド（■　）及び軽鎖変換ポリペプチド（■、）を発現せしめる ことにより作成し、Ｇｌｏｏｐ２Ｆｙと同様にしてｉｎ　ＶｉｔｒＯ再構成を行 なった。

このムリンモノクローナル抗体は、ｉｓ治療に適用可能である。ヒトの系でのそ の抗原性を減じるために、キメラ体が作成された（ｉＪｈｉｔｔｌｅら、１９８ ７）。遺伝子工学的方法により、ヒトの定常領域上に変換領域を設けた。結合活 性が保持されることにより、変換領域（又はＦ、）結合性の独立性が［された。

■　及び■、遺伝子を、ＡＴＧ　（ホルミルメチオニン）！１ スター・トコトン及びストップコドンを挿入することにより、あらかじめクロー ン化した完全な（しかし再７レンジされていない−Ｗｈｉｔｔｌｅら、前述）重 鎮及び軽鎖遺伝子から構築した。３’Ｂｇ１２及′Ｃｊ５′　ＥＣｏＲｌ部位も 設けた。全ＦＶ配列がこれらの２つの遺伝子中に含まれ、発瑣ベクターに適合性 を有する制限酵素部位によってかこまれるように構築した。

Ｇ　ｌ　ｏ　ｏ　ｌ）　２　Ｖ　Ｈ遺伝子構築と同様にしてリンカ−を挿入する ことにより５′末端を作成した。ベクターｐＭＧ９３９に挿入後、２本鎖プラス ミドをジデオキシ法により配列決定することにより、リンカ−領域の配列を確認 した。

前記の例で記載したベクターｐＭＧ９３９の成長ホルモン遺伝子を除き、８７２ ．３発現用のＶ）ｌ又は■、遺仏子を挿入し、プラスミドｐＭＧ、ＲＯＨ４／９ 及びｐＭＧ、ＲＯＬ５／１０を形成せしめた。

上記の二重オリジンベクターを用いて、１０テア一ゼ欠損株Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＡ Ｇ６２９　（ｈｔＤ　Ｒ−及びＩｏｎ　−）中にて重鎮及び軽鎖ポリペプチド（ それぞれ、１２０アミノ酸及び１０９アミノ酸）を産生せしめた。この両者のポ リペプチドは、宿主細胞の不溶性画分中に現われたく第９図）。

結　論 スモールサイズのｒＦｖを用いることにより、物理的方法による抗体結合部位の 研究が簡単になる。Ｘ線結晶学については、スウィッチサイトアングル（変換ド メインと定常ドメインとの間）を測定する必要はなく、コンピータ−処理時間が 減少し、ｒＦｖ間の３次元構造の類似性により、新たなｒＦｖ結晶のデータ評価 が迅速に行ない得る。更には、全てのＦａｂが結晶化するわけではなく　（Ｄａ Ｖ＋ｅＳとＨｅｔｚａｅｒ、’１９８３　）　、また、フレキシブルニルボウベ ンドを欠いたｒＦｖはより容易に結晶化する可能性がある。■ｏと■、とび別々 に産生される可能性があるために、ＮＭＲスペクトルによる完全なアサインメン トが可能であり、またインタードメインの相互作用の評価も可能である。

Ｅ、ＣＯ１＋はその生成物をグリコジル化しない。イムノグロブリンの変換ドメ インはｉｎ　ｖｉｖｏにおいて非化学Φ論的にグリコジル化されるが、カーボハ イドレートは通常は抗原結合に関与せず（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ら、１９８５） 、またカーボハイドレートが存在しない場合にはＩｇＧ２ｂ機能を示さない（Ｎ ｏ５ｅと一１ｏｚｅｌｌ、１９８３）。

変換ドメインベアーの性質が保有されることがら（Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８５ ）、カオトロピックバッファー中でのｒｌ”ｖ結合の再構成法はいずれのｒｌ” ｖにも適用することができる。ここに記載した方法は、抗原結合の研究に適用す ることができる。■ポリペプチド発現のための高収量でかつ細胞質的ルートは、 イムノトキシン構築物の開発又は低抗原性の治療用キメラ試薬の開発に極めて有 用である。

象！ ５ａｓｔｅｒ、Ｔ、Ａ、、ＧｒＯ３ＳＩｌａｎ、Ａ、Ｄ、ａｎｄ　ｃｒｏｓｓ、 Ｃ，Ａ、（１９８４）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１． 　６７７９−６７８３゜Ｂｏｓｓ、Ｈ，Ａ、Ｋｅｎｔｅｎ、Ｊ、Ｈ，、Ｃ，Ｒ， ＆　Ｅｉｔａｇｅ、Ｓ、Ｊ。

（１９８４）　Ｈｕｃｌｅｉｃ　ＡＣ，Ｒｅｓ、１２．　３７９１−３８０６゜ Ｂｕｅｌｌ、　Ｇ、、　５ｃｈｕｌｚ、Ｈ−Ｆ　５ｅｌＺｅｒ　、Ｇ、、　Ｃｈ ｏｌｌｅｔ、　Ａ、。

Ｈｏｖｖａ、Ｎ、Ｒ，、Ｓｅｍｏｎ、Ｄ、、Ｅｓｃａｎｅｚ、Ｓ、、Ｋａｗａｓ ｈｉｍａ、Ｅ。

（１９８５）　Ｈｕｃｌｅｉｃ　ＡＣ，Ｒｅｓ、１３．　１９２３−１９３８． 　Ｂｕｒｄｏｎ、Ｒ。

Ｈ，（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２４０．　３１３−３２４゜Ｂｕｒｎ ｅｔｔｅ、　Ｗ、Ｎ、（１９８１）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１２．　１ ９５−２０３、Ｃａｂｉｌｌｙ、Ｓ、　Ｒｉｇｇｓ、　Ａ、Ｄ、、Ｐａｎｄｅ、 　Ｈ，，５ｈｉｖｅｌｙ、　Ｊ、Ｅ、。

Ｈｏ１ｉｅｓ、　Ｗ、Ｅ、、Ｒｅｙ、　Ｈ，、Ｐｅｒｒｙ、　’Ｌ、Ｊ、、　Ｗ ｅｔｚｅｌ　Ｒ，＆Ｈｅｙｎｅｋｅｒ、Ｈ，Ｌ、（１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８１．３２７３−３２７７゜ Ｃａｒｔｅｒ、　Ｐ、、　Ｂｅｄｏｕｅｌｌｅ、　Ｈ，＆　Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ 、（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡＣ，Ｒｅｓ、１３．　４４３１−４４４２゜ Ｃａｒｔｅｒ、Ｐ、Ｊ、、　Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、、　Ｗｉｌｋｉｎｓｏ、　Ａ、 Ｊ、＆　Ｆｅｒｓｈｔ。

（１９８４）　Ｃｅ１ｌ　３８．　８３５−８４０゜Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ，、Ｈ ｏｖｏｔｎｙ、Ｊ、、Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ、Ｒ，＆にａｒｐｌｕｓ、Ｈ，（１ ９８５）　Ｊ、Ｈｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８６．　６５１−６６３゜Ｃｏ１ｃｈｅ ｒ、Ｄ、、Ｈａｎｄ、Ｐ、Ｈ，、Ｎｕｔｉ、Ｈ，、Ｓｃｈ’ｌｏ（Ｊ。

（１９８１）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８．　３１ ９９−３２０３゜Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｊ、、Ｉｎｏｕｙｅ、Ｈ，＆　Ｎａｋａｇ＋ ｕｒａ、に、（１９８５）　Ｊ。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８１．　１３９−１４３゜Ｄａｒｓｌｅｙ、Ｈ，Ｊ、＆　 Ｒｅｅｓ、Ａ、Ｒ，（１９８５ａ）　ＥＨＢＯＪ、４．　３８３−３９２゜ Ｄａｒｓｌｅｙ、Ｍｌ、＆　Ｒｅｅｓ、Ａ、Ｒ，（１９８５ｂ）　ＥＨＢＯＪ、 ４．　３９３−３９８゜ Ｄａｖｉｅｓ、Ｄ、Ｒ，＆　Ｈｅｔｚｇｅｒ、Ｈ，（１９８３）　Ａｎｎ、Ｒｅ ｖ。

Ｌｍｉｕｎｏｌ。１．　８７−１１８゜ｄｅ　ｌａ　ｐａｚ、ｐ、＋　５ｕｔｔ ｏｎ、Ｂ、Ｊ、、Ｄａｒｓｌｅｙ、１４．Ｊ、＆Ｒｅｅｓ、Ａ、Ｒ，（１９８６ ）　ＥＨＢＯＪ、Ｓ、４１５−４２５゜Ｆｉｅｌｄ、　Ｈ（１９８８）　Ｄ、Ｐ ｈ１ｌ　ｔｈｅｓｉｓ、　０ｘｆｏｒｄ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

ｔｌ、　Ｋ。

Ｆｉｅｌｄ、Ｈ，、Ｙａｒｒａｎｔｏｎ、Ｇ、Ｔ、Ｒｅｅｓ、Ａ、Ｒ，（１９８ ８）　Ｉｎ”Ｖａｃｃｉｎｅｓ　’８８’　”、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ｐａｏｅｓ　２９−３４゜ Ｆｕｊｉｓａｗａ、Ｙ、、Ｉｔｏ、Ｙ、、Ｉｋｅｙａｍａ、Ｓ、＆　Ｋｉｋｕｃ ｈｉ、Ｈ。

（１９８５）　ｇａｎｅ　４０．　２３−２９゜Ｇｌａｓｓ、Ｒ，Ｅ、（１９８ ２）ａｅｎｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ａｎｄ　１ｔｓｈｅｒｉｔａ ｂｌｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ、Ｃｒｏｏｎ　ｈｅｌｍ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＤＤ、５８ −７０゜Ｇｏｆｆ、Ｓ、Ａ、、Ｃａ５ｓｏｎ、Ｌ、Ｐ、＆　Ｇｏｌｄｂｅｒｏ。

Ａ、Ｌ、（１９８４）ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１． 　６６４７−６６５１、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、Ｌ、、ロｏｖｅｙ、Ｈ，Ｆ、、 　Ｌａｗｙｅｒ、Ｆ、Ｃ，＆Ｇｅ１ｆａｎｄ、Ｄ、Ｈ，（１９８６）Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４．１００６−１０１１゜Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ａ、Ｄ、、 Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ、ＪＪ、Ｇｒｏｓｓ、Ｃ，＾、（１９８４）Ｃｅｌｌ　３８， ３８３−３９０゜ Ｈａｂｅｒ、Ｅ、（１９６４）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ＾ ５２゜１０９９−１１０６　Ｈｃｎｄｅｒｓｈｏｔ、Ｌ、、Ｒｏｌｅ、Ｄ、ａｎ ｄ　Ｋｅａｒｎｅｙ。

Ｊ、Ｆ、　（１９８７）　ｌｓａｕｎｏｔｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　ａ、１１１−１ １４゜Ｈｏｃｈｉａｎ、Ｊ、、Ｉｎｂａｒ、Ｄ、＆　Ｇｉｖｏｌ、Ｄ、（１９７ ３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１２．１１３０−１１３５゜Ｈｗａｎｇ、Ｂ、 Ｊ、、Ｐａｒｋ、ＬＪ、、Ｃｈｕｎｇ、Ｃ，）１．　＆　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ。

Ａ、Ｌ、（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４． ５５５０−５５５４゜ Ｊａｃｏｂ、Ｗ、Ｆ、、５ａｎｔｅｒ、Ｈ，＆　Ｄａｈｌｂｅｒｏ、Ａ、Ｅ、（ １９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４．４７５７− ４７６１゜にｅｎｔｅｎ　Ｊ、、Ｈｅ１ｎ、Ｂ、、ｌ５ｈｉｚａｋａ、Ｔ、、Ｃ ａｔｔｉｎｉ、Ｐ、＆Ｇｏｕｌｄ、Ｉ１．（１９８４）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１゜２９５５−２９５９゜ Ｋｌａｕｓｎｅｒ、Ａ、（１９８６）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４．　 １０４１−１０４３゜にｏｌｔｕｎｏ、Ａ、Ｈ，Ｇｒｃｇｇ、に、＆　Ｒｏｇｅ ｒｓ、Ｇ、Ｅ、（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡＣ，Ｒｅｓ、１５．７７９５− ７８０８゜Ｌｏｏｍａｎ、Ａ、Ｃ，、Ｂｏｄｌａｅｎｄｅｒ、Ｊ、、Ｃｏｒｎｓ ｔｏｃｋ、Ｌ、Ｊ、。

Ｅａｔｏｎ、Ｄ、、Ｊｈｕｒａｎｉ、Ｐ、、ｄｅ　Ｂｏｅｒ、Ｈ，Ａ、＆　ｖａ ｎＫｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、Ｐ、Ｈ，（１９８７）Ｅ）ＩＢＯＪ、６．　２４８ ９−２４９２゜Ｈａｎｄｅｃｋｉ、−、、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｂ、Ｓ、、Ｈｏ１ｌｉ ｓｏｎ、Ｋ、）１．。

Ｃａｒｔｅｒ、Ｇ、１４．　＆　Ｆｏｘ、Ｊ、Ｌ、（１９８６）　Ｇｅｎｅ　４ ３．　１３１−１３８゜Ｈａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、＆ 　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、（１９８２）Ｈｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮｅｗＹ ｏｒｋ。

Ｈａｘａ（Ａ、Ｈ，＆　Ｇ１１ｂｅｒｔ、Ｉｐ４．　（１９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４，５６０−６５４゜Ｎｏ５ｅ、　Ｈ，＆　Ｗｉｇｚｅｌｌ 、　ｈ、（１９８３）　Ｐｒｏｃ、　Ｈｅ口、　ＡＣａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．　６６３２−６６３６゜Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｓ、、Ｃｈｅ ｅｔｈａｍ、Ｊ、Ｃ，＆　Ｒｅｅｓ、Ａ、Ｒ，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌ ｏｎｄ、）　３２８．　７３１−７３４゜Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｓ、＆　Ｒｅｅｓ、 Ａ、Ｒ，（１９８６）ＰｒｏｔｅｉｎＥｒ＋ｇｉｎｅｅｒｉｎｏ　１．　５９− ６５゜Ｒｙａｎ、Ｒ，（１９８８）Ｄ、Ｐｈ１ｌ　ｔｈｅｓｉｓ、０ｘｆｏｒｄ 　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。

Ｕ、Ｋ。

Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、＆　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，（１ ９８７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．５４６３−５ ４６７゜Ｓｃｈｏｅｍａｋｅｒ、Ｊ、Ｈ，、Ｂｒａｓｎｅｔｔ、Ａ、Ｈ，＆　Ｈ ａｒｓｔｏｎ、Ｆ、Ａ、Ｏ。

（１９８５）ＥＨＢＯＪ、４　７７５−７８０゜Ｓｅｎ、Ｊ、ａｎｄ　Ｂｅｙｃ ｈｏｋ、Ｓ、（１９８６）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｆｕｎｃｔ ｉｏｎ　＆　ｇｅｎｅＮｃｓ　１．　２５６−２６２゜５ｈａｒｏｎ、Ｊ、＆　 Ｇｉｖｏｌ、、Ｄ、（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５゜１５９１− １５９４゜ Ｓｕｎｇ、Ｗ、Ｌ、、Ｙａｏ、Ｆ−Ｌ、、２ａｈａｂ、Ｄ、Ｈ，＆　Ｎａｒａｎ ｇ、Ｓ、八。

（１９８６）　Ｐｒｏｃ、　Ｈｅ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３゜ ５６１−５６５゜Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｔ、、　Ｈｉｚｕｏｃｈｉ、　Ｔ、、 Ｂｅａｌｅ、　Ｈ，、Ｄｗｅｋ。

Ｒ，Ａ、、Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ、Ｔ、Ｗ、ａｎｄ　にｏｂａｔａ、Ａ、（１９ ８５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４，５５５１−５５５７゜Ｔｓｕｎｅｎａ ｇａ、）Ｉ、＋　ｃｏｔｏ、Ｙ、＋　にａｗａｔａ、Ｙ、、Ｈａｍａｇｕｃｈｉ 、に。

（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６．　６０４４−６０５１゜Ｖｅｒ ｈｏｅｙｅｎ、Ｈ，ａｎｄ　Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、Ｌ、（１９８８）Ｂｉｏｅｓ ｓａｙｓ８、　７４−７８゜ Ｗａｘｍａｎ、Ｌ、＆　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、Ａ、Ｌ、（１９８２）Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９．４８８３−４８８７゜Ｗｈｉｔｔｌｅ、Ｎ、 、Ａｄａｉｒ、Ｊ、、Ｌｌｏｙｄ、Ｃ，、Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｌ、。

ＤｅＶｉｎ１３．　Ｊ、、　５ＣｈｌＯ１ｌ、　Ｊ、、　Ｒａｕｂｉｔｓｃｈｅ ｋ、　Ａ、、　Ｃｏ１ｃｈｅｒ。

Ｄ、、Ｂａｄｇｌｅｒ、Ｈ（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ ｇ　１，４９９−５０５゜ Ｗｒｉｇｎｔ、Ｅ、Ｈ，、Ｈｕｎｐｈｒｅｙｓ、Ｇ、Ｏ，＆　Ｙａｒｒａｎｔｏ ｎ　Ｇ、Ｔ（１９８６）　ｇｅｎｅ　４９．　３１１−３２１．　２ｉｍａｒｉ ｎｏ、Ｖ、＆　ｊｈ＋、Ｃ。

（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌａｎｄ、）３２７，７２７−７３０゜浄書（内 容に変更なし） ＦＩＧ、２ 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） Ｌｏｇ、、ｊｆｆｉ／ｌｏｇｌＯＭ Ａ　ｌ１ｗｘｓａ 浄書（内容に変更なＬ） 浄書（内容に変更なし） よ 手　続　補　正　書坊式） １−事件の表示 ＰＣ丁１０Ｂ８ｇ１００７４７ ２−発明の名称 ポリペプチド製造 氏名（名称） セルチック　リミテッド ４−代理人 ５−ネ甫正命令の日１寸　平成２年　１月３０日６−−ｐＨｌ正により増加する 請求項の数７−補正の対象 口面の翻訳文　ｃＪ」、φ−Ｊ５／り 代理権を証明する書面 国際調査報告 ｗ＊ｍａ＋＃＋ｕ　ｉｌ＃ｕｔａ１４Ｎ　ｂＬ　Ｐ’：’Ｔ　？Ｅ　ε８Ｊｏこ ７４７国際調査報告 Ｔｈｅ＝；＝ｍ＋ｖａｒｅａｇ’ｅ＊ｎす、：：：７．ｂｗｔ：：ｒｎニジ：＋ ！、：ｍ、；フ＝７：コフ７ｄ、ｉ１ｍｍｂｍ＋−＊ｗａ＋＝{ｆｆｌ’ＳＩｎ ＋ｔｍＩ＃ａｒｆｉｒｑ＊ｆＬ丁１ｗｋ中ａａＦａｔｅｓＯＩＴｌｃｔＩＥＴｏ ａｓ＋ａｌｋａｍｌｅｈｒｋｐａｒｔ＋ａ＋ｌｘ＋ｍｍ：ｐ＊慴１ｗｍｐｍ４ｅ ＋ｍｄｉ＋狽P６ｆｆｉｓｌｌｆｉ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．細菌宿主細胞中のポリペプチドの直接発現からなるポリペプチドの製造方法 において、誘導発現系をプロテアーゼ欠失細菌宿主株と組合わせて用いることを 特徴とするポリペプチドの製造方法。
2. ２．アミノ酸の数が１４０より少ない長さのポリペプチドが製造される請求項１ に記載の方法。
3. ３．免疫機能的抗体断片が製造され、補足可変ドメインを有するＨ及びＬ鎖ポリ ペプチドの発現を含む請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．抗体断片がＦｖ断片である請求項３に記載の方法。
5. ５．プロテアーゼ欠失細菌宿主株がＥ．ｃｏＬｉである請求項１〜４のいずれか １項に記載の方法。
6. ６．プロテアーゼ欠失細菌宿主株がｌｏｎ−株である請求項５に記載の方法。
7. ７．プロテアーゼ欠失細菌宿主株がｈｐｔＲ−株である請求項５に記載の方法。
8. ８．プロテアーゼ欠失細菌宿主株が多重プロテアーゼ欠失である請求項５に記載 の方法。
9. ９．ポリペプチドが直接発現生成物として発現される請求項１〜８のいずれか１ 項に記載の方法。
10. １０．比較的小さなポリペプチド、又はＤＮＡ配列が、それが直接発現生成物と して発現するようにベクター内に位置している比較的小さなポリペプチドのため のＤＮＡ配列コードを含む誘導細菌発現ベクター。
11. １１．ＤＮＡ配列コードがアミノ酸の数が１４０より少ない長さのポリペプチド のためのコードである請求項１０に記載のベクター。
12. １２．ＤＮＡ配列コードが実質的に完全なドメインを有するＨ及びＬ鎖ポリペプ チドのためのコードである請求項１０又は１１に記載のベクター。
13. １３．請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の発現ベクターで形質転換された プロテアーゼ欠失細菌宿主細胞。