JPH02167078A - 二次代謝産物生産増加のための生合成遺伝子又は制御遺伝子の単離法及び使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野は二次代謝産物生産遺伝子の単離法及び使
用法に関する。

この４０年間、従来の株数良法によりペニシリン生産量
は非常に増加してきている。この従来の株数良法は、基
本的にペニシリウムクリソゲナム（Ｐｅｎ１ｃｉ１１ｉ
ｕ＊　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｉ　）のランダム突然変異
処理及び、よりペニシリンを生産する突然変異体の選択
に基づいている。しかし、クローニング技術の発達は新
しく有力な手段を提供し、さらに、この菌類のペニシリ
ン生産を改良した。

ペニシリンは、Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕａ＋　）により、いくつかの酵素ステップを介して生
産される（例えば、Ｅアルバレズ（Ａｌｖａｒｅｚ　）
等、アンチマイクロービアルエイジエントケモセラビ−
（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏ
ｔｈｅｒ、）　３土（１９Ｂ？　）１６７５〜１６８２
）。これらのステップを第１図に示す。この説明の中で
は生合成経路に直接関係する遺伝子が重要であり、二次
代謝産物生産に至るい（つかのステップで活性を示す酵
素をコードする遺伝子、すなわちペニシリンＧ、又はＶ
の生産の場合には第１図で示されている酵素をコードす
る遺伝子が意味を持っている。第１の反応は、α−アミ
ノアジピン酸、システィン及びバリンからのトリペプチ
ドδ−（Ｌ−α−アミノアジピル）−Ｌ−システイニル
−Ｄバリンの合成である。この反応を担う酵素は、巨大
な多機能酵素であるＡＣＶシンセターゼ（以後ＡＣＶＳ
と呼ぶ）である。このトリペプチドはイソペニシリンＮ
シンセターゼ（以後ＩＰＮＳと呼ぶ）又はシクラーゼの
作用により環化する。この反応産物はイソペニシリンＮ
であり、この化合物は典型的なβ−ラクタム環構造を含
み、かつ抗菌性を有する。ペニシリン合成の最終ステッ
プはイソペニシリンＮのα−アミノアジピン酸側鎖の疎
水性側鎖による交換である。工業生産で通常用いられる
疎水性側鎖にはペニシリンＧを生ずるフェニル酢酸、及
びペニシリン■を生ずるフェノキシ酢酸がある。この側
鎖交換は単一の酵素により触媒される反応であると提唱
されている（　Ａ、Ｌ、デマイン（Ｄｅｍａｉｎ　）、
１９８３年、Ａ、Ｌ、デマイン（Ｄｅｍａｉｎ　）及び
Ｎ、八、ソロモン（Ｓｏｌｏｍｏｎ　）Ｉ、β−ラクタ
ム構造を有する抗生物質ｌ、スプリンガーバーラク版、
ベルリン、１８９−２２８）。しかし中間体として６−
ＡＰＡを含む２ステップ反応も可能である（Ｅ、アルパ
レス（Ａｌｖａｒｅｚ　）等、上述）。最終反応に関す
ると同定された酵素はアシルＣｏＡ：ｂ−ＡＰＡアシル
トランスフェラーゼである（以後ＡＴと呼ぶ）。この酵
素は均一にまで精製された（Ｅ、アルパレス（Ａｌｖａ
ｒｅｚ　）等、上述）。

ＩＰＮから６−ＡＰＡまでの反応を触媒する第２の酵素
の関与はまだ確証がつかめていない。

１個以上の酵素反応がペニシリン生合成経路の律速とな
っているかどうかは明確ではなく、また、もしそうであ
るとしても、どの酵素ステップが関与しているか明らか
ではない。

ペニシリン生合成経路は、互いに代謝経路の一部を成し
ている３個のアミノ酸で始まるので、その各々の経路に
おける制御ステップもペニシリン生合成に影響するであ
ろう。一方ペニジリンの合成は炭素代謝抑制及び窒素源
制御に関係している（　Ｊ、Ｆ、マーチン（Ｍａｒｔｉ
ｎ　）等、Ｈ，タレインカーフ（Ｋｌｅｉｎ　Ｋａｒｆ
　）　　Ｈ，フォンデレン（ｖｏｎＤｏｈｒｅｎ　）、
■、ドナウアー（Ｄｏｎｎａｕｅｒ　）及びＧ、ネセマ
ン（Ｎｅｓｅｍａｎｎ　）　５、′二次代謝産物合成の
制御″、ＶＣＨバーラゲセルシャフト（Ｖｅｒｌａｇｇ
ｅｓｅ１１ｓｃｈａｆｔ　）　、ウエインヘイム（Ｗｅ
ｉｎｈｅｉｍ　）　、１９８５年、４１〜７５）、また
制御タンパク質がこれらのタイプの制御にも関係し得る
。これらの制御タンパク質及びそれらにより制御される
タンパク質が、二次代謝産物、この場合のペニシリンの
生合成経路に間接的に関係することは明らかである。

最近、ペニシリンＧ１イソペニシリンＮシンセターゼ（
Ｉ　ＰＮＳ）又はシクラーゼへの生合成経路において活
性を示す唯一つの酵素の遺伝子が、対応するアクレモニ
ウムクリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍにｈｒｙｓｏ
ｇｅｒ＋ｕｓ＋　）遺伝子（Ｓ、Ｍ、サムソン（Ｓａｍ
ｓｏｎ　）等、ネイチ−？−（Ｎａｔｕｒｅ）３１８　
（１９８５）１９１−１９４）を用いてクローン化され
、かつ配列決定された。後者の遺伝子がクローン化され
、かつＩＰＮＳタンパク質を精製し、アミノ末端アミノ
酸配列を決定し、この配列に従う一部の合成オリゴデオ
キシリボヌクレオチドを合成し、及びこれらを混合した
オリゴデオキシヌクレオチドでコスミドゲノムライブラ
リーを採ることによりこれを同定した（　Ｓ、Ｍ、サム
ソン（Ｓａｍｓｏｎ　）　、上述）。

ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）においてクローン化したペ
ニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｉ　）のイソペニシリンＮシンセ
ターゼ遺伝子を用いた株改良実験は酵素活性を増加させ
たが、ペニシリン生産量は増加せず、またペニシリン合
成の促進も見られなかった（　Ｐ、Ｌ、スカトラド（５
ｋａｔｒｕｄ　）等、ポスターセツション１９８７、工
業微生物学会集会、バルチモア、１９８７年８月、ＳＩ
Ｍニュース刊行アブストラクト、３７　　（１９８７）
７７頁）。

β−ラクタム抗生物質の生合成がグルコース抑制を受け
ていることが証明された（　Ｊ、Ｆ、マーチン（Ｍａｒ
ｔｉｎ　）及びＰ、ライラス（Ｌｉｒａｓ　）、ＴｌＢ
５３　　（１９８５）３９−４４）。このグルコースに
よる抑制はＡＣＶＳによるトリペプチドの合成及びＩＰ
ＮＳ活性に関して確認された（レビラ（Ｒｅｖｉ１１ａ
　）等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　
Ｂａｃｔ、　）　　１６８　　（１９８６）（９４７−
９５２）。一方、°アシルトランスフェラーゼに対する
データは明確ではない。ＡＴがグルコース抑制を受けて
いない事をレビラ（Ｒｅｖｉ１１ａ）等（上述）は報告
したが、他のデータはＡＴ活性が無いか、又は少なくと
も減少していることを示した（　Ｂ、スペンサー（５ｐ
ｅｎｃｅｒ　）及びＴ、マング（Ｍａｕｎｇ　）、プロ
シーディング・イン・バイオケミカル・ソサイアテイー
（Ｐｒｏｃ、旧ｏｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　）１９７０．２９−３０）。

グルコースによる抑制がどのステップで行なわれている
かは不明である。すなわちこの事は転写レベルでもまた
翻訳レベルでも起こり得る。もし前者の制御が適用され
る場合は、生産及び非生産培養物におけるｍＲＮＡレベ
ルの差が上記遺伝子の単離に使用し得る。

さらにペニシリン生産細胞における種々の酵素をコード
するｍＲＮＡの濃度は不明確である。

微生物における二次代謝産物生産に関連する遺伝子同定
に比較単離法を採用している。この方法は、Ｐ、クリソ
ゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）におけるペニシリ
ン生産で例示されている。

本発明に従がい、モノ−又はポリジストロニックな配列
を含むＤＮＡフラグメントを同定する。

この配列によりコードされる遺伝子は商品価値のある二
次代謝産物又はその他の生産物の生産に関する酵素に翻
訳される。目的とするこれらの配列は目的遺伝子が活発
に発し、その二次代謝産物を生産し得る生物及び発現し
得ない微生物に由来するＤＮＡ配列の比較により同定し
た。それゆえ特定発現し、かつ商品価値のある生産物の
生成に関する１個以上の遺伝子をコードするＤＮＡフラ
グメントが提供される。この出願を通して、特定発現と
は、特定の条件下でのみ活性であり、かつ等しくよく限
定された他の条件下では存在しない（本発明において低
レベルで存在することを意味し、例えば油清段階と比較
べて５％のレベル以下を示す）目的遺伝子の発現に対し
て使用される。

発現の不在は遺伝子発現の抑制又は誘導の欠除、突然変
異、又は目的遺伝子の転写を起こさせない他の事象の結
果として起こり得る。単離ＤＮＡは、例えばラムダ又は
コスミドクローニングベクター又は発現ベクター内に含
まれるゲノム又はＣＤＮＡライブラリーの遺伝子ライブ
ラリーをスクリーニングすることから得られる。二次代
謝産物の生合成に際し発現される配列を濃縮したｃＤＮ
Ａプローブを用いることによりライブラリー中から引き
つづく操作に必要なポジティブハイブリッドが同定され
、該二次代謝産物生産に関する酵素の発現構築物を提供
する。それゆえ微生物の遺伝子ライブラリーを２つのｃ
ＤＮＡプローブ（１つは転写活性状態由来の配列を濃縮
したもの、及びもう１つは転写不活性状態に由来する配
列を有するもの）を用いてスクリーニングする。この比
較及びその差から、特定の活性条件のみで活発に発現す
る遺伝子を含むクローンを単離し得る。

本方法は二次代謝産物、より特定するとラクトース生育
（生産性）及びグルコース生育（非生産性）菌糸体に由
来する２つのｃＤＮＡプローブを用いたペニシリン生合
成に関する遺伝子の単離で例示される。

この同定されたＤＮＡ配列は抗生物質生合成酵素及び、
又はその全生合成経路由来の制御タンパク質、又より一
般的には上記抗生物質生合成にポジティブであれ、又ネ
ガティブであれ、どのような形でも関係するタンパク質
をコードする少なくとも１個の遺伝子を含む。

適当な宿主微生物中にうまく導入された時、ポジティブ
に作用する構築物は遺伝子投入機の増加、又はより高い
遺伝子発現によりβ−ラクタム生産微生物中で機能する
生合成経路の効率を高める。

一方抗生物質生産にネガティブな効果を示す構築物（例
えば副産物の生産）も単離し得る。これらの構築物は遺
伝子置換又は同様の効果をもつ他の方法によりネガティ
ブに作用する遺伝子を不活性化するのに使用される。結
局両方法とも工業生産における目的抗生物質をより高い
収率で提供する。

本方法は抗生物質、特にペニシリンの生産のためのβ−
ラクタム生産微生物により例示され、かつその特定の応
用例を提供する。その発現カセットは律速段階を触媒す
る酵素をコードする遺伝子、又は転写の誘導のための制
御タンパク質をコードする遺伝子等を含むことが望まし
い。

さらに本方法はコードされている生産物が未知である配
列を提供するが、この配列は目的産物の生産を増加する
。これらの配列は′潜在的遺伝子′と呼ばれ、機能が不
明の遺伝子を含み、本単離法で人手し得る配列を意味す
る。これらの遺伝子は非形質転換宿主と比較して形質転
換宿主微生物においてはより高い量の投及び、又は発現
が特徴である。′潜在的遺伝子′に加え、提供されるそ
の他の遺伝子にはＩ　ＰＮＳ及びアシルトランスフェラ
ーゼがある。ｔＹＩと命名される潜在的遺伝子はペニシ
リンの生合成を増加することが示された。

本発明で用いる微生物には、アクチノミセテス（Ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ　）又はフラボバクテリウム（Ｆ
ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）の系統に属するような
細菌、又はアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉ１１ｕｓ　
）、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　）又はペ
ニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）属に属する菌
類（イーストを含む）を含む原核生物及び真核生物の両
方が含まれる。

原核性又は真核性、ゲノム又はｃＤＮＡ等のフラグメン
トの由来に応じて種々の発現カセットを構築し得る。細
菌由来のゲノムＤＮＡの場合、七ノー又はポリジストロ
ニックコーディング領域を含むフラグメントは、それ自
身の転写開始制御領域の他に転写終止領域及び例えば、
シャインダルガルノ配列及び終止コドン等の適当な翻訳
シグナルを含む。ゲノムＤＮＡが菌類由来の場合、通常
唯一の遺伝子が転写開始制御領域に会合しており、その
結果各遺伝子はそれ自体独立した転写開始制御領域を有
する。ｃＤＮＡを用いる場合、引き続く発現に用いられ
る宿主微生物に依存して適当な転写開始制御領域を提供
する必要がある。

目的遺伝子は上記二次代謝産物を生産する上記微生物の
一次培養由来のｍＲＮＡ又はＤＮＡから得られるプロー
ブで、上記微生物から調製したＤＮＡライブラリーをス
クリーニングすること、すなわち上記ＤＮＡライブラリ
ーを、上記微生物又は、上記二次代謝産物生産を欠くそ
の突然変異体由来のｍＲＮＡ又はＤＮＡから得られるプ
ローブでスクリーニングし、及び上記−次培養において
転写され、かつ上記二次培養においては実質的に転写さ
れない遺伝子を含むフラグメントを同定することにより
入手し得る。

特に価値ある遺伝子とは当分野で知られているβ−ラク
タム生合成酵素（例えばトリペプチドシンセターゼ（Ａ
ＣｖＳ）、シクラーゼ（ＩＰＮＳ）、アシルトランスフ
ェラーゼ（ＡＴ）　、エピメラーゼ、エキスパンダーゼ
、ヒドロキシラーゼ、トランス力ルバモイラーゼ、メト
キシラーゼ、トランスアセチラーゼ）をコードする遺伝
子を含み、かつ抗生物質生合成の際に特別に発現される
ものが含まれるＩＰＮ：ｂ−ＡＰＡアシルトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子又は潜在的遺伝子″Ｙ″が大
量に投与され、又は発現され、形質転換菌類において目
的とする抗生物質を高収量で生成することが望ましい。

β−ラクタム生産宿主において発現される遺伝子が、そ
の宿主細胞のＲＮＡポリメラーゼにより認識される自分
自身本来のプロモーター配列を有しているか、又は他の
適当なプロモーター、例えば種々のβ−ラクタム生合成
遺伝子のプロモータ、又はホスホグリセレートキナーゼ
、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、
トリオースホスフェートイソメラーゼ等の解糖遺伝子の
プロモーター、又は翻訳延長因子、ＥＰ−Ｔｕのプロモ
ーター等に連結し得ることは当業者にとって当然のこと
であろう。

このようなプロモーターの使用は上記酵素をコードする
１個以上の遺伝子の発現制御に影響し得る。ペニシリン
生産は、非形質転換宿主株ではペニシリン生産を誘導し
ない条件、例えば解糖系酵素はグルコース存在下で発現
されるか、一方ペニジリン生産はグルコース存在下で抑
制されるというような条件下で可能であるので（Ｊ、Ｆ
、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ　）　、上述）、このことは
形質転換後の抗生物質生産の増加に導く。解糖遺伝子の
プロモーターの制御下、ペニシリン生合成遺伝子を発現
させることにより、この遺伝子はグルコース存在下でも
発現し得、それにより十分な量の菌糸体の生成に高濃度
のグルコースが必要である時、発酵の初期にペニシリン
が生成し得る。またこのようなプロモーターの制御下に
選択マーカーも含め得る。

本発明はペニシリン生合成のグルコース抑制に打ち勝つ
ために使用されるプロモーターとしてＰ。

クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）のホスホグ
リセレートキナーゼのプロモーターを例示している。こ
のプロモーターは、Ｒ９八、ヒッ′ンエマン（１１ｉｔ
ｚｅｍａｎ　）等（ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）　　１０　（
１９８２）　　？７９１−７８０８　）により公表され
ているイースト配列由来のオリゴデオキシリボヌクレオ
チドを用いた標準法により、Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ　）のゲノムライブラリーから単離さ
れる。このホスホグリセレートキナーゼのプロモーター
のヌクレオチド配列を第５図に示す。

ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）の形質転換
に対して形質転換細胞の選択用の少なくとも１つのマー
カー及び、好ましくは組込みＤＮＡの保持を高める領域
を含む構築物が用いられる。それゆえベクターには形質
転換効率を増加させることが知られているＤＮＡ配列が
含まれていることが望ましい。このようなりＮＡ配列の
例としてはアスペルギラス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉ１１ｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ　）から単離されるａｎ
ｓ　　″要素がある（バランス（Ｂａ１ｌａｎｃｅ　）
及びターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ　）　、ジーン（Ｇｅｎｅ
）３６　（１９８５）３２１−３３１参照）。本発明は
ａｎｓ　″配列の効果に恨た効果を有する配列と同定さ
れた、Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕａ＋　
）のゲノムから単離されるＤＮＡ配列を提供している。

この配列はＰ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
　）由来のものであるので、Ｐ。

クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）における形
質転換効率を増加するのに使用し得る。このＤＮＡ配列
はＰ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）　ｐ
ｙｒ　Ｇ遺伝子を含み、かつ単独で、上記ＤＮＡ配列が
トランスホーマントの選択及び形質転換増加効果の両方
を提供するｐｙｒ　Ｇ−宿主と組合せて（ＥＰ−Ａ９２
６０７６２参照）、又は他の選択マーカー、例えばフレ
オマイシン（ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎ　）などの殺菌剤耐
性をコードする遺伝子と組合せて使用し得る。

後者の場合、トランスホーマントの選択及び形質転換増
加効果は２個別々のＤＮＡ配列により提供され、またｐ
ｙｒＧ要素の単一の機能は形質転換効率の増加である。

トランスホーマントクローンの有用な選択マーカーは、
例えばアルギニン等のアミノ酸、例えばウラシル等のヌ
クレオチド前駆体等への代謝経路の欠陥により引き起こ
される宿主細胞の栄養要求を相補し得る同種又は異種の
生合成遺伝子である。

選択マーカーを提供する構造遺伝子は野生型ペニシリウ
ム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）宿主本来のものでもよ
いし、又宿主内で機能し得る異種の構造遺伝子でもよい
。例えば代謝経路の酵素をコードする構造遺伝子はペニ
シリウム（Ｐｅｎ１ｃｉ１１ｉｕｎ＋　）由来のもので
もよいし、又は例えばアスペルギラス（＾ｓｐｅｒｇｉ
１１ｕｓ　）　、、　ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐ
ｏｒａ　）−ボドスボラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ　）又は
イースト等、その構造遺伝子がペニシリウム（Ｐｅｎｉ
ｃｉ１１ｉｕｍ　）宿主中で機能しかつ栄養要求株を原
栄養株へと相補する、他の繊維状菌類由来のものでもよ
い。

この相補構造遺伝子は、プリン又はピリミジン（ヌクレ
オシド）又はアミノ酸の合成などの代謝経路に由来する
ものである。例えば酵素オロチジン−５′−ホスフェー
トデカルボキシラーゼをコードする遺伝子（ＩｆｆｉＧ
又はｆｆ１４）などのピリミジン経路の酵素をコードす
る構造遺伝子が特に興味深い。その他の遺伝子には、例
えばオルニチンカルバモイル・トランスフェラーゼ（但
ＩＢ）及びオルギニノ・サクシネート・リアーゼ（但１
４）などのアミノ酸生合成遺伝子がある。上記選択マー
カーの使用法はＥＰ−Δ−２６０７６２に提供されてい
る。

栄養要求マーカーに代って、唯一の炭素源又は窒素源と
してのアミドの使用能又は例えばガラクトースなどの種
々の糖での生育能等の発酵マーカーも使用し得る。

さらに例えばヒグロマイシン、ゲンタマイシン、フレオ
マイシン、グリホセート、パイアラホス等の殺菌剤耐性
をコードする遺伝子も使用し得る。

目的配列を含む構築物が提供され、かつこれは、例えば
クローニング宿主及び、又は二次代謝産物の発現を目的
とする標的宿主等、１種以上の宿主における複製システ
ムのような他の機能、すなわち上記の１種以上の宿主に
おける１個以上の選択マーカー、形質転換効率を高める
遺伝子又は他の特定の機能を含み得る。

この構築物は本発明の方法により単離された少なくとも
１個の遺伝子を含む。この構築物は適当な宿主由来の他
の望ましい遺伝子の単離、その遺伝子の全部又は一部の
合成、又はこれらの組合せによる従来法により合成され
る。同様に制御シグナル、すなわち転写及び翻訳開始及
び終止領域は天然のものから単離されるか、又は合成さ
れるか、もしくはそれらを組合せて得られる。種々のフ
ラグメントについてエンドヌクレアーゼ消化（制限処理
）、ライゲーション、配列決定、インビトロ突然変異誘
発、プライマー修復等が行なわれる。

これらの種々の操作は、文献によく説明されており、か
つ特定の目的を達成するのに使用される。

種々のフラグメントは従来法に従がい、結合、クローン
化、単離及び配列決定が行ない得る。各操作後、ＤＮＡ
フラグメント又はそれらフラグメントの組合せたものを
クローニングベクターに挿入し、そのベクターにより、
例えば大腸菌等のクローニング宿主を形質転換し、この
クローニング宿主を生育させ、溶菌した後プラスミドを
単離してからそのフラグメントを制限分析、配列決定又
はそれらを組合せて分析する。また大腸菌は大量のタン
パク質生産の目的で、目的遺伝子発現の宿主として用い
る。

構築物の開発及び宿主細胞の形質転換の際には種々のベ
クターが用いられる。これらベクターにはクローニング
ベクター、発現ベクター及び宿主への組込みを提供する
ベクター又は形質転換及び組込みのための裸のＤＮＡの
使用を可能にするベクターが含まれる。

はとんどの場合、クローニングベクターは、クローニン
グベクターを含む宿主の選択マーカー及び形質転換促進
配列による特徴を有しているが、場合によっては１個以
上のポリリンカー、又は挿入、選択、操作、配列決定、
切断等に適する付加的配列を含む。

通常発現ベクターは転写及び翻訳開始及び終止領域を含
む構築物の挿入を提供する。すなわち構築物はそれらの
制御領域の１方又は両方を欠いており、それらはタンパ
ク質産物をコードする配列を挿入した発現ベクターによ
り提供される。

目的の酵素をコードするＤＮＡはＥＰ−Ａ−２６０７６
２に記述されている操作に従かいペニシリウム（Ｐｅｎ
ｉｃｉ１１ｉｕｍ　）宿主に導入される。

ペニシリウム（Ｐｅｎ１ｃｉ１１ｉｕｎ　）の効率的形
質転換は、特に宿主ゲノムに組込まれた（インチグラン
ド）、発現し得る１個以上の構造遺伝子を有するトラン
スホーマントを提供する。形質転換宿主細胞の選択を可
能にするＤＮＡ構築物を調製する。

高頻度の形質転換が可能となる形質転換条件を適用し、
目的とする構造遺伝子を発現する形質転換宿主の選択及
び単離を保証する。生成したトランスホーマントは、組
込みＤＮＡの安定的保持及び発現を提供する。本発明に
従う形質転換宿主は、他のＤＮＡ仲介形質転換、例えば
原形質融合、交配及び突然変異等の株数良法における出
発株として用い得る。生成した株は本発明の一部を形成
すると考える。

形質転換により導入した目的遺伝子は、その形質転換ベ
クターの組込み部分を形成しているが、しばしばその形
質転換混合物中の別のベクター上にこれらの遺伝子を乗
せておき、繊維状菌類の場合には非常に効率的プロセス
である選択ベクターとのコトランスホーメーションによ
り該遺伝子を導入する方が、より簡便である（例えば、
Ｐ、Ｊ。

プント（Ｐｕｎｔ　）等、ジーン（Ｇｅｎｅ）５６（１
９８７）１１７−１２４、Ｋ、ワーナース（Ｗｅｒｎａ
ｒｓ　）等、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　）２
０９　（１９８７）７１−７７　；　　１．Ｈ，マター
ン（Ｍａｔｔｅｒｎ　）等、モレキュラー・アンド・ジ
ェネラル・ジエネティクス（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅ
ｎｅｔ、　）２１０　（１９８７）４６０−４６１）。

形質転換の結果、目的遺伝子の少なくとも１コピー、し
ばしば２個以上で通常１００個以下、より普通には約１
０個以下のコピーが存在する。その数は組込み又は安定
なエピソーム的維持が可能かどうか、組込まれたコピー
数、該構築物が増巾を受けているかどうか等に依存する
。

本発明は二次代謝産物の生産増加のための潜在的遺伝子
を同定するのに例証となる、特異的ｃＤＮＡプローブを
用いた生産生物、Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｎ＋　）の遺伝子ライブラリー由来のペニシリン生
合成に関する遺伝子単離法を゛例示している。二次代謝
産物の生合成に参与している１個以上の遺伝子をコード
するＤＮＡ構築物を単離するための本方法には、生合成
に際して特異的に発現される配列を濃縮したｃＤＮＡプ
ローブで遺伝子ライブラリーをスクリーニングすること
が含まれる。′特異的に“発現されるとは、これらの遺
伝子がペニシリン生産が無い場合は、発現されないか、
又はその発現が非常に低いレベルであり（例えば、生産
レベルの５％以下）、一方ペニジリン生産に際しては発
現のレベルが高いという事を意味している。最後に、ペ
ニシリン生産相のＰ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅ
ｎｕｍ　）菌糸体から単離されるｍＲＮＡテンプレート
上で放射性又は他のラベル化したｃＤＮＡプローブが合
成される。

ついで、このプローブをペニシリン生産を許さない、例
えば高グルコース濃度等の条件下のペニシリウム（Ｐｅ
ｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）発酵由来のｍ　ＲＮ　Ａにハイ
ブリダイズするｃＤＮＡ配列を除去することにより、望
ましい遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を濃縮
する。この濃縮プローブを用い、Ｐ、クリソゲナム（ｃ
ｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）遺伝子ライブラリーから非生
産菌糸体由来のプローブにハイブリダイズしないクロー
ンを選択する。このようにして得た多くのクローンはペ
ニシリン生合成酵素イソペニシリンＮシンセターゼ（Ｉ
　ＰＮＳ又はシクラーゼ）をコードしているようである
。

さらに、これらのクローンの中に側鎖交換酵素（アシル
トランスフェラーゼ）をコードする数コピーの遺伝子が
存在することが分った。このことは精製した酵素のアミ
ノ末端ペプチド配列に基づ＜　ＤＮＡプローブを採用し
た実験で証明された。

これらのクローンの同一性は、生化学的及び生物学的に
証明された。アシルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレ
オチド及び推定されるアミノ酸配列を第３図に示す。驚
くべきことに、イソペニシリンＮシンセターゼ及びアシ
ルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が１つの
ＤＮＡフラグメント上に一緒に存在している。このこと
はラムダベクターＥＭＢＬ３におけるＰ、クリソゲナム
（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）のゲノムライブラリーの
、各上記遺伝子に特異的なプローブによるハイブリダイ
ゼーションで示された。同一クローンが両方のプローブ
と別々にハイブリダイズした。

サラに、１つのゲノムラムダクローンの物理マツプ構築
及びそのラムダクローン制限断片の、両遺伝子に対する
別々のプローブによるハイブリダイゼーション後、その
ゲノム構成は第２図に示したものであることが示された
（クローンＢ２１及びＧ２）。１個の大きいＤＮＡフラ
グメント上における両遺伝子の存在が、両遺伝子の相対
的構成又は均衡のとれた発現を乱すことなく、両イソベ
ニソリンＮシンセターゼ及びアシルトランスフェラーゼ
遺伝子を高い密度で含むＰ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓ
ｏｇｅｎｕｎ＋　）の構築を可能にした。さらに多数の
、その大きいＤＮＡフラグメントの導入は、正常な状態
と、同様の上流及び下流の配列を含む自然な環境で、そ
のＤＮＡフラグメント以上の両遺伝子を発現させる。

均衡のとれた発現及び自然環境の維持の両方が、遺伝子
発現、すなわちペニシリン生産増加に有利であることが
分った。〔イソペニシリンＮシンセターゼ＋アシルトラ
ンスフェラーゼ〕遺伝子りラスター〇単離技術は、染色
体歩行技術を用いて、ペニシリン生合成遺伝子がクラス
ター化している、その他のペニシリン生合成遺伝子の単
離にうまく応用できる。

さらに、β−ラクタム生合成に１役を担っているように
思われるがまた機能が明確ではない多くの潜在的遺伝子
が単離されている。本発明の潜在的遺伝子の物理マツプ
を第２図に示す（クローンＢ９−８２３）。

″潜在的′遺伝子のうち、クローンＢ９、Ｌ５及びＧ５
に存在するＹと命名される遺伝子は、適当な宿主に形質
転換したとき（３，０ｋｂ　Ｓｐｈ　Ｉ　＋ＢａｍＨＩ
サブフラグメントとして）、非形質転換宿主と比較して
、ペニシリン生産を２６％増加させる。このことは、ペ
ニシリン生合成において遺伝子Ｙ産物が関与しているこ
とを示している。さらに、このことは、それらの機能又
はその物自体を知ることなしに、本発明の方法で単離し
た遺伝子を用いる形質転換をＰ、クリソゲナム（ｃｈｒ
ｙｓｏｇｅｎｕｍ　）の株改良にうまく応用できること
を示している。

さらに本発明は、抗生物質が合成される条件下で特異的
に発現し、かつその抗生物質生成への生合成反応を触媒
する遺伝子産物をコードする遺伝子を有する形質転換Ｐ
、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）で例示さ
れる。

このような１つの酵素アシルトランスフェラーゼ（以後
ＡＴと呼ぶ）はペニシリン生合成の最終ステップ、すな
わちイソペニシリンＮのアミノアジビジル部分の、例え
ばフェニル酢酸又はフェノキシ酢酸等の疎水性側鎖前駆
体による交換を触媒し、各々ペニシリンＧ又は■を化成
する。

Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）のアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子で、その配列が同じアミノ
配列をコードするが、３０％もの異なる塩基、より一般
には多くとも約１０％の異なる塩基を有する保存的突然
変異、又は、約１０％以下より一般的には約５％以下、
好ましくは多くとも約１％のアミノ酸が、天然のアミノ
酸と比較して置換又は欠失しており、かつ５％以下の挿
入アミノ酸を有する非保存的突然変異をもつものが提供
されている。さらに、通常約９個のコドン、より一般的
には少なくとも約１５個のコドンからなる、該酵素をコ
ードする両核酸フラグメントが、それらの発現産物と同
様抗体生産のためのプローブとして用いられる。このプ
ローブはハイブリダイゼーション用の核酸又は交叉反応
タンパク質同定用の抗体を用いることによる、異種生物
中の酵素の同定に用いられる。

アシルトランスフェラーゼの基質となる非天然側鎖前駆
体又は他のペニシリン又はセファロスポリン類の探索は
、本来の基質イソペニシリンＮ以外の、フェニル酢酸又
はフェノキシ酢酸以外の側鎖前駆体、又はペニシリン類
又はセファロスポリン類を基質とするアシルトランスフ
ェラーゼ酵素変異体の探索で補い得る。本発明はそのよ
うなアシルトランスフェラーゼ酵素変異体の探索の出発
物質を提供する。大腸菌は突然変異クローニング実験の
最良の宿主である。すなわち大腸菌は、本アシルトラン
スフェラーゼ遺伝子中に存在するイントロンを除去する
スプライシング機構を欠いているので、アシルトランス
フェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡクローンは大腸菌中の該酵
素発現の選択配列となる。このｃＤＮＡ配列は、例えば
照射（Ｘ線又はＵＶ）又は化学的変異原（エチルメタン
スルホネート、ニトロソグアニジン又はメチルメタンス
ルホネート等）又は部位指定突然変異誘発など当分群で
よく知られている操作で容易に突然変異を起こし、一方
では、基質として非天然の側鎖前駆体を認識し、イソペ
ニシリンＮから非天然型のペニシリン生成を触媒し、又
一方ではイソペニシリンＮ以外のペニシリン類又はセフ
ァロスポリン類の側鎖交換反応を触媒する酵素変異体を
入手し得る。

ＡＴ−１Ｙ−及び他のペニシリン生合成遺伝子の単離は
、プロモーター、上流活性化配列（ＵＡＳ）、ターミネ
ータ−等の各遺伝子の制御要素の同定を可能にする。こ
のことは、それら遺伝子自体の配列比較、及びイソペニ
シリンＮシンセターゼ生合成遺伝子及びその他の関連遺
伝子間の配列比較で行い得る。さらに後者の比較はペニ
シリン生合成遺伝子群の遺伝子発現制御の特別な性格を
明らかにする。

このような“ペニシリン生合成制御要素″の同定はゲル
遅延、交叉結合、ＤＮＡフィンガープリンティング等の
標準技術により特異的制御Ｂタンパク質の同定を誘導す
る。アフィニティークロマトグラフィーによる特異的制
御タンパク質の単離は該タンパク質をコードする遺伝子
のクローニング及び適当な宿主における操作を可能にす
る。

クローン化したＡＴ遺伝子、と遺伝子及びその他のペニ
シリン生合成遺伝子の使用により、修正酵素を設計し合
成する。これらの修正は、至適ｐＨ又は温度、安全性の
変化又は基質特異性の変化等、該酵素の特性を変化させ
る。これら修正酵素をコードする遺伝子で形質転換した
宿主株が種々の条件下での抗生物質生産又は、例えばペ
ニシリンの代りにアンピシリン等、別の抗生物質の°合
成を行うよう計画し得る。

本発明の別のコードしては、クローン化した遺伝子が、
本来これらの酵素を有しない宿主株を形質転換し得るこ
とがある。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　）及びアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　
）はＡＴ酵素を有しないが、一方、ペニシリウム（Ｐｅ
ｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）はセファロスポリン及びセファ
ロマイシン生合成酵素の遺伝子を欠いていることが知ら
れている。宿主株へのこれら遺伝子の導入は、ペニシリ
ウム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）によるセファロスポ
リン又はセファロマイシン生合成又は、アクレモニウム
（Ａｃｒｅ＋１ｌｏｎｉｕ＋ｓ　）による疎水性側鎖を
もつペニシリン又はセファロスポリンの合成を起こす。

次に示す結果から、二次代謝産物生産は二次代謝産物生
産と関連するＤＮＡ配列の同定を可能にするスクリーニ
ング操作を用いることにより大巾に増加し得ることは明
白である。二次代謝産物と関連する特異的配列の同定に
おいて比較法を用いることにより、プローブとして使用
するためのｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを単離及び同定する。

従ってまた機能が分っていない潜在的遺伝子を含むフラ
グメントが二次代謝産物の生産を大巾に増加することが
分り、かつこの二次代謝産物の生産のため宿主の形質転
換に用いられる。この操作は特にペニシリンについて例
示される。

さらにβ−ラクタム化合物を、修飾する酵素として、ラ
ベルとして、アシルトランスフェラーゼに対する抗体生
産のための抗原源として、プロモーター配列源として、
結晶化のための大量のタンパク質発現源として、修正し
た特性を有する酵素を得るためのインビトロ突然変異誘
発のテンプレートとして使用する等、巾広い用途がある
ことが分ったアシルトランスフェラーゼ遺伝子が提供さ
れた。

この明細書に記述されている全ての出版物及び特許出願
は、各々個別の出版物又は特許出願が、特別かつ個別に
参考として引用されていると明示されているのと同様に
、参考として引用している。

本発明は、より明確な理解を目的として説明及び例によ
り詳細に記述されているが、当業者にとって本発明が特
許請求の範囲の精神又はその範囲を逸脱することなしに
、ある変化及び修正が可能であることは明白であろう。

次に示す例は説明を目的とするもので、本発明を制限す
るものではない。

（例１） ペニシリウムクリソゲナムのゲノムライブラリーの構築 ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｎ＋　）　　（ＡＴＣＣ２８０８
９）のゲノムライブラリーは、実質的に当分群でよく知
られている方法に従がい構築した（Ｔ、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　）等（１９８２）モレキュラークロニ
ング、ラボラトリ−マニュアル、コールドスプリングハ
ーバ−ラボラトリ−１ＮＹ）。先にＥＰ−Ａ−２６０７
６２で報告されているように菌糸体から原形質体を生成
することにより、染色体ＤＮＡをペニシリウムクリソゲ
ナム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ
　）から抽出した。

その後４倍容のＴ　Ｅ　Ｓバソフプ　（０，０５Ｍ１−
リス・塩酸ｐ　Ｈ８，０，０゜ＩＭ　ＥＤＴＡ、０．１
５ＭＮａＣ１）で等張（０，７ＭＫＣｌりサスペンショ
ンを希釈することにより、この原形質体を溶解した。

この溶解物に１％ラウリル硫酸ナトリウムを加え、この
混合物を５５℃で３０分間インキヱベートした。フェノ
ールで１回及びクロロホルムで２回抽出した後、ＤＮＡ
をエタノール沈殿し、乾燥後ＴＥバッファ　（１０ｍＭ
　　トリス、１ｍＭＥＤＴＡｐＨ８，０）に溶解した。

さらにこのＤＮＡ溶液を１００．１７ｇ／ｍ／！のＲＮ
ａｓｅを用いて、３７℃、１時間処理した後、２００μ
ｇ　／　ｍ　１のプロティナーゼＫを用い、４２℃で１
時間処理した二この溶液をフェノールで１回及びクロロ
ホルムで２回抽出した。等容量のインプロパツールを水
層の上に重層し、これをガラス棒でかき回しながらその
界面に析出するＤＮＡを回収した。乾燥後このＤＮＡを
ＴＥバッファに溶解した。このようにして得たＤＮＡ溶
解物の分子量は、約１０”であっで切断した脱リン酸化
ＥＭＢＬ３　（プロメガバイオチク、マジソン、Ｗｂ　
ＵＳＡ）にライゲーションした後、プロメガバイオチク
製のパッケージーンシステム（Ｐａｃｈａｇｅｎｅ　５
ｙｓｔｅｎ＋　）を用いてバクテリオファージラムダカ
ブシト中に包み込んだ。

パッケージ反応を２２℃、２〜３時間行った事以外は、
全ての反応を業者の指示に従って行った。

パンケージ化ファージをブレーティングし、３７℃で７
〜８時間インキュベーションした後ペトリ皿当り４　ｍ
　ｌのＳＭバッフｙ　　（０，ｌ　Ｍ　ＮａＣ１，０、
ＯＩ　Ｍ　Ｍｇ５Ｏａ、０．０５Ｍ１−リス・塩酸ｐＨ
７，５，０，０１％ゼラチン）を用いてファージを溶出
することによりライブラリーを増巾した。

（例２） 比較スクリーニング法を用いたペニシリン生合成中に特
異的に発現する遺伝子の単離 ペニシリン生合成に際し、特異的に、又は著しく発現す
る遺伝子を、生産性（ラクトース生育）及び非生産性（
グルコース生育）菌糸体から抽出したｍＲＮＡテンプレ
ート上で合成したラベル化ｃＤＮＡプローブを用いて、
例１のゲノムライブラリーを検索し、かつ先の（＋）プ
ローブで著しくポジティブなシグナルを与えるクローン
を選択することにより同定した。

メツセンジャーＲＮＡは、生産培地中（例３参照）（＋
調製）又はラクトースをグルコースで置換えた同培地（
−調製）中３日又は６日間増殖した培養物から単離した
。その菌糸体を濾過で回収し、液体窒素中で凍結してか
らホモジナイズした後、ｍＲＮＡをＴ、マニアチス（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　）等のグアニジンイソチオシアネート
法（上述）を用いて単離した。

１２．５　　　　ｍＭ ５０　　　　　ｍＭ １００　　　　　ｍＭ １２５　　　　　ｍＭ ２　　　　　ｕ／μ１ ５００　　　　　ｐＨ ３Ｏ０ｐ　Ｍ ５００　　　　　ｐＨ ｇＣ１ｚ トリス　１ｌｃ７！　　ｐＨ８，３ ＣＩ ＴＴ ｙ−ルエヌアシン ＧＴＰ ＣＴＰ ＴＴＰ ２５　　　　　　８Ｍ　　　　　　　　　ｄＡＴＰＯ，
１、ｔ／　ｇ／ｍ　Ｉ　　　　　　ＵＳＡｌｏｏ−２０
０μｇ／ｍ　ｌ　　　　　　　　　ポリ　Ａ”ＲＮＡ５
Ｏ−６０μｇ／ｒｎ　ｌ　　　　　　　オリゴ　ｄＴ１
２−１１１．２　　　　ｕ／μｌ　　　　逆転写酵素１
．６７　　　　　μＣｉ／μ　ｉ　　　　　　〔α−”
Ｐ）　　ｄＡＴＰを含む３０μｐの反応混合物中（ポリ
Ａ″ＲＮＡ及びオリゴｄＴは別に混合し、反応混合物に
添加する前に１分間１００℃に加熱し、ついで氷水で冷
却する）、両ｍＲＮＡに対してｃＤＮＡを合成し、かつ
〔α−”Ｐ）ｄＡＴＰを用いて高比活性のラヘル化を行
った。４２℃、１時間のインキュベーションの後、５１
１１の１ｍＭｄＡＴＰを加え、さらに３０分間インキュ
ベーションを続けた。つづいてこの反応混合物を２０　
ｍＭ　ＥＤＴＡ、　４０ｍＭ　Ｎａ０１１　（最終体積
１０（１１ｊｊ２）としてから６５℃に加熱した。１時
間のインキュベーション後、５μβのＬＭ）リス・塩酸
（ｐＨ８，３）、４０μｌの０．ＩＮＨＣｆ、７μｇ仔
牛胸腺ＤＮＡ、１００μＡＴＥＳバッファ　（１０ｍＭ
）リス、１　　ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、ｐＨ７，５
＞、及び２００μｌの５Ｍ酢酸アンモニウムを加えてか
ら、８００μｌのエタノールを用い、−２０℃、１６時
間でＤＮＡを沈殿させた。

沈殿を遠心で回収し、７％エタノールで洗浄後、乾燥し
てから、３２μｐのＴＥバッファ（１０ｍＭトリス、１
　　ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に溶解した。

その後（ｔ）ｃＤＮＡ調製物について、３２．５　　　
　μβ　　　（＋）　ＣＤＮＡ１０　　　　　μｍ　　
　　（−）　ｍＲＮＡ　（１μｇ／μｍ）３０　　　　
　、ｕ　ｌ　　　　ＩＭ　ＮａＰＯｔ　　ｐＨ６，８１
，５μ　ｌ　　　　　　　　１０χ　５ＤＳ１　　　　
μｍ　　　　Ｏ，５Ｍ　ＥＤＴＡを含む７５μ２の反応
混合物中、（−）ｍＲＮＡ調製物に対する連続する２回
のハイブリダイゼーションにより、ペニシリン生合成に
際し特異的に発現する配列の濃縮を行った。

６８℃、１６時間のインキュベーション後１０２μｌの
水を加え（最終リン酸濃度１７０ｍＭ）、６８℃でこの
混合物を１７０ｍＭリン酸で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラムに通した。これらの条件下、二本鎖核酸
はカラムに結合するが、−末鎖核酸は溶出する。この溶
出物を回収し、ＴＥバフファに対して１．５時間透析し
た後４μｇのキャリヤー（１牛胸腺）ＤＮＡを添加して
エタノール沈殿を行った。この操作を繰り返し、最終的
に未結合のｃＤＮＡを以下に示すようにペニシリウム（
Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）株のゲノムライブラリーの
スクリーニングプローブとして直接使用した。

例１の増巾ライブラリーのサンプルを、ペトリ皿当り約
１５００個のプラークを含めるように５枚のベトリ皿に
添加した。このプレートの複製を業者の説明に従かいシ
ーンスクリーンプラスフィルタに作ったにューイングラ
ンドニュークリア）。

１組のフィルターをラベル化濃縮（＋）ＣＤＮＡ調製物
で採った。ポジティブプラークを精製し、第２のスクリ
ーニングを行った。このようにして（＋）ｃＤＮＡプラ
ークに対し著しくポジティブシグナルを与える９６個の
プラークを選択した。

最初のスクリーニングにおいて２強“又は“中“のシグ
ナルを与える組換えファージのＤＮＡを３２ｐでラベル
化し、生産及び非生産菌糸体での発現レベルを測定する
ための、両画糸体由来のペニシリウム（Ｐｅｎ１ｃｉ１
１ｉｕ＋ｎ　）ＲＮＡのノーザンプロットを採るプロー
ブとして用いた。このことから組換えクローンは３つの
グループに分けられる。

クラス１はペニシリン生合成の際に非常に発現される。

遺伝子を含み、クローン ＊６２及びＢ２１ ＊Ｂ９、Ｌ５及びＧ５ ＊Ｌ１２ ＊に９ で例示される。

クラス２は、中程度に発現し、 ＊Ｃ１２ ＊Ｐ３及びＫ１１ ＊Ｂ１３ ＊Ｂ２０ で例示される。

クラス３は発現は低く、 ＊Ｇ３ ＊Ｇｌ　　　　　　　　　　　　　＊Ｋｌ　６＊ＬＩＯ
＊Ｂ２３ で例示される。

これら組換えファージの物理マツプを第２図に示す。ク
ローンＧ２及びＢ２１をイソペニシリンＮシンセターゼ
特異的プローブで採るとポジティブのハイブリダイゼー
ションシグナルを与える（　Ｓ、Ｍ、サムソン（Ｓａｍ
ｓｏｎ　）等、上述）。驚くべきことに同クローンはア
シルトランスフヱラーゼ特異的プローブともハイブリダ
イズするようである（例５参照）。

（例３） アシルトランスフェラーゼの精製 ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ
ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）株（ＡＴＣＣ２８０８９）
を、コーンひたし１（２０Ｋ１１、酒造溶質物（２０Ｋ
１１り、スクロース（２０ｇ　／　ｌ　）　、ＣａＣＯ
ｚ（５ｇ／β）（滅菌前ｐ　Ｈ５，７）を含む複合接種
培地に接種する（２Ｘ１０６コンジア／　ｍ　ｌ　）。

３６時間、２５℃、２５０ｒｐｍのインキュベーション
後、得られた培養物を、コーンひたし液固形物（３５Ｋ
１１）　、ラクトース（２５ｇ／ｊ？）　、フェニル酢
酸カリウム（２，５Ｋ１１）　、Ｍｇ５Ｏ，・　７８！
Ｏ（３Ｋ１１）、ＫＩＩｚＰＯ４，（７ｇ／ｆ）　、コ
ーン油（２，５ｇ／　ｆ）　、ＣａＣ０：＋　　（１０
ｇ／　Ｎ）を含む２０倍容の複合生産培地の接種に用い
た。４８時間のインキュベーション後、濾過により菌糸
体を回収し、その濾過固形物を冷０．１５　Ｍ　ＮａＣ
１で４回洗浄した。

菌糸体２００ｇ　（湿重量）を５　ｍＭのジチオスレイ
トールを含む０．０５　Ｍ　トリス・塩酸（ｐＨ８）（
以後ＴＤバッファと呼ぶ）７０Ｑｍｃに懸濁し、エタノ
ール／ドライアイス浴で冷やしながら、バロチニガラス
ビーズ（シグマ社Ｖ型、径４５０〜５００μｍ）を用い
、ブラウン製デスインチグレーター（ブラウン社、メル
サンゲン、Ｆ、Ｒ，Ｇ、）中、１５秒の間隔を置いた３
０秒間の処理で破壊した。その後この抽出物を２０．Ｑ
ＯＯｘｇ、３０分間で遠心した。その操作及び以後の操
作は４℃で行った。抽出物６４０ｍｌに０．０５Ｍ）リ
ス・塩酸（ｐＨ８）中１０％（智／ν）の硫酸プロタミ
ン溶液２７ｍ１を緩やかに加えた。４５分間の攪拌後、
沈殿した核酸を２０，０００ｘｇの遠心で除去し、その
上清を溶液のｐＨを８．０に維持しながら硫酸アンモニ
ウムを添加することによる沈殿化で分画した。４０％及
び５５％飽和の間で沈殿するフラクションを、１Ｍ硫酸
アンモニウムを含むＴＤバッファに溶解し、同バッファ
で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラム（
１，８Ｘ１６ｃｍ）にかけた。５ｍｌ／ｍｉｎの流速で
ＴＤバッファを流すことにより未結合タンパク質の放出
がなくなるまでカラムを洗浄した。

その後、０．０５　Ｍ　ｌ−リス・塩酸（ｐＨ８，０）
中４０％のエチレングリコール溶液を用い、カラムから
アシルトランスフェラーゼを溶出した。

この溶出フラクションについて、最終容積２００μβ中
０．２ｍＭフェニルアセチル補酵素Ａ、０．２ｍＭ　６
−アミノペニシラン酸、５　ｓＭジチオスレイトール、
０．１　Ｍ　ｌ−リス・ＨＣｌ（ｐＨ８，０）及び酵素
抽出物を含む反応混合物中２５℃でインキュベーション
することにより、アシルトランスフェラーゼ活性の検定
を行った。１０分後２００μｌのメタノールを加えるこ
とにより反応を停止した。このサンプルを５０００ｘｇ
で遠心し、従来の微生物学的又はクロマトグラフィー的
方法により、その上清のペニシリンＧを検定した。

フェニルセファロースカラムからの活性フラクションを
集めて、ＴＤバッファで平衡化したＤＥＡＥ−セファロ
ースカラム（１，５Ｘ２０Ｃ１１）にかけ、０、２５　
ｍ　ｌ　／ｗｉｎの流速でＴＤバッファ中ＯＯ，２５Ｍ
　ＮａＣ１の直線濃度勾配を用いてアシルトランスフェ
ラーゼ活性を溶出した。集めた活性フラクションを７０
％硫酸アンモニウムで沈殿し、そのベレットを３ｍｌの
ＴＤバッファに溶解した後ＴＤバッファで平衡化したセ
ファデックスＧ７５　（粗）カラム（２，６Ｘ７０ｃｍ
）にかけた。

９ｍｌ／ｈの流速のＴＤバッファを用いてアシルトラン
スフェラーゼを溶出し、アシルトランスフェラーゼ活性
を有するタンパク質の対称ピークとして得られるフラク
ションの後半部分を回収した。Ｒ終精製度は２５８倍で
あった。

（例４） アシルトランスフェラーゼのアミノ末端アミノ酸配列決
定及びそれに対応するオリゴヌクレオチドプローブ混合
物の設計 例３で得られた酵素調製物を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにか
けた（υ、に、レムリ　（Ｌａｅｍｍｌｉ　）、ネイチ
−？−（Ｎａｔｕｒｅ）２２７　　（１９７０）６８０
ｆｆ）（１３％アクリルアミド、５０ｍＡ）、２９ＫＤ
バンド（タンパク質約１０μｇ）をＳＤＳゲルから切り
出し、そのタンパク質をマルチフォー■ツバプロットユ
ニット　（ＬＫＢ、　０．８　ｍＡ／ｃｄ、　９０分、
電極バッファ５　ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８，０）
を用い、ＰＣＧＭ２メンブレン（ポリブレン含浸クラス
ファイバー、ヤンセン（Ｊａｎｓｅｎ　）、パース（Ｂ
ｅｅｒｓｅ　）　、ベルギー）に電気泳動により転移さ
せた。プロッティング後、そのＰＣＣＭメンブレンを２
５　ｍＭ　ＮａＣｊｉ’、　１０　ｍＭホウ酸ナトリウ
ム、ｐＨ８，０）で４回洗浄し、空気乾燥した。このよ
うにして得たＰＣＧＭ吸着タンパク質バンドを気相シー
クエネーター（アプライドバイオシステム社４７０ａ型
）を用いてＮ末端アミノ酸配列を分析した。以下の配列 ｔｈｒ−ｔｈｒ−ａｌａ−ｔｙｒ−ｃｙｓ−ｇｌｎ−１
ａｕ−ｐｒｏ−ａｓｎ−ｇｌｙ−ａｌａ−Ｉｅｕ−ｇｌ
ｎ−ｇｌｙ−ｇｌｎ−ａｓｎ−ｔｒｐ−ａｓｐが決定さ
れた。このアミノ酸配列の下線部分に従かい以下に示す
オリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。

しばしば調製物中に存在する１０ｋＤバンドのアミノ末
端アミノ酸配列も決定したがオリゴデオキシリボヌクレ
オチドプローブの構築には用いなかった。得られた配列
は、 Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−旧ｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｘ−ＧＩｎ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇ
ｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−旧５−Ｇｌｙ−３ｅｒ−＾１ａ
−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ−＾１ａ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ａｌａ
。

であった。

（例５） アシルトランスフェラーゼ遺伝子の同定例２の多くのラ
ムダクローンのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａ１
１で消化し、そのフラグメントを０．７％アガロースゲ
ルで分画し、シーンスクリーンプラス（Ｇｅｎｅ　５ｃ
ｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ　）に転移後、例４の（３２ｐ）末
端ラベル化オリゴヌクレオチド混合物とハイブリダイズ
させた。ポジティブシグナルを示すクローンを標準法を
用いた制限分析によりマツプ化した。組換えファージ、
ラムダＢ２１及びラムダＧ２由来の２個の代表的物理マ
ツプを第２図に示す。オリゴデオキシリボヌクレオチド
混合物はマツプ上に示されているＥｃｏＲＩ　／　１ｌ
ｉｎｄ　ｍフラグメントに特異的にハイブリダイズした
。このフラグメント及び隣接するフラグメントをｐＴＺ
１８／１９（ユナイテッドステートバイオケミカルコー
ポレーション）に再クローン化し、ヌクレオチド配列分
析を行った。決定された配列及び推定されるアミノ酸配
列を第３図に示す。

調製物中に存在する１０ｋＤのアミノ末端アミノ酸配列
も決定し、これが２９ｋＤ配列上流のＤＮＡ配列に相当
することが分った。それゆえおそら＜ＡＴは４０ｋＤの
タンパク質として合成されるのであろう。このことは、
１５００塩基の長さを持ち、従って３′及び５′側に１
００塩基の非翻訳領域を有するｍＲＮＡの長さ（３８ｋ
Ｄのタンパク質をコードするイソペニシリンＮシンセタ
ーゼｍＲＮＡと同じ）から確認される。

２９ｋＤのアミノ酸配列（Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔ
ｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇ　１ｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇ
　１ｙ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ１　ｙ−Ｇ　
ＩｎＡｓｎ−Ｔｒｐ−＾５ｐ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−３ｅｒ
−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ａｌａ）及び１０
ｋＤのタンパク質は２つのイントロンの存在を明らかに
した。第３のイントロンの存在が、１０ｋＤタンパク質
全体のアミノ酸組成及びその境界のコンセンサス配列に
基づいて推定される（口、Ｊ、バランス（Ｂａ１ｌａｎ
ｃｅ　）、イースト（Ｙｅａｓｔ　）叢（１９８６）２
２９−２３６）。この第３のイントロンは、ブライマー
伸長及びコード領域及び非コード領域由来のオリゴヌク
レオチドプローブを用いたノーザンプロットにより確か
められた。

（例６） ｐＰＳ４７の構築 ホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）遺伝子をハイブ
リダイゼーションプローブとして、対応するイースト遺
伝子（ヒッツエマン（Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎ）等、上述）
を用いた標準法によりペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉ１１
　ｉｕｍ）ゲノムライブラリーより単離した（マニアチ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）、例１　）　ｏ　ｆ１ｇｋプ
ロモーター領域は、ｐｇｋコード領域の直前に位置する
、第５図に示した配列により部分的に特定される。

Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）　ｐｇ
ｋプロモーターを１゜５　ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラ
グメントとしてｐＴＺ１８Ｒにクローン化し、その中か
ら望ましい配向のクローンを選択した。

つづいてフレオマイシン耐性遺伝子を、ｐＵＴ７０２　
（カイラ　（Ｃａｙｌａ　）、トウールースセデックス
（Ｔｏｕｌｏｕｓｅ　Ｃｅｄｅｘ　）　、フランス）か
ら単離してこのクローンのポリリンカーのＢａｍＨ１部
位にクローン化した。このｐｇｋプロモーターは以下の
配列； ５　’　　−ＧＧＡ　　ＡＣＧ　　ＧＣＡ　　ＣＴＧ　
　ＧＴＣＡＡＣＴＴＧ　　ＧＣＣＡＴＧ　　ＧＴＧＧＧ
Ｔ　　ＡＧＴ　　ＴＡＡ　　ＴＧＧ　　ＴＡＴ　　Ｇ−
３’をもつオリゴヌクレオチドを用いて、欠失させる配
列をループアウトさせることにより、フレオマイシン耐
性遺伝子と読み枠が合うように融合した。

さらにこのオリゴヌクレオチドはＡＴＧ部位（下線）に
Ｎｃｏ１部位を導入する。

（例７） 高い形質転換効率を有する形質転換ベクター（ｐＰＳ５
４）の構築 β−ラクタム生合成に関する非選択性遺伝子を相補又は
増巾する目的で、形質転換又は共形質転換により遺伝子
を導入するのに十分高い形質転換効率を有するＰ、クリ
ソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｎ＋　）を得るため、
その形質転換ベクター中に形質転換促進配列が含まれる
ことが望ましい（アスペルギラス（八ｓｐｅｒｇｉ１１
ｕｓ　）におけるａｎｓ、Ｄ、Ｊ、バランス（Ｂａ１ｌ
ａｎｃｅ　）及びＧ、ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ　）、ジ
ーン（Ｇｅｎｅ）３６　　（１９８５）３２１−３３１
）。

驚くべきことにＰ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎ
ｕｍ　）中で機能する形質転換促進配列は、Ｐ、クリソ
ゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）　工Ｇ遺伝子を含
むＤＮＡフラグメント中に存在する。この２．４　ｋｂ
　ＥｃｏＲＩフラグメントの一部は第４図に示されてい
るヌクレオチド配列により特定される。このＤＮＡフラ
グメントはプラスミドｐＵｃ１３のＢａｍＨ１部位にク
ローンにクローン化された４　ｋｂ　５ａｎ３Ａ部分フ
ラグメントの一部を形成している（Ｊ、メシング（Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ　）、メソッド・イン・エンザイモロジー（
Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　　１０１　　（ア
カデミツクプレス、１９８３）ｐ２ｏ　　ｆｆ　）、　
こ（７）プラスミドを以後ｐＵｃ１３　ｉ　ｉ　　ｐｙ
ｒＧと呼ぶ（ＥＰ−Ａ−２６０７６参照）。

２、４　　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントは、Ｐ、クリ
ソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｎ＋　）由来のホスホ
グリセレートキナーゼ（ｐｇｋ　）遺伝子のプロモータ
ーの制御下、ストレプトアロティカス・ヒンダスタナス
（５ｔｒｅｐｔｏａ１１ｏｔｅｉｃｈｕｓ　ｈｉｎｄｕ
ｓｔａｎｕｓ　）のフレオマイシン耐性遺伝子を含むプ
ラスミド（ｐＰＳ４７）中に含まれていた。生成した構
築物はｐＰＳ５４である。

形質転換効率に関する因グＧフラグメントの促進効果を
以下の第１表に示す。

第１表 プラス　ミ　ド　　　　　　　　　　　　　　トランス
ネーマント／μｇＤＮへｐＰＳ４７　　（ｐｈｌｅｏ”
　　）　　　　　　　　　　　　　　　　　　３７ｐＰ
Ｓ５４　　（ｐｈｌｅｏＲ、Ｐｙ工Ｇ）　　　　　　　
　　　　１８６（例８） ＡＴクローン同定の生物学的及び生化学的１１ｉ認ＡＴ
クローンの同定は、Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇ
ｅｎｕｍ　）のアシルトランスフェラーゼネガティブ突
然変異体、轄１ｓ５４　１２５５．Ｈ狙８の相補性によ
り確認した。

ｗｉｓ５４　１２５５、ｎｐｅ８株のウラシル要求誘導
体、ｗｉｓ５４−１２５５、但徂８ｂ工Ｇ（ＣＢＳ５１
２．８８）の２Ｘ１０’個の原形質体を、５μｇの選択
性プラスミドｐＵｃ１３ｉｉ里Ｇ及び１５℃ｇのラムダ
Ｂ２１ＤＮＡの混合物を用い、先に報告されている方法
（ＥＰ−Ａ２６０７６２）により共形質転換した。

数百側のトランスホーマントが得られ、その中のコニシ
アを回収して、ベトリ皿当り１〜１０個のコロニーとな
る密度で、例１の複合生産培地にブレーティングした。

２５℃、３日間のインキュベーション後、そのプレート
にペニシリン感受性バチルスサチルス（Ｂａｃｉ１１ｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）インジケーター株を重層し、
３０℃で１晩インキユベーシヨンして、細菌地中に現わ
れる阻止帯の大きさを測定した。

はとんどの（７５％）トランスホーマントはペニシリン
非生産受容株」狙８兜Ｇと同じ大きさの、非常に小さい
ホールを示した。残りの２５％は野生株、ｗｉｓ５４−
１２５５と同様の大きな阻止帯を示した。先のクラスは
選択性プラスミド１）　ＵＣ１３ｉ　ｉ　里Ｇのみしか
受は入れていなかったが、一方後者はｐＵｃｌ　３　ｉ
　ｉ　ＰＪＬＧ及びラムダＢ２１の両方を受は入れてお
り、ペニシリン生産能を保持していると結論される。

両グループに由来するいくつかのトランスホーマントク
ローンに対し無細胞抽出物中のＡＴ活性レベルを以下の
方法で測定した。例３で説明したように、２日間の培養
後菌糸体を回収し、洗浄後液体窒素で凍結してから破壊
した。

各検定に対し、２．５ｇの粉砕菌糸体を５　ｍＭジチオ
スレイトール及び５ｍＭＥＤＴＡを含む５０１のリン酸
カリウムバッファ　（ｐＨ８，０）に懸濁しく最終容積
１２．５ｍ１）　、２５分間攪拌した。

無細胞抽出物は、このサスペンションを遠心（１，ＯＯ
Ｏｘｇ、５分間）することにより得た。

ＡＴ活性は、２ｍｌの無細胞抽出物を２５℃でＱ、　ｌ
　ｍ　ｌ！ジチオスレイトール（１０ｇ／１ｍｌり、０
．２ｍｆ６−アミノペニシラン酸（１０ｍｇ／ｎｊり及
びＱ、　２ｍ　ｌフェニルアセチル補酵素Ａ溶液（２０
■／１１１１）とともにインキュベーションすることに
より検定した。

１５分又は３０分後、等容量のメタノールを加えること
により反応を停止し、そのサンプルを遠心した（５００
０　ｘ　ｇ、２０分間）。それから、この上清について
当分野で知られているクロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法に
より生成したペニシリンＧを検定した。典型的実験結果
を以下の第２表に示す。これらのデータは形質転換株（
３）及び（４）においてＡＴ活性レベルが、遺伝子投入
量の増加と一敗して、野生型（５）の２〜３倍増加して
いることを示している。

（ＩＰＮＳ＋ＡＴ）クラスターをｐＰｓ５４にサブクロ
ーン化して、ｐＧＪＯＩＡ及びＢを得た。

５　ｋｂの５ａ１１フラグメントをＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼの作用によりプラントエンド化し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼ処理を行ったｐＰｓ５４又はｐＰＳ４７中の唯
一のＨｔｎｄｌＩ［部位にライゲーションした。

（例９） 潜在的遺伝子Ｙで形質転換した宿主株におけるペニシリ
ン生産の増加 ペニシリン生産に関することが同定された遺伝子の効果
を示すため、これら遺伝子の中の１つの遺伝子の、ペニ
シリウム（Ｐｅｎｉｃｉ１１ｉｕｍ　）宿主株への投入
量を増加させた。すなわちラムダクローンＢ９、Ｌ５及
びＧ５に含まれる遺伝子＃Ｙ“を３、Ｏｋｂ　　（Ｂａ
ｍＨＩ＋５ｐｈｌ）フラグメントとしてｐＰＳ４７にサ
ブクローン化した。生成した構築物ｐ　ＲＨ０５をＰ、
クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）ｗｉｓ　　
５４−１２５５　　（ＡＴＣＣ２８０８９）に形質転換
し、フレオマイシン耐性クローンを単離した。振盪フラ
スコ中、いくつかのクローンについてペニシリン生産テ
ストを行った。

単離した１個のトランスホーマントについて得られた結
果を以下の第３表に示す。

第３表 株　　　　　　　　　　　　　　　ペニシリンの相対生
産量ｗｉｓ　５４　１２５５　　　　　　　　　　　　
　　　１００ｗ１ｓ　５４−１２５５：：　　ｐＲＨ０
５１２２非形質転換宿主と比較して、このトランスホー
マント中の遺伝子Ｙの遺伝子投入量の増加は、サウザン
プロット分析により確認した。本発明の方法により単離
した潜在的遺伝子Ｙの投入量の増加はペニシリン生産の
実質的増加をもたらした。

遺伝子Ｙの転写物のサイズは、ノーザンブロットハイプ
リダイゼーショで測定し、約１．Ｏｋｂ長である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、 Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）におけ
るペニシリンＧ又は■の生合成経路を図式的に示した図
であり、 第２図は、 本発明の方法により単離されたラムダクローンの物理マ
ツプを示し、第２図中、クローンラムダＧ２及びラムダ
Ｂ２１は、シクラーゼ及びアシルトランスフェラーゼ遺
伝子クラスターを含み、クローンラムダＢ９、Ｇ５及び
Ｌ５は潜在的遺伝子Ｙを含み、他のラムダクローンは別
の潜在的遺伝子を含む。さらに第２図中、 Ｅ・・・ＥＣ０ＲＩ；Ｂ・・・ＢａＩＩＩＨ１１Ｈ・・
・Ｈ１ｎｄ■；Ｋ・・・Ｋｐｎ■；Ｓ・・・Ｓａｌ■；
Ｓａ　・・・５ａＣＩ；Ｓｐ　・・・Ｓρｈ■；Ｐ・・
・ＰｓＬＩ；Ｘ・・・ＸｈＯ■；Ｘｂ　・・・ＸｂａＩ
；Ｈρ　・・ＩＨｐａ■；Ｎ・・・ＮＣＯ■、Ｂｇ　・
・・Ｂｇｌｎ、 ニ＝コ・バクテリオファージラムダＥＭＢ　Ｕ３（９ｋ
ｂ）の右側アーム、 ■■■・バクテリオファージラムダＥＭＢＬ３（２０，
３ｋｂ）の左側アーム、 ：：：：：　・・・　ｐｅｎ゛　ＣＤＮＡにハイブリダ
イズする領域、 ・・・マツプ中の不明領域、 （）・・・謁限部位の位置／存在が不明確な領域を示し
、 ｌａ及びｒａは各々バクテリオファージラムダの左側ア
ーム及び右側アームを示す。 第３図ＡＳＢ、Ｃは、 Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）のアシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推
定されるアミノ酸配列を示し、 第４図Ａ、、Ｂは、 Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）　ｐ）
ｚＧ遺伝子のヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸
配列を示し、この配列は形質転換促進配列として働＜　
２．４　ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントの主要部分を形
成するものである。 第５図は、 Ｐ、クリソゲナム（ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕ＋ｗ　）のホ
スホグリセレートキナーゼ遺伝子のプロモーターのヌク
レオチド配列を示し、 第６図は、 ｐＵｃｌ　３　ｉ　ｉ　Ｄ！Ｇの制限部位及び機能マツ
プを示し、 第７図は、 ｐＰＳ５４の制限部位及び機能マツプを示し、第８図は
、 ｐＲＨ０５の制限部位及び機能マツプを示し、第９図は
、 ｐＧＪＯＩＡ及びＢの制限部位及び機能マ、７ブを示し
、 第１０図は、 ｐＰＳ４７の制限部位及び機能マツプを示す。 １−ｄ−アミノアジピン酸 し−システィン Ｌ−バリン ■ イソペニシリン （ＪＰＮ） ペニシリン−Ｇ又はＶ ＦＩＧ、　１ 図面の浄書（内容に変更なし） ト　　　　　０ ＜　　　　　　← ← く← ０コ （ノ　− ○− （コ　； トΦ ロ ビー ト Ａｍｐ　Ｒ ｐＰＧＫ ｈｌｅｏＲ ｋｂ ＦＩＧ、１０ 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ ■、事件の表示 平成１−年特許願第２０９４９２号 ３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ４、代 理 人

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）微生物の代謝の際に発現し、かつ該微生物、好ま
   しくは細菌又は菌類において二次代謝産物生産に直接的
   又は間接的に重要であるＤＮＡフラグメントを単離する
   方法であって、 （ａ）該二次代謝産物を生産する該微生物の一次培養物
   由来のｍＲＮＡ又はＤＮＡから得たプローブを用いて、
   該微生物から調製したＤＮＡライブラリーをスクリーニ
   ングする工程、 （ｂ）該二次代謝産物の生産能を欠く該微生物又はその
   突然変異体の二次培養物由来のｍＲＮＡ又はＤＮＡから
   得たプローブを用いて、該 ＤＮＡライブラリーをスクリーニングする工程、及び （ｃ）前記二次培養において実質的に転写されず、かつ
   前記一培養において転写される遺伝子を含むフラグメン
   トを同定する工程 を含む方法。
2. （２）ＤＮＡ構築物を調製する方法であって、（ａ）請
   求項（１）記載の二次代謝産物生産の際に発現するフラ
   グメントを単離する工程、及び （ｂ）単離したフラグメントをサブクローニングして、
   目的とする遺伝子及び必要とされる全ての転写及び翻訳
   要素及び場合によっては選択マーカーを含むＤＮＡ構築
   物を生成する工程 を含む方法。
3. （３）微生物宿主における二次代謝産物の生産方法又は
   生産増加方法であって、 （ａ）請求項（３）記載のＤＮＡ構築物を調製する工程
   、 （ｂ）該ＤＮＡ構築物で宿主候補者を形質転換する工程
   、 （ｃ）生成したトランスホーマントをクローニングする
   工程、及び （ｄ）上記宿主候補者より高いレベルの該二次代謝産物
   を生産するクローンを同定する工程 を含む方法。
4. （４）前記一次及び二次培養物がβ−ラクタム抗生物質
   の生産能を有する請求項（１）記載の方法。
5. （５）前記一次及び二次培養物がペニシリウム、アスペ
   ルギラス、アクレモニウム、フラボバクテリウム又はア
   クチノミセテスである請求項（１）記載の方法。
6. （６）二次代謝産物を導く生合成経路に直接的又は間接
   的に関する遺伝子でアシルトランスフェラーゼ遺伝子、
   潜在的遺伝子Ｙ、及びファージＬ１２、Ｋ９、Ｃ１２、
   Ｐ３、Ｋ１１、Ｂ１３、Ｂ２０、Ｇ３、Ｇ１、Ｌ１０、
   Ｋ１６及びＢ２３内に全体的に又は部分的に含まれる潜
   在的遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子をコードする
   配列、ある場合には該二次代謝産物を生産する宿主にお
   ける選択マーカー及びある場合には該宿主における形質
   転換効率を増加する配列を含むベクター。
7. （７）第３図に示される構造を有するアシルトランスフ
   ェラーゼをコードする配列を含むベクター。
8. （８）第３図に示されているＤＮＡ配列の挿入突然変異
   誘発、欠失突然変異誘発、挿入及び欠失突然変異誘発の
   組合せ、又は部位指定突然変異誘発により修正されたア
   シルトランスフェラーゼをコードする配列を含む請求項
   （６）記載のベクター。
9. （９）前記遺伝子が内在するもの以外の転写プロモータ
   ーを含む請求項（６）記載のベクター。
10. （１０）請求項（２）記載の方法で鋼製したＤＮＡ構築
    物を含む形質転換宿主細胞。
11. （１１）宿主において機能し、かつ二次代謝産物を誘導
    する生合成経路に直接的又は間接的に関し、該二次代謝
    産物生産を高めるタンパク質をコードする遺伝子で、ア
    シルトランスフェラーゼ遺伝子、潜在的遺伝子Ｙ、及び
    ファージＬ１２、Ｋ９、Ｃ１２、Ｐ３、Ｋ１１、Ｂ１３
    、Ｂ２０、Ｇ３、Ｇ１、Ｌ１０、Ｋ１６及びＢ２３中に
    全体的に又は部分子に含まれる潜在的遺伝子からなる群
    から選択される遺伝子を含む１コピーの配列を、形質転
    換によって含む形質転換宿主細胞。
12. （１２）請求項（６）記載のベクターを含む形質転換宿
    主細胞、又は請求項（１０）又は（１１）記載の形質転
    換宿主細胞を用いた、ＤＮＡ仲介の形質転換以外の株改
    良操作で得られる新規株。
13. （１３）前記宿主細胞がβ−ラクタム抗生物質を生産し
    得る請求項（１０）又は（１１）記載の形質転換宿主細
    胞。
14. （１４）前記宿主細胞が、ペニシリウム、アスペルギラ
    ス、アクレモニウム、フラボバクテリウム又はアクチノ
    ミセテスである請求項（１０）又は（１１）記載の形質
    転換宿主細胞。
15. （１５）前記二次代謝産物がβ−ラクタムである請求項
    （１０）記載の形質転換宿主細胞。
16. （１６）前記β−ラクタムがペニシリンである請求項（
    １０）記載の形質転換宿主細胞。
17. （１７）前記宿主細胞の種がペニシリウムクリソゲナム
    又はアクレモニウムクリソゲナム又は大腸菌である請求
    項（１４）記載の形質転換宿主細胞。
18. （１８）前記遺伝子が野生型の転写開始制御領域以外の
    転写開始制御下にある請求項（１４）記載の形質転換宿
    主細胞。
19. （１９）Ｐ．クリソゲナムのホスホグリセレートキナー
    ゼ遺伝子プロモーター及び該プロモーターの転写制御下
    の、請求項（２）記載の方法で調製した遺伝子を含むＤ
    ＮＡ構築物。
20. （２０）選択マーカーが、ホスホグリセレートキナーゼ
    遺伝子プロモーターの転写制御下で発現するフレオマイ
    シン耐性遺伝子である請求項（２）記載の方法で調製し
    たＤＮＡ構築物。
21. （２１）ペニシリウム・クリソゲナムのアシルトランス
    フェラーゼ遺伝子のプロモーター及び翻訳活性化配列を
    含む組換えＤＮＡ構築物。
22. （２２）ペニシリウム・クリソゲナムのアシルトランス
    フェラーゼの３′側制御配列を含む組換えＤＮＡ構築物
    。
23. （２３）アシルトランスフェラーゼをコードし、かつプ
    ローブとして第３図に示すＤＮＡ化合物を用いることに
    より同定し得る組換えＤＮＡ構築物。
24. （２４）ｐＧＪ０１Ａ又はＢ、又はｐＲＨ０５からなる
    群から選択されるプラスミド。
25. （２５）野生型配列以外の配列に結合した、第４図の配
    列を含む形質転換促進配列を含むＤＮＡ構築物。
26. （２６）前記野生型配列以外の配列が酵素活性又はペニ
    シリンをコードする遺伝子を含む請求項（２５）記載の
    ＤＮＡ配列。
27. （２７）抗生物質二次代謝産物の収率を高める方法であ
    って、 （ａ）請求項（１）又は（２）記載の方法で単離され、
    かつ抗生物質二次代謝産物生産の生合成経路に直接的又
    は間接的に関するタンパク質をコードする遺伝子を含む
    配列のコピーを余分に含む形質転換宿主細胞を生育させ
    て、より多量の該抗生物質を生産する工程、及び（ｂ）
    生成した抗生物質産物を単離する工程を含む方法。
28. （２８）前記抗生物質がβ−ラクタムである請求項（２
    ７）記載の方法。
29. （２９）前記宿主細胞が、ペニシリウム、アスペルギラ
    ス、アクレモニウム、フラボバクテリウム又はアクチノ
    ミセテスである請求項（２８）記載の方法。
30. （３０）前記宿主細胞がペニシリウムクリソゲナムであ
    る請求項（２９）記載の方法。
31. （３１）前記遺伝子がアシルトランスフェラーゼをコー
    ドする請求項（２７）記載の方法。
32. （３２）前記遺伝子が第３図に示す構造を有するタンパ
    ク質をコードする請求項（２７）記載の方法。
33. （３３）前記遺伝子が潜在的遺伝子Ｙである請求項（２
    ７）記載の方法。