JPH02287258A - 体液中の感染症原因生物に対する抗体の測定方法およびそのための剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌、ウィルス、寄生虫および真菌に対する
抗体を検出および測定するための免疫化学的、競合的方
法に関する。記載の方法の一変法を用いれば体液中の原
因生物を検出することもできる。更にその方法を行うた
めのテストキットおよびその使用を記載する。

特別な一態様によれば、特に梅毒の場合に抗体の定量的
検出が可能となる。

最近、二重感染していることの多いＨＩＶ患者における
潜伏梅毒の再活性化の重要性が認識されている。神経梅
毒の診断は、かかる患者の免疫学的状態が特別なため、
極めて困難である。

梅毒抗体には極めて様々な検出方法が存在しているが、
このことは、この原因体の場合には早くから（１９０６
年）診断へのかかわりが始まっていたことを反映してお
り、またこれは今世紀初期においてさえ保健政策に多大
な重要性を帯びていた。梅毒抗体の検出方法は三つのカ
テゴリーに区分けすることができる： ■、トレボネーマ特異的でない試験。例：ワラセルマン
反応またはカルシオリピンＣＦＲ。

ＶＤＲＬ試験またはカルシオリビン・マイクロフロキュ
レーション試験、ＲＰＲ試験：　Ｅ、Ｌ、　Ｒｅｅｄ。

Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂ、　（１９６５）
　２３：９６−１０３゜ＶＤＲＬ　ＥＬＩＳＡ　：　Ｎ
、Ｓ、　Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、　Ｏ，ＯｒｕｍおよびＳ、
　Ｍｏｕｒｉｔｓｅｎ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　（１９８７）２５　：　１７１１−１７
１６゜ ■、トレポネーマ特異的な試験、例えばＲｅ１ＬａｒＣ
ＦＲまたはいわゆる鞭毛ＥＬＩＳＡ　（Ｒ，Ｖ、Ｗ、　
　ＶａｎＥｉｊｋ、　Ｈ，Ｅ、　Ｍｅｎｋｅ、　Ｃ；、
Ｊ、　Ｔｉｄｅｍａｎｎ　ａｎｄ　Ｅ。

５ｔｏｌｚ、　Ｇｅｎ１ｔｏｕｒｉｎ、　Ｍｅｄ、　（
１９８８）　６２　：　３６７−３７２）。

■、梅毒トレポネー？　（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌ
ｌｉｄｕｍ）特異的試験、例えばネルソン試験（梅毒ト
レボネーマ固定試験）、蛍光トレポネーマ抗体（ＰＴＡ
）試験（Ｅ、Ｆ、　　Ｈｕｎｔｅｒ、　　Ｗ、Ｅ、　　
ＤｅａｃｏｎおよびＰ、Ｆ、　Ｍｅｙｅｒ、　Ｐｕｂｌ
、旧ｔｈ、　Ｒｅｐ、　（１９６４）７９　：　４１０
−４１２）、梅毒トレボネーマ赤血球凝集アッセイ（Ｔ
ＰＨＡ　：　Ｔ、　ＴｏｍｉｚａｗａおよびＳ、　Ｋａ
ｓａ−ｍａｔｓｕ、　Ｊａｐ、　Ｊ、　ｍａｄ、　Ｓｃ
ｉ、　Ｂｉｏｌ、（１９６６）１９：３０３−３０８）
。ＩｇＧまたはＩｇＭを検出するための間接的酵素イム
ノアッセイは、固相に（通常吸着によって）結合した梅
毒トレボネーマ抗原調製物に対する特異抗体の結合に基
づいている。結合抗体はヒトＩｇＧまたはＩｇ旧こ対す
る酵素標識第二抗体によって検出される。梅毒１ｇＭ検
出のための間接的ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法は、米国特許第４．
２８８．４２６号に記載されている。

まとめると、文献記載のまたは商業的に利用可能な試験
はいずれも許容し得る技術的複雑度、客観的および定量
的試験評価、実質的に自動化可能な手順、および必要と
される高度の感度および特異性という点で、スクリーニ
ング試験に求められる要件を満たしていないということ
ができる。

ＨＩＶに対する抗体を定量的に検出するための競合的Ｅ
ＬＩＳＡは欧州特許比！！［ＥＰ−Ａ　０．２６５．８
５１に記載されている。

細胞培養中の風疹ウィルスを定量するための競合的ＥＬ
ＩＳＡの特定の一態様がＹ、　　Ｖａｒｅｌａ、　　Ｅ
。

ＯｒｔｅｇａおよびＢ、　Ｇｏｍｅｚ、　Ｊ、　Ｖｉｒ
ｏｌ、　ＭｅＬｈ、（１９８８）１９　：　７９−８７
に記載されている。しかしながら、これらの著者は、直
接に標識された風疹特異的抗体を用いていない。ｗｐ＋
　　８６−１３０６８９／２０は風疹抗体を検出するた
めの競合的アッセイ原理の使用を記載している。

本発明の基本的目的は、細菌、ウィルスおよび寄生虫に
対する抗体を高い特異性および高い感度をもって検出す
る方法を開発することである。この試験の意図するとこ
ろは少ないおよび多くの一連の試験を手動的にも、また
実質的に自動的に（例えばＢａｈｒｉｎｇ　ＥＬＩ５Ａ
　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｌ［を用いて）行うことができる
ようにすることにある。スクリーニング試験としてこの
試験の特に意図するところは、病気の流行度の低いこと
を考慮して信頼できる陽性／陰性判別を可能にすること
である。これに関連して、かかる試験は更にＩｇＧ力価
が通常低い、特に感染性の高い早い初期段階を信頼性高
く検出することが重要である。他方、開発されるべき試
験は、より精緻な試験を用いてのみ確認できる偽陽性結
果率を最小限に抑えるｊ；めに高い特異性を有していな
ければならない。今般、適切に選択された接合体（Ｃ０
１ｊｕｇａｔｅ）抗体を用いれば、ある程度異物混入が
あってもよい抗原が直接に、すなわち抗体の介在する結
合を伴わずに結合した固相を用いることにより、梅毒、
トキソプラズマ症、風疹、サイトメガリイ（ｃｙｔｏｍ
ｅｇａｌｙ）　、アメーバ症、包虫症、破傷風および百
日咳の原因生物に対する。　ＩｇＭおよびＩｇＧクラス
両方の抗体を検出し測定する競合的方法が可能となるこ
とを見出した。

純粋なＩｇＧ不合１ｇＭ調製物を用いた実験において特
異的ＩｇＭ抗体も測定される信号を著しく減少させるこ
とを示すことができた（第１図；検体１，２および３）
。

本発明は、担体と該担体に不可逆的に結合した特定の原
因生物の抗原とより成る固相および前記特定の原因生物
の本質的抗原に対する標識抗体を用い、前記固相上の結
合部位に対し抗体間の競合を行わしめることより成り、
そして前記タンパク質は直接に又は非免疫化学的結合ス
ペーサを介して、不可逆的に結合されている、梅毒、ト
キソプラズマ症、風疹、サイトメガリイ、アメーバ症、
包虫症、破傷風および百日咳に対する抗体を検出および
測定するための免疫化学的競合的方法に関する。

梅毒、トキソプラズマ症および風疹の原因生物に対する
抗体の検出および測定方法が好ましい。

更に、本発明は、特定の原因体の抗原が直接にまたは非
免疫化学的結合スペーサを介して結合した担体、該膜タ
ンパク質に対する標識抗体および場合により該標識の検
出用試薬を含む前述の如き免疫化学的競合的方法で抗体
を検出および測定するｌ；めのテストキットに関する。

更に、本発明は、前述のテストキットを、梅毒、トキソ
プラズマ症、風疹、サイトメガリイ、アメーバ症、包虫
症、破傷風および百日咳の原因生物に対する抗体の検出
および測定方法に用いることに関する。

更に、本発明は、信号減少が力価の対数と直線的に関連
付けられる前述の如き方法に関する。

更に、本発明は、検体を未コート容器中でまず接合体抗
体と予めインキュベートし、次いで特定の原因生物の抗
原でコートされた測定容器に移すことより成る、梅毒、
トキソプラズマ症、風疹、サイトメガリイ、アメーバ症
、包虫症、破傷風および百日咳の原因生物の検出および
測定方法に関する。

梅毒陽性血清の力価プロットは、広い力価範囲にわたっ
て直線関係にあり、また相互に並行的である（第１図）
。

力価プロットは間接ＥＬ［ＳＡにおいてこの性質を有し
ていることが知られている。

動物から得た過免疫血清は比較し得る直線性および並行
性を示し、また国際標準の基礎として適している。様々
な検体の抗体含量を定量比較するために、例えば、いわ
ゆる５０％力価、すなわち、陰性対照の信号の５０％に
達する血清希釈度を測定した（第１図）、濃縮血清検体
を試験した際の信号減少はその特異抗体力価と相関する
。驚くべきことに、本発明方法を用いると（陰性対照の
％としての）信号減少が力価の対数に直線的に関係付け
られることが判明した（第２図）。この性質は梅毒抗体
の定量のための特定の態様に用いられる（実施例２参照
）。

５０％力価を示す血清だけが濃縮検体の試験時に測定信
号を陰性対照の５０％以下に減少させることから、縦座
ＩＩ（陰性対照の％としての信号減少）は５０〜１００
％信号減少の測定範囲しか示していない。これまで検査
した検体の９５％以上がこの測定範囲に入る。

信号減少と力価の対数の間の直線関係は、９０％以上の
信号減少を示す血清検体にはもはやあてはまらない（同
じく第１図参照）。（未希釈血清を用いた）スクリーニ
ング試験の後、かかる検体は予め希釈（例えば１　：　
２０）　した後もう一度再試験しなければならない。少
くとも２つの標準血清（または標準血清の２つの異なる
希釈液）がこの方法を定量的に行う場合に含まれる場合
、第８図に示される如く直線的内挿により力価または抗
体含量を国際単位で測定することができる。この直線的
内挿は、計算により、そして好ましい評価様式において
は、コンピュータプログラムを用いて行うこともできる
。

更にまた前記方法により血清検体の力価測定および試験
を行った結果、競合的ＥＬＩＳＡよりの力価はＴＰＨＡ
よりのものと直線的に関連付けられることが認められた
（第３図）。

本試験の高い感度は、すべての段階の梅毒患者からの多
数の臨床的に規定された血清検体を試験することにより
実証された（第４図）。高い特異性は、自己免疫病患者
、ボレリア症（ｂｏｒｒｅｌ　１ｏｓｉｓ）患者および
多くの健常供血症からの検体の陰性反応によって実証さ
れる（第４図）。

更にまた、驚くべきことに、特別な態様においては、す
なわち、未コート容器内で検体を接合体抗体と予めイン
キュベートし次いでその容器内に移すことにより抗原を
検出することができることも認められた。可溶性のＭＪ
Ｍ等価物がこの試験混合物において測定信号を著しく低
下させることは実験によって確認することができた（第
５図）。

定性用の競合的ＥＬ　Ｉ　ＳＡは、特に（それだけでは
ないが）技術的手順が簡単なため、多量の検体を約３時
間内に試験することができる。特異的１ｇＭを付加的に
検出するため、特異的１ｇＧが不存在であっても、感染
の極めて初期の段階にむいてさえ、極めて鋭敏な検出が
可能となる。特別な一態様においては、すなわち、検体
をＰＯＤ標識抗体と予めインキュベートし次いで測定容
器に移した後に、抗原を検出することもできる。

定量用の競合的ＥＬＩＳＡは、例えば梅毒診断において
、（１ｇＭ特異的試験のほかに）抗生物質療法の結果を
評価し、または病気の段階を評価するために重要なデー
タを提供する。この関連でＴＰＨＡとは良好に相関する
ことを強調しておく必要がある。

更に、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎ
ｄｉｉ）および風疹ウィルスに対する抗体の検出にもこ
の原理が有用であることも実証された。接合体抗体の選
択により試験の特異性を向上させ、そしてそれ故に、一
定の状況下での抗原の精緻で大規模な精製を不要にでき
ることは特に有利なこととして考えられる。

固相に適した抗原調製物は、自体知られた方法によって
得ることができる。その−例はＷＯ３３１０２８８６に
よる梅毒トレポネーマである。この場合トレポネーマは
感染ウサギの季丸から得られ、そして非イオン洗剤であ
るｎ−オクチルグルコシドを用いて抽出される。

固相に適した担体材料は、プラスチック、例えばポリス
チレン、ポリビニルクロライド、ポリアミドおよびその
他の合成ポリマー、天然ポリマー例えばセルロース、お
よび誘導体化された天然ポリマー、例えばセルロースア
セテートおよびニトロセルロース、そのほかガラス、特
にガラス繊維などである。

前記担体は微粒子（０，０１〜１μ＋Ｘ）、ビーズ、杆
体（ロンド）、管体（チューブ）およびマイクロアッセ
イ・プレートの形態であってよい。

シート様構造物、例えば帯状用紙、小プレートおよび膜
なども適している。それら担体の表面は水性溶液に対し
透過性、非透過性のいずれであってもよい。

好ましい担体はビーズ、微粒子、管体、帯状用紙および
膜である。特に好ましい担体はマイクロアッセイ・プレ
ートである。

固相は抗原調製物を担体に不可逆的に結合することによ
って作られる。

本発明にいうところの不可逆的結合は、例え■）免疫化
学剤例えば高親和性抗体によって、また本方法に用いら
れる剤、例えば抗体、および希釈および緩衝溶液によっ
ても破壊されない吸着による結合、 ２）非免疫学的に結合したスペーサーが介在シたバイオ
アフイニテイ結合（該スペーサーはビオチンとアビジン
とで、あるいはその他の受容体・リガンド接３合体で構
成されていてもよい）、 ３）直接の共有結合、 ４）二官能性化学的スペーサーが介在した共有結合 の場合に存在する。

透水性担体が用いられる場合には共有結合性の結合が好
ましく、また透水性および非透水性担体が用いられる場
合には、吸着による結合が好ましい。

担体としてのガンマ線処理されたポリスチレンへの抗原
調製物の吸着による直接結合が特に好ましい。

接合体担体に用いられる出発材料は、特定の原因生物に
対し陽性血清像を有する供血者からの血清プールである
。単クローン抗体も同じく適当である。

マーカーとしては、放射性同位元素、蛍光および化学光
色素、および色素原性、発光原性または蛍光原性基質系
により検出し得る酵素を用いることができる。

標識は、前記マーカーについて従来技術として記載され
た方法によって行われる。

抗体をペルオキシダーゼで標識する場合、Ｎａｋａｎｅ
　ｅｔ　ａｔ、、　１９７４．　Ｊ、　Ｈ４ｓｔｏｃｈ
ｅｍ、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ。

２２、　１０８４−１０９０の過沃素酸塩法、または相
手同士をヘテロニ官能性試薬を結合するｌ　ｓｈ　ｉｋ
ａｗａａｔ　ａ＋、、　　１９８３．　　Ｊ、　　Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ　　４　、　２０９−３２７の方法
を用いることができる。

本発明方法は、例えば前述の結合抗原調製物を含むマイ
クロアッセイプレートの凹所（ウェル）中に、 ａ）同時に検体および標識抗体溶液を、適切な場合には
まず検体を一定時間後に標識抗体溶液を導入し、その溶
液を規定されたインキュベーション時間後に除去しそし
てそれらウェルを緩衝液で洗浄し、次いでそれらウェル
内の標識を測定するか、または ｂ）まず標識抗体含有溶液を導入しその溶液を規定され
たインキュベーション時間後に除去し、そしてそれらウ
ェルを緩衝液で洗浄し、適切な場合にはそのマイクロア
ッセイプレートを乾燥し、次いで希釈検体を添加しそし
て規定された時間の間インキュベートし、次いでその検
体をウェルから除去し、そして検体中の標識を測定する ことによって行うことができる。

本発明方法は固相および乾燥状態で所要試薬の一部また
はすべてを含む診断要素を用いて行うこともできる。

好ましい一態様においては、本発明方法は原因生物の検
出および測定に用いることができる。

これは、例えばまず検体および標識抗体溶液をマイクロ
アッセイグレートの未コート凹所中でインキュベートす
ることにより行われる。規定時間の後、予めインキュベ
ートされた溶液を抗原でコートされた凹所に移す。規定
インキュベーション時間の後、その溶液を除去し、その
凹所を適切な場合には緩衝液で洗浄し、次いでその凹所
中の標識を測定する。

以下の実施例は本発明を例示するためのものであって実
施例中に特定された態様に限定するものではない。

実施例： １、マイクロアッセイプレートへの梅毒トレポネーマ抗
原： 梅毒トレボネーマスピロヘータは、１０〜１５日前に生
きた原因生物で感染させたウサギ車丸から得られる。そ
れらトレポネーマを４８　、０００　Ｘ　ｙで遠心分離
することにより０．１Ｍホスフェート緩衝液で３回洗浄
し、１０’／ｍΩの生物数まで調節し、そしてｗｏ　８
３１０２８８６に記載の如く非イオン洗剤であるｎ−オ
クチルグルコシドを用いて抽出する。

このようにして得られた０、２ｒｎｇ／ｍＱより低いタ
ンパク質含量を有する抗原溶液を、１：５０．１００．
１５０．２００．３００．４００．６００および８００
という様々な希釈度で希釈する。アッセイプレートとし
て好ましいのは、Ｎｕｎｃ（Ｒｏｓｋｉｌｄａ、　Ｄｅ
ｎｍａｒｋ）製の分割可能なポリスチレン製微量力価測
定プレートである。異なる各希釈液について各ウェル中
に１００μαを入れた１枚のアッセイプレートを作成す
る。

抗原溶液を加えたアッセイブレートを２０°Ｃに１８時
間放置し、次いでウェル内溶液を吸引し、そしてそれら
ウェルを、０．２％牛血清アルブミン含有Ｌｒ１ｓ／ク
エン酸溶液（０，０５Ｍ、　ｐＨ７，４）を充填し吸引
することにより３回洗浄し、そしてそれらアッセイプレ
ートを次いでシリカゲル上、２０°Ｃで乾燥する。

接合体抗体に用いられる出発材料は梅毒陽性血清像を有
する供血者からの血清プールである。

要件はＴＰＨＡにおける最小力価がｌ　：　１０．００
０より大でありモしてＶＤＲＬおよびカルシオリビンＣ
ＦＲ力価陽性であることである。かかる血清は梅毒トレ
ボネーマ・ウェスターンプロットにおいて複数の反応性
バンドを有する複雑なパターンを示す。

その血清を３０ｍＭ　ＮａｔＨＰＯ４／　ＮａＨｚＰＯ
４（ｐＨ７，２）緩衝液に対して透析し、そしてＤＥＡ
Ｅ−セルロース　ＤＥ　３２　（Ｗｈａ、ｔｍａｎ）を
充填し、同じ緩衝液で平衡させたカラムにかける。流過
液（ｆｌｏｗ−Ｌｈｒｏｕｇｈ）中に含まれるＩｇＧ画
分をＰＢＳに対して透析し、そして１０ｍｇ／ｍ１２１
：調節する。この方法によれば特定の抗体特異性の損失
は生じることなく、また有意な力価低下も生じないこと
が確認された。ＧＭＢＳを通してのペルオキシダーゼ標
識の抗体への結合はＥＰ−Ａ−０２６５８５１に詳述さ
れている。

３、梅毒トレボネーマに対するヒト抗体の定性民順 血清、血漿またはＣＳＦ　（各々２５μ＋２）を抗梅毒
トレポネーマアツセイプレートのウェルに導入し、そし
て３７℃で１時間インキュベートした。

それらプレートをラッパーフィルムでカバーした。次い
で、１００μＱの抗・梅毒トレポネーマ／ＰＯＤを各ウ
ェルに添加し、そしてそのアッセイブレートを更に１時
間３７℃でインキュベートした。ウェルの内容物を吸引
により除去し、そしてそれらウェルを洗浄用緩衝液で４
回洗浄した。

１００／１ｆｆのＴＭＢ基質調製物を各ウェルに導入し
、２０〜２２℃で３０分間インキユベートシ、そしてイ
ンキュベーションを１００μαのＩＮ硫酸を添加するこ
とにより止めた。呈色した溶液のＯＤ　　４５０をＰＢ
Ｓを基準として用いて測定した。陰性対照血清のＯＤの
６０％より低いＯｒＪを有する検体は抗梅毒トレポネー
マ陽性のカテゴリーに入れ、そのＯＤ　４５０が陰性対
照の６０〜７０％の範囲である検体は抗梅毒トレボネー
マ疑陽性（ｍａｒｇｉｎａｌ）のカテゴリーに入れ、そ
して陰性検体の７０％より高いＯＤ　４５０を有する検
体は抗梅毒トレボネーマ陰性のカテゴリーに入れた。第
４図は１２８個の梅毒陽性検体、８０個の自己免疫病患
者血清検体、５３個のボレリア症患者からの検体、およ
び７１個の臨床的に健常な供血者からの検体の頻度分布
（ヒストグラム）を示す。

この図から、陽性群は陰性群からはっきりと分かれてい
るが、自己免疫病患者のおよび正常供血者の血清の一つ
は陽性域にあることが明白である。この試験で陽性信号
を与えたすべての検体は、他の方法による比較試験によ
り確認され　Ｉこ　。

４、梅毒トレポネーマに対するヒト抗体の定量測定 試験手順は実施例３に記載のものに相当する。

高力価血清プール（ＴＰＨＡ力価＞　１　：　１０００
０）をまず、陰性血清中でｌ：ｌ、１：４．１：１６．
１：６４およびｌ：２５６の割合で段階希釈しｔ；。

これらの希釈血清検体は、天然血清に期待される力価範
囲を代表している。次にそれら検体を各場合につきＰＢ
Ｓ　（ｐＨ７，２）中、３倍希釈による様々な希釈度を
用いて力価測定した。同じ試験デザインを用いて、標準
血清Ｌ３を８段ｒ！！（３倍希釈）で力価測定し、また
付加的に（二重測定により）１：２０および１　：、ｓ
ｏｏという異なる希釈度に含めた。力価プロットは第１
図に示されたプロットと比較し得る変化を示した。前記
５つの希釈血清検体の５０％力価はまず、第１図に示さ
れる如く測定されそして標準血清Ｌ３の５０％力価（基
準値４０１ＬＩ）に関係付けた。最後に、各員なる希釈
度の希釈血清検体の含量（ＩＵ単位）を計算により測定
し、そして（５０％法により）グラフ的に測定された値
に対してプロットした。

５、可溶性梅毒トレポネーマ抗原の検出この試験デザイ
ンにおいて、血清検体に代えて６０μＱの抗原溶液をセ
クション４のお載と同様にしてＰＢＳ希釈しく　１０’
ｍ菌当ｆｋ／ｍＱより、３倍希釈）、そして未コートマ
イクロタイタープレート中、３７°Ｃで１時間、至適で
あるとして測定された接合体希釈液（６０μａ）と共に
インキュベートした。この混合物ｌＯＯμａをアッセイ
プレート中に移した後、それを３７６０でもう１時間イ
ンキュベートし、そして４回洗浄後、試験を実施例３に
記載の如く基質の添加および評価により行った。第５図
は、０．１−１μｇ／ｍαに対応して１０’〜１０’細
菌／ｒａＱ以上の生物数がこの方法により検出できるこ
とを示している。

微量力価測定プレートの凹所に各々０．０１Ｍ重炭酸塩
緩衝液（ｐＨ９，５）中の（ＲＨ株の）トキソプラズマ
超音波抗原の溶液１００μαを加え、そして室温に２０
時間放置する。それらプレートを実施例１の如く洗浄し
乾燥する。

高力価抗血清を取得するために、ウサギを同じ抗原を用
いて標準的方法により３週間にわたり免疫する。ＤＥ分
画法および西洋わさびペルオキシダーゼへのＧＭＢＳ接
合法も同じ〈実施例２に記載されている。競合的ＥＬ　
Ｉ　ＳＡを行うに際し、まず、血清検体を２５μαずつ
アッセイプレート中に導入し、そして１５分間以内にＰ
ＢＳ中の接合体抗体を１００μαずつ添加する。３７℃
で１時間インキュベーションした後、試験混合物を３に
記載の如く４回洗浄する。色素Ｊｉｉ（ＴＭＢを添加後
、お載の如く試験を行い、評価する。

比較のために、ウサギよりの抗−ヒトＩ　ｇＧ／ＰＯＤ
接合体を用いた間接１ｇＧ　ＥＬＩＳＡ　（Ｅｎｚｙｇ
ｎｏｓｔトキソプラズマ症／ＩｇＧ）において８０個の
供血者血清群についても１：２３１に血清希釈して試験
する。第６図はそれら方法が極めて良好に一致すること
を示しているが、競合的ＥＬＩＳＡの方がより良好な陽
性／陰性弁別および技術的により簡単な手順を与える。

感度が比較し得るものであることは、陽性標準血清の力
価測定系列の反応結果から明白である（第６図参照）。

７、風疹ウィルスに対する血清抗体の検出のだマイクロ
アッセイプレートのコーティングおよび試験手順は６に
記載の方法と同様の方法で行った。風疹ウィルス（ＲＡ
２７／３株）をＢＨＫ細胞細胞層養し、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）６０００を用いてその細胞培養上清
から沈殿させ、そしてＬａｕｆｓおよびＴｈｏｍｓｓｅ
ｎ　（Ａｒｃｈ、　Ｇｅｓ、　Ｖｉｒ−ｕｓｆｏｒｓｃ
ｈｕｎｇ　（１９６８）　２４　：　１６４−１８０）
に記載の方法に従ってＴｖｅｅｎ　８０／ジエチルエー
テル処理に付した。プレートをコーティングするために
、可溶性抗原をＰＢＳ　（ｐＨ７，２）に溶解した。抗
体−ＰＯＤ接合体を調製するために、５名を超える供血
者からの高力価血清プール（各側についてｌ　：　１０
０００より大きいＥＬＩＳＡ　　ＩｇＧ力価）をＥＰＯ
，２６５，８５１に記載の方法により分画し、そして純
粋なＩｇＧ画分をＧＭＢＳ法により西洋わさびペルオキ
シダーゼに結合した。

血清の選択に際しては、間接１ｇＧ　ＥＬＩＳＡにおけ
る対照抗原に対するその反応性がなるべく低くなるよう
に留意した。９０個の供血者血清群を実施例６に記載さ
れた詳細と同様にして、間接ＩｇＧ　ＥＬ［ＳＡ　（血
清希釈度１　：　２３１　；ウサギよりの抗−ヒ）　Ｉ
ｇＧ）および競合的ＥＬＩＳＡで試験し比較した。

８、本方法のリニア化 多異なる抗原希釈液の個々のバー（ｂａｒ）において、
まず梅毒陰性供血者血清の存在下に接合体力価測定を行
う。そのために、まず血清検体を２５μαずつ３７°Ｃ
で１時間インキュベートし、次いで抗−梅毒トレボネー
マ／　ＰＯＤ接合体１００μαずつをｌ：５０．１００
．１５０．２００．３００．４００．６００および８０
０希釈列（ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２．０−３Ｍ、　ｐＨ７，
２）に添加し、そしてもう１時間３７°Ｃでインキュベ
ートする。０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０含有ＰＢＳ　（ｐ
Ｈ７，２）で４回洗浄した後、１００μａのＴＭＢ基質
調製物を各つエルに添加しそして２０〜２２℃で３０分
間インキュベートする。そのインキュベーションを各々
に１００μａのＩＮ硫酸を添加することにより止める。

ＰＢＳを基準として用いて４５０ｎｍにおける溶液の吸
光度を測定する。ｌ、５〜１．８の吸光度（ＯＤ　４５
０）を有する抗原／接合体組合せを以後の至適化実験に
選択する。

もう一つの試験デザインにおいては、従来試験における
梅毒トレボネーマ特異抗体含量の知られている血清検体
を、各側につき相互に調節された抗原／接合体濃度を用
いて試験した。適切であるとして選ばれた抗原／接合体
組合せは、信号減少が力価の対数に対し直線関係にある
ものである。例えば、ｌ：３００抗原希釈液（約０．７
μｇ／ｍＱに相当する）およびｌ：２０接合体希釈液を
用いると至適結果が得られる。抗−梅毒トレボネーマの
測定には、００４５０が陰性対照の吸光度の７０％より
大である場合に梅毒陰性、そしてＯＤ　４５０が７０％
より小である場合に梅毒陽性であるように範囲設定する
のが有益であるとされるから、抗−梅毒トレポネーマ測
定用マイクロアッセイプレート製造のためのウェルの処
理（これはコーティングとも呼ばれる）には約１μｇ／
ｍＱの濃度が選択される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、競合的梅毒ＥＬＩＳＡに代表的な力価測定プ
ロット（血清検体１，２および３は陰性血清にそった純
粋なＩｇＭ画分を表わす）を示す。 第２図は、信号減少（％単位）と５０％力価の対数との
相関関係（４８個の梅毒陽性血清検体について）を示す
。 第３図は、競合的ＥＬＩＳＡ　（Ｅｎｚｙｇｎｏｓｔ梅
毒）のＴＰＨＡ　（Ｃｅｌｌｏｇｎｏｓｌ）Ｅ毒、Ｈ）
との相関関係を示す。 第４図は、全測定範囲にわたる梅毒陽性（陰性対照の信
号の６０％より小）および梅毒陰性（陰性対照の信号の
７０％より大）血清検体の頻度分布（ヒストグラム）を
示す。 第５図は、直線内挿による算出された力価（＋’Ｕ単位
）とグラフ的に測定されたものとの相関関係を示す。強
度の異なる５個の血清検体についての測定値を検体希釈
度の関数として示している。 第６図は、競合的ＥＬＩＳＡ　（修正法）における信号
減少の抗原濃度への依存性を示す。 第７図は、間接（ＩｇＧ）　ＥＬＩＳＡ　（Ｅｎｚｙｇ
ｎｏｓｔ　トキソプラズマ症／ＩｇＧ）および競合的ト
キソプラズマ抗体ＥＬＩＳＡにおける測定値の比較（８
０個の健常で無症候性の供血者の血清）を示す。この図
は競合的ＥＬＩＳＡの方が間接ＥＬＩＳＡよりもはっき
りとした陽性／陰性弁別が可能となることを示している
。 第８図は２つの標準血清または標準血清の２つの異なる
希釈液からの直線内挿にょる力価または抗体含量の測定
を例示するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）梅毒、トキソプラズマ症、風疹、サイトメガリイ、
   アメーバ症、包虫症、破傷風、および百日咳に対する抗
   体を検出および測定する免疫化学的競合的方法であって
   、担体と該担体に不可逆的に結合した特定の原因生物の
   抗原とより成る固相および前記特定の原因生物の本質的
   抗原に対する標識抗体を用い、前記固相上の結合部位に
   対し、抗体間の競合を行わしめることより成り、そして
   前記タンパク質は直接にまたは非免疫化学的結合スペー
   サを介して不可逆的に結合されていることを特徴とする
   前記方法。 ２）原因生物が梅毒、トキソプラズマ症および風疹の原
   因生物である請求項１記載の方法。 ３）抗原／抗体接合体組合せを信号減少が力価の対数に
   対し直線的に関係付けられるように調節する請求項１記
   載の方法。 ４）評価を、特に適切なコンピュータプログラムを用い
   た、計算により行う請求項３記載の方法。 ５）特定の原因体の抗原が直接にまたは非免疫化学的結
   合スペーサを介して結合した担体、該抗原に対する標識
   抗体、場合により該標識の検出用試薬を含む請求項１記
   載の免疫化学的競合的方法により抗体を検出および測定
   するためのテストキット。 ６）固相および乾燥状態で検出および測定に必要な試薬
   の一部またはすべてが含まれる要素より成る請求項５記
   載のテストキット。 ７）請求項５〜７のいずれかに記載のテストキットの、
   梅毒、トキソプラズマ症、風疹、サイトメガリイ、アメ
   ーバ症、包虫症、破傷風、および百日咳の原因生物に対
   する抗体の検出および測定方法への使用。 ８）梅毒、トキソプラズマ症、風疹、サイトメガリイ、
   アメーバ症、包虫症、破傷風、および百日咳に対する抗
   体を検出および測定する免疫化学的競合的方法であって
   、担体と該担体に不可逆的に結合した特定の原因生物の
   抗原とより成る固相、および前記特定の原因生物の本質
   的抗原に対する標識抗体を用い、検体をまず試験容器外
   で予め標識抗体とインキュベートしておいてから固相に
   添加して該固相上の結合部位に対し抗体間の競合を行わ
   しめることより成り、そして前記抗原は直接にまたは非
   免疫化学的結合スペーサを介して不可逆的に結合されて
   いることを特徴とする前記方法。