JPH02115767A - 妊娠誘発高血圧および子かんのイムノアツセイおよび試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、妊娠の間の妊娠誘発高血圧（Ｐ　Ｉ　Ｈ）ま
たは子かん前症を検出する方法、試薬およびキットに関
する。とくに、本発明は、全血、血清または血漿の試料
を内皮細胞の障害のためのマーカー例えば、細胞フィブ
ロネクチンの存在について試験することによる、ＰＩＨ
または子かん前症の決定に関する。

本発明は、要約すれば、次の通りである：妊娠誘発高血
圧（Ｐ　Ｉ　Ｈ）および子かんは、サンドイッチイムノ
アッセイまたは競合イムノアッセイを使用して、妊娠し
た女性の血液、血漿または血清の試料中の内皮細胞マー
カーの存在を同定することによって決定される。試料中
の細胞フィブロネクチンマーカーは、抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体との結合により決定される。これらの方
法のだめの試薬も本発明の１つの面である。

子かん前症、子かんおよび妊娠誘発高血圧（ＰＩＨ）は
、増大した血圧、タンパク質尿、および浮腫により特性
づけられる。これらの疾患の原因および性質は、部分的
にのみ理解されているに過ぎない。子かん前症およびＰ
ＩＨは、しばしば、同一疾患を表示するために使用され
る。用語「子かん前症（ｐｒｅｅｃｌｍｐｓｉａ）」は
、以後、説明を明瞭とする目的で、限定を意図しないで
、子かん前症、妊娠誘発高血圧および子かんを広く包含
するために使用する。子かん前症は米国において比較的
希であると考えられているが、診断の基準および研究の
人口に依存して、妊娠女性の２〜３５％で政界的に起こ
っている。子かん前症がらの死亡はレドマン（Ｒｅ　ｄ
ｍａ　ｎ）Ｃ，のｉｌ！近の報告（Ｂｒ　ｉ　ｔ、Ｍｅ
ｄ、Ｊ、２９６　：１２０９−１２１０　（Ａｐ　ｒ　
ｉ　１．１９８８））において子かんからのそれらにほ
ぼ等しい。しかしながら、これらの状態は、状態が進行
してしまうまで、しばしば不明瞭であり、そしてこれら
の状態の診断はしばしば不可能であった。この状態の早
期の診断のための信頼性ある試験は、非常に要求されて
いる。

子かん前症におけるプロスタグランジンの役割の外観は
、フリートマン（Ｆｉｅｄｍａｎ）、Ｓｏ、ｏｂｓｔｅ
ｔ　　Ｇｙｎｅｃｏｌ、７１：１２２−１３７　（１９
８８）により発表された。ＰＩＨおよび子かん前症のた
めの代謝のマーカーの母系液（ｍａｔｅｒｎａｌ　　ｆ
ｌｕｉｄ）の検査は、２゜３−ジノル−６−ケドＰＧＦ
、、の泳レベルはこの状態の間に増加することが明らか
にされた、ｏｂ／Ｇｙｎ　　Ｔｏｐｃｓ、　２：５　（
１９８７）ｏ血液中の他の物質のレベルは、また、研究
されてきｔこ　。

ある数の研究は、これらの病気のプロセスの間の血液中
のフィブロネクチンのレベルの一般的増加に集中された
：例えば、グラニンガ−（Ｇｒａｎ　ｉ　ｎ　ｇｅ　ｒ
）　、’Ｗ、　　ら、Ｅｕｒｏｑ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、
Ｇｙｎｅｃ、Ｒｅｑｒｏｄ、Ｂｉｌ、、１９　：　２２
３−２２９　（１９８５）；ヘス（Ｈｅｓｓ）、Ｌ、　
　ら、Ｏｂｓ　ｔ　ｒｅ　ｔ、Ｇｙｎｅｃ。

１．６８：２５−２８　（１９８６）；ラザルチック（
Ｌａｚａｒｃｈｉｃｋ）、Ｊ、ら、Ａｍ、Ｊ。

Ｏｂ、Ｇｙｎ、　　１５４　　：　　１０５０−１　０
５２　　（１９８６）；エリクセン（Ｅｒ　ｉ’ｃｋｓ
ｅｎ）、Ｈ。

ら、Ａｃｔａ、０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ。

５ｃａｎｄ、６６：２５−２８　（１９８７）：および
サレ（Ｓａｌｅｈ）ら、ｏｂｓｔｅｔ、ｃｙｎｅｃｏｌ
、７１ニア１９　（１９８８）。血液中のフィブロネク
チンのレベルはＰＩＨおよび子かん前症とともにより高
くなることが報告されているが、増加の程度は各個体お
よび妊娠の段階とともに変化し、そして単独と考えられ
、病気の信頼性ある診断のインジケーターではなかった
。シバイ　　（Ｓｉｂａｉ）　　、　　Ｂ、　　　ら　
、　　Ｃｏｎｔｅｍｑ、Ｏｂ／Ｇｙｎ、５７　（Ｆｅｂ
、１９８８）は、ＰＩＨを予知する信頼性ある手段およ
び発生を減少する有効な方法のだめの研究を続けている
ことを報告している。しばらくして、臨床医は、なお、
管理を統制するために血圧の基準を使用し続けている。

子かん前症で観測される増大したフイブ口ネクチンのレ
ベルが内皮の障害を示唆することは、バチア（Ｂ１１ａ
ｔ　ｉａ）、Ｒ，ら、Ａｍ、Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎ
ｅｃｏｌ、１５７：１０６　１０８　（１９８７）によ
り仮定された。より最近、ロバーツ（ｒｏｂｅ　ｒ　ｔ
　５）（Ｏｂ、Ｇｙｎ、Ｎｅｗｓ、２２１　（Ｎｏｖ、
１９８７））は、子かん前症が内皮細胞の障害に基本的
に関係する病気のプロセスであることを示唆する証拠が
高血圧の疾患でないことを示唆した。

ヒト細胞フィブロネクチンと優先的に結合し、そして細
胞フィブロネクチンおよび血漿フィブロネクチンを区別
することができるモノクローナル抗体は、キーン（Ｋｅ
ｅｎ）Ｊ、ら、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、２：１５　
２７（１９８４）により記載されている。胚および大人
ヒト組織中の細胞フィブロネクチンの独特Ｅｄ配列と結
合するモノクローナル抗体は、パーチオ（Ｖａｒｔｉｏ
）Ｔ、ら、Ｊ、　Ｃｅ　１１Ｓｃ　ｉ、　　８８　：　
４１９−４３０（１９８７）により記載されている。ヒ
トフィブロネクチン中に存在する独特アミノ酸ストレッ
チは、ブトマン（Ｇｕ　ｔ　ｍａ　ｎ）Ａ、ら、Ｐｒｏ
ｃ。

Ｎａ　ｔ　　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　　ｉ、ＵＳＡ、８４
　　：　７１７９−７１８２　（１９８７）により報告
されている。ペータース（Ｐｅｔｅｒｓ）Ｊ、ら、Ａｍ
。

Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｑｉｒ、Ｄｉｒ、１３８：１６７−１７
４　（１９８８）は、ヒト細胞フィブロネクチン中に存
在する２９アミノ酸の独特非相同ストレッチに対応する
エクストラタイプＩＩＩドメイン（ＥＤＩ）ペプチドの
合成、この領域と結合する抗体、およびこれらの抗体で
開発されたＥＬＩＳＡイムノアッセイを記載している。

開示されているペプチド配列は、次の単一の文字の略字
を使用すると、ＴＹＳＳＰＥＤＧ　ＩＨＥＬＦＰＡＰＤ
ＧＥＥＤＴＡＥＬＱＧＧＣである：アラニン（Ａ）、シ
スティン（Ｃ）　、アスパラギン酸（Ｄ）　、グルタミ
ンａ　（Ｅ）　、フェニルアラニンＣＦ）　、グリシン
（Ｇ）　、ヒスチジン（Ｈ）　、インロイシン（ｉ）、
ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、
セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、およびチロシン（Ｙ
）。

子かん前症、妊娠誘発高血圧（ＰＩＨ）および子かんは
、サンドイッチイムノアッセイまたは競合イムノアッセ
イを使用して、妊娠した女性の血液、血漿または血清の
試料中の内皮細胞マーカーの存在を同定することによっ
て決定される。

１つの実施態様において、試料中の内皮細胞マーカーの
存在は、試料を抗（内皮細胞マーカー）抗体と接触させ
、そして前記抗体と内皮細胞マーカーとの結合を決定す
ることによって決定される。

試料は第１抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した不溶
性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こ
させることができる；次いで、不溶性支持体は第２抗（
内皮細胞マーカー）抗体と十分な時間接触させて抗原−
抗体結合を起こさせることができる；そして不溶性支持
体上の第２抗（内皮細胞マーカー）抗体の存在を決定す
ることができる。第２抗（内皮細胞マーカー）抗体は、
物理学的検出標識を有するすることができる。あるいは
、この方法は試料および第２抗（内皮細胞マーカー）抗
体を、第１抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した不溶
性支持体と、十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起
こさせ、そして不溶性支持体上の第２抗（内皮細胞マー
カー）抗体の存在を決定することからなる。内皮マーカ
ーは細胞フィブロネクチンであり、モして抗（内皮細胞
マーカー）抗体は抗（細胞フィブロネクチン）抗体であ
るすることができる。２つの異なる抗（内皮マーカー）
抗体を使用し、そして一方が抗（細胞フィブロネクチン
）抗体であるとき、第２抗体は非（交差反応性）抗体ま
たは抗（フィブロネクチン）抗体であることができる。

本発明の１つの親会方法は、抗（内皮細胞マーカー）抗
体が付着した不溶性支持体を、試料および前記支持体に
付着した抗（内皮細胞マーカー）抗体のすべてと結合す
るために不十分である量の標識した内皮細胞マーカーの
混合物を接触させ、そして不溶性支持体に結合した標識
した内皮細胞マーカーの量または前記混合物中に残るた
内皮細胞マーカーの量を決定することからなる。別の競
合実施態様において、この方法は内皮細胞マーカ−が付
着した不溶性支持体を、試料および前記支持体に付着し
た内皮細胞マーカーのすべてと結合するために不十分で
ある量の標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の混合物
と接触させ、そし不溶性支持体に結合した標識した抗（
内皮細胞マーカー）抗体の量または前記混合物中に残る
標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の量を決定するこ
とからなる。

本発明の試薬は、不溶性試薬支持体に付着した抗（内皮
細胞マーカー）抗体および不溶性試薬支持体に付着した
内皮細胞マーカーからなる。

本発明の１つの試験キットは、不溶性支持体に付着した
抗（内皮細胞マーカー）抗体、例えば、抗（細胞フィブ
ロネクチン）抗体および標識した抗（内皮細胞マーカー
）抗体、例えば、標識した抗（細胞フィブロネクチン）
抗体からなる。他のキットは、不溶性支持体に付着した
抗（フィブロネクチン）抗体および標識しＩ；抗（細胞
フィブロネクチン）抗体からなる。なおほかのキットは
、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）抗体
および標識した内皮細胞マーカーからなる。

他のキットは、不溶性支持体に付着した内皮細胞マーカ
ーおよび標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からなる
。

試薬は、キットにおいて適当な形態で、例えば、別の容
器、パッケージ、など中に存在することができる。

本発明の目的は、サンドイッチイムノアッセイまたは競
合イムノアッセイを使用して妊娠した女性の血液、血漿
または血清の試料中の内皮細胞マーカーの存在を同定す
ることによって、子かん前症、妊娠誘発高血圧（Ｐ　Ｉ
　Ｈ）および子かんを検出することである。

用語「内皮細胞マーカー」は、ここで使用するとき、妊
娠した女性が子かん前症、ＰＩＨまたは子かんの過程ま
たは状態を有するとき、彼女の血液中に存在し、そして
正常の妊娠の間有意の量で存在しない、化学物質または
物質を意味する。用語「抗（内皮細胞マーカー）抗体」
は、ここで使用するとき、内皮細胞マーカーと優先的に
結合し、そして正常の妊娠において存在する血液成分と
有意に結合しない抗体（親和精製したポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体）を意味する。

１つの内皮細胞マーカーは、内皮細胞フィブロネクチン
、以後細胞フィブロネクチンと呼ぶ、である。細胞フィ
ブロネクチンは、子かん前症、ＰＩＨまたは子かんの病
気の過程において破壊または混乱される内皮細胞から誘
導する。それは、肝炎由来である血漿フィブロネクチン
と、あるいは胎児細胞から由来する胎児フィブロネクチ
ンと区別される。胎児フィブロネクチンは妊娠の間の母
系血液中に有意の量で存在しない。用語「抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体）は、ここで使用するとき、内皮細
胞フィブロネクチンと優先的に結合するが、血漿フィブ
ロネクチンと有意に結合しない、抗体（親和精製したポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体）を包含す
ると定義される。

用語「抗（フィブロネクチン）抗体」は、ここで使用す
るとき、血漿フィブロネクチンおよび内皮細胞フィブロ
ネクチンを包含する血液の合計のフィブロネクチン成分
と結合するが、あるいは細胞フィブロネクチンのみと結
合する、抗体を包含すると定義される。

用語「抗体」は、ここで使用するとき、クラス）ｇＧＸ
　ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの抗体、および
抗体の結合性断片、半抗体、およびハイブリッド誘導体
く例えば、抗体のＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片
、これらに限定されない）を包含すると定義される。

用語「優先的に結合する」は、ここで使用するとき、１
０％以下、好ましくは５％以下の交差反応性を有する抗
体および抗体の断片を包含すると定義される。

本発明の方法において、血液試料を患者から普通の方法
より集める。それは毛管または静脈から集めることがで
きる。それは排気した容器中に抜き出し、ヘパリン、ク
エン酸ナトリウムまたはＥＤＴＡと混合し、そして遠心
して細胞を除去し、血漿を得る。それを凝固させ、そし
て血清を凝固から分離することができる。それを吸収材
料、例えば、紙により吸収し、そして乾燥することがで
きる。

内皮細胞マーカーの検出は、任意の適当な方法により決
定することができる。免疫学的方法は、特異性をもつた
め、この方法の実施に最も便利であり、そして用語「イ
ムノアッセイ」は、ここで使用するとき、内皮細胞マー
カーが第２物質、結合相手、通常抗体または内皮細胞マ
ーカーのエピトープと選択的に、好ましくは優先的に結
合する抗原結合部位を有する他の物質と、優先的に結合
する性質を使用する方法を意味すると定義される。

本発明の範囲内に、次のものが包含されるが、これらの
限定されない：この工程を含むすべてのイムノアッセイ
方法、例えば、サンドイッチイムノアッセイ、競合イム
ノアッセイ、凝集、沈澱、トランジスターブリッジプロ
ーブ、粒子分類、光混乱、光散乱、および超音波グロー
ブイムノアッセイ。適当なイムノアッセイは、標識とし
て、放射性同位元素、酵素、または蛍光、発色、または
化学発光物質を使用することができる。

１つの好ましい実施態様において、試料を抗（内皮細胞
マーカー）抗体が付着しＩ；不溶性支持体と接触させて
、試料中の内皮細胞マーカーの結合および捕捉をおこな
う。次いで、不溶性支持体を不溶性支持体に付着する内
皮細胞マーカーと結合する非標識または標識抗体と接触
させて、捕捉しｔ；内皮細胞マーカーを標識しかつ測定
する。例えば、抗（内皮細胞マーカー）抗体を不溶性支
持体に付着し、そして標識または非標識抗（内皮細胞マ
ーカー）抗体を使用して捕捉した抗原を標識することが
できる。

本発明の方法および試薬において好ましい内皮細胞マー
カーはフィブロネクチンであり、そして以後の本発明の
説明はしばしば試料中の細胞フィブロネクチンの検出を
参照し、これは明瞭さを目的とし、限定を意味しない；
本発明は、患者の血液、血清または血漿中の内皮細胞マ
ーカーの検出を包含する。

子かん前症、ＰＩＨまたは子かんを決定する１つの方法
は、妊娠の患者から血液、血漿または血清の試料を取り
、そして試料中の内皮細胞マーカーの存在を決定するこ
とからなる。試料中の内皮細胞マーカーの存在は、試料
を抗（内皮細胞マーカー）抗体と接触させ、そして抗体
と内皮細胞マーカーとの結合を決定することによって決
定することができる。これは、試料を第１抗（内皮細胞
マーカー）抗体が付着した不溶性支持体と十分な時間接
触させて抗原−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持
体を第２抗（内皮細胞マーカー）抗体十分な時間接触さ
せて抗原−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上
の第２抗（内皮細胞マーカー）抗体の存在を決定する工
程により達成することができる。第２抗（内皮細胞マー
カー）抗体は、物理学的検出標識を有することができる
。

あるいは、これは試料および第２抗（内皮細胞マーカー
）抗体の混合物を第１抗（内皮細胞マーカー）抗体が付
着した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体
結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の第２抗（内皮
細胞マーカー）抗体の存在を決定することによって達成
することができる。

本発明の好ましい実施態様において、内皮細胞マーカー
は細胞フィブロネクチンである。この場合において、こ
の方法は試料を抗（細胞フィブロネクチン）抗体を十分
な時間接触させて抗（細胞フィブロネクチン）抗体との
抗原−抗体結合を起こさせ、そして前記結合の存在を決
定することからなる。この方法は、試料を抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体が付着した不溶性支持体と十分な時
間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、不溶性支持体
を抗（フィブロネクチン）抗体と十分な時間接触させて
抗原−抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の抗
（フィブロネクチン）抗体の存在を決定する工程からな
る。抗（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出標識を
有することができる。抗（フィブロネクチン）抗体は、
抗（細胞フィブロネクチン）抗体であることができる。

１つの実施態様において、不溶性支持体に付着した抗（
細胞フィブロネクチン）抗体は第１抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体であり、モして抗（フイプロネクチン）抗
体は第１抗（細胞フィブロネクチン）抗体と有意に交差
反応しない第２抗（細胞フィブロネクチン）抗体でアル
。

別の方法において、工程は試料および抗（フィブロネク
チン）抗体の混合物を抗（細胞フィブロネクチン）抗体
が付着した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−
抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の抗（フィ
ブロネクチン）抗体の存在を決定することからなる。抗
（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出標識を存する
ことができ、抗（細胞フィブロネクチン）抗体は第１抗
（細胞フィブロネクチン）抗体であることができ、そし
て抗（フィブロネクチン）抗体は有意に交差反応しない
第２抗（細胞フィブロネクチン）抗体であることができ
る。

他の方法は、試料を抗（フィブロネクチン）抗体を付着
した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結
合を起こさせ、不溶性支持体を抗＜ｍ胞フィブロネクチ
ン）抗体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こ
させ、そして不溶性支持体上の抗（細胞フィブロネクチ
ン）抗体の存在を決定する工程からなる。抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体は物理学的検出標識を有することが
できる。あるいは、工程は試料および抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体の混合物を抗（フィブロネクチン）抗体
が付着した不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−
抗体結合を起こさせ、そして不溶性支持体上の抗（細胞
フィブロネクチン）抗体の存在を決定することからなる
。この別の実施態様において、抗（フィブロネクチン）
抗体は物理学的検出標識を有することができる。

本発明の競合イムノアッセイの実施態様は、抗（内皮細
胞マーカー）抗体が付着された不溶性支持体を、試料お
よび前記支持体へ付着した抗（内皮細胞マーカー）抗体
のすべてと結合するために不十分である量の標識した内
皮細胞マーカーの混合物と接触させ、そして不溶性支持
体に結合した標識した内皮細胞マーカーの量または前記
混合物中に残る標識した内皮細胞マーカーの量を決定す
ることからなる。この方法の好ましい実施態様は、抗（
細胞フィブロネタチン）抗体が付着した不溶性支持体を
、試料および前記支持体に付着した抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体のすべてと結合するために不十分である量
の標識した細胞フィブロネクチンの混合物と接触させ、
そして不溶性支持体に結合した標識した細胞フィブロネ
クチンの量または前記混合物中に残る標識した細胞フィ
ブロネクチンの量を決定することからなる。

本発明の別の競合イムノアッセイは、内皮細胞マーカー
が付着した不溶性支持体を、試料および前記支持体に付
着した内皮細胞マーカーのすべてと結合するために不十
分である量の標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の混
合物と接触させ、そして不溶性支持体に結合した標識し
た抗（内皮細胞マーカー）抗体の量または前記混合物中
に残る標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体の量を決定
することからなる。本発明の好ましい実施態様は、細胞
フィブロネクチンが付着した不溶性支持体を、試料およ
び前記支持体に付着した細胞フィブロネクチンのすべて
と結合するために不十分である量の標識した抗（ｍ胞フ
ィブロネクチン）抗体の混合物とを接触させ、そして不
溶性支持体に結合した標識した標識した抗（細胞フィブ
ロネクチン）抗体の量または前記混合物中に残る標識し
た抗（細胞フィブロネクチン）抗体の量を決定すること
からなる。

抗（内皮細胞マーカー）抗体は、内皮細胞マーカー、例
えば、細胞フィブロネクチンから、好ましくは高度に精
製した細胞フィブロネクチンから、普通の抗血清（ポリ
クローナル）またはモノクローナル技術により得ること
ができる。抗（血漿フィブロネクチン）抗体は、血漿フ
ィブロネクチンから、普通の抗血清（ポリクローナル）
技術またはモノクローナル技術により得ることができる
。

ヒト細胞フィブロネクチンと優先的に結合し、そして細
胞フィブロネクチンと血漿フィブロネクチンとの間を区
別することができる適当なモノクローナル抗体は、キー
ン（Ｋｅｅｎ）Ｊら、Ｍ。

１、Ｂ　ｉ　１．Ｍｅｄ、２　：１５−２７　（１９８
４）に記載されている。胚および大人ヒト組織中の細胞
フィブロネクチンの独特Ｅｄ配列は、パルチオ（Ｖａｒ
ｔ　ｉｏ）、Ｔ、　　ら、Ｊ、（６１１Ｓｃ　ｉ。

８８：４１９−４３０　（１９８７）に記載されている
。ヒト細胞フィブロネクチンと優先的に結合するポリク
ローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製に使用す
ることができる独特アミノ酸ストレッチは、ブトマン（
Ｇｕ　ｔ　ｍａ　ｎ）Ａ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．
Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ｕ、ｓ。

Ａ、８４ニア１７９−７１８２　（１９８７）に記載さ
れている。ベータース（Ｐｅｔｅｒｓ）Ｊ。

ら、Ａｍ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｑｉｒ、Ｄｉｓ、１３８　：
１６７−１７４　（１９８８）は、ヒト細胞フィブロネ
クチン中に存在する２９アミノ酸の独特非相同ストレッ
チに対応するエクストラタイプＩＩ■ドメイン（ＥＤＩ
）ペプチドの合成、この領域と結合する抗体、およびこ
れらの抗体で開発されたＥＬＩＳＡイムノアッセイを記
載している。開示されているペプチド配列は、次の単一
の文字の略字を使用すると、ＴＹＳＳＰＥＤＧＩＨＥＬ
ＦＰＡＰＤＧＥＥＤＴ″ＡＥＬＱＧＧＣである：アラニ
ン（Ａ）、システィン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、
グルタミンｆｉ　（Ｅ）　、フェニルアラニン（Ｆ）、
グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、インロイシン（１
）、ロインン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、クルタミン（Ｑ
）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、およびチロシン
（ｙ　）。これらの刊行物に報告されている抗体の各々
は、本発明の方法において抗（内皮細胞マーカー）抗体
として使用することができ、そして上に記載する刊行物
の各々の全体の内容をここに引用によって加える。

ポリクローナル抗（細胞フィブロネクチン）抗体は、動
物、例えば、ウサギ、モルモット、ラットまたはヤギを
濃縮した細胞フィブロネクチンで免疫化し、免疫化した
動物から血清を取り出し、そして免疫グロブリンを血清
から、硫酸アンモニウム沈澱により分離することによっ
て得ることができる。本発明の方法において有用な主な
抗体は、ＩｇＧ主なＩｇＭ抗体であるが、ＩｇＤｌ　１
ｇＥおよびＩｇＡ抗体は、また、入手可能である感染、
十分な量で使用することができる。次いで、細胞フィブ
ロネクチンの抗体を、普通の親和クロマトグラフィー技
術、例えば、次の文献に記載されているものを使用して
親和精製する：ミシエル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシル
ギ（Ｓｈｉｌｇｉ）、細胞免疫学的において選択した方
法（ＳＥＬＥＣＴＥＤ　　ＭＥＴＨＯＤＳ　　ＩＮ　　
ＣＥＬＬＵＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、サンフラン
シスコニＦｒｅｅｍａｎ　（１９８０）、ボウディング
（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｊ５、モノクローナル抗体：ｙＫ理
および実施（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　　ＡＮＴＩＢＯＤ
ＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ　　ＡＮＤ　　ＰＲＡＣ
Ｔ　Ｉ　ＣＥ）　、ニューヨーク：Ａｃａｄｅｍｉｃ　
　Ｐｒｅｓｓ　　ｐｐＨｌ−１１４（１９８３）、およ
びパリク（ｐａｒｉｋｈ）、１．ＣＥＮ（Ａｕｇｕｓｔ
　　２６．１９８５）（それらの各々の全体をここに引
用によって加える）。親和クロマトグラフィーにおいて
使用のために適当な吸収体は、細胞フィブロネクチン抗
体が共有結合した、架橋したアガロースおよび架橋した
ポリアクリルアミドを包含する。血漿フィブロネクチン
と交差反応する抗体を除去するため、抗体血清を血漿フ
ィブロネクチンが結合されているカラムに通過させる。

次いで、残りの抗体を含有するする溶離液の部分を細胞
フィブロネクチンのカラムに通過させ、そして溶離して
親和精製した抗体を得ることができる。

これらの方法において、抗体溶液をカラムにリン酸塩緩
衝液中で適用し、そして抗体は２．５モルのＮａ５ＣＮ
溶液、ｐＨ８，０、で溶離することができる。抗体の濃
縮は、必要に応じて、マイナスの圧力の透析または限外
濾過により達成することができる。この方法の反復は所
望の純度を達成するために要求されることがある。カラ
ム分離の反復は、所望のカラムの分離および純度が達成
されるまで、続ける。

モノクローナル抗体の抗（細胞フィブロネクチン）抗体
は、ゲラフレ（Ｇｌａｆｒｅ）およびミルスティン（Ｍ
ｉ　Ｉ　ｓ　ｔｅ　ｉｎ）　、メソッズ・イン・エンジ
モロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、７
３：　１　（１９８１）の方法により、マウスを細胞フ
ィブロネクチンで免疫化して肺細胞をハイブリダイゼー
ションのＩ；めに得ることができる。適当な方法はボウ
ディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｊ、（ｓｕｐｒａ、ｐｐ５
６−９７）（その内容全体をここに引用によって加える
）。胎児フィブロネクチンに、また、結合する細胞フィ
ブロネクチンの産生のため、マツウラ（ｍａｔｕｕｒａ
）Ｈ，およびハコモリ（ｈａｋｏｍｏｒｉ）Ｓ９、（５
ｕ　ｐ　ｒ　ａ）の方法に従い、腫瘍フィブロネクチン
のかわりに胎児フィブロネクチンを使用することができ
る。これらの抗体の調製に適当な手順は、本出願人によ
る１９８７年１１月１７日提出の米国特許出願第１２１
，８９５号（その内容全体をここに引用によって加える
）に記載されている。

ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両者の
抗（フィブロネクチン）の変異型は、よく知られており
、そして商業的に入手可能であるか、あるいは公に入手
可能なハイブリドーマの受託所から入手可能である。例
えば、抗（合計のフィブロネクチン）モノクローナル抗
体は、ＡＴＣＣＨＢ　　９１（アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐ
ｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ！Ｉｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏ
ｃｋｖｉ　］　Ｉｓ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）からクローン
の試料から誘導することができる。このような抗体は、
また、日本国特許比！１６００９１２６号（ＤＩＡＬＯ
Ｇデータベースのファイル３５１．ＷＰＩ　　Ａｃｅ、
Ｎｏ、８５−１６１６１７／２７）および米国特許第４
．３２５．８６７号に記載されている。

本発明の装置、キットおよび方法における使用に適当な
、優勢的に結合する抗体断片は、それぞれのモノクロー
ナル抗体またはポリクローナル抗体から、普通の酵素ま
たは化学的断片化方法によりつくることができる。適当
な方法は、例えば、次の文献に記載されている：チジセ
ン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｐ、、生化学および分子生物学
において実験室の技術：酵素イムノアッセイの実施およ
び（ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　
　　ＩＮ　　　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　　　ＡＮＤ
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ：ＰＲＡＣＴＩＣＥ
　　　ＡＮＤ　　　Ｔ）（ＥＯＲＩＥＳ　　　ＯＦ　　
　ＥＮＺＹＭＥ　　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＹＡＳ）、ニュ
ーヨーク：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　（１９８５）。

抗体の試薬は不溶性支持体に普通の方法により結合する
ことができる。抗体を不溶性支持体に結合する方法は、
例えば、米国特許第３，５５１゜５５５号、米国特許第
３，５５３．３］０号、米国特許第４，０４８，２９８
号および再発行第２９．４７４号、およびチジセン（Ｔ
ｉｊｓｓｅｎ）（ｓｕｐｒａ　　ｐｐ２９７　３２８）
。抗体をポリスチレンに吸着により結合する方法は、例
えば、米国特許第３，６４６，３４６号および米国特許
第４．０９２，４０８号に記載されている。

種々の材料を不溶性支持体として使用することができ、
主な考察は抗（１ｍ胞フィブロネクチン）抗体または抗
（フィブロネクチン）抗体の表面への結合、試薬間の干
渉の不存在、あるいは結合反応の存在および程度を決定
するために使用することができる他の反応である。有機
および無機のポリマー、両者は自然および合成、を不溶
性支持体として使用することができる。適当ポリマーの
例は、次のものを包含する：ポリエチレン、ポリプロピ
レン、ポリブチレン、ポ（４−メチルブチレン）、ブチ
ルゴム、シラスチックポリマー、ポリエステル、ポリア
ミド、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、酢
酸セルロース、ニトロセルロースなど）、アクリレート
、メタクリレート、ビニルポリマー（例えば、ポリ酢酸
ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリ
フッ化ビニルなど）、ポリスチレンおよびスチレングラ
フトコポリマー　レーヨン、ナイロン、ホリヒニルブチ
レート、ポリホルムアルデヒドなど。不溶性支持体とし
て使用することができる他の材料は、上のポリマーのラ
テックス、シリカゲル、ケイ素ウェー７１−、ガラス、
紙、不溶性タンパク質、金属、メタロイド、金属酸化物
、磁性材料、半導体材料、セラミックなどである。さら
に、ゲルを形成する物質、リポ多糖、ケイ酸塩５．アガ
ロース、ポリアクリルアミド、またはいくつかの水性相
を形成するポリマー、例えば、デキストラン、ポリアル
キレングリコール（２〜３個の炭素原子のアルキル）ま
たは界面活性剤、例えば、アンフォフイリック（ａｍｐ
ｈｏｐｈｉｌｉｃ）化合物、例えば、ホスホリピド、長
鎖（１２〜２４個の炭素原子）のアルキルアンモニウム
塩などが包含される。

好ましい支持体は、ナイロンまたはニトロセルロース膜
からなる。別の診断支持体は、ポリスチレン、スチレン
コポリマー、例えば、スチレン−アクリロニトリルコポ
リマー、またはポリオレフィン、例えば、ポリエチレン
またはポリプロピレン、およびアクリートおよびメタク
リレートのポリマーおよびコポリマーから作られるゆ抗
（細胞フィブロネクチン）抗体、他の抗体試薬、および
細胞フィブロネクチン試薬は不溶性支持体に、吸着、イ
オン結合、ファンデルワールス吸着、静電結合、または
他の非共有結合により結合することができる。この方法
にとくに有利な支持体は、複数のウェルを有するマイク
ロタイタープレートからなる。

ウェルの表面またはその中のプラスチックのカップのイ
ンサートは抗原または抗体の支持体を構成することがで
きる。決定は蛍光測定の使用を必要とする場合、マイク
ロタイタープレートまたはウェルのインサートは有利に
は光に対して不透明であって、ウェルに加える励起光が
取り囲む内容物に到達しないか、あるいは影響を及ぼさ
ないようにする。

非共有結合のための方法は、米国特許第４，５２８．２
６７号に記載されている。不溶性支持体へ抗体および抗
原を共有結合するための方法は、イチロー・チバタ（Ｉ
ｃｈｉｒｏ　　Ｃｈｉｂａｔａ）、固定化酵素（ＩＭＭ
ＯＢＩＬＩＺＥＤ　　ＥＮＺＹＭＥＳ）、Ｈａｌｓｔｅ
ｄ　　Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク（１９７８）およびＡ
、クアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）、ジャー
ナル囃オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ
ｏ　１．Ｃｈｅｍ、）　、２４５　：　３０５９　（１
９７０）（その内容全体をここに引用によって加える）
に記載されている。表面をタンパク質で被覆し、そして
米国特許第４，２１０，４１８号に記載されている方法
に従い、カップリング剤として、例えば、グルタルアル
デヒドを使用して、抗体または抗原と結合することがで
きる。なお他の方法において、ウェルは遊離のインシア
ネート基を有する層、例えば、ポリエーテルイソンアネ
ートで被覆し、そして水溶液中の抗体または抗原をそれ
に適用して必要な結合を実施する。なお他の方法におい
て、抗体または抗原をヒドロキシル化に米国特許１３，
７２０，７６０号に記載されているようにシアン化臭素
によりカップリングすることができる。

不溶性支持体は、好ましくは、［遮断（ｂｌ。

ｃｋ）Ｊ　［、て非特異的結合を減少する。適当な遮断
剤の選択は、不溶性支持体のタイプにより決定する。例
えば、ポリスチレンの支持体について、適当な遮断剤は
水溶性非免疫動物のタンパク質を包含する。適当な水溶
性非免疫動物のタンパク質は、次のものを包含する：ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒ
ツジ、およびウマの血清アルブミン；カゼインおよび非
脂肪ミルク；オバルブミン、糖タンパク質なと。

同一の遮断剤は、また、ナイロンおよびニトロセルロー
スの支持体を使用することができる。しかしながら、ニ
トロセルロースまたはナイロンの支持体のための好まし
い遮断剤は非脂肪ミルクまたはカゼインである。これら
は膜の支持体のための最適な遮断剤は、１〜５重量％の
非脂肪乾燥ミルク、および非イオン性界面活性剤、例え
ば、ポリオキシエチレンソルビタンの誘導体およびポリ
オキシエチレンエーテルを含有する水溶液である。

本発明の標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体、抗
（フィブロネクチン）抗体および抗（抗体）試薬は、標
識をタンパク質に取り付ける普通の方法により、好まし
くは抗体結合部位を適当に保護して調製することができ
る。標識はタンパク質の試薬に、化学的または物理学的
結合により結合またはカップリングすることができる。

本発明の抗体へ結合することができる配位子および基は
、次のものを包含する：それらが結合する試薬を試験す
べき試料中の化合物および材料と区別することができる
、物理学的または化学的特性を有する、元素、化合物ま
たは生物学的物質。

本発明の放射線標識した抗（フィブロネクチン）抗体ま
たは抗（細胞フィブロネクチン）抗体は、生体外診断の
試験のために使用することができる。

標識した抗体の比活性は、放射性標識の半減期、アイソ
トープの純度および標識を抗原または抗体中に組み込む
方法に依存する。表Ａはいくつかの商業的に使用されて
いるアイソトープ、それらの比活性および半減期を記載
する。イムノア７セイ試験において、より高い比活性は
、一般に、感受性がよりすぐれる。

表Ａ 口Ｃ６，２５Ｘ　１０’　　　　　　５７２０年３　Ｈ
２，９１Ｘ　１０’　　　　　　１２．５年コ’　Ｓ　
　　　　　　　１．５０Ｘ　ｔｏ’　　　　　　　８７
日＋２’　１　　　　　　２．１８Ｘ　１０’　　　　
　　　６０日”Ｐ　　　　　　　　３．１６Ｘ　１０”
　　　　　　　１４．３日１３’　Ｉ　　　　　　　１
．６２Ｘ　１０’　　　　　　８．１日表Ａに記載する
放射性アイソトープを使用する標識の手順は、一般に、
知られている。トリチウムの標識っけの手順は、例えば
、米国特許筒４゜３０２．４３８号に記載されている。

抗体のためにことに応用されるヨウ素化、トリチウムの
標識つけおよび１％ｃ、の標識っけの手順は、ボウディ
ング（Ｇｏｄｉｎｇ）（ｓｕｐｒａ、ｐｐ１２４１２６
）およびその中に引用されている参考文献に記載されて
いる。抗体をヨウ素化する他の手順は、次の参考文献に
記載されている：ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）およびグリ
ーンウッド（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）、ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、１４４：９４５　（１９６２）、デイピッ
ド（Ｄａｖｉｄ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓ　ｔ　ｒｙＮ　３　：　１０１４−１０２１（
１９７４）、および米国特許筒３．８６７．５１７号お
よび米国特許筒４．３７６．１１０号。適当な系、カッ
プリングが手順およびそれらとの基質の反応の例は、例
えば、次の参考文献に記載されている：米国特許再発行
第３１，００６号、米国特許筒ＢＩ３．６５４．０９０
号、米国特許筒４．２１４゜０４８号、米国特許筒４，
３０２．０４８号、米国特許筒４，３０２，４３８号、
米国特許筒４゜３１２．９４３号、米国特許筒４．３７
６．１１０号、およびその中の参考文献。他の適当な系
の例は、ベセ（Ｐｅｓｃｅ）ら、クリニカル・ケミスト
リー（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）２０：３５３−３５９　
（１９７４）およびライスダム（Ｗｉｓｄａｍ）Ｇ、ク
リニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ、）２２
：１２４３（１９７６）に記載されている。

標識つけに使用することができる適当な酵素のクラスの
リスト、および各クラスについて特定の例は次のとおり
である： 表Ｂ 酵素の例 アミラーゼ ポリヌクレオチダーゼ アギナーゼ アデナーゼ アミノポリペブチダーゼ ペプシン リパーゼ カタラーゼ チロシナーゼ アルコールデヒドロゲナー ゼ コハク酸デヒドロゲナーゼ 酵素還元サイト クーム イエロー酵素 ムターゼ クラス ヒドラーゼ ヌクレアーゼ アミダーゼ プリンデミナーゼ ペプチダーゼ プロイテナーゼ エステラーゼ 鉄の酵素 銅酵素 補酵素含有酵素 ジアホラーゼ グリオキサラーゼ デスモラーゼ オキシダーゼ ホスファターゼ デヒドロゲナーゼ アルドラーゼ グルコースオキシダーゼ ホースラデッシュベルオキ シダーゼ アルカリ性ホスファターゼ 酸性ホスファターゼ Ｇ６ＰＤＨ（グルコース６ −６−ホスホデヒドロゲナ ーゼ β−ガラクトシ ダーゼ ホスホリラーゼ へキソキナーゼ 適当な酵素のリストは、ハウム（Ｈａｗｋ）も、実際の
生理学的化学（ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　　ＰＨＹＳＩＯＬ
ＯＧＩＡＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、ニューヨー
ク：ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　　ｐｐ３０６−３９７　
（１９５４）に記載されている。

蛍光発生および発色の酵素（蛍光性または発色性生成物
を生成する選択した基質の存在下の酵素）は、有用な標
識つけ部分である。抗体の抗原と結合する能力を損傷し
ないで抗体に酵素を選択的に接合し、そして酵素をタン
パク質の試薬に接合する方法は、この分野においてよく
知られている。

適当な酵素およびそれらを抗体にカンプリングする手順
は、例えば、次の参考文献に記載されている：イチロー
・チバタ（Ｉｃｈｉｒｏ　　Ｃｈｉｂａｔａ）、固定化
酵素（ＩＭＭＯＢ　Ｉ　Ｌ　Ｉ　ＺＥＤ　　ＥＮＺＹＭ
ＥＳ　（ｓｕｐｒａ）；Ａ、クアトレカサス（Ｃｕａｔ
ｏｒｅｃａｓａｓ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂ　ｉ　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、）、　（ｓ　ｕ　ｐ　ｒ　
ａ）　　；ウィＬＶン（Ｗｉ　ｌ　５ｏｎ）ら、免疫蛍
光および関連する着色技術における国際会議（ＩＮＴＥ
ＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　　Ｃ０ＮＦＥＲＥＮＣＥ　　ＩＮ
　　ＩＭＭＵＮＯＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ　　ＡＮＤ
ＲＥＬＡＴＥＤ　　５ＴＡｒＮＩＮＧ　　ＴＥＣＨＮｒ
ＱＵＥｓ）　、Ｗ、ナック（Ｋｎａｑｑ）ら編、アムス
テルダム：ＥＩｓｅｖｉｅｒ　　ｐｐ２１５−２４４　
（１９７８）；スリビアン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）、Ｍ、
ら、Ａｎｎａｌｓ　　ｏｆ　　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙｓ　　１６：２２１−２４０　（
１９７９）；ニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）、Ｈ，ら、Ｍｅ
ｄｉｃａｌ　　Ｂｉｌｏｇｙ。

５７：１８７−１９１　　（１９７９）ｉガドヵリ（Ｇ
ａｄｋａ　ｒ　ｉ）　、Ｄ、　　ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　
　ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、１
０：２１５−２２４　（１９８５）；チジセン（Ｔｉ　
ｊ　ｓ　ｓ　ｅ　ｎ）　、Ｐ、ら、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

）、１３６：４５１−４５７　（１９８４）；ツルタ（
Ｔｓｕｒｕｔａ）ら、Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　　
ｏｆ　　　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　　ａｎｄＣ
ｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｘ　　３３ニア６７７７７　
（１９８５）；イシカワ（ｉｓｈｉｋａｗａ）、Ｅ、　
　、　Ｊｏｕｒｎａ　　！　　　ｏｆ　　　Ｉｍｍｕｎ
ｏａｓｓａｙ、４：２０９−３２７　　（１９８３）；
および米国特許第４．１９０．４９６号（上の参考文献
の内容全体をここに引用によって加える）好ましい酵素
およびそれらに対応する適当な基質は、ホースラデッン
ユペルオキシダーゼを包含し、そのために適当な基質は
０−フェニレンジアミン、ｍ−フェニレンジアミン、０
−ジアニシジン、および４−クロロ−σ−ナフトールで
ある。

それらは、また、β−ガラクトシダーゼを包含し、その
ために適当な基質は、例えば、４−メチルウベリ７エリ
ルーβ−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニドＣＩフェニルーβ
−Ｄ−４ラクトース、ｐ−ニトロフェノーノ呟ｏ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−ガラクトース、およＣｆｏ−トノ
ロフェノールである。

それらはアルカリ性ホスファターゼを包含し、それらの
ために適当な基質は、例えば、ｐ−ニトロフェニルホス
フェート、インドキシルホス７二−ト、および５−ブロ
モ−３−クロロインドキシルホスフェートである。

抗体を標識する酵素について適当な手順の例は、カーポ
ジイミド、ジアルデヒド、およびグルタルアルデヒドの
二官能性カップリング基を包含する。

アミン基を経る酵素の連結は、タンパク質を塩化チオニ
ル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび同様な試薬で
無水溶媒、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、ジメチ
ルスルホキシド、テトラヒドロ７ランなど中で処理する
ことによって達成することができる。別のカップリング
剤は、カーポジイミド、例えば、■−エチルー３−　（
３−（Ｎ。

Ｎ′−ジメチルアミノ）グロビル）−カーボジイミＦ、
１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）カ
ーポジイミドメチル−ｐ−トルエンスルホネート、スフ
シミジル４−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート
を包含する。

酵素の炭水化物部分は、また、アルデヒドに酸化し、そ
して免疫グロブリンのリシルアミノ基と反応させてシッ
ク塩基を形成することができる。

ホウ水素化ナトリウムを使用する還元は、酵素および抗
体の安定な連結を行う。ホースラデッシュベルオキシダ
ーゼと抗体は、免疫グロブリンへウィルソン（Ｗｊｌｓ
ｏｎ）（ｓｕｐｒａ］の方法により効果的に連結するこ
とができる。

蛍光団および発色団標識抗体は、この分野において知ら
れている標準の方法により調製することができる。抗体
および他のタンパク質は約３１０ｎｍまでの波長を有す
る光を吸収するので、蛍光部分は３１０ｎｍ以上、好ま
しくは４００ｎｍ以上の波長において実質的な吸収を有
するように選択すべきである。種々の適当な蛍光体およ
び発色団は、ストリアー（Ｓｔｒｙｅｒ）、サイエンス
（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１６２　：　５６２　（１９６ｇ
）およびブランド（Ｂｒａｎｄ）Ｌ、ら、Ａｎｎｕａｌ
　　Ｒｅｖｉｅｗ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ　
ｒｙ、４１　：　８４３−８６８　（１９７２）に記載
されている。抗体は蛍光発色団で普通の方法、例えば、
米国特許第３，９４０．４７５号、米国特許第４，２８
９，７４７号および米国特許第４゜３７６．１１０号に
開示されている方法により標識することができる。

上に記載するある数の所望の性質を有する蛍光体の１つ
の群は、次のとおりである：キサンテン色素、これは３
．６−シヒドロキシー９−７エニルキサントヒドロール
およびレサミンから誘導されたフルオレセインおよび３
．６−ジアミツー９−フェニルキサントヒトロールおよ
びリサミンローダミンＢから誘導されたローダミン。９
−ｏ−力ルポキシフェニルキサントヒドロールのローダ
ミンおよびフルオレセイン誘導体は、９−ｏ−カルボキ
シフェニル基を有する。反応性カップリング基、例えば
、アミノおよびインシアネート基を有するフルオレセイ
ン化合物、例えば、フルオレセインイソチアシアネート
およびフルオレスカミンは容易に入手可能である。フル
オレセイン化合物の他の群は、ａまたはβ位置にアミノ
基を有する。

抗体はフルオロクロームまたは発色団でボウディング（
Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｊ　、　　（ｓｕ　ｐ　ｒ　ａ　ｓ　
ッ２０８−２４９）に記載されている手順により標識す
ることができる。

本発明の方法において使用する抗体は、本発明の１つの
実施態様においてアビジンまたはビオチンに共有結合す
ることができる。適当な結合手順は、二官能性架橋剤に
よる架橋を包含する。適当な二官能性化合物は、ペータ
ース（Ｐｅｒｔｅｒｓ）Ｋ、　　ら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ。

４６：５２３　（１９７７）に記載されている。

他の場合において、結合は試薬それら自体の間で直接形
成することができる。例えば、抗体はアビジンにそれぞ
れの物質上の官能基により結合することができる。特定
の例として、アビジンは過ヨウ素酸で処理し、そして抗
体と反応させて、ビオチン対アビジンの結合を阻害せず
に、あるいは抗体の免疫学的活性を遮断しないで、シッ
ク塩基を形成することができる。

二官能性架橋剤を使用する既知の技術は、次のものを包
含する＝　（あ）ｌ工程のグルタルアルデヒトの連結、
アブラメアス（Ａｖ　ｒ　ａｍｅ　ａ　ｓ）、Ｓ−１ｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓ　６：４３（１９６９）
；　（ｂ）２工程のグルタルアルデヒド連結、アブラメ
アス（Ａｖ　ｒａｍｅ　ａ　ｓ）　、Ｓ。

Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ、８　：１１７
５（１９７１）；およびシマレイミド連結、カド−（Ｋ
ａ　ｔ　ｏ）Ｋ、ら、Ｅｕｒｏ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｍ、６
２　：　２８５　（１９６６）。

抗体は、金属のラジオヌクレオチドで、次の参考文献に
記載されている方法に従って標識することができる：ハ
ナトウィッチ（Ｈａｎａｔｏｗｉａｈ）Ｄ、　ら、Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｒａｄｉａ
ｔｉｏｎ、３５：５５４−５５７（１９８４）およびバ
クレイ（Ｂｕｃｋｌｅｙ）Ｒ，ら、Ｆｅｄｅｒａｔｉｏ
ｎ　　ｏｆ　　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｔ　　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ、１６６：２０２　２０
４（Ｊａｎ。

１９８４）。

本発明のイムノアッセイの１つの実施態様は、不溶性支
持体として、抗（細胞フィブロネクチン）抗体または抗
（フィブロネクチン）抗体が、直接にあるいはヤギ抗マ
ウス抗体により付着したポリスチレンを使用する。それ
を水性β−ガラクトシダーゼ、例えば、リン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）、ｐＨ６〜８、好ましくは７．２〜７，６で
希釈した試料と、試料中の細胞フィブロネクチンを不溶
性支持体上の抗体と十分時間接触させ、次いで試料を支
持体から除去する。インキュベーション時間は、実質的
な結合を起こさせるために十分であるべきであり、時間
は温度に依存する。適当なインキュベーション時間は、
１６〜４０℃の範囲の温度において約３０〜２４０時間
であり、好ましい接触加熱は２０〜２６℃の範囲の温度
において少なくとも６０分である。次いで、残留する試
料溶液は支持体からすすぎ溶液の使用により除去する。

普通のすすぎ溶液を使用することができる。適当なすす
ぎ溶液は米国特許第４，５２８．２６７号に記載されて
いる。それは、ｏ、ｏｏｏｔ〜０゜０５のリン酸塩のモ
ル濃度、６〜８のｐＨを有し、そして０．００１〜０．
１重量％の非イオン性界面活性剤を含有する水性リン酸
塩緩衝液である。

適当な非イオン性界面活性剤は、次のものを包含する：
ポリオキシエチレンエーテル（ＢＲＩＪ。

例えば、ラウリル、セチル、オレイル、ステアリル、お
よびトリデシルポリオキシエチレンエーテル）；ポリオ
キシエチレンソルビタン（Ｔ　Ｅ　Ｅ　Ｎ。

例えば、ポリオキシエチレンソルビタルモノラウレート
、モノパルミテート、モノステアレート、モノオレート
、およびトリオレエート）；および他のポリオキシエチ
レンエーテル（例エバ、ＴＲＩＴＯＮ）。

次いで、不溶性支持体をその上の補足された細胞フィブ
ロネクチンと結合する第２抗体、サンドイッチ抗体、と
接触させる。標識しないサンドイッチ抗体を使用する場
合、サンドイッチ抗体と結合すしかつ物理学的検出標識
を有する第３抗体を、普通の方法で使用してサンドイッ
チ抗体を決定することができる。

種々の標識を上に記載した。明瞭のためかつ限定を意図
しないで、この方法の引き続く工程を、酵素、好ましく
は発色酵素または蛍光発生酵素で標識した、抗（細胞フ
ィブロネクチン）抗体ついて説明する。用語［発色酵素
（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ　１ｃｅｎｚｙｒｎｅ）Ｊは、こ
こにおいて、適当な基質上発色体生成物を生成する酵素
を意味する。

用語「蛍光発生（ｆ　ｌｕｏ　ｒｏｇｅｎ　ｉ　ｃ）酵
素」は、ここにおいて、適当な基質と蛍光体生成物を生
成する酵素を意味する。

サンドインチ抗体は水溶液中で不溶性支持体に適用する
。この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結合
反応を促進するための適当な塩類または緩衝剤を含有す
る。例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、および温和な界面活性剤
、例えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシエ
チレンソルビタンを含有することができる。インキュベ
ーションは十分時間続けて、必要に応じて不溶性支持体
へ付着している、露出した細胞フィブロネクチンのエピ
トープとサンドインチ抗体が結合できるようにする。

次いで、サンドイッチ抗体の溶液を不溶性支持体から除
去し、そして支持体をすすぎ溶液、例えば、前述のもの
、ですすいで残留する結合しない標識した物質を除去す
る。

サンドイッチ抗体が標識されていない場合、サンドイッ
チ抗体に選択的に結合する、酵素標識抗体または他の結
合剤を、水溶液中において不溶性支持体に適用する。こ
の溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結合反応
を促進するための適当な塩類または緩衝剤を含有する。

例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リ
ン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、および温和な界面活性剤、例
えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシエチレ
ンソルビタンを含有することができる。インキュベーシ
ョンは十分時間続けて、必要に応じて不溶性支持体へ付
着している、露出した細胞フィブロネクチンのエピトー
プとサンドイッチ抗体が結合できるようにする。

次いで、サンドイッチ抗体の溶液を不溶性支持体から除
去し、そして支持体をすすぎ溶液、例えば、前述のもの
、ですすいで残留する結合しない標識した物質を除去す
る。

本発明のサンドイツチ法の次の工程において、不溶性支
持体を基質の水溶液と接触させ、前記基質は酵素の存在
下に反応して溶液中に蛍光性化合物または発色性化合物
を放出する。転化することができる適当な基質および酵
素は、例えば、米国特許第４．１９０．４９６号および
米国特許第４゜５２８．２６７号に記載されている。支
持体は１０−２〜１Ｏ−１°モル濃度の基質を含有する
する水溶液と接触させる。１Ｏ−４〜ｉｏ−’の基質の
モル濃度は好ましい。基質溶液中の好ましい追加の試薬
および緩衝剤は、２−アミノ−２−メチル−１プロパツ
ール緩衝剤、トリス、および塩化マグ不ンウムを包含す
る。

基質溶液は不溶性支持体を十分な時間インキュベーショ
ンして、蛍光体または発色体を生ずる反応を起こさせる
。１８〜４０℃の温度において、５〜２４０時間のイン
キュベーション時間を使用することができる。好ましく
は、温度は２０〜２６℃の範囲内であり、そしてインキ
ュベーション時間は３０〜１２０分である。

次いで、溶液中の蛍光体または発色体のレベルを測定す
る。基質溶液中の蛍光体または発色体のレベルを決定す
るための装置および方法は、この分野において普通に使
用されているものである。

溶液中の蛍光体または発色体のレベルは、不溶性支持体
上の酵素の濃度の関数であり、そして酵素の濃度は試料
中の細胞フィブロネクチンの量の関数である。細胞フィ
ブロネクチンの濃度は、溶液の蛍光体または発色体のレ
ベルを、既知濃度の蛍光体を含有する対照溶液を使用し
て得られた蛍光体または発色体のレベルと比較すること
によって決定することができる。

本発明のイムノアッセイ法の膜の実施態様において、抗
（フィブロネクチン）抗体が付着している不溶性支持体
を、水性緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、
ｐＨ６〜８、好ましくは７゜２〜７．６で希釈した血液
、血清または血漿の試料と十分な時間接触させて、試料
中の細胞フィブロネクチンを不溶性支持体上の抗（フィ
ブロネクチン）抗体と結合させる。結合のために要求さ
れる時間は、貫流系において非常にわずかである。

適当なインキュベーション時間は、１６〜４０℃の範囲
内の温度において２０分までであり、好ましい接触時間
は１分より短く、最適には１０秒〜２分である。

次いで、不溶性支持体は、サンドイッチ抗体である抗（
細胞フィブロネクチン）抗体と接触させる。サンドイッ
チ抗体は、標識または非標識であることができる。非標
識抗体を使用する場合、サンドインチ抗体と結合しかつ
物理学的検出標識を有する第２抗体を普通の方法で使用
して、サンドイッチ抗体を決定することができる。

種々の標識を上に記載した。明瞭の目的でかつ限定を意
図しないで、この方法の引き続く工程を、酵素、好まし
くは発色体酵素で標識した、抗（細胞フィブロネクチン
）抗体について説明する。

サンドイッチ抗体を水溶液中で不溶性支持体に適用する
。この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結合
反応を促進するために適当な塩類および緩衝剤を含有す
る。例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、および温和な界面活性剤
、例えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシエ
チレンソルビタンを含有することができる。インキュベ
ージ２ンは十分な時間続けて、必要に応じて不溶性支持
体へ付着している、露出した細胞フィブロネクチンのエ
ピトープとサンドイッチ抗体が結合できるようにする。

次いで、サンドイッチ抗体の溶液を必要に応じて不溶性
支持体から除去し、そして支持体をすすぎ溶液、例えば
、前述のもの、ですすいで残留する結合しない標識した
物質を除去する。

サンドイッチ抗体が標識されていない場合、サンドイッ
チ抗体に選択的に結合する、酵素標識抗体または他の結
合剤を、水溶液中において不溶性支持体に適用する。こ
の溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ結合反応
を促進するための適当な塩類または緩衝剤を含有する。

例えば、この溶液はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リ
ン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、および温和な界面活性剤、例
えば、前述のすすぎ溶液中で使用するポリオキシエチレ
ンソルビタンを含有することができる。インキュベーシ
ョンは十分な時間続けて、必要に応じて不溶性支持体へ
付着している、露出した細胞フィブロネクチンのエピト
ープと標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体が結合
できるようにする。好ましいインキュベーションの時間
および温度は、不溶性化した試薬の抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体を細胞内フィブロネクチン抗原（またはそ
の複合体）との結合について記載したようなものである
。

次いで、標識抗体の溶液を不溶性支持体から除去し、そ
して支持体をすすぎ溶液、例えば、前述のもの、ですす
いで残留する結合しない標識した物質を除去する。

本発明のサンドイツチ法の次の工程において、不溶性支
持体を基質の水溶液と接触させ、前記基質は酵素の存在
下に反応して溶液中に発色性化合物を放出する。転化す
ることができる適当な基質および酵素は、例えば、米国
特許第４．１９０゜４９６号および米国特許第４．５２
８．２６７号に記載されている。支持体は１０１〜１０
−”モル濃度の基質を含有するする水溶液と接触させる
。

１０−’〜１Ｏ−６の基質のモル濃度は好ましい。基質
溶液中の好ましい追加の試薬および緩衝剤は、２−アミ
ノ−２−メチル−１−プロパツール緩衝剤、トリス、お
よび塩化マグネシウムを包含する。

基質溶液は不溶性支持体を十分な時間インキュベージコ
ンして、蛍光体または発色体を生ずる反応を起こさせる
。１８〜４０℃の温度において、１〜２０分を使用する
ことができる。好ましくは、温度は２０〜２６°Ｃの範
囲内であり、そしてインキュベーション時間は２〜５分
である。膜上の発色体のレベルは反射計またはデンシト
メーターを使用して測定することができる。

本発明のキットは、サンプリング装置、サンプリング装
置とともに輸送および貯蔵のための緩衝液の組み合わせ
：本発明の試薬を付着させてを有する支持体；本発明の
試薬のバイアル、はくのパッケージまたは他の容器：お
よびそれらの組み合わせからなる。はくのパッケージ中
の不溶性支持構造体の各々はバイアルまたは他のパッケ
ージ中の他の試薬を組み合わせることができる。それら
は、また、別のバイアルまたは他のパッケージ中の他の
任意の試薬、例えば、停止試薬と組み合わせることがで
きる。

本発明の試薬は、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞
マーカー）抗体、好ましくはここで抗（内皮細胞マーカ
ー）抗体は抗（細胞フィブロネクチン）抗体である；お
よび不溶性支持体に付着した内皮細胞マーカー、好まし
くは内皮細胞マーカーは細胞フィブロネクチンである；
を包含する。

本発明の１つの試験キットは、不溶性支持体に付着した
抗（内皮細胞マーカー）抗体および標識した抗（内皮細
胞マーカー）抗体を包含する。不溶性支持体へ付着した
抗（内皮細胞マーカー）抗体および標識した抗（内皮細
胞マーカー）抗体は、好ましくは有意に交差反応性では
ない、抗（細胞フィブロネクチン）抗体である。

他の試験キットは、不溶性支持体へ付着した抗（細胞フ
ィブロネクチン）抗体および標識した抗（フィブロネク
チン）抗体からなる。なお他のものは、不溶性支持体へ
付着した抗（フィブロネクチン）抗体および標識した抗
（細胞フィブロネクチン）抗体からなる。なお他の試験
キットは、不溶性支持体へ付着した抗（内皮細胞マーカ
ー）抗体および標識した内皮細胞マーカーからなり、こ
こで抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体であることができ、そして標識した内皮細
胞マーカーは標識した細胞フィブロネクチンであること
ができる。なおさらに他の試験キットは、不溶性支持体
に付着した内皮細胞マーカーおざらに標識した抗（内皮
細胞マーカー）抗体からなり、ここで内皮細胞マーカー
は細胞フィブロネクチンであり、そして標識した抗（内
皮細胞マーカー）抗体は標識した抗（細胞フィブロネク
チン）抗体であることができる。

本発明は、さらに、次の非限定的実施例により例示する
。特記しない限り、温度はセ氏で記載し、そしてパーセ
ントは重量による。構成的にここにおける実施に変形し
た実施例は現在時制で記載し、そして前置て実施に変形
した実験室の実験を表す実施例は過去の時制で記載され
ている。

実施例１ ポリクローナル抗（細胞フィブロネクチン）抗体細胞フ
ィブロネクチンはヒト内皮細胞から精製する（Ｅｎｇｖ
ａ　ｌ　１おけるＲｏｕｓｌａｎｔｉ。

Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、２０：１−５（１９７７）
。

抗（細胞フィブロネクチン）抗体をウサギにおいて、文
献（例えば、５ｔｏｌ　ｊａｒ、Ｍｅｔｈａｄｓ　　ｏ
ｆ　　Ｅｎｇｙｍｏｌｏｇｙ、７０ニア０（１９８０）
）に記載されている免疫化技術およびスケジュールを使
用し、細胞フィブロネクチン抗原でウサギを免疫化して
引き出す。抗血清はモノクローナル抗体について使用さ
れたものに類似する固相アッセイにおいてスクリーニン
グする（例えば、Ｌｎｇｅら、ＣＩ　ｉｎ、Ｅｘｐ、Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、２５：１９１　（１９７６）およびＰｓ
ｅｔｋｙら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ。

４１　　：　　１８７　　（１９８１）　）。

抗血清のＩｇＧ分画を、細胞フィブロネクチンをカップ
リングしたＣＮＢ　ｒ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）４Ｂ　（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）を使用する親和クロマトグラフィーによ
り、さらに精製する。カップリングのために使用する方
法は、ゲルの製造業（者、アフィニティー・クロマトグ
ラフィー（ＡＦＩＮＩＴＹ　　ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡ
ＰＹ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍ
ｉｃａＩｓ、ｐｐ１５−１８）により推奨されるもので
ある。

このカラムを２〜３体積の緩衝液（０，０１モルのＰＢ
Ｓ％ｐＨ７，２）と平衡化し、次いで抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体含有溶液をカラムに適用する。溶離液の
吸収性を、カラムをタンパク質がもはや通過しなくなる
まで、２８００ｍにおいて監視する。次いで、カラムを
０．１モルのグリシン緩衝液、ｐＨ２，５で洗浄して、
免疫親和結合した抗（細胞フィブロネクチン）抗体を脱
着する。ピークの分画を集め、プールし、そして多数回
緩衝液を交換して、０．０１モルのＰＢＳ。

ｐＨ７，２に対して２４〜３６時間４℃において透析す
る。

高い純度を望む場合、親和精製したＩｇＧを血漿フィブ
ロネクチン結合親和カラムを、前述の手順により、通過
させて、血漿フィブロネクチンと交差反応するであろう
抗体を除去した。

実施例２ モノクローナル抗体抗（内皮細胞マーカー）抗体実施例
の手順により得られた精製した内皮細胞フィブロネクチ
ンを使用して、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）およびミルス
ティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、メソッズ・イン・エンジ
モロジー（Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、７３：　ｌ　（１９８１
）およびマツテ（Ｍａｒｓｕｒｒａ）、Ｈ，およびハコ
モリ（Ｈａｋｏｍｏ　ｒ　ｉ）　、Ｓ、ら（ｓｕｐｒａ
）の標準の手順に従い、マウスの免疫化のために細胞フ
ィブロネクチンを抗原として使用して、細胞フィブロネ
クチンに対するマウスモノクローナル抗体を得た。モノ
クローナル抗体は、文献、例えば、Ｌｎｇｅら、ＣＩ　
ｉｎ、Ｅｘｐ、１ｍｍｕｎｏ　１．２５　：１９１　（
１９７６）およびＰｓｅｔｋｙら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ。

４１　：１８７　（１９８１）に記載されている技術の
変更を使用してスクリーニングする。

マウスモノクローナル抗体は、腹水またはハイブリドー
マの培養上澄み液から、プロティン−Ａ結合セファロー
ズ−４８４Ｂ　（Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉａ　　Ｆｉｎｅ
　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、チジソン（Ｔｉ
　ｊ　ｓ　５ｏｎ）　、酵素イムノアッセイの実施およ
び理論（ＰＲＡＣＴＩＣＥ　　ＡＮＤＴＨＥＯＲＹ　　
ＯＦ　　ＥＮＺＹＭＥ　　ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＹＡＳ）
、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ　　Ｐｕｂｌｉｓｅ
ｒｓＳ　ｐｐ１０５　１０７（１９８５）の手順に従い
精製する。

実施例３ ポリクローナル抗体被覆マイクロタイターブレー実施例
１に記載するように調製し、そしてさらに精製して血漿
フィブロネクチンの交差反応性を除去した、ウサギ抗＜
ｍ胞フィブロネクチン）抗体を、０．０５モルの炭酸塩
緩衝液、ｐＨ９，６中でｌＯμｇ／ｍＱに希釈する。１
００μＱをイムロン（ＩＭＭＵＬＯＮ）Ｉ　Ｉマイクロ
タイタープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）のウェルの各々
中に分散する。プレートをカバーし、そして室温におい
て４時間または４℃において一夜インキユベーションす
る。プレートを洗浄緩衝液（０，０２モルのトリス−Ｈ
Ｃｌ、０．０１５モルのＮａＣ１，０，０５％のツイー
ン−２０）で４回洗浄し、ウェルを充填し、そして最終
使用でウェルを完全に空にする。次いで、プレートを各
ウェル中に２００μＱの遮断溶液（０，０１モルのＰＢ
Ｓ、１％のＢＳＡ、０．０２％のＮａＮ、、ｐＨ７，，
４）を分配し、そして室温において１時間インキュベー
ションする。次いで、ウェルを４回前述の洗浄緩衝液で
洗浄する。プレートはここで試料のイムノアッセイのた
めに準備されてる。

実施例４ モノクローナル抗体被覆マイクロタイタープレート ヤギＦ　（ａｂ’　）　２抗マウス■ｇＧ抗体（Ｔａｇ
ｏ）を０．０５モルの炭酸塩緩衝液、ｐＨ９゜６、中に
１０μｇ７ｍ（ｌに希釈する。１００μαをイムロン（
ＩＭＭＵＬＯＮ）Ｉ　Ｉマイクロタイタープレート（Ｄ
ｙｒ＋ａｔｅｃｈ）のウェルの各々中に分散する。プレ
ートをカバーし、そシテ室温において４時間または４℃
において一夜インキユベーションする。プレートを実施
例４におけるように洗浄緩衝液で４回洗浄する。次いで
、プレートを実施例３に記載する遮断溶液を各ウェル中
に分配することによって遮断する。実施例２におけるよ
うに調製したマウスモノクローナル抗細胞フィブロネク
チンを、０．０１モルのＰＢＳ−１％のＢＳＡ、ｐＨ７
，４、で１１５００に希釈する。

１００μａの溶液を遮断したマイクロタイタープレート
の各ウェル中に分配する。ウェルをインキュベーション
し、カバーし、室温において２時間または４°Ｃにおい
て一夜インキユベーションする。

次いで、プレートを前述の洗浄緩衝液で４回洗浄し、次
いで試料のイムノアッセイのために準備される。

実施例５ 酵素標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体実施例１
または実施例２の手順に従って調製した抗（細胞フィブ
ロネクチン）抗体を、■工程のグルタルアルデヒドの方
法に従いアルカリ性ホスファターゼと接合する（Ａｖｒ
ａｍｅａｓ％　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ　ｔ　ｒｙｚ
　６　：　４３　（１９６９））。

実施例６ サンドイッチイムノアッセイ 陽性および陰性の対照をこの試験において含める。陽性
の対照は、既知濃度の精製したヒト細胞フィブロネクチ
ンであり、アッセイの範囲内に入るように適切に希釈す
る（モノクローナルに基づくアッセイについて２０　ｎ
　ｇ／ｍＱ〜５μｇ　／　ｍＱ）。陰性の対照は試料の
希釈物である。アッセイの標準は既知フィブロネクチン
濃度の精製したヒト細胞フィブロネクチンであり、系統
的に希釈して、２０％ｇ”ＩＯμｇ／ｍ４の範囲の標準
曲線を作成する。

試料の希釈物は、１９８８年９月１５１３提出の同時継
続出願第２４４．９８４号（その内容全体をここに引用
によって加える）に記載されている、抗プロテアーゼカ
クテルである。それはフィブロネクチン含有試料を輸送
および貯蔵の間タンパク質分解から保護する。この溶液
は０．０５モルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４：０．１
５モルのＮａｃＩ、０．０２％のＮａＮ、、１％のＢ５
Ａ１５００力リクレイン単位／ｍＱのアプロチニン、１
ナノモルのフッ化フェニルメチルスルホニル（ｐＭＳＦ
）および５ミリモルのＥＤＴＡから成っていた。

血液試料を患者から採取し、そして処理して血漿または
血漿の試料を生成する。

実施例３または４におけるように調製したマイクロタイ
タープレートをアッセイに使用する。１００μＱの各標
準、試料、陽性および陰性の対照を別々のウェル中に入
れ、そして室温において２時間インキュベーションする
。プレートを実施例３および４に記載する洗浄緩衝液で
４回洗浄する。

■００μＱの実施例５におけるように調製したアルカリ
性ホスファターゼ接合ヤギ抗（細胞フィブロネクチン）
を、接合緩衝液（０，２モルのトリス−ＨＣｌ５　ｐＨ
８，０，３モルのＮａＣＩ、０゜０５％のツイーン２０
．５％のＢ５Ａ１０．０２％のＮａＮ５）中で１／１０
００に希釈する。１００μαを各ウェルに分配し、そし
て室温において２時間インキュベーションする。プレー
トを４回前述のように洗浄する。４ｍｇ／ｍＱのｐ−ニ
トロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）　を基ｆｆとし
て使用する。これを０，１８モルのの２−アミノ−２−
メチル−１−プロパツール（ＡＭＰ）緩衝液、ｐＨ９，
５および０．１２ミリモルのＭｇＣ１！中で希釈する。

１００μｇをマイクロタイタープレートの各ウェルに分
配する。室温において５分インキュベーションした後、
反応速度（ミリーＯＤ／分）を４０５　ｎｍｔ’Ｖ−Ｍ
ＡＸ”力学的プレート読取装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
　Ｄｅｖｕｃｅ）により読む。

増加する反応速度を標準における増加する細胞ブイプロ
ネクチン濃度と関係づけることによって、標準曲線を構
成した。未知のものは、この曲線から直接計算するか、
あるいはプリーセットコンピュータープログラム（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　　Ｄｅｖｕｃｅ）を使用して計算した
。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１１工程： ａ）血液、血漿または血清の試料を妊娠した患者から取
り、そして ｂ）試料中の内皮細胞マーカーの存在について決定する
、 からなることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血
圧または子かんを決定する方法。

２、試料中で内皮細胞マーカーの存在は、ａ）試料を抗
（内皮細胞マーカー）抗体と接触させ、そして ｂ）抗体と内皮細胞マーカーとの結合を決定する、 ことによって決定する、記載１項記載の方法。

３、工程： ａ）試料を第１抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した
不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を
起こさせ、 ｂ）前記不溶性支持体を第２抗（内皮細胞マーカー）抗
体とを十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ
、そして Ｃ）前記不溶性支持体上の第２抗（内皮細胞マーカー）
抗体の存在を決定する、 からなる、上記第２項記載の方法。

４、第２抗（内皮細胞マーカー）抗体は物理学的検出標
識を有する、上記第３項記載の方法。

５、工程： ａ）試料および第２抗（内皮細胞マーカー）抗体の混合
物を第１抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した不溶性
支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさ
せ、そして ｂ）前記不溶性支持体上の第２抗（内皮細胞マーカー）
抗体の存在を決定する、 からなる、上記第２項記載の方法。

６、第２抗（内皮細胞マーカー）抗体は物理学的検出標
識を有する、上記第６項記載の方法。

７、抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体である、上記第１項記載の方法。

８、工程： ａ）試料を抗（細胞フィブロネクチン）抗体と十分な時
間接触させて、抗（細胞フィブロネクチン）抗体との抗
原−抗体結合を起こさせ、そしてｂ）前記結合の存在を
決定する、 からなる、上記第７項記載の方法。

９、工程： ａ）試料を抗（細胞フィブロネクチン）抗体が付着した
不溶性支持体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を
起こさせ、 ｂ）前記不溶性支持体を抗（フィブロネクチン）抗体と
十分な時間付着させて抗原−抗体結合を起こさせ、そし
て Ｃ）前記不溶性支持体上の抗（フィブロネクチン）抗体
の存在を決定する、 からなる、上記第８項記載の方法。

１０、抗（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出標識
を有する、上記第９項記載の方法。

１１１抗（フィブロネクチン）抗体は抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体である、上記第９項記載の方法。

１２、前記不溶性支持体に付着した抗（細胞フィブロネ
クチン）抗体は第１抗（細胞フィブロネクチン）抗体で
あり、そして抗（フィブロネクチン）抗体は第１抗（細
胞フィブロネクチン）抗体と有意に交差反応しない第２
抗（細胞フィブロネクチン）抗体である、上記第１１項
記載の方法。

１３、工程： ａ）試料および抗（フィブロネクチン）抗体の混合物を
抗（細胞フィブロネクチン）抗体が付着した不溶性支持
体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、
そして ｂ）前記不溶性支持体上の抗（フィブロネクチン）抗体
の存在を決定する、 からなる、上記第８項記載の方法。

１４、前記抗（フィブロネクチン）抗体は物理学的検出
標識を有する、上記第１３項記載の方法。

１５、前記抗（細胞フィブロネクチン）抗体は第１抗（
細胞フィブロネクチン）抗体であり、そして前記抗（フ
ィブロネクチン）抗体は有意に交差反応しない第２抗（
細胞フィブロネクチン）抗体である、上記第１３項記載
の方法。

１６、工程： ａ）試料を抗（フィブロネクチン）抗体が付着した不溶
性支持体と十分な時間接触させて抗原抗体結合を起こさ
せ、 ｂ）前記不溶性支持体を抗（細胞フィブロネクチン）抗
体と十分な時間接触させて抗原−抗体結合を起こさせ、
そして Ｃ）前記不溶性支持体上の抗（細胞フィブロネクチン）
抗体の存在を決定する、 からなる、上把第７項記載の方法。

１７、前記抗（細胞フィブロネクチン）抗体は物理学的
検出標識を有する、上記第１６項記載の方法。

１８、工程： ａ）試料および抗（細胞フィブロネクチン）抗体の混合
物を抗（フィブロネクチン）抗体が付着した一不溶性支
持体と十分な時間接触させて抗原抗体結合を起こさせ、
そして ｂ）前記不溶性支持体上の抗＜ｍ胞フィブロネクチン）
抗体の存在を決定する、 からなる、上記第７項記載の方法。

１９、前記抗（細胞フィブロネクチン）抗体は物理学的
検出標識を有する、上記第１８項記載の方法。

２０、工程： ａ）抗（内皮細胞マーカー）抗体が付着した不溶性支持
体を、試料および前記支持体に付着した抗（内皮細胞マ
ーカー）抗体のすべてと結合するために不十分である量
の標識した内皮細胞マーカーの混合物と接触させ、そし
て ｂ）前記不溶性支持体に結合した標識した内皮細胞マー
カーの量または前記混合物中に残る標識した内皮細胞マ
ーカーの量を決定する、かもなる、上記第２項記載の方
法。

２１、工程： ａ）抗（細胞フィブロネクチン）抗体が付着した不溶性
支持体を、試料および前記支持体に付着しｔ；抗（細胞
フィブロネクチン）抗体のすべてと結合するために不十
分である量の標識した廁胞フィブロネクチンの混合物と
接触させ、そしてｂ）前記不溶性支持体に結合した標識
した細胞フィブロネクチンの量または前記混合物中に残
る標識した細胞フィブロネクチンの量を決定する、から
なる、上記第２１項記載の方法。

２２、工程： ａ）内皮細胞マーカーが付着した不溶性支持体を、試料
および前記支持体に付着した内皮細胞マーカーのすべて
と結合するために不十分である量の標識した抗（内皮細
胞マーカー）抗体の混合物と接触させ、そして ｂ）前記不溶性支持体に結合した標識した抗（内皮細胞
マーカー）抗体の量または前記混合物中に残る標識した
抗（内皮細胞マーカー）抗体の量を決定する、 からなる、上記第２項記載の方法。

２３、細胞フィブロネクチンが付着した不溶性支持体を
、試料および前記支持体に結合した細胞フィブロネクチ
ンのすべてと結合するために不十分である量の標識した
抗（細胞フィブロネクチン）抗体の混合物と接触させ、
そして ｂ）前記不溶性支持体に結合した標識した抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体の量または前記混合物中に残る標識
した抗（細胞フィブロネクチン）抗体の量を決定する、 からなる、上記第２２項記載の方法。

２４、不溶性試薬支持体に付着した抗（内皮細胞マーカ
ー）抗体からなることを特徴とする、子かん前症、妊娠
誘発高血圧または子かんを決定するための試薬。

２５、前記抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィ
ブロネクチン）抗体である、上記第２４項記載の試薬。

２６、不溶性試薬支持体に付着した内皮細胞マーカーか
らなることを特徴とする、予がん前症、妊娠誘発高血圧
または子かんを決定するための試薬。

２７、前記内皮細胞マーカーは細胞フィブロネクチンで
ある、上記第２６項記載の試薬。

２８、不溶性支持体に付着する抗（内皮細胞マーカー）
抗体および標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からな
ることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧また
は子かんを決定するための試験キット。

２９、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）
抗体および標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体は、抗
（細胞フィブロネクチン）抗体である、上記第２８項記
載の試験キット。

３０、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）
抗体および標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体は、有
意に交差反応しない抗（細胞フィブロネクチン）抗体で
ある、上記第２９項記載の試験キット。

３Ｌ不溶性支持体に付着した抗（細胞フィブロネクチン
）抗体および標識した抗（フィブロネクチン）抗体から
なることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧ま
たは子かんを決定するための試験キット。

３２、不溶性支持体に付着した抗（フイブロネクチン）
抗体および標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体か
らなることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧
または子かんを決定するための試験キット。

３３、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）
抗体および標識した内皮細胞マーカーからなることを特
徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または子かんを
決定するための試験キット。

３４、抗（内皮細胞マーカー）抗体は抗（細胞フィブロ
ネクチン）抗体であり、そして標識した内皮細胞マーカ
ーは標識した細胞フィブロネクチンである、上記第３３
項記載の試験キット。

３５、不溶性支持体に付着した内皮細胞マーカーおよび
標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からなることを特
徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧まｊ二は子かん
を決定するための試験キット。

３６、内皮細胞マーカーは細胞フィブロネクチンであり
、そして標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体は標識し
た抗（細胞フィブロネクチン）抗体である、上記第３５
項記載の試験キット。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： ａ）血液、血漿または血清の試料を妊娠した患者から取
   り、そして ｂ）試料中の内皮細胞マーカーの存在について決定する
   、 からなることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血
   圧または子かんを決定する方法。 ２、不溶性試薬支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー
   ）抗体からなることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘
   発高血圧または子かんを決定するための試薬。 ３、不溶性試薬支持体に付着した内皮細胞マーカーから
   なることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧ま
   たは子かんを決定するための試薬。 ４、不溶性支持体に付着する抗（内皮細胞マーカー）抗
   体および標識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からなる
   ことを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または
   子かんを決定するための試験キット。 ５、不溶性支持体に付着した抗（細胞フィブロネクチン
   ）抗体および標識した抗（フィブロネクチン）抗体から
   なることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧ま
   たは子かんを決定するための試験キット。 ６、不溶性支持体に付着した抗（フィブロネクチン）抗
   体および標識した抗（細胞フィブロネクチン）抗体から
   なることを特徴とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧ま
   たは子かんを決定するための試験キット。 ７、不溶性支持体に付着した抗（内皮細胞マーカー）抗
   体および標識した内皮細胞マーカーからなることを特徴
   とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または子かんを決
   定するための試験キット。 ８、不溶性支持体に付着した内皮細胞マーカーおよび標
   識した抗（内皮細胞マーカー）抗体からなることを特徴
   とする、子かん前症、妊娠誘発高血圧または子かんを決
   定するための試験キット。