JPH02501530A - 新規なバチルス・スリンギエンシス菌株、それらの分離方法および関連する組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

２、発明の背景　３ ２、　１　商用農薬ニ一般の考察　３ ２．２　生物学的農薬　４ ３、発明の要約　５ ４、図面の簡単な説明 ５、発明の説明　７ よび接合　９ ５．２　ＨＤ−１変異型の分離　１１ ５．３　ＨＤ２６９−２　（ＥＧ２０６９）の分離　１３５．４　ＨＤ２６３− ４　（ＥＧ２０３８）の分離　１３５．５　ＨＤ２６３−４−１　（ＥＧ２０９ ４）の分離　１３５．５　ＨＤ２６３−４−５Ａ（ＥＧ２１０］）の分離　１４ ５．７　ＨＤ２６９−２−７　（ＥＧ２３４８）の分離　１４５．８　ＨＤ２６ ９−２−３０（ＥＧ２３７１）（７）分１ｍ　１５５．９　ＨＤ２７９−７２　 （ＥＧ２１５７）の分離　１６５．１０　ＨＤ２６９−２−８（ＥＧ２３４９） の分離　１６５．１１　ＭＤＩ−１９−８（ＥＧ２３９７）の分離　１７５．１ ２　新規なりＴ菌株の分離および構成の要約　１７５ｉ３ＢＴ菌株を組み込んだ 産生物および組成物　２゜６、バイオアッセイ　２４ ６．１　ＨＤ−１変異型のバイオアッセイ　２５６．２　ＢＴＴ菌株Ｄ２６９− ２−３０のバイオアッセイ　２８ ６．３　ＢＴＴ菌株Ｄ２６９−２−７のバイオ６．５　ＢＴＴ菌株ＤＩ−１９− ８、ＨＤ２７９−７２、およびＨＤ２６９−２−８のバイオ７、微生物の受託　 ３５ この出願は、１９８７年５月８日に提出された、米国特許出願第０４７゜９６５ 号の一部継続出願である。 改良の方法に関する。これらの新しい菌株は、鱗翅類に対する増大した活性を有 する。本発明は、また、これらの新規な菌株を組み込んだ殺虫剤組成物に関する 。 毎年、世界の商業的重要な農作物の有意な部分は昆虫および他の有害生物（ｐｅ ｓｔ）の蔓延により損失されている。これらの有害生物により生ずる損害は、商 業的に重要な植物のすべての領域、例えば、食物、繊維材料および種々の家庭の 植物に及び、そして経済的損害は数１００万ドルになる。こうして、このような 蔓延から作物の保護はきわめて重要である。 広いスペクトルの農薬（ｐｓｔｉｃｉｄｅｓ）は作物の保護に最も普通に使用さ れるいるが、これらの薬剤の無分別の使用は植物の自然の防御因子の破壊ｌ二導 くことがある。さらに、それらの活性の広いスペクトルのために、化学的農薬は 非標的有機体、例えば、有益な昆虫および破壊的有害生物の寄生体を破壊するこ とがある。これらは、また、動物およびヒトに対してしばしば有害であり、こう して、適用するとき、環境的危険を与える。 さらに、昆虫および他の有機体は、これらの農薬に反復して！＃露するとき、こ れらの農薬に対してしばしば抵抗性を発現する。農薬の実用性を減少する二七に 加えて、小さい有害生物の抵抗性系統は有益な寄生有機体の減少のために主要な 蔓延の問題となりうる。 これは広いスペクトルの農薬を使用するとき直面する主要な問題である。必要と するものは、活性のより狭いスペクトルと、延長した期間にわたってその活性を 維持する能力を兼備する生物分解性農薬、すなわち、それに対する抵抗がまった くないにしても、非常により遅い農薬である。 ２．２　生物学的農薬 生物農薬（ｂｉｏｐｅｓｔｉｅｉｄｅｓ）は、またバイオラシ日ナル（ｂｉｏｒ ａｔｉｏｎａｌｓ）と呼ばれ、天然に産出する病原体を使用して、昆虫、菌・か び、および農作物の雑草の蔓延を抑制する。このような物質は、バクテリアの成 長培地の存在または不存在下に、蔓延す因子Ｊ二対して毒性の物質（例えば、毒 素）を産生ずるバクテリウムからなることができる。このようなバクテリアは、 標準の適用方法により植物に直接適用することができ、化学的農薬に比較して、 典型的には非有機体に、および全体として環境にそれほど有害でない。 有害生物の抑制の生物学的方法の使用は、菌・かびの病気がカイコにおいて発見 されたとき、最初に１８９５年に示唆された。しかしながら、生物学的有害生物 の抑制が最初に達成されたのは、乳化病のバチルス・ボピリアエ（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　Ｌ豆豆１±土工土工）の胞子を使用してマメコガネを抑制した１９４０年 であった。バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　ｊ ｅｎｓｉｓ）（以後、互換的にｒＢ、ｔ、ＪまたはｒＢｔＪと呼ぶ）という名前 のバクテリウム、すなわち、幼虫および他の昆虫に対して致死的な毒素を産生ず るバクテリア、は現在最も広く使用されてし゛る生物農薬である。１９６０年代 の終わりにおいて、ＨＤ−１，であるＢ、ｔ、の高度に毒性の菌株は生物農薬の 商業的使用の段階を設定した。 バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）（そうでなければ、ｒＢ、ｔ、Ｊまたは「ＢＴ」として知られている）は、広 く分布している、棒状の、好気性の、胞子形成性の微生物である。その胞子形成 期の間、ＢＴはプロトキシン（ｐｒｏｔ。 ｘ　ｉ　ｎ　ｓ）またはデルタ−エンドトキシン（ｄｅｌｔａ−ｅｎｄｏｔ。 ｘ　ｉ　ｎ　ｓ）として知られているタンパク質を形成する。これらの毒素はＢ Ｔにむいてパラ胞子の結晶質封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）としてまたは胞子 殻の一部分として蓄積する。種々の感受性昆虫、例えば、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏ ｐｔｅｒａ）およびジブテラ（Ｄｉｐｔｅｒａ）の目における昆虫に対するＢＴ の病原性は、本質的にこのパラ胞子の結晶のためであり、この結晶は胞子形成の 時にＢＴＭ胞の乾燥重量の２０％を越えることがある。 パラ胞子の結晶は摂取後にのみ活性である。例えば、鱗翅類の昆虫により摂取後 、アルカリ性ｐＨおよび中腸内のタンパク質分解酵素は結晶を活性化して毒性成 分を放出させる。これらの毒性成分は中腸の細胞を毒して、昆虫の食物摂取を停 止させ、究極的に死亡させる。事実、ＢＴは、鱗翅類の有害生物を鬼理するとき 、有効かつ環境的安全な殺虫剤であることが明らかとなった。 が報告された。しかしながら、ＢＴ菌株の多くにより産生される、副ピラミッド 形の、主要な結晶の形態の１つは、Ｐｌとして知られているタンパク質から構成 されている。Ｐｌは、約１３０，０００ダルトンの分子量を有し、そして、また 、胞子膜中に存在することができる。バラ胞子結晶ＰＩの遺伝子および他のタン パク質結晶のほとんどの成長培地は、ＢＴ中に変化する大きさの異なるプラスミ ドの多数のうちの１または２以上の上に存在する。 ３、発明の要約 本発明は、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）目の昆虫に対する殺虫活性を有す る、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈユニ上ユエエエ旦１ １１）の生物学的に純粋な菌株を提供する。これらの菌株は、キュアー（ｃｕｔ ｉｎｇ）および接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）の手順により誘導された。 また、本発明の目的は、ＢＴ菌株における毒素タンパク質の遺伝情報を指定する 遺伝子を含有するプラスミドを認識し、これにより、プラスミドのキュアーおよ び接合の実験のために特定の菌株を選択的に使用して、特定のまたは増大した殺 虫活性を有するＢＴの菌株を誘導する新規な方法を提供することである。 さらに、本発明の目的は、これらの新規なバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株で鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅ ｒａ）目の昆虫を抑制する方法を提供することである。 本発明の上の実施態様のすべては、以下の本発明の説明において詳しく記載され る。 ４、

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＭＤＩ−１およびいくつかの誘導された菌株からの可溶化された結晶 のゲル電気泳動の写真であり、種々の菌株におけるＰＩおよびＰ２の結晶タンパ ク質の示差的産生を示す。 第２図は、ゲル電気泳動の写真であり、これは、５５．１〜５．８に記載しかつ 第３図に図解するように構成された、ＮＲＲＬに寄託された新規なりＴ菌株のプ ラスミドおよびまた、供与体および受容体として使用するＢＴ菌株の列を示す。 第３図は、＠５．１〜５．８に記載する新規なりＴ菌株の構成を示すフローチャ ートである。 第４図は、ゲル電気泳動の写真であり、これは、ｌ１ｉ６５．９〜５．１１に記 載しかつ第５図に図解するように構成された、ＮＲＲＬに寄託された新規なりＴ 菌株のプラスミド、ならびに供与体および受容体として使用するＢＴ菌株の列を 示す。 第５図は、目５．９〜５．１１に記載する新規なりＴ菌株の構成を示すフローチ ャートである。 ５、発明の説明 一般に、本発明は、鱗！１ｌｌｉ［（Ｌｅｐ　１ｄｏｐｔ　ｅ　ｒａ）　目ｆ） 昆虫にＨする殺虫活性を有する、新規なバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）！！ｉ株を提供する。これらの薦株の 生物学的に純粋な培養物は、ＮＲＲＬに寄託された。後述するバイオアッセイは 、これらの菌株の活性を確証した。したがって、ＢＴのこれらの菌株は、鱗翅類 １．プテラまたは甲虫類の昆虫に対して有用な殺虫剤組成における活性成分の少 なくとも１つのとして使用するために好ましい。 本質的に、本発明は、いくつかの技術（例えば、新規なりＴ菌株の分離、毒素プ ラスミドのキュアーおよび転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）、同質遺伝子の菌株の使用 、プラスミド列のアニーリング、特異的毒性の個々の毒素プラスミドへの帰属を 組み合わせおよび最適化して、所定の感受性昆虫に対してより大きい毒性のため にＢＴ菌株を修飾する、新規な系統的なアプローチを達成することからなる。 一般に、本発明は、工程： （ａ）殺虫毒素のタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子により与えられた特定 の殺虫活性を有する第１バチルス・スリンギエンシス（呈上ｃｉｌｌｕｓ　ｔｈ ｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を中間のバチルス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　１ｕｓ）受 容体菌株と混合し、前記遺伝子はプラスミド上に位置し、これにより前記中間の バチルス（Ｂａｃ　ｉ　］　Ｉｕｓ）受容体菌株は殺虫活性を与えるプラスミド を接合により獲得し、（ｂ）殺虫活性を与える前記プラスミドを獲得した、前記 中間のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）受容体菌株を分離および同定し、（Ｃ）工 程（ｂ）において分離されたトランスコンシュガントの中間ｕＳ　ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は、殺虫活性を与えるプラスミドを、前記トランスコンシ ュカントの中間のバチルス（Ｂａｃｉ！１見上）受容体菌株から獲得し、そして （ｄ）選択的に標的した殺虫活性を有する、工程（ｃ）の培養混合物からトラン スコンシュガントを分離および同定する、る。 例えば、本発明の好ましい実施態様において、第１バチルス・スリンｅ　ｐ　ｉ 　ｄ　ｏ、ｐ、ｔ、ｅ　ｒ　ａ）・に対する活性を獲得する（接合により）。毒 素をエンコードするプラスミドを獲得した、菌株は、ゲル電気泳動のような方法 により同定して、そのプラスミドの列を、決定し、この列はその第２菌株中に存 在することが知られているものの外４こ、獲得したプラスミドを示すであろう： 毒素プラスミドを獲得した菌５株を分離し、次いでそのトランスコンシュガント （ｔｒａｎｓ・ｃｏ・ｎｊｕｇａｎｔ）の菌株を、選択約数・主活性（すなわち 、鱗翅類の昆虫またはジブテラまたは甲虫類と異なる）を有する第３バチルス・ スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ＋＋１ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） は、前記トランスコンシュガント菌株から、接合により、殺虫活性を与えるプラ スミドを獲得する。 したがって、生ずるＢＴ菌株は、鱗翅類の有害生物の異なる種（それらの各々は 特定のＢＴ毒素に対して変化する程度の感受性を有する）、または鱗翅類および ジブテラの昆虫、鱗翅類および甲虫類、またはジブテラおよび甲虫類の有害生物 に対して、広い範囲の選択的活性を有する。 本発明の新しいＢＴ菌株は、より大きい特異性および毒性の毒素プラスミドの無 尽蔵の源として働くことができ、次いでこれらはいくつかの受容体菌株のいずれ かの中に接合により転移して、毒素プラスミドおよび毒素タンパク質の従来未知 の組み合わせをもつ新規な発生させることができる。 本発明は、また、ＢＴおよび適当な担体の混合物からなる鱗翅類、甲虫類、また はジブテラに対して使用するための新規な殺虫剤を提供する。 ＢＴ菌株は、胞子、全有機体、またはこれらの組み合わせの形態で使用すること ができる。適当な担体は、当業者に知られている、ある数の固体または液体のい ずれの１つであることもできる。 本発明のこれらのすべての面は、下に詳述しかつ下の実施例において例示する。 ５、　１　バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）のキュアーおよび接合バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（ＢＴ）の殺虫性菌株は、関係する種の旦 、ｃｅｒｅｕｓと、胞子形成の間のタンパク質の封入体、パラ胞子の結晶の生成 により区別される。結晶を構成するタンパク質は、個々のＢＴ菌株の毒性（すな わち、鱗翅類、ジブテラ、または甲虫類のいずれの幼虫が影響を受けるか）を決 定する。毒素結晶のタンパク質をエンコードする遺伝子は、染色体外ＤＮＡ分子 （プラスミド）上に位置する。大量の毒素結晶タンパク質を構成するＢＴ菌株は 、種々の技術のアプローチにより２またはそれ以上の明確な毒素プラスミドを含 有することが示された。ある菌株中の毒素プラスミドの各々はそれ自体の毒素タ ンパク質の遺伝情報を指定し、前記タンパク質は存在する他の毒素タンパク質に よりエンコードされる毒素タンパク質と、免疫学的、電気泳動的、または他の技 術的手段により区別することができる。 キュアー（ｃｕｔｉｎｇ）はプラスミドＤ’ＮＡの損失である。ｌまたは２以上 のプラスミド（多数の毒素プラスミドのＢＴ菌株における）、および可能ならば 無毒のプラスミドさえのキュアーは、残りの毒素グラスミドによりエンコードさ れる毒素タンパク質の産生の増加に導くことができる。残りの毒素プラスミドは 、損失した毒素プラスミドがなすより多くの潜在的毒素をエンコードする場合、 誘導された部分的にキュアーされた菌株の毒性は、タンパク質基準で、および時 には原料（ｒａｗ）（投与量）基準で、より大きいであろう。こうして、特定の プラスミドのＢＴ菌株をキュアーすることによって、それが合成する毒素タンパ ク質のタイプを変更して、所定の標的昆虫に対してより大きい毒性を与えること ができる。このことが意味し得るように、毒素誘導体はその昆虫に対して特異性 であるであろう。 プラスミドのキュアーは多数の異なる方法により達成することができる。プラス ミドのキュアーは事実自発的に低いレベルで起こり、そしてこれらの自発的にキ ュアーされた菌株は日常のスクリーニングにより検出することができる。しかし ながら、キュアーは、また、培養温度の増大により、活発に誘発することができ る。これは好ましくは段階的に、すなわち、漸進的に約３７℃から約４５℃にす ることによってなされる。 菌株を洗浄剤９例えば、ドデシル硫酸ナトリウムに暴露するか、あるいはＤＮＡ の複製を妨害する化学物質、例えば、アクリジン、臭化エチジウムまたはノボビ オシンに暴露して、また、プラスミドのキュアーの頻度増加することができる。 本発明の目的に対して、高温は一般に好ましい。中程度の大きさの範囲（約４０ 〜９０メガダルトン（Ｍｄ））のＢＴ毒素プラスミドは、通常、それらを支持す る菌株から他のＢＴまたはＢ、ｃｅｒｅｕｓ菌株中に転移することができる。受 容体菌株が結晶陰性（Ｃｒｙ−）である場合、毒素プラスミドの獲得はそれを結 晶産生（Ｃｒ７つに転化する。この方法は接合的プラスミドの転移（ｃｏｎｊｕ ｇａｔｉｖｅ　ｐｌｓｍｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）として知られており、そして 毒素プラスミドとしてプラスミドを同定する１つの方法である。 それは、同質遺伝子のパックブラウン８二８ける毒素プラスミドを比較すること によって、個々の毒素プラスミドの毒性および特異性を決定するために使用する ことができる。単一の毒素プラスミドを支持するトランスコンシュガント（すな わち、これは本来同質遺伝子の菌株であることができた）は、順番に供与体とし て使用することができ、モしてｌまたは２以上の毒素プラスミドを既に支持する 菌株は受容体として使用し、そして追加の毒素プラスミドを獲得することができ る（上の節５．０および下の節５．６．５，７．５．８．５．１０および５．１ １に記載するように）。 ５．２ＨＤ−１変異型の分離 ＨＤ−１，すなわち、変異型クルスタキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）（１１毛の血清型 ３ａｂ）のＢＴ菌株は、米国において鱗翅類の有害生物を抑制するために最も頻 繁に使用されているＢＴ菌株である。ＨＤ−１を広範なキュアー操作にかけて、 綿植物を攻撃する幼虫の有害生物、ことにヘリオチス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）種 、旦、ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、以後ＨＶと呼ぶ、およびＨ，ｚｅａ、以後Ｈ２と呼 ぶ、ｊ二対する特異性および活性を改良することが努力された。プラスミドの含 量が、ｌまたは２以上のプラスミドの損失（例えば、部分的キュアー）またはそ れらのプラスミド列中により複雑な変化を有することによって変更された、ＨＤ −１変異型の群を発生させ、そしてＨＶおよびＨ２に対してバイオアッセイされ た。 個々のプラスミドの損失は、ＭＤＩ−１（野生型の菌株）が２つの毒素プラスミ ド、４４およびｌ　１５Ｍａの大きさ、を含有することを示した。ｌ１５−Ｍｄ のプラスミドは２つの型の毒素タンパク質の結晶の遺伝情報を指定しＩ；：約１ ３０．０００ダルトンの大きさのタンパク質を含有する、ＰＩとして知られてい る、副ピラミッドの結晶、および６８゜０００ダルトンの大きさのタンパク質か ら構成されている、Ｐ２として知られている、平らな立方形の結晶、ｌ１５−Ｍ ｄのプラスミドは、少なくとも２つの明確なＰｉ１ｍ素遺伝子、４．５および６ ．６遺伝子として知られている、を含有する。４４−Ｍｄの毒素プラスミドはＰ ｌ型タンパク質の遺伝情報を指定し、このタンパク質は１１５−Ｍａのプラスミ ドによりユンコードされるもの２区別され、大きさがほぼ２０００ダルトンだけ わずかに小さい。 このわずかに小さいＰＩタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子は、５．３型遺 伝子として知られている。４４−Ｍｄ毒素プラスミドを欠くＨＤ−１変異型の培 養物は、両者の毒素プラスミドを支持しくしたがってより大きい数のＰ１遺伝子 を含有する）ＨＤ−１変異型により作られｔ；ものより小さい、副ピラミッド形 の（Ｐ　ｌ）結晶を作った。他方において、このような菌株はＰ２結晶を作り、 この結晶はより小さいＰＩ毒素プラスミドを支持する菌株におけるものよりも顕 著に大きかった。したがって、１つのみのプラスミド、ｌ１５−Ｍｄ、を支持す る菌株は、より大きい量のＰ２毒素を作り、そしてより大きい産生されたＰ２対 Ｐｌの比を有した。大きい群のＨＤ−１変異型からの結晶の電気泳動は、Ｐ２の 増加する大きさの顕微鏡観測を確証した。 第１図において、両者の毒素プラスミド（ＭＤＩ−１，−３、−５、−２６）ま たはｌ１５−Ｍｄのプラスミドのみ（Ｈｌ−２、−１１，−１２、−１４、−２ ７、−３０）を支持する菌株からの毒素タンパク質は、電気泳動され、そして大 きさに従って分割された。同一の条件下に増殖させた、等しい量の培養物をゲル 上に配置した。ｌ１５−Ｍｄのみを支持する菌株は、Ｐ１バンドの強度のほぼ５ ０％の減少を示し、４４−Ｍｄプラスミド上のＰ１毒素遺伝子の損失を反映した 。しかしながら、Ｐ２タンパク質バンドは、これらの菌株におけるＰ２タンパク 質の収量の増加により引き起こされる、強度の５０〜１００％の上昇を示した。 第１図における誘導体のいくつかはプラスミドのキュアーよりおおくのラジカル の変更を行った：ＨＤｌ−１５、−１８、−１９、−２１１および−２３におい て、４４−Ｍｄプラスミドは損失され、次いでｌ１５−Ｍｄプラスミド上のＰｉ ｍｌ素遺伝子の１つ（ｒ６．６」遺伝子）は自発的に欠失されたので、これらの 誘導体は２つだけの活性毒素遺伝子、すなわち、４．５型のＰ１遺伝子およびＰ ２遺伝子を有する。第１図における遺伝子により確証された顕微鏡の観察は、こ の菌株の細胞がおおよその量でＰＩおよびＰ２タンパク質を産生ずることをを示 す。 ５．３　ＨＤ２６９−２　（ＥＧ２０６９）の分離ＢＴ菌株ＨＤ−２６９は、Ｕ 、Ｓ、Ｄ、Ａ、から２つの密接に関係する変異型の混合培養物として得られた。 これらの変異をの存在は、培養物を受け取った時、知られていなかった。これら の変異型の両者を分離し、特徴づけ（例えば、ＨＤ−１変異型を使用して）そし て生物学的に純粋な培養物として確立された。一方の変異型ＨＤ２６９−１　（ Ｅｃ２０６８）はｌ　ｌ　ＯＭｄおよび６９Ｍｄの大きさの２つの毒素プラスミ ドを含有しＩ；。他方の変異型ＨＤ２６９−２　（ＥＧ２０６９）は、部分的に キュアーされたＨＤ２６９−１の誘導体であり、モして６９−Ｍｄの毒素プラス ミドを欠いた。 ５．４　ＨＤ２６３−４　（ＥＧ２０３８　の分離ＨＤ−２６３親菌株、ＨＤ２ ６３−１　（ＥＧ２０３５）、は大きさ１１　ＯＭｄ、６０Ｍｄ８よび４４Ｍｄ の３つの毒素プラスミドを含有する。 ＨＤ２８３−１はディフコ（Ｄｉｒｃｏ）栄養プロス中の震盪しながら高温（４ ２℃）において−夜増殖させ、次いで単一のコロニーを一夜の培養物から分離し た。４４−Ｍｄの毒素グラスミドを失ったコロニーは、アガロースゲル上の単一 のコロニーのランダムスクリーニングにより、４４−Ｍｄのプラスミドの不存在 を検出することによって発見し、そしてＨＤ２６３−４と命名した。 ５．５　ＨＤ２６３−４−１　（ＥＣ２０９４）の分離ＢＴＷ株ＨＤＩ−９（Ｅ Ｃ２００９）（参照、表ＩＶ）を、栄養塩類ブロス中で受容体菌株ＨＤ７３−２ ６と一緒に増殖させることによって、供与体として使用した。栄養塩類ブロスは 、八（ｇ”（１ミリモルに）、Ｃａ”（０ロアミリモルに）およびＭｎ”（０， ０５ミリモルに）を補充した０、８％のディ７コ（Ｄｉｒｃｏ）栄養ブロスから 成っていた。 プラスミドの転移は、供与体および受容体の菌株の胞子を栄養塩類ブロス中に接 種し、そして菌株を一緒に３１時間３０℃においておだやかに震盪しながら増殖 させることによって実施した。その後、受容体菌株のコロニーを、ストレプトマ イシン含有平板ＣＨＤ７３−２６は７．）Ｌ、７’トマイシンに対して抵抗性で ある）を使用することによって選択し、次いでＣｒｙ＋コロニーを相コントラス ト顕微鏡検査により同定した。このようにして、トランスコンシュガントのＨＤ ７３−２６−４　（ＥＣ２２３６）が作られ、これはＨＤＩ−９から４４＋Ｍｄ の転移可能なＰｌ−毒素解読プラスミドを獲得した。次いで、ＨＤ７３−２６− ４は、その胞子および受容体菌株ＨＤ２６３−４　（ＥＣ２０３８）の胞子を一 緒に液体Ｍ２７グロス（処方は節６．１に記載されている）中に接種し、そして それらを−緒に３０℃において７時間おだやかに震盪しながら増殖させることに よって、供与体として使用した。ＨＤ７３−２６−４から４４＋ＭｄのＰｉｍｌ 素プラスミドを獲得した、トランスコンシュガントのＨＤ２６３−４−Ｉ　ＥＣ ２０９４）を、アガロースゲル上で受容体４（ＰＩＰ２＋）コロニーのランダム スクリーニングにより分離しｔ二。 ５．６　ＨＤ２６３−４−５Ａ（ＥＣ２１０１）の分離ＢＴ菌株ＨＤ−１２２Ａ 　（ＥＧ２１７５）を、受容体菌株ＨＤ７３−２６と一緒に増殖させることによ り、両者の菌株の胞子をＭ２７ブロス（組成は下の節６．１に記載されている） 中に接種し、そして−緒に８時間３０°Ｃにおいておだやかに震盪しながら増殖 させることによって、供与体として使用した。その後、受容体菌株のコロニーを 、ストレプトマイシン含有平板（ＨＤ７３−２６はストレプトマイシンに対して 抵抗性である）を使用することによって選択し、次いでＣｒｙ”コロニーを相コ ントラスト８９鏡検査により同定した。このようにして、トランスコンシュガン トのＨＤ７３−２６−２３　（ＥＣ２２５５）が作られ、これはＨＤ−１２２Ａ から４６＋および５．４Ｍｄのプラスミドを獲得した。次いで、ＨＤ７３−２６ −２３は、その胞子および受容体菌株ＨＤ２６３−４　（ＥＣ２０３８）の胞子 を一緒に液体Ｍ２７グロス（処方は節６．１に記載されている）中に接種し、そ してそれらを−緒に３０°Ｃにおいて８時間おだやかにＨＡしながら増殖させる ことによって、供与体として使用した。ＨＤ７３−２６−２３から４５＋Ｍｄの Ｐ１毒素プラスミドを獲得した、トランスコンシュガントのＨＤ２６３−４−５ Ａ（ＥＣ２１０１）を、アガロースゲル上で受容体−型（ＰＩＦ２＋）コロニー のランダムスクリーニングにより分離した。 ＢＴ菌株ＨＤ−１２２Ａ　（ＥＧ２１７５）を、受容体菌株ＨＤ７３−２６と一 緒に増殖させることにより、両者の菌株の胞子をＭ２７ブロス中に接種し、そし て−緒に８時間３０℃においておだやかに震盪しながら増殖させることによって 、供与体として使用した。その後、受容体菌株のコロニーを、ストレプトマイシ ン含有平板（ＨＤ７３−２６はストレプトマイシンに対して抵抗性である）を使 用することによって選択し、次いでＣｒｙ”コロニーを相コントラスト顕微鏡検 査により同定した。 このようにして、トランスコンシュガントのＨＤ７３−２６−２３　（ＥＣ２２ ５５）が作られ、これはＨＤ１２２Ａから４６＋および５．４Ｍｄのプラスミド を獲得した。次いで、ＨＤ７３−２６−２３は、その胞子および受容体菌株ＨＤ ２６９−２　（ＥＣ２０６９）の胞子を一緒に液体Ｍ２７グロス中に接種し、そ してそれらを−緒に３０℃において１６時間おだやかに震盪しながら増殖させる ことによって、供与体として使用した。ＨＤ７３−２６−２３から４６＋Ｍｄの Ｐｉ！！素プラスミドを獲得した、トランスコンシュガントのＨＤ２６９−２− ７　（ＥＣ２３４８）を、アガロースゲル上で受容体−型（Ｐ　Ｉ　Ｆ　２　＋ ）コロニーのランダムスクリーニングにより分離した。 ５．８　ＨＤ２６９−２−３０　（ＥＣ２３７１）の分離穀粒ダスト（ｇｒａｉ ｎ　ｄｕｓｔ）から分離した、ＢＴ菌株ＥＧ２４６１を、受容体菌株ＨＤ７３− ２６と一緒におだやかに震盪しながら増殖させることにより、両者の菌株の胞子 をＭ２７ブロス中に接種し、そして−緒に９．５時間３０℃において増殖させる ことによって、供与体として使用した。その後、受容体菌株のコロニーを、スト レプトマイシン含有平板（ＨＤ７３−２６はストレプトマイシンに対して抵抗性 である）を使用することによって選択し、次いでＣｒｙ”コロニーヲ相コントラ スト顕微鏡検査により同定した。このようにして、トランスコンシュガントのＨ Ｄ７３−２６＝６７　（ＥＣ２２９９）が作られ、これはＥＧ２４６１からり、 Ｄ、Ｅ、および４７＋Ｍｄのプラスミドを獲得した。次いで、ＨＤ７３−２６− ６７は、その胞子および受容体菌株ＨＤ２６９−２　（ＥＣ２０６９）の胞子を 一緒に液体Ｍ２７グロス中に接種し、そしてそれらを−緒に３０℃において６８ 時間おだやかに震盪しながら増殖させることによって、供与体として使用しＩ； 。Ｌ、Ｄ、Ｅ、およびＥＧ２４６１から４７＋Ｍｄのプラスミドを獲得しｌこ、 トランスコンシュガントのＨＤ２６９−２−７　（ＥＣ２３４８）を、アガロー スゲル上で受容体−型（ＰＩＦ２＋）コロニーのランダムスクリーニングにより 分離した。 ５．９　ＨＤ２７９−７２　（ＥＣ２１５７）の分離ＨＤ−２７９親菌株、ＨＤ ２７９−１　（ＥＣ２１５４）は、大きさｌ１０Ｍｄ、６０Ｍｄ、および４４Ｍ ｄの３つの毒素プラスミドを含有する。ＨＤ２７９−１をルリア（Ｌｕ　ｒ　ｉ 　ａ）寒天（１％のペプトン０゜５％の酵母エキス、０．５％のＮａＣ１，１， ２％の寒天）上で高温（４３℃）において数日間増殖させ、次いでコロニーを単 細胞から誘導し、過剰に増殖したコロニーから分離した。６０−Ｍｄの毒素プラ スミドを失ったコロニーは、アガロースゲル上の単一のコロニーの再スクリーニ ングにより発見し、そしてＨＤ２７９−７２　（ＥＣ２１５７）と命名しＩこ。 ５．１０　ＩＤ２６９−２−８　（ＥＣ２３４９）の分離ＢＴ菌株ＨＤ−２３２ ８（ＥＣ２１６７）を、受容体菌株ＨＤ７３−２６と一緒に増殖させるここによ り、供与体として使用した。両者の菌株の胞子をＭ２７ブロス中に接種し、そし て−緒に８時間３０℃においておだやかに震盪しながら増殖させた。その後、受 容体菌株のコロニーを、ストレプトマイシン含有平板（ＩＤ７３−２６はストレ プトマイシンに対して抵抗性である）を使用することによって選択し、次いでＣ ｒｙ１コロニーを相コントラスト顕微鏡検査により同定した。このようにして、 トランスコンシュガントのＩＤ７３−２６−２５　（ＥＣ２２５７）が作られ、 これはＨＤ２３２Ｂから５０＋、Ｌ、Ｄ、Ｅ、　、９．６．５゜４、および１． ４ｙｔａのプラスミドを獲得した。次いで、ＩＤ７３−２６−２５は、その胞子 および受容体菌株）（Ｄ２６９−２　（ＥＣ２０６９）の胞子を一緒に液体Ｍ２ ７ブロス中に接種し、そしてそれらを−緒に３０℃において１６時間おだやかに 震盪しながら増殖させることによって、供与体として使用した。ＨＤ２３２Ｂか ら５０°、Ｌ、Ｄ、Ｅ、　、９゜６．５．４、および１．４ＭｄのＰＩ毒素プラ スミドを獲得し、およびまたＩＤ７３−２６−２５から９．６Ｍｃｌおよび１． ４Ｍｄのプラスミドを獲得し、そしてＩＤ２６９−２に対して自然の７．５Ｍｄ のプラスミド失った、トランスコンシュガントのＩＤ２６９−２−２５　（ＥＣ ２３４９）を、アガロースゲル上で受容体−型（ｐｌＰ２＋）コロニーのランダ ムスクリーニングにより分離した。 ５、ｌ　Ｉ　ＭＤＩ−１９−８（ＥＣ２３９７）の分離ＢＴ菌株ＨＤ−１３７Ａ 　（ＥＣ２１６１）を、受容体菌株ＨＤ７３−２６と一緒に増殖させることによ り、供与体として使用した。両者の菌株の胞子をＭ２７グロス中に接種し、そし て−緒に８時間３０℃においておだやかに震盪しながら増殖させｔ；。その後、 受容体菌株のコロニーを、ストレプトマイシン含有平板（ＩＤ７３−２６はスト レプトマイシンに対して抵抗性である）を使用することによって選択し、次いで Ｃｒｙ３コロニーを相コントラスト顕微鏡検査により同定した。このようにして 、トランスコンシュガントのＩＤ７３−２６−３４　（ＥＣ２２６６）が作られ 、これはＨＤ２３２Ｂから４２”Ｍｄのプラスミドを獲得した。 次いで、ＩＤ７３−２６−３４は、その胞子および受容体菌株ＨＤＩ−１９（Ｅ Ｃ２０１９）の胞子を一緒に液体Ｍ２７ブロス中に接種し、そしてそれらを−緒 に３０℃において７時間おだやかに震盪しながら増殖させることによって、供与 体として使用した。ＩＤ７３−２６−３４から４２”ＭｄのＰＬ毒素プラスミド を獲得した、トランスコンシュガントのＭＤＩ−１９−８（ＥＣ２３９７）を、 アガロースゲル上で受容体−型（ＰＩＦ２＋）コロニーのランダムスクリーニン グにより分離した。 ５．１２　新規なりＴ菌株の分離および構成の要約ＨＤ−２６３１５よびＨＤ− ２６９の部分的にチユアーしたおよびトランスコンシュガントの誘導体を包含す る、本発明に関係するいくつかの菌株の由来および含量を表１に記載し、それら のいくつはＮＲＲＬに寄託されている。 ）ＩＤ７−１　（ＥＣ２１８０）：フランスからの原形菌株ｖａｒ、りＡｙ７゜ タキ（ｋｕｒｓｔａｋｉ）。 プラスミド：旦ｌ、５０．７．５．５．４．５．２．４．９Ｍｄ。 毒素プラスミド：５０（Ｆ’１） ＩＤ７３−２６　（ＥＣ２２０５）：　５旦、５０．７．５．５．４および５． ２Ｍｄのプラスミドの損失およびストレプトマイシン抵抗性の付加により、原形 菌株ＨＤ７３−１から誘導されｔ；。 ＩＤ２６３−１　（ＥＣ２０３５）：英国からの原形菌株ｖａ　ｒ、クルスタキ （ｋｕｒｓｔａｋｉ）。 プラスミド＝１３０、上土旦、見立、互Ａ１４３．７．５．５．４．５．２．５ ．０．４．９．１．４Ｍｄ。 毒素プラスミド：　１１０　（ＰＩ、Ｐｌ）、６０（ＰＩ）、４４（Ｐｌ） ＩＤ２６３４　（ＥＣ２０３８）：　４４−ｍｄの毒素プラスミドのキュアーし た菌株ＨＤ２６３−１゜ 毒素プラスミド：１１０（ＰＩ％Ｐ２）、６０（ＰＩ）ＩＤ２６３−４−１　（ ＥＣ２０９４）：ＨＤ−１の４４−Ｍｄ（ＰＩ）毒素プラスミドを獲得した受容 体としてＩＤ２６３−４を使用したトランスコンシュガント。 ＩＤ２６３−４−５Ａ　（ＥＣ２１０１）：ＨＤ−１２２Ａの４６Ｍｄ（Ｐｌ） ＩＩ素プラスミドを獲得した受容体としてＩＤ２６３−４を使用したトランスコ ンシュガント。 ＩＤ２６９−１　（ＥＣ２０６８）：英国からの原形菌株ｖａ　ｒ、クルスタキ （ｋｕｒｓｔａｋｉ）。 プラスミド：１３０、上上旦、見立、４９．４４．７．５．５．４．５．２．５ ．０．４．９８よび４．９Ｍｄ。 毒素プラスミド：１ＩＯ（ＰＩ、Ｐｌ）、６９（ＰＩ）ＩＤ２６９−２　（ＥＣ ２０６９）：　６９Ｍｄの毒素プラスミドの自発的損失により）（Ｄ２６９−１ から誘導された。 ＩＤ２６９−２−７　（ＥＣ２３４８）：ＨＤ−１２２Ａから４６（ＰＩ）Ｍｄ の毒素プラスミドを獲得した受容体としてＩＤ２６９−２を使用するトランスコ ンシュガント。 ＩＤ２６９−２−３０　（ＥＣ２３７１）：ＥＣ２４６１から４７Ｍｄ（Ｐｌ） 毒素プラスミドを獲得した受容体として）ＩＤ２６９−２を使用するトランスコ ンシュガント。 ＭＤＩ−１（ＥＣ２００１）：米国からの原形菌株ｖａｒ、クル７、タキ（ｋｕ ｒｓｔａｋｉ）。 プラスミド：１３０、土工】、５３．５１１旦、２９．９゜６．５．４．５．２ ．５．０．４．９１．４Ｍｄおよびり。 ＭＤＩ−９（ＥＣ２００９）：　ｌ　３０、土工盈、５１．９．６および５゜４ Ｍｄのプラスミドおよびり、Ｄ、Ｅ、の損失により原形撹拌ＨＤＩ−１（米国） から誘導された。 プラスミド＝５３、旦、２９．５．２．４．９．１．４Ｍ毒素プラスミド：４４ （ＰＩ） ＨＤ−１２２Ａ（ＥＣ２１７５）：英国から原形菌株ｖａｒ、アイザワイ（ａｉ ｚａｗａｉ）。 プラスミド：１２０、土工π、７８．５０、す旦、４３．３゜３．３１１６．０ 　（０，Ｃ，）、８．０．５．４．４．７．３．５Ｍｄおよびり、Ｄ、Ｅ、。 毒素プラスミド：１ｌＯ（ＰＩ）、４６（ＰＩ）ＥＣ２４６１：米国カンサス州 の穀粒ダストの試料（コムギ）から分離された新規なりＴ。 プラスミド：１２０、土工升、旦、４４．３４、Ｌ、Ｄ。 Ｅ、、６．０　（０，Ｃ，）、８．２．８．０．７．２．７゜０および３．５Ｍ ｄ。 毒素プラスミド：１ｌＯ（Ｐｉ）、４７（ＰＩ）ＨＤ２７９−７２　（ＥＣ２１ ５７）：　６０Ｍｄの毒素プラスミドの損失によりＨＤ２７９−１から誘導され ｔ二。 ＨＤ７３−２６−２５　（ＥＣ２２５７）：ＨＤ−２３２Ｂ　（ＥＣ２１６７） から５０°（ＰＩ）、９．６．５．４．１．４Ｍｄのプラスミドおよびり、Ｄ、 Ｅ、を獲得した受容体としてＨＤ７３−２６を使用するトランスコンシュガント 。 ＨＤ２６９−２−８　（ＥＣ２３４９）：ＨＤ７３−２６−２５　（ＥＣ２２５ ７）から５０９（Ｐｌ）、９．６８よびのプラスミドおよびり、Ｄ。 Ｅ、を獲得し、そして７．５Ｍｄのプラスミドを有する受容体としてＨＤ２６９ −２を使用するトランスコンシュガント。 ＨＤ７３−２６−３４　（ＥＣ２２６６）：ＨＤ−１３７Ａ　（ＥＧ２１６１） から４２″″Ｍｄ（Ｐｌ）毒素プラスミドを獲得した受容体としてＨＤ７３−２ ６を使用するトランスコンシュガント。 ＭＤＩ−１９−８（ＥＣ２３９７）：ＨＤ７３−２６−３４　（ＥＣ２２６６） から４２′″Ｍｄ（ＰＩ）毒素プラスミドを獲得した受容体としてＨＤＩ−１９ （ＥＧ２０１９）を使用するトランスコンシュガント。 ｒＬ、Ｄ、Ｅ、Ｊはほぼｌ　ＯＭｄの大きさの線状ＤＮＡ要素である。 ｒｏＣＪはプラスミドのＤＮＡが開いた円として主として存在することＮＲＲＬ に寄託された新規なりＴ菌株のプラスミドおよびそれらの分離に使用した主な前 駆体のプラスミドの列は、第２図および第４図においてゲル上で示されている。 節５．３〜５．１１に記載する本発明の新規なりＴ菌株の構成の通路を第３図お よび第５図に要約する。 ５．１３ＢＴ菌株を組み込んだ産生物および配合物ＢＴは鱗翅類、ジブテラ、お よび甲虫類の昆虫に対する活性をも効力のある殺虫相補的として使用することが できる。したがって、本発明の範囲内において、これらのＢＴＴ菌株殺虫剤（活 性成分）として単独で、あるいはＢＴと他の有機体との混合物の一部分として利 用することができる。ＢＴのこれらの菌株を含有する本発明の組成は、殺虫的に 有効量で適用し、この量は因子、例えば１、抑制すべき特定の昆虫、処置すべき 特定の植物および殺虫活性組成物を適用する方法に依存する。好ましい殺虫剤配 合物は、ＢＴを、単独で、あるいは他の有機体とともに、所望の担体と混合する ことによってつくられる。配合物はダストとしてまたは油（植物性または鉱物性 ）または水中の懸濁液として、湿潤性粉末として、あるいは農学上の適用に適当 な他の材料中で、適当なアジュバントを使用して、投与することができる。適当 な担体は固体または液体であり、そして配合技術において通常使用する物質、例 えば、天然または再生の鉱物性物質、溶媒、分散剤、湿潤剤、増粘剤、結合剤ま たは肥料対応することができる。 ＢＴを含有する本発明の組成物は、適当な昆虫の生息場所に殺虫的に有効量で適 用し、この有効量は、前述したように、因子、例えば、抑制すべき特定の昆虫、 処置すべき特定の植物および殺虫活性組成物を適用する方法に依存する。 本発明の方法により保護される標的作物（すなわち、鱗翅類、ジブテラ、および 甲虫類の潜在的生息場所）は、例えば、次の植物の種からなるが、これらに限定 されない：穀類（例えば、コムギ、オオムギ、ライ、オート麦、イネ、モロキシ および関連する作物）、ビート、マメ科植物、油の植物（例えば、ポピー、オリ ーブおよびヒマワリ）、キュウリ植物、繊維の植物、柑橘類、野菜（例えば、レ タス）、落葉性樹木および針葉樹。 一般に、好ましい組成物は、通常０．１〜９９％、１〜５０％の殺虫剤微生物バ チルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ） またはそれと他の活性成分との組み合わせ、１〜９９．９％の固体または液体の アジュバント、および０〜２５％、好ましい０．１〜２０％の界面活性剤を含有 する。 固体または液体のアジュバントを含有する配合物は、既知の方法において、例え ば、活性成分を増量剤、例えば、溶媒、固体担体、およびある場合において、表 面活性化合物（界面活性剤）と均質に混合および／または粉砕することによって 調製される。 適当な液状担体は、植物性油、例えば、ヤシ油または大豆油、鉱油または水であ る。例えば、ダストおよび分散性粉末のために使用する固体の担体は、通常天然 の鉱パ−繊維、例えば、方解石、タルク、カオリンまたはアクパルジャイトであ る。物理学的性質を改良するために、また高度に分散したケイ酸または高度に分 散した吸収性ポリマーを添加することが可能である。適当な粉砕した吸着性担体 は多孔質のタイプ、例えば、軽石、破壊煉瓦、セブライトまたはベントナイトで ある。適当な非吸着性担体はケイ酸塩または砂のような材料である。さらに、多 数の予備造粒した材料または無機または有機の混合物、例えば、ことにドロマイ トまたは粉砕した植物残留物を使用することができる。 配合すべき活性成分の性質に依存して、適当な表面活性化合物はすぐれた乳化性 、分散性および湿潤性を有する非イオン性、陽イオン性および／または陰イオン 性である。用語「界面活性剤」は、また、界面活性剤の混合物からなるとして理 解されるであろう。 適当な陰イオン性界面活性剤は、水溶性の石鹸および水溶性の表面活性化合物で あることができる。 適当な石鹸は高級脂肪酸（Ｃ＋。−Ｃ＋＋）のアルカリ金属塩、アルカリ土類金 属塩または非置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸、ま たは、例えば、ヤシ油またはタロウ油から得ることができる天然の脂肪酸の混合 物のナトリウム塩またはカリウム塩である。さらに安定な界面活性剤は、まＩ； 、脂肪酸のメチルタウリン塩ならびに変性および未変性のリン脂質である。 しかしながら、より頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、ことに脂肪族スルホネー ト、脂肪族サルフェート、スルホン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキル アリールスルホネートを使用する。 脂肪族スルホネートまたはサル７エーＩは、通常、アルカリ金属塩、アルカリ土 類金属塩まＩ；は非置換アンモニウム塩の形態であり、そして一般にドデシル硫 酸のＣ＠−Ｃ２２アルキルエステル、ナトリウムまたはカリウム塩、あるいは脂 肪酸から得られたアルコールサルフェートの混合物である。これらの化合物は、 また、脂肪族アルコール／エチレンオキシド付加物のスルホン酸エステルおよび スルホン酸の塩類の混合物からなる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、 好ましくは、２つのスルホン酸基および１つの脂肪酸基（約８〜２２個の炭素原 子を含有する）を含有する。アルキルアリールスルホネートの例は、ドデシルベ ンゼンスルホン酸、ジブチナフタレンスルホン酸、まｔ二はナフタレンスルホン 酸／ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノー ルアミン塩である。また、対応するホスフェート、例えば、ｐ−ノニルフェノー ルと４〜１４モルのエチレンオキシドリン酸エステルの塩との付加物のリン酸エ ステルの塩類は適当である。 非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ポリグリコールエーテル誘導体または脂 肪族または環式脂肪族のアルコールまｔ；は飽和または不飽和の脂肪酸およびア ルキルフェノールであり、前記誘導体は３〜ｌＯのグリコールエーテル基および （脂肪族）炭化水素部分中に８〜２０個の炭素原子およびアルキルフェノールの アルキル部分中に６〜１８個の炭素原子を含有する。 他の適当な非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドとアルキプロピレン グリコール、エチレンジアミノポリプロピレングリコールとの水溶性付加物であ り、そしてアルキルポリプロピレングリコールは１〜ｌＯ個の炭素原子をアルキ ル鎖中に含有し、前記付加物は２０〜２５０のエチレングリコールエーテル コールエーテル基を含有する。 非イオン性界面活性剤の代表的例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール 、ヤシ油、グリコールエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物 、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、エチレングリコールおよびオ クチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタンの 脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートは、ま た、適当な非イオン性界面活性剤である。 カチオン性界面活性剤は、好ましくは、置換基として、少なくとも１つのｃｍ　 Ｃｘｘアルキル残基および、それ以上の置換基として、低級非置換マたはハロゲ ン化アルキルベンジル、またはヒドロキシル化低級アルキルベンジル残基を含有 する、第四アンモニウム塩である。塩類は好ましくはハライド、メチルサルフェ ートまたはエチルサルフェートの形態、例えば、ステアリルトリメチルアンモニ ウムクロライドである。 ６、バイオアッセイ バイオアッセイは、既知量のＢＴ粉末を含有するＢＴ懸濁液の既知量を、人工の 寒天に基づく規定穴の表面に局所的に適用することによって実施される。この規 定穴はプラスチックのカップ中に含有され、そしてカップ後とに表面積が均一で ある。多数のカップを処置投与量の各々において処理する。液体担体を蒸発させ た後、１匹の新しく生まれた幼虫をカップの各々の中に配置し、次いでカップに 蓋をし、そしてアッセイを７日間３０℃においてインキュベージコンし、その時 致死率を記録する。ＬＣ５０値をコンピューターのプログラムを経て決定し、こ のプログラムは投与量一致死率のデータをプロビットに変換し、そして試験の集 団の５０％が死亡する致死濃度を計算する。タンパク質のＬＣ５０またはＰＬＣ ５０は、試料のＬＣ５０を化学的アッセイにより決定した結晶タンパク質である 試料の百分率を掛けることによって計算する。 ＢＴ試料の原懸濁液は、粉末の２０〜３０ｍｇを秤量して、ガラスのねじこみカ ップのバイアル中に入れ、そして２０ｍ１２の０．００５％のトリトンＸ−１０ ０を添加することによって調製する。次いで、この懸濁液を約１５秒間超音波処 理する。 バイオアッセイは、一般に、ｌ系列の８投与量から成り、引き続く投与量の各々 は前の投与量の１／２前の２／３である。原懸濁液を使用して、最高の投与量を 含有する管を接種する。次いで、希釈を実施する。 １００μｇの適当な懸濁液をその投与量の規定穴のカップの各々の表面上に配置 する。液体を規定穴の表面にわたって均一に広げ、そして蒸発後、試験昆虫を規 定穴の表面上に配置する。 ＢＴ粉末は、次の順番の手順に従って調製することができる。 １、最終のブロスまたはペリコン（Ｐｅ　１　１　ｉｃｏｎ）濃縮物を５００ｍ Ｑの遠心びん中で２０分間７０００ｒｐｍで遠心する（Ｊ　Ａ−ＩＯローター内 で）。（注、遠心前に、ブロスのｐＨを７．０に調節する）。 ２、上澄み液を取り出し、そして廃棄する。 ３、沈澱を最小量の脱イオン水中に再懸濁する。均質なスラリーが得られるまで 、磁気撹拌機上で１０分間撹拌する。 ４．４〜５体積のアセトンを添加する。 ５、アセトンの懸濁液を３０分間撹拌する。 ６、懸濁液を１０分子、７５００で遠心する（ＪＲ−１Ｏローター）。 ７、上澄み液を廃棄し、そして沈澱をほぼｌｏｏｍＱのアセトン中に再懸濁する 。 ８、再懸濁した沈澱を撹拌する（はぼ１０分間または均一なスラリーが得られる まで）。 ９、ワットマン（Ｗｈａ　ｔ　ｏｍａｎ）＃ｌ濾紙でスラリーを濾過する。 ｌＯ１工程７〜９を反復する。 １１、最終の粉末をアルミニウムの秤量ポートに移し、そして−夜乾燥する。 １２、収量について最終の粉末を秤量し、そして４℃において貯蔵するｔ；め６ ０ｍ＜１のポリプロピレンのびんに移す。 ５．１ＨＤ−１変異型のバイオアッセイＨＤ−１変異型は、バイオアッセイのた めに次のようにして増殖させた：胞子を５０ｍ１２の無菌フラスコ内の５ｍＱの Ｍ２７プロス中に接種した。Ｍ２７グロスは３３ミリモルのＨＰＯ，−およびＨ ｘ　Ｐ　Ｏ４−のアニオンの各々；９８ミリモルのＫ”；０．１７％のペプトン ；０．１％の牛肉エキス：１５０ミリモルのＮａＣ１；５．５ミリモルのグルコ ース：３３０μモルのＭｇ−＋、２３０μモルのＣａ４４、および１７μモルの Ｍｎ”（塩化物塩として添加した）から構成されている。培養物を３０℃におい て農産しながら３日間インキュページコンし、その時胞子形成および結晶の形成 は完結しＩ：。５μＱの無菌ｌ−オクタノールを泡消剤として添加し、そして培 養物をかきまぜて均質なな懸濁液を発生させ、無菌のプラスチック管に移し、密 閉し、そして５℃に８いて貯蔵した。 鱗翅類の３種の幼虫についてのこれらの液体培養物のバイオアッセイは、表ＩＩ に示すように、異なるＨＤ−１変異型が有意に異なる毒性を有することを明らか にした。 表　■ 鱗翅類の異なる種に対するＨＤ−１誘導体の毒性法に対する毒性 Ｈ２ＴＮ　５Ｅ ＨＤＩ−１１８２１５６１４６ ＨＤｉ２　１０７　７８　１６５ ＨＤＩ−１２１０４１１７１５７ ＨＤ！−１９１０５ＮＡ　１１６ Ｈ２ｗＨ，ｚｅａ；ＴＮ−Ｔ、ｎｉ；　５Ｅ−３，ｅｘｉｇｕａ；ＮＡ−得られ ず（ＰＬＣ５０はナノグラムの調製物／　６００　ｍｍ２の規定食表面である） ＨＤ−１誘導体、例えば、ＨＤ　ｌ　−１２を受容体として接合メイティング（ ｍａｔｉｎｇ）において使用し、その間受容体菌株の細胞は供与体菌株から新し い毒素プラスミドを獲得するであろう。このようにして、ＭＤＩ−１２のトラン スコンシュガントが得られ、これらはＨＤＩ−１２のｌ１５−Ｍｄの自然プラス ミド、およびＢＴの他の菌株から由来するｌまたは２以上の毒素プラスミドの両 者を含有した。これらのトランスコンシュガントの菌株は、毒素プラスミドの新 規な組み合わせを収容し、致死的濃度／ナノグラム（ｎ　ｇ）の毒素タンパク質 としてタンパク質基準で測定して、ＭＤＩ−１（もとの、親菌株）のそれらに関 して数表された毒性の毒素結晶をつくることを希望した。これは事実、表ＩＩＩ に示すような場合となった。 表　■ ４４−Ｍｄの毒素プラスミドを他のＢＴ菌株からの毒素プラスミドで置換すれた 、ＨＤＩ−１：１ランスコンシユガントの毒性の変動ＬＣ５０ 亘−珪　ＨＶ　Ｈ２ ＭＤＩ−１（野生を）２０１４０ ＭＤＩ−１２−９６１４２ ＨＤＩ−１２−１０１７１０７ ＨＤＩ−１２−１１２５’　１０９ ＨＤＩ−１２−１２２３９１ ＨＤＩ−１２−１３１４９０ ＨＤＩ−１２−１４７４９ ＨＤＩ−１２−１５１７８５ ＨＤＩ−１２−１６２１９２ ＨＤＩ−１２−１７２１１１３ ＨＤＩ−１２−１８２３１６１ ＨＤＩ−１２−１９１０１３５ ＨＤＩ−１２−２０９２０４ （ＰＬＣ５０はナノグラムの調製物／６００ｍｍ”の規定食表面である）表ＩＩ ＩはＨＤＩ−１２、ＨＤＩ−１２−９〜ＭＤＩ−１２−２０の１２のトランスコ ンシュガントのＨＶおよびＨ２についてのｐＬｃ５０（試験昆虫の５０％を殺す 毒素タンパク質の濃度）を記載し、トランスコンシュガントの各々は異なる新し い毒素プラスミド（１２の異なる供与体菌株からの）を支持する。ＨＶに対して 、毒性はＨＤＩＩより少し悪い（ＨＤｌ−１２−１１）からＨＤｌ−１の３倍の 毒性（ＭＤＩ−１２−９）の範囲に及ぶ。Ｈ２に対して、これらのトランスコン シュガントはＭＤＩ−１はど毒性でない（ＨＤＩ−１２−２０）から２倍の毒性 （ＨＤＩ−１２−１４）の範囲に及ぶ。これらのデータから誘導することができ る２つの重要な結論が存在する。ＢＴ菌株は所定の昆虫に対して、プラスミドの キュアーおよび／またはプラスミドの獲得により改良することができる。さらに 、ある種の標的は可能である：表１１１に表されている１２のトランスコンシュ ガントのうちで、ＭＤＩ−１２−９はＨＶに対して高度に毒性であるが、Ｈ２に 対してＨＤｌ−１はどよくはない。逆に、トランスコンシュガントのあるもの（ 例えば、ＭＤＩ−１２−１５）はＨ２に対しテＨＤ　１−１よりすぐれるが、Ｈ ｖに対してＨＤｌ−１に劣っていた。 ＭＤＩ−１，その変異型およびトランスコンシュガントを使用して得られた結果 に匹敵し得る結果は、また、本来２またはそれ以上の毒素プラスミドを含有する 、ＢＴ菌株ＨＤ２６９を使用して得られた。これらの結果のいくつかを表ＩＶに 表す。 表　■ プラスミドのキュアーおよびプラスミドの転移によりＢＴ菌株ＨＤ２６９の毒素 タンパク質の毒性の変化（ＰＬＣ５０）菌　株　摘　要　昆虫　ＰＬＣ５０ ＨＤ２６９−１　野生型　ＳＥ　１９３ＨＤ２６９−２　１つの毒素プラス　Ｓ Ｅ　１１５ミドのキュアー ＨＤ２６９−２　１つ（７）毒素プラｘ　ＨＶ　１１ミドのキュアー ＨＤ２６９−２−１　新しい毒素プラス　ＨＶ　４ミドの獲得 ＨＤ２６９−２　１つ＋７）毒素プラス　Ｈ２１０３ミドのキュアー ＨＤ２６９−２−１　新シイ毒素プラスＨ２４０ミドの獲得 （ＰＬＣ５０はナノグラムの調製物／６００ｍｍ”の規定食表面である）。 ６−２ＢＴ菌株ＨＤ２６９−２−３０のバイオアッセイＢＴ菌株ＨＤ２６９−２ −３０のバイオアッセイを、２つの異なる粉末の配合を利用して、一般に５６． ０および５６．１に上に記載するようにして実施した。結果を下の表ＶおよびＶ ｌに記載する。 表　Ｖ ＢＴ　５ｔｒａｉｎ　ＨＤ２６９２−３０昆虫　ＰＬＣ５０ Ｈ２９，９ ＳＥ　３７．９ ＳＥ　４５．５ ＴＮ　ｌ　５−２ ＴＮ　２６．３ 昆虫 ０Ｎ−Ｏｓｔｒｉｎｉａ　ｎｕｂｉｌａｌｉｓアワツメイガＨＶ＝Ｈｅｌｉｏｔ ｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ　タバコのガＨ２−Ｈｉｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ　 オオタパコガ５Ｅ−５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ　シロイチモンジョト ウＴＮ−Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　イラクサキンウヮバ（ＰＬＣ５０は ナノグラムの調製物／６００ｍ１の規定食表面である）表　■ ＨＤ２６９−２−３０のＢＴ菌株 昆虫　ＰＬＣ５０ Ｈ２５８，４ ＳＥ　６２−６ ＳＥ　１０８．８ ＴＭ０１．５ Ｔ：Ｎ　１．ｉｌ、、８ °昆虫 ＨＶ＝Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ　タバコのガＨ２＝Ｈｉｌｉｏ ｔｈｉｓ　ｚｅａ　オオタバコガ５Ｅ＝Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ　 シロイチモンジョトウＴＮ＝Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　イラクサキンウ ワバ（ＰＬＣ５０はナノグラムの調製物／　６００　ｍがの規定食表面である） これらの結果が示すように、ＢＴ菌株ＨＤ２６９−２−３０は異なる鱗翅類の昆 虫に対して変化する程度の活性を有する。 ６．３ＢＴ菌株ＨＤ２６９−２−７のバイオアフセイＢＴ菌株ＨＤ２６９−２− ７のバイオアッセイを、２つの異なる粉末の配合を利用して、一般に０６．０お よび６６．１に上に記載するようにして実施した。結果を下の表ＶｌｌおよびＶ ｌｌｌに記載する。 表　■ ＨＤ２６９−２−７のＢＴ菌株 昆虫　ＰＬＣ５０ ＳＥ　４．５．１ ＴＮ　４３．０ 昆虫 −Ｌ’Ｄ”Ｌ１ｙｍ＋ａｎｔｒｉａ　ｄｉｓｐａｒ　マイマイガＨＶ＝Ｈｅｌｉ ｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ　タバコのガＨ２＝Ｈｉｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅ ａ　オオタバコガ５Ｅ−３ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ　シロイチモンジ ョトゥＴＮ−Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　イラクサキンウヮパ（ＰＬＣ５ ０はナノグラムの調製物／６００ｍがの規定食表面である）表　■ ＨＤ２６９−２−７のＢＴ菌株 昆虫　ＰＬＣ５０ Ｈ２３０，６ Ｈ２２８，９ ＳＥ　４６．０ ＳＥ　６６．０ ＳＥ　５２．０ 昆虫 ＬＤ−Ｌｙｍａｎｔｒｉａ　ｄｉｓｐａｒ　マイマイガＨＶ−Ｈｅｌｉｏｔｈｉ ｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ　タバコのガＨ２−Ｈｉｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ　オオ タバコガＳＥｍＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ　シロイチモンジョトウＴ Ｎ−Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　イラクサキンウヮバ（ＰＬＣ５０はナノ グラムの調製物／６００ｍｍ”の規定食表面である）これらの結果が示すように 、ＢＴ菌株ＨＤ２６９−’２−７は異なる鱗翅類の昆虫に対して変化する程度の 活性を有する。 ６．４ＢＴ菌株ＨＤ２６９−２のパイオアフセイＢＴ菌株ＨＤ２６９−２のバイ オアッセイを、２つの異なる粉末の配合を利用して、一般にＨ６，０Ｈよび５６ ．ｌに上に記載するようにして実施した。結果を下の表ＩＸおよびＸに記載する 。 表　■ ＨＤ２６９−２のＢＴＭ株 昆虫　ＰＬＣ５０ 昆虫 ＨＶ＝Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ　タバコのガＨ２−Ｈｉｌｉｏ ｔｈｉｓ　ｚｅａ　オオタバコガ５Ｅ＝Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ　 シロイチモンジョトウ（ＰＬＣ５０はナノグラムの調製物／６００ｍｍ”の規定 食表面である）表　Ｘ ＨＤ２６９−２のＢＴ菌株 昆虫　ＰＬＣ５０ ＳＥ　９４．Ｏ ５Ｅ　８８．０ 昆虫 ＬＤ＝Ｌｙｍａｎｔｒｉａ　ｄｉｓｐａｒ　？イマイガＨＶ＝Ｈｅｌｉｏｔｈｉ ｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ　タ／（コのガＨ２＝Ｈｉｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ　オ オタノ（コガ５Ｅ＝Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａ　シロイチモンジョト ウＴＮ−Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　イラクサキンウワノ（（ＰＬＣ５０ はナノグラムの調製物／６０　Ｑｍがの規定食表面である）これらの結果が示す ように、ＢＴ菌株ＨＤ２６９−２は異なるｗ４翅類の昆虫に対して変化する程度 の活性を有する。 ６．５ＢＴ菌株ＭＤＩ−１９−８、ＨＤ２７９−７２、およびＨＤ２６９−２− ８のバイオアッセイ新規な菌株ＭＤＩ−１９−８、ＨＤ２７９−７２およびＨＤ ２６９−２−９のバイオアッセイを、一般に５６．０およびδ６．１に上に記載 する手順に従って実施し、そして菌株ＨＤＩ−５−１９８０（商用ＢＴ調製物の 国際標準）およびＤＩＰＥＬ　２Ｘ、商業的に入手可能なりＴ調製物（Ａｂｂｏ ｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イリノイ州シカゴ）の毒性と比較した。 表　■ ＨＤＩ−１９−Ｂ、ＨＤ２７９−７２及びＨＤ２６９−２−８ＢＴ菌株 ＬＣ５０ 菌株　ＨＶ　Ｈ２ＳＥ　ＴＮ　ＬＤ ＨＤＩ−５−１９８０２０５８４３８７４８２６２ＤＴＰＥＬ　２Ｘ　２１３６ ０２６４３１５０ＨＤ２７９−７２　４　３７９４２２１２ＭＤＩ−１９−８− １０４２５２９− ＨＤ２６９−２−８　３　５７６８１７−粉末試料からのすべてのデータ。 ＨＶ＝Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓＨ２−Ｈｉｌｉｏｔｈｉｓ　ｚ ｅａ ＳＥ＝Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａＴＮ＝Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　 ｎｉＬＤ−Ｌｙｍａｎｔｒｉａ　ｄｉｓｐａｒ（ＰＬＣ５０はナノグラムの調製 物／６００ｍがの規定食表面である）これらの結果が示すように、これらの新規 な菌株は、一般に、既知の菌株および商用調製物に関して改良された毒性を有す る。 ７．　微生物の受託 本発明の範囲内に、ＢＴ微生物の胞子形成および非胞子形成の両者の形態の分離 した菌株が包含される。ここの開示した組成物および方法において有用な微生物 の例は、次のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ）菌株であり、これらは農学研究培養物収集所（Ａｇｒｉｃｕｌｔ ｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＸＮＲＲ Ｌ）、イリノイ州ペオリア、に寄託され、そして次に列挙した受け入れ番号を割 り当てられた：ＨＤ２６３−４−Ｉ　Ｂ−１８２０５ ＨＤ２６３−４−５Ａ　Ｂ−１８２０６ＨＤ２６９−２　Ｂ−１８２０７ Ｊ（’Ｄ２６９−２−７　Ｂ−１８２０８１（Ｄ；２．６９−２−３０　Ｂ−１ ８２０９ＨＤ２６９−２−８　Ｂ−１８３４６ ＨＤ２７９−７２　Ｂ−１８３４５ ＨＤＩ−１９−８Ｂ−１８３４７ 寄託された実施態様は個々の例示であるので、本発明の１つの面は受託された微 生物により範囲が制限されない。事実、ここに示しかつ記載したものに加えて種 々の変更は前の記載および添付図面から当業者にとって明らかとなるであろう。 ＦＩＧ、１ ０（５ＱのΦの口ΦＱΦΦ ＬａＪ　ＬａＪ　ＬａＪ　ＬＩＪ　ＬＬＩＬＬＩ　ＬＬＩ　ＬａＪ　ＩａＪ　Ｌ ＬＩ　ＬＬＩへりの数字はＨＤ２６９−１および ＨＤ２６３−１プラスミドの大きさ くＭｄ）を示す 自発的：変異型は自発的に生じた Δ　：変異型は高温増殖後に分離した へりの数字はＨＤＩ−１プラスミド の大きさくＭｄ）を示す ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ 自発的１　変異型は自発的！こ生じた ｔｈｓ　変異型は高温増殖後に分離した国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の受け入れ番号： 【配列があります】 を有するバクテリアから成る群より選択される、ＮＲＲＬに寄託され、そして受 け入れ番号を割り当てられたバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）バクテリウム。 ２、請求の範囲第１項記載のバクテリアの少なくとも１つと適当な担体との組み 合わせからなる殺虫剤組成物。 ３、担体は液体の担体である、請求の範囲第２項記載の殺虫剤。 ４、担体は１または２以上の界面活性剤を含有する、請求の範囲第３項記載の殺 虫剤。 ５、担体は固体の担体である、請求の範囲第２項記載の殺虫剤。 ６、固体の担体は、方解石、タルク、カオリン、アタパルジャイト、ケイ酸塩、 砂、ドロマイト、および植物残留物の粉砕物から成る群より選択される、請求の 範囲第５項記載の殺虫剤。 ７、担体は造粒した吸収性担体である、請求の範囲第６項記載の殺虫剤。 ８、工程： （ａ）殺虫毒素のタンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子により与えられた特定 の殺虫活性を有する第１バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株を中間のバチルス（Ｂａｃｉｉｌｕｓ）受容体菌株 と混合し、前記遺伝子はプラスミド上に位置し、これにより前記中間のバチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）受容体菌株は殺虫活性を与えるプラスミドを接合により獲 得し、（ｂ）殺虫活性を与える前記プラスミドを獲得した、前記中間のバチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）受容体菌株を分離および同定し、（ｃ）工程（ｂ）におい て分離されたトランスコンジュガントの中間のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）受 容体菌株を第２バチルス・スリンギェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ）菌株と混合し、これにより前記第２バチルス・スリンギエンシス （ＢａｃｉＩｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株は、殺虫活性を与えるプ ラスミドを、前記トランスコンジュガントの中間のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）受容体菌株から獲得し、そして （ｄ）選択的に標的した殺虫活性を有する、工程（ｃ）の培養混合物からトラン スコンジュガントを分離および同定する、からなる、選択的殺虫活性を有するバ チルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を 産生する方法。 ９、第１菌株は、工程（ａ）の接合の前に、少なくとも１つのプラスミドがキュ アーされている、請求の範囲第８項記載の方法。 １０、特定のプラスミドおよび他のプラスミドをもつ第１菌株を準備し、そして 特定のプラスミド以外の少なくとも１つのプラスミドを第１菌株からキュアーし 、これにより第１菌株より改良された殺虫活性を有する第２のキュアーされた菌 株を産生する、活性が特定のプラスミドでエンコードされた遺伝子により与えら れる、改良された殺虫活性を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｌｓ）菌株を産生する方法。