JPH0216985A - 遺伝子操作植物細胞および植物，ならびにそれに適当な組換えｄｎａ - Google Patents
遺伝子操作植物細胞および植物，ならびにそれに適当な組換えｄｎａInfo
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- JPH0216985A JPH0216985A JP1073736A JP7373689A JPH0216985A JP H0216985 A JPH0216985 A JP H0216985A JP 1073736 A JP1073736 A JP 1073736A JP 7373689 A JP7373689 A JP 7373689A JP H0216985 A JPH0216985 A JP H0216985A
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
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- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に関し、さらに詳しく
は組換えＤＮＡを用いる植物細胞および植物の遺伝子操
作の分野に関する。
は組換えＤＮＡを用いる植物細胞および植物の遺伝子操
作の分野に関する。
発明の背景
１）緒言
原核生物および真核生物のいずれにおいても、遺伝子の
発現は調節遺伝子の生成物によって制御できる。特殊な
場合には、これらの調節遺伝子によってコーＶされるタ
ンパク質生成物のほかに、調節遺伝子によってコードさ
れる（非翻訳）転写体も遺伝子の発現に影響することが
明らかにされている。調節ＲＮＡは特定のｍＲＮＡに相
補性のヌクレオチド配列を含有する。２種の転写体の結
合が塩基の対合によって起こる。ｉｎ Ｖｉｔｒｏでも
ｉｎ ｖｉｖｏでも、ｍＲＮＡが相補性ＲＮＡと／％イ
プリダイゼーションしたのちＫは、も早ｍＲＮＡの翻訳
は起こらない。この阻害の一般に容認されている分子機
構は、ｍＲＮＡ ：相補性ＲＮＡ ／＼イブリッドの生
成である。原核生物では、このような二重鎖ＲＮＡハイ
ブリッドの生成は翻訳の阻害を招き、真核生物ではＲＮ
Ａプロセッシングの阻害、細胞核から細胞質へのＲＮＡ
輸送の阻害、細胞質中での翻訳の遮断、ＲＮＡターンオ
ーバー速度の変化、またはこれらの効果の組合せを招来
する。アンチセンスＲＮＡの用語によるほか、これらの
調節転写体は、アンチｍＲＮＡ 、相補性ＲＮＡ 、ナ
ンセンスＲＮＡまたはｍｉｃ ＲＮＡ （ｍＲＮＡ干渉
相補性ＲＮＡ ）とも呼ばれる。
発現は調節遺伝子の生成物によって制御できる。特殊な
場合には、これらの調節遺伝子によってコーＶされるタ
ンパク質生成物のほかに、調節遺伝子によってコードさ
れる（非翻訳）転写体も遺伝子の発現に影響することが
明らかにされている。調節ＲＮＡは特定のｍＲＮＡに相
補性のヌクレオチド配列を含有する。２種の転写体の結
合が塩基の対合によって起こる。ｉｎ Ｖｉｔｒｏでも
ｉｎ ｖｉｖｏでも、ｍＲＮＡが相補性ＲＮＡと／％イ
プリダイゼーションしたのちＫは、も早ｍＲＮＡの翻訳
は起こらない。この阻害の一般に容認されている分子機
構は、ｍＲＮＡ ：相補性ＲＮＡ ／＼イブリッドの生
成である。原核生物では、このような二重鎖ＲＮＡハイ
ブリッドの生成は翻訳の阻害を招き、真核生物ではＲＮ
Ａプロセッシングの阻害、細胞核から細胞質へのＲＮＡ
輸送の阻害、細胞質中での翻訳の遮断、ＲＮＡターンオ
ーバー速度の変化、またはこれらの効果の組合せを招来
する。アンチセンスＲＮＡの用語によるほか、これらの
調節転写体は、アンチｍＲＮＡ 、相補性ＲＮＡ 、ナ
ンセンスＲＮＡまたはｍｉｃ ＲＮＡ （ｍＲＮＡ干渉
相補性ＲＮＡ ）とも呼ばれる。
アンチセンスＲＮＡ ’ｉミコーする遺伝子はアンチセ
ンス遺伝子と呼ばれる。
ンス遺伝子と呼ばれる。
アンチセンスＲＮＡ機構は原核生物で発見されも細菌は
この調節システムを、とくにＤＮＡ複製および、Ｃ０１
ｌＩｉ１、Ｃ１ｏ Ｄ Ｆ １３ 、ＰＢＦ Ｉ Ｏ３
０％１）１５Ａ、Ｒ１、ＮＲ１、Ｒ６−５、ｐＴｉ ｓ
ｉのようなシラスミドの不適合性の制御、Ｔｎ−１０転
位の調節、大腸菌内の浸透圧調節、ならびにファージ増
殖の調節に使用している。真核生物においてもアンチセ
ンスＲＮＡが調節機構として用いられているという徴候
はあるものの、これはまだ証明されていない。
この調節システムを、とくにＤＮＡ複製および、Ｃ０１
ｌＩｉ１、Ｃ１ｏ Ｄ Ｆ １３ 、ＰＢＦ Ｉ Ｏ３
０％１）１５Ａ、Ｒ１、ＮＲ１、Ｒ６−５、ｐＴｉ ｓ
ｉのようなシラスミドの不適合性の制御、Ｔｎ−１０転
位の調節、大腸菌内の浸透圧調節、ならびにファージ増
殖の調節に使用している。真核生物においてもアンチセ
ンスＲＮＡが調節機構として用いられているという徴候
はあるものの、これはまだ証明されていない。
天然の糸においてアンチセンスＲＮＡが遺伝子の発現を
阻害できることの発見は、この方法を用いて遺伝子を人
工的に調節しようと試みる多くの実験を誘導した。実験
的に投与されたアンチセンスＲＮＡによる遺伝子発現の
操作は、原核生物でも真核生物でも可能であることが証
明された。アンチセンスＲＮＡによるタンパク合成の遮
断または低下は、細菌、培養哺乳動物細胞、アフリカッ
メガエルおよびショウジヨウバエの胚、タマホカリカビ
、ならびに植物細胞を含む多くの細胞株で機能すること
がわかっている。比較的単純な操作で、選ばれたｍＲＮ
Ａに対して相補性のアンチセンスＲＮＡ ’ｚｉｎ ｖ
ｉｖｏまたはｉｎ Ｖｉｔｒｏでも合成できる。クロン
化遺伝子の配列を切り出し、ついで同じフラグメント’
ｔ−プロモーターに対して逆の方向に挿入すると、アン
チセンスＲＮＡが生じる。
阻害できることの発見は、この方法を用いて遺伝子を人
工的に調節しようと試みる多くの実験を誘導した。実験
的に投与されたアンチセンスＲＮＡによる遺伝子発現の
操作は、原核生物でも真核生物でも可能であることが証
明された。アンチセンスＲＮＡによるタンパク合成の遮
断または低下は、細菌、培養哺乳動物細胞、アフリカッ
メガエルおよびショウジヨウバエの胚、タマホカリカビ
、ならびに植物細胞を含む多くの細胞株で機能すること
がわかっている。比較的単純な操作で、選ばれたｍＲＮ
Ａに対して相補性のアンチセンスＲＮＡ ’ｚｉｎ ｖ
ｉｖｏまたはｉｎ Ｖｉｔｒｏでも合成できる。クロン
化遺伝子の配列を切り出し、ついで同じフラグメント’
ｔ−プロモーターに対して逆の方向に挿入すると、アン
チセンスＲＮＡが生じる。
原核生物および／または真核生物の細胞でアンチセンス
ＲＮＡを誘導するには、２つの方法がある。
ＲＮＡを誘導するには、２つの方法がある。
（１）％定のｍＲＮＡと相補性のオリゴヌクレオチドま
たはアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、つい
でその細胞中への尋人 （２） アンチセンス遺伝子の細胞中への導入。アン
チセンス遺伝子を機能性プロモーターとともに与えると
、細胞転写系により所望のアンチセンスＲＮＡのｉｎ
ｖｉｖｏ産生が行われる。プロモーターは構成プロモー
ターでも、また調節もしくは誘導プロモーター、であっ
てもよい。
たはアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成、つい
でその細胞中への尋人 （２） アンチセンス遺伝子の細胞中への導入。アン
チセンス遺伝子を機能性プロモーターとともに与えると
、細胞転写系により所望のアンチセンスＲＮＡのｉｎ
ｖｉｖｏ産生が行われる。プロモーターは構成プロモー
ターでも、また調節もしくは誘導プロモーター、であっ
てもよい。
ｉｎ ＶｉｔｒＯ合成されたアンチセンスＲＮＡまたは
オリゴヌクレオチドの大ｆを、マイクロインジェクショ
ンによって直接細胞内例導入することができる。相補性
転写体の寿命は短いので、得られる効果は本来−時的な
ものにすぎない（「過渡発現」）。
オリゴヌクレオチドの大ｆを、マイクロインジェクショ
ンによって直接細胞内例導入することができる。相補性
転写体の寿命は短いので、得られる効果は本来−時的な
ものにすぎない（「過渡発現」）。
アンチセンス遺伝子のｒツム内への組込みまたはアンチ
センス遺伝子のシラスミド上への安定の維持により連続
的なアンチセリンＲＮＡ産生が導かれる。
センス遺伝子のシラスミド上への安定の維持により連続
的なアンチセリンＲＮＡ産生が導かれる。
遺伝子の細胞性機能を決定する場合、遺伝子産物の合成
ある因は活性を完全にまたは部分的に阻害するのが有益
なことが多い。しかしながら、遺伝子およびその遺伝子
生成物の同定および特性の解明は、このような遺伝子に
おける突然変位は致命的なことが多く、また（倍数体の
場合）劣性であるため、その実行は困難を伴うことが多
い。しかしまた、形質転換技術により、デノムに付加的
な、必要であれば突然変異した、遺伝子を添加すること
が可能になり、元の遺伝子もそのまま存在する場合が多
い。抗生物質または抗体を、生細胞中に、遺伝子産物の
特異的インヒビターとして導入することができる。これ
にはしかしながら、標的タンパク質およびインヒビター
の特性づけが心太である。遺伝子発現のアンチセンスＲ
ＮＡによる選択的阻害ならば、通常の技術への付加が可
能であろう。特定の遺伝子を、遺伝子産物の完全な特徴
づけを行う必要なしに、作動および遮断に切換えたり、
修飾（部分阻害）することができる。アンチセンス遺伝
子はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるファージ、ウィルス
および腫瘍タンパク質の産生ｔｌ−阻害するために使用
することもできる。
ある因は活性を完全にまたは部分的に阻害するのが有益
なことが多い。しかしながら、遺伝子およびその遺伝子
生成物の同定および特性の解明は、このような遺伝子に
おける突然変位は致命的なことが多く、また（倍数体の
場合）劣性であるため、その実行は困難を伴うことが多
い。しかしまた、形質転換技術により、デノムに付加的
な、必要であれば突然変異した、遺伝子を添加すること
が可能になり、元の遺伝子もそのまま存在する場合が多
い。抗生物質または抗体を、生細胞中に、遺伝子産物の
特異的インヒビターとして導入することができる。これ
にはしかしながら、標的タンパク質およびインヒビター
の特性づけが心太である。遺伝子発現のアンチセンスＲ
ＮＡによる選択的阻害ならば、通常の技術への付加が可
能であろう。特定の遺伝子を、遺伝子産物の完全な特徴
づけを行う必要なしに、作動および遮断に切換えたり、
修飾（部分阻害）することができる。アンチセンス遺伝
子はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるファージ、ウィルス
および腫瘍タンパク質の産生ｔｌ−阻害するために使用
することもできる。
２）原核生物におけるアンチセンスＲＮＡ原核生物にお
いて、アンチセンスＲＮＡによル遺伝子機能の阻害が天
然の過程であることが見出された。
いて、アンチセンスＲＮＡによル遺伝子機能の阻害が天
然の過程であることが見出された。
小さな相補性ＲＮＡ分子の調節的役割が、最初、大腸菌
内でのプラスミド複製の試験中に明らかにされた。小さ
な大腸菌シラスミＰ ＣＯＩ ｘ １およびソ（Ｄ関連
シラスミ）ＦＣｌｏ Ｄ Ｆ ｉ ３、ｐＢＲ３２２、
ｐｓｐ １０３０、ｐｌ ５Ａの複製および不適合性は
、２種の転写体（互いに相補性である） ： ＲＮＡ
ｌおよびＲＮＡ ［の相互作用によって制御される。Ｒ
）ＪＡ ｌは、複製オリジンで鋳型ＤＮＡとノ・イブリ
ッドを形成する。ついでこのハイブリダイゼーションし
たＲＮＡ Ｍを消化して、シラスミｒのＤＮＡ合成のた
めのプライマーを形成させる。ＲＮＡ ｌの転写は同じ
（ＲＮＡ ｆｌをコードする領域内で起こるが方向は逆
である。このＲＮＡ ｌのＲＮＡ ｌの結合がＲＮＡ
ｌと鋳型ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションを阻害し
、したがってプライマー形成はも早不可能になり、シラ
スミｒの複製は起こらない。
内でのプラスミド複製の試験中に明らかにされた。小さ
な大腸菌シラスミＰ ＣＯＩ ｘ １およびソ（Ｄ関連
シラスミ）ＦＣｌｏ Ｄ Ｆ ｉ ３、ｐＢＲ３２２、
ｐｓｐ １０３０、ｐｌ ５Ａの複製および不適合性は
、２種の転写体（互いに相補性である） ： ＲＮＡ
ｌおよびＲＮＡ ［の相互作用によって制御される。Ｒ
）ＪＡ ｌは、複製オリジンで鋳型ＤＮＡとノ・イブリ
ッドを形成する。ついでこのハイブリダイゼーションし
たＲＮＡ Ｍを消化して、シラスミｒのＤＮＡ合成のた
めのプライマーを形成させる。ＲＮＡ ｌの転写は同じ
（ＲＮＡ ｆｌをコードする領域内で起こるが方向は逆
である。このＲＮＡ ｌのＲＮＡ ｌの結合がＲＮＡ
ｌと鋳型ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションを阻害し
、したがってプライマー形成はも早不可能になり、シラ
スミｒの複製は起こらない。
Ｃ０１Ｅ１とは無関係な大腸画工ｎｃ Ｆ ｌプラスミ
ドＲ１、ＮＲ１およびＲ６−５の複製および不適合も同
様にＲＮＡ ： ＲＮＡ相互作用を介して調節される。
ドＲ１、ＮＲ１およびＲ６−５の複製および不適合も同
様にＲＮＡ ： ＲＮＡ相互作用を介して調節される。
遺伝子ｒθｐＡの遺伝子産物はシラスミド複製に必須で
ある。天然のアンチセンスＲＮＡ （長さ９０ヌクレオ
チｒ）はｒｅｐ Ａ ｍＲＮＡの５′末端と相補性であ
る。アンチセンスＲＮＡのｒｅｐ Ａ ｍＲＮＡ 、！
：のハイブリダイゼーションはｒｅｐ Ａ ｍＲＮＡの
翻訳を阻害し、その結果、シラスミド複製は起こること
ができない。したがって、Ｃ０１Ｅ１および関連シラス
ミドと異なり、プライマー形成ではなく、ｒｅｐ Ａ翻
訳がこのアンチセンスＲ２１１Ａ機構を介して調節され
る。
ある。天然のアンチセンスＲＮＡ （長さ９０ヌクレオ
チｒ）はｒｅｐ Ａ ｍＲＮＡの５′末端と相補性であ
る。アンチセンスＲＮＡのｒｅｐ Ａ ｍＲＮＡ 、！
：のハイブリダイゼーションはｒｅｐ Ａ ｍＲＮＡの
翻訳を阻害し、その結果、シラスミド複製は起こること
ができない。したがって、Ｃ０１Ｅ１および関連シラス
ミドと異なり、プライマー形成ではなく、ｒｅｐ Ａ翻
訳がこのアンチセンスＲ２１１Ａ機構を介して調節され
る。
４．４ ｋｂ黄色プｒつ球菌シラスミドｐ７）８１の複
製は、大腸画工ｎｃＦ ■プラスミドについて述べたと
ほぼ同一の様式で起こる。しかしながら、この場合は、
２種の天然アンチセンス転写体が関与する。
製は、大腸画工ｎｃＦ ■プラスミドについて述べたと
ほぼ同一の様式で起こる。しかしながら、この場合は、
２種の天然アンチセンス転写体が関与する。
ｐＴｌ ８１でも、Ｃｏ１Ｅｊおよび工ｎｃｌＦ １群
でも、いずれもシラスミｒの複製はアンチセンス機構で
調節されるが、これらの３種のプラスミｒ群で１つの一
般的アンチセンス転写体が用いられることには凝いの余
地はない。ｐＴｌ ８１とＣ０ＩＥ １およびＩｎＣＦ
“１群のアンチセンス転写体の間には有意な塩基配列ホ
モロジーはないというのが事実である。
でも、いずれもシラスミｒの複製はアンチセンス機構で
調節されるが、これらの３種のプラスミｒ群で１つの一
般的アンチセンス転写体が用いられることには凝いの余
地はない。ｐＴｌ ８１とＣ０ＩＥ １およびＩｎＣＦ
“１群のアンチセンス転写体の間には有意な塩基配列ホ
モロジーはないというのが事実である。
細菌での翻訳のアンチセンス制御の他の例には、大腸菌
でのＴｎ−ｊ Ｏ）ランスポザーゼの産生の調節がある
。この場合は、長さ１８０ヌクレオチドの小さなアンチ
センスＲ）ＪＡとＴｎ−１０）ランスボデーゼｍＲＮＡ
の間で二重＠ ＲＮＡハイブリッドが形成される。アン
チセンスＲＮＡとトランスボデーゼｍＲＮＡとのハイブ
リダイゼーションにより、トランスボデーゼｍＥＮＡの
翻訳は起こらなｍ０ｉｎ ｖｉｖ。
でのＴｎ−ｊ Ｏ）ランスポザーゼの産生の調節がある
。この場合は、長さ１８０ヌクレオチドの小さなアンチ
センスＲ）ＪＡとＴｎ−１０）ランスボデーゼｍＲＮＡ
の間で二重＠ ＲＮＡハイブリッドが形成される。アン
チセンスＲＮＡとトランスボデーゼｍＲＮＡとのハイブ
リダイゼーションにより、トランスボデーゼｍＥＮＡの
翻訳は起こらなｍ０ｉｎ ｖｉｖ。
における転位頻度は細胞内のトランスボず−ゼレベルに
依存するので、Ｔｎ−１０転位頻度は結局、調節を受け
ることができる。
依存するので、Ｔｎ−１０転位頻度は結局、調節を受け
ることができる。
プラスミド複製およびＴｎ−１０）ランスポデーゼ産生
におけるＲＮＡ分子の調節効果は知られていたが、ＥＮ
Ａ阻害技術の重要性、その普遍性（の可能性）、および
利用が認識されたのはごく最近、すなわち、天然のアン
チセンスｏｍｐＦ ＲＮＡが発見されて以来である。外
膜タンパク質の大腸菌遺伝子ｏｍｐｃおよびｏｍｐＦの
発現は培養メジウムの浸透圧に依存している。これらの
外膜タンパク質は、小さな親水性分子の拡散孔としての
役割をもっている。これらのタンパク質の総量は一定に
保持されているが、相互の割合はメジウムの浸透圧に依
存する。高滲透圧の場合は、外膜は主としてＯｍｐＣと
きわめてわずかのｏｒｎｐＦから構成されている。高浸
透圧の場合は実は、ａｍｐｃの二方向性転写が起こるの
である。このようにして得られた天然のアンチセンス転
写体は、長さ１７４ヌクレオチＶで、ｏｍｐＦ ＲＮＡ
の翻訳開始領域と相補性で、ｏｍｐＦタンパク質の産生
を阻害する。
におけるＲＮＡ分子の調節効果は知られていたが、ＥＮ
Ａ阻害技術の重要性、その普遍性（の可能性）、および
利用が認識されたのはごく最近、すなわち、天然のアン
チセンスｏｍｐＦ ＲＮＡが発見されて以来である。外
膜タンパク質の大腸菌遺伝子ｏｍｐｃおよびｏｍｐＦの
発現は培養メジウムの浸透圧に依存している。これらの
外膜タンパク質は、小さな親水性分子の拡散孔としての
役割をもっている。これらのタンパク質の総量は一定に
保持されているが、相互の割合はメジウムの浸透圧に依
存する。高滲透圧の場合は、外膜は主としてＯｍｐＣと
きわめてわずかのｏｒｎｐＦから構成されている。高浸
透圧の場合は実は、ａｍｐｃの二方向性転写が起こるの
である。このようにして得られた天然のアンチセンス転
写体は、長さ１７４ヌクレオチＶで、ｏｍｐＦ ＲＮＡ
の翻訳開始領域と相補性で、ｏｍｐＦタンパク質の産生
を阻害する。
バクテリオファージデフ突然変異体における遺伝子１．
１の翻訳趣断についても、大腸菌ｃＡＭＰレセプタータ
ンパク質の合成の調節と同様、アンチセンス調節系が同
じく想定されている。アンチセンスＲＮＡはファージラ
ムダの発生における調節因子の１種である。Ｑタンパク
質およびＯＦＦ ＲＩＪＡ両者の合成は、多分、天然の
アンチセンス転写体によって制御されている。サルモネ
ラファージｐ２２のアンチリゾレッサータンパク質の合
成も、同様に、天然のアンチセンス転写体によって負の
調節を受けている。
１の翻訳趣断についても、大腸菌ｃＡＭＰレセプタータ
ンパク質の合成の調節と同様、アンチセンス調節系が同
じく想定されている。アンチセンスＲＮＡはファージラ
ムダの発生における調節因子の１種である。Ｑタンパク
質およびＯＦＦ ＲＩＪＡ両者の合成は、多分、天然の
アンチセンス転写体によって制御されている。サルモネ
ラファージｐ２２のアンチリゾレッサータンパク質の合
成も、同様に、天然のアンチセンス転写体によって負の
調節を受けている。
アンチセンス阻害機構は、内因性に生物体内に存在する
および／または実験的に細胞内に導入される遺伝子の発
現を制御するためにも、実験的に応用できる。この目的
では、合成オリゴヌクレオチ１？ ｔ タハｉｎ ｖｌ
ｔｒｏで合成されたアンチセンスＲＮＡを細胞内に導入
することができる。さらに、アンチセンス遺伝子を細胞
内に導入することもでき、これがｉｎ ｖｆｖｏでアン
チセンスＲ２ＪＡを産生する。
および／または実験的に細胞内に導入される遺伝子の発
現を制御するためにも、実験的に応用できる。この目的
では、合成オリゴヌクレオチ１？ ｔ タハｉｎ ｖｌ
ｔｒｏで合成されたアンチセンスＲＮＡを細胞内に導入
することができる。さらに、アンチセンス遺伝子を細胞
内に導入することもでき、これがｉｎ ｖｆｖｏでアン
チセンスＲ２ＪＡを産生する。
合成相補性オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒ。
およびｉｎ ｖｉｖｏの両者で、ｍＲＮＡへのハイブリ
ダイゼーションによって、原核生物におけるａ訳を阻害
する。バクテリオファージＴ４の遺伝子６２は、７アー
ジＤＮＡの複製、組換えおよび修復にきわめて重要な役
割を果たすタンパク質をコードしている。遺伝子３２タ
ンパク質合成（Ｄ ｔｎ ｖｉｔｒ。
ダイゼーションによって、原核生物におけるａ訳を阻害
する。バクテリオファージＴ４の遺伝子６２は、７アー
ジＤＮＡの複製、組換えおよび修復にきわめて重要な役
割を果たすタンパク質をコードしている。遺伝子３２タ
ンパク質合成（Ｄ ｔｎ ｖｉｔｒ。
調節は、遺伝子３２ ｍＲＮＡのリポソーム結合部位に
相補性の１０−マーおよび１５−マー合成オリゴヌクレ
オチげによって可能であることが明らかにされた（トウ
ールメら：ＰＮＡＳＸ第８３巻、第１２２７〜１２３１
頁、１９８６年）。
相補性の１０−マーおよび１５−マー合成オリゴヌクレ
オチげによって可能であることが明らかにされた（トウ
ールメら：ＰＮＡＳＸ第８３巻、第１２２７〜１２３１
頁、１９８６年）。
転写体の限られた寿命のため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ア
ンチセンスＲＮＡまたは相補性オリゴヌクレオチＰの細
胞内へのマイクロインジェクション後に得られる効果は
、本来、一過性にすぎなめ０アンチセンス遺伝子を細胞
内に導入し、それがそこに安定に維持された場合には、
細胞自体が（アンチセンス遺伝子の転写が起これば）
ｉｎ ｖｉｖｏでアンチセンスＲＮＡを産生できること
になる。こうすればアンチセンス阻害によって生じる効
果は、合成オリゴヌクレオチドを用いた場合に得られる
阻害に比べて長く持続する。
ンチセンスＲＮＡまたは相補性オリゴヌクレオチＰの細
胞内へのマイクロインジェクション後に得られる効果は
、本来、一過性にすぎなめ０アンチセンス遺伝子を細胞
内に導入し、それがそこに安定に維持された場合には、
細胞自体が（アンチセンス遺伝子の転写が起これば）
ｉｎ ｖｉｖｏでアンチセンスＲＮＡを産生できること
になる。こうすればアンチセンス阻害によって生じる効
果は、合成オリゴヌクレオチドを用いた場合に得られる
阻害に比べて長く持続する。
エリシンら（ジャーナル唸オプ・バイオロジカル−ケミ
ストリー、第２６０巻、第９０８５〜９０８７頁、１９
８５年）およびペスヵら（ＰＡＮＳ。
ストリー、第２６０巻、第９０８５〜９０８７頁、１９
８５年）およびペスヵら（ＰＡＮＳ。
第８１巻、第７５２５〜７５２８頁）は、ファーシンム
ダのＰＬ ｙ°ＯモーターおよびｔＢリプレッサ突然変
異体を月Ｊ−て、ｌ−ガラクトシダーゼ産生に対するア
ンチセンスβ−ガラクトシダーゼ（１ａｏｚ ）プラス
ミドの作用を試験した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシ）’ ） 含有メジウム中４
２℃において、アンチセンス’１ａｃＺ含有プラスミド
の存在は、大腸菌細胞中β−ガラクトシダーゼレベルの
それぞれ８０％および９８％低下を招来した。β−ガラ
クトシダゼ、ラクトースパーミアーゼ、およびトランス
アセチラーゼは同じポリジストロニックｍＲＮＡから生
成する。アンチセンスβ−ガラクトシダーゼＲＮＡを形
成させた場合は、ラクトースパーミアーゼ性は８０％、
チオガラクトシダーゼトランスアセチラーゼ活性は５５
％低下した。他のｍＲＮＡ鋳型から生成されるアルカリ
ホスファターゼの合成はしかしながら、阻害されなかっ
た。
ダのＰＬ ｙ°ＯモーターおよびｔＢリプレッサ突然変
異体を月Ｊ−て、ｌ−ガラクトシダーゼ産生に対するア
ンチセンスβ−ガラクトシダーゼ（１ａｏｚ ）プラス
ミドの作用を試験した。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシ）’ ） 含有メジウム中４
２℃において、アンチセンス’１ａｃＺ含有プラスミド
の存在は、大腸菌細胞中β−ガラクトシダーゼレベルの
それぞれ８０％および９８％低下を招来した。β−ガラ
クトシダゼ、ラクトースパーミアーゼ、およびトランス
アセチラーゼは同じポリジストロニックｍＲＮＡから生
成する。アンチセンスβ−ガラクトシダーゼＲＮＡを形
成させた場合は、ラクトースパーミアーゼ性は８０％、
チオガラクトシダーゼトランスアセチラーゼ活性は５５
％低下した。他のｍＲＮＡ鋳型から生成されるアルカリ
ホスファターゼの合成はしかしながら、阻害されなかっ
た。
ｉｎ ｖｉｖｏアンチセンス調節は、リポタンパク質（
ｌｐｐ ）ならびに外膜タンパク質ａｍｐｃおよびｏｍ
ｐＦをコードする大腸菌遺伝子でもＩＰＴＧ誘導、１ｐ
ｐ 、 ｏｍｐＣまたはｏｍｐＦ発現ベクターによっ
て起こル（コールマンら：セル、１３７ｓ、第４２９〜
４３６頁、１９８４年）。
ｌｐｐ ）ならびに外膜タンパク質ａｍｐｃおよびｏｍ
ｐＦをコードする大腸菌遺伝子でもＩＰＴＧ誘導、１ｐ
ｐ 、 ｏｍｐＣまたはｏｍｐＦ発現ベクターによっ
て起こル（コールマンら：セル、１３７ｓ、第４２９〜
４３６頁、１９８４年）。
アンチセンスＲＮＡは、細胞遺伝子の発現を遮断するた
めにも使用できる。さらに、外部から細胞内へ侵入した
有害ウィルス遺伝子を類似の調節機構によって無効にす
ることもできる。高等なを椎動物では、このような有害
なウィルスは免疫系によって無効にすることができる。
めにも使用できる。さらに、外部から細胞内へ侵入した
有害ウィルス遺伝子を類似の調節機構によって無効にす
ることもできる。高等なを椎動物では、このような有害
なウィルスは免疫系によって無効にすることができる。
すなわち、生体異物高分子に対する反応として、望まし
くない分子に対する高特異的親和性を有するタンパク質
（抗体）が生成される。生体は、血中に相貫する抗体が
存在する限り有害なウィルスに対して免疫となる。すな
わち、抗体がその後の感染から生体を保護する。アンチ
センスＲＮＡ技術は、病原に対する「免疫系」としても
使用でき、この場合、免疫を生じる高特異的分子は抗体
（タンパク質ではなく、アンチセンスＲＮＡ分子である
。このようなアンチセンス１−免役系」のモデル系とし
て、コールマンら（ネイチャー、第３１５巻、第６０１
〜６０６頁、１９８５年）は、アンチセンスフアジ５Ｐ
ＤＮＡ’ｉ、このコリファージによる感染を防止するた
めに大腸菌内に導入した。アンチセンス７アージコート
タンパク質ＤＮＡおよび／またはアンチ七ンス７アージ
レプリカーゼをもつプラスミｒで大腸菌を形質転換した
。工ＰＴＧ誘導によって多くのアンチセンスＲＮＡが形
成された場合、ファージ感染後も、バクテリア細胞の溶
菌は起こらなかった。プラーク形成の９０％以上の阻害
を生じた。３Ｈ−ロイシンを用いた実験では、他のタン
パク質の合成は影響されないことが明らかになった。そ
の後、アンチセンスファージｓｐプロティンＡシラスミ
ドは大腸菌中で、７アージｓｐ感染に対するさらに強力
な、はぼ完全な抵抗性を与えることが見出された。アン
チセンス「免疫系」は、特定のウィルスの増殖を効果的
に阻害できる。
くない分子に対する高特異的親和性を有するタンパク質
（抗体）が生成される。生体は、血中に相貫する抗体が
存在する限り有害なウィルスに対して免疫となる。すな
わち、抗体がその後の感染から生体を保護する。アンチ
センスＲＮＡ技術は、病原に対する「免疫系」としても
使用でき、この場合、免疫を生じる高特異的分子は抗体
（タンパク質ではなく、アンチセンスＲＮＡ分子である
。このようなアンチセンス１−免役系」のモデル系とし
て、コールマンら（ネイチャー、第３１５巻、第６０１
〜６０６頁、１９８５年）は、アンチセンスフアジ５Ｐ
ＤＮＡ’ｉ、このコリファージによる感染を防止するた
めに大腸菌内に導入した。アンチセンス７アージコート
タンパク質ＤＮＡおよび／またはアンチ七ンス７アージ
レプリカーゼをもつプラスミｒで大腸菌を形質転換した
。工ＰＴＧ誘導によって多くのアンチセンスＲＮＡが形
成された場合、ファージ感染後も、バクテリア細胞の溶
菌は起こらなかった。プラーク形成の９０％以上の阻害
を生じた。３Ｈ−ロイシンを用いた実験では、他のタン
パク質の合成は影響されないことが明らかになった。そ
の後、アンチセンスファージｓｐプロティンＡシラスミ
ドは大腸菌中で、７アージｓｐ感染に対するさらに強力
な、はぼ完全な抵抗性を与えることが見出された。アン
チセンス「免疫系」は、特定のウィルスの増殖を効果的
に阻害できる。
３）真核生物におけるアンチセンスＲＮＡタンパク質合
成のための鋳型としてのほかに、ＲＮＡは真核生物中で
調節過程においても天然に使用されている。真核生物ｍ
ＲＮＡにおける分子内塩基対合は二次構造の生成を招き
、これによって転写体の翻訳が阻害される。しかしなが
ら、アンチセンス阻害機構には、分子間塩基対合がある
。
成のための鋳型としてのほかに、ＲＮＡは真核生物中で
調節過程においても天然に使用されている。真核生物ｍ
ＲＮＡにおける分子内塩基対合は二次構造の生成を招き
、これによって転写体の翻訳が阻害される。しかしなが
ら、アンチセンス阻害機構には、分子間塩基対合がある
。
ｍＲＮＡは、細胞質中でも核中でもいしばしばタンパク
質と関連づけられてきた。真核生物内でのアンチセンス
ＲＮＡ技術の可能性を考える場合、問題のｍＲＮＡのは
かに、それと会合したタンパク質も重要な役割を来たし
ている可能性があることを悟るべきである。ｍＲＮＡス
ゾライシングは、二重鎖ＲＮＡハイブリダイゼーション
が起こる天然過程の一例である。小さなリボ核タンパク
質粒子と会合した５ｎＲＮＡ （小さな核ＨＭＡ ）が
その中で大きな役割を果たしている。
質と関連づけられてきた。真核生物内でのアンチセンス
ＲＮＡ技術の可能性を考える場合、問題のｍＲＮＡのは
かに、それと会合したタンパク質も重要な役割を来たし
ている可能性があることを悟るべきである。ｍＲＮＡス
ゾライシングは、二重鎖ＲＮＡハイブリダイゼーション
が起こる天然過程の一例である。小さなリボ核タンパク
質粒子と会合した５ｎＲＮＡ （小さな核ＨＭＡ ）が
その中で大きな役割を果たしている。
真核生物から単離されたある種のＲＮＡはｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの翻訳に影響できる。ヒナ胚からの筋肉組織には
、ミオシン重鎖（ＭＨＣ） ｍＲＮＡの翻訳を阻害する
ｔｃＲＮＡ （翻訳制御ＲＮＡ ）が存在する。
ｒｏでの翻訳に影響できる。ヒナ胚からの筋肉組織には
、ミオシン重鎖（ＭＨＣ） ｍＲＮＡの翻訳を阻害する
ｔｃＲＮＡ （翻訳制御ＲＮＡ ）が存在する。
ＭＨＣｍＲＮＡの５′末端は、長さ１０２ヌクレオチド
のｔｃＲＮＡの３′末端と高度に相補性であるから、こ
のｔ ｃＲＮＡはＭＨ（：’ ｍＲＮＡの天然アンチセ
ンスＲＮＡであると想定される。
のｔｃＲＮＡの３′末端と高度に相補性であるから、こ
のｔ ｃＲＮＡはＭＨ（：’ ｍＲＮＡの天然アンチセ
ンスＲＮＡであると想定される。
ヒナ胚筋肉組織からはまた、タンパク質と複合体を形成
する他の短い転写体も単離されている。
する他の短い転写体も単離されている。
これらの転写体は上述の５ｎＲＮＡおよびｔｃＲＮＡと
は異なり、ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳開始の強力なインヒビタ
ーである。
は異なり、ｉｎ ｖｉｖｏ翻訳開始の強力なインヒビタ
ーである。
真核生物アンチセンス転写体が、多分タンパク質と複合
体を作る小ＲＮＡから構成されることは考えられる。こ
の点から、真核生物には機能不明の多くの小転写体が存
在することは興味がある。その例は、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ（ＤＨＦＲ）のマウス遺伝子の５′末端側領域
中に転写される小さな核ＲＮＡである。これらの／Ｊ％
ＲＮＡとＤＨＰＲｍＲＮＡの合成は反対方向に起こり
、これらは互いに部分的に相補性である。これらのｌ」
・ＩＩＮＡの機能はまだわかっていない。マウス染色体
上には、２種のｍＦｔＮＡの転写が反対方向に起こる領
域がさら例存在し、６′非翻訳末端は１３３ｂｐ：ｉｆ
複する。これらの転写体の機能は不明である。
体を作る小ＲＮＡから構成されることは考えられる。こ
の点から、真核生物には機能不明の多くの小転写体が存
在することは興味がある。その例は、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ（ＤＨＦＲ）のマウス遺伝子の５′末端側領域
中に転写される小さな核ＲＮＡである。これらの／Ｊ％
ＲＮＡとＤＨＰＲｍＲＮＡの合成は反対方向に起こり
、これらは互いに部分的に相補性である。これらのｌ」
・ＩＩＮＡの機能はまだわかっていない。マウス染色体
上には、２種のｍＦｔＮＡの転写が反対方向に起こる領
域がさら例存在し、６′非翻訳末端は１３３ｂｐ：ｉｆ
複する。これらの転写体の機能は不明である。
ショウジヨウバエのｒツムでも、相対するＤＮＡ鎖上に
１複転写単位が生じる。この場合、ドーパデカルボキシ
ラーゼｍＲＮＡの３′末端をコードするデノム領域と機
能不明のｍＲＮＡの６′末端との間に８８ ｂ：ｐの重
複が起こる。キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ ）も
アンチセンス調節系をもつ可能性がある。ＣＭＶのｒツ
ムは一本鎖ＲＮＡから構成される。一部のＣＭＶ ＲＮ
Ａ単離において、ＣＭＶ中に一般に存在するＲＮＡ集団
に加えて、小さな一本鎖ＲＮＡ。
１複転写単位が生じる。この場合、ドーパデカルボキシ
ラーゼｍＲＮＡの３′末端をコードするデノム領域と機
能不明のｍＲＮＡの６′末端との間に８８ ｂ：ｐの重
複が起こる。キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ ）も
アンチセンス調節系をもつ可能性がある。ＣＭＶのｒツ
ムは一本鎖ＲＮＡから構成される。一部のＣＭＶ ＲＮ
Ａ単離において、ＣＭＶ中に一般に存在するＲＮＡ集団
に加えて、小さな一本鎖ＲＮＡ。
ＣＭＶサテライ） ＲＮＡが見出される。このサテライ
トＲＮＡは、その複製にＣＭＶ機能を要求する。ＣＭＶ
Ｑ株では、このサテライトＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで
ＣＭＶコートタンパク質遺伝子に結合する。２６ヌクレ
オチドの短い相補性配列の存在がわかっているので、サ
テライ） ＲＮＡは多分コートタンパク質の周囲Ｋ Ｒ
ＩＪＡを巻きつけていると思われる。サテライ） ＲＮ
Ａのこのコートタンパク質への結合がコートタンパク質
の合成を調節するとするのが考えやすい。アンチセンス
ＲＮＡ ｐ節では、アンチセンスＲＮＡ ： ｍＲＮＡ
ハイブリダイゼーションが起こり、したがって二重ａ
ＲＮＡが形成される。アフリカッメガエル卵母細胞のＲ
ＮＡ抽出液にはｄｅＲＮＡが実際に存在し、注射された
卵母細胞では、ｉｎ ＶｉｔｒＯでもｉｎ ｖｉｖｏで
もこのｄｅＲＮＡの翻訳の進行は悪い。
トＲＮＡは、その複製にＣＭＶ機能を要求する。ＣＭＶ
Ｑ株では、このサテライトＲＮＡはｉｎ ｖｉｔｒｏで
ＣＭＶコートタンパク質遺伝子に結合する。２６ヌクレ
オチドの短い相補性配列の存在がわかっているので、サ
テライ） ＲＮＡは多分コートタンパク質の周囲Ｋ Ｒ
ＩＪＡを巻きつけていると思われる。サテライ） ＲＮ
Ａのこのコートタンパク質への結合がコートタンパク質
の合成を調節するとするのが考えやすい。アンチセンス
ＲＮＡ ｐ節では、アンチセンスＲＮＡ ： ｍＲＮＡ
ハイブリダイゼーションが起こり、したがって二重ａ
ＲＮＡが形成される。アフリカッメガエル卵母細胞のＲ
ＮＡ抽出液にはｄｅＲＮＡが実際に存在し、注射された
卵母細胞では、ｉｎ ＶｉｔｒＯでもｉｎ ｖｉｖｏで
もこのｄｅＲＮＡの翻訳の進行は悪い。
まだ証明されてはいないが、このように、アンチセンス
ＲＮＡは原核生物のみでなく、真核生物においても、天
然の調節機構であることを支持する徴候がある。
ＲＮＡは原核生物のみでなく、真核生物においても、天
然の調節機構であることを支持する徴候がある。
内因性遺伝子または細胞内に実験的に導入した遺伝子の
発現のアンチセンスＲＮＡによる阻害は、真核生物でも
可能である。この目的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し
たアンチセンスＪ’ｉＮＡまたは合成相補性オリゴヌク
レオチドを細胞内に導入できる。さらに、細胞内に導入
したアンチセンス遺伝子の転写をｉｎ ｖｉｖｏアンチ
センスＲＮＡ産生のために使用できる。
発現のアンチセンスＲＮＡによる阻害は、真核生物でも
可能である。この目的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し
たアンチセンスＪ’ｉＮＡまたは合成相補性オリゴヌク
レオチドを細胞内に導入できる。さらに、細胞内に導入
したアンチセンス遺伝子の転写をｉｎ ｖｉｖｏアンチ
センスＲＮＡ産生のために使用できる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＃ｊ４訳系においては、翻訳はｍＲ
ＮＡ ：ｃ ＤＮＡハイブリッド形成後およびｍＲＮＡ
： ＲＮＡハイブリッド形成後のいずれでも阻害され
る。
ＮＡ ：ｃ ＤＮＡハイブリッド形成後およびｍＲＮＡ
： ＲＮＡハイブリッド形成後のいずれでも阻害され
る。
ある生物学的系におりて、（アンチセンス）遺伝子の安
定な形質転換のためＫどの方法も利用できない場合、ま
たは動車的な発現ベクターが知られていない場合には、
ｉｎ ＶｉｔｒＯで合成したアンチセンスＲＮＡを、マ
イクロインジェクションにより、各細胞に直接導入する
ことができる。
定な形質転換のためＫどの方法も利用できない場合、ま
たは動車的な発現ベクターが知られていない場合には、
ｉｎ ＶｉｔｒＯで合成したアンチセンスＲＮＡを、マ
イクロインジェクションにより、各細胞に直接導入する
ことができる。
メルトン（ＲＮＡ８ 、第８２巻、第１４４〜１４８頁
、１９８５年）は、アフリカッメガエル卵母細胞におけ
るβ−グロビンの生成に対するアンチセンスβ−グロビ
ンＲＮＡの存在の影響を調べた。アフリカッメガエルβ
−グロビンｍＲＮＡおよびアンチセンスβ−グロビンＲ
ＮＡはいずれもバクテリオファージＥＩ Ｐ ６ＲＮＡ
ポリメラーゼ系を用いてｉｎ ｖｉｔｒ。
、１９８５年）は、アフリカッメガエル卵母細胞におけ
るβ−グロビンの生成に対するアンチセンスβ−グロビ
ンＲＮＡの存在の影響を調べた。アフリカッメガエルβ
−グロビンｍＲＮＡおよびアンチセンスβ−グロビンＲ
ＮＡはいずれもバクテリオファージＥＩ Ｐ ６ＲＮＡ
ポリメラーゼ系を用いてｉｎ ｖｉｔｒ。
で合成した。ｊＩＲ常グロビ／を生成しない卵母細胞の
細胞質内にグロビンｍＲＮＡをマイクロインジェクショ
ンすると、グロビンの合成か起こる。最初にアンチセン
ス、５ｑ間後にセンスグロビンＲＨＡを注射するが、ま
たはこれらの２種の転η体の同時注射を行ったところ、
グロビンの合成は完全に阻害された（アンチセンス：セ
ンスの比＝５０：１）。
細胞質内にグロビンｍＲＮＡをマイクロインジェクショ
ンすると、グロビンの合成か起こる。最初にアンチセン
ス、５ｑ間後にセンスグロビンＲＨＡを注射するが、ま
たはこれらの２種の転η体の同時注射を行ったところ、
グロビンの合成は完全に阻害された（アンチセンス：セ
ンスの比＝５０：１）。
しかしながら、ナでにａ胸中に存在するｍＲＨＡの完全
阻害を達成することは困難であることがわかった。最初
にセンス、５時間後にアンチセンスグロビンＨＭＡを細
胞内に注射した場合は、１０倍のグロビン合成阻害を生
じたにすぎなかった。この観察ハ、アンチセンスグロビ
ンＥＮＡはグロビンの翻訳を阻害するが、ｎ＋ＲＮＡが
ポリソーム中に達したのちには阻害程度は低下すること
を示唆している。阻害はきわめて特異的であって、関係
のない転写体の翻訳は影響されなかった。アフリカッメ
ガエル卵母細胞中に注射したチミジンキナーゼ（Ｔ Ｋ
） ｍＲＮＡ、および注射されたクロラムフェニコー
ルアセテールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）遺伝子の
発現も、それぞれアンチセンスＴ Ｋ ＲＮＡおよびア
ンチセンスＣＡＴ ＲＮＡで阻害することができる。
阻害を達成することは困難であることがわかった。最初
にセンス、５時間後にアンチセンスグロビンＨＭＡを細
胞内に注射した場合は、１０倍のグロビン合成阻害を生
じたにすぎなかった。この観察ハ、アンチセンスグロビ
ンＥＮＡはグロビンの翻訳を阻害するが、ｎ＋ＲＮＡが
ポリソーム中に達したのちには阻害程度は低下すること
を示唆している。阻害はきわめて特異的であって、関係
のない転写体の翻訳は影響されなかった。アフリカッメ
ガエル卵母細胞中に注射したチミジンキナーゼ（Ｔ Ｋ
） ｍＲＮＡ、および注射されたクロラムフェニコー
ルアセテールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）遺伝子の
発現も、それぞれアンチセンスＴ Ｋ ＲＮＡおよびア
ンチセンスＣＡＴ ＲＮＡで阻害することができる。
異種遺伝子のほかに、内因性遺伝子も、細胞中にアンチ
センスＲＮＡを注射することにより、アンチセンス法で
阻害できる。クリュツペル（Ｋｒ ）遺伝子はショウジ
ヨウバエの胚の卵割の調節にきわめて重要な機能を有す
る。Ｋｒ ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、胚
の表現型には何ら影響しない。アンチセンスＫｒ ＲＮ
Ａのマイクロインジェクションは、アンチセンスＲＮＡ
の投与蓋に依存した軽度ないし強度（致死）の表現型応
答を与えた（ロゼンベルグら：ネイチャ−、第３１６巻
、第７０３〜７０６頁、１９８５年）。
センスＲＮＡを注射することにより、アンチセンス法で
阻害できる。クリュツペル（Ｋｒ ）遺伝子はショウジ
ヨウバエの胚の卵割の調節にきわめて重要な機能を有す
る。Ｋｒ ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、胚
の表現型には何ら影響しない。アンチセンスＫｒ ＲＮ
Ａのマイクロインジェクションは、アンチセンスＲＮＡ
の投与蓋に依存した軽度ないし強度（致死）の表現型応
答を与えた（ロゼンベルグら：ネイチャ−、第３１６巻
、第７０３〜７０６頁、１９８５年）。
以上述べた真核細胞における実験的アンチセンス阻害で
は、（はぼ）完全なｍＲＮＡとノ・イブリダイゼーショ
ンしたアンチセンス転写体が使用された。しかしながら
、アンチセンス転写体は、遺伝子の発現を阻害するため
には、完全なｍＲＮＡとノ・イプリダイゼーションする
必要はない。短い相補性ＲＮＡフラグメントまたはオリ
ゴヌクレオチドでも、タンパク質の合成を阻害できる。
は、（はぼ）完全なｍＲＮＡとノ・イブリダイゼーショ
ンしたアンチセンス転写体が使用された。しかしながら
、アンチセンス転写体は、遺伝子の発現を阻害するため
には、完全なｍＲＮＡとノ・イプリダイゼーションする
必要はない。短い相補性ＲＮＡフラグメントまたはオリ
ゴヌクレオチドでも、タンパク質の合成を阻害できる。
合成オリイヌクレオチドによる発現の阻害には３つの利
点がある。まず第一に、特異的配列を高モル濃度に得る
ことが容易である。さらに、逆方向の遺伝子のクローン
を必要とせず、短いＤＮＡ配列片で十分である。最後に
、５′末端で始まる長い配列は転写時に二次構造に折り
畳まれることがあり、こうなると相補性転写体とのノ・
イブリダイゼーションにはも半殺に立たない。短いオリ
ゴヌクレオチドでは、この問題を生じる頻度ははるかに
少ないか、あるいはこの問題は全く起こらない。
点がある。まず第一に、特異的配列を高モル濃度に得る
ことが容易である。さらに、逆方向の遺伝子のクローン
を必要とせず、短いＤＮＡ配列片で十分である。最後に
、５′末端で始まる長い配列は転写時に二次構造に折り
畳まれることがあり、こうなると相補性転写体とのノ・
イブリダイゼーションにはも半殺に立たない。短いオリ
ゴヌクレオチドでは、この問題を生じる頻度ははるかに
少ないか、あるいはこの問題は全く起こらない。
ｉｎ ｖｉｔｒｏのみでなく、ｉｎ ｖｉｖｏでも、短
い合成オリゴヌクレオチドとのｍＲＮＡ翻訳ハイブリダ
イゼーション（ＨＡＲＴ ）が起こっている。アフリカ
ッメガエル卵母細胞では、異種インターロイキン２およ
び３遺伝子の発現を、これらの遺伝子と１８〜２６７−
合成相補性オリゴヌクレオチドの同時注射によって９５
％以上阻害できる。アフリカッメガエル制球へ、ギャッ
プ結合ｍＲＮＡと相補性のオリゴヌクレオチドをマイク
ロインジェクションすると、ギャップ結合欠失突然変異
体の表現型に相当するアフリカッメガエルを生じる。ヒ
トで細胞リンホトロビックウイルスｍ型または単純ヘル
ペスウィルスＩ型で感染させたヒト細胞において、オリ
イヌクレオチドはウィルスの複製および／またはウィル
ス遺伝子の発現を阻害することができる。多分２０−マ
ーオリゴヌクレオチｒの経時的分解の結果と思われるが
、同じ総量の大用量のオリゴヌクレオテＶを一回に添加
するよりも感染後毎日添加する方がより効果的に阻害さ
れた。
い合成オリゴヌクレオチドとのｍＲＮＡ翻訳ハイブリダ
イゼーション（ＨＡＲＴ ）が起こっている。アフリカ
ッメガエル卵母細胞では、異種インターロイキン２およ
び３遺伝子の発現を、これらの遺伝子と１８〜２６７−
合成相補性オリゴヌクレオチドの同時注射によって９５
％以上阻害できる。アフリカッメガエル制球へ、ギャッ
プ結合ｍＲＮＡと相補性のオリゴヌクレオチドをマイク
ロインジェクションすると、ギャップ結合欠失突然変異
体の表現型に相当するアフリカッメガエルを生じる。ヒ
トで細胞リンホトロビックウイルスｍ型または単純ヘル
ペスウィルスＩ型で感染させたヒト細胞において、オリ
イヌクレオチドはウィルスの複製および／またはウィル
ス遺伝子の発現を阻害することができる。多分２０−マ
ーオリゴヌクレオチｒの経時的分解の結果と思われるが
、同じ総量の大用量のオリゴヌクレオテＶを一回に添加
するよりも感染後毎日添加する方がより効果的に阻害さ
れた。
ヒナ胚線維芽細胞中でのラウス肉腫ウィルス産生および
感染マウスＬ細胞中での水液性口内炎ウィルスの合成は
、それぞれオリがヌクレオチドおよびオリイヌフレオシ
Ｐで阻害される（ヌクレオシドはヌクレアーゼ加水分解
に抵抗性で、培養哺乳動物細胞中に侵入できる）。
感染マウスＬ細胞中での水液性口内炎ウィルスの合成は
、それぞれオリがヌクレオチドおよびオリイヌフレオシ
Ｐで阻害される（ヌクレオシドはヌクレアーゼ加水分解
に抵抗性で、培養哺乳動物細胞中に侵入できる）。
アンチセンスＲＮＡまたは相補性オリゴヌクレオｆＹ（
Ｄ細胞中への直接マイクロインジェクションは実験期間
中のアンチセンスＲＮＡの量を修飾することを可能にす
るが、生育中の生物体の場合にはアンチセンスＲＮＡは
経過中に希釈されまた分解されるので、アンチセンスＲ
ＮＡをくり返し注射しなければならない。また、細胞は
小さく、接近が難しいので、多くの細胞に注射を行うこ
とはできない。培養メジウム中の高濃度のヌクレオチド
の存在による細胞の形質転換も他の可能なアプローチで
はある。しかしながら、細胞をそれ自体のアンチセンス
ＲＮＡを産生するように刺激できれば、アンチセンスＲ
ＮＡ阻害法はより広範囲に応用できるようになると思わ
れる。細胞中に導入されたアンチセンス遺伝子による十
分なアンチセンス転写体の産生には、有効なプロモータ
ーが第一の必須要件である。細胞の正常な生育および発
生に必須な遺伝子を永久的に不活化することはできない
ので、アンチセンスＲＮＡの合成を制御できるような誘
導プロモーターであることも望ましい。
Ｄ細胞中への直接マイクロインジェクションは実験期間
中のアンチセンスＲＮＡの量を修飾することを可能にす
るが、生育中の生物体の場合にはアンチセンスＲＮＡは
経過中に希釈されまた分解されるので、アンチセンスＲ
ＮＡをくり返し注射しなければならない。また、細胞は
小さく、接近が難しいので、多くの細胞に注射を行うこ
とはできない。培養メジウム中の高濃度のヌクレオチド
の存在による細胞の形質転換も他の可能なアプローチで
はある。しかしながら、細胞をそれ自体のアンチセンス
ＲＮＡを産生するように刺激できれば、アンチセンスＲ
ＮＡ阻害法はより広範囲に応用できるようになると思わ
れる。細胞中に導入されたアンチセンス遺伝子による十
分なアンチセンス転写体の産生には、有効なプロモータ
ーが第一の必須要件である。細胞の正常な生育および発
生に必須な遺伝子を永久的に不活化することはできない
ので、アンチセンスＲＮＡの合成を制御できるような誘
導プロモーターであることも望ましい。
チミジンキナーゼ遺伝子による実験で、人工的アンチセ
ンス遺伝子を、真核生物における特定の遺伝子の発現の
調節に使用できることが明らかにされた。ＴＫマイナス
マウス細胞にセンスＴＫ遺伝子をもつプラスミＰを導入
すると、細胞内にＴＫ酵素の活性が生じる。センスＴＫ
遺伝子に対して１００倍過剰のアンチセンスＴＫ遺伝子
の（ＴＫマイナス細胞への）同時注射、リン酸カルシウ
ム共沈殿および同時トランスフェクションはいずれも、
センスＴＫ遺伝子のみの導入後に比べて、ＴＫ酵素活性
の９０〜９５％の低下を生じた。
ンス遺伝子を、真核生物における特定の遺伝子の発現の
調節に使用できることが明らかにされた。ＴＫマイナス
マウス細胞にセンスＴＫ遺伝子をもつプラスミＰを導入
すると、細胞内にＴＫ酵素の活性が生じる。センスＴＫ
遺伝子に対して１００倍過剰のアンチセンスＴＫ遺伝子
の（ＴＫマイナス細胞への）同時注射、リン酸カルシウ
ム共沈殿および同時トランスフェクションはいずれも、
センスＴＫ遺伝子のみの導入後に比べて、ＴＫ酵素活性
の９０〜９５％の低下を生じた。
ＴＫをまだ合成してｂだ細胞のオートラジオグラフィー
で ３Ｈチミジン取り込みのきわめて著しい低下が認め
られた。アンチセンスＴＫ遺伝子とともにブロモターを
除去し、そしてセンスＴＫ遺伝子と同時注射したのちに
は、ＴＫ酵素活性の阻害はもう見出されなかった。予想
されたように、アンチセンスＴＫ遺伝子に対するプロモ
ーターが強力なほど、ＴＫ酵累活性の強力な阻害が認め
られた。マウス細胞では、クロラムフェニコールアセテ
ールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）ならびに１ａｃＺ
遺伝子の発現が同様に、それぞれ、センスおよびアンチ
センスＣＡＴ遺伝子を含有するシラスミドの同時注射後
（イずントおよびワイントラウプ：サイエンス、第２２
９巻、第３４５〜３５２Ｎ、１９８５１ならびにセンス
およびアンチセンス１ａｃＺ遺伝子を含有するプラスミ
ドの同時トランスフェクション後（ルピンシュタインら
：コント・ランシュ・ドウ・ラカデミー・デ・シェンス
、第２９９巻、第２７）〜２７４頁、１９８４年〕に阻
害された。マウス線維芽細胞におけるＱ−ｆＯθタンパ
ク質のアンチセンス阻害も起こる。ｃ−ｆｏｓ遺伝子（
フィンケルービスキスージンキンス骨肉腫ウィルストラ
ンスフオーム遺伝子の細胞性相同体）は、哺乳動物細胞
の細胞分裂に重要な役割を果たしている。マウス線維芽
細胞がセンスおよびアンチセンス１ａｃＺ遺伝子を含有
する発現ベクターで形質転換された。センスおよびアン
チセンスｃ−ｆｏｓ転写体の産生は、デキサメサゾン誘
導マウス孔がんウィルス（ＭＭＴＶ ）プロモーターに
よって調節された。デキサメサゾンの存在は、プラスミ
ドにコードされたｃ−ｆｏｅの転写体の５〜６００倍の
増加を生じた。アンチセンスｃ−ｆｏｓ ＲＮＡ ＋７
） ５’キサメサゾン誘導産生により、形質転換体の数
は９０〜９６％低下した。デキサメサゾンを除去すると
直ちにこの阻害は消失し、この過程は可逆性である（ホ
ルトら： ＰＮＡＳ 、第８６巻、第４７９４〜４７９
８頁、１９８６年）。
で ３Ｈチミジン取り込みのきわめて著しい低下が認め
られた。アンチセンスＴＫ遺伝子とともにブロモターを
除去し、そしてセンスＴＫ遺伝子と同時注射したのちに
は、ＴＫ酵素活性の阻害はもう見出されなかった。予想
されたように、アンチセンスＴＫ遺伝子に対するプロモ
ーターが強力なほど、ＴＫ酵累活性の強力な阻害が認め
られた。マウス細胞では、クロラムフェニコールアセテ
ールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）ならびに１ａｃＺ
遺伝子の発現が同様に、それぞれ、センスおよびアンチ
センスＣＡＴ遺伝子を含有するシラスミドの同時注射後
（イずントおよびワイントラウプ：サイエンス、第２２
９巻、第３４５〜３５２Ｎ、１９８５１ならびにセンス
およびアンチセンス１ａｃＺ遺伝子を含有するプラスミ
ドの同時トランスフェクション後（ルピンシュタインら
：コント・ランシュ・ドウ・ラカデミー・デ・シェンス
、第２９９巻、第２７）〜２７４頁、１９８４年〕に阻
害された。マウス線維芽細胞におけるＱ−ｆＯθタンパ
ク質のアンチセンス阻害も起こる。ｃ−ｆｏｓ遺伝子（
フィンケルービスキスージンキンス骨肉腫ウィルストラ
ンスフオーム遺伝子の細胞性相同体）は、哺乳動物細胞
の細胞分裂に重要な役割を果たしている。マウス線維芽
細胞がセンスおよびアンチセンス１ａｃＺ遺伝子を含有
する発現ベクターで形質転換された。センスおよびアン
チセンスｃ−ｆｏｓ転写体の産生は、デキサメサゾン誘
導マウス孔がんウィルス（ＭＭＴＶ ）プロモーターに
よって調節された。デキサメサゾンの存在は、プラスミ
ドにコードされたｃ−ｆｏｅの転写体の５〜６００倍の
増加を生じた。アンチセンスｃ−ｆｏｓ ＲＮＡ ＋７
） ５’キサメサゾン誘導産生により、形質転換体の数
は９０〜９６％低下した。デキサメサゾンを除去すると
直ちにこの阻害は消失し、この過程は可逆性である（ホ
ルトら： ＰＮＡＳ 、第８６巻、第４７９４〜４７９
８頁、１９８６年）。
動物細胞のほかに、アンチセンス阻害は、植物細胞にも
有効に適用されている（エラカーおよびデピス； ＰＮ
ＡＳ 、第８３巻、第５３７２〜５６７６頁、１９８６
年）。この目的では、バクテリアＣＡＴ遺伝子をセンス
またはアンチセンスの方向で、多くの異なる植物遺伝子
プロモーター、すなわちノパリンシンターゼ遺伝子のプ
ロモーター（］）ＮＯＥＩ）、カリフラワーモザイクウ
ィルス５５ Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター（ｐＣａ
ＭＶ ）またはニンジンのフェニルアラニンアンモニア
リアーゼ遺伝子のプロモーター（ｐＰＡＬ ）にカップ
リングさせたプラスミドを構築した。センスおよびアン
チセンスＣＡＴ ｆｆｉ伝子金子含有シラスミドなる割
合で、エレクトロポレーションにより、ニンジンの原形
質体に導入した。センス：アンチセンスＣＡＴ遺伝子含
有プラスミドの比がｉ：ｉｏｏでＣＡＴ酵素活性の９５
％以上の低下を生じた。ＣＡＴ酵素活性の阻害程度はア
ンチセンスプラスミド上のプロモーターの強度に相関し
、アンチセンス転写体がポリ（Ａ）シグナルを含有する
と増大した。
有効に適用されている（エラカーおよびデピス； ＰＮ
ＡＳ 、第８３巻、第５３７２〜５６７６頁、１９８６
年）。この目的では、バクテリアＣＡＴ遺伝子をセンス
またはアンチセンスの方向で、多くの異なる植物遺伝子
プロモーター、すなわちノパリンシンターゼ遺伝子のプ
ロモーター（］）ＮＯＥＩ）、カリフラワーモザイクウ
ィルス５５ Ｓ ＲＮＡ遺伝子のプロモーター（ｐＣａ
ＭＶ ）またはニンジンのフェニルアラニンアンモニア
リアーゼ遺伝子のプロモーター（ｐＰＡＬ ）にカップ
リングさせたプラスミドを構築した。センスおよびアン
チセンスＣＡＴ ｆｆｉ伝子金子含有シラスミドなる割
合で、エレクトロポレーションにより、ニンジンの原形
質体に導入した。センス：アンチセンスＣＡＴ遺伝子含
有プラスミドの比がｉ：ｉｏｏでＣＡＴ酵素活性の９５
％以上の低下を生じた。ＣＡＴ酵素活性の阻害程度はア
ンチセンスプラスミド上のプロモーターの強度に相関し
、アンチセンス転写体がポリ（Ａ）シグナルを含有する
と増大した。
以上述べた真核生物におけるアンチセンス阻害は、阻害
すべきセンス遺伝子が、マイクロインジェクション、ト
ランスフエクションマタハリン酸カルシウム共沈殿によ
って細胞内に実験的に導入されたものであった。このよ
うな人工的遺伝子の発現に加えて、細胞内に内因性に存
在する遺伝子の発現も、アンチセンス遺伝子を細胞内に
導入することによるアンチセンス法で阻害できる。真核
生物の内因性細胞遺伝子が同じくアンチセンス阻害に感
受性であることは、と（ＫＸ ＴＫプラスマウスＬ細胞
におけるチミジンキナーゼ遺伝子、ショクショクバエ組
織培養細胞におけるショウジヨウバエ熱ショックタンパ
ク質２６遺伝子、マウスＬ細胞におけるマウスβ−アク
チン遺伝子、ジクチオステリウム・ジスコジウムにおけ
るムラサキホコリカビジスコイジン１遺伝子、およびビ
ール酵母菌における酵母イソ−１−シトクロームＣ遺伝
子のアンチセンス阻害によって示されている。
すべきセンス遺伝子が、マイクロインジェクション、ト
ランスフエクションマタハリン酸カルシウム共沈殿によ
って細胞内に実験的に導入されたものであった。このよ
うな人工的遺伝子の発現に加えて、細胞内に内因性に存
在する遺伝子の発現も、アンチセンス遺伝子を細胞内に
導入することによるアンチセンス法で阻害できる。真核
生物の内因性細胞遺伝子が同じくアンチセンス阻害に感
受性であることは、と（ＫＸ ＴＫプラスマウスＬ細胞
におけるチミジンキナーゼ遺伝子、ショクショクバエ組
織培養細胞におけるショウジヨウバエ熱ショックタンパ
ク質２６遺伝子、マウスＬ細胞におけるマウスβ−アク
チン遺伝子、ジクチオステリウム・ジスコジウムにおけ
るムラサキホコリカビジスコイジン１遺伝子、およびビ
ール酵母菌における酵母イソ−１−シトクロームＣ遺伝
子のアンチセンス阻害によって示されている。
ロススメインら（ＰＮＡＳＸ第８４巻、第８４３９〜８
４４３頁、１９８７年）は、トマト植物の細菌アグロバ
クテリウム・ツマファシェンスのノパリンシンターゼ遺
伝子（Ｎｏａ ）による形質転換、ついで強力なＣａＭ
Ｖ ３５ Ｓプロモータの制御下のアンチセンスＮｏθ
遺伝子による重感染を行った。
４４３頁、１９８７年）は、トマト植物の細菌アグロバ
クテリウム・ツマファシェンスのノパリンシンターゼ遺
伝子（Ｎｏａ ）による形質転換、ついで強力なＣａＭ
Ｖ ３５ Ｓプロモータの制御下のアンチセンスＮｏθ
遺伝子による重感染を行った。
得られた二重形質転換体ではＮｏｅ酵素活性の低下が認
められた。
められた。
ヨコヤマおよびイマモト（ＰＡＮＳ、第８４巻、第７３
６３〜７３６７頁、１９８７年）によって行われた研究
では、アンチセンス法） ＭＹＣ前Ｊ［ｆ １ＫＫ遺伝
子をシミアンウィルス（ｅＶ）４０プロモーターの制御
下に含有するシラスミドを、原形質体融合によってヒト
前骨髄球白血病細胞系ＨＬ−６０中に導入した。ＭＭＣ
タンパク質の構成産生は７０％低下した。ＭＭＣの発現
は、翻訳のレベルのみでなく転写のレベルでも阻害され
ることが明らかにされた。
６３〜７３６７頁、１９８７年）によって行われた研究
では、アンチセンス法） ＭＹＣ前Ｊ［ｆ １ＫＫ遺伝
子をシミアンウィルス（ｅＶ）４０プロモーターの制御
下に含有するシラスミドを、原形質体融合によってヒト
前骨髄球白血病細胞系ＨＬ−６０中に導入した。ＭＭＣ
タンパク質の構成産生は７０％低下した。ＭＭＣの発現
は、翻訳のレベルのみでなく転写のレベルでも阻害され
ることが明らかにされた。
内因性細胞性遺伝子のほかに、外部から細胞に侵入した
有害な（ウィルス）遺伝子も、アンチセンス法により無
効とすることができる。ひとつの研究は、腫瘍を生じる
ポリオーマウィルスＰｙに関するものである（アミニら
：モルキュラー・アンｒ・セルラー・バイオロジー、第
６巻、第２３０５〜２３１６頁、１９８６年）。Ｐ７ウ
イルスを予め感染させたラット細胞を使用した。
有害な（ウィルス）遺伝子も、アンチセンス法により無
効とすることができる。ひとつの研究は、腫瘍を生じる
ポリオーマウィルスＰｙに関するものである（アミニら
：モルキュラー・アンｒ・セルラー・バイオロジー、第
６巻、第２３０５〜２３１６頁、１９８６年）。Ｐ７ウ
イルスを予め感染させたラット細胞を使用した。
アンチセンスＰｙ Ｑ−日ｒｅ遺伝子（肉腫ウィルスト
２ンスホーム遺伝子の細胞性相同体）を誘導メタ０チオ
ネインプロモーターの後部に有するプラスミＶでこれら
の細胞を形質転換した。このアンチセンス遺伝子のｃｄ
２＋誘導はｐｙでコードされたＣ−８ｒｅタンパク質を
８０〜９０％低下させた。この低下は時間およびＣｄ２
＋濃度に依存した。アンチセンス遺伝子を発現できる細
胞は、３週齢フィッシャーラットに注射したのちも依然
として腫瘍の生育を生じた。細胞をＣｄ２＋で処理しな
かったにもかかわらず、腫瘍の生育は、Ｐｙ含有母細胞
（アンチセンスＣ−８ｒｅ遺伝子は含まない）を注射し
たラットよりも明らかに低下した。多分、これらの動物
における重金属の皮下レベルは、ともかくメタロチオネ
インプロモーターの部分誘導音生じるのに十分高いので
あろう。
２ンスホーム遺伝子の細胞性相同体）を誘導メタ０チオ
ネインプロモーターの後部に有するプラスミＶでこれら
の細胞を形質転換した。このアンチセンス遺伝子のｃｄ
２＋誘導はｐｙでコードされたＣ−８ｒｅタンパク質を
８０〜９０％低下させた。この低下は時間およびＣｄ２
＋濃度に依存した。アンチセンス遺伝子を発現できる細
胞は、３週齢フィッシャーラットに注射したのちも依然
として腫瘍の生育を生じた。細胞をＣｄ２＋で処理しな
かったにもかかわらず、腫瘍の生育は、Ｐｙ含有母細胞
（アンチセンスＣ−８ｒｅ遺伝子は含まない）を注射し
たラットよりも明らかに低下した。多分、これらの動物
における重金属の皮下レベルは、ともかくメタロチオネ
インプロモーターの部分誘導音生じるのに十分高いので
あろう。
発明の説明
本明細書にはじめて記載される発明は、植物または植物
細胞（以下、宿主ともい５）中に存在する遺伝子の発現
に１関連遺伝子童たはそれと十分に相同性の遺伝子をア
ンチセンス方向に含有する組換えＤＮＡの宿主への導入
により、定量的および定性的な両影響を与える、植物ま
たは植物細胞中でのアンチセンスＤＮＡの使用である。
細胞（以下、宿主ともい５）中に存在する遺伝子の発現
に１関連遺伝子童たはそれと十分に相同性の遺伝子をア
ンチセンス方向に含有する組換えＤＮＡの宿主への導入
により、定量的および定性的な両影響を与える、植物ま
たは植物細胞中でのアンチセンスＤＮＡの使用である。
本発明はしたがって、宿主内で活性なプロモーターと、
このプロモーターによって制御され、転写時に、宿主の
ＤＮＡ中に存在する遺伝子の転写時に生成されるＲＮＡ
分子と二重鎖を形成できるアンチセンスＲＮＡ分子を生
成するようなヌクレオチｒ配列を有する遺伝子とからな
る組換えＤＮＡによる、任意の原種の遺伝子操作で得ら
れる植物細胞および植物に関する。
このプロモーターによって制御され、転写時に、宿主の
ＤＮＡ中に存在する遺伝子の転写時に生成されるＲＮＡ
分子と二重鎖を形成できるアンチセンスＲＮＡ分子を生
成するようなヌクレオチｒ配列を有する遺伝子とからな
る組換えＤＮＡによる、任意の原種の遺伝子操作で得ら
れる植物細胞および植物に関する。
さらに詳しくは、本発明は、宿主内で活性なプロモータ
ーと、このプロモーターによって制御され、転写時に、
宿主のＤＮＡ中に存在する二次代謝経路の遺伝子の転写
時に生成されるＲＩＪＡ分子と二重鎖を形成することが
できるアンチセンスＲＮＡ分子を生成するようなヌクレ
オチＰ配列を有する遺伝子とからなる組換えＤＮＡによ
る、任意の原種の遺伝子操作で得られる植物細胞および
植物に関する。
ーと、このプロモーターによって制御され、転写時に、
宿主のＤＮＡ中に存在する二次代謝経路の遺伝子の転写
時に生成されるＲＩＪＡ分子と二重鎖を形成することが
できるアンチセンスＲＮＡ分子を生成するようなヌクレ
オチＰ配列を有する遺伝子とからなる組換えＤＮＡによ
る、任意の原種の遺伝子操作で得られる植物細胞および
植物に関する。
本発明の好まし込態様は、フェニループ口パノイＶ経路
（第１図参照）の植物遺伝子、とくに酵素カルコンシン
ターゼ（ＣＨＳ） 、カルコンフラバノンイソメラーゼ
（ＣＨＩ）およびジヒドロフラボノールレダクターゼ（
ＤＦＲ）の１種をコードする遺伝子に関する。フェニル
ーゾロパノイｒ経路におけるその好まし込位置から、Ｃ
ＨＳ酵素の遺伝子が最も好ましい。導入される遺伝子は
ペチユニアのアンチセンスＣＨＳｃＤＮＡ 、たとえば
フエチュニアハイプリダ、変種バイカレン）３０（Ｖ３
Ｑ）のアンチセンスＣＨＳ（遺伝子Ａ）からなることが
好ましい。このアンチセンス遺伝子はペチユニアに由来
するが、それは異なる植物種、すなわちタバコにおいて
も、ＣＨＳ遺伝子の発現に影響を与えることが明らかに
された。したがって、ペチユニアに由来するこのアンチ
センス遺伝子を用いる場合でも、本発明によるトランス
ジェニック植物細胞または細胞はペチユニアに限定され
るものではない。しかしながら、所望により、関連植物
種の標的遺伝子と高いホモロジーをもつアンチセンス遺
伝子、たとえばアンチセンス方向性のその標的遺伝子自
体を用いて、他の植物種の遺伝子変換植物細胞および植
物を生成させることができる。
（第１図参照）の植物遺伝子、とくに酵素カルコンシン
ターゼ（ＣＨＳ） 、カルコンフラバノンイソメラーゼ
（ＣＨＩ）およびジヒドロフラボノールレダクターゼ（
ＤＦＲ）の１種をコードする遺伝子に関する。フェニル
ーゾロパノイｒ経路におけるその好まし込位置から、Ｃ
ＨＳ酵素の遺伝子が最も好ましい。導入される遺伝子は
ペチユニアのアンチセンスＣＨＳｃＤＮＡ 、たとえば
フエチュニアハイプリダ、変種バイカレン）３０（Ｖ３
Ｑ）のアンチセンスＣＨＳ（遺伝子Ａ）からなることが
好ましい。このアンチセンス遺伝子はペチユニアに由来
するが、それは異なる植物種、すなわちタバコにおいて
も、ＣＨＳ遺伝子の発現に影響を与えることが明らかに
された。したがって、ペチユニアに由来するこのアンチ
センス遺伝子を用いる場合でも、本発明によるトランス
ジェニック植物細胞または細胞はペチユニアに限定され
るものではない。しかしながら、所望により、関連植物
種の標的遺伝子と高いホモロジーをもつアンチセンス遺
伝子、たとえばアンチセンス方向性のその標的遺伝子自
体を用いて、他の植物種の遺伝子変換植物細胞および植
物を生成させることができる。
導入される組換えＤＮＡはともかく、企図された宿主内
で活性で、宿主内にアンチセンス遺伝子の転写の実現を
保証するプロモーターからなるものでなければならない
。一般に、強力なプロモーター、が好ましい。プロモー
ターは構成プロモーターであってもよい。プロモーター
はまた、調節または誘導プロモーターであってもよい。
で活性で、宿主内にアンチセンス遺伝子の転写の実現を
保証するプロモーターからなるものでなければならない
。一般に、強力なプロモーター、が好ましい。プロモー
ターは構成プロモーターであってもよい。プロモーター
はまた、調節または誘導プロモーターであってもよい。
適当な植物プロモーターの例は本技術分野の熟練者には
公知である。きわめて適当なものは、たとえばカリフラ
ワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ ） ３５ ｓゾロモ
ターである。ＣａＭＶ ３５ Ｓプロモーターは発生調
節を受けやすい。生物体の発生時に調節現象によってｍ
ＲＮＡ ／アンチセンスＲＮＡ比が劇的に変化すると、
発生組織内に発現型の変化を招く遺伝子発現バタンか生
じる。特定の化学物質、特殊な照射≦しくは光への暴露
により、または温度変化によって調節または誘導される
ことが可能な様々な植物プロモーターは、本技術分野の
熟練者には公知である。
公知である。きわめて適当なものは、たとえばカリフラ
ワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ ） ３５ ｓゾロモ
ターである。ＣａＭＶ ３５ Ｓプロモーターは発生調
節を受けやすい。生物体の発生時に調節現象によってｍ
ＲＮＡ ／アンチセンスＲＮＡ比が劇的に変化すると、
発生組織内に発現型の変化を招く遺伝子発現バタンか生
じる。特定の化学物質、特殊な照射≦しくは光への暴露
により、または温度変化によって調節または誘導される
ことが可能な様々な植物プロモーターは、本技術分野の
熟練者には公知である。
導入される組換えＤＮＡは、その内部にポリＡ付加シグ
ナルを有する３′末端側領域も包含することが好ましい
。しかし、これは、アンチセンス遺伝子がすでに必要な
ポリＡ付加シグナルを含有することがあるので、常に必
要とは限らない。適当な６′末端側領域の例はノパリン
シンターゼ遺伝子（Ｎｏ！？）の６′テールである。
ナルを有する３′末端側領域も包含することが好ましい
。しかし、これは、アンチセンス遺伝子がすでに必要な
ポリＡ付加シグナルを含有することがあるので、常に必
要とは限らない。適当な６′末端側領域の例はノパリン
シンターゼ遺伝子（Ｎｏ！？）の６′テールである。
本発明は上述のトランスジェニック植物および植物細胞
のみでなく、このようなトランスジェニック植物および
植物細胞を形成するために使用でき、植物プロモーター
およびこのプロモーターによって制御されるアンチセン
ス遺伝子ならびに所望により３′末端側領域からなる組
換えＤＮＡにも関する。
のみでなく、このようなトランスジェニック植物および
植物細胞を形成するために使用でき、植物プロモーター
およびこのプロモーターによって制御されるアンチセン
ス遺伝子ならびに所望により３′末端側領域からなる組
換えＤＮＡにも関する。
本発明の組換えＤＮＡは、本発明の組換えＤＩＪＡに加
えてベクタ一部分からなる組換えＤＮＡベクターの部分
を形成する。本技術分野の熟練者には明らかなように、
ベクタ一部分は、その組換えＤＮＡベクターが適する宿
主系を決定する。一方、多くの宿主系について適当なベ
クターが知られている。
えてベクタ一部分からなる組換えＤＮＡベクターの部分
を形成する。本技術分野の熟練者には明らかなように、
ベクタ一部分は、その組換えＤＮＡベクターが適する宿
主系を決定する。一方、多くの宿主系について適当なベ
クターが知られている。
クローニングの目的では、微生物、とくに大腸菌のよう
な特定の細菌中で複製可能なベクターが通常は使用され
る。この目的には、公知のｐＵＣプラスミｖがきわめて
適当である。本発明の組換えＤＮＡベクターで形質転換
された微生物も本発明に包含される。
な特定の細菌中で複製可能なベクターが通常は使用され
る。この目的には、公知のｐＵＣプラスミｖがきわめて
適当である。本発明の組換えＤＮＡベクターで形質転換
された微生物も本発明に包含される。
植物および植物細胞の形質転換は、適当な植物ベクター
の使用を要する。数種の植物ベクターも本技術分野の熟
練者にはよく知られている。好ましいベクターは、ベバ
ンによってヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、第１２
巻、第８７）１〜８７２１頁に記載されている植物ベク
ターＢ１ｎ１９である。
の使用を要する。数種の植物ベクターも本技術分野の熟
練者にはよく知られている。好ましいベクターは、ベバ
ンによってヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、第１２
巻、第８７）１〜８７２１頁に記載されている植物ベク
ターＢ１ｎ１９である。
本発明の組換えＤＮＡの植物または植物細胞への導入の
効果は、そのまま将来の世代にも表出されるので（将来
の世代における安定性は笑験によって確立されている）
、本発明は、本発明の組換えＤＮＡの遺伝情報を含有す
る遺伝子操作植物または植物細胞の子孫も包含する。
効果は、そのまま将来の世代にも表出されるので（将来
の世代における安定性は笑験によって確立されている）
、本発明は、本発明の組換えＤＮＡの遺伝情報を含有す
る遺伝子操作植物または植物細胞の子孫も包含する。
本発明は、別の目的にも使用できる。−例としては、植
物改良における使用、ならび忙化学剤たとえば細胞抑制
剤および発酵生成物たとえばビルの製造への使用を挙げ
ることができる。
物改良における使用、ならび忙化学剤たとえば細胞抑制
剤および発酵生成物たとえばビルの製造への使用を挙げ
ることができる。
とくに、フラボノイｒすなわち花の着色に関与する特殊
な二次代鮒物の合成における役割を果たす植物遺伝子の
発現に影響するアンチセンス遺伝子を用いた場合、応用
の重要な分野は花の色の改良である。フラボノイｒの生
合成は、第１図に示す全般的フェニルプロパノイＰ経路
の一分岐経路を通って進行する。この経路の最も重要な
酵素を図に示す。図中、ＰＡＬはフェニルアラニンアン
モニアリアーゼ、Ｃ′ｋｉＳはカルコンシンターゼ、Ｃ
Ｈ工はカルコンフラバノンイソメラーゼ、ＤＦＲはジヒ
ドロ７ラボノールレダクターゼである。
な二次代鮒物の合成における役割を果たす植物遺伝子の
発現に影響するアンチセンス遺伝子を用いた場合、応用
の重要な分野は花の色の改良である。フラボノイｒの生
合成は、第１図に示す全般的フェニルプロパノイＰ経路
の一分岐経路を通って進行する。この経路の最も重要な
酵素を図に示す。図中、ＰＡＬはフェニルアラニンアン
モニアリアーゼ、Ｃ′ｋｉＳはカルコンシンターゼ、Ｃ
Ｈ工はカルコンフラバノンイソメラーゼ、ＤＦＲはジヒ
ドロ７ラボノールレダクターゼである。
実験の部から明らかなように、花の色の変化が本発明に
よって実際に得られることは確立している。これらの実
験では、酵素ＣＨＳをコードするＤＮＡ ｉ使用した。
よって実際に得られることは確立している。これらの実
験では、酵素ＣＨＳをコードするＤＮＡ ｉ使用した。
フラボノイド合成のこの分岐経路における鍵酵素はカル
コンシンターゼ（ｃＨｓ ）で、これは３モルのマロニ
ルＣＯＡ 、！： １モルのフマロイルＣｏＡ ｆナリ
ンゲニンカルコンに縮合させる。
コンシンターゼ（ｃＨｓ ）で、これは３モルのマロニ
ルＣＯＡ 、！： １モルのフマロイルＣｏＡ ｆナリ
ンゲニンカルコンに縮合させる。
カルコンフラバノンイソメラーゼ（ＣＨＩ）による異性
化で相当するフラバノンを生じる。さらに還元および置
換が行われてフラボノイｒ花色素が生じる。
化で相当するフラバノンを生じる。さらに還元および置
換が行われてフラボノイｒ花色素が生じる。
大部分の植物遺伝子と同様、ペチユニアハイプリダから
のＣＨＳ遺伝子は多重遺伝子族の一部を形成する。変種
バイオレット３０（Ｖ３０）では１種のＣＨＢ遺伝子（
遺伝子Ａ）が高度に発現される（コズら：ヌクレイツク
・アシツズ・リサーチ、第１４巻、第５２２９〜５２３
９頁、１９８６年：コズらニブラント・モルキュラー・
バイオロジー第１０巻、第１５９〜１６９頁、１９８７
年）。
のＣＨＳ遺伝子は多重遺伝子族の一部を形成する。変種
バイオレット３０（Ｖ３０）では１種のＣＨＢ遺伝子（
遺伝子Ａ）が高度に発現される（コズら：ヌクレイツク
・アシツズ・リサーチ、第１４巻、第５２２９〜５２３
９頁、１９８６年：コズらニブラント・モルキュラー・
バイオロジー第１０巻、第１５９〜１６９頁、１９８７
年）。
第二のＣＨＢ遺伝子（遺伝子Ｊ）は約１０％発現される
。ＣＨＳ−ＡおよびＣＨＢ−Ｊ遺伝子は約８６％の配列
ホモロジーを有する。したがって、両者が同一のアンチ
センスＣＨＳ−Ａ遺伝子によって不活化することが期待
できる。この活性ＣＨＳ遺伝子Ａに相当するｃＤＮＡ
ｆ逆の方向で、カリフラワーモデイクウィルス３５Ｂプ
ロモーターおよびＮｏ８３’テールと融合させる。この
構成をつ−で、植物ベクターＢｉｎ １９にクローン化
する（第２図参照）。
。ＣＨＳ−ＡおよびＣＨＢ−Ｊ遺伝子は約８６％の配列
ホモロジーを有する。したがって、両者が同一のアンチ
センスＣＨＳ−Ａ遺伝子によって不活化することが期待
できる。この活性ＣＨＳ遺伝子Ａに相当するｃＤＮＡ
ｆ逆の方向で、カリフラワーモデイクウィルス３５Ｂプ
ロモーターおよびＮｏ８３’テールと融合させる。この
構成をつ−で、植物ベクターＢｉｎ １９にクローン化
する（第２図参照）。
この構築体を、葉板形質転換法によって、ペチユニアお
よびタバコに導入した。色強度の低下に加えて、バタン
形成、すなわち独立の形質転換体における変化も、はじ
めて観察された。ペチユニアお・よびタバコの両者で、
色素の合成が完全に抑制された完全に白色の花をもつ形
質転換体も得られた。結果は、遺伝子の発現が、アンチ
センスＣＨ３ＤＮＡにより、発生特異的様式で修飾でき
ること、またほぼ完全に低下できることを明らかに示し
て込る。異種植物、たとえばタバコにおけるペチユニア
アンチセンスＣＨＳｃＤＮＡ ｍ集体の活性ハ、ペチユ
ニアとタバコＣＨＢ遺伝子の間の高いホモロジーによっ
て説明できる。現在まで、単離されたＣＨＳ遺伝子はす
べて、高度のホモロジーを有することが明らかにされて
いて、ペテユニアＣＨＢ ｃＤＮＡ構築体はナス科の内
外両者で機能することが期待できる。一方、極内の植物
（ジャガイモ）も釉外の植物（クローバ−）も形質転換
できるので、このＣＨＢ ｃＤＮＡ構築体はさらに一般
的な応用が可能である。また、カルコン７ラバノンイン
メラーゼ（’ＣＨ工）およびジヒドロ７ラボノールレダ
クターゼ（ＤＦＲ）の遺伝子も被テユリアからクローン
化され、アンチセンス構築体が作成された。同じ生合成
経路からのこれらの２釉の遺伝子は同様に、花の色の改
良の分野での可能性を提供する。たとえば、ＣＨＩ発胡
の操作は花弁の拡大部に黄色のカルコンを蓄積させ、新
しい色調の生成を可能にする。
よびタバコに導入した。色強度の低下に加えて、バタン
形成、すなわち独立の形質転換体における変化も、はじ
めて観察された。ペチユニアお・よびタバコの両者で、
色素の合成が完全に抑制された完全に白色の花をもつ形
質転換体も得られた。結果は、遺伝子の発現が、アンチ
センスＣＨ３ＤＮＡにより、発生特異的様式で修飾でき
ること、またほぼ完全に低下できることを明らかに示し
て込る。異種植物、たとえばタバコにおけるペチユニア
アンチセンスＣＨＳｃＤＮＡ ｍ集体の活性ハ、ペチユ
ニアとタバコＣＨＢ遺伝子の間の高いホモロジーによっ
て説明できる。現在まで、単離されたＣＨＳ遺伝子はす
べて、高度のホモロジーを有することが明らかにされて
いて、ペテユニアＣＨＢ ｃＤＮＡ構築体はナス科の内
外両者で機能することが期待できる。一方、極内の植物
（ジャガイモ）も釉外の植物（クローバ−）も形質転換
できるので、このＣＨＢ ｃＤＮＡ構築体はさらに一般
的な応用が可能である。また、カルコン７ラバノンイン
メラーゼ（’ＣＨ工）およびジヒドロ７ラボノールレダ
クターゼ（ＤＦＲ）の遺伝子も被テユリアからクローン
化され、アンチセンス構築体が作成された。同じ生合成
経路からのこれらの２釉の遺伝子は同様に、花の色の改
良の分野での可能性を提供する。たとえば、ＣＨＩ発胡
の操作は花弁の拡大部に黄色のカルコンを蓄積させ、新
しい色調の生成を可能にする。
本発明によって色素の合成の完全な抑制を達成する可能
□性が証明されたことは、ビールの製造に必要な色素を
含まない大麦およびホップを高い収量で実現することの
見通しを開くものである。ジエンデーストリツｒおよび
モラー：カールスパーグ・リサーチ・コミュニケーショ
ン、第４１、第５６〜６４頁、１９８１年に記載されて
いるように、色素はタンパク質と共沈殿を示し、これが
ビールの濁りｆ、住じる。大麦のたとえばアンチセンス
ＣＨＳ遺伝子による形質転換は、色素を除去するための
現行の方法に変法を提供する可能性がある。
□性が証明されたことは、ビールの製造に必要な色素を
含まない大麦およびホップを高い収量で実現することの
見通しを開くものである。ジエンデーストリツｒおよび
モラー：カールスパーグ・リサーチ・コミュニケーショ
ン、第４１、第５６〜６４頁、１９８１年に記載されて
いるように、色素はタンパク質と共沈殿を示し、これが
ビールの濁りｆ、住じる。大麦のたとえばアンチセンス
ＣＨＳ遺伝子による形質転換は、色素を除去するための
現行の方法に変法を提供する可能性がある。
第１図から、フェニルゾロパノイｐ（ｐｐ）経路が興味
あるものであることがわかる。その分岐経路は、生化学
的には関係があるが機能的には異なる化合物、たとえば
フラボノイｒ１ フィトアレキシンおよびリグナンの全
範囲に至るからである。
あるものであることがわかる。その分岐経路は、生化学
的には関係があるが機能的には異なる化合物、たとえば
フラボノイｒ１ フィトアレキシンおよびリグナンの全
範囲に至るからである。
−例として、以下Ｋ ＩＪグナン生合成について述べる
。ポドフィロトキシンのようなリグナン類は野生の熱帯
植物から回収され、細胞抑制剤（たとえば、テニポサイ
ドおよびエトボサイｖ１ ポドフィロトキシン誘導体）
製造の基剤として有用である。倍養植物細胞にアンチセ
ンスＣｌ１Ｓ ｃＤＮＡを導入すると代謝の流れをフェ
ニルアラニンからりダナンの方向に効果的に向けること
が可能となり、収量が増加する。アンチセンスＤＮＡの
使用は、他の二次代謝経路の制御にも、好結果をもたら
すものと考えられる。
。ポドフィロトキシンのようなリグナン類は野生の熱帯
植物から回収され、細胞抑制剤（たとえば、テニポサイ
ドおよびエトボサイｖ１ ポドフィロトキシン誘導体）
製造の基剤として有用である。倍養植物細胞にアンチセ
ンスＣｌ１Ｓ ｃＤＮＡを導入すると代謝の流れをフェ
ニルアラニンからりダナンの方向に効果的に向けること
が可能となり、収量が増加する。アンチセンスＤＮＡの
使用は、他の二次代謝経路の制御にも、好結果をもたら
すものと考えられる。
第１図は、高等植物に存在する二次代謝経路であるフェ
ニルゾロパノイＶ経路を図式的に示した図である。この
経路の分岐路は、フラボノイｖ１フィトアレキシン、リ
グニンおよびリグナンのような４１：化学的に関連があ
るが機能的には異なるある範囲の化合物に至る。使用し
た略号はすでに説明した。
ニルゾロパノイＶ経路を図式的に示した図である。この
経路の分岐路は、フラボノイｖ１フィトアレキシン、リ
グニンおよびリグナンのような４１：化学的に関連があ
るが機能的には異なるある範囲の化合物に至る。使用し
た略号はすでに説明した。
第２図は、アンチセンスＣＢＳ遺伝子を含有する本発明
の組換えＤＮＡベクターの構築を図式的に示した図であ
る。ＣＢＳ配列のドナーとしてはペチユニアＶ ５０
ｃＨ８遺伝子ＡのｃＤＮＡり０−７ Ｖ工Ｐ５ Ｑ ｍ
ｕｔ ｆ用い、Ｎｅｏ （部位をｉｎ ｖｉｔｒｏで開
始コｒンとともに導入した。このクローンはコズらによ
って、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１４巻、
第５２２９〜５２３９負、１９８６年）に記載されてい
る。Ｖ工Ｐ ５ Ｑ ｍｕｔをＮｃＯ■で部分切断し、
ＢｃｏＲｌで完全に切断した。粘着端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩのフレノウフラグメントと（ＬＮＴＰでプラント
末端に変換し、ついで生成したフラグメントをファージ
Ｍ１３ｍｐ７のＨｉｎｃ １部位にり０−ン化した。Ｃ
ＨＳをコードする配列をＢａｍ Ｈエフラグメントとし
て単離し、このフラグメントをついで、プラスミｈ”
ｐＲＯＫ工（ボールコムペラ、ネイチャー、第６２１巻
、第４４６〜４４９頁、１９８６年）のＣａＭＶ ３５
Ｂプロモーターと、ポリ Ａ付加シグナルを含むツバ
リン合成３′末端側領域の間に位置するＥａｍＨ（部位
にクローン化した。ＣＨＢをコードする配列がＣａＭＶ
３５ Ａプロモーターの後方に逆の方向に挿入された
クローン（ｖｘｐ ｆ０２ ）を選択し、そのＥｃｏＲ
Ｊ −Ｈｌｎｄ ｍ７７′グメン）を単離し、これを次
に、ベパンによってヌクレイツク番アシツズ・リサーチ
、第１２巻、第８７）１〜８７２１頁、１９８４年に記
載されているようにして、二元ベクターＢｉｎ １９の
ポリリンカ一部位にクローン化した。このようにして、
本発明の組換えＤＮＡベクターｖＴ、ｐ １（１４）が
得られた。
の組換えＤＮＡベクターの構築を図式的に示した図であ
る。ＣＢＳ配列のドナーとしてはペチユニアＶ ５０
ｃＨ８遺伝子ＡのｃＤＮＡり０−７ Ｖ工Ｐ５ Ｑ ｍ
ｕｔ ｆ用い、Ｎｅｏ （部位をｉｎ ｖｉｔｒｏで開
始コｒンとともに導入した。このクローンはコズらによ
って、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１４巻、
第５２２９〜５２３９負、１９８６年）に記載されてい
る。Ｖ工Ｐ ５ Ｑ ｍｕｔをＮｃＯ■で部分切断し、
ＢｃｏＲｌで完全に切断した。粘着端をＤＮＡポリメラ
ーゼＩのフレノウフラグメントと（ＬＮＴＰでプラント
末端に変換し、ついで生成したフラグメントをファージ
Ｍ１３ｍｐ７のＨｉｎｃ １部位にり０−ン化した。Ｃ
ＨＳをコードする配列をＢａｍ Ｈエフラグメントとし
て単離し、このフラグメントをついで、プラスミｈ”
ｐＲＯＫ工（ボールコムペラ、ネイチャー、第６２１巻
、第４４６〜４４９頁、１９８６年）のＣａＭＶ ３５
Ｂプロモーターと、ポリ Ａ付加シグナルを含むツバ
リン合成３′末端側領域の間に位置するＥａｍＨ（部位
にクローン化した。ＣＨＢをコードする配列がＣａＭＶ
３５ Ａプロモーターの後方に逆の方向に挿入された
クローン（ｖｘｐ ｆ０２ ）を選択し、そのＥｃｏＲ
Ｊ −Ｈｌｎｄ ｍ７７′グメン）を単離し、これを次
に、ベパンによってヌクレイツク番アシツズ・リサーチ
、第１２巻、第８７）１〜８７２１頁、１９８４年に記
載されているようにして、二元ベクターＢｉｎ １９の
ポリリンカ一部位にクローン化した。このようにして、
本発明の組換えＤＮＡベクターｖＴ、ｐ １（１４）が
得られた。
図中に用いた制限部位の略号は、Ｂ ： ＦｉｃｏＲｌ
。
。
Ｂ ： ＢａｍＨＪ、 ′Ｎ： Ｎｅｏ ｌ、 Ｈ
： Ｈｌｎｄｌ［である。
： Ｈｌｎｄｌ［である。
ペチユニアＶＲハイブリッドおよび夕／々コＳＲ１植物
の形質転換に、組換えＤＮＡベクターｖｘｐ１ｃＪ４を
使用した。この形質転換には、ＶＩＰ１（１４）をアグ
ロバクテリウム・ツメファシェンス４（１４）に、標準
トリバレンタル対合法（ディタら：ｐＮＡｓ。
の形質転換に、組換えＤＮＡベクターｖｘｐ１ｃＪ４を
使用した。この形質転換には、ＶＩＰ１（１４）をアグ
ロバクテリウム・ツメファシェンス４（１４）に、標準
トリバレンタル対合法（ディタら：ｐＮＡｓ。
第７７巻、第７３４７〜７３５１頁、１９８０年参照）
を用いて動員し、ついで植物の形質転換は葉板形質転換
（ホルシュら：ｔイエンス、第２２７巻、第１２２９〜
１２３１頁）によって行った。
を用いて動員し、ついで植物の形質転換は葉板形質転換
（ホルシュら：ｔイエンス、第２２７巻、第１２２９〜
１２３１頁）によって行った。
ランナー誘導メジウム釦はＢｉｎ １９のＴ −ＤＮＡ
領域に存在するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
（ＮＰＴ ）遺伝子を発現した細胞の選択のために、２
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有させる。
領域に存在するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
（ＮＰＴ ）遺伝子を発現した細胞の選択のために、２
５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有させる。
各植物について、デノムＤＮＡのすずンプロット解析に
より、形質転換を確認した。各形質転換体からコズら（
プラント・モルキュラー・バイオロジ、第１０巻、第１
５９〜１６９頁、１９８７年）によって記載された方法
で全ＤＮＡを単離した。
より、形質転換を確認した。各形質転換体からコズら（
プラント・モルキュラー・バイオロジ、第１０巻、第１
５９〜１６９頁、１９８７年）によって記載された方法
で全ＤＮＡを単離した。
５μ９景のＤＮＡ ｆ Ｈｌｎｄ ｌ［で切断したのち
、フラグメントを１％アガロ−スケゞル上電気泳動で分
離し、シーンスクリーン・フラグメンブレン（エヌ・イ
ー・エヌ・リサーチ・プロダクション）に移した。プロ
ットを、３２Ｆ標識ＮＰＴ ＤＮＡまたは３２ｐ標識Ｃ
ＨＳｃＤＮＡをゾローブとして解析した。Ｂｉｎｄ ［
１処理はゲノムに組込まれた各ＮＰＴコピーについて唯
一の７２グメントを導くはずであるから、ＮＰＴとハイ
ブリダイゼーションしたバンド数をコぎ数の指標として
用いた。
、フラグメントを１％アガロ−スケゞル上電気泳動で分
離し、シーンスクリーン・フラグメンブレン（エヌ・イ
ー・エヌ・リサーチ・プロダクション）に移した。プロ
ットを、３２Ｆ標識ＮＰＴ ＤＮＡまたは３２ｐ標識Ｃ
ＨＳｃＤＮＡをゾローブとして解析した。Ｂｉｎｄ ［
１処理はゲノムに組込まれた各ＮＰＴコピーについて唯
一の７２グメントを導くはずであるから、ＮＰＴとハイ
ブリダイゼーションしたバンド数をコぎ数の指標として
用いた。
第６図は、ペチユニアＶＲハイブリッドの多数の異なる
形質転換体を示す。一部の形質転換体については上述の
コピー数をカッコ内に示す。
形質転換体を示す。一部の形質転換体については上述の
コピー数をカッコ内に示す。
トランスジェニックペチユニア植物の花は着色のタイプ
によって６種類に分類された。２５の形質転換体中１２
個は野生ＷＶＲハイブリッドの花と識別できない花をつ
げた（り２ス１、赤色の花冠、筒状部および朽）。８個
の独立した形質転換体で花の色が弱まり、着色および無
色（白色）の扇形部が交互にみられることが多いが、こ
れらの形質転換体では筒状部は着色していた（クラス２
）。
によって６種類に分類された。２５の形質転換体中１２
個は野生ＷＶＲハイブリッドの花と識別できない花をつ
げた（り２ス１、赤色の花冠、筒状部および朽）。８個
の独立した形質転換体で花の色が弱まり、着色および無
色（白色）の扇形部が交互にみられることが多いが、こ
れらの形質転換体では筒状部は着色していた（クラス２
）。
５個の形質転換体（クラス６）では色のパタンはクラス
２とは根本的に異なり、筒状部からまたそこからさらに
外側、花冠組織中まで着色の阻害がみられ、着色リング
をもった白色の花または完全に白色な花を生じた。どの
トランスジェニック植物でも、朽の着色は攻撃されな−
ようであった。
２とは根本的に異なり、筒状部からまたそこからさらに
外側、花冠組織中まで着色の阻害がみられ、着色リング
をもった白色の花または完全に白色な花を生じた。どの
トランスジェニック植物でも、朽の着色は攻撃されな−
ようであった。
白色化組織からの抽出物の薄層クロマトグラフィーによ
る解析で、フラボノイドは存在しないことが明らかにな
った。さらに、色素生合成の遮断は、白色花冠組織にナ
リンゲニンカルコン（ＣＨＳ活性の正常生成物）を添加
すると回避できることがわかった。この添加によって着
色を生じ、これかうＣＨＢ以降のフェニルプロパノイド
経路に作用する酵素は、これらのトランスジェニック植
物でも存在して活性であると結論された。
る解析で、フラボノイドは存在しないことが明らかにな
った。さらに、色素生合成の遮断は、白色花冠組織にナ
リンゲニンカルコン（ＣＨＳ活性の正常生成物）を添加
すると回避できることがわかった。この添加によって着
色を生じ、これかうＣＨＢ以降のフェニルプロパノイド
経路に作用する酵素は、これらのトランスジェニック植
物でも存在して活性であると結論された。
第４図は、タバコ１３１１植物の形質転換でも６つの異
なる表現型があることを示している。４０個の形質転換
体中、３６個は野生型タバコの花と識別できない花をつ
げた（クラス１）。６個の植物では扇形に分割された着
色をもつ花が認められ（クラス２）、１個の植物では花
は完全な白であった（クラス６）。
なる表現型があることを示している。４０個の形質転換
体中、３６個は野生型タバコの花と識別できない花をつ
げた（クラス１）。６個の植物では扇形に分割された着
色をもつ花が認められ（クラス２）、１個の植物では花
は完全な白であった（クラス６）。
第５図は、各クラスのペチユニア形質転換体の（Ａ）ウ
ェスタンプロットおよび（Ｂ）ノーデンプロット解析を
示している。各形質転換体から、５〜７個のまだ閉じて
いる蕾を完全な形で集めて解析した。
ェスタンプロットおよび（Ｂ）ノーデンプロット解析を
示している。各形質転換体から、５〜７個のまだ閉じて
いる蕾を完全な形で集めて解析した。
筒状部と花冠の組織を分離し、液体窒素中で凍結した。
形質転換体Ｍ３０１１／１（１４）／１３の花冠組織は
、無色部分（Ｃ工）と着色部分（Ｃ２）に分けた。
、無色部分（Ｃ工）と着色部分（Ｃ２）に分けた。
ウエスタンプロツ）（Ａ）はモルラ（モルキュラーリア
ンｒ・ゼネラル・ジエネテイクス、第１９２巻、第４２
４〜４２９頁、１９８３年〕によって記載された方法で
作成した。各サンプルについて、筒状部組Ｍ（Ｔ）また
は花冠部組織（Ｃ）のいずれかから抽出したタンパク質
の等量を使用した。ＣＢＳタンパク質は、ウサギＣＨＥ
Ｉ抗血清、およびヤギ抗つサギエｇ（）と抱合したアル
カリホスファターゼ（テユネンおよびモル：アーカイプ
ズ嘩オプ・、Ｎ％イオケミストリー・アンｐ・７寸イオ
フイジクス、第２５７巻、第８５〜９１頁、１９８７年
〕によって免疫学的に検出した。
ンｒ・ゼネラル・ジエネテイクス、第１９２巻、第４２
４〜４２９頁、１９８３年〕によって記載された方法で
作成した。各サンプルについて、筒状部組Ｍ（Ｔ）また
は花冠部組織（Ｃ）のいずれかから抽出したタンパク質
の等量を使用した。ＣＢＳタンパク質は、ウサギＣＨＥ
Ｉ抗血清、およびヤギ抗つサギエｇ（）と抱合したアル
カリホスファターゼ（テユネンおよびモル：アーカイプ
ズ嘩オプ・、Ｎ％イオケミストリー・アンｐ・７寸イオ
フイジクス、第２５７巻、第８５〜９１頁、１９８７年
〕によって免疫学的に検出した。
ノ〜デンプロット（Ｂ ）は、筒状部組織（Ｔ、１また
は花冠部組織（Ｃ）のいずれかから抽出した全ＲＮＡの
等量（２μｇ）によりシーンスクリーン・プラス・メン
プラン上に作成した。ＣＨＢ３ ｍＲＮＡは、■工Ｐ５
０のＥｃｏＩｌｌｌ −Ｈｌｎｄ ｌ ７ラグメントを
含有するｐＴＺ ｌ ３ Ｕベクター（ユーーエスーバ
イオクミカル・コーポレーション）からＴ７ボリメラー
ゼでの転写によって得られたＩＰ標識アンチセンス（：
’Ｈａ ＲＮＡを用込で検出した。プロットのハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄は６０℃でなく７５℃で実施
したほかは指示通りとした。
は花冠部組織（Ｃ）のいずれかから抽出した全ＲＮＡの
等量（２μｇ）によりシーンスクリーン・プラス・メン
プラン上に作成した。ＣＨＢ３ ｍＲＮＡは、■工Ｐ５
０のＥｃｏＩｌｌｌ −Ｈｌｎｄ ｌ ７ラグメントを
含有するｐＴＺ ｌ ３ Ｕベクター（ユーーエスーバ
イオクミカル・コーポレーション）からＴ７ボリメラー
ゼでの転写によって得られたＩＰ標識アンチセンス（：
’Ｈａ ＲＮＡを用込で検出した。プロットのハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄は６０℃でなく７５℃で実施
したほかは指示通りとした。
プロット解析では、筒状部および花冠組織においてＣＢ
Ｓタンパク質量と、一方では筒状部および花冠組織の安
定なＣＨＢ ｍＲＮＡレベルとの間に、他方では観察さ
れた表現型の間に、よい相関が認められた。一部の形質
転換体のゲノムＤＮＡの制限解析では、内因性ＣＨＳ遺
伝子コピーには変化は起こらなかったことが明らかにさ
れた。上述の色素パタンの変化は、アンチセンスＣＢＳ
遺伝子で形質転換したペチユニア植物にのみ認められた
。正常または「センスＪ ＣＨＳ遺伝子構築体では、こ
のような偏向表現型は認められなかった（２０個の形質
転換ペチユニア植物につじで解析）。
Ｓタンパク質量と、一方では筒状部および花冠組織の安
定なＣＨＢ ｍＲＮＡレベルとの間に、他方では観察さ
れた表現型の間に、よい相関が認められた。一部の形質
転換体のゲノムＤＮＡの制限解析では、内因性ＣＨＳ遺
伝子コピーには変化は起こらなかったことが明らかにさ
れた。上述の色素パタンの変化は、アンチセンスＣＢＳ
遺伝子で形質転換したペチユニア植物にのみ認められた
。正常または「センスＪ ＣＨＳ遺伝子構築体では、こ
のような偏向表現型は認められなかった（２０個の形質
転換ペチユニア植物につじで解析）。
したがって、これらの表現型がツマクローナル変異、同
種組換えまたは遺伝子変換によって生じたとするのは不
適当である。
種組換えまたは遺伝子変換によって生じたとするのは不
適当である。
第６図は、ペチユニアＶ工Ｐ１（１４）形質転換体の３
つのクラスの葉でのアンチセンスＣＨＳ遺伝子の発現に
つｂてのノーずン解析の結果を示す。
つのクラスの葉でのアンチセンスＣＨＳ遺伝子の発現に
つｂてのノーずン解析の結果を示す。
アンチセンス（Ｊ（Ｓ遺伝子の発現とともに、トランス
ジェニックペチユニア植物およびトランスジェニックタ
バコ植物の両者で、それぞれ約１３００ ｂｐおよび約
１１００ ｂｐの長さを有する２釉の異なるＲＮＡが生
成する。ＣＢＳ配列のアンチセンス方向ではノパリンボ
ＩＪ Ａ付加部位の２２０ ｂｐ上流に多分さらにポ
リーＡ付加シグナル（ＡＡＴＡＡＴ ）の存在が認めら
れたので、上述の２種の異なるＲＮＡは異なる部位での
ポリアゾニレ−ジョンの発生によるものとされる。
ジェニックペチユニア植物およびトランスジェニックタ
バコ植物の両者で、それぞれ約１３００ ｂｐおよび約
１１００ ｂｐの長さを有する２釉の異なるＲＮＡが生
成する。ＣＢＳ配列のアンチセンス方向ではノパリンボ
ＩＪ Ａ付加部位の２２０ ｂｐ上流に多分さらにポ
リーＡ付加シグナル（ＡＡＴＡＡＴ ）の存在が認めら
れたので、上述の２種の異なるＲＮＡは異なる部位での
ポリアゾニレ−ジョンの発生によるものとされる。
このノーずン解析に用いた方法は、第５Ｂ図につ因て上
述した方法と同じであった。アンチセンスＣＨ３ＲＮＡ
は、ＶＩＰ ５ ＱのＥｃｏＲ７−Ｈｌｎｄ ＠フラグ
メントを含有するＴＩＴＺ ｌ ９ Ｕベクター（ユエ
ス０バイオケミカルーコーポレーション）からＴ７ポリ
メラーゼでの転写によって得られた３２ｐ標識センスＣ
ＨＳＲＮＡで検出した。
述した方法と同じであった。アンチセンスＣＨ３ＲＮＡ
は、ＶＩＰ ５ ＱのＥｃｏＲ７−Ｈｌｎｄ ＠フラグ
メントを含有するＴＩＴＺ ｌ ９ Ｕベクター（ユエ
ス０バイオケミカルーコーポレーション）からＴ７ポリ
メラーゼでの転写によって得られた３２ｐ標識センスＣ
ＨＳＲＮＡで検出した。
結果ハ、葉組織内の挿入したアンチセンスコピー数とア
ンチセンスＣＥＢ ＲＮＡの安定なレベルとの間に相関
はないことを示している（第６図の１（１４）−１８と
１［１４−１３の結果を比較されたー）。ＩＪＮＡ中の
隣接配列が遺伝子発現に量的影響を与えることは明白で
ある。さらに、葉組織内に等しい安定レベルのアンチセ
ンスｃＨｓ ＲＮＡ ｆ 有−ｊる別個の独立したトラ
ンスジェニック植物が花の着色に相違を示している（第
６図の１（１４）−７と１（１４）−１８の結果を比較
されたい）。一部の独立したトランスジェニック植物は
葉組織にきわめて低い９２定なレベルのアンチセンスＣ
ＨＢ ＲＮＡ ｔ、 カ示さなりにもかかわらず、これ
らの植物には花の着色に明確な影響が認められる（たと
えば第６図の１（１４）−１３参照〕。
ンチセンスＣＥＢ ＲＮＡの安定なレベルとの間に相関
はないことを示している（第６図の１（１４）−１８と
１［１４−１３の結果を比較されたー）。ＩＪＮＡ中の
隣接配列が遺伝子発現に量的影響を与えることは明白で
ある。さらに、葉組織内に等しい安定レベルのアンチセ
ンスｃＨｓ ＲＮＡ ｆ 有−ｊる別個の独立したトラ
ンスジェニック植物が花の着色に相違を示している（第
６図の１（１４）−７と１（１４）−１８の結果を比較
されたい）。一部の独立したトランスジェニック植物は
葉組織にきわめて低い９２定なレベルのアンチセンスＣ
ＨＢ ＲＮＡ ｔ、 カ示さなりにもかかわらず、これ
らの植物には花の着色に明確な影響が認められる（たと
えば第６図の１（１４）−１３参照〕。
これらの中でと〈Ｋ花の着色の異なる種類が出現するこ
との観察は、異なる形質転換体では組込まれたアンチセ
ンスＣＢＳ遺伝子が異なる状態で発現し、これはゲノム
中でのそれらの位置に関係するものであることを明らか
に示している。隣接配列は、遺伝子の発現に定性的にも
影響するようである（たとえば遺伝子発現のタイミング
および遺伝子発現の空間的配置）。
との観察は、異なる形質転換体では組込まれたアンチセ
ンスＣＢＳ遺伝子が異なる状態で発現し、これはゲノム
中でのそれらの位置に関係するものであることを明らか
に示している。隣接配列は、遺伝子の発現に定性的にも
影響するようである（たとえば遺伝子発現のタイミング
および遺伝子発現の空間的配置）。
最後に、原核生物の場合と異なり、影響の出現にはアン
チセンス５′リーダー配列は必袂がなしごとも認められ
る。したがって、遺伝子発現の不活化は翻訳の開始のレ
ベルでは起こらないように思われ、この推定は他の観察
によっても提起される。
チセンス５′リーダー配列は必袂がなしごとも認められ
る。したがって、遺伝子発現の不活化は翻訳の開始のレ
ベルでは起こらないように思われ、この推定は他の観察
によっても提起される。
第１図は、植物に存在する二次代謝経路であるフェニル
ゾロパノイド経路を図式的に示した図である。 第２図は、アンチセンスＣＢＳ遺伝子を含有する本発明
の組換えＤＮＡベクター Ｖ工Ｐ１（１４）の構築を図
式的に示した図である。 第６図は、生物の形態を示す写真であって本発明のトラ
ンスジェニックペチユニア植物の様々な表現型を示す。 第４図は、生物の形態を示す写真であって本発明のトラ
ンスジェニックタバコ植物の様々な表現型を示す。 第５図は、本発明のペチユニア形質転換体の（Ａ）ウェ
スタンプロットおよび（Ｂ）ノーデンプロット解析の結
果である。 第６図は、本発明のペチユニアＶ工Ｐ１（１４）形質転
換体の６柚類の表現型についてのアンチセンスＣＨＳ遺
伝子のノーずン解析の結果である。
ゾロパノイド経路を図式的に示した図である。 第２図は、アンチセンスＣＢＳ遺伝子を含有する本発明
の組換えＤＮＡベクター Ｖ工Ｐ１（１４）の構築を図
式的に示した図である。 第６図は、生物の形態を示す写真であって本発明のトラ
ンスジェニックペチユニア植物の様々な表現型を示す。 第４図は、生物の形態を示す写真であって本発明のトラ
ンスジェニックタバコ植物の様々な表現型を示す。 第５図は、本発明のペチユニア形質転換体の（Ａ）ウェ
スタンプロットおよび（Ｂ）ノーデンプロット解析の結
果である。 第６図は、本発明のペチユニアＶ工Ｐ１（１４）形質転
換体の６柚類の表現型についてのアンチセンスＣＨＳ遺
伝子のノーずン解析の結果である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）宿主内で活性なプロモーターと、このプロモータ
ーによつて制御され、転写時に、宿主のＤＮＡ中に存在
する遺伝子の転写時に生成されるＲＮＡ分子と二重鎖を
形成することができるアンチセンスＲＮＡ分子を生成す
るようなヌクレオチド配列を有する遺伝子とからなる組
換えＤＮＡによる、任意の原種の遺伝子操作で得られる
植物細胞および植物。（２）宿主内で活性なプロモータ
ーと、このプロモーターによつて制御され、転写時に、
宿主のＤＮＡ中に存在する二次代謝経路の遺伝子の転写
時に生成されるＲＮＡ分子と二重鎖を形成することがで
きるアンチセンスＲＮＡ分子を生成するようなヌクレオ
チド配列を有する遺伝子とからなる組換えＤＮＡによる
、任意の原種の遺伝子操作で得られる植物細胞および植
物。 （３）宿主内で活性なプロモーターと、このプロモータ
ーによつて制御され、転写時に、宿主のＤＮＡ中に存在
するフェニルプロパノイド経路の遺伝子の転写時に生成
されるＲＮＡ分子と二重鎖を形成することができるアン
チセンスＲＮＡ分子を生成するようなヌクレオチド配列
を有する遺伝子とからなる組換えＤＮＡによる、任意の
原種の遺伝子操作で得られる植物細胞および植物。 （４）宿主内で活性なプロモーターと、このプロモータ
ーによつて制御され、転写時に、宿主のＤＲＡ中に存在
し、酵素カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、カルコンフラ
バノンイソメラーゼ（ＣＨＩ）およびジヒドロフラボノ
ールレダクターゼ（ＤＦＲ）の１種をコードするフェニ
ルプロパノイド経路の遺伝子の転写時に生成されるＲＮ
Ａ分子と二重鎖を形成することができるアンチセンスＲ
ＮＡ分子を生成するようなヌクレオチド配列を有する遺
伝子とからなる組換えＤＮＡによる、任意の原種の遺伝
子操作で得られる植物細胞および植物。 （５）宿主内で活性なプロモーターと、このプロモータ
ーによつて制御され、転写時に、宿主のＤＮＡ中に存在
し、酵素カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）をコードするフ
ェニルプロパノイド経路の遺伝子の転写時に生成される
ＲＮＡ分子と二重鎖を形成することができるアンチセン
スＲＮＡ分子を生成するようなヌクレオチド配列を有す
る遺伝子とからなる組換えＤＮＡによる、任意の原種の
遺伝子操作で得られる植物細胞および植物。 （６）導入された遺伝子はペチユニアのアンチセンスＣ
ＢＳ ｃＤＮＡから構成されている植物細胞および植物
。 （７）導入された遺伝子は、ペチユリアハイブリッダ、
変種バイオレット３０（Ｖ３０）のアンチセンスＣＨＳ
ｃＤＮＡから構成されている特許請求の範囲第５項の
植物細胞および植物。 （８）導入された遺伝子は、カリフラワーモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータによつて制御される
特許請求の範囲第１項から第７項までのいずれかの植物
細胞および植物。 （９）導入された遺伝子は、調節または誘導植物プロモ
ーターによつて制御される特許請求の範囲第１項から第
７項までのいずれかの植物細胞および植物。 （１０）導入された組換えＤＮＡは、ポリＡ付加シグナ
ルをその内部に有する３′末端側領域からなる特許請求
の範囲第１項から第９項までのいずれかの植物細胞およ
び植物。 （１１）導入された組換えＤＮＡはノパリンシンターゼ
遺伝子（Ｎｏｓ）の３′テールからなる特許請求の範囲
第１０項の植物細胞および植物。 （１２）植物細胞および植物内で活性なプロモーター、
および上記プロモーターによつて制御され、転写時に、
植物遺伝子の転写時に生成するＲＮＡ分子と二重鎖を形
成できるアンチセンスＲＮＡ分子を生成するようなヌク
レオチド配列を有する遺伝子からなる組換えＤＮＡ。 （１３）植物細胞および植物内で活性なプロモーター、
および上記プロモーターによつて制御され、転写時に、
二次代謝経路の植物遺伝子の転写時に生成するＲＮＡ分
子と二重鎖を形成できるアンチセンスＲＮＡ分子を生成
するようなヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる組
換えＤＮＡ。 （１４）植物細胞および植物内で活性なプロモーター、
および上記プロモーターによつて制御され、転写時に、
フェニルプロパノイド経路の植物遺伝子の転写時に生成
するＲＮＡ分子と二重鎖を形成できるアンチセンスＲＮ
Ａ分子を生成するようなヌクレオチド配列を有する遺伝
子からなる組換えＤＮＡ。 （１５）植物細胞および植物内で活性なプロモーター、
および上記プロモーターによつて制御され、転写時に、
酵素カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、カルコンフラバノ
ンイソメラーゼ（ＣＨＩ）およびジヒドロフラボノール
レダクターゼ（ＤＦＲ）の１種をコードするフェニルプ
ロパノイド経路の植物遺伝子の転写時に生成するＲＮＡ
分子と二重鎖を形成できるアンチセンスＲＮＡ分子を形
成するようなヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる
組換えＤＮＡ。 （１６）植物細胞および植物内で活性なプロモーター、
および上記プロモーターによつて制御され、転写時に、
酵素カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）をコードするフェニ
ルプロパノイド経路の植物遺伝子の転写時に生成するＲ
ＮＡ分子と二重鎖を形成できるアンチセンスＲＮＡ分子
を形成するようなヌクレオチド配列を有する遺伝子から
なる組換えＤＮＡ。 （１７）植物プロモーターによつて制御される遺伝子は
、ペチユニアのアンチセンスＣＨＳ ｃＤＮＡから構成
されている特許請求の範囲第１６項の組換えＤＮＡ。 （１８）植物プロモーターによつて制御される遺伝子は
、ペチユニアハイブリッダ、変種バイオレット３０（Ｖ
３０）のアンチセンスＣＨＳ（遺伝子Ａ）ｃＤＮＡから
構成されている特許請求の範囲第１６項の組換えＤＮＡ
。 （１９）遺伝子はカリフラワーモザイクウイルス（Ｃａ
ＭＶ）３５Ｓプロモーターによつて制御される特許請求
の範囲第１２項から第１８項までのいずれかの組換えＤ
ＮＡ。 （２０）遺伝子は調節または誘導植物プロモーターによ
つて制御される特許請求の範囲第１２項から第１８項ま
でのいずれかの組換えＤＮＡ。 （２１）さらに、その内部にポリＡ付加シグナルを有す
る３′末端側領域からなる特許請求の範囲第１２項から
第２０項までのいずれかの組換えＤＮＡ。 （２２）ノパリンシンターゼ遺伝子（Ｎｏｓ）の３′テ
ールからなる特許請求の範囲第２１項の組換えＤＮＡ。 （２３）ベクターＤＮＡと特許請求の範囲第１２項から
第２２項までのいずれかの組換えＤＮＡの挿入体からな
る組換えＤＮＡベクター。 （２４）植物ベクターと特許請求の範囲第１２項から第
２２項までのいずれかの組換えＤＮＡの挿入体からなる
組換えＤＮＡベクター。 （２５）微生物中へのクローニングに適したベクターと
特許請求の範囲第１２項から第２２項までのいずれかの
組換えＤＮＡの挿入体からなる組換えＤＮＡベクター。 （２６）特許請求の範囲第２５項の組換えＤＮＡベクタ
ーを用いて形質転換された微生物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8800756A NL8800756A (nl) | 1988-03-25 | 1988-03-25 | Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna. |
| NL8800756 | 1988-03-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0216985A true JPH0216985A (ja) | 1990-01-19 |
Family
ID=19852006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1073736A Pending JPH0216985A (ja) | 1988-03-25 | 1989-03-24 | 遺伝子操作植物細胞および植物，ならびにそれに適当な組換えｄｎａ |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0335451A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0216985A (ja) |
| NL (1) | NL8800756A (ja) |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0335451A2 (en) | 1989-10-04 |
| NL8800756A (nl) | 1989-10-16 |
| EP0335451A3 (en) | 1989-10-25 |
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