JPH02195899A - 糖化蛋白の測定法および測定試薬 - Google Patents
糖化蛋白の測定法および測定試薬Info
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- JPH02195899A JPH02195899A JP1565789A JP1565789A JPH02195899A JP H02195899 A JPH02195899 A JP H02195899A JP 1565789 A JP1565789 A JP 1565789A JP 1565789 A JP1565789 A JP 1565789A JP H02195899 A JPH02195899 A JP H02195899A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は糖化蛋白の測定法および測定試薬に関する。さ
らに詳しくは、たとえば糖尿病診断のための長期の平均
的血糖値を反映する指標等として有用な糖化蛋白の測定
法及び測定試薬に関する。
らに詳しくは、たとえば糖尿病診断のための長期の平均
的血糖値を反映する指標等として有用な糖化蛋白の測定
法及び測定試薬に関する。
［従来の技術］
従来、糖化蛋白の測定法としてはアルカリ条件下におけ
る糖化蛋白の還元力を利用する方法、アフイニテイクロ
マトグラフイー法、チオバルビッール酸法、高速液体ク
ロマトグラフィー法、ラジオイムノアッセイ法、酵素免
疫測定法などが知られている 〔例えば、クリニカ・シ
ミ力・アクタ（ＣＩｉｎ、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ）第
１２７巻、第８７〜９５頁（１９８２年）、糖尿病第２
５巻、第９６３〜９６８頁（１９８２年）、ダイアベト
ロシア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）第２１巻、第９４
〜９８頁（１９８１年）、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミス
トリー（Ｊ、 Ｃ１１ｎ、 Ｃｈｅｍ、 Ｃｌ１ｎ。
る糖化蛋白の還元力を利用する方法、アフイニテイクロ
マトグラフイー法、チオバルビッール酸法、高速液体ク
ロマトグラフィー法、ラジオイムノアッセイ法、酵素免
疫測定法などが知られている 〔例えば、クリニカ・シ
ミ力・アクタ（ＣＩｉｎ、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ）第
１２７巻、第８７〜９５頁（１９８２年）、糖尿病第２
５巻、第９６３〜９６８頁（１９８２年）、ダイアベト
ロシア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）第２１巻、第９４
〜９８頁（１９８１年）、ジャーナル・オブ・クリニカ
ル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミス
トリー（Ｊ、 Ｃ１１ｎ、 Ｃｈｅｍ、 Ｃｌ１ｎ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ）第１９巻、第８１〜８７頁（１９
８１年）、糖尿病第２９巻、第５８１〜５９０頁（１９
８６年）、糖尿病節２９巻補冊２、第３４０頁（１９８
６年）〕。
８１年）、糖尿病第２９巻、第５８１〜５９０頁（１９
８６年）、糖尿病節２９巻補冊２、第３４０頁（１９８
６年）〕。
［発明が解決しようとする課題］
しかしながら従来の方法には干渉物質の影響を受ける、
操作が複雑で手間がかかるなどの問題点がある。
操作が複雑で手間がかかるなどの問題点がある。
［課題を解決するための手段］
本発明者らは干渉物質の影響を受けず、かつ簡便な糖化
蛋白測定法および測定試薬を得るべく鋭意検討した結果
本発明に到達した。すなわち本発明はＣＨ−ＯＨ基を水
素供与体とし、（ＩＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋
または（２）酸素分子を水素受容体とする酸化還元酵素
を糖化蛋白に作用させ（１）ＮＡＤＨおよび／またはＮ
ＡＤＰＨの消費量または（２）酸素の消費量または過酸
化水素の発生量を測定する糖化蛋白の測定法；糖化蛋白
の糖結合部位であるリジン残基を遊離させて得られる混
合物にＣＨ−ＯＨ基を水素供与体としく１）ＮＡＤ＋お
よび／またはＮＡＤＰ＋または（２）酸素分子を水素受
容体とする酸化還元酵素を作用させ、（１）ＮＡＤＨお
よび／またはＮＡＤＰＨの消費量または（２）酸素の消
費量または過酸化水素の発生量を測定する糖化蛋白の測
定法；およびＣＨ−ＯＨ基を水素供与体としく１）ＮＡ
Ｄ＋および／またはＮＡＤＰ＋または（２）酸素分子を
水素受容体とする酸化還元酵素を含有してなる糖化蛋白
測定試薬である。
蛋白測定法および測定試薬を得るべく鋭意検討した結果
本発明に到達した。すなわち本発明はＣＨ−ＯＨ基を水
素供与体とし、（ＩＮＡＤ＋および／またはＮＡＤＰ＋
または（２）酸素分子を水素受容体とする酸化還元酵素
を糖化蛋白に作用させ（１）ＮＡＤＨおよび／またはＮ
ＡＤＰＨの消費量または（２）酸素の消費量または過酸
化水素の発生量を測定する糖化蛋白の測定法；糖化蛋白
の糖結合部位であるリジン残基を遊離させて得られる混
合物にＣＨ−ＯＨ基を水素供与体としく１）ＮＡＤ＋お
よび／またはＮＡＤＰ＋または（２）酸素分子を水素受
容体とする酸化還元酵素を作用させ、（１）ＮＡＤＨお
よび／またはＮＡＤＰＨの消費量または（２）酸素の消
費量または過酸化水素の発生量を測定する糖化蛋白の測
定法；およびＣＨ−ＯＨ基を水素供与体としく１）ＮＡ
Ｄ＋および／またはＮＡＤＰ＋または（２）酸素分子を
水素受容体とする酸化還元酵素を含有してなる糖化蛋白
測定試薬である。
本発明においてＣＨ−ＯＨ基を水素供与体としＮＡＤ＋
および／またはＮＡＤＰ＋または（２）酸素分子を水素
受容体とする酸化還元酵素としては、蛋白に糖が非酵素
的に結合することによって生成するカルボニル基に作用
する酵素であればいずれでもよい。このような酸化還元
酵素の例としてソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニ
トールデヒドロゲナーゼ、マンニトール−１−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、Ｄ−キシルロースレダクターゼ、グル
コネート−５−デヒドロゲナーゼ等のデヒドロゲナーゼ
等を挙げることができる。これらのうち好ましいのはソ
ルビトールデヒドロゲナーゼおよびマンニトールデヒド
ロゲナーゼである。
および／またはＮＡＤＰ＋または（２）酸素分子を水素
受容体とする酸化還元酵素としては、蛋白に糖が非酵素
的に結合することによって生成するカルボニル基に作用
する酵素であればいずれでもよい。このような酸化還元
酵素の例としてソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニ
トールデヒドロゲナーゼ、マンニトール−１−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、Ｄ−キシルロースレダクターゼ、グル
コネート−５−デヒドロゲナーゼ等のデヒドロゲナーゼ
等を挙げることができる。これらのうち好ましいのはソ
ルビトールデヒドロゲナーゼおよびマンニトールデヒド
ロゲナーゼである。
ＮＡＤ”、ＮＡＤＰ＋および酸素分子は使用する酵素に
応じて使い分けられる。
応じて使い分けられる。
本発明の測定対象物である糖化蛋白としてはグルコース
等のアルドースが蛋白のりジン残基等のアミノ基と非酵
素的に反応し、さらにアマトリ転移して生じるものがあ
げられる。たとえばフルクトサミン（糖化血清蛋白）、
糖化アルブミン、ヘモグロビンＡＩ（：などがある。
等のアルドースが蛋白のりジン残基等のアミノ基と非酵
素的に反応し、さらにアマトリ転移して生じるものがあ
げられる。たとえばフルクトサミン（糖化血清蛋白）、
糖化アルブミン、ヘモグロビンＡＩ（：などがある。
本発明の測定を行なうための酸化還元酵素反応の条件は
使用する酸化還元酵素について通常用いられる条件でよ
い。たとえばバイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ、 ）第８３巻、第１３５〜１４４頁（１９６
２年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー （Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 第２３
８巻、第１５９８〜１６０３頁（１９６３年）に記載の
反応条件を用いることができる。例えばソルビトールデ
ヒドロゲナーゼを用いる場合の反応条件は次の通りであ
る。
使用する酸化還元酵素について通常用いられる条件でよ
い。たとえばバイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｊ、 ）第８３巻、第１３５〜１４４頁（１９６
２年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー （Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ） 第２３
８巻、第１５９８〜１６０３頁（１９６３年）に記載の
反応条件を用いることができる。例えばソルビトールデ
ヒドロゲナーゼを用いる場合の反応条件は次の通りであ
る。
酸化還元酵素添加量は通常０．０１〜１００／ｍＱ 、
好ましくは０．１〜ＩＵ／ｙｄである。ＮＡＤＨおよび
／またはＮＡＤＰＨの添加量は通常０．００１〜１ ｍ
ｇ／ｄ、好ましくは０．０１〜０．１■／ｙｄである。
好ましくは０．１〜ＩＵ／ｙｄである。ＮＡＤＨおよび
／またはＮＡＤＰＨの添加量は通常０．００１〜１ ｍ
ｇ／ｄ、好ましくは０．０１〜０．１■／ｙｄである。
反応液のｐＨは通常４〜１０、好ましくは６〜８である
。反応温度は通常１０〜６０℃、好ましくは３０〜４０
℃である。反応時間は通常１〜６０分、好ましくは５〜
２０分である。反応には通常緩衝液が用いられるが、緩
衝液としては酵素反応に通常用いられるものならば特に
制限されず、０．Ｏ１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液等を用
いることができる。
。反応温度は通常１０〜６０℃、好ましくは３０〜４０
℃である。反応時間は通常１〜６０分、好ましくは５〜
２０分である。反応には通常緩衝液が用いられるが、緩
衝液としては酵素反応に通常用いられるものならば特に
制限されず、０．Ｏ１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液等を用
いることができる。
またマンニトールデヒドロゲナーゼを用いる場合の反応
条件は、反応液のｐＨが通常５〜１０、好ましくは７〜
９、反応温度が通常５〜５０℃、好ましくは２０〜３０
℃である以外はソルビトールデヒドロゲナーゼの場合と
同様の条件を用いることができる。
条件は、反応液のｐＨが通常５〜１０、好ましくは７〜
９、反応温度が通常５〜５０℃、好ましくは２０〜３０
℃である以外はソルビトールデヒドロゲナーゼの場合と
同様の条件を用いることができる。
酸化還元酵素、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ，お
よび糖化蛋白は同時に加えてもよく、逐次加えてもよい
。逐次加える場合１．加える順序は制限されない。
よび糖化蛋白は同時に加えてもよく、逐次加えてもよい
。逐次加える場合１．加える順序は制限されない。
酸化還元酵素は糖化蛋白に直接作用させてもよいが、あ
らかじめ糖の結合部位であるリジン残基等を遊離させて
得られる混合物に作用させることによりさらに効率よく
反応が進行し好ましい。糖が結合したりジン残基等を遊
離させる方法は通常の方法でよく、酵素法、化学法があ
る。酵素法では糖化蛋白に作用してリジン残基等を遊離
させることができる酵素ならばいずれでも使用すること
ができる。カルボキシペプチダーゼＢ１パパイン等のエ
ンドペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼ等のエキソ
ペプチダーゼのいずれも使用することができる。化学法
としては塩酸等を用いる加水分解法がある。これらのう
ち好ましいのは酵素法である。
らかじめ糖の結合部位であるリジン残基等を遊離させて
得られる混合物に作用させることによりさらに効率よく
反応が進行し好ましい。糖が結合したりジン残基等を遊
離させる方法は通常の方法でよく、酵素法、化学法があ
る。酵素法では糖化蛋白に作用してリジン残基等を遊離
させることができる酵素ならばいずれでも使用すること
ができる。カルボキシペプチダーゼＢ１パパイン等のエ
ンドペプチダーゼまたはアミノペプチダーゼ等のエキソ
ペプチダーゼのいずれも使用することができる。化学法
としては塩酸等を用いる加水分解法がある。これらのう
ち好ましいのは酵素法である。
酵素法によりリジン残基等を遊離させる際の反応条件は
通常の反応条件でよく、エンドペプチダーゼを用いる場
合は、例えばジャーナル・オブ・バイオロジカ）Ｌｔ−
ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）第２
３７巻、第３０９４〜３０９９頁（１９６２年）、同第
２０７巻第５１５〜５３１頁（１９５４年）に記載の反
応条件を、またエキソペプチダーゼを用いる場合は、た
とえばメソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、
Ｅｎ−ｚｙｍｏｌ、 ）第１９巻、第５１４〜５２１
頁（１９７０年）に記載の反応条件をそれぞれ用いるこ
とができる。
通常の反応条件でよく、エンドペプチダーゼを用いる場
合は、例えばジャーナル・オブ・バイオロジカ）Ｌｔ−
ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ）第２
３７巻、第３０９４〜３０９９頁（１９６２年）、同第
２０７巻第５１５〜５３１頁（１９５４年）に記載の反
応条件を、またエキソペプチダーゼを用いる場合は、た
とえばメソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、
Ｅｎ−ｚｙｍｏｌ、 ）第１９巻、第５１４〜５２１
頁（１９７０年）に記載の反応条件をそれぞれ用いるこ
とができる。
リジン残基等を遊離させる酵素と酸化還元酵素は逐次添
加してもよく、同時に添加してもよい。
加してもよく、同時に添加してもよい。
ＣＨ−ＯＨ基を水素供与体とし、ＮＡＤ＋および／また
はＮＡＤＰ＋を水素受容体とする酸化還元酵素による反
応は反応式： ％式％ 酸化還元酵素Ｒ１−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（。Ｈ）−Ｒ’
＋ ＮＡＤ、および／またはＮＡＤＰ” （式中Ｒは蛋白分子またはリジンの残基を、Ｒ′はアル
ドースの残基を表す） にしたがって進行し、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰ
Ｈの消費を伴う。ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの
消費量は存在する糖化蛋白の濃度に比例する。したがっ
て、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの消費量を測定
すれば、糖化蛋白の濃度を知ることができる。ＮＡＤＨ
および／またはＮＡＤＰＨの消費量はたとえば３４０ｎ
ｍにおける吸光度により測定することができる。
はＮＡＤＰ＋を水素受容体とする酸化還元酵素による反
応は反応式： ％式％ 酸化還元酵素Ｒ１−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（。Ｈ）−Ｒ’
＋ ＮＡＤ、および／またはＮＡＤＰ” （式中Ｒは蛋白分子またはリジンの残基を、Ｒ′はアル
ドースの残基を表す） にしたがって進行し、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰ
Ｈの消費を伴う。ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの
消費量は存在する糖化蛋白の濃度に比例する。したがっ
て、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの消費量を測定
すれば、糖化蛋白の濃度を知ることができる。ＮＡＤＨ
および／またはＮＡＤＰＨの消費量はたとえば３４０ｎ
ｍにおける吸光度により測定することができる。
本発明の測定法ではＣＨ−ＯＨ基を水素供与体としＮＡ
Ｄ＋および／またはＮＡＤＰ＋を水素受容体とする酸化
還元酵素の他にＣＨ−ＯＨ基を水素供与体とし、酸素分
子を水素受容体とする酸化還元酵素を用いることもでき
る。このような酵素による反応は、（１）酸素の消費ま
たは（２）酸素の消費および過酸化水素の発生を伴う。
Ｄ＋および／またはＮＡＤＰ＋を水素受容体とする酸化
還元酵素の他にＣＨ−ＯＨ基を水素供与体とし、酸素分
子を水素受容体とする酸化還元酵素を用いることもでき
る。このような酵素による反応は、（１）酸素の消費ま
たは（２）酸素の消費および過酸化水素の発生を伴う。
酸素の消費量または過酸化水素の発生量は存在する糖化
蛋白の濃度に比例する。したがって、酸素の消費量また
は過酸化水素の発生量を測定すれば糖化蛋白の濃度を知
ることができる。酸素の消費量および過酸化水素の発生
量の測定は通常の方法で行なうことができる。酸素の消
費量は、たとえば酸素電極によりまた過酸化水素の発生
量は、たとえばパーオキシダーゼによる発色反応を用い
て測定することができる。
蛋白の濃度に比例する。したがって、酸素の消費量また
は過酸化水素の発生量を測定すれば糖化蛋白の濃度を知
ることができる。酸素の消費量および過酸化水素の発生
量の測定は通常の方法で行なうことができる。酸素の消
費量は、たとえば酸素電極によりまた過酸化水素の発生
量は、たとえばパーオキシダーゼによる発色反応を用い
て測定することができる。
測定には通常標準物質が必要であるが、標準物質として
はアマトリ転移物ならば特に制限されず合成アマトリ転
移物などを用いることができる。
はアマトリ転移物ならば特に制限されず合成アマトリ転
移物などを用いることができる。
本発明の測定法を糖尿病診断のための臨床検査に利用す
る場合、糖化蛋白を含有する検体は通常臨床検査に用い
られる全血、血しよう、血清のいずれでもよい。これら
はそのまま測定に供してもよいが、あらかじめ透析など
の前処理を行なったのち測定に供してもよい。検体量と
しては通常１〜ｉ、ｏｏｏｌｔｇ 好ましくは１Ｏ−１
００１ｔｆｆを用いる。
る場合、糖化蛋白を含有する検体は通常臨床検査に用い
られる全血、血しよう、血清のいずれでもよい。これら
はそのまま測定に供してもよいが、あらかじめ透析など
の前処理を行なったのち測定に供してもよい。検体量と
しては通常１〜ｉ、ｏｏｏｌｔｇ 好ましくは１Ｏ−１
００１ｔｆｆを用いる。
本発明の測定法で用いる酸化還元酵素、パーオキシダー
ゼ等の酵素は溶液状態で用いてもよいが固定化して用い
ることもできる。固定化した酸化還元酵素、パーオキシ
ダーゼ等はカラム型式、バッチ型式等のいずれの型式で
も用いることができる。
ゼ等の酵素は溶液状態で用いてもよいが固定化して用い
ることもできる。固定化した酸化還元酵素、パーオキシ
ダーゼ等はカラム型式、バッチ型式等のいずれの型式で
も用いることができる。
本発明の測定法は用手法で実施することもできるが臨床
検査等で通常用いられる自動分析装置で実施すればさら
に効果的である。
検査等で通常用いられる自動分析装置で実施すればさら
に効果的である。
測定結果は糖化蛋白の濃度で表現してもよいが同時に検
体中に含まれる全蛋白濃度を測定すれば全蛋白濃度に対
する糖化蛋白濃度の比率で表現することもできる。全蛋
白濃度の測定法としては通常の方法でよく、たとえば２
８０ｎｍにおける吸光度を測定する方法、ロウクー法（
Ｌｏｗｒｙ法）をあげることができる。
体中に含まれる全蛋白濃度を測定すれば全蛋白濃度に対
する糖化蛋白濃度の比率で表現することもできる。全蛋
白濃度の測定法としては通常の方法でよく、たとえば２
８０ｎｍにおける吸光度を測定する方法、ロウクー法（
Ｌｏｗｒｙ法）をあげることができる。
［実施例］
次に本発明を実施例により具体的に説明するが本発明は
以下の実施例によって限定されるものではない。
以下の実施例によって限定されるものではない。
実施例１
（１）糖化蛋白測定試薬
酵素試薬：ソルビトールデヒドロゲナーゼ（シグマ社製
、３．ｌＵ／ｍｇ） ８ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）１ｍｕに溶解し、凍結乾燥した。
、３．ｌＵ／ｍｇ） ８ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）１ｍｕに溶解し、凍結乾燥した。
ＮＡＤＨ試薬：ＮＡＤＨ・２Ｎａ （和光紬薬工業■製
）０．５ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
ｌｄに溶解し、凍結乾燥した。
）０．５ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）
ｌｄに溶解し、凍結乾燥した。
（２）リジン残基遊離試薬
パパイン溶液（シグマ社製、６００Ｕ／ｍ１） ４００
ｐ、 ９゜、カルボキシペプチダーゼＢ溶液（シグマ
社製、２．３００Ｕ／艷）２００μ２、システィン２０
■を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１ｍに溶解
し、凍結乾燥した。
ｐ、 ９゜、カルボキシペプチダーゼＢ溶液（シグマ
社製、２．３００Ｕ／艷）２００μ２、システィン２０
■を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１ｍに溶解
し、凍結乾燥した。
（３）標準物質
リジンのアミノ基にグルコースを結合させて得た物質２
６■を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１戒に溶
解し、凍結乾燥した。
６■を０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）１戒に溶
解し、凍結乾燥した。
比較例１
糖尿病患者および正常者の血清を生理食塩水に対して透
析した。透析後の血清１００μ２に蒸留水を加え、全量
を５００μ党とした。１ｍｏｌｅ／Ｒ濃度の蓚酸５００
μ２を加え、１００℃で５時間加熱した。次いで６００
ｇ ／ ｆｆｉ濃度のトリクロル酢酸２００μ２を加
え除蛋白した。除蛋白後の上清液に５０ｍｍｏｌ／Ｒ濃
度のチオバルビッール酸３００μ２を加え、３７℃で１
５分間インキュベーションした。室温に２０分間放置し
たのち４４３ｎｍにおける吸光度を測定した。なお標準
溶液には５−ハイドロキシメチルフルフラール溶液を用
い、除蛋白後の血清サンプルと同様゛に操作した。血清
中の糖化蛋白濃度（Ｃ）は次式により算出した。測定結
果は第１図に示す。
析した。透析後の血清１００μ２に蒸留水を加え、全量
を５００μ党とした。１ｍｏｌｅ／Ｒ濃度の蓚酸５００
μ２を加え、１００℃で５時間加熱した。次いで６００
ｇ ／ ｆｆｉ濃度のトリクロル酢酸２００μ２を加
え除蛋白した。除蛋白後の上清液に５０ｍｍｏｌ／Ｒ濃
度のチオバルビッール酸３００μ２を加え、３７℃で１
５分間インキュベーションした。室温に２０分間放置し
たのち４４３ｎｍにおける吸光度を測定した。なお標準
溶液には５−ハイドロキシメチルフルフラール溶液を用
い、除蛋白後の血清サンプルと同様゛に操作した。血清
中の糖化蛋白濃度（Ｃ）は次式により算出した。測定結
果は第１図に示す。
ＡＳ：サンプルを測定したときの吸光度Ａ１．：標準物
質を測定したときの吸光度Ｃ１４：標準物質濃度（ｎｍ
ｏｌ／ｍＱ）実施例２ 糖化蛋白測定試薬（酵素試薬、ＮＡＤＨ試薬）、リジン
残基遊離試薬、標準物質に蒸留水を１ｍｆｌずつ加え溶
液とし、比較例と同じ血清サンプルについて以下の方法
で糖化蛋白を測定した。
質を測定したときの吸光度Ｃ１４：標準物質濃度（ｎｍ
ｏｌ／ｍＱ）実施例２ 糖化蛋白測定試薬（酵素試薬、ＮＡＤＨ試薬）、リジン
残基遊離試薬、標準物質に蒸留水を１ｍｆｌずつ加え溶
液とし、比較例と同じ血清サンプルについて以下の方法
で糖化蛋白を測定した。
未透析の血清１００μＱに０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐ
ｉ−１７，５） １ｍｆｆ１およびリジン残基遊離試薬
１００μ氾を加え、３７℃で１５分間インキュベーショ
ンした。
ｉ−１７，５） １ｍｆｆ１およびリジン残基遊離試薬
１００μ氾を加え、３７℃で１５分間インキュベーショ
ンした。
ついでＮＡＤＨ試薬２５０μＱを加えて３４０ｎｍの吸
光度を測定した（ＡＳＩ）。次いで酵素試薬５０μ氾を
加え、３７℃で１５分間インキュベーションした後３４
０ｎｍの吸光度を測定した（ＡＳ２）。標準物質につい
ても同様の操作をおこなった。酵素試薬を加える前後の
吸光度をそれぞれＡ４．■、Ａ、２とする。血清中の糖
化蛋白濃度は次式により算出した。測定結果は第１図に
示す。干渉物質を透析により除去して測定した比較例の
測定結果とよく相関している。
光度を測定した（ＡＳＩ）。次いで酵素試薬５０μ氾を
加え、３７℃で１５分間インキュベーションした後３４
０ｎｍの吸光度を測定した（ＡＳ２）。標準物質につい
ても同様の操作をおこなった。酵素試薬を加える前後の
吸光度をそれぞれＡ４．■、Ａ、２とする。血清中の糖
化蛋白濃度は次式により算出した。測定結果は第１図に
示す。干渉物質を透析により除去して測定した比較例の
測定結果とよく相関している。
すなわち、本測定法はあらかじめ干渉物質を除去しなく
てもその影響を受けることなく正しい糖化蛋白濃度を測
定できることを示している。
てもその影響を受けることなく正しい糖化蛋白濃度を測
定できることを示している。
／Ａ、： ＡＳｌ−ＡＳ２
ＡＡ＋＜： ＡＪ ＡＲ２
Ｃ＋＜ ：標準物質濃度（ｎｍｏｌ／ｒｎ！Ｑ）［発
明の効果］ 本発明の測定法および測定試薬は特異性の高い酵素を用
いるため、従来の測定法では避けられなかった干渉物質
（たとえばアスコルビン酸、尿酸、グルタチオン、ＥＤ
ＴＡ−２Ｎａなど）の影響を受けない。また、糖化蛋白
を含有する検体からカラムクロマトグラフィー等の方法
によって糖化蛋白を分離するなどの複雑な操作を必要と
しない等の優れた効果を奏する。
明の効果］ 本発明の測定法および測定試薬は特異性の高い酵素を用
いるため、従来の測定法では避けられなかった干渉物質
（たとえばアスコルビン酸、尿酸、グルタチオン、ＥＤ
ＴＡ−２Ｎａなど）の影響を受けない。また、糖化蛋白
を含有する検体からカラムクロマトグラフィー等の方法
によって糖化蛋白を分離するなどの複雑な操作を必要と
しない等の優れた効果を奏する。
糖尿病の診断あるいは糖尿病患者の血糖コントロールの
指標の一つに血糖値がある。しかしながら、血糖値は食
事等の影響で短期間に激しく変動するためこれだけでは
正確な診断あるいは血糖コントロールの把握ができない
。そこで長期（１週間〜数ケ月）の平均的血糖値を反映
する指標が注目され診断等に用いられている。本発明は
このような診断等の目的に有効に利用し得る。
指標の一つに血糖値がある。しかしながら、血糖値は食
事等の影響で短期間に激しく変動するためこれだけでは
正確な診断あるいは血糖コントロールの把握ができない
。そこで長期（１週間〜数ケ月）の平均的血糖値を反映
する指標が注目され診断等に用いられている。本発明は
このような診断等の目的に有効に利用し得る。
第１図は比較例１の測定結果と実施例２の測定結果の相
関図である。 図面 第１図 （ｎｍｏｌ／ｍＱ） 実施例２による測疋値
関図である。 図面 第１図 （ｎｍｏｌ／ｍＱ） 実施例２による測疋値
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＣＨ−ＯＨ基を水素供与体とし、（１）ＮＡＤ＾＋
および／またはＮＡＤＰ＾＋または（２）酸素分子を水
素受容体とする酸化還元酵素を糖化蛋白に作用させ（１
）ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの消費量または（
２）酸素の消費量または過酸化水素の発生量を測定する
糖化蛋白の測定法。 ２、糖化蛋白の糖結合部位であるリジン残基を遊離させ
て得られる混合物にＣＨ−ＯＨ基を水素供与体とし（１
）ＮＡＤ＾＋および／またはＮＡＤＰ＾＋または（２）
酸素分子を水素受容体とする酸化還元酵素を作用させ、
（１）ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの消費量また
は（２）酸素の消費量または過酸化水素の発生量を測定
する糖化蛋白の測定法。 ３、ＣＨ−ＯＨ基を水素供与体とし、（１）ＮＡＤ＾＋
および／またはＮＡＤＰ＾＋または（２）酸素分子を水
素受容体とする酸化還元酵素を含有してなる糖化蛋白測
定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1565789A JPH02195899A (ja) | 1989-01-25 | 1989-01-25 | 糖化蛋白の測定法および測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1565789A JPH02195899A (ja) | 1989-01-25 | 1989-01-25 | 糖化蛋白の測定法および測定試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02195899A true JPH02195899A (ja) | 1990-08-02 |
Family
ID=11894802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1565789A Pending JPH02195899A (ja) | 1989-01-25 | 1989-01-25 | 糖化蛋白の測定法および測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02195899A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0709457A1 (en) | 1994-10-05 | 1996-05-01 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same |
| US6127138A (en) * | 1997-04-24 | 2000-10-03 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Method of enzymatically measuring glycated protein |
| US7250269B2 (en) | 2001-01-31 | 2007-07-31 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Composition for assaying glycoprotein |
| KR102073759B1 (ko) * | 2019-02-14 | 2020-02-05 | 주식회사 에이치앤비나인 | Nadh를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
-
1989
- 1989-01-25 JP JP1565789A patent/JPH02195899A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0709457A1 (en) | 1994-10-05 | 1996-05-01 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same |
| US5712138A (en) * | 1994-10-05 | 1998-01-27 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase |
| US6127138A (en) * | 1997-04-24 | 2000-10-03 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Method of enzymatically measuring glycated protein |
| US7250269B2 (en) | 2001-01-31 | 2007-07-31 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Composition for assaying glycoprotein |
| EP2107123A2 (en) | 2001-01-31 | 2009-10-07 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Composition for assaying glycated proteins |
| EP2107376A2 (en) | 2001-01-31 | 2009-10-07 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Composition for assaying glycated proteins |
| EP2236618A2 (en) | 2001-01-31 | 2010-10-06 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Compositions for assaying glycoprotein |
| EP2248909A1 (en) | 2001-01-31 | 2010-11-10 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Compositions for assaying glycoprotein |
| US8105800B2 (en) | 2001-01-31 | 2012-01-31 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Composition for assaying glycated proteins |
| KR102073759B1 (ko) * | 2019-02-14 | 2020-02-05 | 주식회사 에이치앤비나인 | Nadh를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
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