JPH022372A - 活性化されたヒトプロテインｃの直接発現のためのベクターおよび化合物 - Google Patents
活性化されたヒトプロテインｃの直接発現のためのベクターおよび化合物Info
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- JPH022372A JPH022372A JP63306784A JP30678488A JPH022372A JP H022372 A JPH022372 A JP H022372A JP 63306784 A JP63306784 A JP 63306784A JP 30678488 A JP30678488 A JP 30678488A JP H022372 A JPH022372 A JP H022372A
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒトプロティンＣ活性をコードしている新規
ＤＮＡ化合物および絹換えＤＮＡクローニングベクター
を提供するものである。これらベクターは、ヒトプロテ
ィンＣをその活性型で発現させる簡単かつ効率的な手段
を与える。プロティンＣを得るための従来法は、高レベ
ルのトロンビン、またはトロンビンとトロンボモジュリ
ン、または他の活性化用の高価な酵素による処理を必要
とする不活性型のプロティンＣ（酵素前駆体）を製造す
ることからなっていた。本発明は、タンパク質加水分解
切断部位をコードしているＤＮＡをプロティンＣの暗号
配列中に導入することにより、組換え宿主細胞中で活性
化プロティンＣを直接発現させるベクターを提供するこ
とによって上記のめんどうな活性化工程を回避する活性
化プロティンＣの製造方法を提供するものである。
ＤＮＡ化合物および絹換えＤＮＡクローニングベクター
を提供するものである。これらベクターは、ヒトプロテ
ィンＣをその活性型で発現させる簡単かつ効率的な手段
を与える。プロティンＣを得るための従来法は、高レベ
ルのトロンビン、またはトロンビンとトロンボモジュリ
ン、または他の活性化用の高価な酵素による処理を必要
とする不活性型のプロティンＣ（酵素前駆体）を製造す
ることからなっていた。本発明は、タンパク質加水分解
切断部位をコードしているＤＮＡをプロティンＣの暗号
配列中に導入することにより、組換え宿主細胞中で活性
化プロティンＣを直接発現させるベクターを提供するこ
とによって上記のめんどうな活性化工程を回避する活性
化プロティンＣの製造方法を提供するものである。
発明の背景および従来技術
ビタミンに依存性の血漿タンパク質であるプロティンＣ
は、主として止血のコントロールにおいて生理学的な重
要性を有する。プロティンＣは不活性分子として合成さ
れる（本明細書では形成期プロティンＣと呼ぶ）。この
形成期プロティンＣは複雑なプロセッシングを経て、以
下さらに詳しく説明する多数の別種不活性分子を生成す
る。不活性な、分泌された形のプロティンＣを本明細書
では酵素前駆体プロティンＣと呼ぶ。プロティンＣの活
性化は、トロンボモジュリンートロンピンフンプレノク
スが関与する反応により血液中で起こる。活性化された
プロティンＣは、その補助因子プロティンＳとともに、
生理学的に重要な抗凝固剤である。活性化されたプロテ
ィンＣは、血管内の血栓症を防止することができ、既存
の面餅の拡大を抑制することができる。活性型プロティ
ンＣの作用機序、および不活性酵素前駆体の活性プロテ
アーゼへの活性化機序はこの数年の間に明らかにされて
いる［Ｊ、 Ｅ、 Ｇａｒｄｉｎｅｒ ａ’ｎｄ Ｊ、
ｔｌ、 ＧｒｉｆＴｉｎ、 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
Ｉｌｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、ＸＩＩＩ、 ２６
５−２７８頁＋ Ｅｌｍｅｒ Ｂ、 Ｂｒｏｗ
ｎ ｍ、 Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ ５ｔｒａＬｔ
ｏｎ。
は、主として止血のコントロールにおいて生理学的な重
要性を有する。プロティンＣは不活性分子として合成さ
れる（本明細書では形成期プロティンＣと呼ぶ）。この
形成期プロティンＣは複雑なプロセッシングを経て、以
下さらに詳しく説明する多数の別種不活性分子を生成す
る。不活性な、分泌された形のプロティンＣを本明細書
では酵素前駆体プロティンＣと呼ぶ。プロティンＣの活
性化は、トロンボモジュリンートロンピンフンプレノク
スが関与する反応により血液中で起こる。活性化された
プロティンＣは、その補助因子プロティンＳとともに、
生理学的に重要な抗凝固剤である。活性化されたプロテ
ィンＣは、血管内の血栓症を防止することができ、既存
の面餅の拡大を抑制することができる。活性型プロティ
ンＣの作用機序、および不活性酵素前駆体の活性プロテ
アーゼへの活性化機序はこの数年の間に明らかにされて
いる［Ｊ、 Ｅ、 Ｇａｒｄｉｎｅｒ ａ’ｎｄ Ｊ、
ｔｌ、 ＧｒｉｆＴｉｎ、 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ
Ｉｌｅｍａｔｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ、ＸＩＩＩ、 ２６
５−２７８頁＋ Ｅｌｍｅｒ Ｂ、 Ｂｒｏｗ
ｎ ｍ、 Ｇｒｕｎｅ ａｎｄ ５ｔｒａＬｔ
ｏｎ。
Ｉｎｃ、、 １９８３を参照］。
プロティンＣの活性化には、トロンビン、凝固カスケー
ドの最後のセリンプロテアーゼ、およびトロンボモジュ
リンと呼ばれる内皮細胞膜関連の糖タンパク質が関与し
ている。トロンボモジュリンはトロンビンと強固かつ化
学量論的なコンプレックスを形成する。トロンビンとコ
ンプレックス化したときのトロンボモジュリンはトロン
ビンの機能的な性質を完全に変化させる。通常、トロン
ビンはフィブリノーゲンを凝固させ、血小板を活性化し
、血餅形成の補助因子■および■をその活性型であるＶ
ａおよび■ａに変換する。最後に、トロンビンはプロテ
ィンＣを活性化するが、それは極めてゆっくりであり、
非効率的なものでしかない。
ドの最後のセリンプロテアーゼ、およびトロンボモジュ
リンと呼ばれる内皮細胞膜関連の糖タンパク質が関与し
ている。トロンボモジュリンはトロンビンと強固かつ化
学量論的なコンプレックスを形成する。トロンビンとコ
ンプレックス化したときのトロンボモジュリンはトロン
ビンの機能的な性質を完全に変化させる。通常、トロン
ビンはフィブリノーゲンを凝固させ、血小板を活性化し
、血餅形成の補助因子■および■をその活性型であるＶ
ａおよび■ａに変換する。最後に、トロンビンはプロテ
ィンＣを活性化するが、それは極めてゆっくりであり、
非効率的なものでしかない。
対照的に、トロンボモジュリンとコンプレックス化した
トロンビンはフィブリノーゲンを凝固させず、血小板を
活性化せず、あるいは血餅形成の補助因子Ｖおよび■を
その活性型であるＶａおよび■ａに変換しないが、極め
て効率のよいプロティンＣの活性化因子となる。トロン
ボモジュリントロンビンによるプロティンＣ活性化の速
度定数はトロンビン単独の速度定数のＩ ０００倍以上
である。
トロンビンはフィブリノーゲンを凝固させず、血小板を
活性化せず、あるいは血餅形成の補助因子Ｖおよび■を
その活性型であるＶａおよび■ａに変換しないが、極め
て効率のよいプロティンＣの活性化因子となる。トロン
ボモジュリントロンビンによるプロティンＣ活性化の速
度定数はトロンビン単独の速度定数のＩ ０００倍以上
である。
活性化されたプロティンＣがどのようにして息液凝固を
下方調節するのかを理解するため１７Ｍ固酵素系の簡単
な説明を以下に挙げる。凝固系は、酵素前駆体の活性セ
リンプロテアーゼへの逐次活性化からなる連鎖反応と考
えるのが最もよい。この連鎖反応により最後には酵素ト
ロンビンが生成し、これが限定されたタンパク質加水分
解により血漿のフィブリノーゲンを不溶性ゲルのフィブ
リンに変換する。この凝固カスケードにおける２つの鍵
となる現象は、凝固形成因子ＩＸａによる凝固形成因子
ＸのＸａへの変換、および凝固形成因子Ｘａによるプロ
トロンビンのトロンビンへの変換である。この両者反応
は、細胞表面、とりわけ血小板表面で起こり、両反応は
補助因子を必要とする。系中の主補助因子、即ち因子■
および■は、比較的不活性な前駆体として循環している
が、トロンビンの最初の数分子が生成すると、トロンビ
ンか輪（ループ）を後戻りし、限定されたタンパク質加
水分解により補助因子を活性化する。活性化された補助
因子Ｖａおよび■ａは、プロトロンビンのトロンビンへ
の変換、および因子Ｘの因子Ｘａへの変換の両方を約５
オーダー促進する。活性化されたプロティンＣは優先し
て凝固形成補助因子Ｖａおよび■ａ（不活性な凝固形成
因子■および■の活性型）をタンパク質加水分解により
減成し、加水分解し、そして不可逆的に破壊するように
作用する。対照的に、凝固形成因子■および■は活性化
されたプロティンＣの基質となることが極めて少ない。
下方調節するのかを理解するため１７Ｍ固酵素系の簡単
な説明を以下に挙げる。凝固系は、酵素前駆体の活性セ
リンプロテアーゼへの逐次活性化からなる連鎖反応と考
えるのが最もよい。この連鎖反応により最後には酵素ト
ロンビンが生成し、これが限定されたタンパク質加水分
解により血漿のフィブリノーゲンを不溶性ゲルのフィブ
リンに変換する。この凝固カスケードにおける２つの鍵
となる現象は、凝固形成因子ＩＸａによる凝固形成因子
ＸのＸａへの変換、および凝固形成因子Ｘａによるプロ
トロンビンのトロンビンへの変換である。この両者反応
は、細胞表面、とりわけ血小板表面で起こり、両反応は
補助因子を必要とする。系中の主補助因子、即ち因子■
および■は、比較的不活性な前駆体として循環している
が、トロンビンの最初の数分子が生成すると、トロンビ
ンか輪（ループ）を後戻りし、限定されたタンパク質加
水分解により補助因子を活性化する。活性化された補助
因子Ｖａおよび■ａは、プロトロンビンのトロンビンへ
の変換、および因子Ｘの因子Ｘａへの変換の両方を約５
オーダー促進する。活性化されたプロティンＣは優先し
て凝固形成補助因子Ｖａおよび■ａ（不活性な凝固形成
因子■および■の活性型）をタンパク質加水分解により
減成し、加水分解し、そして不可逆的に破壊するように
作用する。対照的に、凝固形成因子■および■は活性化
されたプロティンＣの基質となることが極めて少ない。
活性化プロティンＣ用の重要な補助因子は、別のビタミ
ンに依存性の血漿タンパク質であるプロティンＳである
。プロティンＳは、活性化プロティンＣか介する因子Ｖ
ａおよび■ａの加水分解を実質的に２５倍増加させる。
ンに依存性の血漿タンパク質であるプロティンＳである
。プロティンＳは、活性化プロティンＣか介する因子Ｖ
ａおよび■ａの加水分解を実質的に２５倍増加させる。
プロティンＣは有用な治療剤であると認識されている［
例えば、欧州特許公開Ｎｏ、 ０２１５５４８およびＮ
ｏ、 ０１９１６０６を参照コ。活性化されたプロテ
ィンＣは、現在利用可能な抗凝固剤（ヘパリンや経口の
ヒドロキノクマリン型の抗凝固剤）よりも広い治療イン
デックスを有する新規な抗血栓症剤である。
例えば、欧州特許公開Ｎｏ、 ０２１５５４８およびＮ
ｏ、 ０１９１６０６を参照コ。活性化されたプロテ
ィンＣは、現在利用可能な抗凝固剤（ヘパリンや経口の
ヒドロキノクマリン型の抗凝固剤）よりも広い治療イン
デックスを有する新規な抗血栓症剤である。
凝固形成因子■をＶａに、モして■を■ａに変換するの
にトロンビンが必要とされるので、酵素前駆体のプロテ
ィンＣも活性化されたプロティンＣもトロンビンが生成
するまでは有効ではない；活性型のこれら２種類の補助
因子は活性化プロティンＣの好ましい基質である。また
、トロンボモジュリン−トロンビンのコンプレックスが
ないとプロティンＣ酵素前駆体がその活性型に変換され
ないので、酵素前駆体のプロティンＣを活性化するのに
トロンビンが必要とされる。
にトロンビンが必要とされるので、酵素前駆体のプロテ
ィンＣも活性化されたプロティンＣもトロンビンが生成
するまでは有効ではない；活性型のこれら２種類の補助
因子は活性化プロティンＣの好ましい基質である。また
、トロンボモジュリン−トロンビンのコンプレックスが
ないとプロティンＣ酵素前駆体がその活性型に変換され
ないので、酵素前駆体のプロティンＣを活性化するのに
トロンビンが必要とされる。
活性化プロティンＣは補助因子Ｖａおよび■ａを不活性
化することによって作動するので、活性化プロティンＣ
は要求があって働く抗凝固剤である。
化することによって作動するので、活性化プロティンＣ
は要求があって働く抗凝固剤である。
因子■および〜１をその活性型のＶａおよび■ａに変換
するのにトロンビンが必要とされるので、プロティンＣ
はトロンビンが生成した後にだけ抗凝固剤として作用す
る。活性化プロティンＣとは対照的に、通常の抗凝固剤
はそれが患者に投与されて循環している間はずっと一定
の抗凝固状態を維持するので、出血合併症の危険がプロ
ティンＣあるいは活性化プロティンＣのときより実質的
に増加する。このように、活性化プロティンＣは要求が
あって作動する抗凝固剤であり、ヘパリンやヒドロキノ
クマリン類に代わるものとして広い臨床用用途を有して
いる。
するのにトロンビンが必要とされるので、プロティンＣ
はトロンビンが生成した後にだけ抗凝固剤として作用す
る。活性化プロティンＣとは対照的に、通常の抗凝固剤
はそれが患者に投与されて循環している間はずっと一定
の抗凝固状態を維持するので、出血合併症の危険がプロ
ティンＣあるいは活性化プロティンＣのときより実質的
に増加する。このように、活性化プロティンＣは要求が
あって作動する抗凝固剤であり、ヘパリンやヒドロキノ
クマリン類に代わるものとして広い臨床用用途を有して
いる。
遺伝性のプロティンＣ欠損などのある疾患状態では、プ
ロティンＣ酵素前駆体は大きな治療上の重要性を有する
。先天的なホモ接合のプロティンＣ欠損では、その患者
は極めて幼い時に、致死型の播種住血管内凝固を伴うこ
とが多い電撃性紫斑病で死んでしまう。ヘテロ接合のプ
ロティンＣ欠損では、その患者は重篤な、再発性の血栓
塞栓に苦しむ。血友病Ｂあるいは因子ＩＸ欠損を治療す
るために設計した血漿タンパク質濃縮物（不純物として
プロティンＣを含んでいる）はへテロ接合性のプロティ
ンＣ欠損での血管内凝固の防止および治療に有効である
ことが臨床的に十分確立されている。また、播種性の血
管内凝固などの血栓状態では、ならびに大けが、大手術
、および癌などの血栓症になりやすい疾患状態では、プ
ロティンＣのレベルが異常に低いことがわかっている。
ロティンＣ酵素前駆体は大きな治療上の重要性を有する
。先天的なホモ接合のプロティンＣ欠損では、その患者
は極めて幼い時に、致死型の播種住血管内凝固を伴うこ
とが多い電撃性紫斑病で死んでしまう。ヘテロ接合のプ
ロティンＣ欠損では、その患者は重篤な、再発性の血栓
塞栓に苦しむ。血友病Ｂあるいは因子ＩＸ欠損を治療す
るために設計した血漿タンパク質濃縮物（不純物として
プロティンＣを含んでいる）はへテロ接合性のプロティ
ンＣ欠損での血管内凝固の防止および治療に有効である
ことが臨床的に十分確立されている。また、播種性の血
管内凝固などの血栓状態では、ならびに大けが、大手術
、および癌などの血栓症になりやすい疾患状態では、プ
ロティンＣのレベルが異常に低いことがわかっている。
酵素前駆体型のプロティンＣは治療用に極めて有用であ
るが、ある種の疾患状態については患者に活性型のプロ
ティンＣを投与することによりさらに効果的に治療を行
うことが可能となる。例えば、心筋梗塞あるいは深静脈
血栓症（特に手術後に下肢に発生するようなもの）など
の疾患状態では、患者は正常なレベルのプロティンＣ酵
素前駆体を有しているが、血栓の生成を防止し、既存の
血栓の除去を維持するに十分な活性化プロティンＣを有
していない。十分な量の活性化プロティンＣを生成でき
ないのは不十分なトロンボモジュリンレベルによってい
るのかもしれないが、その原因が何であれ、これら疾患
状態の治療を有効に行うためには酵素前駆体ではなく活
性化プロティンＣを投与する必要がある。本発明は、組
換えＤＮＡ法を用いて活性化ヒトプロティンＣを得るた
めの新規化合物および方法を提供するものである。
るが、ある種の疾患状態については患者に活性型のプロ
ティンＣを投与することによりさらに効果的に治療を行
うことが可能となる。例えば、心筋梗塞あるいは深静脈
血栓症（特に手術後に下肢に発生するようなもの）など
の疾患状態では、患者は正常なレベルのプロティンＣ酵
素前駆体を有しているが、血栓の生成を防止し、既存の
血栓の除去を維持するに十分な活性化プロティンＣを有
していない。十分な量の活性化プロティンＣを生成でき
ないのは不十分なトロンボモジュリンレベルによってい
るのかもしれないが、その原因が何であれ、これら疾患
状態の治療を有効に行うためには酵素前駆体ではなく活
性化プロティンＣを投与する必要がある。本発明は、組
換えＤＮＡ法を用いて活性化ヒトプロティンＣを得るた
めの新規化合物および方法を提供するものである。
本発明およびプロティンＣ活性化の理解を容易にするた
め、形成期ヒトプロティンＣの暗号配列、および対応す
るアミノ酸残基配列を以下に示すＣＣＣＧＣＡ ＧＴＧ
ＡＡＧ ＴｒＣＣＣＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＧＧ Ｃ
ＣＣＴＧＧ ＡＡＧ ＣＧＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＰＲＯＡＬＡ ＶＡＬ ＬＹＳ Ｐ）［Ｅ ＰＲＯＣＹ
Ｓ ＧＬＹ ＡＲＧ ＰＲＯＴＲＰ ｒ、ＹＳ ＡＲＧ
ＭＥＴ ＧＬＵ ＬＹＳＡＡＧ ＣＧＣＡＧＴ ＣＡ
ＣＣＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＣＡＣＡ ＧＡＡ Ｇ
ＡＣＣＡＡ ＧＡＡ ＧＡＣＣＡＡ ＧＴＡＬＹＳ Ａ
ＲＧ ＳＥＲＨＩＳ ＬＥｔｌ ＬＹＳ ＡＲＧ ＡＳ
Ｐ Ｔ）［ＲＧＬｔｌ ＡＳＰ ＧＩＪＩ ＧＬＩＪ
ＡＳＰ ＧＬＮ ＶＡＬＧＡＴ ＣＣＧ ＣＯＧ ＣＴ
ＣＡＴｒ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣＡ
ＧＧ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＳＰ Ｐ
ＲＯＡＪＩＧ ＬＥＤ Ｉ部Ａ５Ｐ ＧＬＹ ＬＹＳ
ＭＥＴ Ｔ）［ＲＡＲＧ ＡＲＧ ＧＬＹ ＡＳＰ Ｓ
ＥＲＰＲＯＴＧＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＧＴＣＣＴＣＣＴ
Ｇ ＧＡＣＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ
ＧＣＣＴＧＣＧＧＧ ＧＣＡＴＲＰ ＧＬＮ ＶＡＩ、
ＶＡＬ ＬＥＤ ＬＥｔｌ ＡＳＰ ＳＥＲＬＹＳ Ｌ
ＹＳ ＬＹＳ ＩＪ：Ｕ ＡＬＡ ＣＹＳ ＧＬＹ Ａ
ＬＡＧＴＧ ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＡ ＧＣＧ ＧＣＣＣＡＣＴＧＣ
ＡＴＧ ＧＡＴＶＡＬ ＩＪ：ｔｌ ＩＩＪ、ＨＩＳ
ＰＲＯＳＥＲＴＲＩ’ ＶＡＬ ＩＪ：ｕ Ｔ）［ＲＡ
ＬＡ ＡＬＡ ＨＩＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＳＰＧＡＧ
ＴＣＣＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＣＣＴＴ ＧＴＣＡＧＧ
ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＡＴ ＧＡＣＣＴＧ Ｃ
ＧＧ ＣＧＣＧＬＵ ＳＥＲＬＹＳ ＬＹＳ ＬＥＤ
ＬＥＤ ＶＡＩｌ、ＡＲＧ ＬＥＤ ＧＬＹ ＧＬＵＴ
ＹＲＡＳＰ ＬＥＤＡＲＧ ＡＲＧ［配列中、＾はデオ
キシアデニル、Ｇはデオキシアデル、Ｃはデオキシアデ
ニル、Ｔはチミジル、ＡＬＡはアラニン、ＡＲＧはアル
ギニン、ＡＳＮはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン
酸、ＣｙＳはンスティン、ＧＬＮはグルタミン、ＧＬＵ
はグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン、ｌｌｌ５はヒスチ
ジン、ＩＬＥはイソロイシン、ＬＥＵはロインン、ＬＹ
Ｓはリジン、ＭＥＴはメチオニン、ＰＩＩＥはフェニル
アラニン、ＰＲＯはプロリン、５ＩＥＲはセリン、ＴＨ
Ｒはトレオニン、ＴＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチ
ロシン、そしてＶＡＬはバリンである］。
め、形成期ヒトプロティンＣの暗号配列、および対応す
るアミノ酸残基配列を以下に示すＣＣＣＧＣＡ ＧＴＧ
ＡＡＧ ＴｒＣＣＣＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＡＧＧ Ｃ
ＣＣＴＧＧ ＡＡＧ ＣＧＧ ＡＴＧ ＧＡＧ ＡＡＧ
ＰＲＯＡＬＡ ＶＡＬ ＬＹＳ Ｐ）［Ｅ ＰＲＯＣＹ
Ｓ ＧＬＹ ＡＲＧ ＰＲＯＴＲＰ ｒ、ＹＳ ＡＲＧ
ＭＥＴ ＧＬＵ ＬＹＳＡＡＧ ＣＧＣＡＧＴ ＣＡ
ＣＣＴＧ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＡＣＡＣＡ ＧＡＡ Ｇ
ＡＣＣＡＡ ＧＡＡ ＧＡＣＣＡＡ ＧＴＡＬＹＳ Ａ
ＲＧ ＳＥＲＨＩＳ ＬＥｔｌ ＬＹＳ ＡＲＧ ＡＳ
Ｐ Ｔ）［ＲＧＬｔｌ ＡＳＰ ＧＩＪＩ ＧＬＩＪ
ＡＳＰ ＧＬＮ ＶＡＬＧＡＴ ＣＣＧ ＣＯＧ ＣＴ
ＣＡＴｒ ＧＡＴ ＧＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＣＣＡ
ＧＧ ＣＧＧ ＧＧＡ ＧＡＣＡＧＣＣＣＣＡＳＰ Ｐ
ＲＯＡＪＩＧ ＬＥＤ Ｉ部Ａ５Ｐ ＧＬＹ ＬＹＳ
ＭＥＴ Ｔ）［ＲＡＲＧ ＡＲＧ ＧＬＹ ＡＳＰ Ｓ
ＥＲＰＲＯＴＧＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＧＴＣＣＴＣＣＴ
Ｇ ＧＡＣＴＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ
ＧＣＣＴＧＣＧＧＧ ＧＣＡＴＲＰ ＧＬＮ ＶＡＩ、
ＶＡＬ ＬＥＤ ＬＥｔｌ ＡＳＰ ＳＥＲＬＹＳ Ｌ
ＹＳ ＬＹＳ ＩＪ：Ｕ ＡＬＡ ＣＹＳ ＧＬＹ Ａ
ＬＡＧＴＧ ＣＴＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧ
ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＡ ＧＣＧ ＧＣＣＣＡＣＴＧＣ
ＡＴＧ ＧＡＴＶＡＬ ＩＪ：ｔｌ ＩＩＪ、ＨＩＳ
ＰＲＯＳＥＲＴＲＩ’ ＶＡＬ ＩＪ：ｕ Ｔ）［ＲＡ
ＬＡ ＡＬＡ ＨＩＳ ＣＹＳ ＭＥＴ ＡＳＰＧＡＧ
ＴＣＣＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＣＣＴＴ ＧＴＣＡＧＧ
ＣＴＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＡＴ ＧＡＣＣＴＧ Ｃ
ＧＧ ＣＧＣＧＬＵ ＳＥＲＬＹＳ ＬＹＳ ＬＥＤ
ＬＥＤ ＶＡＩｌ、ＡＲＧ ＬＥＤ ＧＬＹ ＧＬＵＴ
ＹＲＡＳＰ ＬＥＤＡＲＧ ＡＲＧ［配列中、＾はデオ
キシアデニル、Ｇはデオキシアデル、Ｃはデオキシアデ
ニル、Ｔはチミジル、ＡＬＡはアラニン、ＡＲＧはアル
ギニン、ＡＳＮはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン
酸、ＣｙＳはンスティン、ＧＬＮはグルタミン、ＧＬＵ
はグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン、ｌｌｌ５はヒスチ
ジン、ＩＬＥはイソロイシン、ＬＥＵはロインン、ＬＹ
Ｓはリジン、ＭＥＴはメチオニン、ＰＩＩＥはフェニル
アラニン、ＰＲＯはプロリン、５ＩＥＲはセリン、ＴＨ
Ｒはトレオニン、ＴＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチ
ロシン、そしてＶＡＬはバリンである］。
上に挙げたＤＮＡ配列は、ヒトプロティンＣをコードし
ているヒト肝臓ｎＲＮＡから調製したｃＤＮＡクローン
から得た。遺伝コードの縮重性により同一のアミノ酸残
基配列をコードしている多数の別種ＤＮＡ配列を組み立
てることができることは当業者の理解するところである
。従って、上記の形成期ヒトプロティンＣのｃＤＮＡ配
列は、可能性のある多数の形成期ヒトプロティンＣ−コ
ード化配列の１つであるにすぎない。ｃＤＮＡクローン
の組み立てにおいて、５°ポリＧ配列、３°ボＩＪＣ配
列、ならびに両５°および３°のＰｓｔＩ制限酵素認識
配列を、プロティンＣをコードしているｃＤＮΔの両末
端に構築した。これらｃＤＮＡクローンの２つを操作し
て、形成期ヒトプロティンＣの暗号配列、ならびに暗号
領域の５°および３゛末端の非翻訳化ｍＲＮＡをフード
しているＤＮＡ部分の両方を含むＤＮＡ分子を構築した
。このＤＮＡ分子をプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１
部位に挿入してプラスミドｐＨＣ７を構築した。従って
、プラスミドｐＨＣ７は上記の暗号配列を含んでおり、
また、形成期ヒトプロティンＣの暗号配列の解読路の５
°および３゛末端のそれぞれに以下の付加的な配列を含
んでいる（分子の１本の鎖だけを示す）： ５°−ＣＴＧＣＡＧＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣＡＧＡ−３゜ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＣＴＧ Ｔ
ＣＡＧＡＣＧＧＣＧＡＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＴＡ Ｔ
ＣＴＧＣＣＣＣＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＣＣＡＧＴ Ｇ
ＣＣおよび ５ −ＣＧＡ ＣＣＣＴＣＣＣＴＧ ＣＡＧ Ｇ
ＧＣＴＧＧ ＧＣＴ ＴＴＴ ＧＣＡＴＧＧ Ｃ
ＡＡ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧ
Ｇ ＧＡＣＡＴＧＴＡＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＣＡＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴ
ＧＣＡ Ｇ−３ ＤＮＡ塩基が対になる相補性の性質により、２本鎖ＤＮ
Ａ分子のうち１本鎖の配列はもう一方の鎖の配列を決め
るのに十分である。プラスミドｐＨＣ７は、ノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−［Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）、 Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌ
ｉｎｏｉｓ］に寄託され、その永久保存培養物コレクン
ヨンの一部をなしている菌株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）Ｋ ｌ ２ ＲＲｌ／ｐＨＣ７から常法により単
離することができる。大腸菌Ｋ １２ ＲＲｌ／ｐＨＣ
７の培養物はＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１
５９２６のもとて入手することができる。プラスミドｐ
ＨＣ７の制限部位および機能地図を添付の第２図に示す
。
ているヒト肝臓ｎＲＮＡから調製したｃＤＮＡクローン
から得た。遺伝コードの縮重性により同一のアミノ酸残
基配列をコードしている多数の別種ＤＮＡ配列を組み立
てることができることは当業者の理解するところである
。従って、上記の形成期ヒトプロティンＣのｃＤＮＡ配
列は、可能性のある多数の形成期ヒトプロティンＣ−コ
ード化配列の１つであるにすぎない。ｃＤＮＡクローン
の組み立てにおいて、５°ポリＧ配列、３°ボＩＪＣ配
列、ならびに両５°および３°のＰｓｔＩ制限酵素認識
配列を、プロティンＣをコードしているｃＤＮΔの両末
端に構築した。これらｃＤＮＡクローンの２つを操作し
て、形成期ヒトプロティンＣの暗号配列、ならびに暗号
領域の５°および３゛末端の非翻訳化ｍＲＮＡをフード
しているＤＮＡ部分の両方を含むＤＮＡ分子を構築した
。このＤＮＡ分子をプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１
部位に挿入してプラスミドｐＨＣ７を構築した。従って
、プラスミドｐＨＣ７は上記の暗号配列を含んでおり、
また、形成期ヒトプロティンＣの暗号配列の解読路の５
°および３゛末端のそれぞれに以下の付加的な配列を含
んでいる（分子の１本の鎖だけを示す）： ５°−ＣＴＧＣＡＧＧ ＧＧＧ ＴＧＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＣＧＡ ＣＣＣ ＴＣＣＡＧＡ−３゜ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＣＴＧ Ｔ
ＣＡＧＡＣＧＧＣＧＡＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＧＴＡ Ｔ
ＣＴＧＣＣＣＣＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＧＣＣＡＧＴ Ｇ
ＣＣおよび ５ −ＣＧＡ ＣＣＣＴＣＣＣＴＧ ＣＡＧ Ｇ
ＧＣＴＧＧ ＧＣＴ ＴＴＴ ＧＣＡＴＧＧ Ｃ
ＡＡ ＴＧＧ ＡＴＧ ＧＧＡ ＣＡＴ ＴＡＡ ＡＧ
Ｇ ＧＡＣＡＴＧＴＡＡ ＣＡＡ ＧＣＡ ＣＡＣＣＣ
ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴ
ＧＣＡ Ｇ−３ ＤＮＡ塩基が対になる相補性の性質により、２本鎖ＤＮ
Ａ分子のうち１本鎖の配列はもう一方の鎖の配列を決め
るのに十分である。プラスミドｐＨＣ７は、ノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリ−［Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ（ＮＲＲＬ）、 Ｐｅｏｒｉａ、 ｌ１ｌ
ｉｎｏｉｓ］に寄託され、その永久保存培養物コレクン
ヨンの一部をなしている菌株である大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ）Ｋ ｌ ２ ＲＲｌ／ｐＨＣ７から常法により単
離することができる。大腸菌Ｋ １２ ＲＲｌ／ｐＨＣ
７の培養物はＮＲＲＬから取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１
５９２６のもとて入手することができる。プラスミドｐ
ＨＣ７の制限部位および機能地図を添付の第２図に示す
。
また、形成期のプロティンＣを次のように図示すること
もできる ＜ ＨＣ プレープロ：形成期ヒトプロティンＣのアミノ酸残基１
〜４２であり、プロティンＣ の分泌およびγ−カルボキシル化に重 要なヒトプロティンＣのシグナルペ プチドおよびプロペプチドをコード している。
もできる ＜ ＨＣ プレープロ：形成期ヒトプロティンＣのアミノ酸残基１
〜４２であり、プロティンＣ の分泌およびγ−カルボキシル化に重 要なヒトプロティンＣのシグナルペ プチドおよびプロペプチドをコード している。
ＬＣ、形成期プロティンＣのアミノ酸残基４３〜１９７
であり、翻訳後に修飾 されると２本鎖の酵素前駆体（ＫＲＲ Ｒプチドの除去により１本鎖の酵素 前駆体から生成する；後に説明する） および活性化形のプロティンＣの両 者の軽鎖（ＬＣ）を構成する。
であり、翻訳後に修飾 されると２本鎖の酵素前駆体（ＫＲＲ Ｒプチドの除去により１本鎖の酵素 前駆体から生成する；後に説明する） および活性化形のプロティンＣの両 者の軽鎖（ＬＣ）を構成する。
〉
Ｒ
Ｐ
ＡＨＣ
：形成期ヒトプロティンＣのアミノ酸
残基１９８〜１９９であり、これら
の残基は、おそらくは最初の切断（残
基１９７−１９８あるいは１９９−
２００の間）とそれに続くカルボキシ
ペプチダーゼあるいはアミノペプチ
ダーゼの作用からなる２ステツプの
工程で除去されて２本鎖のプロティ
ンＣを生成するものと考えられてい
る（ウシプロティンＣとの相同性に基
づいて）。
：形成期プロティンＣのアミノ酸残基
２００〜２１１であり、酵素前駆体
形のプロティンＣから除去されて活
性化プロティンＣを与える活性化ペ
プチドを構成している。
：形成期プロティンＣのアミノ酸残基
２１２〜４６１であり、翻訳後に修
飾されると活性プロティンＣの活性
化された重鎖（ＡＨＣ）を構成する。
ＨＣ・アミノ酸残基２００〜４６１、即ちＡＰおよびＡ
ＨＣからなる、翻訳後 に修飾された後の、２本鎖形のプロ ティンＣ酵素前駆体の重鎖。
ＨＣからなる、翻訳後 に修飾された後の、２本鎖形のプロ ティンＣ酵素前駆体の重鎖。
ヒトプロティンＣ酵素前駆体は、肝臓で合成され、血液
中に存在するセリンプロテアーゼ前駆体である。完全な
生物学的活性を現すためには、フロティンＣは翻訳後の
修飾を必要とし、これにビタミンＫが必要となる。成熟
した、２本鎖の、ジスルフィド結合したプロティンＣ酵
素前駆体か、部分的なタンパク質加水分解によって１本
鎖の前駆体から生成する。この部分的なタンパク質加水
分解には、細胞内プロセノ７ングおよび細胞からの形成
期ポリペプチドの分泌の間の、アミノ酸残基１〜４２か
らなるプレープロペプチドの切断および除去、ならびに
酵素前駆体で観察される２本鎖を生成するためのアミノ
酸残基１９８および１９９の除去が含まれるものと考え
られている。この酵素前駆体の活性なセリンプロテアー
ゼへの活性化にはＡＲＧ−ＬＥＵペプチド結合（残基２
１１および２１２）のタンパク質加水分解による切断が
関与している。この後者の切断は、２本鎖酵素前駆体分
子の大きい方の鎖（重鎮）のアミノ末端を構成している
ドデカペプチド（残基２００〜２１１）を放出する。プ
ロティンＣは相当にグリコンル化されている；成熟酵素
は〜２３％の炭水化物を含んでいる。また、プロティン
Ｃは、γ−カルボキングルタミン酸およびβ−ヒドロキ
７アスパラギン酸（エリスローし一β−ヒドロキ７アス
バルテート）を含む多数の普通ではないアミノ酸を含有
している。γ−カルボキングルタミン酸（ｇｌａ）は、
補助因子としてビタミンＫを必要とする肝ミクロソーム
のカルボキシラーゼの働きにより、グルタミン酸残基か
らγ−グルタミルカルボキ／ル化によって生成する。
中に存在するセリンプロテアーゼ前駆体である。完全な
生物学的活性を現すためには、フロティンＣは翻訳後の
修飾を必要とし、これにビタミンＫが必要となる。成熟
した、２本鎖の、ジスルフィド結合したプロティンＣ酵
素前駆体か、部分的なタンパク質加水分解によって１本
鎖の前駆体から生成する。この部分的なタンパク質加水
分解には、細胞内プロセノ７ングおよび細胞からの形成
期ポリペプチドの分泌の間の、アミノ酸残基１〜４２か
らなるプレープロペプチドの切断および除去、ならびに
酵素前駆体で観察される２本鎖を生成するためのアミノ
酸残基１９８および１９９の除去が含まれるものと考え
られている。この酵素前駆体の活性なセリンプロテアー
ゼへの活性化にはＡＲＧ−ＬＥＵペプチド結合（残基２
１１および２１２）のタンパク質加水分解による切断が
関与している。この後者の切断は、２本鎖酵素前駆体分
子の大きい方の鎖（重鎮）のアミノ末端を構成している
ドデカペプチド（残基２００〜２１１）を放出する。プ
ロティンＣは相当にグリコンル化されている；成熟酵素
は〜２３％の炭水化物を含んでいる。また、プロティン
Ｃは、γ−カルボキングルタミン酸およびβ−ヒドロキ
７アスパラギン酸（エリスローし一β−ヒドロキ７アス
バルテート）を含む多数の普通ではないアミノ酸を含有
している。γ−カルボキングルタミン酸（ｇｌａ）は、
補助因子としてビタミンＫを必要とする肝ミクロソーム
のカルボキシラーゼの働きにより、グルタミン酸残基か
らγ−グルタミルカルボキ／ル化によって生成する。
また、ヒトプロティンＣの活性化を以下のように図示す
ることもできる。図に示した各ステ、ブの順序が必ずし
もインビボでの経路を反映したものではないことは当業
者の認めるところである。
ることもできる。図に示した各ステ、ブの順序が必ずし
もインビボでの経路を反映したものではないことは当業
者の認めるところである。
ブレー；／ａ−ＬＣ−ＫＲ−ＡＰ−人１１ｃ 形成期
プロティンＣＬＣ−ＫＲ−ＡＰ−ＡＩＩＣ１本鎖の酵素
前駆体Ｃ ２本鎖の酵素前駆体 ＡＩＩＣ−ＡＰ ＬＣ 活性化プロティンＣ 発明の目的および構成 本発明は組換え活性化プロティンＣの直接発現のための
新規化合物、ベクター、形質転換体、および方法を提供
するものである。
プロティンＣＬＣ−ＫＲ−ＡＰ−ＡＩＩＣ１本鎖の酵素
前駆体Ｃ ２本鎖の酵素前駆体 ＡＩＩＣ−ＡＰ ＬＣ 活性化プロティンＣ 発明の目的および構成 本発明は組換え活性化プロティンＣの直接発現のための
新規化合物、ベクター、形質転換体、および方法を提供
するものである。
本明細書中で用いる用語を以下に定義する。
Ａｄ２ＬＰ：アデノウィルス２型の主後期プロモーター
タンパク實またはペプチド中のアミノ酸残基は次の短縮
形で示した ３文字短縮形 アミノ酸残基 １文字短縮形ＰＨ
Ｅ フェニルアラニン ＦＬＥＵ
ロイシン ＬＩＬＥ イソロイ
シン ＩＭＥＴ メチオニン
ＭＶＡＬ バリン ■ＳＥＲセ
リン Ｓ ＰＲ○ プロリン ＰＴＨＲトレ
オニン Ｔ ＡＬＡ アラニン ＡＴＹＲチロ
ノン Ｙ ＨＩＳ ヒスチジン Ｉ（ＧＬＮ
グルタミン ＱＡＳＮ ア
スパラギン ＮＬ Ｙ Ｓ リジン
ＫＡＳＰ アスパラギン酸
ＤＧＬＵ グルタミン酸 Ｅ
ＣＹＳ ／スティン ＣＴＲＰ
トリプトファン ＷＡＲＧ アル
ギニン ＲＧＬＹ グリシン
ＧＡｐＲ：アンピンリン耐性の表現型またはそ
れを付与する遺伝子。
形で示した ３文字短縮形 アミノ酸残基 １文字短縮形ＰＨ
Ｅ フェニルアラニン ＦＬＥＵ
ロイシン ＬＩＬＥ イソロイ
シン ＩＭＥＴ メチオニン
ＭＶＡＬ バリン ■ＳＥＲセ
リン Ｓ ＰＲ○ プロリン ＰＴＨＲトレ
オニン Ｔ ＡＬＡ アラニン ＡＴＹＲチロ
ノン Ｙ ＨＩＳ ヒスチジン Ｉ（ＧＬＮ
グルタミン ＱＡＳＮ ア
スパラギン ＮＬ Ｙ Ｓ リジン
ＫＡＳＰ アスパラギン酸
ＤＧＬＵ グルタミン酸 Ｅ
ＣＹＳ ／スティン ＣＴＲＰ
トリプトファン ＷＡＲＧ アル
ギニン ＲＧＬＹ グリシン
ＧＡｐＲ：アンピンリン耐性の表現型またはそ
れを付与する遺伝子。
ＢＫ ： ＢＫウィルス由来のＤ Ｎ Ａ ０ＣＡＴニ
クロラムフエニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子。
クロラムフエニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子。
Ｅ ｎｈマタハエンハンサー：ＢＫウィルスのエンバッ
サ− ｅｐまたは５Ｖ４０ｅｐ：ＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子の
初期プロモーター、′「−抗原結合部位、ＳＶ４０のエ
ンハンサ−１およびＳＶ４０の復製起源を含有するＤＮ
Ａセグメント。
サ− ｅｐまたは５Ｖ４０ｅｐ：ＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子の
初期プロモーター、′「−抗原結合部位、ＳＶ４０のエ
ンハンサ−１およびＳＶ４０の復製起源を含有するＤＮ
Ａセグメント。
γ−カルボキシル化 グルタミン酸のγ−炭素にカルボ
キシル基を付加する反応。
キシル基を付加する反応。
γ−カルボキシル化されたタンパク質、グルタミン酸残
基のいくつかがγ−カルボキンル化を受けたタンパク質
。
基のいくつかがγ−カルボキンル化を受けたタンパク質
。
ＩＶＳ：イントロンをコードしているＤＮＡであり、介
在配列とも呼ばれる。
在配列とも呼ばれる。
Ｍ Ｍ Ｔ ｐｒｏ ：マウスのメタロチオネイン−Ｉ
遺伝子のプロモーター 形成期タンパク質：ｍＲＮＡ転写体の翻訳によって生成
したポリペプチドであり、翻訳後の修飾を全く受けてい
ないもの。しかし、ｍＲＮＡ転写体からタンパク質が完
全に翻訳される前に、グルタミン酸残基のγ−カルボキ
シル化およびアスパラギン酸残基のヒドロキ／ル化なと
の翻訳後修飾を受けることもある。
遺伝子のプロモーター 形成期タンパク質：ｍＲＮＡ転写体の翻訳によって生成
したポリペプチドであり、翻訳後の修飾を全く受けてい
ないもの。しかし、ｍＲＮＡ転写体からタンパク質が完
全に翻訳される前に、グルタミン酸残基のγ−カルボキ
シル化およびアスパラギン酸残基のヒドロキ／ル化なと
の翻訳後修飾を受けることもある。
ＮｅｏＲ：ネオマイシン耐性を付与する遺伝子であり、
この遺伝子を用いて抗生物’ｆｆＧ４１８に対する耐性
を付与することもできる。
この遺伝子を用いて抗生物’ｆｆＧ４１８に対する耐性
を付与することもできる。
ｐＡ ポリアデニル化シグナルをコードしているＤＮ
Ａ配列。
Ａ配列。
プロモーター： ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配
列。
列。
プロティンＣ活性：タンパク質加水分解活性、アミド分
解活性、エステル分解活性、および生物学的活性（抗凝
固あるいはプロフィプリン分解活性）の原因であるヒト
プロティンＣのすべての性質。タンパク質の抗凝固活性
の試験方法は当分野でよく知られている［Ｇｒｉｎｎｅ
ｌｌ ｅＬ ａｌ、、 １９８７． Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ５：１１８９を参照］。
解活性、エステル分解活性、および生物学的活性（抗凝
固あるいはプロフィプリン分解活性）の原因であるヒト
プロティンＣのすべての性質。タンパク質の抗凝固活性
の試験方法は当分野でよく知られている［Ｇｒｉｎｎｅ
ｌｌ ｅＬ ａｌ、、 １９８７． Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ ５：１１８９を参照］。
キ且換えＤＮＡクローニングベクター・１まｔこはそれ
以上の別のＤＮＡセグメントを付加したか、または付加
することができるＤＮＡ分子を含有するあらゆる媒体で
あり、染色体に組込まれる媒体、自ｉＪｔ的に反製する
プラスミド、およびファージか含まれるがこれらに限定
はされない。
以上の別のＤＮＡセグメントを付加したか、または付加
することができるＤＮＡ分子を含有するあらゆる媒体で
あり、染色体に組込まれる媒体、自ｉＪｔ的に反製する
プラスミド、およびファージか含まれるがこれらに限定
はされない。
組換えＤＮＡ発現ベクター：プロモーターが導入された
あらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター 、ヤＨ換えＤＮＡベクター：あらゆる組換えＤ Ｎ Ａ
クローニングベクターまたは発現ベクターレプリコン：
プラスミドまたは他のベクターの自律的な複製を支配し
、それを可能にするＤＮＡ配列。
あらゆる組換えＤＮＡクローニングベクター 、ヤＨ換えＤＮＡベクター：あらゆる組換えＤ Ｎ Ａ
クローニングベクターまたは発現ベクターレプリコン：
プラスミドまたは他のベクターの自律的な複製を支配し
、それを可能にするＤＮＡ配列。
制限フラグメント：１またはそれ以上の制限エンドヌク
レアーゼ酵素の作用によって生成したあらゆる直線状の
ＤＮＡ配列。
レアーゼ酵素の作用によって生成したあらゆる直線状の
ＤＮＡ配列。
感受性宿主細胞：ある抗生物質またはその他の毒性化合
物の存在下では、それらに対する耐性を付与するＤＮＡ
セグメントがないと生育することができない宿主細胞。
物の存在下では、それらに対する耐性を付与するＤＮＡ
セグメントがないと生育することができない宿主細胞。
構造遺伝子 翻訳開始および停止シグナルを含めた機能
的なポリペプチドをコードしているあらゆるＤＮＡ配列
。
的なポリペプチドをコードしているあらゆるＤＮＡ配列
。
ＴｃＲ・テトラサイタリン耐性の表現型またはそれを付
与する遺伝子。
与する遺伝子。
形質転換・受容宿主細胞にＤ’ＮＡを導入することであ
り、これにより受容宿主細胞の遺伝型が変化する。
り、これにより受容宿主細胞の遺伝型が変化する。
形質転換体；形質転換を経た受容宿主細胞。
翻訳活性化配列＋ｍＲＮＡ転写体をペプチドまたはポリ
ペプチドに翻訳させる、５−ＡＴＧ−３などの翻訳開始
コドンおよびリポソームの結合部位をコードしている配
列を含めたあらゆるＤＮＡ配列。
ペプチドに翻訳させる、５−ＡＴＧ−３などの翻訳開始
コドンおよびリポソームの結合部位をコードしている配
列を含めたあらゆるＤＮＡ配列。
酵素前駆体：タンパク質加水分解酵素の酵素的に不活性
な前駆体。本明細書中で用いるプロティンＣ酵素前駆体
とは、それが１本鎖であっても２本鎖であっても、分詑
・された不活性型のプロティンＣを指す。
な前駆体。本明細書中で用いるプロティンＣ酵素前駆体
とは、それが１本鎖であっても２本鎖であっても、分詑
・された不活性型のプロティンＣを指す。
第１図は４つの部分からなり、本発明のプラスミドｐＬ
ＡＰＣの構築に用いる出発物質であるプラスミドｐＬＰ
Ｃの構築プロトコールを示すものである。
ＡＰＣの構築に用いる出発物質であるプラスミドｐＬＰ
Ｃの構築プロトコールを示すものである。
第１Ａ図は、ＢＫウィルスおよびプラスミドｐｄＢ Ｐ
Ｖ−ＭＭＴｎｅｏからのプラスミドｐＢＫｎｅｏｌの構
築を示す工程図である。
Ｖ−ＭＭＴｎｅｏからのプラスミドｐＢＫｎｅｏｌの構
築を示す工程図である。
第１Ｂ図は、アデノウィルス２およびプラスミドｐＳ
Ｖ ２ ｃａｔからのプラスミドｐＬＰｃａｔの構築を
示す工程図である。
Ｖ ２ ｃａｔからのプラスミドｐＬＰｃａｔの構築を
示す工程図である。
第１Ｃ図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびプラスミ
ドｐＬＰｃａＬからのプラスミドｐＢＬｃａｔの構築を
示す工程図である。
ドｐＬＰｃａＬからのプラスミドｐＢＬｃａｔの構築を
示す工程図である。
第１Ｄ図は、プラスミドｐＢＬｃａｔおよびプラスミド
ｐＬ１３３からのプラスミドｐＬＰＣの構築を示す工程
図である。
ｐＬ１３３からのプラスミドｐＬＰＣの構築を示す工程
図である。
第２図は、プラスミドｐｔ、ｐｃの構築に用いる出発物
質であるプラスミドｐＬ１３３の構築を示す工程図であ
る。
質であるプラスミドｐＬ１３３の構築を示す工程図であ
る。
本発明は、活性化されたヒトプロティンＣの発現をコー
ドしているＤＮＡ化合物に関する。ヒトプロティンＣ酵
素前駆体および形成期ヒトプロティンＣを製造するため
の方法がいくつか開示されているが（欧州特許公開Ｎ
ｏ、 ２１５５４８およびＮｏ、１９１６０６を参照）
、これらの方法は活性化されたヒトプロティンＣの直接
発現を提供するものではない。
ドしているＤＮＡ化合物に関する。ヒトプロティンＣ酵
素前駆体および形成期ヒトプロティンＣを製造するため
の方法がいくつか開示されているが（欧州特許公開Ｎ
ｏ、 ２１５５４８およびＮｏ、１９１６０６を参照）
、これらの方法は活性化されたヒトプロティンＣの直接
発現を提供するものではない。
活性化されたプロティンＣを得るためには、これらの方
法によって得たプロティンＣ酵素前駆体を、α−トロン
ビン、トリプシン、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ ｌ）のヘ
ビ毒因子Ｘ活性化因子、あるいはトロンビンとトロンボ
モジコリンの混合物などの物質で処理しなければならな
い。これらの活性化法のすべては、組換え法による活性
化ヒトプロティンＣの製造に非効率、汚染の危険、およ
びより高いコストを与える。さらに、ある種の活性化反
応は、タンパク質加水分解が活性化ペプチドのタンパク
質加水分解切断の後に停止するよう厳密にモニターしな
ければならない（そうしないと、生成した活性化プロテ
ィンＣが切断され、不活性になる）。
法によって得たプロティンＣ酵素前駆体を、α−トロン
ビン、トリプシン、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ ｌ）のヘ
ビ毒因子Ｘ活性化因子、あるいはトロンビンとトロンボ
モジコリンの混合物などの物質で処理しなければならな
い。これらの活性化法のすべては、組換え法による活性
化ヒトプロティンＣの製造に非効率、汚染の危険、およ
びより高いコストを与える。さらに、ある種の活性化反
応は、タンパク質加水分解が活性化ペプチドのタンパク
質加水分解切断の後に停止するよう厳密にモニターしな
ければならない（そうしないと、生成した活性化プロテ
ィンＣが切断され、不活性になる）。
本発明は、組換え縮性化ヒトプロティンＣの直接発現の
ためのＤ Ｎ Ａ化合物、組換えＤＮＡ発現ベクター、
形質転換セルライン、および方法を提供するものである
。
ためのＤ Ｎ Ａ化合物、組換えＤＮＡ発現ベクター、
形質転換セルライン、および方法を提供するものである
。
本発明は、
（Ａ）以下の（ｉ）および（ｉ））を含有する組換えＤ
ＮＡベクターで宿主細胞を形質転換し くｉ）アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ａ）γ
−カルボキシル化され、分ｌ・されるタンパク質のシグ
ナルペプチドおよびプロペプチド ｂ）ヒトプロティンＣの軽鎖； Ｃ）リジン−アルギニン、リジン−リジン、またはアル
ギニン−アルギニンから選ばれるジペプチド ｄ）細胞に随伴するプロテアーゼのための切断配列；お
よび ｅ）活性化されたヒトプロティンＣの重鎖；［ただし、
該切断配列はヒトプロティンＣ酵素前駆体の活性化ペプ
チドではないコ を含んでいるアミノ酸残基配列をコードしているＤＮＡ
配列； （ｉ１）該ＤＮＡ配列を発現させるように設置したプロ
モーター・ （Ｂ）工程（Ａ）で形質転換した宿主細胞を、該ＤＮＡ
配列を発現させる条件下で培養すること、を特徴とする
真核宿主細胞からの分泌時に組換え活性化プロティンＣ
を直接産生させる方法を提供するものである。
ＮＡベクターで宿主細胞を形質転換し くｉ）アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ａ）γ
−カルボキシル化され、分ｌ・されるタンパク質のシグ
ナルペプチドおよびプロペプチド ｂ）ヒトプロティンＣの軽鎖； Ｃ）リジン−アルギニン、リジン−リジン、またはアル
ギニン−アルギニンから選ばれるジペプチド ｄ）細胞に随伴するプロテアーゼのための切断配列；お
よび ｅ）活性化されたヒトプロティンＣの重鎖；［ただし、
該切断配列はヒトプロティンＣ酵素前駆体の活性化ペプ
チドではないコ を含んでいるアミノ酸残基配列をコードしているＤＮＡ
配列； （ｉ１）該ＤＮＡ配列を発現させるように設置したプロ
モーター・ （Ｂ）工程（Ａ）で形質転換した宿主細胞を、該ＤＮＡ
配列を発現させる条件下で培養すること、を特徴とする
真核宿主細胞からの分泌時に組換え活性化プロティンＣ
を直接産生させる方法を提供するものである。
本発明は、活性化プロティンＣを製造するための方法に
用いる新規ＤＮＡ化合物を提供する。これらの新規化合
物はすべて、分泌させるためのシグナルペプチドおよび
γ−カルボキシル化される（ビタミンに依存性のカルホ
キ／ラーゼの作用によって）タフバク質由来のプロペプ
チドからなるプレプロペプチドをコードしている。この
ようなプロペプチド配列は当分野でよく知られている。
用いる新規ＤＮＡ化合物を提供する。これらの新規化合
物はすべて、分泌させるためのシグナルペプチドおよび
γ−カルボキシル化される（ビタミンに依存性のカルホ
キ／ラーゼの作用によって）タフバク質由来のプロペプ
チドからなるプレプロペプチドをコードしている。この
ようなプロペプチド配列は当分野でよく知られている。
例えば、サノティー等［５ｕｔＬｉｅ ｅＬ ａｌ、、
１９８７． Ｐｒｏｃ。
１９８７． Ｐｒｏｃ。
ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ８４：６３４−６３７
］を参照。好ましくは、そして構築を容易にするため、
シグナルペプチドの暗号配列およびプロペプチドの暗号
配列の両者はγ−カルボキ／ル化されるタンパク質のプ
レープロペプチドのアミノ酸残基配列から得る。そのよ
うなγ−カルホキ／ル化されたタンパク質の例には、因
子■、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、プロティン
Ｓ、プロティンＺ１そして最も好ましくはプロティンＣ
が含まれるが、これらに限定はされない。
］を参照。好ましくは、そして構築を容易にするため、
シグナルペプチドの暗号配列およびプロペプチドの暗号
配列の両者はγ−カルボキ／ル化されるタンパク質のプ
レープロペプチドのアミノ酸残基配列から得る。そのよ
うなγ−カルホキ／ル化されたタンパク質の例には、因
子■、因子ＩＸ、因子Ｘ、プロトロンビン、プロティン
Ｓ、プロティンＺ１そして最も好ましくはプロティンＣ
が含まれるが、これらに限定はされない。
また、本発明のＤＮＡ化合物は、プレープロペプチドの
暗号配列の下流にすぐ隣接して、そして該配列を含む翻
訳リーディングフレーム内に設置されたヒトプロティン
Ｃの軽鎖の暗号配列を含有している。ヒトプロティンＣ
の軽鎖は、前記のように、形成期プロティンＣのアミノ
酸残基４３〜１９７を含んでいる。プロティンＣの軽鎖
のアミノ末端部分などのビタミンに依存性の血漿タンパ
ク質のアミノ末端部分は、これらタンパク質のカルシウ
ム結合活性の原因である。これら血漿タンパク質、例え
ば因子■、因子ＩＸ、囚子因子プロトロンビン、および
プロティンＳなどのカルシウム結合活性は交換可能であ
り（欧州特許公開Ｎｏ、０２１５５４８Ａ１、第１２お
よび１３頁を参照）、ヒトプロティンＣの軽鎖のカルフ
ラム結合領域と等価である。
暗号配列の下流にすぐ隣接して、そして該配列を含む翻
訳リーディングフレーム内に設置されたヒトプロティン
Ｃの軽鎖の暗号配列を含有している。ヒトプロティンＣ
の軽鎖は、前記のように、形成期プロティンＣのアミノ
酸残基４３〜１９７を含んでいる。プロティンＣの軽鎖
のアミノ末端部分などのビタミンに依存性の血漿タンパ
ク質のアミノ末端部分は、これらタンパク質のカルシウ
ム結合活性の原因である。これら血漿タンパク質、例え
ば因子■、因子ＩＸ、囚子因子プロトロンビン、および
プロティンＳなどのカルシウム結合活性は交換可能であ
り（欧州特許公開Ｎｏ、０２１５５４８Ａ１、第１２お
よび１３頁を参照）、ヒトプロティンＣの軽鎖のカルフ
ラム結合領域と等価である。
さらに、本発明のＤＮＡ化合物は、軽鎖の暗号配列の下
流にすく隣接１５て、そして該配列を含む翻訳リーディ
ングフレーム内に設置されたジペプチドＬＹＳ−ＡＲＧ
（ＫＲ）の暗号配列を含有している。ＬＹＳ−ＡＲＧな
どの二塩基性ジペプチドは、形成期タンパク質中の、軽
鎖のカルボキシ末端部と、細胞に随伴するプロテアーゼ
のための切断配列のアミノ末端部の間に位置している。
流にすく隣接１５て、そして該配列を含む翻訳リーディ
ングフレーム内に設置されたジペプチドＬＹＳ−ＡＲＧ
（ＫＲ）の暗号配列を含有している。ＬＹＳ−ＡＲＧな
どの二塩基性ジペプチドは、形成期タンパク質中の、軽
鎖のカルボキシ末端部と、細胞に随伴するプロテアーゼ
のための切断配列のアミノ末端部の間に位置している。
発現されたタンパク質中のＬＹＳ−ＡＲＧジペプチドの
配向は本発明の目的には関係しない。ＬＹＳＩ、ＹＳあ
るいはＡＲ（、−ＡＲＧなどの二塩基性ジペプチドは、
本発明においてはＬ Ｙ Ｓ −Ａ ＲＧジペプチドと
等価である。
配向は本発明の目的には関係しない。ＬＹＳＩ、ＹＳあ
るいはＡＲ（、−ＡＲＧなどの二塩基性ジペプチドは、
本発明においてはＬ Ｙ Ｓ −Ａ ＲＧジペプチドと
等価である。
Ｌ Ｙ Ｓ −Ａ ＲＧジペプチドのコドンのすぐ下流
は、タンパク質加水分解の切断配列の暗号配列である。
は、タンパク質加水分解の切断配列の暗号配列である。
天然では、ヒトプロティンＣｆ７）ＬＹＳ−ＡＲＧジペ
プチドのカルボキシ末端の位置に１２アミノ酸残基のペ
プチド（活性化ペプチド：タンパク實加水分解による切
断によって除去される）が存在している。しかし、本発
明のＤＮＡ化合物の鍵となる特徴は、活性化ペプチドの
暗号配列の存在が必要ではないというところにある。本
発明の好ましいＤＮＡ化合物は活性化ペプチドの暗号配
列を含有していない。その代わりに、好ましい化合物で
は、ＡＰ暗号配列が、細胞に随伴するプロテアーゼ用の
タンパク質加水分解の切断配列の暗号配列で置き換えら
れている。
プチドのカルボキシ末端の位置に１２アミノ酸残基のペ
プチド（活性化ペプチド：タンパク實加水分解による切
断によって除去される）が存在している。しかし、本発
明のＤＮＡ化合物の鍵となる特徴は、活性化ペプチドの
暗号配列の存在が必要ではないというところにある。本
発明の好ましいＤＮＡ化合物は活性化ペプチドの暗号配
列を含有していない。その代わりに、好ましい化合物で
は、ＡＰ暗号配列が、細胞に随伴するプロテアーゼ用の
タンパク質加水分解の切断配列の暗号配列で置き換えら
れている。
本発明の目的は活性化プロティンＣを組換え細胞から直
接産生させることにあるので、プロティンＣの活性化重
鎖からのプロティンＣの軽鎖の切断は細胞内または分泌
時の細胞表面のいずれかで起こらなければならない。本
発明の目的のためには、細胞に随伴するプロテアーゼと
は、細胞質あるいは細胞オルガネラに存在するプロテア
ーゼだけでなく、分泌中あるいは分泌してすぐタンパク
質を切断することができる細胞膜に存在するプロテアー
ゼをも含んでいる。即ち、本発明は、ヒトプロティンＣ
の活性化重鎮と軽鎖を分離するための、細胞随伴のプロ
テアーゼ用のタンパク質加水分解の切断配列をコードし
ているＤＮＡ化合物を提供するものである。
接産生させることにあるので、プロティンＣの活性化重
鎖からのプロティンＣの軽鎖の切断は細胞内または分泌
時の細胞表面のいずれかで起こらなければならない。本
発明の目的のためには、細胞に随伴するプロテアーゼと
は、細胞質あるいは細胞オルガネラに存在するプロテア
ーゼだけでなく、分泌中あるいは分泌してすぐタンパク
質を切断することができる細胞膜に存在するプロテアー
ゼをも含んでいる。即ち、本発明は、ヒトプロティンＣ
の活性化重鎮と軽鎖を分離するための、細胞随伴のプロ
テアーゼ用のタンパク質加水分解の切断配列をコードし
ているＤＮＡ化合物を提供するものである。
細胞随伴プロテアーゼ用の多種のタンパク質加水分解の
切断配列が当分野で知られている。切断配列とは、細胞
随伴のプロテアーゼの切断部位に隣接するアミノ酸配列
である。以下の第１表に、本発明の方法および化合物に
おいて細胞随伴のプロテアーゼ用の切断配列として用い
るのに適した切断配列を挙げる。この表に挙げたものは
例示であって、本発明を限定するものではない。
切断配列が当分野で知られている。切断配列とは、細胞
随伴のプロテアーゼの切断部位に隣接するアミノ酸配列
である。以下の第１表に、本発明の方法および化合物に
おいて細胞随伴のプロテアーゼ用の切断配列として用い
るのに適した切断配列を挙げる。この表に挙げたものは
例示であって、本発明を限定するものではない。
羽↓に細胞随伴のプロテアーゼ用のタンパク質加水分解
の供 給 源 醋り（ｉ文字の短縮形で
表示）１本鎖分子から２本鎖分子を生成するように細胞
随伴のプロテアーゼによって認識される切断配列には次
のものが含まれるインスリン受容体
ＰＲＰＳＲＫＲＲプロティンＣＫＫＲ３ＨＬＫＲ 囚子Ｘ ＱＴＬＥＲＲＫＲ
インスリン ＬＥＧＳＬＱＫＲ
およびＦＹＴＰＫＴＲＲ 分泌されたタンパク質からプロペプチドを除去するよう
に細胞随伴のプロテアーゼによって認識される切断配列
には次のものか含まれる・ グルカゴン ＭＬＶＱＧＳＷＱ
プロティンＣＱＶＬＲＩＲＫＲ 囚子ＩＸ 因子 ＫＩＬＮＲＰＫ
Ｒ囚子Ｘ 因子 ＮＩ ＬＡＲＶ
ＴＲ組織プラスミノーゲン活性化囚子 ＡＲ因子ＲＧＡ
Ｒポリペプチド、即ちプレブログルカフンからオリゴペ
プチドを生成するように細胞随伴のプロテアーゼによっ
て認識される切断１ｓＪＩＩには次のものが含まれるニ
アミノ末端ペプチド ＤＱＭＮＥＤＫＲ
グルカゴン ＱＷＬＭＮＴＫＲ
スペーサーペプチドｌ ＮＲＤＤＩΔＫ
ＲＣ；ＬＰＩ ＬＶＫＧＲ
ＧＲＲスペーサーペプチド２ ＩＶＥＥＬ
ＧＲＲ本発明で用いるのに適した細胞随伴のプロテアー
ゼのための別の切断配列をシュワルツ［Ｓｃｈｗａｒｔ
ｚ１９８６、 ＦＥＢＳ ２００（ｉ）＋１］が例示し
ている。さらに、Ｃ−末端に二塩基性ジペプチドを含ん
でいる天然の、または合成の、ペプチドをコードしてい
るあらゆる配列が細胞随伴のプロテアーゼのための切断
配列を構成するであろう。第１表に挙げた切断配列のう
ち、２本鎖のインスリン受容体分子を生成するように切
断される切断配列が本発明で最も好ましい。
の供 給 源 醋り（ｉ文字の短縮形で
表示）１本鎖分子から２本鎖分子を生成するように細胞
随伴のプロテアーゼによって認識される切断配列には次
のものが含まれるインスリン受容体
ＰＲＰＳＲＫＲＲプロティンＣＫＫＲ３ＨＬＫＲ 囚子Ｘ ＱＴＬＥＲＲＫＲ
インスリン ＬＥＧＳＬＱＫＲ
およびＦＹＴＰＫＴＲＲ 分泌されたタンパク質からプロペプチドを除去するよう
に細胞随伴のプロテアーゼによって認識される切断配列
には次のものか含まれる・ グルカゴン ＭＬＶＱＧＳＷＱ
プロティンＣＱＶＬＲＩＲＫＲ 囚子ＩＸ 因子 ＫＩＬＮＲＰＫ
Ｒ囚子Ｘ 因子 ＮＩ ＬＡＲＶ
ＴＲ組織プラスミノーゲン活性化囚子 ＡＲ因子ＲＧＡ
Ｒポリペプチド、即ちプレブログルカフンからオリゴペ
プチドを生成するように細胞随伴のプロテアーゼによっ
て認識される切断１ｓＪＩＩには次のものが含まれるニ
アミノ末端ペプチド ＤＱＭＮＥＤＫＲ
グルカゴン ＱＷＬＭＮＴＫＲ
スペーサーペプチドｌ ＮＲＤＤＩΔＫ
ＲＣ；ＬＰＩ ＬＶＫＧＲ
ＧＲＲスペーサーペプチド２ ＩＶＥＥＬ
ＧＲＲ本発明で用いるのに適した細胞随伴のプロテアー
ゼのための別の切断配列をシュワルツ［Ｓｃｈｗａｒｔ
ｚ１９８６、 ＦＥＢＳ ２００（ｉ）＋１］が例示し
ている。さらに、Ｃ−末端に二塩基性ジペプチドを含ん
でいる天然の、または合成の、ペプチドをコードしてい
るあらゆる配列が細胞随伴のプロテアーゼのための切断
配列を構成するであろう。第１表に挙げた切断配列のう
ち、２本鎖のインスリン受容体分子を生成するように切
断される切断配列が本発明で最も好ましい。
切断配列中のアミノ酸残基の数がいくらか変わっていて
もよいことは当業者の理解するところであろう。活性化
されたプロティンＣを得るための本発明の方法において
は、形成期タンパク質は軽鎖のカルホキ／末端のところ
で切断され（ＫＲジペプチドのところで）、また、活性
化されな重鎖のアミノ末端のところで切断される。従っ
て、ＫＲジペプチドとタンパク質加水分解切断部位（活
性化された重鎮のアミノ末端に位置する）の間にある残
基はポリペプチドのプロセッシングの間に除去されるで
あろう。これら２つのタンパク質加水分解切断反応は軽
鎖のカルボキン末端と重鎮のアミノ末端の間のすべてを
除去するであろうから、タンパク質加水分解の切断配列
は目的産物である活性化プロティンＣの性質に影響する
ことなく付加的な残基を含むことができる。このように
、第１表に示したものより長い切断配列を本発明の方法
および化合物に用いることができる。さらに、上記の切
断配列はすべて８個の残基を含んでいるが、すべて８個
の残基が必要とされるわけではなく、それより短い配列
も本発明の方法および化合物に用いることができる。
もよいことは当業者の理解するところであろう。活性化
されたプロティンＣを得るための本発明の方法において
は、形成期タンパク質は軽鎖のカルホキ／末端のところ
で切断され（ＫＲジペプチドのところで）、また、活性
化されな重鎖のアミノ末端のところで切断される。従っ
て、ＫＲジペプチドとタンパク質加水分解切断部位（活
性化された重鎮のアミノ末端に位置する）の間にある残
基はポリペプチドのプロセッシングの間に除去されるで
あろう。これら２つのタンパク質加水分解切断反応は軽
鎖のカルボキン末端と重鎮のアミノ末端の間のすべてを
除去するであろうから、タンパク質加水分解の切断配列
は目的産物である活性化プロティンＣの性質に影響する
ことなく付加的な残基を含むことができる。このように
、第１表に示したものより長い切断配列を本発明の方法
および化合物に用いることができる。さらに、上記の切
断配列はすべて８個の残基を含んでいるが、すべて８個
の残基が必要とされるわけではなく、それより短い配列
も本発明の方法および化合物に用いることができる。
本発明のＤＮＡ配列において、タンパク質加水分解の切
断配列の暗号配列の下流にすく隣接し、そして該暗号配
列を含む翻訳リーディングフレーム内にあるのは、ヒト
プロティンＣの活性化重鎖の暗号配列である。前記のよ
うに、ヒトプロティンＣの活性化重鎖は形成期ヒトプロ
ティ／Ｃの残基２１２〜４６１からなっている。
断配列の暗号配列の下流にすく隣接し、そして該暗号配
列を含む翻訳リーディングフレーム内にあるのは、ヒト
プロティンＣの活性化重鎖の暗号配列である。前記のよ
うに、ヒトプロティンＣの活性化重鎖は形成期ヒトプロ
ティ／Ｃの残基２１２〜４６１からなっている。
以下に示すのは、本発明の好ましいＤＮＡ暗号配列から
生成したｍＲＮΔ転写体から翻訳された、プロセ・ノ／
ングされていない形成期ポリペプチドのアミノ酸残基配
列である。このポリペプチドは、ヒトプロティンＣのプ
レープロペプチドから始まり、次にヒトプロティンＣの
軽鎖、その次にしＹＳ−へＲＧジペプチド、これにイン
スリン受容体の切断配列（Ｉ Ｒ５）が続き、そしてさ
らにヒトプロティンＣの活性化重鎖へと続く。図で示す
と、このポリペプチドは次のようである ブレープロ ＬＣＫＲＩＲＳＡＨに のポリペプチドのアミノ酸残基配列は次のようである・ Ｈ２Ｎ−ＭＥＴ ＴＲＰ ＧＬＮ ＬＥｕ ＴＨＲＳＥ
ＲＬＥＤ ＩＪ：Ｕ ＬＥＵ ＰＩＥ ＶＡＬ ＡＬＡ
ＴＨＲＴＲＰ ＧＬＹ ＩＬＥＳＥＲＧＬＹ ＴＨＲ
ＰＲＯＡｕ ＰＲＯＬＥＤ ＡＳＰ ＳＥＲＶＡＬ Ｐ
）［Ｅ ＳＥＲＳＥＲＳＥＲＧＬＵ ＡＲＧＡＬＡ Ｈ
ＩＳ ＧＩＪＪ ＶＡＬ ＬＥＤ ＡＲＧ ＩＬＥ Ａ
ＪｔＧ ＬＹＳ ＡＲＧ ＡＬＡ ＡＳＷ ＳＥＲＰ）
ｔＥ ＬＥＵ ＧＬＵＧＬＵ ＬＥＤ ＡＲＧ ＨＩＳ
ＳＥＲＳＥＲＬＥＵ ＧＬＵ ＡＲＧ ＧＬＵ ＣＹ
Ｓ ＩＬＥ ＧＬｔｌ ＧＬＵ ＩＬＥ ＣＹＳＡＳＰ
Ｐ）［Ｅ ＧＬＬＩ ＧＬＵ ＡＬＡ ＬＹＳ ＧＬ
ｔｌ ＩＬＥ ＰＨＥ ＧＬＮ ＡＳＷ ＶＡＬ ＡＳ
Ｐ ＡＳＰ ＴＨＲＬＥｔｌＡＬＡ ＰＩＥ ＴＲＰ
ＳＥＲＬＹＳ ＨＩＳ ＶＡＬ ＡＳＥ’ ＧＬＹ Ａ
ＳＰ ＧＩＪＩ ＣＹＳ ＬＥＤ ＶＡＬ ＬＥＤ Ｐ
ＲＯＬＥＵ ＧＬＵ ＨＩＳ ＰＲＯＣＹＳ ＡＬＡ
ＳＥＲＬＥＤ ＣＹＳ ＣＹＳ ＧＬＹ ＨＩＳＧＬＹ
Ｔｌ（ＲＣＹＳ ＩＬＥＡＳＰ ＧＬＹ ＩＩＪ：
ＧＬＹ ＳＥＲＰＩ（Ｅ ＳＥＲＣＹＳ ＡＳＰ Ｃ
ＹＳ ＡＲＧ ＳＥＲＧＬＹ ＴＲＰ ＧＬＵ （、Ｌ
ＹＡＲＧ Ｐｌ（Ｅ ＣＹＳ ＧＬＮ ＡＲＧ ＧＬＵ
ＶＡＬ ＳＥＲＰＨＥ ＬＥＵ ＡＳＷ ＣＹＳ Ｓ
ＥＲＬＥＤ ＡＳＰ ＡＳＮＧＬＹ ＧＬＹ ＣＹＳ
Ｔ）［ＲＨＩＳ ＴＹＲＣＹＳ ＬＥＤ ＧＬＵ ＧＬ
Ｕ ＶＡＬ ＧＬＹ ＴＲＰ ＡＲＧ ＡＲＧ ＣＹＳ
ＳＥＲＣＹＳ ＡＬＡ ＰＲＯＧＬＹ ＴＹＲＬＹＳ
ＬＥＤ ＧＬＹ ＡＳＰ ＡＳＩ’ ＬＥＤ ＬＥＵ
ＧＩＪＪ ＣＹＳ ＨＩＳＰＲＯＡＬＡ ＶＡＬ ＬＹ
Ｓ ＰＩＥ ＰＲＯＣＹＳ ＧＬＹ ＡＲＧ ＰＲＯＴ
ＲＰ ＬＹＳ ＡＲＧ ＭＥＴ ＧＬｔｌ ＬＹＳＬＹ
Ｓ ＡＲＧ ＳＥＲＨＩＳ ＬＥＤ ＬＹＳ ＡＲＧ
ＰＲＯＡＲＧ ＰＲＯＳＥＲＡＲＧ ＬＹＳ ＡＲＧ
ＡＲＧ ＬＥＵＩＬＥ ＡＳＰ ＧＬＹ ＬＹＳ ＭＥ
Ｔ Ｔ）［ＲＡＲＧ ＡＲＧ ＧＬＹ ＡＳＰ ＳＥＲ
ＰＲＯＴＲＰ ＧＬＮ ＶＡＬ ＶＡＬＬＥＬＩ ＬＥ
Ｄ ＡＳＰ ＳＥＲＬＹＳ ＬＹＳ ＬＹＳ ＬＥＤ
ＡＬＡ ＣＹＳ ＧＬＹ ＡＬＡ ＶＡＬ ＬＥＤ Ｉ
ＬＥ ＨＩＳＰＲＯＳＥＲＴＲＰ ＶＡＬ ＬＥＬＩ
Ｔ）［ＲＡＬＡ ＡＬＡ ＨＩＳ ＣＹＳ ＫＴ ＡＳ
Ｐ ＧＬＵ ＳＥＲＬＹＳ ＬＹＳＬＥＵ ＬＥｔｌ
ＶＡＬ ＡＲＧ ＬＥＤ ＧＬＹ ＧＬＵ ＴＹＲＡＳ
Ｐ ＩＪ：Ｕ ＡＲＧ ＡＲＧ ＴＲＰ ＧＬＵ ＬＹ
Ｓ ＴＲＰＧＬＵ ＬＥＤ ＡＳＰ ＬＥＵ ＡＳＰ
ＩＬＥ ＬＹＳ ＧＬＵ ＶＡＬ ＰＨＥ ＶＡＬ
ＨＩＳ ＰＲＯＡＳＨＴＹＲ５ＥＲＬＹＳ ＳＥＲＴＨ
ＲＴＨＲＡＳＰ ＡＳＷ ＡＳＰ ＩＬＥ ＡＬＡ Ｌ
ＥＵ ＬＥＵ ＨＩＳ ＬＥＵ ＡＩＩＧＬＮ ＰＲＯ
ＡＬＡ ７８１ ＬＥｔｌ ＳＥＲＧＩＪＩ Ｔ皿ＩＬ
Ｅ ＶＡＬ ＰＲＯＩＬＥ ＣＹＳ ＬＥＤ ＰＲＯＡ
ＳＰ ＳＥＲＧＬＹＬＥＵ ＡＬＡ ＧＬＵ ＡＲＧ
ＧＬＵ ＬＥＵ ＡＳＮ ＧＬＮ ＡＬＡ ＧＬＹ Ｇ
ＬＮ ＧＬＵ Ｔ）ｔＲＬＥＵＶＡＬ ＴＨＲＧＬＹ
ＴＲＰ ＧＬＹ ＴＹＲＨＩＳ ＳＥＲＳＥＲＡＪｔＧ
ＧＬＵ ＬＹＳ ＧＬｔｌ ＡＬＡ ＬＹＳ ＩＪｔ
Ｇ ＡＳＮ紘ＧＴｌ（ＲＰ）［Ｅ ＶＡＬ ＬＥｔｌ
ＡＳＮ Ｐ）［Ｅ ＩＬＥ ＬＹＳ ＩＬＥ ＰＲＯＶ
ＡＬ ＶＡＬ ＰＲＯ）ＩＩＳ ＡＳＮ ＧＬＵＣＹＳ
ＳＥＲＧＬＬＩ ＶＡＬ ＭＥＴ ＳＥＲＡＳＮＭＥ
Ｔ ＶＡＬ ＳＥＲＧＬｌｌ ＡＳＮ ＩＧ：Ｔ ＬＥ
Ｄ ＣＹＳ ＡＬＡＧＬＹ ＩＬＥ ＬＥＵ ＧＬＹ
ＡＳＰ ＡＲＧ ＧＬＮ ＡＳＰ ＡＬＡ ＣＹＳ Ｇ
ＬＵＧＬＹ ＡＳＰ ＳＥＲＧＬＹ ＧＬＹＰＲＯＭＥ
Ｔ ＶＡＬ ＡＬＡ ＳＥＲＰＩ（Ｅ ＨＩＳ ＧＬＹ
Ｔ）［ＲＴＲＰ ＰＨＥ ＬＥｔｌ ＶＡＬ Ｇｒ、
Ｙ ＬＥＤ ＶＡＬＳＥＲＴＲＰ ＧＬＹ ＧＬＵＧＬ
Ｙ ＣＹＳ ＧＬＹ ＬＥＤ ＬＥＵ ＨＩＳ ＡＳＷ
ＴＹＲＧＬＹ ＶＡＬ ＴＹＲＴ）［ＲＬＹＳ ＶＡ
Ｌ ＳＥＲＡＲＧ ＴＹＲＬＥｔｌ ＡＳＰ ＴＲＰ
ＩＬＥ ＨＩＳ ＧＬＹ ＨＩＳ ＩＴ＋Ｅ ＡＲＧ
ＡＳＰ ＬＹＳＧＬＵ ＡＬＡ ＰＲＯＧＬＮ ＬＹＳ
ＳＥＲＴＲＰ ＡＬＡ ＰＲＯ−ＣＯＯＨ遺伝コード
の縮重により多種のＤＮＡ化合物が上記のポリペプチド
をコードすることができることは当業者の認識するとこ
ろであろう。従って、後記で説明する構築、ならびに本
発明の好ましいＤＮＡ化合物、ベクター、および形質転
換体についての実施例で説明する構築は単なる例示であ
って、本発明を限定するものではない。
生成したｍＲＮΔ転写体から翻訳された、プロセ・ノ／
ングされていない形成期ポリペプチドのアミノ酸残基配
列である。このポリペプチドは、ヒトプロティンＣのプ
レープロペプチドから始まり、次にヒトプロティンＣの
軽鎖、その次にしＹＳ−へＲＧジペプチド、これにイン
スリン受容体の切断配列（Ｉ Ｒ５）が続き、そしてさ
らにヒトプロティンＣの活性化重鎖へと続く。図で示す
と、このポリペプチドは次のようである ブレープロ ＬＣＫＲＩＲＳＡＨに のポリペプチドのアミノ酸残基配列は次のようである・ Ｈ２Ｎ−ＭＥＴ ＴＲＰ ＧＬＮ ＬＥｕ ＴＨＲＳＥ
ＲＬＥＤ ＩＪ：Ｕ ＬＥＵ ＰＩＥ ＶＡＬ ＡＬＡ
ＴＨＲＴＲＰ ＧＬＹ ＩＬＥＳＥＲＧＬＹ ＴＨＲ
ＰＲＯＡｕ ＰＲＯＬＥＤ ＡＳＰ ＳＥＲＶＡＬ Ｐ
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ＡＬＡ ７８１ ＬＥｔｌ ＳＥＲＧＩＪＩ Ｔ皿ＩＬ
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ＩＬＥ ＨＩＳ ＧＬＹ ＨＩＳ ＩＴ＋Ｅ ＡＲＧ
ＡＳＰ ＬＹＳＧＬＵ ＡＬＡ ＰＲＯＧＬＮ ＬＹＳ
ＳＥＲＴＲＰ ＡＬＡ ＰＲＯ−ＣＯＯＨ遺伝コード
の縮重により多種のＤＮＡ化合物が上記のポリペプチド
をコードすることができることは当業者の認識するとこ
ろであろう。従って、後記で説明する構築、ならびに本
発明の好ましいＤＮＡ化合物、ベクター、および形質転
換体についての実施例で説明する構築は単なる例示であ
って、本発明を限定するものではない。
活性化されたヒトプロティンＣを直接発現させるための
最初の試みは、部位特異的な突然変異誘発によってＡＰ
領域を削除しておいた形成期ヒトプロティンＣの暗号配
列を使用することからなっていた。図で示すと、この暗
号配列は次の構造を有していた： ブレープロ ＬＣＫＲＡＨＣ 後記実施例で説明するように、この暗号配列を組換えＤ
ＮＡ発現ベクターに挿入し、得られたベクター（ｐＬ
Ａ Ｐ Ｃと命名）を真核宿主細胞に導入した。得られ
た形質転換体は、抗−プロチインＣ抗体との反応性で調
べると正常な量の２本鎖プロティンＣを産生じていたが
、この物質はプロティンＣ活性が極めて低かった。プラ
スミドｐＬＡＰＣ構築の根拠は、ＫＲ領領域切断して２
本鎖の酵素前駆体を生成させる原因であるどのようなタ
ンパク質加水分解活性も、たぶんＡＰ領域を欠いたプロ
ティンＣ分子を切断するように作用するであろうという
ものであった。ＡＰを欠いたプロティンＣ暗号配列を発
現する細胞から２本鎖の物質が得られることが観察され
たが、この物質は低レベルの活性化ヒトプロティンＣの
アミド分解活性を有しているにすぎなかった。しかし、
活性化されたプロティンＣ活性を発現させる際のその有
用性に加えて、プラスミドｐＬＡＰＣは、活性化ヒトプ
ロティンＣを高レベルで直接組換え発現させる本発明の
他のベクターを構築するための有用な出発物質としても
用いられる。出発プラスミドｐＨＣ７からのプラスミド
ｐＬＡＰＣの構築のプロトコールを実施例１で説明する
。プラスミドｐＨＣ７は、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・センター（Ｎ ＲＲＬ ； Ｐｅｏｒｉａ、
ＩＬ ６１６０４）から、取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−
１５９２６のもと、大腸菌に１２ＲＲＩ／ｐＨＣ７で入
手できる。
最初の試みは、部位特異的な突然変異誘発によってＡＰ
領域を削除しておいた形成期ヒトプロティンＣの暗号配
列を使用することからなっていた。図で示すと、この暗
号配列は次の構造を有していた： ブレープロ ＬＣＫＲＡＨＣ 後記実施例で説明するように、この暗号配列を組換えＤ
ＮＡ発現ベクターに挿入し、得られたベクター（ｐＬ
Ａ Ｐ Ｃと命名）を真核宿主細胞に導入した。得られ
た形質転換体は、抗−プロチインＣ抗体との反応性で調
べると正常な量の２本鎖プロティンＣを産生じていたが
、この物質はプロティンＣ活性が極めて低かった。プラ
スミドｐＬＡＰＣ構築の根拠は、ＫＲ領領域切断して２
本鎖の酵素前駆体を生成させる原因であるどのようなタ
ンパク質加水分解活性も、たぶんＡＰ領域を欠いたプロ
ティンＣ分子を切断するように作用するであろうという
ものであった。ＡＰを欠いたプロティンＣ暗号配列を発
現する細胞から２本鎖の物質が得られることが観察され
たが、この物質は低レベルの活性化ヒトプロティンＣの
アミド分解活性を有しているにすぎなかった。しかし、
活性化されたプロティンＣ活性を発現させる際のその有
用性に加えて、プラスミドｐＬＡＰＣは、活性化ヒトプ
ロティンＣを高レベルで直接組換え発現させる本発明の
他のベクターを構築するための有用な出発物質としても
用いられる。出発プラスミドｐＨＣ７からのプラスミド
ｐＬＡＰＣの構築のプロトコールを実施例１で説明する
。プラスミドｐＨＣ７は、ノーザン・リージョナル・リ
サーチ・センター（Ｎ ＲＲＬ ； Ｐｅｏｒｉａ、
ＩＬ ６１６０４）から、取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−
１５９２６のもと、大腸菌に１２ＲＲＩ／ｐＨＣ７で入
手できる。
活性化プロティンＣを直接発現させる別の試みは、タン
パク質加水分解切断配列がプロティンＣ暗号配列中、Ａ
Ｐ暗号配列とＡＨＣ暗号配列の間に挿入された暗号配列
を創製することからなっていた。タンパク質加水分解切
断部位を、インスリン受容体由来のタンパク質加水分解
切断配列とともに導入した。従って、この暗号配列は図
で示すと次の構造を有していた ブレープロ ＬＣＫＲＡＰ ＩＲＳＡＨに の暗号配列をプラスミドｐＬＡＰＣに類似するベクター
中に挿入してプラスミドｐＬＰＣ−ＩＲＳを得た。しか
し、プラスミドｐＬＰＣ−ＩＲＳを真核宿主細胞中に導
入しても、検出しうるプロティンＣ活性または抗原を産
生ずる形質転換体は得られなかった。
パク質加水分解切断配列がプロティンＣ暗号配列中、Ａ
Ｐ暗号配列とＡＨＣ暗号配列の間に挿入された暗号配列
を創製することからなっていた。タンパク質加水分解切
断部位を、インスリン受容体由来のタンパク質加水分解
切断配列とともに導入した。従って、この暗号配列は図
で示すと次の構造を有していた ブレープロ ＬＣＫＲＡＰ ＩＲＳＡＨに の暗号配列をプラスミドｐＬＡＰＣに類似するベクター
中に挿入してプラスミドｐＬＰＣ−ＩＲＳを得た。しか
し、プラスミドｐＬＰＣ−ＩＲＳを真核宿主細胞中に導
入しても、検出しうるプロティンＣ活性または抗原を産
生ずる形質転換体は得られなかった。
活性化プロティンＣを直接発現させる本発明方法は、Ａ
Ｐ暗号配列をＩＲＳ暗号配列に置き換えた後にだけ達成
された。得られた暗号配列は図で示すと次の構造を有し
てした プレープロ ＬＣＫＲＩＲＳΔＨＣ ＡＰ暗号配列がＴＲ３配列で置き換えられているこの暗
号配列の構築を実施例３で説明する。重要なことは、こ
の構築がプロティンＣ暗号配列の部位特異的な突然変異
誘発を含んでいるということである。活性化ペプチドを
コードしているＤＮＡを含有するプロティンＣ暗号配列
の一部をプラスミドｐＨＣ７から単離し、ファージＭ１
３ｍｐ１８に挿入し、次いで部位特異的な突然変異誘発
によって変えた。次に、この突然変異暗号配列を真核生
物性のクローニングベクター中にクローニングして、Ｋ
ＲおよびＡ ＨＣ暗号配列の間にＩＲＳ暗号配列を挿入
したこと以外はプラスミドｐＬＡＰＣと同一である、ｐ
ＬＡ、ＰＣ−ＩＲＳと命名したプラスミドを得た。プラ
スミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳは、ＡＰ暗号配列の削除がプ
ラスミドｐＬＰＣ−ＩＲＳと異なっているだけである。
Ｐ暗号配列をＩＲＳ暗号配列に置き換えた後にだけ達成
された。得られた暗号配列は図で示すと次の構造を有し
てした プレープロ ＬＣＫＲＩＲＳΔＨＣ ＡＰ暗号配列がＴＲ３配列で置き換えられているこの暗
号配列の構築を実施例３で説明する。重要なことは、こ
の構築がプロティンＣ暗号配列の部位特異的な突然変異
誘発を含んでいるということである。活性化ペプチドを
コードしているＤＮＡを含有するプロティンＣ暗号配列
の一部をプラスミドｐＨＣ７から単離し、ファージＭ１
３ｍｐ１８に挿入し、次いで部位特異的な突然変異誘発
によって変えた。次に、この突然変異暗号配列を真核生
物性のクローニングベクター中にクローニングして、Ｋ
ＲおよびＡ ＨＣ暗号配列の間にＩＲＳ暗号配列を挿入
したこと以外はプラスミドｐＬＡＰＣと同一である、ｐ
ＬＡ、ＰＣ−ＩＲＳと命名したプラスミドを得た。プラ
スミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳは、ＡＰ暗号配列の削除がプ
ラスミドｐＬＰＣ−ＩＲＳと異なっているだけである。
プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳｔＭ築のプロトコールを
実施例３で詳細に説明する。
実施例３で詳細に説明する。
後記実施例に記・戟した部位特異的な突然変異誘発の方
法は例示であって、この方法を用いて、ＩＲＳ暗号配列
が細胞随伴のプロテアーゼのタンパク質加水分解切断部
位のための別の暗号配列で置き換えられている本発明の
他の化合物を得ることができる。また、本発明のＤＮＡ
化合物を、化学的に、あるいは制限フラグメントの組合
せによって、あるいは当分野で既知の方法を組合せるこ
とによって合成することかできる。さらに、ＤＮＡ合成
機も使用することができ、これを用いて本発明の化合物
を構築することができる。
法は例示であって、この方法を用いて、ＩＲＳ暗号配列
が細胞随伴のプロテアーゼのタンパク質加水分解切断部
位のための別の暗号配列で置き換えられている本発明の
他の化合物を得ることができる。また、本発明のＤＮＡ
化合物を、化学的に、あるいは制限フラグメントの組合
せによって、あるいは当分野で既知の方法を組合せるこ
とによって合成することかできる。さらに、ＤＮＡ合成
機も使用することができ、これを用いて本発明の化合物
を構築することができる。
本発明の例示ベクターであるプラスミドｐＬＡＰＣ−Ｉ
Ｒ３は、本発明の新規活性化プロティンＣ暗号配列の
アデノウィルス主後期プロモーターによる転写を刺激す
るように設置されたＢＫエンハンサ−を含有している。
Ｒ３は、本発明の新規活性化プロティンＣ暗号配列の
アデノウィルス主後期プロモーターによる転写を刺激す
るように設置されたＢＫエンハンサ−を含有している。
極めて多数の真核性のプロモーター、エンハンサ−１お
よび発現ベクターが当分野で知られていること、ならび
にこれらを本発明方法で用いることができることは当業
者の認識するところである。また、当業者は、真核性の
発現ベクターがエンハンサ−要素なしで機能しうろこと
も認識している。本発明の鍵となる点は、活性化プロテ
ィンＣを発現させるために用いる特定のエンハンサ−あ
るいはプロモーターにあるのではなく、むしろ、プロテ
ィンＣの暗号配列中のタンパク質加水分解切断配列を用
いて組換え細胞から活性化プロティンＣを直接産生させ
ることにある。
よび発現ベクターが当分野で知られていること、ならび
にこれらを本発明方法で用いることができることは当業
者の認識するところである。また、当業者は、真核性の
発現ベクターがエンハンサ−要素なしで機能しうろこと
も認識している。本発明の鍵となる点は、活性化プロテ
ィンＣを発現させるために用いる特定のエンハンサ−あ
るいはプロモーターにあるのではなく、むしろ、プロテ
ィンＣの暗号配列中のタンパク質加水分解切断配列を用
いて組換え細胞から活性化プロティンＣを直接産生させ
ることにある。
しかし、プロモーター、エンハンサ−１および選択マー
カーなどのベクター要素の選択は、真核宿主細胞が産生
ずる活性化プロティンＣの最終レベルに大きな影響を与
える。米国特許出願Ｎｏ、８４９、９９９（ｉ９８６年
４月９日出願）は、ヒトプロティンＣを発現させるよう
に設置した真核性のプロモーターを刺激するためにＢＫ
エンハンサ−を利用している、酵素前駆体プロティンＣ
用の多数の発現ベクターを開示している。これらのベク
ターは、真核細胞に導入したとき特に高いレベルで発現
をし、また大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物、
例えばアゾンウィルスのＥＩＡ遺伝子産物なども発現さ
せる。本明細書中に記載した例示ベクター要素八ＰＣ−
ＩＲＳから明らかなように、Ｎｏ、８４９９９９のＢＫ
エンハンサー−ＣＩ Ａ遣（ｍ子産物）発現方法は本発
明のベクターで用いるのに特に好ましい。
カーなどのベクター要素の選択は、真核宿主細胞が産生
ずる活性化プロティンＣの最終レベルに大きな影響を与
える。米国特許出願Ｎｏ、８４９、９９９（ｉ９８６年
４月９日出願）は、ヒトプロティンＣを発現させるよう
に設置した真核性のプロモーターを刺激するためにＢＫ
エンハンサ−を利用している、酵素前駆体プロティンＣ
用の多数の発現ベクターを開示している。これらのベク
ターは、真核細胞に導入したとき特に高いレベルで発現
をし、また大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物、
例えばアゾンウィルスのＥＩＡ遺伝子産物なども発現さ
せる。本明細書中に記載した例示ベクター要素八ＰＣ−
ＩＲＳから明らかなように、Ｎｏ、８４９９９９のＢＫ
エンハンサー−ＣＩ Ａ遣（ｍ子産物）発現方法は本発
明のベクターで用いるのに特に好ましい。
本発明は特定の真核宿主細胞の使用に限定されるもので
はない。多種の真核宿主細胞が寄託所、例えばアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレク’ｙＢン［Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ（Ａ ＴＣＣ）、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＶＤ
２０８５２］などから入手可能であり、本発明のベクタ
ーとともに用いるのに適している。特定の宿主細胞の選
択は、ある程度は本発明の活性化プロティンＣをコード
しているＤＮＡ化合物を発現させるために用いる特定の
発現ベクターに依存している。しかし、プロティンＣ酵
素前駆体は実質的な翻訳後修飾を受けるので、ある種の
宿主細胞が本発明のベクターととしに用いるのにより好
ましい。米国特許比”ＥＡ Ｎ ｏ、 ８４９．９９９
およびグリン不ル等（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｉ、
、 １９８７．Ｂｉ。
はない。多種の真核宿主細胞が寄託所、例えばアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレク’ｙＢン［Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ（Ａ ＴＣＣ）、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ＶＤ
２０８５２］などから入手可能であり、本発明のベクタ
ーとともに用いるのに適している。特定の宿主細胞の選
択は、ある程度は本発明の活性化プロティンＣをコード
しているＤＮＡ化合物を発現させるために用いる特定の
発現ベクターに依存している。しかし、プロティンＣ酵
素前駆体は実質的な翻訳後修飾を受けるので、ある種の
宿主細胞が本発明のベクターととしに用いるのにより好
ましい。米国特許比”ＥＡ Ｎ ｏ、 ８４９．９９９
およびグリン不ル等（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｉ、
、 １９８７．Ｂｉ。
／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１８９）には、アデノ
ウィルスで形質転換したヒト胚腎細胞が、ヒトプロティ
ンＣなどのγ−力ルホキンル化されたタンパク質の組換
え製造において用いるのに特に好ましいことが記載され
ている。このようなアデノウィルスで形質転換したヒト
肝腎セルラインの１つは、ＡＴＣＣから取得番号ＣＲＬ
１５７３のもとて入手可能な２９３セルラインであ
る。この２９３セルラインは本発明のベクターとともに
用いるのにも好ましい。
ウィルスで形質転換したヒト胚腎細胞が、ヒトプロティ
ンＣなどのγ−力ルホキンル化されたタンパク質の組換
え製造において用いるのに特に好ましいことが記載され
ている。このようなアデノウィルスで形質転換したヒト
肝腎セルラインの１つは、ＡＴＣＣから取得番号ＣＲＬ
１５７３のもとて入手可能な２９３セルラインであ
る。この２９３セルラインは本発明のベクターとともに
用いるのにも好ましい。
しかし、アデノウィルスで形質転換されたセルライン中
でγ−カルボキシル化されたタンパク質（例えば、ヒト
プロティンＣなど）を産生させることの利点は、アデノ
ウィルスで形質転換されたヒト胚腎細胞に限定されるも
のではない。実際のところ、アデノウィルスで形質転換
された細胞はγカルボキシル化されたヒトプロティンＣ
の産生用としては一般的には例外的な宿主である。この
型の特に好ましいセルラインの１つは、ＡＴＣＣから取
得番号ＣＲＬ ９５９５のもとて人手可能なＡＶ１２
−６６４（以下、Ａｖ１２という）セルラインである。
でγ−カルボキシル化されたタンパク質（例えば、ヒト
プロティンＣなど）を産生させることの利点は、アデノ
ウィルスで形質転換されたヒト胚腎細胞に限定されるも
のではない。実際のところ、アデノウィルスで形質転換
された細胞はγカルボキシル化されたヒトプロティンＣ
の産生用としては一般的には例外的な宿主である。この
型の特に好ましいセルラインの１つは、ＡＴＣＣから取
得番号ＣＲＬ ９５９５のもとて人手可能なＡＶ１２
−６６４（以下、Ａｖ１２という）セルラインである。
ヒトアデノウィルス１２をゴールデンハムスターの首筋
に注射し、生した腫瘍から細胞を単離することによって
、このＡＶ１２セルラインを作成した。後記実施例４は
、例示ベクターｐＬＡＰＣ−ＩＲＳによる２９３および
ＡＶ１２の両セルラインの形質転換を記載するものであ
る。
に注射し、生した腫瘍から細胞を単離することによって
、このＡＶ１２セルラインを作成した。後記実施例４は
、例示ベクターｐＬＡＰＣ−ＩＲＳによる２９３および
ＡＶ１２の両セルラインの形質転換を記載するものであ
る。
本発明のベクターを、多種の真核宿主細胞、特に咄乳動
物宿主細胞に導入し、発現させることができる。安定な
真核細胞形質転換体を単離し、同定するための選択マー
カーを全（持っていない本発明のベクターは、−時的な
検定用にだけでなく、米国特許Ｎｏ、 ４．３９９．２
１６ （ｉ９８３年８月２６日発行）に記載されている
方法である同時形質転換用にも有用である。また、本発
明のベクターは、大腸菌中での複製を可能にする配列を
含むことができる（一般に、大腸菌中でプラスミドＤＮ
Ａを調製する方が他の宿主微生物中で調製するより効率
的であるので）。
物宿主細胞に導入し、発現させることができる。安定な
真核細胞形質転換体を単離し、同定するための選択マー
カーを全（持っていない本発明のベクターは、−時的な
検定用にだけでなく、米国特許Ｎｏ、 ４．３９９．２
１６ （ｉ９８３年８月２６日発行）に記載されている
方法である同時形質転換用にも有用である。また、本発
明のベクターは、大腸菌中での複製を可能にする配列を
含むことができる（一般に、大腸菌中でプラスミドＤＮ
Ａを調製する方が他の宿主微生物中で調製するより効率
的であるので）。
本発明のベクターに含まれる活性化ヒトプロティンＣの
構造遺伝子の直接発現は、この構造遺伝子に関連する特
定のプロモーターが機能する宿主細胞で起こる。本発明
で用いるのに適した宿主細胞の例を、適切な注とともに
第２表に挙げる。
構造遺伝子の直接発現は、この構造遺伝子に関連する特
定のプロモーターが機能する宿主細胞で起こる。本発明
で用いるのに適した宿主細胞の例を、適切な注とともに
第２表に挙げる。
第２表
宿主細胞 由 来 供給函
注ｔｌｅｐＧ−２ヒト肝１［１１１ｍ ＡＴＣＣ
Ｉｔ ＨＢ ８０６５ ＊ＣＭ−１アフリカミドリ ザル腎臓 ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ ７０ＬＬＣ
−ＭＫ 、原型 アカゲザル腎臓 ＡＴＣＣＩｆ
ＣＣＬ ７ＬＬＣ−ＭＫ 、誘導体 アカゲザル腎臓
ＡＴＣＣＩｆ ＣＣＬ ７．１ ＊＊３Ｔ３
マウス胚線維芽細胞 ＡＴＣＣ＃ Ｃ
ＣＬ ９２ＣＨＯ−Ｋ ｌ チャイニーズハ
ムスター卵巣 ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ ６１
＊＊＊ＨｅＬａ ヒト頚部エピテロイド
ＡＴＣＣＩｔ ＣＣＬ ２ＲＰＭＩ８２２
６ ヒト骨髄腫 ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ
１５５ ＊★＊＊１１４１１Ｅｃ３ ラ
ット肝腫瘍 ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ １６００
＊＊＊＊＊Ｃ１２７１マウス線維芽細胞 ＡＴＣＣ！
ｌ ＣＲＬ １６１６１１Ｓ−８ｕｌｔａｎ ヒ
ト血漿細胞プラスマ細胞腫 ＡＴＣＣｉｔ Ｃ
ＲＬ １４１’！４ＢＩＩＫ−２１幼ハムスター腎臓
ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ １０＊ このセルラインを使
用することは米国特許Ｎｏ、 ４．３９３．１３３に記
載されている。
注ｔｌｅｐＧ−２ヒト肝１［１１１ｍ ＡＴＣＣ
Ｉｔ ＨＢ ８０６５ ＊ＣＭ−１アフリカミドリ ザル腎臓 ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ ７０ＬＬＣ
−ＭＫ 、原型 アカゲザル腎臓 ＡＴＣＣＩｆ
ＣＣＬ ７ＬＬＣ−ＭＫ 、誘導体 アカゲザル腎臓
ＡＴＣＣＩｆ ＣＣＬ ７．１ ＊＊３Ｔ３
マウス胚線維芽細胞 ＡＴＣＣ＃ Ｃ
ＣＬ ９２ＣＨＯ−Ｋ ｌ チャイニーズハ
ムスター卵巣 ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ ６１
＊＊＊ＨｅＬａ ヒト頚部エピテロイド
ＡＴＣＣＩｔ ＣＣＬ ２ＲＰＭＩ８２２
６ ヒト骨髄腫 ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ
１５５ ＊★＊＊１１４１１Ｅｃ３ ラ
ット肝腫瘍 ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ １６００
＊＊＊＊＊Ｃ１２７１マウス線維芽細胞 ＡＴＣＣ！
ｌ ＣＲＬ １６１６１１Ｓ−８ｕｌｔａｎ ヒ
ト血漿細胞プラスマ細胞腫 ＡＴＣＣｉｔ Ｃ
ＲＬ １４１’！４ＢＩＩＫ−２１幼ハムスター腎臓
ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ １０＊ このセルラインを使
用することは米国特許Ｎｏ、 ４．３９３．１３３に記
載されている。
Ｕ ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ ７より早く増殖する。
＊＊＊ プロリンを必要とする。ｄｈｒｒ−誘導体Ｄ
ＸＢ１１など、Ｃｌｌ０−Ｋ ｌの誘導体をこの宿主か
ら得ることができる。
ＸＢ１１など、Ｃｌｌ０−Ｋ ｌの誘導体をこの宿主か
ら得ることができる。
＊＊＊＊ ＩｇＧλ型の軽鎖を分泌する。
＊＊＊＊ｉｌ ８−アザグアニン耐性のＦＡＺＡ宿主細
胞などの誘導体をこの宿主から得ることができる。
胞などの誘導体をこの宿主から得ることができる。
第２表に示したように、多数の哺乳動物宿主細胞が、本
発明の化合物上のタンパク質加水分解切断部位およびン
グナルベブチドを認識して適切にブロセソンングするた
めに必要な細胞機構を備えており、血漿中に存在するヒ
トプロティンＣで観察されるようなグリコジル化、γ−
カルボキシル化、およびβ−ヒドロキンル化などの翻訳
後修飾を付与する。後記のような多種多様のベクターが
このような真核宿主細胞の形質転換用に存在しているが
、以下に例示する特定のベクターは本発明の範囲を限定
しようとするものではない。
発明の化合物上のタンパク質加水分解切断部位およびン
グナルベブチドを認識して適切にブロセソンングするた
めに必要な細胞機構を備えており、血漿中に存在するヒ
トプロティンＣで観察されるようなグリコジル化、γ−
カルボキシル化、およびβ−ヒドロキンル化などの翻訳
後修飾を付与する。後記のような多種多様のベクターが
このような真核宿主細胞の形質転換用に存在しているが
、以下に例示する特定のベクターは本発明の範囲を限定
しようとするものではない。
ｐＳ■２型のベクターは、明確な真核性の転写単位−プ
ロモーター（ｅｐ）、介在配列（ＩＶｓ）、およびポリ
アデニル化（ｐＡ）部位−を構成している５Ｖ４Ｑゲノ
ムのセグメントを含有している。ＳＶ４０のＴ−抗原の
ないところでは、プラスミドｐｓｖ２型のベクターは宿
主細胞の染色体ＤＮＡ中に組込まれることによって哺乳
動物宿主細胞およびその池の真核宿主細胞を形質転換す
る。ＳＶ４０プロモーターが挿入遺伝子を転写させる、
プラスミドｐＳ Ｖ ２−ｇｐｔ、ｐＳ Ｖ ２−ｎｅ
ｏ、 ｐＳ Ｖ ２ｄｈｒｒ、 ｐＳ Ｖ ２−ｈｙｇ
、およびｐＳ Ｖ ２ Ｊ−グロビンなとの多種のプラ
スミドｐＳ ｖ ２型のベクターが構築されている［
ｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓＪ、グルズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）ｉ、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ＋ Ｎｅｅｒ
Ｙｏｒｋ。
ロモーター（ｅｐ）、介在配列（ＩＶｓ）、およびポリ
アデニル化（ｐＡ）部位−を構成している５Ｖ４Ｑゲノ
ムのセグメントを含有している。ＳＶ４０のＴ−抗原の
ないところでは、プラスミドｐｓｖ２型のベクターは宿
主細胞の染色体ＤＮＡ中に組込まれることによって哺乳
動物宿主細胞およびその池の真核宿主細胞を形質転換す
る。ＳＶ４０プロモーターが挿入遺伝子を転写させる、
プラスミドｐＳ Ｖ ２−ｇｐｔ、ｐＳ Ｖ ２−ｎｅ
ｏ、 ｐＳ Ｖ ２ｄｈｒｒ、 ｐＳ Ｖ ２−ｈｙｇ
、およびｐＳ Ｖ ２ Ｊ−グロビンなとの多種のプラ
スミドｐＳ ｖ ２型のベクターが構築されている［
ｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓＪ、グルズマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）ｉ、コールド・ス
プリング・ハーバ−・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ ｌ１ａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ＋ Ｎｅｅｒ
Ｙｏｒｋ。
１９８２）版を参照］。これらのベクターは本発明の暗
号配列とともに用いるのに適しており、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ！Ａａｒｙｌａｎ
ｄ）またはノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラ
トリ−（Ｎ ＲＲＬ ）（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｐｅｏｒｉａ、 １ｌｌｉｎｏｉｓ）から人手する
ことができる。
号配列とともに用いるのに適しており、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃ
ｔｉｏｎ、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、 ！Ａａｒｙｌａｎ
ｄ）またはノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラ
トリ−（Ｎ ＲＲＬ ）（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｐｅｏｒｉａ、 １ｌｌｉｎｏｉｓ）から人手する
ことができる。
プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）
は、５Ｖ４Ｑ初期プロモーターの支配下にある不ズミの
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有してい
る。適当な条件下では、このｄｈｆｒ遺伝子は宿主の染
色体中で増幅されるか、またはコピーされることが知ら
れている。シムケの総説（Ｓｃｈｉｍｋｅ。
は、５Ｖ４Ｑ初期プロモーターの支配下にある不ズミの
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を含有してい
る。適当な条件下では、このｄｈｆｒ遺伝子は宿主の染
色体中で増幅されるか、またはコピーされることが知ら
れている。シムケの総説（Ｓｃｈｉｍｋｅ。
１９８４、Ｃｅ１ｌ ３？ニアＱ５−７１３）に記載さ
れているこの増幅は、ｄｈｆｒ遺伝子に密に隣接してい
るＤＮＡ配列（例えば、本発明の活性化ヒトプロティン
Ｃをコードしている配列など）を包含することができ、
従ってこれを用いて活性化プロティンＣの産生を増加さ
せることができる。
れているこの増幅は、ｄｈｆｒ遺伝子に密に隣接してい
るＤＮＡ配列（例えば、本発明の活性化ヒトプロティン
Ｃをコードしている配列など）を包含することができ、
従ってこれを用いて活性化プロティンＣの産生を増加さ
せることができる。
哺乳動物宿主細胞およびその他の真核宿主細胞中で活性
化プロティンＣ活性を発現させるために構築した本発明
のプラスミドは、多種多様のプロモーターを利用するこ
とができる。本発明は、本明細書中に例示した特定の真
核生物性プロモーターを用いることに限定されるもので
はない。ブノチャー等［Ｂｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ、、
１９８６． Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
化プロティンＣ活性を発現させるために構築した本発明
のプラスミドは、多種多様のプロモーターを利用するこ
とができる。本発明は、本明細書中に例示した特定の真
核生物性プロモーターを用いることに限定されるもので
はない。ブノチャー等［Ｂｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ、、
１９８６． Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
１４（２４）：１００９］が開示している真核生物性プ
ロモーターあるいはＳＶ４０後期プロモーターなどのプ
ロモーター、または、例えばエストロゲン誘導が可能な
ニワトリ卵アルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子
、グルココルチコイド誘導が可能なチロシンアミノトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子などの
真核生物性遺伝子、および主初期および後期アデノウィ
ルス遺伝子からのプロモーターを容易に単離することが
でき、そして真核宿主細胞においてプロティンＣを産生
ずるように設計した組換えＤ Ｎ Ａ発現ベクターで用
いるように修飾することができる。また、真核生物性プ
ロモーターを直列で用いてプロティンＣを発現させるこ
ともできる。さらに、多数のレトロウィルスが、広範囲
の真核宿主細胞に感染することが知られている。レトロ
ウィルスＤＮＡ中の長末端反復はプロモーター活性をコ
ードしていることが多く、従って活性化ヒトプロティン
Ｃを発現させるのに用いることができる。
ロモーターあるいはＳＶ４０後期プロモーターなどのプ
ロモーター、または、例えばエストロゲン誘導が可能な
ニワトリ卵アルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子
、グルココルチコイド誘導が可能なチロシンアミノトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子などの
真核生物性遺伝子、および主初期および後期アデノウィ
ルス遺伝子からのプロモーターを容易に単離することが
でき、そして真核宿主細胞においてプロティンＣを産生
ずるように設計した組換えＤ Ｎ Ａ発現ベクターで用
いるように修飾することができる。また、真核生物性プ
ロモーターを直列で用いてプロティンＣを発現させるこ
ともできる。さらに、多数のレトロウィルスが、広範囲
の真核宿主細胞に感染することが知られている。レトロ
ウィルスＤＮＡ中の長末端反復はプロモーター活性をコ
ードしていることが多く、従って活性化ヒトプロティン
Ｃを発現させるのに用いることができる。
プラスミドｐＲＳ Ｖｃａｔ（ＡＴＣＣ３７１５２）は
、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ；ニワトリおよびその他
の宿主細胞を感染させることか知られているウィルス）
の長末端反復の部分を含有している。Ｒ３Ｖの長末端反
復配列をプラスミドｐＲ３Ｖ ｃａｔの〜０．７６ｋｂ
Ｎｄｅｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントで単離す
ることができる。Ｒ３Ｖの長末端反復中のプロモーター
［ゴーマン等（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔａｌ、 １９８２
． Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、 ７９二６７７７）］は本発明の
ベクターで用いるのに適している。プラスミドｐＭＳＶ
ｉ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２９）は、ネズミ肉腫ウィ
ルス（ＭＳＶ：マウスおよびその他の宿主細胞を感染さ
せることが知られているウィルス）の長末端反復を含有
している。これらの反りｕ配列は本発明のベクター中の
プロモーターとして用いるのに適している。また、マウ
スのメタロチオネイン（ＭＭＴ）プロモーターは、真核
宿主細胞での使用用にその特徴がよく調べられており、
本発明のベクターで用いるのに適している。このＭＭＴ
プロモーターは１５ｋｂのプラスミドｐｄＢ Ｐ Ｖ−
ＭＭＴｎｅ。
、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ；ニワトリおよびその他
の宿主細胞を感染させることか知られているウィルス）
の長末端反復の部分を含有している。Ｒ３Ｖの長末端反
復配列をプラスミドｐＲ３Ｖ ｃａｔの〜０．７６ｋｂ
Ｎｄｅｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントで単離す
ることができる。Ｒ３Ｖの長末端反復中のプロモーター
［ゴーマン等（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔａｌ、 １９８２
． Ｐ、Ｎ、＾、Ｓ、 ７９二６７７７）］は本発明の
ベクターで用いるのに適している。プラスミドｐＭＳＶ
ｉ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２９）は、ネズミ肉腫ウィ
ルス（ＭＳＶ：マウスおよびその他の宿主細胞を感染さ
せることが知られているウィルス）の長末端反復を含有
している。これらの反りｕ配列は本発明のベクター中の
プロモーターとして用いるのに適している。また、マウ
スのメタロチオネイン（ＭＭＴ）プロモーターは、真核
宿主細胞での使用用にその特徴がよく調べられており、
本発明のベクターで用いるのに適している。このＭＭＴ
プロモーターは１５ｋｂのプラスミドｐｄＢ Ｐ Ｖ−
ＭＭＴｎｅ。
（ＡＴＣＣ３７２２４）中に存在しており、本発明の他
のプラスミドを構築するための出発物質として用いるこ
とができる。
のプラスミドを構築するための出発物質として用いるこ
とができる。
本発明の例示ＤＮＡ配列およびプラスミドには多数の修
飾および変異が可能である。例えば、遺伝子コードの縮
重は、コードされているポリペプチドの暗号配列を変え
ることなく、ポリペプチド暗号領域中の、ならびに翻訳
停止／グチル中のヌクレオチドを置換することを可能に
する。このような置換しつる配列はヒトプロティンＣの
既知のアミノ酸およびＤＮＡ配列から推定することがで
き、次の一般的な合成法あるいは部位特異的な突然変異
誘発法によって構築することができる。合成法は、実質
的にイタクラ等（Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｔ、、 １
９７７ ５ｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６）およびフ
レア等（Ｃｒｅａ ｅｔａｌ、、 １９７８． Ｆ’
ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７５：５
７６５）の方法に従って行うことができる。従って、本
発明は具体的に例示したＤＮＡ配列およびプラスミドに
限定されるものではない。
飾および変異が可能である。例えば、遺伝子コードの縮
重は、コードされているポリペプチドの暗号配列を変え
ることなく、ポリペプチド暗号領域中の、ならびに翻訳
停止／グチル中のヌクレオチドを置換することを可能に
する。このような置換しつる配列はヒトプロティンＣの
既知のアミノ酸およびＤＮＡ配列から推定することがで
き、次の一般的な合成法あるいは部位特異的な突然変異
誘発法によって構築することができる。合成法は、実質
的にイタクラ等（Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｔ、、 １
９７７ ５ｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６）およびフ
レア等（Ｃｒｅａ ｅｔａｌ、、 １９７８． Ｆ’
ｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ７５：５
７６５）の方法に従って行うことができる。従って、本
発明は具体的に例示したＤＮＡ配列およびプラスミドに
限定されるものではない。
本発明のベクターを真核宿主細胞に導入した後、選択し
うる表現型に基づいて形質転換体を選択することができ
る。この選択しうる表現型は、発現ベクターに存在する
選択マーカーによって、または宿主細胞に発現ベクター
と同時導入される別のベクターに存在する選択マーカー
によって付与することができる。形質転換体が選択され
たら、どの形質転換体が発現ベクターにコードされてい
る所望のタンパク質を最高レベルで発現しているかを同
定するのが望ましい。このような同定は、選択マーカー
を含むプラスミドだけを含有し、発現ベクターを含有し
ていない形質転換体を多数生成する同時形質転換法の後
では特に重要である。
うる表現型に基づいて形質転換体を選択することができ
る。この選択しうる表現型は、発現ベクターに存在する
選択マーカーによって、または宿主細胞に発現ベクター
と同時導入される別のベクターに存在する選択マーカー
によって付与することができる。形質転換体が選択され
たら、どの形質転換体が発現ベクターにコードされてい
る所望のタンパク質を最高レベルで発現しているかを同
定するのが望ましい。このような同定は、選択マーカー
を含むプラスミドだけを含有し、発現ベクターを含有し
ていない形質転換体を多数生成する同時形質転換法の後
では特に重要である。
従って、本発明は、所望のタンパク質を発現し、分泌す
る細胞の新規同定方法たけでなく、この方法を用いて試
験した他の細胞との比較においてタンパク質分泌量を定
量するための新規方法をも提供するものである。また、
この方法は、所望のタンパク質を分泌している細胞を生
存している状態で単離することを可能にする。この方法
はあらゆる分泌タンパク質１こ一般的に適用することが
できるが、本明細書中では特に活性化プロティンＣにつ
いて説明した。さらに、この方法は、真核生物性であっ
ても原核生物性であっても、また形質転換されたもので
あっても天然のものであっても、あらゆる細胞に適用す
ることができるが、本明細書中では真核生物性形質転換
体への適用によって説明した。
る細胞の新規同定方法たけでなく、この方法を用いて試
験した他の細胞との比較においてタンパク質分泌量を定
量するための新規方法をも提供するものである。また、
この方法は、所望のタンパク質を分泌している細胞を生
存している状態で単離することを可能にする。この方法
はあらゆる分泌タンパク質１こ一般的に適用することが
できるが、本明細書中では特に活性化プロティンＣにつ
いて説明した。さらに、この方法は、真核生物性であっ
ても原核生物性であっても、また形質転換されたもので
あっても天然のものであっても、あらゆる細胞に適用す
ることができるが、本明細書中では真核生物性形質転換
体への適用によって説明した。
タンパク質を発現し分泌する細胞を同定し分離するため
の本方法、および本方法で試験した他の細胞との関連に
おいて産生タンパク質量を定量するための本方法は、（
ａ）適当な固体基質上に細胞集団を得：（ｂ）該細胞に
滅菌寒天のフィルムをかフセ； （ｃ）該フィルム上に
ニトロセルロースのシートを置き；そして（ｄ）該シー
トを取り、該タンパク質に対する抗体を用いて該シート
に結合した該タンパク質を検出することからなる。タン
パク質と結合するあらゆる膜をニトロセルロースに代え
て用いることができ、これにはナイロン、ＤＢＭ、ある
いは酢酸セルロースが含まれる。また、ゼラチンを寒天
に代えて用いることができる。高レベルタンパク質の分
泌細胞を同定するための本方法を後記実施例５でさらに
詳しく説明する。
の本方法、および本方法で試験した他の細胞との関連に
おいて産生タンパク質量を定量するための本方法は、（
ａ）適当な固体基質上に細胞集団を得：（ｂ）該細胞に
滅菌寒天のフィルムをかフセ； （ｃ）該フィルム上に
ニトロセルロースのシートを置き；そして（ｄ）該シー
トを取り、該タンパク質に対する抗体を用いて該シート
に結合した該タンパク質を検出することからなる。タン
パク質と結合するあらゆる膜をニトロセルロースに代え
て用いることができ、これにはナイロン、ＤＢＭ、ある
いは酢酸セルロースが含まれる。また、ゼラチンを寒天
に代えて用いることができる。高レベルタンパク質の分
泌細胞を同定するための本方法を後記実施例５でさらに
詳しく説明する。
以下に実施例を挙げて本発明の方法、ならびに代表的な
化合物、ベクターおよび形質転換体の構築（作成）プロ
トコールを説明するが、これらは本発明を限定しようと
するものではない。
化合物、ベクターおよび形質転換体の構築（作成）プロ
トコールを説明するが、これらは本発明を限定しようと
するものではない。
火鬼廻ニブラスミドｐＬＡＰＣの構築
本実施例はプラスミドｐＬＡＰＣ構築の詳細なプロトコ
ールを提供するものである。簡単に説明すると、実施例
ＩＡは、活性化ペプチドを含むプロティンＣ分子の一部
をコードしているＤＮＡフラグメントのプラスミドｐＨ
Ｃ７からの単離を説明するものであり、実施例１Ｂは、
このＤＮＡフラグメントのファージＭ１３ｍｐ１８への
クローニング、および部位特異的な突然変異誘発による
、得られた組換えファージからの活性化ペプチドをコー
ドしているＤＮＡの除去を説明するものであり、実施例
ＩＣは、プラスミドｐＬＡＰＣ構築の最後の工程、さら
に詳しくは、この突然変異フラグメントを単離し、プラ
スミドｐＬＰＣ由来の２つのフラグメントとライゲート
してプラスミドｐＬＡＰＣを得ることを説明するもので
ある。プラスミドｐＬＰＣ構築のプロトフールは実施例
２で説明する。
ールを提供するものである。簡単に説明すると、実施例
ＩＡは、活性化ペプチドを含むプロティンＣ分子の一部
をコードしているＤＮＡフラグメントのプラスミドｐＨ
Ｃ７からの単離を説明するものであり、実施例１Ｂは、
このＤＮＡフラグメントのファージＭ１３ｍｐ１８への
クローニング、および部位特異的な突然変異誘発による
、得られた組換えファージからの活性化ペプチドをコー
ドしているＤＮＡの除去を説明するものであり、実施例
ＩＣは、プラスミドｐＬＡＰＣ構築の最後の工程、さら
に詳しくは、この突然変異フラグメントを単離し、プラ
スミドｐＬＰＣ由来の２つのフラグメントとライゲート
してプラスミドｐＬＡＰＣを得ることを説明するもので
ある。プラスミドｐＬＰＣ構築のプロトフールは実施例
２で説明する。
Ａ、ヒトプロティンＣの活性化ペプチドの暗号配プラス
ミドｐＨＣ７は形成期ヒトプロティンＣの完全な暗号配
列を含んでいる。１５μ９／ｍＱのテトラサイクリンを
含むＩＱのしブロス（ｉ０ｇペプトン、１０９ＮａＣ＋
２、および５ｇ酵母抽出物）に大腸菌Ｋ ｔ ２ ＲＲ
１／ｐＨＣ７（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２６）の培養物
を接種し、５９０ｎｉでの光学密度（０，Ｄ、）が〜ｌ
吸収単位となるまで空気−振盪インキュベーター中、３
７℃でインキュベートし、この時点でクロラムフェニコ
ール（ｉ５０ｘ９）ヲ培養物に加えた。約１６時間イン
キュベートを続けた。クロラムフェニコールの添加はタ
ンパク質の合成を阻害し、従ってさらに細胞分裂するの
を阻害するか、プラスミドの復製は継続させる。
ミドｐＨＣ７は形成期ヒトプロティンＣの完全な暗号配
列を含んでいる。１５μ９／ｍＱのテトラサイクリンを
含むＩＱのしブロス（ｉ０ｇペプトン、１０９ＮａＣ＋
２、および５ｇ酵母抽出物）に大腸菌Ｋ ｔ ２ ＲＲ
１／ｐＨＣ７（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２６）の培養物
を接種し、５９０ｎｉでの光学密度（０，Ｄ、）が〜ｌ
吸収単位となるまで空気−振盪インキュベーター中、３
７℃でインキュベートし、この時点でクロラムフェニコ
ール（ｉ５０ｘ９）ヲ培養物に加えた。約１６時間イン
キュベートを続けた。クロラムフェニコールの添加はタ
ンパク質の合成を阻害し、従ってさらに細胞分裂するの
を阻害するか、プラスミドの復製は継続させる。
この培養物を、５ｏｒｖａｌｌ ＧＳＡローター（［）
ｕｐｏｎｔＣｏ、、 Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＰＦＯｄ
ｕｃｔｓ、 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
。
ｕｐｏｎｔＣｏ、、 Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＰＦＯｄ
ｕｃｔｓ、 Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
。
ＮｅｗＬｏｗｎ、 ＣＮ ０６４７０）中、６０００ｒ
ｐｍ、 ４°Ｃで５分間遠心した。この上清を捨て、細
胞ベレットをＴＥＳ緩衝液［１０ｍＭ）リス−ＨＣＱ、
ｐＨ＝７．５； ｌｏｍＭ ＮａＣＱ：および１ｍＭ
ＥＤＴＡ］（４０ｙＱ）テ’６Ｌ浄し、再ペレット化し
た。もう−度上清を捨て、細胞ベレットをドライアイス
−エタノール浴で凍結させ、そして解凍した。解凍した
細胞ベレットを２５％スクロース１５０ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｉ０ｆｆのに再想濁した。５Ｍｇ／ｍＱのリソチ
ーム溶液（約１ｆｆＣ） ； ０．２５ＭのＥＤＴＡ、
ｐＨ＝８゜０（３ＲＱ）；および１０ｘ９／畦のＲＮア
ーゼＡ（ｉ００μａ）をこの溶液に加え、次いでこれを
水上で１５分間インキュベートした。このリソチーム処
理した細胞に３ｆｆ（の溶菌溶液［１０％トリトン−Ｘ
１００（３１１Ｑ）： ０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝
８．０（７５ス１２）；１Ｍトリス−ＨＣρ、ｐＨ＝８
．０（ｉ５ｘＱ）；および水（７Ｒσ）を混合して調製
］を加え、混合し、得られた溶液を水上でさらに１５分
間インキュベートした。この溶解した細胞をドライアイ
ス−エタノール浴で凍結させ、次いで解凍した。
ｐｍ、 ４°Ｃで５分間遠心した。この上清を捨て、細
胞ベレットをＴＥＳ緩衝液［１０ｍＭ）リス−ＨＣＱ、
ｐＨ＝７．５； ｌｏｍＭ ＮａＣＱ：および１ｍＭ
ＥＤＴＡ］（４０ｙＱ）テ’６Ｌ浄し、再ペレット化し
た。もう−度上清を捨て、細胞ベレットをドライアイス
−エタノール浴で凍結させ、そして解凍した。解凍した
細胞ベレットを２５％スクロース１５０ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液（ｉ０ｆｆのに再想濁した。５Ｍｇ／ｍＱのリソチ
ーム溶液（約１ｆｆＣ） ； ０．２５ＭのＥＤＴＡ、
ｐＨ＝８゜０（３ＲＱ）；および１０ｘ９／畦のＲＮア
ーゼＡ（ｉ００μａ）をこの溶液に加え、次いでこれを
水上で１５分間インキュベートした。このリソチーム処
理した細胞に３ｆｆ（の溶菌溶液［１０％トリトン−Ｘ
１００（３１１Ｑ）： ０．２５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝
８．０（７５ス１２）；１Ｍトリス−ＨＣρ、ｐＨ＝８
．０（ｉ５ｘＱ）；および水（７Ｒσ）を混合して調製
］を加え、混合し、得られた溶液を水上でさらに１５分
間インキュベートした。この溶解した細胞をドライアイ
ス−エタノール浴で凍結させ、次いで解凍した。
５Ｗ２７０−ター（Ｂｅｃｋｍａｎ＋ ７３６０ Ｎ、
Ｌｉｎｃｏｌｎ Ａｖｅ、。
Ｌｉｎｃｏｌｎ Ａｖｅ、。
Ｌｉｎｃｏｌｎｗｏｏｄ、 ＩＬ ６０６４６）中、
２５．ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠心することによってこ
の溶液から細胞の残骸を除去した。この溶液にＣ３ＣＱ
（約３０．４４９）および５１１９／ Ｉ！＋２臭化エ
チジウム溶液（〜ＩＪＩのを加え、その容量を４ＣＪｒ
Ｑに調節した。この溶液をＶｔ１５Ｑ超遠心管（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ）にデカンテーションした。この管を密封し、
Ｖｔ ｉ５０ローター中、４２．００ Ｏｒｐｍで〜１
６時間遠心した。紫外光で見えるようにしてプラスミド
のバンドを単離し、ｔｉ７５管およびローター（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ）に入れ、５５．００Ｏｒｐｍで１６時間遠心
した。必要な容量の調節はすべて０．７６１９／ＲＱの
Ｃ５ＣＱを含むＴＥＳを用いて行った。プラスミドのバ
ンドをもう一度単離し、臭化エチジウムを塩−飽和のイ
ンプロパツールで抽出し、最後にＴＥＳ緩衝液で１＝３
に希釈しｔ：。
２５．ＯＯＯｒｐｍで４０分間遠心することによってこ
の溶液から細胞の残骸を除去した。この溶液にＣ３ＣＱ
（約３０．４４９）および５１１９／ Ｉ！＋２臭化エ
チジウム溶液（〜ＩＪＩのを加え、その容量を４ＣＪｒ
Ｑに調節した。この溶液をＶｔ１５Ｑ超遠心管（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ）にデカンテーションした。この管を密封し、
Ｖｔ ｉ５０ローター中、４２．００ Ｏｒｐｍで〜１
６時間遠心した。紫外光で見えるようにしてプラスミド
のバンドを単離し、ｔｉ７５管およびローター（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ）に入れ、５５．００Ｏｒｐｍで１６時間遠心
した。必要な容量の調節はすべて０．７６１９／ＲＱの
Ｃ５ＣＱを含むＴＥＳを用いて行った。プラスミドのバ
ンドをもう一度単離し、臭化エチジウムを塩−飽和のイ
ンプロパツールで抽出し、最後にＴＥＳ緩衝液で１＝３
に希釈しｔ：。
次いで、この溶液に２容量のエタノールを加え、得られ
た混合液を一２０°Ｃで一部インキユベートした。この
溶液を、５Ｓ３４０−ター（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ、）中
、ｔｏ、ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心することによって
プラスミドＤＮＡをペレット化した。
た混合液を一２０°Ｃで一部インキユベートした。この
溶液を、５Ｓ３４０−ター（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ、）中
、ｔｏ、ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心することによって
プラスミドＤＮＡをペレット化した。
この方法によって得られたプラスミドｐＨＣ７Ｄ Ｎ
Ａ （〜Ｉ Ｒ９’）をＴＥ緩衝１ｆｆｌ［１０ｍＭ）
リスＨＣＬ ｐｔ（＝７．６、およびＯ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡコ（Ｉ ＲＱ＞に懸濁し、−２０°Ｃで保存した。
Ａ （〜Ｉ Ｒ９’）をＴＥ緩衝１ｆｆｌ［１０ｍＭ）
リスＨＣＬ ｐｔ（＝７．６、およびＯ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡコ（Ｉ ＲＱ＞に懸濁し、−２０°Ｃで保存した。
プラスミドｐＨＣ７の制限部位および機能地図を添付の
第２図に示す。
第２図に示す。
プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ（約７μ９；７μのを、１Ｑ
ＸＣｏｒｅ緩衝液ＴＭ（２５ｊＩＱ’） ［Ｃｏｒｅ緩
衝液”（ＢＲＬ）は５００ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝
８．ｏ ： ５００ｍＭ ＮａＣＱ：および１００ ｍ
Ｍ ＭｇＣＱ、である］、水（ｉ９８μの、制限酵素５
ｓｔｌ（ｉ２μＱ；〜６０単位）［Ｂ ＲＬ （Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＤ ２０８７
７）；実施例中で言及する酵素のすべては、他に記載が
なければ、ＢＲＬから、またはＮ Ｅ Ｂ （Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、 Ｂｅｖｅｒｌｙ、
Ｍへ〇＋９１５−９９９０）から人手可能であり、こ
れらを実質的に製造元の推奨に従って用いた］、および
制限酵素ｓ ａｌ Ｉ （８μＱ；８０単位）に加えた
。
ＸＣｏｒｅ緩衝液ＴＭ（２５ｊＩＱ’） ［Ｃｏｒｅ緩
衝液”（ＢＲＬ）は５００ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝
８．ｏ ： ５００ｍＭ ＮａＣＱ：および１００ ｍ
Ｍ ＭｇＣＱ、である］、水（ｉ９８μの、制限酵素５
ｓｔｌ（ｉ２μＱ；〜６０単位）［Ｂ ＲＬ （Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＤ ２０８７
７）；実施例中で言及する酵素のすべては、他に記載が
なければ、ＢＲＬから、またはＮ Ｅ Ｂ （Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、 Ｂｅｖｅｒｌｙ、
Ｍへ〇＋９１５−９９９０）から人手可能であり、こ
れらを実質的に製造元の推奨に従って用いた］、および
制限酵素ｓ ａｌ Ｉ （８μＱ；８０単位）に加えた
。
この反応混合物を３７°Ｃで４時間インキュベートし、
次いで５ｓｔｌ−３ａｌｌ消化したプラスミドｐＨＣ７
ＤＮＡを始めフェノールで、次にクロロホルムで抽出し
、エタノール沈澱および遠心によって集め、最後に′Ｆ
Ｅ／１０緩衝液［１０ｍＭトリス塩基、ｐＨ＝７．６；
およびＯ，ＩｍＭ ＥＤＴＡ］（ｉ５μのに懸濁した。
次いで５ｓｔｌ−３ａｌｌ消化したプラスミドｐＨＣ７
ＤＮＡを始めフェノールで、次にクロロホルムで抽出し
、エタノール沈澱および遠心によって集め、最後に′Ｆ
Ｅ／１０緩衝液［１０ｍＭトリス塩基、ｐＨ＝７．６；
およびＯ，ＩｍＭ ＥＤＴＡ］（ｉ５μのに懸濁した。
次に、この反応混合物を、トリス−酢酸塩緩衝液中、〜
１３０■および〜６５ｍＡで２〜３時間、〜０．６％低
ゲル化温度アガロース（ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａＬｉｏｎ
Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏ１１ｏｉｄｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、 Ｍａｉｎｅ０４８４１）ゲルで
電気泳動にかけた。このゲルを臭化エチジウムの希釈溶
液で染色し、長波長のＵＶ光で見えるようにし、〜０．
７ｋｂ ５ｓｔｌ−３ａｌＩ制限フラグメントを含むＤ
ＮＡのバンドを小さな切片でゲルから切り取った。この
切片の体積を切片の密度と重量から求め、切片を入れた
試験管に４容１ｎの０．２５Ｍ ＮａＣＱ含有のＴＥを
加えた。
１３０■および〜６５ｍＡで２〜３時間、〜０．６％低
ゲル化温度アガロース（ＦＭＣＣｏｒｐｏｒａＬｉｏｎ
Ｍａｒｉｎｅ Ｃｏ１１ｏｉｄｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ
、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、 Ｍａｉｎｅ０４８４１）ゲルで
電気泳動にかけた。このゲルを臭化エチジウムの希釈溶
液で染色し、長波長のＵＶ光で見えるようにし、〜０．
７ｋｂ ５ｓｔｌ−３ａｌＩ制限フラグメントを含むＤ
ＮＡのバンドを小さな切片でゲルから切り取った。この
切片の体積を切片の密度と重量から求め、切片を入れた
試験管に４容１ｎの０．２５Ｍ ＮａＣＱ含有のＴＥを
加えた。
次いで、この切片を７２℃でインキュベートして溶解し
た。約４００μρ中に、プラスミドｐＨＣ７の〜０．７
ｋｂ ５ｓｔｌ−３ａ１１制限フラグメントが約０，５
μ９得られた。このＤＮＡ溶液を製造元の推奨に従いＮ
ＡＣ３−ｐｒｅｐａｃＲカラム（ＢＲＬ）に通すとさら
に精製されたＤＮＡが得られた。この精製フラグメント
を脱イオン水（＋５μＱ）に再懸濁した。
た。約４００μρ中に、プラスミドｐＨＣ７の〜０．７
ｋｂ ５ｓｔｌ−３ａ１１制限フラグメントが約０，５
μ９得られた。このＤＮＡ溶液を製造元の推奨に従いＮ
ＡＣ３−ｐｒｅｐａｃＲカラム（ＢＲＬ）に通すとさら
に精製されたＤＮＡが得られた。この精製フラグメント
を脱イオン水（＋５μＱ）に再懸濁した。
誘発による除去
約１μ９のファージＭ １３ ｍｐ １８ （Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから入手）のＲＦ（複製
型）ＤＮＡを、実質的に実施例ＩＡ記載の方法に従って
、制限酵素５ｓｔｌおよび５ａｌｌで消化した。この反
応混合液をフェノールで、次いでクロロホルムで抽出す
ることによって反応を止め、そしてＤＮＡを沈澱させ、
遠心して集め、約１５μρのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから入手）のＲＦ（複製
型）ＤＮＡを、実質的に実施例ＩＡ記載の方法に従って
、制限酵素５ｓｔｌおよび５ａｌｌで消化した。この反
応混合液をフェノールで、次いでクロロホルムで抽出す
ることによって反応を止め、そしてＤＮＡを沈澱させ、
遠心して集め、約１５μρのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
この消化によって得られた２種類のフラグメントを〜０
．６％の低ゲル化温度アガロースゲルで分離し、大きい
方のフラグメントをゲルから切り出し、実施例ＩＡの記
載のようにして精製した。
．６％の低ゲル化温度アガロースゲルで分離し、大きい
方のフラグメントをゲルから切り出し、実施例ＩＡの記
載のようにして精製した。
この５ｓｔｌ−３ａｌｌｌ肖化したＭ１３ｍｐ１８ＲＦ
ＤＮＡ（５Ｉｌｆｆ）に、プラスミドｐＨＣ７の〜
０゜７ｋｂ ５ｓｔｌ −３ａｌ Ｉ制限フラグメント
（約０．１μ９、水７μρ中）を、ＩＯＸ リガーゼ
緩衝液［０，５Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，８： ６
０ｍＭ ｔＶＩｇｃＱｔ、および０．２Ｍ ジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）］（２μの、ｌ ｍ９／ｍＱ Ｂ
Ｓ Ａ （２μ＆）、２５ｍＭ 八ＴＰ（ｉμＱ）、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）（ｌμＱ。
ＤＮＡ（５Ｉｌｆｆ）に、プラスミドｐＨＣ７の〜
０゜７ｋｂ ５ｓｔｌ −３ａｌ Ｉ制限フラグメント
（約０．１μ９、水７μρ中）を、ＩＯＸ リガーゼ
緩衝液［０，５Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，８： ６
０ｍＭ ｔＶＩｇｃＱｔ、および０．２Ｍ ジチオトレ
イトール（ＤＴＴ）］（２μの、ｌ ｍ９／ｍＱ Ｂ
Ｓ Ａ （２μ＆）、２５ｍＭ 八ＴＰ（ｉμＱ）、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）（ｌμＱ。
〜４００単位）、および水（２μのとともに加えた。
このライゲート反応液を２５°Ｃで一部インキユベート
した。ライゲートしたＤＮＡは２本鎖形の所望のファー
ジＭ１３ｍｐｌ ８−ＨＥ Ｉ ＤＮＡからなってい
ｔこ。
した。ライゲートしたＤＮＡは２本鎖形の所望のファー
ジＭ１３ｍｐｌ ８−ＨＥ Ｉ ＤＮＡからなってい
ｔこ。
大腸菌Ｋ ｌ ２Ｊ Ｍ １０１ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の−晩培養物（約３００μの
を２Ｘ ＴＹブロス［ＴＹブロスは１０ｇ／Ｑトリプト
ン、１０９／ＱＮａＣＱ、および５ｉ＋／Ｑ酵母抽出物
である］（３０ｆｆＯ）に接種し、この培養物を、Ｏ，
Ｄ、ａｏｏが〜０．５になるまで曝気しながら３７°Ｃ
でインキュベートした。培養物を氷水浴で１０分間冷却
し、遠心して集め、冷１０ ｍＭ Ｎ ａＣＱ＜ １５
ｍＱ）に再懸濁した。
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の−晩培養物（約３００μの
を２Ｘ ＴＹブロス［ＴＹブロスは１０ｇ／Ｑトリプト
ン、１０９／ＱＮａＣＱ、および５ｉ＋／Ｑ酵母抽出物
である］（３０ｆｆＯ）に接種し、この培養物を、Ｏ，
Ｄ、ａｏｏが〜０．５になるまで曝気しながら３７°Ｃ
でインキュベートした。培養物を氷水浴で１０分間冷却
し、遠心して集め、冷１０ ｍＭ Ｎ ａＣＱ＜ １５
ｍＱ）に再懸濁した。
細胞をもう一度遠心して集め、冷却した３０ｍＭのＣａ
Ｃ０，−（ｉ５ｍＱ）に再懸濁した。この細胞を氷上に
２０分間置き、遠心して集めた。細胞を冷３ＯｍＭ Ｃ
ａＣＩＬ（ｉ，５１）に再懸濁し、その２００μＱを取
り、上記調製のライゲートＤＮＡ（９μｍ２）に加え、
水上で約３０分間インキュベートした。次いで、この細
胞−Ｄ Ｎ Ａ混合物を４２°Ｃで２分間インキュベー
トし、トップ寒天［４５°Ｃで溶融するように保たれた
０、５％寒天含有のＴＹブロスてあり、２％Ｘ−ガル（
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルーβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノ／ド）（５０μの、ｌｏｏｍＭ ＩＰＴ
Ｇ（イソプロピルβＤ−チオガラクトピラノシド）（５
０μａ）、および対数増殖期の大腸菌Ｋ１２ ＪＭＩ
ＯＩ（ｉ００μのをも含んでいる］（：Ｍ）に加えた。
Ｃ０，−（ｉ５ｍＱ）に再懸濁した。この細胞を氷上に
２０分間置き、遠心して集めた。細胞を冷３ＯｍＭ Ｃ
ａＣＩＬ（ｉ，５１）に再懸濁し、その２００μＱを取
り、上記調製のライゲートＤＮＡ（９μｍ２）に加え、
水上で約３０分間インキュベートした。次いで、この細
胞−Ｄ Ｎ Ａ混合物を４２°Ｃで２分間インキュベー
トし、トップ寒天［４５°Ｃで溶融するように保たれた
０、５％寒天含有のＴＹブロスてあり、２％Ｘ−ガル（
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルーβ−Ｄ−ガ
ラクトピラノ／ド）（５０μの、ｌｏｏｍＭ ＩＰＴ
Ｇ（イソプロピルβＤ−チオガラクトピラノシド）（５
０μａ）、および対数増殖期の大腸菌Ｋ１２ ＪＭＩ
ＯＩ（ｉ００μのをも含んでいる］（：Ｍ）に加えた。
次いで、この細胞−トップ寒天の混合物をＴＹ−寒天プ
レートに蒔き、このプレートを３７°Ｃで一部インキユ
ベートした。
レートに蒔き、このプレートを３７°Ｃで一部インキユ
ベートした。
翌朝、４つの透明なプラークを２Ｘ ＴＹブロス（２１
１のに別々に接種し、この培養物を曝気しながら３７°
Ｃて６時間インキュベートした。次に、培養物を遠心し
、得られた上清（細胞ベレットは制限酵素分析用のファ
ージＤＮＡの調製に用いた）（５００μＱ）を大腸菌Ｋ
１２ ＪＭＩＯＩの培養物（５００μＱ：Ｏ，Ｄ、ｓ
ｓ。−０，５）および２Ｘ ＴＹブロス（５０ｘ＆）に
加えた。これらの培養物を３７００で一部インキユベー
トした。この細胞ベレットから、培養培地に抗生物質を
全く用いなかったことと超遠心の工程をフェノールおよ
びクロロホルム抽出に置き換えたこと以外は実施例ＩＡ
記載の方法のスケールを小さくした方法を用いて、ファ
ージＲＦ ＤＮＡを単離した。ファージＭ１３ｍｐ１
８−ＨＥＩ ＤＮＡを含む形質転換体をそのファージ
ＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
１のに別々に接種し、この培養物を曝気しながら３７°
Ｃて６時間インキュベートした。次に、培養物を遠心し
、得られた上清（細胞ベレットは制限酵素分析用のファ
ージＤＮＡの調製に用いた）（５００μＱ）を大腸菌Ｋ
１２ ＪＭＩＯＩの培養物（５００μＱ：Ｏ，Ｄ、ｓ
ｓ。−０，５）および２Ｘ ＴＹブロス（５０ｘ＆）に
加えた。これらの培養物を３７００で一部インキユベー
トした。この細胞ベレットから、培養培地に抗生物質を
全く用いなかったことと超遠心の工程をフェノールおよ
びクロロホルム抽出に置き換えたこと以外は実施例ＩＡ
記載の方法のスケールを小さくした方法を用いて、ファ
ージＲＦ ＤＮＡを単離した。ファージＭ１３ｍｐ１
８−ＨＥＩ ＤＮＡを含む形質転換体をそのファージ
ＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。
−晩培養物を遠心し、上清５ＲＱあたりに２０％ポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）６０００と２５ｍＭ Ｎａ
Ｃｆ！からなる溶液約ＩＩＩＱを加え、次いで室温で１
０分間インキュベートした。この混合物を１０．ＯＯＯ
ｒｐｍで１０分間遠心し、得られたベレット（ｉ本鎖の
ファージＭ１３ｍｐ１８−ＨＥＩ ＤＮＡを含んでいる
）をＴＥＳ緩衝液［２０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７
．５ ； Ｏ，ＩＭ ＥＤＴＡ；および１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ２］（５００μＱ）に再懸濁した。このＤＮＡ溶液
を、始めクロロホルムで、次いでＴＥ飽和のフェノール
で２回、さらにもう−度クロロホルムで抽出した。次い
で、エタノールおよびＮａ０Ａｃを用いて１本鎖のＤＮ
Ａを沈澱させ、遠心し、そしてベレットを７０％エタノ
ールで洗浄し、乾燥した後、得られたベレットを水（８
０μ７１’）に溶解した。このファージ調製物を次の工
程（部位特異的な突然変異誘発）で用い、活性化ペプチ
ドをコードしているＤＮＡを除去した。
チレングリコール（ＰＥＧ）６０００と２５ｍＭ Ｎａ
Ｃｆ！からなる溶液約ＩＩＩＱを加え、次いで室温で１
０分間インキュベートした。この混合物を１０．ＯＯＯ
ｒｐｍで１０分間遠心し、得られたベレット（ｉ本鎖の
ファージＭ１３ｍｐ１８−ＨＥＩ ＤＮＡを含んでいる
）をＴＥＳ緩衝液［２０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７
．５ ； Ｏ，ＩＭ ＥＤＴＡ；および１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ２］（５００μＱ）に再懸濁した。このＤＮＡ溶液
を、始めクロロホルムで、次いでＴＥ飽和のフェノール
で２回、さらにもう−度クロロホルムで抽出した。次い
で、エタノールおよびＮａ０Ａｃを用いて１本鎖のＤＮ
Ａを沈澱させ、遠心し、そしてベレットを７０％エタノ
ールで洗浄し、乾燥した後、得られたベレットを水（８
０μ７１’）に溶解した。このファージ調製物を次の工
程（部位特異的な突然変異誘発）で用い、活性化ペプチ
ドをコードしているＤＮＡを除去した。
活性化ペプチドをコードしているＤＮＡを除去するため
の突然変異誘発に用いる１本鎖のＤＮＡフラグメントは
自動ＤＮＡ合成機で合成したが、これは次の配列を有し
ている： ５°−ＧＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’この１本鎖の
ＤＮＡフラグメント（「突然変異誘発オリゴヌクレオチ
ド」）（約３０ｐモル；１μｅ）、およびＭ１３普遍ブ
ライマー［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅＩＩＩ
Ｉ肌ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂ Ｍ Ｂ ）、 ７９４
１ Ｃａｓｔｌｅｗａｙ Ｄｒｉｖｅ。
の突然変異誘発に用いる１本鎖のＤＮＡフラグメントは
自動ＤＮＡ合成機で合成したが、これは次の配列を有し
ている： ５°−ＧＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’この１本鎖の
ＤＮＡフラグメント（「突然変異誘発オリゴヌクレオチ
ド」）（約３０ｐモル；１μｅ）、およびＭ１３普遍ブ
ライマー［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅＩＩＩ
Ｉ肌ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂ Ｍ Ｂ ）、 ７９４
１ Ｃａｓｔｌｅｗａｙ Ｄｒｉｖｅ。
Ｐ、 Ｏ，Ｂｏｘ ５０８１６．１ｎｄｉａｎａｐｏｌ
ｉｓ、 ＩＮ ４６２５０から市販されている］（７
，５ｐモル；１．５μＱ）を、１ｍＭのＡＴＰ（ｌμｅ
）を含むｔＸキナーゼ緩衝液［１１００ＩＩＩトリス−
ＨＣＱ、ｐＨ＝８．３ ； １００ｍＭ ＤＤＴ；およ
びｌ ＯＯｍＭ ＭｇＣＱｔ］（ｉ０μの中、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ５単位［Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
ｉｓ、 ＩＮ ４６２５０から市販されている］（７
，５ｐモル；１．５μＱ）を、１ｍＭのＡＴＰ（ｌμｅ
）を含むｔＸキナーゼ緩衝液［１１００ＩＩＩトリス−
ＨＣＱ、ｐＨ＝８．３ ； １００ｍＭ ＤＤＴ；およ
びｌ ＯＯｍＭ ＭｇＣＱｔ］（ｉ０μの中、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ５単位［Ｐｈａｒｍａｃｉａ。
Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｉｎｃ、、８０
０ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａ！ Ａｖｅｎｕｅ。
０ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａ！ Ａｖｅｎｕｅ。
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ ０８８５４］を用いて、
３７°Ｃで３０分間別々に処理し、次いで６５°Ｃで１
０分間インキュベートし、そして凍結させた。このキナ
ーゼ処理したＤＮＡを以下に記載の突然変異誘発に用い
た。
３７°Ｃで３０分間別々に処理し、次いで６５°Ｃで１
０分間インキュベートし、そして凍結させた。このキナ
ーゼ処理したＤＮＡを以下に記載の突然変異誘発に用い
た。
突然変異誘発の最初の工程では、突然変異誘発オリゴヌ
クレオチドとＭ１３ＦＦ遍ブライマーを１本鎖のファー
ジＤＮＡにアニーリングした。普遍ブライマー（ｌｐモ
ル、１，２μρ）、突然変異誘発オリゴヌクレオチド（
ｉμモル；０．３μＱ）、１ＱＸ７二−リング緩衝液［
１００ｍＭ）リス−ＨＣρ、ｐＨ−７，５； １ｍＭ
ＥＤＴＡ；および５００ｍＭＮａＣＱコ（２μの、およ
び水（ｉ６μＱ）に１本鎖のファージＭ１３ｍｐ１８−
ＨＥＩ（３００ｎ９；０．５μσ）を加え、この混合物
を８０°Ｃで２分間、次いで５０°Ｃで５分間インキュ
ベートし、最後に混合物を室温まで冷却してアニーリン
グ反応を行った。
クレオチドとＭ１３ＦＦ遍ブライマーを１本鎖のファー
ジＤＮＡにアニーリングした。普遍ブライマー（ｌｐモ
ル、１，２μρ）、突然変異誘発オリゴヌクレオチド（
ｉμモル；０．３μＱ）、１ＱＸ７二−リング緩衝液［
１００ｍＭ）リス−ＨＣρ、ｐＨ−７，５； １ｍＭ
ＥＤＴＡ；および５００ｍＭＮａＣＱコ（２μの、およ
び水（ｉ６μＱ）に１本鎖のファージＭ１３ｍｐ１８−
ＨＥＩ（３００ｎ９；０．５μσ）を加え、この混合物
を８０°Ｃで２分間、次いで５０°Ｃで５分間インキュ
ベートし、最後に混合物を室温まで冷却してアニーリン
グ反応を行った。
オリゴヌクレオチドがアニーリングされたなら、ＤＮＡ
ポリメラーゼでブライマーを延長することによりファー
ジＤＮＡを２本鎖にした。この延長反応は、アニーリン
グしたＤＮＡの混合物にｌＯＸの延長緩衝液［５００ｍ
Ｍ１−リス−ＨＣ１２、ｐｔ−＋−８； １ｍＭ ＥＤ
ＴＡ ；および１２ ＯｍＭ ＭｇＣ＆−］（３ｕＱ’
）、ＩＯＸのリガーゼ緩衝液（３μの、０．２ｍＭ Ｄ
ＴＴ（ｉ，５μＱ）、ｄＮＴＰ混合物［各ｄＮＴＰが０
．５ｍＭ］（３μの、２５ｍＭ ＡＴＰ（ｉ，２ａ（ｉ
）、フレノウ酵素［５Ｕ／μＱ： ＢＭＢ］ （０，５
μＱ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ［４０００：ＮＥＢ］
（ｌμＱ）、および水（＋９．８μＱ）を加えることに
よって行った。この延長反応液を、室温で３０分間、次
いで３７℃で４時間、さらに４°Ｃで一部インキコベー
トした。
ポリメラーゼでブライマーを延長することによりファー
ジＤＮＡを２本鎖にした。この延長反応は、アニーリン
グしたＤＮＡの混合物にｌＯＸの延長緩衝液［５００ｍ
Ｍ１−リス−ＨＣ１２、ｐｔ−＋−８； １ｍＭ ＥＤ
ＴＡ ；および１２ ＯｍＭ ＭｇＣ＆−］（３ｕＱ’
）、ＩＯＸのリガーゼ緩衝液（３μの、０．２ｍＭ Ｄ
ＴＴ（ｉ，５μＱ）、ｄＮＴＰ混合物［各ｄＮＴＰが０
．５ｍＭ］（３μの、２５ｍＭ ＡＴＰ（ｉ，２ａ（ｉ
）、フレノウ酵素［５Ｕ／μＱ： ＢＭＢ］ （０，５
μＱ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ［４０００：ＮＥＢ］
（ｌμＱ）、および水（＋９．８μＱ）を加えることに
よって行った。この延長反応液を、室温で３０分間、次
いで３７℃で４時間、さらに４°Ｃで一部インキコベー
トした。
この反応を、フェノール−クロロホルム抽出、およびエ
タノールと酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）によるＤＮＡ
沈澱によって停止させた。ＤＮＡを遠心して集め、Ｓ１
緩衝液［０，３Ｍ ＮａＣＱ： ０゜０３Ｍ Ｎａ０Ａ
ｃＳｐＨ＝４．５ ＋および０．３ｍＭＺｎＣｆ２−］
（４０ｕＱ）に再懸濁し、次いでＤＮＡの溶液に加えた
。以下に記載するＳｌ処理は、部位特異的な突然変異誘
発法に有用であると報告されている。しかし、本発明者
等はＳ１処理に有意の利点を全く見い出すことができず
、本明細書の後記実施例で説明する構築プロトコールで
はこのＳ１処理を完全に削除した。
タノールと酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）によるＤＮＡ
沈澱によって停止させた。ＤＮＡを遠心して集め、Ｓ１
緩衝液［０，３Ｍ ＮａＣＱ： ０゜０３Ｍ Ｎａ０Ａ
ｃＳｐＨ＝４．５ ＋および０．３ｍＭＺｎＣｆ２−］
（４０ｕＱ）に再懸濁し、次いでＤＮＡの溶液に加えた
。以下に記載するＳｌ処理は、部位特異的な突然変異誘
発法に有用であると報告されている。しかし、本発明者
等はＳ１処理に有意の利点を全く見い出すことができず
、本明細書の後記実施例で説明する構築プロトコールで
はこのＳ１処理を完全に削除した。
ＤＮＡの溶液を２本の試験管に均等に分け、この試験管
の１本に８１ヌクレアーゼ（ｉ００単位： ＢＭＢ）を
加えた。このＳ１反応液を室温で５分間インキュベート
し、反応混合物をＴＥ飽和のフエ／−ルークロロホルム
（５０：５０）で１回抽出することによって反応を停止
させた。エタノールとＮａ０Ａｃを用いてこの反応混合
物から、およびＳｌ処理していない試料からＤＮＡを沈
澱させｔこ。
の１本に８１ヌクレアーゼ（ｉ００単位： ＢＭＢ）を
加えた。このＳ１反応液を室温で５分間インキュベート
し、反応混合物をＴＥ飽和のフエ／−ルークロロホルム
（５０：５０）で１回抽出することによって反応を停止
させた。エタノールとＮａ０Ａｃを用いてこの反応混合
物から、およびＳｌ処理していない試料からＤＮＡを沈
澱させｔこ。
このＤＮＡペレットを水（６０μＱ）に再懸濁し、これ
を用い、Ｉ ＰＴＧまたはＸガルをプレートに全く加え
なかったこと以外はファージＭ１３ｍｐ１８−）ＩＥＩ
の構築に用いた方法に従って大腸菌に１２ ＪＭＩＯ
Ｉを形質転換した。ドツト−プロットハイブリダイゼー
ションおよびプラークのプローブとして突然変異誘発オ
リゴヌクレオチドの小部分５°−ＴＧＡＡＡＣＧＡＣＴ
ＣＡＴＴＧＡ−３”（放射性活性にラベルした）を用い
ることによって突然変異体をスクリーニングした。ハイ
ブリダイゼーションにより陽性と見られたいくつかのプ
ラークを取り、対数増殖期の大腸菌に１２ ＪＭＩＯ
Ｉの培養物（２ｆｆＱ）に別々に接種した。これらの培
養物を曝気しなから３７°Ｃで約６時間インキュベート
し、次いでこれらを用い、ファージＭ１３ｍｐｌ ８−
ＨＥ １について上記したようにして１本鎖のＤＮＡを
調製した。
を用い、Ｉ ＰＴＧまたはＸガルをプレートに全く加え
なかったこと以外はファージＭ１３ｍｐ１８−）ＩＥＩ
の構築に用いた方法に従って大腸菌に１２ ＪＭＩＯ
Ｉを形質転換した。ドツト−プロットハイブリダイゼー
ションおよびプラークのプローブとして突然変異誘発オ
リゴヌクレオチドの小部分５°−ＴＧＡＡＡＣＧＡＣＴ
ＣＡＴＴＧＡ−３”（放射性活性にラベルした）を用い
ることによって突然変異体をスクリーニングした。ハイ
ブリダイゼーションにより陽性と見られたいくつかのプ
ラークを取り、対数増殖期の大腸菌に１２ ＪＭＩＯ
Ｉの培養物（２ｆｆＱ）に別々に接種した。これらの培
養物を曝気しなから３７°Ｃで約６時間インキュベート
し、次いでこれらを用い、ファージＭ１３ｍｐｌ ８−
ＨＥ １について上記したようにして１本鎖のＤＮＡを
調製した。
ジデオキンー配列決定法［Ｊ、 ｔｌ、 Ｓｍ１ｔｈ、
１９８０． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ ６５：５６０−５８０］を用いて１本鎖ＤＮＡ
の配列決定を行った。いくつかのファージが所望の突然
変異体であると同定された。活性化ペプチドの暗号配列
が削除されているファージをファージＭ１３ｍｐ１８−
ＨＥ２と命名した。７７一ジＭ１３ｍｐ１８−ＨＥ２中
の突然変異は、天然の暗号配列に対して３６ｂｐの大き
さの減少をもたらし、この差異を、突然変異した領域を
含むＤＮＡの同定を容易にするのに用いることができる
。
１９８０． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ ６５：５６０−５８０］を用いて１本鎖ＤＮＡ
の配列決定を行った。いくつかのファージが所望の突然
変異体であると同定された。活性化ペプチドの暗号配列
が削除されているファージをファージＭ１３ｍｐ１８−
ＨＥ２と命名した。７７一ジＭ１３ｍｐ１８−ＨＥ２中
の突然変異は、天然の暗号配列に対して３６ｂｐの大き
さの減少をもたらし、この差異を、突然変異した領域を
含むＤＮＡの同定を容易にするのに用いることができる
。
後の構築に用いるためＲＦ型のファージＭ１３ｍｐ１８
−ＨＥ２を調製した。
−ＨＥ２を調製した。
な構築
実質的に実施例１Ａの方法に従い、ＲＦ型のファージＭ
１３＋ｎｐ１８−ＨＥ２の突然変異誘発サレタ５ｓｔｌ
−３ａｌｌ（〜０．７ｋｂ）制限フラグメントをファー
ジから切り取り、単離した。しかし、１：２希釈の低ゲ
ル化アガロース中、〜０．１μ２の所望の〜０．７ｋｂ
フラグメントを含む〜１００μＱの溶液をいかなる精製
カラムにもかけず、直接、下記のプラスミドｐＬＡＰＣ
を得るためのライゲートに用いた。
１３＋ｎｐ１８−ＨＥ２の突然変異誘発サレタ５ｓｔｌ
−３ａｌｌ（〜０．７ｋｂ）制限フラグメントをファー
ジから切り取り、単離した。しかし、１：２希釈の低ゲ
ル化アガロース中、〜０．１μ２の所望の〜０．７ｋｂ
フラグメントを含む〜１００μＱの溶液をいかなる精製
カラムにもかけず、直接、下記のプラスミドｐＬＡＰＣ
を得るためのライゲートに用いた。
３種のＤＮＡフラグメント、即ち、上記のファ−ジＭ１
３ｍｐ１８−ＨＥ２の〜０．７ｋｂ ５ｓｔＩ −３ａ
ｌｌ制限フラグメント、およびプラスミドｐＬＰＣ由来
の２種類のＤＮＡフラグメントをいっしょにしてライゲ
ートし、プラスミドｐＬＡＰＣを得た。プラスミドｐｔ
、ｐｃ構築のプロトコールは実施例２で説明する。プラ
スミドｐＬＰＣの制限部位および機能地図を添付の第１
図に示す。プラスミドｐＬＰＣ上の５ａｌｌＳＳｓｔｌ
およびＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位の設置により、所望
のＥｃｏＲＩＳａｌｔおよびＥｃｏＲＩ−３ｓｔｌ制限
フラグメントは２種類の別々の消化で調製しなければな
らなかった。
３ｍｐ１８−ＨＥ２の〜０．７ｋｂ ５ｓｔＩ −３ａ
ｌｌ制限フラグメント、およびプラスミドｐＬＰＣ由来
の２種類のＤＮＡフラグメントをいっしょにしてライゲ
ートし、プラスミドｐＬＡＰＣを得た。プラスミドｐｔ
、ｐｃ構築のプロトコールは実施例２で説明する。プラ
スミドｐＬＰＣの制限部位および機能地図を添付の第１
図に示す。プラスミドｐＬＰＣ上の５ａｌｌＳＳｓｔｌ
およびＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位の設置により、所望
のＥｃｏＲＩＳａｌｔおよびＥｃｏＲＩ−３ｓｔｌ制限
フラグメントは２種類の別々の消化で調製しなければな
らなかった。
ＥｃｏＲｌ−３ｓｔｌフラグメントを調製するため、水
（２５μの中のプラスミドｐＬＰＣ（約４０μｇ）を、
ｌｖ９／ｘＱのＢＳＡ（ｌＯμＱ）、ＩＯＸのＣｏｒｅ
緩衝液ＴＭ（ｉ０μ１２；ＢＲＬ）、制限酵素Ｅ ｃｏ
ＲＩ （５ｕＱ、５ＱＵ、Ｂ’ＲＬ）、制限酵素５ｓｔ
ｌ（５μＣ；２５Ｕ、ＢＲＬ）、および水（４５μのに
加え、得られた反応液を３７°Ｃで１．５時間インキュ
ベートした。エタノールで沈澱させ、遠心することによ
って５ｓＬＩ−ＥｃｏＲＩ〆肖化したプラスミドｐＬＰ
ＣのＤＮＡを集めた。この５ｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ消化し
たＤＮＡを水に再懸濁し、次いで〜０．６％の低ゲル（
ｆｊＭ度のアガロースゲルにかけ電気泳動でＤＮＡフラ
グメントを分離した。
（２５μの中のプラスミドｐＬＰＣ（約４０μｇ）を、
ｌｖ９／ｘＱのＢＳＡ（ｌＯμＱ）、ＩＯＸのＣｏｒｅ
緩衝液ＴＭ（ｉ０μ１２；ＢＲＬ）、制限酵素Ｅ ｃｏ
ＲＩ （５ｕＱ、５ＱＵ、Ｂ’ＲＬ）、制限酵素５ｓｔ
ｌ（５μＣ；２５Ｕ、ＢＲＬ）、および水（４５μのに
加え、得られた反応液を３７°Ｃで１．５時間インキュ
ベートした。エタノールで沈澱させ、遠心することによ
って５ｓＬＩ−ＥｃｏＲＩ〆肖化したプラスミドｐＬＰ
ＣのＤＮＡを集めた。この５ｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ消化し
たＤＮＡを水に再懸濁し、次いで〜０．６％の低ゲル（
ｆｊＭ度のアガロースゲルにかけ電気泳動でＤＮＡフラ
グメントを分離した。
ＥｃｏＲＩ−３ａｉｌフラグメントを調製するため、水
（９μＱ）中のプラスミドｐＬＰＣ（約１５μｇ）を始
めに制限酵素Ａｐａ＋で処理して似た大きさの制限フラ
グメントによる汚染がないようにした。ｌＯＸのＡｐａ
ｌ緩衝液［６０ｍＭ ＮａＣ４； ６０ｍＭ トリス−
ＨＣｌ２、ｐＨ＝７．４ ； ６０ｍＭ ＭｇＣ（！、
；および６０ｍＭ ＤＴＴＩ（約ＬｏμＱ）、Ｉｊ！９
／Ｉ！（！のＢＳＡ（ｉ０μの、水（６９μの、および
制限酵素Ａｐａｌ（２μｅ； ５００ 、ＮＥＢ）をプ
ラスミドｐＬＰＣＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液
を３７°Ｃで１時間インキュベートした。次に、２Ｍ
ＮａＣｌ２（ｉ５μの、水（６９μＱ）、制限酵素５ａ
ｌＩ（８μＱ；ＮＥＢ）、および制限酵素ＥｃｏＲＩ（
８ｕＱ； ＮＥＢ）をＡｐａ＋消化したプラスミドｐＬ
ＰＣＤＮＡの溶液に加え、この反応液を３７°Ｃで１時
間インキュベートした。このＡｐａｌ−３ａｉｌ −Ｅ
ｃｏＲｌ？肖化したプラスミドｐｉ、ＰＣＤＮＡを、始
めフェノールで、次いでクロロホルムで抽出し、続いて
エタノール沈澱と遠心によって集め、最後に水（２５μ
Ｑ）に再懸濁した。次に、このＤＮＡを〜０．６％の低
ゲル化温度のアガロースゲルにかけ、ＤＮＡフラグメン
トを電気泳動で分離した。
（９μＱ）中のプラスミドｐＬＰＣ（約１５μｇ）を始
めに制限酵素Ａｐａ＋で処理して似た大きさの制限フラ
グメントによる汚染がないようにした。ｌＯＸのＡｐａ
ｌ緩衝液［６０ｍＭ ＮａＣ４； ６０ｍＭ トリス−
ＨＣｌ２、ｐＨ＝７．４ ； ６０ｍＭ ＭｇＣ（！、
；および６０ｍＭ ＤＴＴＩ（約ＬｏμＱ）、Ｉｊ！９
／Ｉ！（！のＢＳＡ（ｉ０μの、水（６９μの、および
制限酵素Ａｐａｌ（２μｅ； ５００ 、ＮＥＢ）をプ
ラスミドｐＬＰＣＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液
を３７°Ｃで１時間インキュベートした。次に、２Ｍ
ＮａＣｌ２（ｉ５μの、水（６９μＱ）、制限酵素５ａ
ｌＩ（８μＱ；ＮＥＢ）、および制限酵素ＥｃｏＲＩ（
８ｕＱ； ＮＥＢ）をＡｐａ＋消化したプラスミドｐＬ
ＰＣＤＮＡの溶液に加え、この反応液を３７°Ｃで１時
間インキュベートした。このＡｐａｌ−３ａｉｌ −Ｅ
ｃｏＲｌ？肖化したプラスミドｐｉ、ＰＣＤＮＡを、始
めフェノールで、次いでクロロホルムで抽出し、続いて
エタノール沈澱と遠心によって集め、最後に水（２５μ
Ｑ）に再懸濁した。次に、このＤＮＡを〜０．６％の低
ゲル化温度のアガロースゲルにかけ、ＤＮＡフラグメン
トを電気泳動で分離した。
〜３．７６ｋｂのＥｃｏＲＩ −３ａｌ ｌ制限フラグ
メントおよび〜２．ＯｋｂのＥｃｏＲ［−３ｓｔｌ制限
フラグメントをゲルから切り出し、実施例ＩＡ記載のよ
うに、等量の１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ２、ｐＨ−７，６
を加えた後、ゲルフラグメントを溶融した。
メントおよび〜２．ＯｋｂのＥｃｏＲ［−３ｓｔｌ制限
フラグメントをゲルから切り出し、実施例ＩＡ記載のよ
うに、等量の１０ｍＭ）リス−ＨＣＩ２、ｐＨ−７，６
を加えた後、ゲルフラグメントを溶融した。
プラスミドｐＬＰＣの〜３．７６ｋｂ ＥｃｏＲＴＳａ
ｌＴ制限フラグメント（約２μ９）がこのようにして１
０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．６ （〜２００μＱ
）中に得られたくこの液は溶融したアガロースをも含ん
でいた）。プラスミドｐＬＰＣの〜２．０ｋｂＥｃｏＲ
ｌ−３ａｉｌ制限フラグメント（約２μ９）は、アガロ
ースを含む別の１０ｍＭトリス−ＨＣＱ。
ｌＴ制限フラグメント（約２μ９）がこのようにして１
０ｍＭトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．６ （〜２００μＱ
）中に得られたくこの液は溶融したアガロースをも含ん
でいた）。プラスミドｐＬＰＣの〜２．０ｋｂＥｃｏＲ
ｌ−３ａｉｌ制限フラグメント（約２μ９）は、アガロ
ースを含む別の１０ｍＭトリス−ＨＣＱ。
ｐＨ＝７．６（〜２００μｍ２）中に得られた。
２種類の精製制限フラグメント（プラスミドｐＬＰＣの
〜３．７６ｋｂ、ＥｃｏＲＩ−３ａｌ■制限フラグメン
ト、およびプラスミドｐＬＰＣの〜２．０ｋｂＥｃｏＲ
ｒ−３ｓｔｌ制限フラグメント）の溶液（それぞれ約１
２．５μ１２）を、ファージＭ１３ｍｌ）１８−ＨＦ２
の〜０．７ｋｂ ５ｓｔｒ−３ａｌｌ制限フラグメント
（２０μＱ）、ｌｊ！９ＺＩｌｌＱ ＢＳＡ（ｉ０μＱ
）、ｌｏｍＭＡＴＰ（ｉ０μＱ）、ＩＯＸ’Ｊガーゼ緩
衝液（ｉ０μσ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；
〜８００Ｕ・ＮＥＢ）、および水（２３ｇｆｆ）に加え
、得られたライゲート反応液を１５°Ｃで一部インキユ
ベートした。このライゲートしたＤＮＡは所望のプラス
ミドｐＬＡＰＣを構成していた。プラスミドｐＩ、ＡＰ
Ｃは、活性化ペプチドをコードしているＤＮＡが欠失し
ていることがプラスミドｐＬｐｃと異なるだけである（
第１図）。
〜３．７６ｋｂ、ＥｃｏＲＩ−３ａｌ■制限フラグメン
ト、およびプラスミドｐＬＰＣの〜２．０ｋｂＥｃｏＲ
ｒ−３ｓｔｌ制限フラグメント）の溶液（それぞれ約１
２．５μ１２）を、ファージＭ１３ｍｌ）１８−ＨＦ２
の〜０．７ｋｂ ５ｓｔｒ−３ａｌｌ制限フラグメント
（２０μＱ）、ｌｊ！９ＺＩｌｌＱ ＢＳＡ（ｉ０μＱ
）、ｌｏｍＭＡＴＰ（ｉ０μＱ）、ＩＯＸ’Ｊガーゼ緩
衝液（ｉ０μσ）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２μＱ；
〜８００Ｕ・ＮＥＢ）、および水（２３ｇｆｆ）に加え
、得られたライゲート反応液を１５°Ｃで一部インキユ
ベートした。このライゲートしたＤＮＡは所望のプラス
ミドｐＬＡＰＣを構成していた。プラスミドｐＩ、ＡＰ
Ｃは、活性化ペプチドをコードしているＤＮＡが欠失し
ていることがプラスミドｐＬｐｃと異なるだけである（
第１図）。
プラスミドの構造を調べ、真核細胞の形質転換およびさ
らに構築を行うための大量のプラスミドｐｔ、Ａｐｃを
得るため、プラスミドｐＬＡＰＣを含むライデー１−Ｄ
ＮＡを用いて大腸菌に１２ ＲＶ３０８（ＮＲＲＬか
ら取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４のもとて入手可
能）を形質転換した。
らに構築を行うための大量のプラスミドｐｔ、Ａｐｃを
得るため、プラスミドｐＬＡＰＣを含むライデー１−Ｄ
ＮＡを用いて大腸菌に１２ ＲＶ３０８（ＮＲＲＬか
ら取得番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４のもとて入手可
能）を形質転換した。
Ｌグロス中の大腸菌に１２ ＲＶ３０８の培養物（５
０ｆｆのを、５９０ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、）が〜
０．６になるまで増殖させた。この培養物を水上で１０
分間冷却し、細胞を遠心して集めた。この細胞ペレット
を冷１０ｍＭ ＮａＣＱ（２５ｆｆＱ）ｆ：再・び濁し
た。もう−度細胞を遠心してベレット化し、このベレッ
トを冷３０ｍＭ ＣａＣ１！ｔ（２５ｚ＋りに再懸濁し
、水上で３０分間インキュベートした。細胞を再度遠心
して集め、冷３０ｍＭ ＣａＣｆ２２（２５ａσ）に再
懸濁した。
０ｆｆのを、５９０ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、）が〜
０．６になるまで増殖させた。この培養物を水上で１０
分間冷却し、細胞を遠心して集めた。この細胞ペレット
を冷１０ｍＭ ＮａＣＱ（２５ｆｆＱ）ｆ：再・び濁し
た。もう−度細胞を遠心してベレット化し、このベレッ
トを冷３０ｍＭ ＣａＣ１！ｔ（２５ｚ＋りに再懸濁し
、水上で３０分間インキュベートした。細胞を再度遠心
して集め、冷３０ｍＭ ＣａＣｆ２２（２５ａσ）に再
懸濁した。
この細胞懸ｉｆｆ液（２００μＱ）をプラスミドｐＬＡ
ＰＣ含有のライゲートＤＮＡと混合し、水上で６０分間
インキュベートした。次いで、この混合物を４２°Ｃで
２分間、続いて室温で１０分間インキュベー！・シた。
ＰＣ含有のライゲートＤＮＡと混合し、水上で６０分間
インキュベートした。次いで、この混合物を４２°Ｃで
２分間、続いて室温で１０分間インキュベー！・シた。
この細胞−Ｄ Ｎ Ａ ｍ合物に２ＸのＴＹブロス（約
１０！＋のを加え、次いで細胞を１２５ｍＱのフラスコ
に入れ、空気−振盪インキュベーター中、３７°Ｃで２
時間インキュベートした。
１０！＋のを加え、次いで細胞を１２５ｍＱのフラスコ
に入れ、空気−振盪インキュベーター中、３７°Ｃで２
時間インキュベートした。
細胞混合物の一部を１００μｇ／ｘＱアンピシリン含有
のＴＹ−寒天（ｉ５ｇ／ρ寒天のＴＹブロス）プレート
に蒔き、このプレートを３７°Ｃで一部インキユヘート
した。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＬＡＰＣ形質転
換体をそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確
認した。選択剤としてテトラサイクリンではなくアンピ
シリン（５０μｇ／ＩＩ０．）ヲ用いること以外は実質
的に実施例ＩＡの教示に従い、大腸菌Ｋ １２ ＲＶ３
０８／ｐＬＡＰＣ形質転換体からプラスミドＤＮＡを得
り。
のＴＹ−寒天（ｉ５ｇ／ρ寒天のＴＹブロス）プレート
に蒔き、このプレートを３７°Ｃで一部インキユヘート
した。大腸菌Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＬＡＰＣ形質転
換体をそのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確
認した。選択剤としてテトラサイクリンではなくアンピ
シリン（５０μｇ／ＩＩ０．）ヲ用いること以外は実質
的に実施例ＩＡの教示に従い、大腸菌Ｋ １２ ＲＶ３
０８／ｐＬＡＰＣ形質転換体からプラスミドＤＮＡを得
り。
実施例２プラスミドｐＬＰＣの構築
プラスミドｐＬＰＣをプラスミドｐＬＡＰＣ構築の中間
体ベクターとして用いた（実施例ＩＣ参照）。
体ベクターとして用いた（実施例ＩＣ参照）。
プラスミドｐＬＰＣは、ヒトプロティンＣを発現させる
ように配置されたアデノウィルス２の後期プロモーター
およびＢＫウィルスのエンハンサ−をコードしているＤ
ＮＡセグメントを含有している。プラスミドｐＬＡＰＣ
構築のプロトコールは、本質的に、プラスミドｐｔ、、
ｐｃ上のヒトプロティンＣの暗号配列を、活性化ペプチ
ドをコードしているＤＮＡが除去された別のプロティン
Ｃ暗号配列に置き換えることになる。
ように配置されたアデノウィルス２の後期プロモーター
およびＢＫウィルスのエンハンサ−をコードしているＤ
ＮＡセグメントを含有している。プラスミドｐＬＡＰＣ
構築のプロトコールは、本質的に、プラスミドｐｔ、、
ｐｃ上のヒトプロティンＣの暗号配列を、活性化ペプチ
ドをコードしているＤＮＡが除去された別のプロティン
Ｃ暗号配列に置き換えることになる。
プラスミドｐＬＰＣおよびｐＬＡＰＣ上のＢＫエンハン
サ−／アゾ／ウィルス後期プロモーターの発現コントロ
ール配列は、米国特許出願Ｎｏ、０６／８４９、９９９
（ｉ９８６年４月９日出願）の対象物である。米国特許
出願Ｎ ｏ、 ０６／８４９．９９９には、プラスミド
ｐＬＰＣ（従ってｐＬＡＰＣ）の発現コントロール配列
は大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物、即ちアデ
ノウィルスのＥＩＡ遺伝子産物の存在によってその活性
が大きく刺激されることが開示されている。
サ−／アゾ／ウィルス後期プロモーターの発現コントロ
ール配列は、米国特許出願Ｎｏ、０６／８４９、９９９
（ｉ９８６年４月９日出願）の対象物である。米国特許
出願Ｎ ｏ、 ０６／８４９．９９９には、プラスミド
ｐＬＰＣ（従ってｐＬＡＰＣ）の発現コントロール配列
は大きいＤＮＡウィルスの即時型遺伝子産物、即ちアデ
ノウィルスのＥＩＡ遺伝子産物の存在によってその活性
が大きく刺激されることが開示されている。
プラスミドｐＬＰＣ構築のプロトコールを以下に説明す
る。プラスミドｐｔ、ｐｃの全構築プロトコールを添付
の第１図に図示する。簡単に説明すると、実施例２Ａは
ＢＫウィルスＤＮＡの単離を３己載するものであり、こ
れからＢＫエンハンサ−を得ることができる。実施例２
Ｂは、ＢＫエンハンサ−をプラスミドｐｄＢ Ｐ Ｖ−
ＭＭＴｎｅｏに挿入することによって得られるプラスミ
ドである、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌ構築のプロトコー
ルを記載するものである。実施例２Ｃは、アデノウィル
ス２後期プロモーターをプラスミドｐｓＶ２ｃａｔに挿
入することによって得られるプラスミドである、プラス
ミドｐＬＰｃａＬ構築のプロトフールを記載するもので
ある。実施例２Ｄは、アデノウィルス後期プロモーター
の活性を刺激するように設置されたＢＫエンハンサ−を
含むプラスミドである、プラスミドｐＢＬｃａｔ構築の
プロトコールを記載するものである。実施例２Ｅは、プ
ロティンＣ発現ベクターであるプラスミドｐＬ１３３構
築のプロトコールを記載するものであり、出発プラスミ
ドｐＨＣ７から始め、中間体プラスミドｐｓＶ２−ＨＰ
ＣＢの構築を経て、最後にプラスミドｐＬ １３３を構
築する。最後に、実施例２Ｆは、ヒトプロティンＣを発
現するようプラスミドｐＬ１３３に挿入された、プラス
ミドｐＢＬｃａｔのＢＫエンハンサ−／アデノウィルス
後期プロモーター発現コントロール配列を含有するプラ
スミドｐＬＰＣの構築プロトコールを記載するものであ
る。
る。プラスミドｐｔ、ｐｃの全構築プロトコールを添付
の第１図に図示する。簡単に説明すると、実施例２Ａは
ＢＫウィルスＤＮＡの単離を３己載するものであり、こ
れからＢＫエンハンサ−を得ることができる。実施例２
Ｂは、ＢＫエンハンサ−をプラスミドｐｄＢ Ｐ Ｖ−
ＭＭＴｎｅｏに挿入することによって得られるプラスミ
ドである、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌ構築のプロトコー
ルを記載するものである。実施例２Ｃは、アデノウィル
ス２後期プロモーターをプラスミドｐｓＶ２ｃａｔに挿
入することによって得られるプラスミドである、プラス
ミドｐＬＰｃａＬ構築のプロトフールを記載するもので
ある。実施例２Ｄは、アデノウィルス後期プロモーター
の活性を刺激するように設置されたＢＫエンハンサ−を
含むプラスミドである、プラスミドｐＢＬｃａｔ構築の
プロトコールを記載するものである。実施例２Ｅは、プ
ロティンＣ発現ベクターであるプラスミドｐＬ１３３構
築のプロトコールを記載するものであり、出発プラスミ
ドｐＨＣ７から始め、中間体プラスミドｐｓＶ２−ＨＰ
ＣＢの構築を経て、最後にプラスミドｐＬ １３３を構
築する。最後に、実施例２Ｆは、ヒトプロティンＣを発
現するようプラスミドｐＬ１３３に挿入された、プラス
ミドｐＢＬｃａｔのＢＫエンハンサ−／アデノウィルス
後期プロモーター発現コントロール配列を含有するプラ
スミドｐＬＰＣの構築プロトコールを記載するものであ
る。
Ａ、ＢＫウィルスＤＮＡの調製
ＢＫウィルスはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クシコンから取得番号ＡＴＣＣＶＲ８３７のもとで入手
する。このウィルスは凍結乾燥形で供給され、これをバ
ンク（Ｈａｎｋ）のバランス塩［Ｇｉｂｃｏ、 ３１７
５５ｔａｌｅｙ Ｒｏａｄ、 Ｇｒａｎｄ ｌ５ｌａ’
ｎｄ、 ＮＹ １４０７２コに再懸濁して約１０’プラ
ーク形成単位（ｐｆｕ）／杼の力価にした。ＢＫウィル
スＤＮＡの調製用に選択した宿主は一次ヒト胚腎（Ｐ
ＨＥ Ｋ）細胞であり、この細胞はＦｌｏｗ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、 （７６５５０１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ Ｒｏａｄ、 ＭｃＬｅａｎ、
ＶＡ ２２１０１）からカタログ番号０−１ｏｏのもと
で、またはＭ、 Ａ、 Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓからカ
タログ番号７０−１５１のもとで入手することができる
。
クシコンから取得番号ＡＴＣＣＶＲ８３７のもとで入手
する。このウィルスは凍結乾燥形で供給され、これをバ
ンク（Ｈａｎｋ）のバランス塩［Ｇｉｂｃｏ、 ３１７
５５ｔａｌｅｙ Ｒｏａｄ、 Ｇｒａｎｄ ｌ５ｌａ’
ｎｄ、 ＮＹ １４０７２コに再懸濁して約１０’プラ
ーク形成単位（ｐｆｕ）／杼の力価にした。ＢＫウィル
スＤＮＡの調製用に選択した宿主は一次ヒト胚腎（Ｐ
ＨＥ Ｋ）細胞であり、この細胞はＦｌｏｗ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、 （７６５５０１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ Ｒｏａｄ、 ＭｃＬｅａｎ、
ＶＡ ２２１０１）からカタログ番号０−１ｏｏのもと
で、またはＭ、 Ａ、 Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓからカ
タログ番号７０−１５１のもとで入手することができる
。
全面単層の約１０８のＰＨＥＫ細胞を入れた約５個の７
５ｘｘ”ポリスチレン製フラスコをウィルスの調製に用
いた。各フラスコに１０ ’ｐｆｕ／ ａ１２の力価の
ＢＫウィルス（約ＩＩＩＩのを入れ、これを３７℃で１
時間インキュベートし、次いで新鮮な培養培地［ダルベ
ツコの改良イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、 Ｇｒａｎｄ
ｌ５ｌａｎｄ、 ＮＹ １４０７２） ； ｌ ０％つ
／胎児血清を追加コを加え、感染した細胞を３７°Ｃで
ｌＯ〜１４日間、またはウィルスの完全な細胞変性効果
が現れるまでインキュベートした。この細胞変性効果は
、セルラインの種類によって、およびウィルスの種類に
よって異なるが、通常は培養ディスクを集合させ、凝集
させ、そして脱落する細胞からなる。
５ｘｘ”ポリスチレン製フラスコをウィルスの調製に用
いた。各フラスコに１０ ’ｐｆｕ／ ａ１２の力価の
ＢＫウィルス（約ＩＩＩＩのを入れ、これを３７℃で１
時間インキュベートし、次いで新鮮な培養培地［ダルベ
ツコの改良イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、 Ｇｒａｎｄ
ｌ５ｌａｎｄ、 ＮＹ １４０７２） ； ｌ ０％つ
／胎児血清を追加コを加え、感染した細胞を３７°Ｃで
ｌＯ〜１４日間、またはウィルスの完全な細胞変性効果
が現れるまでインキュベートした。この細胞変性効果は
、セルラインの種類によって、およびウィルスの種類に
よって異なるが、通常は培養ディスクを集合させ、凝集
させ、そして脱落する細胞からなる。
凍結−解凍を３回繰り返すことによって細胞からウィル
スを放出させ、５０００Ｘｇで遠心して細胞の残骸を除
いた。ＰＥＧ−６０００（ｉ００ｇ）を加え、溶液を４
°Ｃで２４時間インキュベートし、そして５０００Ｘｇ
で２０分間遠心することによって、上清液（ｉの中のウ
ィルスを沈澱させ、集めた。このベレットを、初めの容
量のｌ／ｌｏｏで０、ｌＸのＳＳＣ緩衝液［ＩＸ ５Ｓ
Ｃ＝Ｏ，Ｉ５ＭＮａＣＱおよび０．０１５Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ＝７］に溶解した。このウィルス＃４濁
液を試験管中の飽和ＫＢｒ溶液（ｉ５ＪＩ＋２）の上に
層状に入れ、これを７５．ＯＯＯＸｇで３時間遠心した
。遠心後、２本のバンドがＫＢｒ／８液中に現れた。完
全なピリオンを含む下方のバンドを集め、ＴＥ［１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．８ ；および１ｍＭＥＤ
ＴＡ］を溶離緩衝液として用いる５ｅｐｈａｄｅｘ”
Ｇ−５０カラム［Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
、、 ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ６３１７８］で脱塩し
た。
スを放出させ、５０００Ｘｇで遠心して細胞の残骸を除
いた。ＰＥＧ−６０００（ｉ００ｇ）を加え、溶液を４
°Ｃで２４時間インキュベートし、そして５０００Ｘｇ
で２０分間遠心することによって、上清液（ｉの中のウ
ィルスを沈澱させ、集めた。このベレットを、初めの容
量のｌ／ｌｏｏで０、ｌＸのＳＳＣ緩衝液［ＩＸ ５Ｓ
Ｃ＝Ｏ，Ｉ５ＭＮａＣＱおよび０．０１５Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ＝７］に溶解した。このウィルス＃４濁
液を試験管中の飽和ＫＢｒ溶液（ｉ５ＪＩ＋２）の上に
層状に入れ、これを７５．ＯＯＯＸｇで３時間遠心した
。遠心後、２本のバンドがＫＢｒ／８液中に現れた。完
全なピリオンを含む下方のバンドを集め、ＴＥ［１０ｍ
Ｍトリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．８ ；および１ｍＭＥＤ
ＴＡ］を溶離緩衝液として用いる５ｅｐｈａｄｅｘ”
Ｇ−５０カラム［Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
、、 ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、 ＭＯ６３１７８］で脱塩し
た。
このカラムから得た精製ピリオンの溶液にドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）を１％の濃度になるまで加え、ｐ
ｒｏｎａｓｅＩｌ（Ｓｉｇｍａ）プロテアーゼを１００
μｇ／ｍＱＬ！ａ度になるよう加え、そしてこの溶液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、この溶
液に塩化セシウムを１．５６９／ｘＱの密度になるよう
加え、臭化エチジウムを最終濃度１００μ９７ｍ（ｌに
なるよう加えた。この溶液を５ｏｒｖａｌｌ ８８５ａ
−夕−［ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ、、 Ｎｅｗｔｏｎ、 Ｃ
Ｔ ０６４７０］または同様の垂直ローター中、２６０
．ＯＯＯＸｇで２４時間遠心した。遠心後、ウィルスＤ
ＮＡのバンドを単離し、１００ｍＭのトリス−ＨＣＱ、
ｐＨ＝７８で飽和したイソアミルアルコールにより５回
抽出した。次いで、ＢＫウィルスＤＮＡの溶液を、ＤＮ
Ａの２６０％ｍ／ ２８０ｎｎ＋吸収比が１．７５〜１
．９０になるまでＴＥ緩衝液に対して透析した。
ナトリウム（ＳＤＳ）を１％の濃度になるまで加え、ｐ
ｒｏｎａｓｅＩｌ（Ｓｉｇｍａ）プロテアーゼを１００
μｇ／ｍＱＬ！ａ度になるよう加え、そしてこの溶液を
３７°Ｃで２時間インキュベートした。次いで、この溶
液に塩化セシウムを１．５６９／ｘＱの密度になるよう
加え、臭化エチジウムを最終濃度１００μ９７ｍ（ｌに
なるよう加えた。この溶液を５ｏｒｖａｌｌ ８８５ａ
−夕−［ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ、、 Ｎｅｗｔｏｎ、 Ｃ
Ｔ ０６４７０］または同様の垂直ローター中、２６０
．ＯＯＯＸｇで２４時間遠心した。遠心後、ウィルスＤ
ＮＡのバンドを単離し、１００ｍＭのトリス−ＨＣＱ、
ｐＨ＝７８で飽和したイソアミルアルコールにより５回
抽出した。次いで、ＢＫウィルスＤＮＡの溶液を、ＤＮ
Ａの２６０％ｍ／ ２８０ｎｎ＋吸収比が１．７５〜１
．９０になるまでＴＥ緩衝液に対して透析した。
ＮａＣＱａ度をＯ，１５Ｍに調節し、２容量のエタノー
ルを加え、この溶液を一７０°Ｃで少なくとも２時間イ
ンキュベートし、そして１２．ＯＯＯＸｇで１０分間遠
心することによってＤＮＡを沈澱させた。得られたＢＫ
ウィルスＤＮＡのペレットを１ ｒｎ９／ ｒｎＱの濃
度でＴＥ緩衝液に懸濁させた。ＢＫウィルスの制限部位
および機能地図を添付の第１図に示す。
ルを加え、この溶液を一７０°Ｃで少なくとも２時間イ
ンキュベートし、そして１２．ＯＯＯＸｇで１０分間遠
心することによってＤＮＡを沈澱させた。得られたＢＫ
ウィルスＤＮＡのペレットを１ ｒｎ９／ ｒｎＱの濃
度でＴＥ緩衝液に懸濁させた。ＢＫウィルスの制限部位
および機能地図を添付の第１図に示す。
Ｂ、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの構築
大腸菌に１２ ＨＢＩＯＩ／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ
細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから取得番号ＡＴＣＣ３７２２４のもと、凍結乾燥形
で入手する。この凍結乾燥細胞をｌＯＯμ９／ｍＱアン
ピシリン含有のし寒天プレートに蒔き、３７°Ｃでイン
キュベートして１９のコロニー単離体を得た。
細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから取得番号ＡＴＣＣ３７２２４のもと、凍結乾燥形
で入手する。この凍結乾燥細胞をｌＯＯμ９／ｍＱアン
ピシリン含有のし寒天プレートに蒔き、３７°Ｃでイン
キュベートして１９のコロニー単離体を得た。
５０μ９／ Ｊ１７！アンピシリン含有のしブロス［，
１１２あたりトリプトン １０ｇ、ＮａＣＣ１０ｇ、お
よび酵母地出物５ｇ１（ＩＱ）に大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩ
ＯＩ／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏのコロニーを接種し、
空気−振５ば型中、Ｏ，Ｄ、、、。が〜１１吸収単にな
るまで３７°Ｃでインキュベートし、この時点で培養物
にクロラムフェニコールは１５０１９）を加えた。約１
６時間インキュベートを続けた。クロラムフェニコール
の添加はタンパク質の合成を阻害し、従ってさらに細胞
分裂するのを抑制するが、プラスミドの？ｉ２は継続さ
せる。次いで、実質的に実施例１Ａ記、戊の方法に従っ
て、培養物からプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ
ＤＮＡを：Ａ製した。
１１２あたりトリプトン １０ｇ、ＮａＣＣ１０ｇ、お
よび酵母地出物５ｇ１（ＩＱ）に大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩ
ＯＩ／ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏのコロニーを接種し、
空気−振５ば型中、Ｏ，Ｄ、、、。が〜１１吸収単にな
るまで３７°Ｃでインキュベートし、この時点で培養物
にクロラムフェニコールは１５０１９）を加えた。約１
６時間インキュベートを続けた。クロラムフェニコール
の添加はタンパク質の合成を阻害し、従ってさらに細胞
分裂するのを抑制するが、プラスミドの？ｉ２は継続さ
せる。次いで、実質的に実施例１Ａ記、戊の方法に従っ
て、培養物からプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ
ＤＮＡを：Ａ製した。
この方法によって得たプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎ
ｅｏ ＤＮＡ（〜ｌニア９）をＴ Ｅ ＦＲ重液（Ｉ
ｆｆ（りに５局させ、−２０’Ｃで保存した。〕川用、
実施例１Ａ記載のプラスミド単離法は、大量の高精製度
プラスミドＤ Ｎ Ａが所望であるときに用いられる。
ｅｏ ＤＮＡ（〜ｌニア９）をＴ Ｅ ＦＲ重液（Ｉ
ｆｆ（りに５局させ、−２０’Ｃで保存した。〕川用、
実施例１Ａ記載のプラスミド単離法は、大量の高精製度
プラスミドＤ Ｎ Ａが所望であるときに用いられる。
この方、去を少し変え、培養細胞を約５ｊＩＱだけ用い
、この細胞を適切にスケールダウンした量の溶菌緩衝液
中で溶菌し、遠心工程をフェノールおよびクロロホルム
抽出に置き換えることによって、比較的少量の、やや精
製度の低いＤＮＡ（例えば、あるプラスミドの存在につ
いて形質転換体をスクリニングするときに必要とされる
ようなりＮＡ）を早く得ることができる。
、この細胞を適切にスケールダウンした量の溶菌緩衝液
中で溶菌し、遠心工程をフェノールおよびクロロホルム
抽出に置き換えることによって、比較的少量の、やや精
製度の低いＤＮＡ（例えば、あるプラスミドの存在につ
いて形質転換体をスクリニングするときに必要とされる
ようなりＮＡ）を早く得ることができる。
上記のようにして調製したプラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭ
Ｔｎｅｏ ＤＮＡ（約５μ９；５μＱ）、および前記の
ようにして調製したＢＫウィルスＤＮＡ（５μ９５μ（
りのそれぞれを、ＩＯＸのＢａｍＨＩ緩衝液［１，５Ｍ
ＮａＣＱ； ６０ｍＭ）リス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，９
： ６０ｍＭ ＭｇＣＱ２：および１１Ｎ９／ｍＱＢＳ
Ａ］（２ｇ１２）、制限酵素ＢａｍＨＩ（ｉμｆ２：〜
ｔｏ単位）、および水（７μＱ）を含む溶液中、３７°
Ｃで２時間消化した。郷里のフェノールで抽出し、続い
てクロロホルムで２回抽出することによって反応を停止
させた。次いで、ＢａｍＨｌ消化したＤＮＡのそれぞれ
を沈澱させ、遠心して集め、水（５μＱ）に再懸濁した
。
Ｔｎｅｏ ＤＮＡ（約５μ９；５μＱ）、および前記の
ようにして調製したＢＫウィルスＤＮＡ（５μ９５μ（
りのそれぞれを、ＩＯＸのＢａｍＨＩ緩衝液［１，５Ｍ
ＮａＣＱ； ６０ｍＭ）リス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，９
： ６０ｍＭ ＭｇＣＱ２：および１１Ｎ９／ｍＱＢＳ
Ａ］（２ｇ１２）、制限酵素ＢａｍＨＩ（ｉμｆ２：〜
ｔｏ単位）、および水（７μＱ）を含む溶液中、３７°
Ｃで２時間消化した。郷里のフェノールで抽出し、続い
てクロロホルムで２回抽出することによって反応を停止
させた。次いで、ＢａｍＨｌ消化したＤＮＡのそれぞれ
を沈澱させ、遠心して集め、水（５μＱ）に再懸濁した
。
Ｂ ａｍＨｌ ｌ白化しｔコブラスミドｐｄＢ Ｐ Ｖ
−ＭＭＴｎｅｏ（ｌ ｕＱ’）とＢａｍＨＩ〆肖化し
たＢＫウィルスＤＮＡ（ｉμＱ）の混合物にＩＯＸのリ
ガーゼ緩衝液（約ｌμＱ）を加えた。このＤ Ｎ Ａ混
合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｉμＱ、〜５単位）および
水（６ｇのを加゛えた後、得られた反応液を１６°Ｃで
一部インキユベートシた。ライゲートしたＤＮＡは所望
のプラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２から
なり、これらはＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なっ
ていた。プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および機
能地図を添付の第１−に示す。
−ＭＭＴｎｅｏ（ｌ ｕＱ’）とＢａｍＨＩ〆肖化し
たＢＫウィルスＤＮＡ（ｉμＱ）の混合物にＩＯＸのリ
ガーゼ緩衝液（約ｌμＱ）を加えた。このＤ Ｎ Ａ混
合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ（ｉμＱ、〜５単位）および
水（６ｇのを加゛えた後、得られた反応液を１６°Ｃで
一部インキユベートシた。ライゲートしたＤＮＡは所望
のプラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびｐＢＫｎｅｏ２から
なり、これらはＢＫウィルスＤＮＡの配向だけが異なっ
ていた。プラスミドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および機
能地図を添付の第１−に示す。
大１１１ｊｍＫ１２ ＨＢＩＯＩ細胞はノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・ラボラトリ−から取得番号ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１５６２６のもと凍結乾燥形で入手可能で
ある。Ｌブロス中の犬１１１Ｋ１２ ＨＢｌｏｌの培
養物（５Ｍ）を、６５０ ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、
ｓｓ。）が約０．４吸収単位になるまで増殖させた。こ
の培養物を水上で１０分間冷却し、細胞を遠心して集め
た。この細胞ペレットを冷１００ ｍＭ ＭｇＣＱｔ（
２５肩Ｑ）に再懸濁し、氷上で２５分間インキュベート
した。細胞を再度遠心してペレット化し、ベレットを冷
１０ｏＩＩＩＭＣａＣら（２５ｍのに再懸濁し、水上で
３０分間インキュベートした。インキュベートした後に
は、この細胞は形質転換用ＤＮＡの取込みに対してコン
ピテントであった。
ージョナル・リサーチ・ラボラトリ−から取得番号ＮＲ
ＲＬ Ｂ−１５６２６のもと凍結乾燥形で入手可能で
ある。Ｌブロス中の犬１１１Ｋ１２ ＨＢｌｏｌの培
養物（５Ｍ）を、６５０ ｎｍでの光学密度（０，Ｄ、
ｓｓ。）が約０．４吸収単位になるまで増殖させた。こ
の培養物を水上で１０分間冷却し、細胞を遠心して集め
た。この細胞ペレットを冷１００ ｍＭ ＭｇＣＱｔ（
２５肩Ｑ）に再懸濁し、氷上で２５分間インキュベート
した。細胞を再度遠心してペレット化し、ベレットを冷
１０ｏＩＩＩＭＣａＣら（２５ｍのに再懸濁し、水上で
３０分間インキュベートした。インキュベートした後に
は、この細胞は形質転換用ＤＮＡの取込みに対してコン
ピテントであった。
この細胞′＃＆濁液（２００μη）を上記調製のライゲ
ート化ＤＮＡと混合し、水上で３０分間インキュベート
した。この時間が経過した時点で、細胞を４２°Ｃの水
浴中に２分間入れ、次いでさらに１０分間氷上に戻した
。細胞を遠心して集め、Ｌグロス（ｉｍＱ）に再％％５
し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。形質転換し
た細胞を１００μ９／ｍＱアンピシリン含有のし寒天プ
レートに蒔いた。大腸菌に１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＢＫｎ
ｅｏｌおよび大腸菌に１２／ｐＢＫｎｅｏ２形質転換体
は、そのアンビンリン耐性の表現型、およびそのプラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。プラスミ
ドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および機能地図を添付の第
１Ａ図に示す。
ート化ＤＮＡと混合し、水上で３０分間インキュベート
した。この時間が経過した時点で、細胞を４２°Ｃの水
浴中に２分間入れ、次いでさらに１０分間氷上に戻した
。細胞を遠心して集め、Ｌグロス（ｉｍＱ）に再％％５
し、３７°Ｃで１時間インキュベートした。形質転換し
た細胞を１００μ９／ｍＱアンピシリン含有のし寒天プ
レートに蒔いた。大腸菌に１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＢＫｎ
ｅｏｌおよび大腸菌に１２／ｐＢＫｎｅｏ２形質転換体
は、そのアンビンリン耐性の表現型、およびそのプラス
ミドＤＮＡの制限酵素分析によって同定した。プラスミ
ドｐＢＫｎｅｏｌの制限部位および機能地図を添付の第
１Ａ図に示す。
ＣプラスミドｐＢＬｃａＬの構築に用いる中間体プアデ
ノウィルス２（Δｄ２）のピリオンＤＮＡは、大きさが
約３５．９４ｋｂの２本鎖の直線状分子である。Ａｄ２
の後期プロモーターをＡｄ２ゲノムの〜０．３２ ｋｂ
Ａｃｅ Ｉ −ＰＶＵＩ＋制限フラグメントで単離す
ることができる；この〜０．３２ｋｂ制限フラグメント
はＡｄ２ゲノムのヌクレオチド位置５７５５と６０７１
の間の配列に対応している。所望の〜０．３２ｋｂ Ａ
ｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントを単離するため、
初めにＡｄ２ ＤＮＡを制限酵素Ｂａ１ｌで消化し、
〜０．３２ｋｂ Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメン
トの全配列を含有している〜２４、ｋｂＢａｌｌ制限フ
ラグメントを単離した。次に、この〜２．４ｋｂ Ｂａ
ｉ＋制限フラグメントをＡｃｃｌおよびＰｖｕｌｌて消
化して所望のフラグメントを得た。
ノウィルス２（Δｄ２）のピリオンＤＮＡは、大きさが
約３５．９４ｋｂの２本鎖の直線状分子である。Ａｄ２
の後期プロモーターをＡｄ２ゲノムの〜０．３２ ｋｂ
Ａｃｅ Ｉ −ＰＶＵＩ＋制限フラグメントで単離す
ることができる；この〜０．３２ｋｂ制限フラグメント
はＡｄ２ゲノムのヌクレオチド位置５７５５と６０７１
の間の配列に対応している。所望の〜０．３２ｋｂ Ａ
ｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントを単離するため、
初めにＡｄ２ ＤＮＡを制限酵素Ｂａ１ｌで消化し、
〜０．３２ｋｂ Ａｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメン
トの全配列を含有している〜２４、ｋｂＢａｌｌ制限フ
ラグメントを単離した。次に、この〜２．４ｋｂ Ｂａ
ｉ＋制限フラグメントをＡｃｃｌおよびＰｖｕｌｌて消
化して所望のフラグメントを得た。
Ａｄ２ ＤＮＡ（約５０μｌ ＢＲＬから入手可能）
を水（８０μＣ）および１０ＸのＢａ１ｌ緩衝液［１０
０ｍＭ トリス−ＨＣＣ，ｐＨ＝７．６ ； １２０
ｍＭＭｇＣ（ｈ ； １００ ｍＭ Ｄ Ｔ Ｔ ：お
よび１ｍ９／ｍＱＢＳＡＤ（ｉ０μのにｌ容量した。こ
のＡｄ２ ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｂａｌ＋（約ｌＯ
旺−〜２０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで
４時間インキュベートした。
を水（８０μＣ）および１０ＸのＢａ１ｌ緩衝液［１０
０ｍＭ トリス−ＨＣＣ，ｐＨ＝７．６ ； １２０
ｍＭＭｇＣ（ｈ ； １００ ｍＭ Ｄ Ｔ Ｔ ：お
よび１ｍ９／ｍＱＢＳＡＤ（ｉ０μのにｌ容量した。こ
のＡｄ２ ＤＮＡの溶液に制限酵素Ｂａｌ＋（約ｌＯ
旺−〜２０単位）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで
４時間インキュベートした。
、＝のＢａ＋Ｉ／Ｍ化したＤＮＡをアガロースゲルにか
け、制限フラグメントが十分に分離するまで電気泳動を
行った。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（０，５μ９
／ ｘＱ’）中で染色し、染色したゲルを長波長の紫外
（ＵＶ）光にあてることによって電気泳動したＤＮＡを
見えるようにした。アガロースからＤＮＡを単離する方
法の１つは次のようである。
け、制限フラグメントが十分に分離するまで電気泳動を
行った。ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液（０，５μ９
／ ｘＱ’）中で染色し、染色したゲルを長波長の紫外
（ＵＶ）光にあてることによって電気泳動したＤＮＡを
見えるようにした。アガロースからＤＮＡを単離する方
法の１つは次のようである。
ゲルの所望のフラグメントの前に小さな切れ目を入れ、
ＮＡ−４５ＤＥＡＥメンプラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ ５ｃｈｕｅｌｌ、 Ｋｅｅｎｅ、 Ｎ）ｌ
０３４３１）の小片をそれぞれの切れ目に入れる。さら
に電気泳動を続けると、ＤＮＡが非共有結合でＤＥＡＥ
メンプランに結合する。所望のフラグメントがＤＥＡＥ
メンプランに結合した後、このメンプランを取り、低塩
の緩衝液［１００ｍＭ ＫＣＱ： Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび２０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ＝８］ですすぐ。
ＮＡ−４５ＤＥＡＥメンプラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ ５ｃｈｕｅｌｌ、 Ｋｅｅｎｅ、 Ｎ）ｌ
０３４３１）の小片をそれぞれの切れ目に入れる。さら
に電気泳動を続けると、ＤＮＡが非共有結合でＤＥＡＥ
メンプランに結合する。所望のフラグメントがＤＥＡＥ
メンプランに結合した後、このメンプランを取り、低塩
の緩衝液［１００ｍＭ ＫＣＱ： Ｏ，１ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび２０ｍＭトリス−ＨＣＬｐＨ＝８］ですすぐ。
次に、このメンプランを小さい試験管に入れ、高塩の緩
衝液［ＩＭ ＮａＣｌ２： ｏ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；お
よび２０ ｍＭ トリス−ＨＣＬｐＨ＝８］に浸漬し、
そして６５℃で１時間インキュベートしてＤＥＡＥ紙か
らＤＮＡを浸出させる。この６５°Ｃのインキュベート
の後、インキュベート緩衝液を集め、メンプランを高塩
の緩衝液ですすぐ。この高塩のすすぎ液を高塩のインキ
ュベート緩衝液とともに集めた。
衝液［ＩＭ ＮａＣｌ２： ｏ、１ｍＭ ＥＤＴＡ；お
よび２０ ｍＭ トリス−ＨＣＬｐＨ＝８］に浸漬し、
そして６５℃で１時間インキュベートしてＤＥＡＥ紙か
らＤＮＡを浸出させる。この６５°Ｃのインキュベート
の後、インキュベート緩衝液を集め、メンプランを高塩
の緩衝液ですすぐ。この高塩のすすぎ液を高塩のインキ
ュベート緩衝液とともに集めた。
Ｎ ａ ＣＱ濃度が０２５Ｍになるように高塩のＤＮＡ
溶液の容量を調節し、次いでこの溶液に３容量の冷、無
水エタノールを加えた。得られた溶液を混合し、１０〜
２０分間、−７０°Ｃにした。次に、この溶液を１５．
００ Ｏｒｐｍで１５分間遠心した。さらに沈澱を行っ
て残留する塩を除去した後、ＤＮＡペレットをエタノー
ルですすぎ、乾燥し、ＴＥ緩衝液（２０μＱ）に再懸濁
した；このペレットは目的のＡｄ２の制限フラグメント
（約３μｇ）からなっていた。得られた精製フラグメン
トをＴＥＡ衝液（ｉ０μＱ）に溶解した。
溶液の容量を調節し、次いでこの溶液に３容量の冷、無
水エタノールを加えた。得られた溶液を混合し、１０〜
２０分間、−７０°Ｃにした。次に、この溶液を１５．
００ Ｏｒｐｍで１５分間遠心した。さらに沈澱を行っ
て残留する塩を除去した後、ＤＮＡペレットをエタノー
ルですすぎ、乾燥し、ＴＥ緩衝液（２０μＱ）に再懸濁
した；このペレットは目的のＡｄ２の制限フラグメント
（約３μｇ）からなっていた。得られた精製フラグメン
トをＴＥＡ衝液（ｉ０μＱ）に溶解した。
水（約６μｅ）およびＩＯＸのＡｃｃｌ緩衝ｉ（！［６
０ｍＭ ＮａＣ（ｉ： ６０ｍＭ トリス−ＨＣｇ％
ｐＨ＝７５ ； ６０＋ｎＭ ＭｇＣ（ｂ ： ６０ｍ
Ｍ ＤＴＴ および１η／ｘＱ Ｂ Ｓ Ａ］（２μ
のを、Ａｄ２の〜２．４ｋｂＢａｌ＋制限フラグメント
の溶液に加えた。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ａｃｃ＋（
約２μσ；〜１０単位）を加えた後、反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。Ａｃｃｌ消化した後、Ｄ
Ｎ Ａをエタノール沈澱によって集め、水（ｉ６μのお
よびＩＯＸのＰｖｕｌｌ緩衝液［６００ｍＭ ＮａＣＱ
： ６０ｍＭ トリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．５ ；
６０ｍＭ ＭｇＣＬ； ６０ｍＭＤＴＴ；およびｌ ｔ
ｎｇ／ ｍＱ Ｂ Ｓ Ａコ（２μＱ）に再Ｑ濁した。
０ｍＭ ＮａＣ（ｉ： ６０ｍＭ トリス−ＨＣｇ％
ｐＨ＝７５ ； ６０＋ｎＭ ＭｇＣ（ｂ ： ６０ｍ
Ｍ ＤＴＴ および１η／ｘＱ Ｂ Ｓ Ａ］（２μ
のを、Ａｄ２の〜２．４ｋｂＢａｌ＋制限フラグメント
の溶液に加えた。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ａｃｃ＋（
約２μσ；〜１０単位）を加えた後、反応液を３７℃で
２時間インキュベートした。Ａｃｃｌ消化した後、Ｄ
Ｎ Ａをエタノール沈澱によって集め、水（ｉ６μのお
よびＩＯＸのＰｖｕｌｌ緩衝液［６００ｍＭ ＮａＣＱ
： ６０ｍＭ トリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．５ ；
６０ｍＭ ＭｇＣＬ； ６０ｍＭＤＴＴ；およびｌ ｔ
ｎｇ／ ｍＱ Ｂ Ｓ Ａコ（２μＱ）に再Ｑ濁した。
このＤＮＡ１ａ液に制限酵素Ｐｖｕｌｌ（約２μａ；約
１０単位）を加えた後、反応液を３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。
１０単位）を加えた後、反応液を３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。
Ａｃｅ Ｉ −Ｐｖｕｌｌ？肖化した、Ａｄ２の〜２．
４ｋｂＢａｌ＋制限フラグメントを〜６％ポリアクリル
アミドゲルにかけ、Ａｄ２の後期プロモーターを含存す
る〜０．３２ｋｂのＡｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ１１制限フラ
グメントが他の消化産物から分離するまで電気泳動を行
った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光を用
いて観察し、−０，３２ｋｂのＡｃｃＩＰｖｕｌｌ制限
フラグメントを含んでいるゲル部分をゲルから切り出し
、これをつぶし、そして室温で一晩、抽出緩衝液［５０
０ｍＭ ＮＨ，ＯＡｃ ； ＩＱｍＭ Ｍｇ０ＡＩ ］
ｍＭ ＥＤＴＡ：および０．１％ＳＤＳ］（〜２５０μ
Ｑ）中に浸した。翌朝、この混合物を遠心し、ベレット
を捨てた。上清中のＤＮＡをエタ／−ルで沈澱させた；
ｔＲＮＡ（約２μｇ）を加えて所望のフラグメントの沈
１毀を確実なものにした。〜０．３２ｋｂ Ａｃｃｌ−
Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントが約０２μ９得られ、これ
を水（７μＱ、）に懸濁させた。
４ｋｂＢａｌ＋制限フラグメントを〜６％ポリアクリル
アミドゲルにかけ、Ａｄ２の後期プロモーターを含存す
る〜０．３２ｋｂのＡｃｃ Ｉ −Ｐｖｕ１１制限フラ
グメントが他の消化産物から分離するまで電気泳動を行
った。このゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光を用
いて観察し、−０，３２ｋｂのＡｃｃＩＰｖｕｌｌ制限
フラグメントを含んでいるゲル部分をゲルから切り出し
、これをつぶし、そして室温で一晩、抽出緩衝液［５０
０ｍＭ ＮＨ，ＯＡｃ ； ＩＱｍＭ Ｍｇ０ＡＩ ］
ｍＭ ＥＤＴＡ：および０．１％ＳＤＳ］（〜２５０μ
Ｑ）中に浸した。翌朝、この混合物を遠心し、ベレット
を捨てた。上清中のＤＮＡをエタ／−ルで沈澱させた；
ｔＲＮＡ（約２μｇ）を加えて所望のフラグメントの沈
１毀を確実なものにした。〜０．３２ｋｂ Ａｃｃｌ−
Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントが約０２μ９得られ、これ
を水（７μＱ、）に懸濁させた。
このＡｃｃｌ−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントをＡｃｃｌ
Ｂｃｌ＋制限フラグメントに変換するため、〜０゜３２
ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントにＢ
ｃｌＩリンカ−をライゲートした。Ｂｅ１ｌリンカ−は
平滑末端であるので、このリンカ−は制限フラグメント
のＰｖｕｌｌ末端にだけ結合した。以下の配列を有する
Ｂｅ１ｌリンカ−（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）を、次の方法によりライゲート用にキナーゼ処
理し、用意した： ５ −ＣＴＧＡＴＣＡＧ−３ ３−ＧＡＣＴＡＧＴＣ−５ リンカ−（４μぐ；〜２μｇ）を水（２０，１５μＱ）
およびｔＯＸのキナーゼ緩衝液［５００ｍＭ）リスＨＣ
Ｑ、 ｐＩ（＝７．６ ＋および１００ ｍＭ ＭｇＣ
Ｑｔ］（５μＱ）に溶解し、９０°Ｃで２分間インキュ
ベートし、次いで室温まで冷却した。この混合物にγ”
Ｐ−ＡＴＰ（５μＱ、〜２０μＣｉ）、ＩＭ ＤＴＴ（
２５μＱ）、およびポリヌクレオチドキナーゼ（５μＱ
〜１０単位）を加え、３７°Ｃで３０分間インキュベー
トした。次に、０．０１．Ｍ ＡＴＰ（３，３５μＱ）
およびキナーゼ（５μＱ）を加え、この反応液をさらに
３０分間、３７°Ｃに保った。放射活性のＡＴＰは、リ
ンカ−が標的ＤＮＡにライゲートしたかどうかを調べる
際の助けとなる。
Ｂｃｌ＋制限フラグメントに変換するため、〜０゜３２
ｋｂ Ａｃｃ Ｉ −Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントにＢ
ｃｌＩリンカ−をライゲートした。Ｂｅ１ｌリンカ−は
平滑末端であるので、このリンカ−は制限フラグメント
のＰｖｕｌｌ末端にだけ結合した。以下の配列を有する
Ｂｅ１ｌリンカ−（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）を、次の方法によりライゲート用にキナーゼ処
理し、用意した： ５ −ＣＴＧＡＴＣＡＧ−３ ３−ＧＡＣＴＡＧＴＣ−５ リンカ−（４μぐ；〜２μｇ）を水（２０，１５μＱ）
およびｔＯＸのキナーゼ緩衝液［５００ｍＭ）リスＨＣ
Ｑ、 ｐＩ（＝７．６ ＋および１００ ｍＭ ＭｇＣ
Ｑｔ］（５μＱ）に溶解し、９０°Ｃで２分間インキュ
ベートし、次いで室温まで冷却した。この混合物にγ”
Ｐ−ＡＴＰ（５μＱ、〜２０μＣｉ）、ＩＭ ＤＴＴ（
２５μＱ）、およびポリヌクレオチドキナーゼ（５μＱ
〜１０単位）を加え、３７°Ｃで３０分間インキュベー
トした。次に、０．０１．Ｍ ＡＴＰ（３，３５μＱ）
およびキナーゼ（５μＱ）を加え、この反応液をさらに
３０分間、３７°Ｃに保った。放射活性のＡＴＰは、リ
ンカ−が標的ＤＮＡにライゲートしたかどうかを調べる
際の助けとなる。
キナーゼ処理したＢζＩＩリンカ−（約０．２５μ９・
０．５ｕ（ｌ中）を〜０．３２ｋｂ Ａｃｃｌ−Ｐｖｕ
ｌｌ制限フラグメントの溶液に加え、次に、このＤＮＡ
溶液に７４ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ：〜１０００単位）
および１０Ｘのりガーゼ緩衝液（ｌμＱ）を加え、得ら
れた反応液を１６°Ｃで一部インキニベートした。
０．５ｕ（ｌ中）を〜０．３２ｋｂ Ａｃｃｌ−Ｐｖｕ
ｌｌ制限フラグメントの溶液に加え、次に、このＤＮＡ
溶液に７４ＤＮＡリガーゼ（ｌμＱ：〜１０００単位）
および１０Ｘのりガーゼ緩衝液（ｌμＱ）を加え、得ら
れた反応液を１６°Ｃで一部インキニベートした。
Ｂｃｌｌリンカ−はＡｃｅ ｌ −Ｐｖｕｌｌ制限フラ
グメントのＰｖｕｌｌ末端にだけライゲートすることが
できた。後のＤ Ｎ Ａ配列決定により、Ａｃｃ Ｉ
−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントのＰｖｕｌｌ末端には４
個のＢａ１ｌリンカ−が結合していることがわかった。
グメントのＰｖｕｌｌ末端にだけライゲートすることが
できた。後のＤ Ｎ Ａ配列決定により、Ａｃｃ Ｉ
−Ｐｖｕｌｌ制限フラグメントのＰｖｕｌｌ末端には４
個のＢａ１ｌリンカ−が結合していることがわかった。
これら余分のＢａ１ｌリンカ−はＢｃｌｒ消化とライゲ
ートによって除くことができるが、これらリンカ−は余
分のリンカ−を含んでいるベクターが適切に機能するの
を妨げないので、余分のＢｃｌ＋は除去しなかった。
ートによって除くことができるが、これらリンカ−は余
分のリンカ−を含んでいるベクターが適切に機能するの
を妨げないので、余分のＢｃｌ＋は除去しなかった。
大腸菌に１２ ＨＢＩＯＩ／ｐＳＶ２ｃａｔ細胞をＡ
ＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７１５５のもと凍結乾燥
形で入手し、テトラサイタリンの代わりに５０μ９／ｍ
Ｑのアンピシリンを用いること以外は実質的に実施例Ｉ
Ａの方法に従って、この細胞からプラスミドｐＳＶ２ｅ
ａｔ ＤＮＡを単離した。
ＴＣＣから取得番号ＡＴＣＣ３７１５５のもと凍結乾燥
形で入手し、テトラサイタリンの代わりに５０μ９／ｍ
Ｑのアンピシリンを用いること以外は実質的に実施例Ｉ
Ａの方法に従って、この細胞からプラスミドｐＳＶ２ｅ
ａｔ ＤＮＡを単離した。
このプラスミドＰＳＶ２ｃａｔの制限部位および機能地
図を添付の第１Ｂ図に示す。約Ｌ１のプラスミドｐｓ
Ｖ ２ｃＢｊ ＤＮ Ａを得、これをＴＥ緩衝液（ｉス
Ｑ）に溶解した。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔ ＤＮＡ（
約３ｕ９：３ｐＱ）をＩＯＸのＡｃｃ＋緩衝液（２μｃ
）および水（ｉ６μのに加え、次いでこのｐｓＶ２ｃａ
ｔＤＮＡの溶液に制限酵素Ａｃｃｌ（３μＱ：約９単位
）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュ
ベートした。次に、このＡｃｃＩ消化したプラスミｔ’
ｐｓ Ｖ ２ｃａｔ Ｄ Ｎ Ａを、ＩＱＸのＳ ｔｕ
Ｉ 緩衝液［１，０Ｍ ＮａＣＱ： １００ｍＭ
トリス−ＨＣＱ。
図を添付の第１Ｂ図に示す。約Ｌ１のプラスミドｐｓ
Ｖ ２ｃＢｊ ＤＮ Ａを得、これをＴＥ緩衝液（ｉス
Ｑ）に溶解した。プラスミドｐＳＶ２ｃａｔ ＤＮＡ（
約３ｕ９：３ｐＱ）をＩＯＸのＡｃｃ＋緩衝液（２μｃ
）および水（ｉ６μのに加え、次いでこのｐｓＶ２ｃａ
ｔＤＮＡの溶液に制限酵素Ａｃｃｌ（３μＱ：約９単位
）を加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時間インキュ
ベートした。次に、このＡｃｃＩ消化したプラスミｔ’
ｐｓ Ｖ ２ｃａｔ Ｄ Ｎ Ａを、ＩＱＸのＳ ｔｕ
Ｉ 緩衝液［１，０Ｍ ＮａＣＱ： １００ｍＭ
トリス−ＨＣＱ。
ｐＨ＝８．ｏ ； １００ｍＭ ＭｇＣｌ２．； ６０
ｍＭ ＤＴＴ：および１ｙ９／ＲＱ Ｂ Ｓ Ａ］（３
μＱ）、水（５μ（り、および制限酵素５ｔｕｌ（約２
μＣ；約ＩＯ単位）を加えることにより制限酵素５ｔｕ
ｌで消化した。得られた反応ｌｆＬを３７°Ｃで２時間
インキュベートした。
ｍＭ ＤＴＴ：および１ｙ９／ＲＱ Ｂ Ｓ Ａ］（３
μＱ）、水（５μ（り、および制限酵素５ｔｕｌ（約２
μＣ；約ＩＯ単位）を加えることにより制限酵素５ｔｕ
ｌで消化した。得られた反応ｌｆＬを３７°Ｃで２時間
インキュベートした。
この反応混合物をフェノールで１回、次いでクロロホル
ムで２回抽出することによって反応を停止させた。約０
．５μ９の目的フラグメントが得られ、これをＴＥ緩衝
液（２０μＱ）に溶解した。
ムで２回抽出することによって反応を停止させた。約０
．５μ９の目的フラグメントが得られ、これをＴＥ緩衝
液（２０μＱ）に溶解した。
Ａｃｃ［−３ｔｕｌｌ肖化したプラスミドｐＳ Ｖ ２
ｃａｔＤＮＡ（約４μＱ）をＡｄ２の〜０．３２ｋｂＡ
ｃｃｌＰｖｕｌｌ（Ｂｃｌｌリンカ−が結合している）
制限フラグメント（約７μＱ）と混合し、１０ｘのりガ
ーゼ緩衝）夜（３μの、水（ｉ５μの、およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（２ｕＱ＋約１０００単位）を加えた後
、このライゲート反応液を１６°Ｃで一部インキユベー
トした。ライゲートしたＤＮＡは、クロラムフエニコー
ルアセチルトランスフエラーセ遺伝子ヲ転写させ、従っ
てこれを発現させるように設置されたＡｄ２後期プロモ
ーターを含有するプラスミドである、目的のプラスミド
ｐＬＰｃａｔを構成していた。プラスミドｆ）ＬＰｃａ
ｔの制限部位および機能地図を添付の第１Ｂ図に示す。
ｃａｔＤＮＡ（約４μＱ）をＡｄ２の〜０．３２ｋｂＡ
ｃｃｌＰｖｕｌｌ（Ｂｃｌｌリンカ−が結合している）
制限フラグメント（約７μＱ）と混合し、１０ｘのりガ
ーゼ緩衝）夜（３μの、水（ｉ５μの、およびＴ４
ＤＮＡリガーゼ（２ｕＱ＋約１０００単位）を加えた後
、このライゲート反応液を１６°Ｃで一部インキユベー
トした。ライゲートしたＤＮＡは、クロラムフエニコー
ルアセチルトランスフエラーセ遺伝子ヲ転写させ、従っ
てこれを発現させるように設置されたＡｄ２後期プロモ
ーターを含有するプラスミドである、目的のプラスミド
ｐＬＰｃａｔを構成していた。プラスミドｆ）ＬＰｃａ
ｔの制限部位および機能地図を添付の第１Ｂ図に示す。
このライゲートしたＤＮＡを用い、実質的に実施例２Ｂ
の方法に従って大腸菌に１２ ＨＢＩＯ１ｖＩＩＩ胞を
形質転換した。形質転換細胞を５０μ９／ｙＱアンピシ
リン含有のし寒天プレートに蒔いた。
の方法に従って大腸菌に１２ ＨＢＩＯ１ｖＩＩＩ胞を
形質転換した。形質転換細胞を５０μ９／ｙＱアンピシ
リン含有のし寒天プレートに蒔いた。
プラスミドＤＮＡの制限酵素分析により大腸［］Ｋ１２
ＨＢ Ｉ Ｏ１／ｐＬ Ｐｃａｔ形質転換体を同定し
た。選択剤としてテトラサイクリンの代わりにアンピシ
リンを用いること以外は実質的に実施例１Ａ記載のプラ
スミド単離法に従って、後の構築で用いるためのプラス
ミドｐＬ ＰｃａＬ ＤＮ Ａを形質転換体から単離し
た。
ＨＢ Ｉ Ｏ１／ｐＬ Ｐｃａｔ形質転換体を同定し
た。選択剤としてテトラサイクリンの代わりにアンピシ
リンを用いること以外は実質的に実施例１Ａ記載のプラ
スミド単離法に従って、後の構築で用いるためのプラス
ミドｐＬ ＰｃａＬ ＤＮ Ａを形質転換体から単離し
た。
Ｄ、プラスミドｐＢＬｃａｔの構築
ＴＥｌａ街１１（５０μＱ）中のプラスミドｐＢＫｎｅ
ｏｌＤＮＡ（約８８μ９）を、ＩＯＸのＡｃｃｌｉ街液
（７５μＱ）、水（３０μの、および制限酵素Ａｃｃｌ
（ｉ５μＱ：約７５単位）に加え、得られた反応液を３
７°Ｃて２時間インキュベートした。このＡｃｃｌ消化
したプラスミドｐＢＫｎｅｏｌ ＤＮＡをアガロース
ゲルにかけ、ＢＫエンハンサ−を含む〜１ 、４ ｋｂ
のフラグメントを他の消化産物から分離した。次いで、
この〜１．４ｋｂＡｃｃｌ制限フラグメントをゲルから
単離し、精製した。このフラグメント（約５ ｕｇ’）
を、ｌＯｘのＰｖｕｌｌ緩衝液（５μｆｆ）、水（４５
μＱ）、および制限酵素Ｐｖｕｌｌ（５μ１２；約２５
単位）に再懸濁し、得られた反応液を３７°Ｃで２時間
インキュベートした。次いで、このＰｖｕｌｌ消化した
ＤＮＡを単離し、精製し、モしてライゲート用に調製し
た。約２μこの所望の〜１．２８ｋｂ Ａｃｃｌ −Ｐ
ｖｕｌｌフラグメントが得られ、これをＴＥ緩衝液（５
μｅ）に溶解した。
ｏｌＤＮＡ（約８８μ９）を、ＩＯＸのＡｃｃｌｉ街液
（７５μＱ）、水（３０μの、および制限酵素Ａｃｃｌ
（ｉ５μＱ：約７５単位）に加え、得られた反応液を３
７°Ｃて２時間インキュベートした。このＡｃｃｌ消化
したプラスミドｐＢＫｎｅｏｌ ＤＮＡをアガロース
ゲルにかけ、ＢＫエンハンサ−を含む〜１ 、４ ｋｂ
のフラグメントを他の消化産物から分離した。次いで、
この〜１．４ｋｂＡｃｃｌ制限フラグメントをゲルから
単離し、精製した。このフラグメント（約５ ｕｇ’）
を、ｌＯｘのＰｖｕｌｌ緩衝液（５μｆｆ）、水（４５
μＱ）、および制限酵素Ｐｖｕｌｌ（５μ１２；約２５
単位）に再懸濁し、得られた反応液を３７°Ｃで２時間
インキュベートした。次いで、このＰｖｕｌｌ消化した
ＤＮＡを単離し、精製し、モしてライゲート用に調製し
た。約２μこの所望の〜１．２８ｋｂ Ａｃｃｌ −Ｐ
ｖｕｌｌフラグメントが得られ、これをＴＥ緩衝液（５
μｅ）に溶解した。
プラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡ（約１μ９）をＩＯＸ
のＡｃｃ＋緩衝液（５μＱ）および水（４０μのに溶解
した。このプラスミドＰＬＰｃａｔ ＤＮＡの溶液に制
限酵素Ａｃｅ’（約５μＱ、〜２５単位）を加え、得ら
れた反応液を３７°Ｃでインキュベートした。このＡｃ
ｃ＋／肖化したプラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、１０ｘのＳｔｕ［Ｆ２街液（５ｕＱ
）、水（４０μの、および制限酵素５ｔｕＩ（５μ１２
；約２５単位）に再懸濁し、得られた反応液を３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。このＡｃｃｌＳ ｔｕ
Ｉ ｉ白化したプラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡをエタ
ノールで数回沈澱させ、大きさが約１６ｂｐの制限フラ
グメントである他の消化産物からＡｄ２後期プロモータ
ーおよび大腸菌の複製起源を含有する〜４．８１ｋｂの
Ａｃｃｌ−３ｔｕｌ制限フラグメントを精製した。目的
の〜４．８１ｋｂ制限フラグメントが約１μ？得られ、
これをＴＥ緩１ｉｉｉ＆（２０μＱ）にｌ８解した。
のＡｃｃ＋緩衝液（５μＱ）および水（４０μのに溶解
した。このプラスミドＰＬＰｃａｔ ＤＮＡの溶液に制
限酵素Ａｃｅ’（約５μＱ、〜２５単位）を加え、得ら
れた反応液を３７°Ｃでインキュベートした。このＡｃ
ｃ＋／肖化したプラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡをエタ
ノールで沈澱させ、１０ｘのＳｔｕ［Ｆ２街液（５ｕＱ
）、水（４０μの、および制限酵素５ｔｕＩ（５μ１２
；約２５単位）に再懸濁し、得られた反応液を３７°Ｃ
で２時間インキュベートした。このＡｃｃｌＳ ｔｕ
Ｉ ｉ白化したプラスミドｐＬＰｃａｔ ＤＮＡをエタ
ノールで数回沈澱させ、大きさが約１６ｂｐの制限フラ
グメントである他の消化産物からＡｄ２後期プロモータ
ーおよび大腸菌の複製起源を含有する〜４．８１ｋｂの
Ａｃｃｌ−３ｔｕｌ制限フラグメントを精製した。目的
の〜４．８１ｋｂ制限フラグメントが約１μ？得られ、
これをＴＥ緩１ｉｉｉ＆（２０μＱ）にｌ８解した。
プラスミドｐＬＰｃａｔの〜４．８１ ｋｂ Ａｃｃ
ｌ５Ｌｕ！制限フラグメント（５μのを、プラスミドｐ
ＢＫｎｅｏｌの〜１．２８ｋｂ Ａｃｃｌ −Ｐｖｕｌ
ｌ制限フラグメント（５μｍ２）に加えた。このＤＮＡ
混合物にｔＯＸのりガーゼ緩衝液（３μＱ）、水（ｉ５
μＱ）、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２μｌ！：約
１０単位）を加えた後、得られたライゲート反応液を１
６°Ｃで一部インキユベートした。ライゲートしたＤＮ
Ａは目的のプラスミドｐＢＬｃａｔを構成していた。プ
ラスミドｐＢＬｃａｔの制限部位および機能地図を添付
の第１Ｃ図に示す。
ｌ５Ｌｕ！制限フラグメント（５μのを、プラスミドｐ
ＢＫｎｅｏｌの〜１．２８ｋｂ Ａｃｃｌ −Ｐｖｕｌ
ｌ制限フラグメント（５μｍ２）に加えた。このＤＮＡ
混合物にｔＯＸのりガーゼ緩衝液（３μＱ）、水（ｉ５
μＱ）、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（２μｌ！：約
１０単位）を加えた後、得られたライゲート反応液を１
６°Ｃで一部インキユベートした。ライゲートしたＤＮ
Ａは目的のプラスミドｐＢＬｃａｔを構成していた。プ
ラスミドｐＢＬｃａｔの制限部位および機能地図を添付
の第１Ｃ図に示す。
ライゲートしたＤＮＡを用い、実質的に実施例２Ｂ記載
の方法に従って大腸菌に１２ ＨＢＩＯ１細胞を形質転
換した。大腸菌に１２ＨＢ１０１／ｐＢＬｃａｔ形質転
換体はそのプラスミドＤＮへの制限酵素分析によって同
定した。後の構築に用いるため、選択剤としてテトラサ
イクリンの代わりにアンピシリンを用いること以外は実
質的に実施例Ｉ Ａの方法に従って、プラスミドｐＢＬ
ｃａｔＤＮへを調製した。
の方法に従って大腸菌に１２ ＨＢＩＯ１細胞を形質転
換した。大腸菌に１２ＨＢ１０１／ｐＢＬｃａｔ形質転
換体はそのプラスミドＤＮへの制限酵素分析によって同
定した。後の構築に用いるため、選択剤としてテトラサ
イクリンの代わりにアンピシリンを用いること以外は実
質的に実施例Ｉ Ａの方法に従って、プラスミドｐＢＬ
ｃａｔＤＮへを調製した。
Ｅ、プラスミドｐＬ１３３の構築
プラスミドｐＬ １３３は、米国特許出願Ｎｏ、０６／
６９９、９６７（ｉ９８５年２月８日出願）に記載され
ているヒトプロティンＣ発現ベクターである。下記のよ
うに、プラスミドｐＬ１３３は、出発ベクタープラスミ
ドｐＳＶ２ｇｐｔおよびｐＨＣ７（プラスミドｐＨＣ７
の調製は前記実施例ＩＡに記載）を用いて中間体ベクタ
ープラスミドｐＳＶ２ ８ＰＣ８をｔ４築し、次いでこ
れをプラスミドｐＳ ｖ ２−β−グロビンと組合せて
構築することができる。プラスミドルミ−１３３構築の
プロトコールを以下で詳細に説明し、添付の第２図に図
示する。
６９９、９６７（ｉ９８５年２月８日出願）に記載され
ているヒトプロティンＣ発現ベクターである。下記のよ
うに、プラスミドｐＬ１３３は、出発ベクタープラスミ
ドｐＳＶ２ｇｐｔおよびｐＨＣ７（プラスミドｐＨＣ７
の調製は前記実施例ＩＡに記載）を用いて中間体ベクタ
ープラスミドｐＳＶ２ ８ＰＣ８をｔ４築し、次いでこ
れをプラスミドｐＳ ｖ ２−β−グロビンと組合せて
構築することができる。プラスミドルミ−１３３構築の
プロトコールを以下で詳細に説明し、添付の第２図に図
示する。
プラスミドｐＨＣ７ＤＮＡ（５０μＱ：〜５０μｇ）を
、制限酵素Ｂａｎ１ （５ｕ１２； 〜５０単位）、ｌ
ＯＸのＢａｎ１反応緩衝液［１，５Ｍ ＮａＣＱ： ６
０ｍＭ） １ ス−ＨＣＱ、 ｐＨ＝７．９ ； ６
０ＩＩＩＭ Ｍｇ（４ｔおよびｌ肩ｇ／耐ＢＳＡ］（ｉ
０μＱ）、および水（３５μＱ）と混合し、消化が完結
するまでインキニベートシた。次いで、このＢａｎ１消
化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを、〜１．２５ｋｂ
Ｂａｎ！制限フラグメントが他の消化産物から分離する
まで、３５％ポリアクリルアミドゲル（２９：Ｌアクリ
ルアミド：ビス−アクリルアミド）電気泳動にかけた。
、制限酵素Ｂａｎ１ （５ｕ１２； 〜５０単位）、ｌ
ＯＸのＢａｎ１反応緩衝液［１，５Ｍ ＮａＣＱ： ６
０ｍＭ） １ ス−ＨＣＱ、 ｐＨ＝７．９ ； ６
０ＩＩＩＭ Ｍｇ（４ｔおよびｌ肩ｇ／耐ＢＳＡ］（ｉ
０μＱ）、および水（３５μＱ）と混合し、消化が完結
するまでインキニベートシた。次いで、このＢａｎ１消
化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを、〜１．２５ｋｂ
Ｂａｎ！制限フラグメントが他の消化産物から分離する
まで、３５％ポリアクリルアミドゲル（２９：Ｌアクリ
ルアミド：ビス−アクリルアミド）電気泳動にかけた。
〜１．２５ｋｂのＢａｎ１制限フラグメントを含んでい
るゲルの領域をゲルから切り出し、試験管に入れ、小さ
くつぶした。このフラグメントの入った試験管に抽出緩
衝液［５００ｍＭ ＮＨ，ＯＡｃ、１０ｍＭ ＭｇＯＡ
ｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、およびｌ Ｏｍ９
／ｍＱ ｔＲＮＡ］（ｉｚＣ）を加え、この試験管を一
晩、３７°Ｃに保った。遠心して残骸をペレット化し、
上清を新しい試験管に移した。
るゲルの領域をゲルから切り出し、試験管に入れ、小さ
くつぶした。このフラグメントの入った試験管に抽出緩
衝液［５００ｍＭ ＮＨ，ＯＡｃ、１０ｍＭ ＭｇＯＡ
ｃ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、およびｌ Ｏｍ９
／ｍＱ ｔＲＮＡ］（ｉｚＣ）を加え、この試験管を一
晩、３７°Ｃに保った。遠心して残骸をペレット化し、
上清を新しい試験管に移した。
残骸を抽出緩衝液（２００μＱ）で１回洗浄し、洗浄上
ｔｎを一晩抽出物の最初の上清と合わせた。この上清を
ガラスクールのプラグに通した後、上清に２容量のエタ
ノールを加え、混合した。得られた溶液をドライアイス
−エタノール浴に〜１０分間入れ、次いで遠心すること
によりＤＮＡをペレット化した。
ｔｎを一晩抽出物の最初の上清と合わせた。この上清を
ガラスクールのプラグに通した後、上清に２容量のエタ
ノールを加え、混合した。得られた溶液をドライアイス
−エタノール浴に〜１０分間入れ、次いで遠心すること
によりＤＮＡをペレット化した。
この方法により約８μ９の〜１．２５ｋｂ Ｂａｎ１制
限フラグメントが得られた。精製したフラグメントをＴ
Ｅ緩衝液（ｉ０μＱ）に懸濁し、−２０°Ｃで保存した
。プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣＢを構築するためには、
リンカ−を加えることによりＢａｎ１制限フラグメント
を修飾しなければならなかった。
限フラグメントが得られた。精製したフラグメントをＴ
Ｅ緩衝液（ｉ０μＱ）に懸濁し、−２０°Ｃで保存した
。プラスミドｐＳＶ２−ＨＰＣＢを構築するためには、
リンカ−を加えることによりＢａｎ１制限フラグメント
を修飾しなければならなかった。
このリンカ−の構築に用いるＤＮＡフラグメントは、５
ｙｓｔｅｃ １４５０Ａ ＤＮＡ合成機（Ｓｙｓｔｅｃ
Ｉｎｃ、。
ｙｓｔｅｃ １４５０Ａ ＤＮＡ合成機（Ｓｙｓｔｅｃ
Ｉｎｃ、。
３８１６ Ｃｈａｎｄｌｅｒ Ｄｒｉｖｅ、 Ｖｉｎｎ
ｅａｐｏｌｉｓ、 ｌ１ｌＮ）、まｔこはＡＢＳ ３ｇ
０Ａ Ｄ ＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ。
ｅａｐｏｌｉｓ、 ｌ１ｌＮ）、まｔこはＡＢＳ ３ｇ
０Ａ Ｄ ＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ。
Ｉｎｃ、、 ８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ
Ｄｒｉｖｅ、 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ。
Ｄｒｉｖｅ、 Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ１ｔｙ。
ＣＡ ９４４０４）のどちらかを用いて合成した。当分
野では多数のＤＮＡ合成装置が知られており、フラグメ
ントの調製に用いることができる。さらに、実質的にイ
タクラ等（Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 １９７’ｌ
、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９８°１０５６）、および
フレア等（Ｃｒｅａ ｅｔ ａｌ。
野では多数のＤＮＡ合成装置が知られており、フラグメ
ントの調製に用いることができる。さらに、実質的にイ
タクラ等（Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ、 １９７’ｌ
、 ５ｃｉｅｎｃｅ、 １９８°１０５６）、および
フレア等（Ｃｒｅａ ｅｔ ａｌ。
１９７８、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 ７５：５７６５）の方法に従ってフラグメン
トを普通に調製することもできる。
ＵＳＡ、 ７５：５７６５）の方法に従ってフラグメン
トを普通に調製することもできる。
１本鎖のリンカ−それぞれ（５００ｐモル）を、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ｉ５単位；〜０５ ｕＱ＞、
ＩＯＸのリガーゼ緩衝液（２ｐＱ）、５００μＭのＡＴ
Ｐ（ｉ０μＱ）、および水（７，５μのを含む反応緩衝
液（２０μの中でキナーゼ処理した。このキナーゼ反応
液を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そして１０
０’Ｃ″ｃｌＯ分間インキュベートすることにより反応
を停止させた。キナーゼ処理（ｋｉｎａｔｉｏｎ）を確
実にするため、反応液を水上で冷却し、これに０．２Ｍ
′；チオトレイトール（２μの、５ｍＭ ＡＴＰ（２，
５μ（２）、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ｉ
５単位）を加えて混合し、３７°Ｃでさらに３０分間イ
ンキュベートした。１００℃でさらに１０分間インキュ
ベートすることによって反応を停止させ、次いで水上で
冷却した。
リヌクレオチドキナーゼ（ｉ５単位；〜０５ ｕＱ＞、
ＩＯＸのリガーゼ緩衝液（２ｐＱ）、５００μＭのＡＴ
Ｐ（ｉ０μＱ）、および水（７，５μのを含む反応緩衝
液（２０μの中でキナーゼ処理した。このキナーゼ反応
液を３７°Ｃで３０分間インキュベートし、そして１０
０’Ｃ″ｃｌＯ分間インキュベートすることにより反応
を停止させた。キナーゼ処理（ｋｉｎａｔｉｏｎ）を確
実にするため、反応液を水上で冷却し、これに０．２Ｍ
′；チオトレイトール（２μの、５ｍＭ ＡＴＰ（２，
５μ（２）、およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ｉ
５単位）を加えて混合し、３７°Ｃでさらに３０分間イ
ンキュベートした。１００℃でさらに１０分間インキュ
ベートすることによって反応を停止させ、次いで水上で
冷却した。
キナーゼ処理は別々に行ったが、キナーゼ反応後に２本
の１本鎖ＤＮＡリンカ−をいっしょにしてｔ見合した。
の１本鎖ＤＮＡリンカ−をいっしょにしてｔ見合した。
鎖をアニーリングするため、キナーゼ反応混合物を、水
（〜１５ｃ）ｆｆρ）を入れた水浴中、１００℃で１０
分間インキュベートした。このインキュベートの後、水
浴の加熱をやめ、室温まで冷却させた。この操作に約３
時間を要した。次いで、キナーゼ処理したＤＮＡの試験
管が入ったままの水浴を４°Ｃで一晩インキユベートし
た。この操作により１本鎖がアニーリングした。作成し
たリンカ−は次の構造を有していた ５ −ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧ−３゜３−人＾ＣＴＡ
ＧＴＣＣＡＣＧ−５ このリンカ−を使用時まで一２０’Ｃで保存した。
（〜１５ｃ）ｆｆρ）を入れた水浴中、１００℃で１０
分間インキュベートした。このインキュベートの後、水
浴の加熱をやめ、室温まで冷却させた。この操作に約３
時間を要した。次いで、キナーゼ処理したＤＮＡの試験
管が入ったままの水浴を４°Ｃで一晩インキユベートし
た。この操作により１本鎖がアニーリングした。作成し
たリンカ−は次の構造を有していた ５ −ＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＧ−３゜３−人＾ＣＴＡ
ＧＴＣＣＡＣＧ−５ このリンカ−を使用時まで一２０’Ｃで保存した。
このリンカ−（〜５０μＱ：〜５００ｐモル）、Ｔ４Ｄ
ＮＡｌ、ｌガーゼ（ｉμＲ； 〜５単位）、ＩＯＸのり
ガーゼ緩衝液（ｉ０μＱ）、および水（２９μのに、〜
１．２５ｋｂ Ｂａｎ＋フラグメント（〜８μｇ）を加
えて混合し、得られたライゲート反応液を４°Ｃで一晩
インキユベートした。６５°Ｃで１０分間インキュベー
トすることによってこのライゲート反応を停止させた。
ＮＡｌ、ｌガーゼ（ｉμＲ； 〜５単位）、ＩＯＸのり
ガーゼ緩衝液（ｉ０μＱ）、および水（２９μのに、〜
１．２５ｋｂ Ｂａｎ＋フラグメント（〜８μｇ）を加
えて混合し、得られたライゲート反応液を４°Ｃで一晩
インキユベートした。６５°Ｃで１０分間インキュベー
トすることによってこのライゲート反応を停止させた。
最終濃度０．３ＭになるまでＮａ０Ａｃを加え、２容１
のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴で冷
却し、次いでこの溶液を遠心することによってＤＮＡを
ベレット化した。
のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴で冷
却し、次いでこの溶液を遠心することによってＤＮＡを
ベレット化した。
このＤＮＡベレットをＩＯＸのＡ ｐ ａ Ｉ 反応Ｆ
ｔ ｔｌ液［６０ｍＭ ＮａＣＱ； ６０ｍＭ トリス
−ＨＣＬｐＨ−７，４，： ６０ｍＭ ＭｇＣ＋！ｔ；
および６０ｍＭ ２メルカブトエタ／−ル］（ｉ０μ（
２）、制限酵素Ａｐａ１（５μＱ、〜５０単位）、水（
８５μＱ）に溶解し、反応液を２時間、３７°Ｃに保っ
た。次いで、上記のようにして反応を停止させ、ＤＮＡ
をペレ・７ト化した。このＤＮＡペレ、トを１０ＸのＨ
ｉｎｄｌｌ１反応緩衝液（ｌｏμ１２）、制限酵素Ｈ１
ｎｄｌｌｌ（５μＱ ：〜５０単位）、水（８５ｕＣ）
に溶解し、反応液を２時間、３７°Ｃに保った。このＨ
ｉｎｄｌｌｌｉ肖化の後、反応（見合物を３５％ポリア
クリルアミドゲルにかけ、所望の〜１．２３ｋｂ Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ−Ａｐａｌルミｌ制限フラグメントから単離
し、精製した。約５μ９の目的フラグメントが得られ、
これをＴＥ緩衝液（ｉ０μのに懸濁し、−２０℃で保存
した。
ｔ ｔｌ液［６０ｍＭ ＮａＣＱ； ６０ｍＭ トリス
−ＨＣＬｐＨ−７，４，： ６０ｍＭ ＭｇＣ＋！ｔ；
および６０ｍＭ ２メルカブトエタ／−ル］（ｉ０μ（
２）、制限酵素Ａｐａ１（５μＱ、〜５０単位）、水（
８５μＱ）に溶解し、反応液を２時間、３７°Ｃに保っ
た。次いで、上記のようにして反応を停止させ、ＤＮＡ
をペレ・７ト化した。このＤＮＡペレ、トを１０ＸのＨ
ｉｎｄｌｌ１反応緩衝液（ｌｏμ１２）、制限酵素Ｈ１
ｎｄｌｌｌ（５μＱ ：〜５０単位）、水（８５ｕＣ）
に溶解し、反応液を２時間、３７°Ｃに保った。このＨ
ｉｎｄｌｌｌｉ肖化の後、反応（見合物を３５％ポリア
クリルアミドゲルにかけ、所望の〜１．２３ｋｂ Ｈｉ
ｎｄｌｌｌ−Ａｐａｌルミｌ制限フラグメントから単離
し、精製した。約５μ９の目的フラグメントが得られ、
これをＴＥ緩衝液（ｉ０μのに懸濁し、−２０℃で保存
した。
プラスミドｐＨＣ７Ｄ Ｎ Ａ（５０μＱ−〜５０μｇ
）を、制限酵素Ｐｓｔ ｌ （５ｕｆ２ ； 〜５０単
位）、ｌＯＸのＰｓｔ１反応緩衝液［１，０Ｍ ＮａＣ
ｌ２： １００ｍＭトリス−Ｈ（４ＳｐＨ＝７．５ ；
ｌｏｏｍＭ ＭｇＣｅ。
）を、制限酵素Ｐｓｔ ｌ （５ｕｆ２ ； 〜５０単
位）、ｌＯＸのＰｓｔ１反応緩衝液［１，０Ｍ ＮａＣ
ｌ２： １００ｍＭトリス−Ｈ（４ＳｐＨ＝７．５ ；
ｌｏｏｍＭ ＭｇＣｅ。
：および１ ｍｇ／ｘ（ｌ Ｂ Ｓ Ａコ（ｉ０μの、
および水（３５μＱ）と混合し、３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。次いで、実質的に上記方法に従い、Ｐ
ｓｔｌ消化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを３５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、目的の〜０．８８
ｋｂフラグメントを精製した。約５μ９の目的フラグメ
ントが得られ、これをＴＥ緩衝液（ｉ０μＱ）に懸濁し
、−２０°Ｃで保存した。
および水（３５μＱ）と混合し、３７°Ｃで２時間イン
キュベートした。次いで、実質的に上記方法に従い、Ｐ
ｓｔｌ消化したプラスミドｐＨＣ７ＤＮＡを３５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にかけ、目的の〜０．８８
ｋｂフラグメントを精製した。約５μ９の目的フラグメ
ントが得られ、これをＴＥ緩衝液（ｉ０μＱ）に懸濁し
、−２０°Ｃで保存した。
この〜０．８８ｋｂ Ｐｓｔｌフラグメント（〜５μ９
）を、自動ＤＮＡ合成機で作成した以下のリンカ−（〜
５０μのに加え、混合した： ５’ −ＧＴＧＡＴＣＡ＾−３′ ３’ −ＡＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧ−５このＤ
ＮＡ混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（約１μＱ：〜ｌ
Ｏ単位）、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（ｉ０μＱ）、および
水（２９μＱ）を加え、得られたライゲート反応液を４
°Ｃで一晩インキユベートした。
）を、自動ＤＮＡ合成機で作成した以下のリンカ−（〜
５０μのに加え、混合した： ５’ −ＧＴＧＡＴＣＡ＾−３′ ３’ −ＡＣＧＴＣＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧ−５このＤ
ＮＡ混合物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（約１μＱ：〜ｌ
Ｏ単位）、ＩＯＸリガーゼ緩衝液（ｉ０μＱ）、および
水（２９μＱ）を加え、得られたライゲート反応液を４
°Ｃで一晩インキユベートした。
このライゲート反応を６５°Ｃｔ’ｌＯ分間インキュベ
ートすることにより停止させた。ライゲートしたＤＮＡ
を沈澱させた後、このＤＮＡベレットを、１０ＸのＡｐ
ａ１反応緩衝液（ｉ０μρ）、制限酵素Ａｐａ［（５μ
Ｑ； 〜５０単位）、および水（８５μのに溶解し、反
応液を２時間、３７°Ｃに（呆った。次いで、反応を止
め、もう−ｆＪｊＤＮＡをベレット化した。このＤＮＡ
ベレットを、ＩＯＸのＢｇｌｌ１反応緩衝液［ＩＭ Ｎ
ａＣ（！； ｌｏｏｍＭ）リス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，４
： １００ｍＭ ＭｇＣＯ２： １００ｍＭ ２メルカ
プトエタノール；およびｉｎ／ｘＣＢＳＡ］（ｉ０μＱ
）、制限酵素Ｂｇｌｌ＋ （５μＱ：〜５０単位）、お
よび水（８５μのに溶解し、反応液を２時間、３７°Ｃ
に保った。このＢｇｌｌｌ消化の後、実質的に上記方法
に従い、反応混合物を３．５％ポリアクリルアミドゲル
にかけ、目的の〜Ｏ，１９ｋｂＡｐａｌ−Ｂｇｌｌｌ制
限フラグメントを単離した。約１μ７の目的フラグメン
トが得られ、これをＴＥ緩衝液（ｉ０μＱ）に懸濁し、
−２０°Ｃで保存した。
ートすることにより停止させた。ライゲートしたＤＮＡ
を沈澱させた後、このＤＮＡベレットを、１０ＸのＡｐ
ａ１反応緩衝液（ｉ０μρ）、制限酵素Ａｐａ［（５μ
Ｑ； 〜５０単位）、および水（８５μのに溶解し、反
応液を２時間、３７°Ｃに（呆った。次いで、反応を止
め、もう−ｆＪｊＤＮＡをベレット化した。このＤＮＡ
ベレットを、ＩＯＸのＢｇｌｌ１反応緩衝液［ＩＭ Ｎ
ａＣ（！； ｌｏｏｍＭ）リス−ＨＣＱ、ｐＨ−７，４
： １００ｍＭ ＭｇＣＯ２： １００ｍＭ ２メルカ
プトエタノール；およびｉｎ／ｘＣＢＳＡ］（ｉ０μＱ
）、制限酵素Ｂｇｌｌ＋ （５μＱ：〜５０単位）、お
よび水（８５μのに溶解し、反応液を２時間、３７°Ｃ
に保った。このＢｇｌｌｌ消化の後、実質的に上記方法
に従い、反応混合物を３．５％ポリアクリルアミドゲル
にかけ、目的の〜Ｏ，１９ｋｂＡｐａｌ−Ｂｇｌｌｌ制
限フラグメントを単離した。約１μ７の目的フラグメン
トが得られ、これをＴＥ緩衝液（ｉ０μＱ）に懸濁し、
−２０°Ｃで保存した。
約１０μ９のプラスミドｐＳ Ｖ ２ｇｐｔ ＤＮＡ（
ΔＴＣＣ３７１４５）を、ＩＯＸのＨｉｎｄｌｌ１反応
緩衝液（ｉ０μＱ）、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ（５ｊｊ
（！ ：〜５０単位）、および水（８５μσ）に溶解し
、この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次に、この
反応混合物を０．２５ＭのＮａ０Ａｃとし、モして２容
世のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴で
インキュベートした後、遠心してＤＮＡをペレット化し
た。このＤＮＡペレットをＩＯＸの８ｇｌ１１緩衝液（
ｉ０ｕ（り、制限酵素Ｂｇｌｌｌ（５μＣ； 〜５０単
位）、および水（８５μＱ）に溶解し、この反応ｉ＆を
２時間、３７°Ｃに保った。このＢｇｌｌ＋消化の後、
この反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、電気泳動
でフラグメントを分離した。このゲルを臭化エチジウム
で染色し、紫外光のもとで観察し、目的の〜５． ｌｋ
ｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ−８ｇｌｌｌフラグメントを含んで
いるバンドをゲルから切り出し、透析管に入れ、ＤＮＡ
がアガロースから出てしまうまで電気泳動を続けた。こ
の透析管からのＤＮＡ含有緩衝液をフェノールおよびク
ロロホルムで抽出し、次いでＤＮＡを沈澱させた。この
ペレットはプラスミドｐｓＶ２ｇｐｔの所望の〜５ 、
１ ｋｂ ＨｉｎｄｌｌｌＢｇｌ１１制限フラグメント
（〜５μ９）からなり、これをＴＥ緩衝液（ＩＱμのに
再懸濁した。
ΔＴＣＣ３７１４５）を、ＩＯＸのＨｉｎｄｌｌ１反応
緩衝液（ｉ０μＱ）、制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌｌ（５ｊｊ
（！ ：〜５０単位）、および水（８５μσ）に溶解し
、この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次に、この
反応混合物を０．２５ＭのＮａ０Ａｃとし、モして２容
世のエタノールを加え、ドライアイス−エタノール浴で
インキュベートした後、遠心してＤＮＡをペレット化し
た。このＤＮＡペレットをＩＯＸの８ｇｌ１１緩衝液（
ｉ０ｕ（り、制限酵素Ｂｇｌｌｌ（５μＣ； 〜５０単
位）、および水（８５μＱ）に溶解し、この反応ｉ＆を
２時間、３７°Ｃに保った。このＢｇｌｌ＋消化の後、
この反応混合物を１％アガロースゲルにかけ、電気泳動
でフラグメントを分離した。このゲルを臭化エチジウム
で染色し、紫外光のもとで観察し、目的の〜５． ｌｋ
ｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ−８ｇｌｌｌフラグメントを含んで
いるバンドをゲルから切り出し、透析管に入れ、ＤＮＡ
がアガロースから出てしまうまで電気泳動を続けた。こ
の透析管からのＤＮＡ含有緩衝液をフェノールおよびク
ロロホルムで抽出し、次いでＤＮＡを沈澱させた。この
ペレットはプラスミドｐｓＶ２ｇｐｔの所望の〜５ 、
１ ｋｂ ＨｉｎｄｌｌｌＢｇｌ１１制限フラグメント
（〜５μ９）からなり、これをＴＥ緩衝液（ＩＱμのに
再懸濁した。
〜１．２３ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ａｐａ＋制限フラグ
メン）（２μＣ）、〜０．１９ｋｂΔｐａｌ−Ｂｇｌｌ
ｌフラグメント（３μの、および〜５ 、 ｌ ｋｂ
Ｈ１ｎｄｌｌｌ −Ｂ ｇｉｌｌフラグメント（２μの
を混合し、次いで、ｌｏｘのりガーゼ緩衝液（ｉ０μの
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ｉμａ：〜５００単位）、
および水（８２ｕｆ２）とともに１６°Ｃで一部インキ
ユベートした。このライゲートしたＤＮＡは目的のプラ
スミドｐＳ ｖ ２８ＰＣ８を構成していた。このプラ
スミドの制限部位および機能地図を添付の第２図に示す
。
メン）（２μＣ）、〜０．１９ｋｂΔｐａｌ−Ｂｇｌｌ
ｌフラグメント（３μの、および〜５ 、 ｌ ｋｂ
Ｈ１ｎｄｌｌｌ −Ｂ ｇｉｌｌフラグメント（２μの
を混合し、次いで、ｌｏｘのりガーゼ緩衝液（ｉ０μの
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ｉμａ：〜５００単位）、
および水（８２ｕｆ２）とともに１６°Ｃで一部インキ
ユベートした。このライゲートしたＤＮＡは目的のプラ
スミドｐＳ ｖ ２８ＰＣ８を構成していた。このプラ
スミドの制限部位および機能地図を添付の第２図に示す
。
実質的に、実施例２Ｂで大腸菌Ｋ１２ ＨＢＩｏｌにつ
いて記載した方法に従い、大腸菌Ｋ１２ＲＲＩ（ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５２１０）細胞を形質転換に対してコンピテ
ントにした。上記調製のライゲートしたＤＮＡを用いて
この細胞を形質転換し、形質転換混合物の一部を１００
μ９／酎アンピシリン含有のし寒天プレートに蒔いた。
いて記載した方法に従い、大腸菌Ｋ１２ＲＲＩ（ＮＲＲ
Ｌ Ｂ−１５２１０）細胞を形質転換に対してコンピテ
ントにした。上記調製のライゲートしたＤＮＡを用いて
この細胞を形質転換し、形質転換混合物の一部を１００
μ９／酎アンピシリン含有のし寒天プレートに蒔いた。
次いで、このプレートを３７℃でインキュベートした。
大腸菌に１２ ＲＲＩ／ｐＳＶ２−ＨＰＣ８形質転１１
１１そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認
した。細胞培養中の選択剤としてテトラサイクリンでは
なくアンピシリンを用いることを除き、実質的に実施例
ＩＡの方法に従って形質転換体からプラスミドｐｓＶ２
−ＨＰＣ８ＤＮＡを調製した。
１１そのプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認
した。細胞培養中の選択剤としてテトラサイクリンでは
なくアンピシリンを用いることを除き、実質的に実施例
ＩＡの方法に従って形質転換体からプラスミドｐｓＶ２
−ＨＰＣ８ＤＮＡを調製した。
プラスミドＰＳＶ２−ＨＰＣ８（５０μ９）を、１０Ｘ
のＨｉｎｄｌｌ１反応緩衝液（ｉ０ｕＱ）、制限酵素Ｈ
１ｎｄｌｌｌ（５ｕＱ ； 〜５０単位）、および水（
８５μＱ）に溶解し、この反応液を３７℃で２時間イン
キュベートした。このＨｉｎｄｌｌ！消化の後、ＤＮＡ
を沈澱させ、ＤＮＡペレットをｌＯＸのＳａｉｌ反応緩
衝液［１，５Ｍ ＮａＣＱ： ６０ｍＭ トリス−Ｈ
ＣＱ、ｐＨ＝７．９ ； ６０ｍＭ ＭｇＣＬ； ６０
ｍＭ ２−メルカプトエタノール；およびｌ Ｉ！ｇ
／ｘＱ Ｂ Ｓ Ａ］（ｉ０ｕＱ’）、制限酵素５ａｌ
ｌ（５ｕ１２；〜５０単位）、および水（８５μＱ）に
溶解した。得られたＳａｉｌ反応混合物を３７°Ｃで２
時間インキュベートした。
のＨｉｎｄｌｌ１反応緩衝液（ｉ０ｕＱ）、制限酵素Ｈ
１ｎｄｌｌｌ（５ｕＱ ； 〜５０単位）、および水（
８５μＱ）に溶解し、この反応液を３７℃で２時間イン
キュベートした。このＨｉｎｄｌｌ！消化の後、ＤＮＡ
を沈澱させ、ＤＮＡペレットをｌＯＸのＳａｉｌ反応緩
衝液［１，５Ｍ ＮａＣＱ： ６０ｍＭ トリス−Ｈ
ＣＱ、ｐＨ＝７．９ ； ６０ｍＭ ＭｇＣＬ； ６０
ｍＭ ２−メルカプトエタノール；およびｌ Ｉ！ｇ
／ｘＱ Ｂ Ｓ Ａ］（ｉ０ｕＱ’）、制限酵素５ａｌ
ｌ（５ｕ１２；〜５０単位）、および水（８５μＱ）に
溶解した。得られたＳａｉｌ反応混合物を３７°Ｃで２
時間インキュベートした。
このＨｉｎｄｌｌｌ−３ａｌｌ消化したプラスミドｐＳ
Ｖ２−ＨＰＣ８を３．５％ポリアクリルアミドゲルにか
け、所望の〜０ 、２９ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌ −Ｓ
ａｔ Ｉ制限フラグメントが他の反応生成物から分離
するまで電気泳動を行った。目的のフラグメントをゲル
から単離した。約２μ９の７ラグメントが得られ、これ
をＴＥ緩衝液（ｉ０μのに懸濁した。
Ｖ２−ＨＰＣ８を３．５％ポリアクリルアミドゲルにか
け、所望の〜０ 、２９ ｋｂ Ｈ１ｎｄｌｌｌ −Ｓ
ａｔ Ｉ制限フラグメントが他の反応生成物から分離
するまで電気泳動を行った。目的のフラグメントをゲル
から単離した。約２μ９の７ラグメントが得られ、これ
をＴＥ緩衝液（ｉ０μのに懸濁した。
プ５スミ）’ｐＳＶ２−ＨＰＣ８（５０μ？）を１０Ｘ
のＢｇ１１１反応緩衝液（ｉ０μＱ）、制限酵素Ｂｇｌ
ｌｌ（５μｅ；５０単位）、および水（８５μのに溶解
し、この反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした
。
のＢｇ１１１反応緩衝液（ｉ０μＱ）、制限酵素Ｂｇｌ
ｌｌ（５μｅ；５０単位）、および水（８５μのに溶解
し、この反応液を３７°Ｃで２時間インキュベートした
。
このＢ ｇｅｔ Ｉ消化の後、ＤＮＡを沈澱させ、ＤＮ
ＡペレットをＩＯＸのＳａｉｌ反応緩衝液（ｉ０ｕＱ）
、制限酵素Ｓａｉ＋（５μＣ；〜５０単位）、および水
（８５μのに溶解した。得られたＳａｉｌ反応混合物を
３７℃で２時間インキュベートした。このＳａｉｌ−Ｂ
ｇｌｌｌ消化したプラスミド１）ＳＶ２−ＨＰＣ８を３
．５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、所望の〜１．１
５ｋｂ Ｓａｉｌ−８ｇｌｌｌ制限フラグメントが他の
反応生成物から分離するまで電気泳動を行った。〜１．
１５ｋｂのＳ ａｌ Ｉ −Ｂｇｌｌｌ制限フラグメン
トをゲルから単離した。約８μ９のフラグメントを得、
これをＴＥ緩衝液（ｉ０μｅ）に懸濁した。
ＡペレットをＩＯＸのＳａｉｌ反応緩衝液（ｉ０ｕＱ）
、制限酵素Ｓａｉ＋（５μＣ；〜５０単位）、および水
（８５μのに溶解した。得られたＳａｉｌ反応混合物を
３７℃で２時間インキュベートした。このＳａｉｌ−Ｂ
ｇｌｌｌ消化したプラスミド１）ＳＶ２−ＨＰＣ８を３
．５％ポリアクリルアミドゲルにかけ、所望の〜１．１
５ｋｂ Ｓａｉｌ−８ｇｌｌｌ制限フラグメントが他の
反応生成物から分離するまで電気泳動を行った。〜１．
１５ｋｂのＳ ａｌ Ｉ −Ｂｇｌｌｌ制限フラグメン
トをゲルから単離した。約８μ９のフラグメントを得、
これをＴＥ緩衝液（ｉ０μｅ）に懸濁した。
約１０μ９のプラスミドｐＳ ｖ ２−β−グロビンＤ
ＮＡ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２８）を、ＩＯＸのＨｉ
ｎｄ１１１反応緩衝液（ｌｏμｃ）、制限酵素Ｈ４ｎｄ
ｌｌ！（５μＱ；〜５０単位）、および水（８５μＱ）
に溶解し、この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次
に、この反応混合物を０．２５ＭのＮａ０Ａｃとし、そ
して２容１のエタノールを加え、ドライアイス−エタノ
ール浴でインキュベートした後、遠心してＤＮＡをベレ
ット化した。このＨｉｎｄｌｌ＋消化したプラスミドｐ
Ｓｖ２−β−グロヒンを１０Ｘｌ１７１０Ｘ１１７）Ｂ
ｈ ｒ夜（ｉ０μ１２）、制限酵素Ｂｇｌｌｌ（５μ
Ｃ； 〜５０単位）、および水（８５μＱ）に溶解し、
この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。このＢｇｌｌ
Ｉ消化の後、この反応混合物を１％アガロースゲルにか
け、電気泳動でフラグメントを分離した。目的の〜４２
ｋｂ Ｈｉｎｄ＋Ｉｌ −Ｂ ｇ目１制限フラグメン
トをゲルから単離した。約５μ９の目的フラグメントが
得られ、これをＴＥ緩衝液（ｉ０ｕｅ）に再懸濁した。
ＮＡ（ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２８）を、ＩＯＸのＨｉ
ｎｄ１１１反応緩衝液（ｌｏμｃ）、制限酵素Ｈ４ｎｄ
ｌｌ！（５μＱ；〜５０単位）、および水（８５μＱ）
に溶解し、この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。次
に、この反応混合物を０．２５ＭのＮａ０Ａｃとし、そ
して２容１のエタノールを加え、ドライアイス−エタノ
ール浴でインキュベートした後、遠心してＤＮＡをベレ
ット化した。このＨｉｎｄｌｌ＋消化したプラスミドｐ
Ｓｖ２−β−グロヒンを１０Ｘｌ１７１０Ｘ１１７）Ｂ
ｈ ｒ夜（ｉ０μ１２）、制限酵素Ｂｇｌｌｌ（５μ
Ｃ； 〜５０単位）、および水（８５μＱ）に溶解し、
この反応液を２時間、３７°Ｃに保った。このＢｇｌｌ
Ｉ消化の後、この反応混合物を１％アガロースゲルにか
け、電気泳動でフラグメントを分離した。目的の〜４２
ｋｂ Ｈｉｎｄ＋Ｉｌ −Ｂ ｇ目１制限フラグメン
トをゲルから単離した。約５μ９の目的フラグメントが
得られ、これをＴＥ緩衝液（ｉ０ｕｅ）に再懸濁した。
プラスミドｐｓＶ２−ＨＰＣ３の〜０．２９ｋｂＨ１ｎ
ｄｌｌｌ −Ｓ ａｔ １フラグメント（２μの、プラ
スミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の〜１．１５ｋｂ Ｓａｉｌ
Ｂｇｌｌｌフラグメント（２μａ）、およびプラスミド
ｐＳＶ２−β−グロビンの〜４．２ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌ
ｌＢｇｌｌｌフラグメント（２ｕＱ）を混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼでライゲートした。ライゲートしたＤ
ＮＡは目的のプラスミドｐｔ、 １３３を構成していた
。プラスミドｐＬ１３３の制限部位およびｉ能地図を添
付の第２図に示す。このライゲートしたＤＮＡを用いて
大腸菌ＫＩ２ ＲＲＩを形質転換し、目的の大腸菌に
１２ ＲＲＩ／ｐＬ１３３形質転換体を、そのアンピ
シリン耐性の表現型によって、およびそのプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析によって同定した。
ｄｌｌｌ −Ｓ ａｔ １フラグメント（２μの、プラ
スミドｐＳＶ２−ＨＰＣ８の〜１．１５ｋｂ Ｓａｉｌ
Ｂｇｌｌｌフラグメント（２μａ）、およびプラスミド
ｐＳＶ２−β−グロビンの〜４．２ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌ
ｌＢｇｌｌｌフラグメント（２ｕＱ）を混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼでライゲートした。ライゲートしたＤ
ＮＡは目的のプラスミドｐｔ、 １３３を構成していた
。プラスミドｐＬ１３３の制限部位およびｉ能地図を添
付の第２図に示す。このライゲートしたＤＮＡを用いて
大腸菌ＫＩ２ ＲＲＩを形質転換し、目的の大腸菌に
１２ ＲＲＩ／ｐＬ１３３形質転換体を、そのアンピ
シリン耐性の表現型によって、およびそのプラスミドＤ
ＮＡの制限酵素分析によって同定した。
約２０μ９のプラスミドｐＢＬｃａＬ ＤＮＡを、１０
ＸのＨ４ｎｄｌｌｌ緩衝液（ｉ０ｕＱ）および水（８０
μＱ）に溶解した。制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（約１０ｕ
（ｉ：〜１００単位）をこのプラスミドｐＢＬｃａｔ
ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時
間インキュベートした。このＨｉｎｄｌ１１肖化したプ
ラスミドｐＢＬｃａｔ ＤＮＡをアガロースゲルにかけ
、ＢＫエンハンサ−とＡｄ２後期プロモーターを含有す
る〜０．８７ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメノトが
池の消化産物から分離するまで電気泳動を行った。
ＸのＨ４ｎｄｌｌｌ緩衝液（ｉ０ｕＱ）および水（８０
μＱ）に溶解した。制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（約１０ｕ
（ｉ：〜１００単位）をこのプラスミドｐＢＬｃａｔ
ＤＮＡの溶液に加え、得られた反応液を３７°Ｃで２時
間インキュベートした。このＨｉｎｄｌ１１肖化したプ
ラスミドｐＢＬｃａｔ ＤＮＡをアガロースゲルにかけ
、ＢＫエンハンサ−とＡｄ２後期プロモーターを含有す
る〜０．８７ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメノトが
池の消化産物から分離するまで電気泳動を行った。
次いで、〜０．８７ｋｂフラグメントを単離し、精製し
、ライゲート用に準備した。約２μ９の目的フラグメン
トが得られ、これをＴＥ緩衝液（５μＱ）に溶解した。
、ライゲート用に準備した。約２μ９の目的フラグメン
トが得られ、これをＴＥ緩衝液（５μＱ）に溶解した。
約１５μ９のプラスミドｐＬ１３３ ＤＮＡを、１０
ＸのＨｉｎｄｌｌｌ援衝液（２μｆｆ）および水（ｉ６
μのに溶解した。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｈ４ｎｄｌ
ｌｌ（約ｌμｇ−〜１０単位）を加え、得られた反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。次に、ＤＮＡを
ＴＥ緩衝液で１００μＱに希釈し、〜０．０６単位のウ
シ腸アルカリホスファターゼで処理し、この反応液を３
７°Ｃで３０分間インキュベートした。この溶液を、Ｉ
ＸのＳＥＴ［５ｍＭ トリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．８
； ５ｍＭ ＥＤＴＡ ；および１５０ｍＭ ＮａＣ
Ｃ］、０．３Ｍ Ｎａ０Ａｃ、および０５％ＳＤＳを含
むように調節し、次いで６５℃で４５分間インキュベー
トした。次に、Ｈｉｎｄｌｌｌ？Ｉ’１化したプラスミ
ドｐＬ１３３ ＤＮＡをフェノールで２回、そしてク
ロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈澱させ、ＴＥ
緩衝液（ｉ０μＱ）に再懸濁した。
ＸのＨｉｎｄｌｌｌ援衝液（２μｆｆ）および水（ｉ６
μのに溶解した。このＤＮＡ溶液に制限酵素Ｈ４ｎｄｌ
ｌｌ（約ｌμｇ−〜１０単位）を加え、得られた反応液
を３７℃で２時間インキュベートした。次に、ＤＮＡを
ＴＥ緩衝液で１００μＱに希釈し、〜０．０６単位のウ
シ腸アルカリホスファターゼで処理し、この反応液を３
７°Ｃで３０分間インキュベートした。この溶液を、Ｉ
ＸのＳＥＴ［５ｍＭ トリス−ＨＣＱ、ｐＨ＝７．８
； ５ｍＭ ＥＤＴＡ ；および１５０ｍＭ ＮａＣ
Ｃ］、０．３Ｍ Ｎａ０Ａｃ、および０５％ＳＤＳを含
むように調節し、次いで６５℃で４５分間インキュベー
トした。次に、Ｈｉｎｄｌｌｌ？Ｉ’１化したプラスミ
ドｐＬ１３３ ＤＮＡをフェノールで２回、そしてク
ロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈澱させ、ＴＥ
緩衝液（ｉ０μＱ）に再懸濁した。
プラスミドｐＢＬｃａｔの〜０ 、８７ ｋｂ Ｈ１ｎ
ｄｌｌｌ制限フラグメント（約５μＱ）をＨｉｎｄｌｌ
ｌ消化したプラスミドｐＬ１３３（ｉ，５μ９；ｌＯμ
Ｑ）に加え、次いで、このＤＮＡ溶液にＩＯＸのリガー
ゼ緩衝液（２ａ（ｉ＞、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（ｌμｆ
ｆ； 〜１０単位）、および水（２μＱ）を加え、得ら
れた反応液を１６°Ｃで一部インキニベートした。ライ
ゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐｔ、ｐｃを構成
していた。
ｄｌｌｌ制限フラグメント（約５μＱ）をＨｉｎｄｌｌ
ｌ消化したプラスミドｐＬ１３３（ｉ，５μ９；ｌＯμ
Ｑ）に加え、次いで、このＤＮＡ溶液にＩＯＸのリガー
ゼ緩衝液（２ａ（ｉ＞、Ｔ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ（ｌμｆ
ｆ； 〜１０単位）、および水（２μＱ）を加え、得ら
れた反応液を１６°Ｃで一部インキニベートした。ライ
ゲートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐｔ、ｐｃを構成
していた。
実質的に実施例２Ｂの方法に従い、ライゲートしたＤＮ
Ａを用いて大腸菌に１２ ＨＢＩＯＩを形質転換した。
Ａを用いて大腸菌に１２ ＨＢＩＯＩを形質転換した。
形質転換細胞をアンピシリン含有のし寒天プレートに蒔
き、アンピシリン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを
制限酵素分析によって試験して大腸菌Ｋ １２ ＨＢ
１０１／ｐＬＰＣ形質転換体を同定した。ＢＫエンハン
サ−とＡｄ２後期プロモーターをコードしている〜０．
８７ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントは、Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ消化したプラスミドｐＬ １３３に２つの配向の
うちのいずれかで挿入することができるが、そのうちの
１つだけがプラスミドｐＬＰＣを生成した。プラスミド
ｐＬＰＣの制限部位および機能地図を添付の第１Ｄ図に
示す。
き、アンピシリン耐性形質転換体のプラスミドＤＮＡを
制限酵素分析によって試験して大腸菌Ｋ １２ ＨＢ
１０１／ｐＬＰＣ形質転換体を同定した。ＢＫエンハン
サ−とＡｄ２後期プロモーターをコードしている〜０．
８７ｋｂＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントは、Ｈｉｎｄ
ｌｌｌ消化したプラスミドｐＬ １３３に２つの配向の
うちのいずれかで挿入することができるが、そのうちの
１つだけがプラスミドｐＬＰＣを生成した。プラスミド
ｐＬＰＣの制限部位および機能地図を添付の第１Ｄ図に
示す。
実施例３プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳの構築実質的に
、実施例１で説明した、プラスミドｐＬＡＰＣの構築の
際に用いる部位特異的な突然変異誘発およびその他の構
築プロトコールに従い、プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳ
を構築した。しかし、プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳの
構築の際に用いる緩衝液およびアニーリング条件は、シ
ラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍ１ｔｈ
、 １９８４． ＤＮＡ ３：４７９−４８９）か開
示したものによった。
、実施例１で説明した、プラスミドｐＬＡＰＣの構築の
際に用いる部位特異的な突然変異誘発およびその他の構
築プロトコールに従い、プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳ
を構築した。しかし、プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳの
構築の際に用いる緩衝液およびアニーリング条件は、シ
ラーおよびスミス（Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍ１ｔｈ
、 １９８４． ＤＮＡ ３：４７９−４８９）か開
示したものによった。
プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳの構築においては、以下
に示す突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、ファ
ージＭ］ ３ｍｐｌ ８−ＨＥ ｌ（実施例ＩＢ参照）
を部位特異的な突然変異誘発にかけた： ５’ −ＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＣＣ
ＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡ
ＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧ−３゜この部位特異的な
突然変異誘発によって得られる突然変異ファージをＭ１
３ｍｐ１８ ＨＥ３と命名した。
に示す突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、ファ
ージＭ］ ３ｍｐｌ ８−ＨＥ ｌ（実施例ＩＢ参照）
を部位特異的な突然変異誘発にかけた： ５’ −ＣＧＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＡＡＡＣＧＡＣＣＣ
ＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡ
ＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧ−３゜この部位特異的な
突然変異誘発によって得られる突然変異ファージをＭ１
３ｍｐ１８ ＨＥ３と命名した。
プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳの最後の構築は、実施例
１Ｃに記載したプラスミドｐＬＡＰＣの構築に類似する
方法で行った。しかし、プラスミドｐＬＡＰＣは、プラ
スミドｐＬＰＣから得た２つの制限フラグメントを用い
て構築した。プラスミドルＬへＰＣ−Ｉ Ｒ３の構築で
は、代わりに、これら同一の２つのフラグメントをプラ
スミドｐＬＡＰＣから得た。プラスミドｐＬＰＣの代わ
りにフラグメントの供給源としてプラスミドｐＬＡＰＣ
を用いた理由は、プラスミドｐＬＡＰＣ−［Ｒ３形質転
換体を同定する際の制限分析を容易にするためである。
１Ｃに記載したプラスミドｐＬＡＰＣの構築に類似する
方法で行った。しかし、プラスミドｐＬＡＰＣは、プラ
スミドｐＬＰＣから得た２つの制限フラグメントを用い
て構築した。プラスミドルＬへＰＣ−Ｉ Ｒ３の構築で
は、代わりに、これら同一の２つのフラグメントをプラ
スミドｐＬＡＰＣから得た。プラスミドｐＬＰＣの代わ
りにフラグメントの供給源としてプラスミドｐＬＡＰＣ
を用いた理由は、プラスミドｐＬＡＰＣ−［Ｒ３形質転
換体を同定する際の制限分析を容易にするためである。
プラスミドｐｔ、ｐｃとＰＬＡＰＣ−ＩＲＳはその大き
さが極めて接近しているので、プラスミドｐＬＡＰＣ−
ＩＲＳと「親」（プラスミドｐＬＰＣ）を区別するのは
困難である。しかし、プラスミドｐＬＡＰＣはプラスミ
ドｐＬＡＰＣ−ＩＲ８より小さいので、プラスミドｐＬ
ＡＰＣから２つのフラグメントを得ることにより、目的
のプラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳと親（プラスミドｐＬ
ＡＰＣ）を容易に区別することができる。即ち、プラス
ミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳを構築するため、ファージＭｌ
３ｍｐｌ ８−ＨＥ３の〜０．７ｋｂ ５ｓｔｌＳａ
ｉ＋制限フラグメントを、プラスミドｐＬＡＰＣの〜３
．７６ｋｂ ＥｃｏＲｌ−３ａｌｌ制限フラグメント、
およびプラスミドｐＬＡＰＣの〜２．０ｋｂＥｃｏＲＩ
−３ｓｔｌ制限フラグメントにライゲートした。ライゲ
ートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳ
を構成しており、これを大腸菌に１２ ＲＶ３０８に
導入した。得られた大腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐＬＡ
ＰＣ−ＩＲＳ形質転換体を用いて、真核細胞の形質転換
に用いるための、プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳＤＮＡ
の大スケール調製物を得た。
さが極めて接近しているので、プラスミドｐＬＡＰＣ−
ＩＲＳと「親」（プラスミドｐＬＰＣ）を区別するのは
困難である。しかし、プラスミドｐＬＡＰＣはプラスミ
ドｐＬＡＰＣ−ＩＲ８より小さいので、プラスミドｐＬ
ＡＰＣから２つのフラグメントを得ることにより、目的
のプラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳと親（プラスミドｐＬ
ＡＰＣ）を容易に区別することができる。即ち、プラス
ミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳを構築するため、ファージＭｌ
３ｍｐｌ ８−ＨＥ３の〜０．７ｋｂ ５ｓｔｌＳａ
ｉ＋制限フラグメントを、プラスミドｐＬＡＰＣの〜３
．７６ｋｂ ＥｃｏＲｌ−３ａｌｌ制限フラグメント、
およびプラスミドｐＬＡＰＣの〜２．０ｋｂＥｃｏＲＩ
−３ｓｔｌ制限フラグメントにライゲートした。ライゲ
ートしたＤＮＡは目的のプラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳ
を構成しており、これを大腸菌に１２ ＲＶ３０８に
導入した。得られた大腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐＬＡ
ＰＣ−ＩＲＳ形質転換体を用いて、真核細胞の形質転換
に用いるための、プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳＤＮＡ
の大スケール調製物を得た。
実施例４ アゾ／ウィルスで形質転換したヒト肝腎セル
ライン２９３／ｐＬＡＰＣ−ＩＲＳおよびアデノウィル
スで形質転換したゴールデンハムスターセルラインＡＶ
１２／ｐＬＡＰＣ−Ｉ Ｒ３形質転換体の作成 ヒト肝腎セルライン２９３は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから、取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ
１５７３のもとて入手できる。
ライン２９３／ｐＬＡＰＣ−ＩＲＳおよびアデノウィル
スで形質転換したゴールデンハムスターセルラインＡＶ
１２／ｐＬＡＰＣ−Ｉ Ｒ３形質転換体の作成 ヒト肝腎セルライン２９３は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションから、取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ
１５７３のもとて入手できる。
また、アデノウィルスで形質転換したゴールデンハムス
ターセルラインＡＶ１２は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから、取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ
９５９５のもとて人手できる。
ターセルラインＡＶ１２は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションから、取得番号ＡＴＣＣＣＲＬ
９５９５のもとて人手できる。
以下に記載する形質転換法は宿主セルラインとして２９
３細胞について言及するものであるが、この方法は、Ａ
Ｖ１２セルラインを含むほとんどの真核セルラインに、
ならびに本発明の発現ベクターに一般的に適用可能であ
る。
３細胞について言及するものであるが、この方法は、Ａ
Ｖ１２セルラインを含むほとんどの真核セルラインに、
ならびに本発明の発現ベクターに一般的に適用可能であ
る。
ＡＴＣＣから取得番号ＣＲＬ １５７３のもと、１０
％の熱−不活性化ウマ血清を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ
）の最少必須培地（Ｇ １ｂｃｏ）中に、全面単層の約
５．５ＸＩＯ８の細胞を含む２５１Ｍ″フラスコで２９
３細胞を入手した。このフラスコを３７°Ｃでインキュ
ベートし、培地を週２回交換した。培地は、１０％ウシ
胎児血清、５０μ９／頒ゲンタマインン、および１０
ｕ９／ ｍＱ ＡｑｕａＭＥＰＩＩＹＴＯＮ８フィトナ
ジオン ビタミンＫ 、（Ｍｅｒｃｋ ５ｈａｒｐ ａ
ｎｄ Ｄｏｈｍｅ、 Ｍｅｒｃｋａｎｄ Ｃｏ、、 Ｉ
ｎｃ、、Ｗｅｓｔ Ｐｏ１ｎｔ、 ＰＡ １９４８６）
を追加したＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）であった。培地を
除き、バンク（Ｈａｎｋ）のバランス塩溶液（Ｇｉｂｃ
ｏ）ですすぎ、０６２５％トリプンン＜０．２９７Ｑ
ＥＤＴＡを含む）を１〜２分間加え、新鮮な培地ですす
ぎ、アスピレータ−処理を行い、そして継代培養比１．
５またはｌ、１０で新しいフラスコに分けることにより
、ｆ’ｌｌｌ胞を継代培養した。
％の熱−不活性化ウマ血清を含むイーグル（Ｅａｇｌｅ
）の最少必須培地（Ｇ １ｂｃｏ）中に、全面単層の約
５．５ＸＩＯ８の細胞を含む２５１Ｍ″フラスコで２９
３細胞を入手した。このフラスコを３７°Ｃでインキュ
ベートし、培地を週２回交換した。培地は、１０％ウシ
胎児血清、５０μ９／頒ゲンタマインン、および１０
ｕ９／ ｍＱ ＡｑｕａＭＥＰＩＩＹＴＯＮ８フィトナ
ジオン ビタミンＫ 、（Ｍｅｒｃｋ ５ｈａｒｐ ａ
ｎｄ Ｄｏｈｍｅ、 Ｍｅｒｃｋａｎｄ Ｃｏ、、 Ｉ
ｎｃ、、Ｗｅｓｔ Ｐｏ１ｎｔ、 ＰＡ １９４８６）
を追加したＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）であった。培地を
除き、バンク（Ｈａｎｋ）のバランス塩溶液（Ｇｉｂｃ
ｏ）ですすぎ、０６２５％トリプンン＜０．２９７Ｑ
ＥＤＴＡを含む）を１〜２分間加え、新鮮な培地ですす
ぎ、アスピレータ−処理を行い、そして継代培養比１．
５またはｌ、１０で新しいフラスコに分けることにより
、ｆ’ｌｌｌ胞を継代培養した。
形質転換の１日前に、細胞を１００＋ｕ皿あたり０．７
Ｘ１０’細胞の割合で蒔いた。ＴＥ緩衝液に溶解した、
滅菌の、エタノール沈澱したプラスミドＤＮＡを用いて
、２５ ｕ９／ ｙｔＱの形質転換用プラスミドＤＮＡ
（プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳの形質転換に対しては
、通常、以下で説明するように、プラスミドルＬへＰＣ
−Ｉ Ｒ３および選択マーカーを含んでいるプラスミド
の２種類のプラスミドを用いる）および２５０ｍＭ Ｃ
ａＣＱ、を含む、２ＸのＤＮＡ ＣａＣＱｖ溶液を調
製した。７．０５〜７１５に調節したｐＨを有し、２８
０ｍＭ ＮａＣＱ、５０ｍＭヘベス（ｔｌｅｐｅｓ）、
および１．５ｍＭ リン酸ナトリウムを含む２ＸのＨＢ
ＳＳを調製した。２Ｘ （７） Ｄ Ｎ Ａ Ｃａ
ＣＱ ！溶液を等ｆｉｌ（７）滅菌２Ｘ ＨＢＳＳに滴
下した。２ＸのＨＢＳＳを入れた混合管に綿栓付きの１
ｍＱの滅菌プラスチノクピペノトを挿入し、ＤＮＡを加
えながら、気泡を吹き込んだ。
Ｘ１０’細胞の割合で蒔いた。ＴＥ緩衝液に溶解した、
滅菌の、エタノール沈澱したプラスミドＤＮＡを用いて
、２５ ｕ９／ ｙｔＱの形質転換用プラスミドＤＮＡ
（プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳの形質転換に対しては
、通常、以下で説明するように、プラスミドルＬへＰＣ
−Ｉ Ｒ３および選択マーカーを含んでいるプラスミド
の２種類のプラスミドを用いる）および２５０ｍＭ Ｃ
ａＣＱ、を含む、２ＸのＤＮＡ ＣａＣＱｖ溶液を調
製した。７．０５〜７１５に調節したｐＨを有し、２８
０ｍＭ ＮａＣＱ、５０ｍＭヘベス（ｔｌｅｐｅｓ）、
および１．５ｍＭ リン酸ナトリウムを含む２ＸのＨＢ
ＳＳを調製した。２Ｘ （７） Ｄ Ｎ Ａ Ｃａ
ＣＱ ！溶液を等ｆｉｌ（７）滅菌２Ｘ ＨＢＳＳに滴
下した。２ＸのＨＢＳＳを入れた混合管に綿栓付きの１
ｍＱの滅菌プラスチノクピペノトを挿入し、ＤＮＡを加
えながら、気泡を吹き込んだ。
撹拌することなく室温で３０〜４５分間、カルンウムー
リン酸塩−ＤＮＡ沈、殿物を形成させた。
リン酸塩−ＤＮＡ沈、殿物を形成させた。
次に、プラスチノクピペノトで穏やかにビベ・ノティン
グすることによって沈澱を混合し、受容細胞を覆う増殖
培地（］０ｊｌＣ）にプレートあたり１ｊｌＣの沈澱を
直接加えた。３７°Ｃで４時間インキュベートシた後、
培地を新鮮な培地に代え、選択圧をかける前に細胞をさ
らに７２時間インキュベートした。プラスミドｐＬＡＰ
Ｃ−ＩＲＳなどのように真核細胞で機能する選択マーカ
ーを含んでいないプラスミドに対しては、プラスミドの
混合物、即ち、選択マーカーを欠いている本発明の発現
ベクターおよび真核細胞で機能する選択マーカーを含ん
でいる発現ベクターを形質転換法に用いる。
グすることによって沈澱を混合し、受容細胞を覆う増殖
培地（］０ｊｌＣ）にプレートあたり１ｊｌＣの沈澱を
直接加えた。３７°Ｃで４時間インキュベートシた後、
培地を新鮮な培地に代え、選択圧をかける前に細胞をさ
らに７２時間インキュベートした。プラスミドｐＬＡＰ
Ｃ−ＩＲＳなどのように真核細胞で機能する選択マーカ
ーを含んでいないプラスミドに対しては、プラスミドの
混合物、即ち、選択マーカーを欠いている本発明の発現
ベクターおよび真核細胞で機能する選択マーカーを含ん
でいる発現ベクターを形質転換法に用いる。
このような同時形質転換系で用いるためには多種のベク
ターが使え、これらにはプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｒｒ
（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＳ Ｖ ２−ｎｅｏ（ＡＴ
ＣＣ３７１４９）、ｐＳＶ２−ｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１
４５）、およびｐＳＶ２−ｈｙｇ（ＮＲＲＬ Ｂ −
１８０３９）が含まれる。プラスミドｐＳ Ｖ ２−ｈ
ｙｇは真核宿主細胞にハイグロマイシンＢ耐性を付与す
る。この同時形質転換法は、選択マーカーを持つプラス
ミドを含んでいる細胞の選択を可能にする。
ターが使え、これらにはプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｒｒ
（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＳ Ｖ ２−ｎｅｏ（ＡＴ
ＣＣ３７１４９）、ｐＳＶ２−ｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１
４５）、およびｐＳＶ２−ｈｙｇ（ＮＲＲＬ Ｂ −
１８０３９）が含まれる。プラスミドｐＳ Ｖ ２−ｈ
ｙｇは真核宿主細胞にハイグロマイシンＢ耐性を付与す
る。この同時形質転換法は、選択マーカーを持つプラス
ミドを含んでいる細胞の選択を可能にする。
これらの細胞をさらに試験して形質転換用プラスミドの
両方を含んでいる細胞を同定する。真核細胞用の選択マ
ーカーを含んでおり、従って同時形質転換法の使用を必
要としない発現ベクターを本発明が包含していることは
もちろんである。
両方を含んでいる細胞を同定する。真核細胞用の選択マ
ーカーを含んでおり、従って同時形質転換法の使用を必
要としない発現ベクターを本発明が包含していることは
もちろんである。
ハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子を含んでいるプ
ラスミドでトランスフェクションされた細胞に対しては
、最終濃度約２００μ９／ｍＱとなるようにハイグロマ
イシンＢを増殖培地に加える。
ラスミドでトランスフェクションされた細胞に対しては
、最終濃度約２００μ９／ｍＱとなるようにハイグロマ
イシンＢを増殖培地に加える。
次いで、３〜４日毎に培地を交換しながら、２〜４週間
、３７°Ｃで細胞をインキュベートした。得られたハイ
グロマイシン耐性のコロニーを、その特徴を調べるため
別々の培養フラスコに移した。
、３７°Ｃで細胞をインキュベートした。得られたハイ
グロマイシン耐性のコロニーを、その特徴を調べるため
別々の培養フラスコに移した。
プラスミドｐＳ Ｖ ２−ｎｅｏはネオマイシン（Ｇ４
１８をネオマイシンの代わりに用いることもできる）に
対する耐性を付与し、６４１８を最終濃度４００μ９／
２Ｑで加えること以外は実質的にハイグロマイシン耐性
細胞の選択方法に従って、不オマインン耐性コロニーの
選択を行った。
１８をネオマイシンの代わりに用いることもできる）に
対する耐性を付与し、６４１８を最終濃度４００μ９／
２Ｑで加えること以外は実質的にハイグロマイシン耐性
細胞の選択方法に従って、不オマインン耐性コロニーの
選択を行った。
ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子あるいはメト
トレキセイトｉ性を付与するｄｈｆｒ遺伝子の誘導体（
ｄＭｒ−ｍｔｘ）を、ｄｈｆｒ−欠損のセルラインに遺
伝子あるいはプラスミドを導入するための選択マーカー
として用いること、ならびに、次にプラスミドのコピー
数を増幅するためにメトトレキセイトを用いることは、
文献において十分に確立されている。２９３細胞はｄｈ
４ ｒ陽性であるので、ｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミ
ドを含有している２９３の形質転換体は、ｄｈｆｒ陽性
の表現型（ヒポキサンチンとチミジンを欠く培地で増殖
する能力）に基づいてのみでは選択されない。機能的な
ｄｈｆｒ遺伝子を欠き、ｄｈｆｒを含有するプラスミド
で形質転換されるセルラインは、ｄｈｆｒ＋の表現型に
基づいて選択することができる。ｄｂ４ｒを産生ずる細
胞において選択および増幅マーカーとしてｄｈｆｒを用
いることは十分に研究されてはいないが、文献中の証拠
により、ｄｈｆｒ産生細胞中での遺伝子増幅用に、およ
び選択マーカーとしてｄｈｆｒを用いうろことが示唆さ
れる。本発明は、発現ベクターに用いる選択マーカーに
よって限定されるものではない。さらに、メタロチオネ
イン遺伝子、アデンシンデアミナーセ遺伝子、あるいは
Ｐ−糖タンパク質遺伝子で例示される多遺伝子耐性族の
一員などの増幅マーカーを用いることもできる。
トレキセイトｉ性を付与するｄｈｆｒ遺伝子の誘導体（
ｄＭｒ−ｍｔｘ）を、ｄｈｆｒ−欠損のセルラインに遺
伝子あるいはプラスミドを導入するための選択マーカー
として用いること、ならびに、次にプラスミドのコピー
数を増幅するためにメトトレキセイトを用いることは、
文献において十分に確立されている。２９３細胞はｄｈ
４ ｒ陽性であるので、ｄｈｆｒ遺伝子を含むプラスミ
ドを含有している２９３の形質転換体は、ｄｈｆｒ陽性
の表現型（ヒポキサンチンとチミジンを欠く培地で増殖
する能力）に基づいてのみでは選択されない。機能的な
ｄｈｆｒ遺伝子を欠き、ｄｈｆｒを含有するプラスミド
で形質転換されるセルラインは、ｄｈｆｒ＋の表現型に
基づいて選択することができる。ｄｂ４ｒを産生ずる細
胞において選択および増幅マーカーとしてｄｈｆｒを用
いることは十分に研究されてはいないが、文献中の証拠
により、ｄｈｆｒ産生細胞中での遺伝子増幅用に、およ
び選択マーカーとしてｄｈｆｒを用いうろことが示唆さ
れる。本発明は、発現ベクターに用いる選択マーカーに
よって限定されるものではない。さらに、メタロチオネ
イン遺伝子、アデンシンデアミナーセ遺伝子、あるいは
Ｐ−糖タンパク質遺伝子で例示される多遺伝子耐性族の
一員などの増幅マーカーを用いることもできる。
プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳとハイグロマイシン耐性
を付与するベクターの混合物で２９３およびＡＶ１２セ
ルラインを形質転換し、次いでハイグロマイノン耐性の
細胞を選択すると、多数の形質転換体が得られた（池の
形質転換体は同時形質転換用ベクターとしてプラスミド
ｐＳ Ｖ ２−ｎｅ。
を付与するベクターの混合物で２９３およびＡＶ１２セ
ルラインを形質転換し、次いでハイグロマイノン耐性の
細胞を選択すると、多数の形質転換体が得られた（池の
形質転換体は同時形質転換用ベクターとしてプラスミド
ｐＳ Ｖ ２−ｎｅ。
を用い、Ｇ４１８耐性細胞を選択することによって得た
）。これら形質転換体を実施例５記載のようにして分析
し、どのハイグロマイシン耐性の細胞がプラスミドルＬ
へＰＣ−Ｉ Ｒ３を含んでいるかを調べた。
）。これら形質転換体を実施例５記載のようにして分析
し、どのハイグロマイシン耐性の細胞がプラスミドルＬ
へＰＣ−Ｉ Ｒ３を含んでいるかを調べた。
実施例５組換えタンパク質を分泌する細胞の同定方法
実施例４で得られたハイグロマイシン耐性の形質転換体
を、組織培養皿あたり数百細胞クローンの密度で、ｌｏ
ｏ＃１１”組織培養皿で増殖させた。
を、組織培養皿あたり数百細胞クローンの密度で、ｌｏ
ｏ＃１１”組織培養皿で増殖させた。
この培地をデカンテーションし、細胞をバンクのバラン
ス塩溶液（Ｇｉｂｃｏ） Ｓ ｍＱずつで２回すすいだ
。
ス塩溶液（Ｇｉｂｃｏ） Ｓ ｍＱずつで２回すすいだ
。
滅菌した０、４５％寒天（Ｓｉｇｍａ Ｔｙｐｅ ４ア
ガロース；カタログ＃Ａ３６４３ ： Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、 、 Ｐ、 Ｏ。
ガロース；カタログ＃Ａ３６４３ ： Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、 、 Ｐ、 Ｏ。
Ｂｏｘ １４５０８． ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ６３１
７ｇ）の溶液を、１．８％寒天（４７’Ｃ； １ ｆｆ
Ｑ）をダルベツコの改良イーグル（ＤＭＥ）塩（Ｇｉｂ
ｃｏ）（３７°Ｃ；３１１１のと混合することによって
調製し、この０．４５％寒天溶液（２１のを細胞上に層
状に入れた。
７ｇ）の溶液を、１．８％寒天（４７’Ｃ； １ ｆｆ
Ｑ）をダルベツコの改良イーグル（ＤＭＥ）塩（Ｇｉｂ
ｃｏ）（３７°Ｃ；３１１１のと混合することによって
調製し、この０．４５％寒天溶液（２１のを細胞上に層
状に入れた。
ニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ、 ｌｎｃ、＋ Ｋｅｅｎｅ、
Ｎｉｌ ０３４３１）を煮沸し、次いで２時間オートク
レーブ処理し、細胞に毒性である浸潤剤を除去した。次
に、このフィルターを寒天層の上に置き、気泡を除去し
た後、このプレートを３７°Ｃで１〜３時間インキュベ
ートした。
ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ、 ｌｎｃ、＋ Ｋｅｅｎｅ、
Ｎｉｌ ０３４３１）を煮沸し、次いで２時間オートク
レーブ処理し、細胞に毒性である浸潤剤を除去した。次
に、このフィルターを寒天層の上に置き、気泡を除去し
た後、このプレートを３７°Ｃで１〜３時間インキュベ
ートした。
次いで、後に行うコロニーの同定を容易にするため、皿
上のフィルターの最初の方向がわがるように、あらかじ
め印をつけておいたこのフィルターを取り、ＰＢＳ（５
０１１１Ｍトリス−ＨＣｆ２．ｐＨ＝７２および１５０
ｍＭ ＮａＣｆｆ）中に入れた。
上のフィルターの最初の方向がわがるように、あらかじ
め印をつけておいたこのフィルターを取り、ＰＢＳ（５
０１１１Ｍトリス−ＨＣｆ２．ｐＨ＝７２および１５０
ｍＭ ＮａＣｆｆ）中に入れた。
フィルターの分析の間、皿上の細胞を生きたままに保つ
ため、１．８％寒天（４７°Ｃ；２１の、ＤＭＥ塩（３
７°Ｃ；２１ｆ２）、および２０％０％ラン血清を含む
ＤＭＥ塩（３７℃：４１１２）からなる混合物Ｃ８ＭＱ
）を細胞に重ねた。次に、この細胞を３７°Ｃのインキ
ュベーター内に入れた。
ため、１．８％寒天（４７°Ｃ；２１の、ＤＭＥ塩（３
７°Ｃ；２１ｆ２）、および２０％０％ラン血清を含む
ＤＭＥ塩（３７℃：４１１２）からなる混合物Ｃ８ＭＱ
）を細胞に重ねた。次に、この細胞を３７°Ｃのインキ
ュベーター内に入れた。
フィルターで行うすべての洗浄および反応は、フィルタ
ーを振動台の上に置いて行った。始めにこのフィルター
を、５％の乳を含むＰＢＳ中、室温でインキュベートす
ることによってプロ、７りした。次に、このフィルター
をＰＢＳ中で４回すすいだ（ｉ回のすすぎは５分間）。
ーを振動台の上に置いて行った。始めにこのフィルター
を、５％の乳を含むＰＢＳ中、室温でインキュベートす
ることによってプロ、７りした。次に、このフィルター
をＰＢＳ中で４回すすいだ（ｉ回のすすぎは５分間）。
２．５％ラウン清アルブミン中の１０μｇ／ｍＱビオチ
ン化ヤギ抗−ヒドブロチインＣポリクローナル抗体を、
フィルターを覆うに十分な量でフィルターに加え、次い
でこれを３７°Ｃで１時間インキュベートした。
ン化ヤギ抗−ヒドブロチインＣポリクローナル抗体を、
フィルターを覆うに十分な量でフィルターに加え、次い
でこれを３７°Ｃで１時間インキュベートした。
プロティンＣに対する抗体を調製するために後に使用す
るプロティンＣの精製は、キジール［Ｋ１５ｉｅｌ、
１９７９． Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、 ８４ニ
ア６１コの記載のようにして行うことができる。ポリク
ローナル抗体は、キャバソト［Ｅ、＾、 Ｋａｂａｔ、
５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ 、 ｌ１ｏｌｄ。
るプロティンＣの精製は、キジール［Ｋ１５ｉｅｌ、
１９７９． Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、 ８４ニ
ア６１コの記載のようにして行うことができる。ポリク
ローナル抗体は、キャバソト［Ｅ、＾、 Ｋａｂａｔ、
５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｉｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ 、 ｌ１ｏｌｄ。
Ｒｈ１ｎｅｈａｒｔ、およσＷｉｎｓｔｏｎｍ（ｉ９６
ｇ）コが開示した方法で調製することができる。また、
本検定で用いるのに適したモノクローナル抗体は、コー
ラ−およびミル７ユタイン［Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ、 １９７５゜Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６
：４９５］の記載のようにして、または米国特許Ｎｏ、
４，６９６，８９５； Ｅ ＰＯＰｕｂ、Ｎｏ、２０５
０４６；ラウレル等［Ｌａｕｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ、、
１９８５． ＦＥＢＳ １９１（ｉ）７５］：スズキ
等［５ｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ、、１９８５． Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ９７：１２７−１３８］ ；およびＥ Ｐ
ＯＰｕｂ、 Ｎｏ、 １３８２２２の記・俄のよう
にして調製することができる。本検定で用いるアビジン
Ｄおよびビオチン化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）はＶｅｃｔａｓｔａｉｎＴｌ″キット［Ｖｅｃ
ｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、
３０１重ｇｏｌｄＲｏａｄ、 Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ
、 Ｃ＾９４０１０］で入手することができる。また、
ビオチンもＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
ｇ）コが開示した方法で調製することができる。また、
本検定で用いるのに適したモノクローナル抗体は、コー
ラ−およびミル７ユタイン［Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎ、 １９７５゜Ｎａｔｕｒｅ、 ２５６
：４９５］の記載のようにして、または米国特許Ｎｏ、
４，６９６，８９５； Ｅ ＰＯＰｕｂ、Ｎｏ、２０５
０４６；ラウレル等［Ｌａｕｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ、、
１９８５． ＦＥＢＳ １９１（ｉ）７５］：スズキ
等［５ｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ、、１９８５． Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ９７：１２７−１３８］ ；およびＥ Ｐ
ＯＰｕｂ、 Ｎｏ、 １３８２２２の記・俄のよう
にして調製することができる。本検定で用いるアビジン
Ｄおよびビオチン化した西洋ワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ）はＶｅｃｔａｓｔａｉｎＴｌ″キット［Ｖｅｃ
ｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、、
３０１重ｇｏｌｄＲｏａｄ、 Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ
、 Ｃ＾９４０１０］で入手することができる。また、
ビオチンもＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｉｎｃ、から得られる。
フィルターを４°ＣのＰＢＳで４回すすいだ。次に、Ｖ
ｅｃｔａｓｔａｉｎＴ′４（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）キット中の製造元の指示に従って、ア
ビジンＤおよびビオチン化した西洋ワサビベルオキンダ
ーゼをａｌｌし、加えた。ＨＲＰとコンジュゲートした
アビジンＤとともに４°Ｃで１時間（タンパク質が少量
骨１必されているときには、もっと長いインキュベート
時間、例えば−晩を用いることができる）、フィルター
をインキュベートし、次いで、このフィルターを４°Ｃ
のＰＢＳで４回すすいだ。
ｅｃｔａｓｔａｉｎＴ′４（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）キット中の製造元の指示に従って、ア
ビジンＤおよびビオチン化した西洋ワサビベルオキンダ
ーゼをａｌｌし、加えた。ＨＲＰとコンジュゲートした
アビジンＤとともに４°Ｃで１時間（タンパク質が少量
骨１必されているときには、もっと長いインキュベート
時間、例えば−晩を用いることができる）、フィルター
をインキュベートし、次いで、このフィルターを４°Ｃ
のＰＢＳで４回すすいだ。
フィルターの指示色を発色させるため、水冷の１００％
メタノールに溶解したＨＲＰカラー発色剤（４−クロロ
−１−ナフトール； Ｓｉｇｍａ）（約３０ｍｇ）をＰ
ＢＳ（５０＋Ｑ）および３０％Ｈ，０，（３０μＱ）に
加えた。この混合物をニトロセルロースフィルターに加
え、これを発色するまで室温でインキュベートした。最
大のヒトプロティンＣを分ｌ必しているコロニーは、最
も早い発色によってだけでなく、フィルターの一段と暗
いスポットによっても示される。
メタノールに溶解したＨＲＰカラー発色剤（４−クロロ
−１−ナフトール； Ｓｉｇｍａ）（約３０ｍｇ）をＰ
ＢＳ（５０＋Ｑ）および３０％Ｈ，０，（３０μＱ）に
加えた。この混合物をニトロセルロースフィルターに加
え、これを発色するまで室温でインキュベートした。最
大のヒトプロティンＣを分ｌ必しているコロニーは、最
も早い発色によってだけでなく、フィルターの一段と暗
いスポットによっても示される。
フィルターを発色させた後、もう−度このフィルターを
最初のプレートと並べ、どのコロニーがフィルターのど
のスポットと関係しているかを調べた。次いで、最大の
ヒトプロティンＣを分泌しているコロニーを選び、これ
を活性化ヒトプロティンＣの製造に用いた。
最初のプレートと並べ、どのコロニーがフィルターのど
のスポットと関係しているかを調べた。次いで、最大の
ヒトプロティンＣを分泌しているコロニーを選び、これ
を活性化ヒトプロティンＣの製造に用いた。
上記の検定が高分泌セルラインを同定する方法の単なる
例示であるにすぎないことは当業者の理解するところで
あろう。この方法において多種の検定法を成功裏に用い
ることができる。例えば、ビオチン化したヤギ抗プロテ
ィンＣ抗体が、ヤギ抗−プロチインＣ抗体（ＴｇＧ）お
よびビオチン化した抗−ヤギ■ｇＧ抗体に置き換えられ
ている、２重−抗体反応を用いることができる。この方
法は、あらゆる細胞由来のあらゆる分泌タンパク質につ
いて成功裏に用いることができる。
例示であるにすぎないことは当業者の理解するところで
あろう。この方法において多種の検定法を成功裏に用い
ることができる。例えば、ビオチン化したヤギ抗プロテ
ィンＣ抗体が、ヤギ抗−プロチインＣ抗体（ＴｇＧ）お
よびビオチン化した抗−ヤギ■ｇＧ抗体に置き換えられ
ている、２重−抗体反応を用いることができる。この方
法は、あらゆる細胞由来のあらゆる分泌タンパク質につ
いて成功裏に用いることができる。
第１Ａ図は、ＢＫウィルスおよびプラスミドｐｄＢ Ｐ
Ｖ −ＭＭ Ｔ ｎｅｏからのプラスミドｐＢＫｎｅ
ｏｌの構築を示す工程図であり、 第１Ｂ図は、アデノウィルス２およびプラスミドｐＳ
Ｖ ２ ｃａｔからのプラスミドｐＬＰｃａｔの構築を
示す工程図であり、 第１Ｃ図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびプラスミ
ドｐＬＰｃａｔからのプラスミドｐＢＬｃａｔの構築を
示す工程図であり、 第１Ｄ図は、プラスミドｐＢＬｃａｔおよびプラスミド
ｐＬ１３３からのプラスミドｐＬＰＣの構築を示す工程
図であり、 第２図は、プラスミドｐｔ、ｐｃの構築に用いる出発物
質であるプラスミドｐＬ１３３の構築を示す工程図であ
る。
Ｖ −ＭＭ Ｔ ｎｅｏからのプラスミドｐＢＫｎｅ
ｏｌの構築を示す工程図であり、 第１Ｂ図は、アデノウィルス２およびプラスミドｐＳ
Ｖ ２ ｃａｔからのプラスミドｐＬＰｃａｔの構築を
示す工程図であり、 第１Ｃ図は、プラスミドｐＢＫｎｅｏｌおよびプラスミ
ドｐＬＰｃａｔからのプラスミドｐＢＬｃａｔの構築を
示す工程図であり、 第１Ｄ図は、プラスミドｐＢＬｃａｔおよびプラスミド
ｐＬ１３３からのプラスミドｐＬＰＣの構築を示す工程
図であり、 第２図は、プラスミドｐｔ、ｐｃの構築に用いる出発物
質であるプラスミドｐＬ１３３の構築を示す工程図であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、 ａ）γ−カルボキシル化され、分泌されるタンパク質の
シグナルペプチドおよびプロペプチド； ｂ）ヒトプロテインＣの軽鎖； ｃ）リジン−アルギニン、リジン−リジン、またはアル
ギニン−アルギニンから選ばれるジペプチド； ｄ）細胞に随伴するプロテアーゼのための切断配列；お
よび ｅ）活性化されたヒトプロテインＣの重鎖；［ただし、
該切断配列はヒトプロテインＣ酵素前駆体の活性化ペプ
チドではない］ を含んでいるタンパク質の暗号配列を含有するＤＮＡ化
合物。 ２、切断配列が次のアミノ酸残基配列で示される請求項
１記載のＤＮＡ化合物： ＰＲＰＳＲＫＲＲ、ＫＫＲＳＨＬＫＲ、 ＱＴＬＥＲＲＫＲ、ＬＥＧＳＬＱＫＲ、 ＦＹＴＰＫＴＲＲ、ＭＬＶＱＧＳＷＱ、 ＱＶＬＲＩＲＫＲ、ＫＩＬＮＲＰＫＲ、 ＮＩＬＡＲＶＴＲ、ＡＲＦＲＲＧＡＲ、 ＤＱＭＮＥＤＫＲ、ＱＷＬＭＮＴＫＲ、 ＮＲＤＤＩＡＫＲ、ＬＶＫＧＲＧＲＲ、 またはＩＶＥＥＬＧＲＲ ［配列中、Ｆはフェニルアラニン、Ｌはロイシン、Ｉは
イソロイシン、Ｍはメチオニン、Ｖはバリン、Ｓはセリ
ン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、Ａはアラニン、Ｙ
はチロシン、Ｈはヒスチジン、Ｑはグルタミン、Ｎはア
スパラギン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグ
ルタミン酸、Ｗはトリプトファン、Ｒはアルギニン、そ
してＧはグリシンである］。 ３、シグナルペプチドおよびプロペプチドが形成期ヒト
プロテインＣのシグナルペプチドおよびプロペプチドで
ある請求項２記載のＤＮＡ化合物。 ４、切断配列がＰＲＰＳＲＫＲＲである請求項３記載の
ＤＮＡ化合物。 ５、ＤＮＡによってコードされているポリペプチドが次
のアミノ酸残基配列で示される請求項４記載のＤＮＡ化
合物： 【アミノ酸配列があります】 ［配列中、ＡＬＡはアラニン、ＡＲＧはアルギニン、Ａ
ＳＮはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、−ＣＯ
ＯＨはカルボキシ末端、ＣＹＳはシステイン、ＧＬＮは
グルタミン、ＧＬＵはグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン
、Ｈ＿２Ｎ−はアミノ末端、ＨＩＳはヒスチジン、ＩＬ
Ｅはイソロイシン、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳはリジン
、ＭＥＴはメチオニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、Ｐ
ＲＯはプロリン、ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはトレオニン
、ＴＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチロシン、そして
ＶＡＬはバリンである］。 ６、請求項１、２、３、４または５のいずれかに記載の
ＤＮＡ化合物を含有する組換えＤＮＡ発現ベクター。 ７、プラスミドｐＬＡＰＣ−ＩＲＳである請求項６記載
のベクター。 ８、請求項６記載のベクターで形質転換した真核宿主細
胞。 ９、２９３／ｐＬＡＰＣ−ＩＲＳである請求項８記載の
真核宿主細胞。 １０、ＡＶ１２／ｐＬＡＰＣ−ＩＲＳである請求項８記
載の真核宿主細胞。 １１、（Ａ）以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含有する組
換えＤＮＡベクターで宿主細胞を形質転換し： （ｉ）アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、 ａ）γ−カルボキシル化され、分泌されるタンパク質の
シグナルペプチドおよびプロペプチド； ｂ）ヒトプロテインＣの軽鎖； ｃ）リジン−アルギニン、リジン−リジン、またはアル
ギニン−アルギニンから選ばれるジペプチド； ｄ）細胞に随伴するプロテアーゼのための切断配列；お
よび ｅ）活性化されたヒトプロテインＣの重鎖；［ただし、
該切断配列はヒトプロテインＣ酵素前駆体の活性化ペプ
チドではない］ を含んでいるアミノ酸残基配列をコードしているＤＮＡ
配列； （ｉｉ）該ＤＮＡ配列を発現させるように設置したプロ
モーター； （Ｂ）工程（Ａ）で形質転換した宿主細胞を、該ＤＮＡ
配列を発現させる条件下で培養すること、を特徴とする
真核宿主細胞からの分泌時に組換え活性化プロテインＣ
を直接産生させる方法。 １２、切断配列が次のアミノ酸残基配列で示される請求
項１１記載の方法： ＰＲＰＳＲＫＲＲ、ＫＫＲＳＨＬＫＲ、 ＱＴＬＥＲＲＫＲ、ＬＥＧＳＬＱＫＲ、 ＦＹＴＰＫＴＲＲ、ＭＬＶＱＧＳＷＱ、 ＱＶＬＲＩＲＫＲ、ＫＩＬＮＲＰＫＲ、 ＮＩＬＡＲＶＴＲ、ＡＲＦＲＲＧＡＲ、 ＤＱＭＮＥＤＫＲ、ＱＷＬＭＮＴＫＲ、 ＮＲＤＤＩＡＫＲ、ＬＶＫＧＲＧＲＲ、 またはＩＶＥＥＬＧＲＲ ［配列中、Ｆはフェニルアラニン、Ｌはロイシン、Ｉは
イソロイシン、Ｍはメチオニン、Ｖはバリン、Ｓはセリ
ン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、Ａはアラニン、Ｙ
はチロシン、Ｈはヒスチジン、Ｑはグルタミン、Ｎはア
スパラギン、Ｋはリジン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグ
ルタミン酸、Ｗはトリプトファン、Ｒはアルギニン、そ
してＧはグリシンである］。 １３、切断配列がＰＲＰＳＲＫＲＲである請求項１２記
載の方法。 １４、ＤＮＡ配列が次のアミノ酸残基配列をコードして
いる請求項１３記載の方法： 【アミノ酸配列があります】 ［配列中、ＡＬＡはアラニン、ＡＲＧはアルギニン、Ａ
ＳＮはアスパラギン、ＡＳＰはアスパラギン酸、−ＣＯ
ＯＨはカルボキシ末端、ＣＹＳはシステイン、ＧＬＮは
グルタミン、ＧＬＵはグルタミン酸、ＧＬＹはグリシン
、Ｈ＿２Ｎ−はアミノ末端、ＨＩＳはヒスチジン、ＩＬ
Ｅはイソロイシン、ＬＥＵはロイシン、ＬＹＳはリジン
、ＭＥＴはメチオニン、ＰＨＥはフェニルアラニン、Ｐ
ＲＯはプロリン、ＳＥＲはセリン、ＴＨＲはトレオニン
、ＴＲＰはトリプトファン、ＴＹＲはチロシン、そして
ＶＡＬはバリンである］。 １５、宿主細胞が２９３またはＡＶ１２宿主細胞である
請求項１４記載の方法。 １６、工程（Ｂ）で培養される宿主細胞が２９３／ｐＬ
ＡＰＣ−ＩＲＳまたはＡＶ１２／ｐＬＡＰＣ−ＩＲＳ宿
主細胞である請求項１５記載の方法。 １７、ベクターｐＬＡＰＣ、Ｍ１３ｍｐ１８ＨＥ１、Ｍ
１３ｍｐ１８ＨＥ２、またはＭ１３ｍｐ１８ＨＥ３であ
るベクター。 １８、（ａ）細胞集団を適当な固体基質上に取り： （ｂ）該細胞に寒天フィルムを乗せ； （ｃ）該フィルムにニトロセルロースシートをかぶせ；
そして （ｄ）該シートを取り、該シートに結合したタンパク質
を該タンパク質に対する抗体を用いて検出すること を特徴とする、タンパク質を発現し、分泌する細胞を同
定し、単離し、そして産生したタンパク質量を他の細胞
に関連させて定量する方法。 １９、タンパク質が活性化プロテインＣである請求項１
８記載の方法。
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