JPH02109983A

JPH02109983A - ヒトｙｐｔ−１様遺伝子

Info

Publication number: JPH02109983A
Application number: JP26207488A
Authority: JP
Inventors: Toshiya Takano; 高野　利也; Koichi Tachibana; 宏一立花
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp; Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1988-10-18
Filing date: 1988-10-18
Publication date: 1990-04-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新規なヒトＹＰＴ−１様遺伝子に関するもの
である。

（従来技術及び発明が解決しようとする問題点）１９７
０年代より、動物細胞を癌化する遺伝子がいくつが単離
・同定されるようになった。その中で、ｒａｓ遺伝子（
分子量的２１．０００）は、実際のヒトｓ（膀胱癌、大
腸癌、肺癌４４）において点突然変異により活性化され
癌化の原因となることが知られている。

ｒａｓ遺伝子のコードする蛋白質（ｐ２１）は細胞膜に
局在し、グアノシントＩＪ７オス７エー）（ＧＴＰ）と
グ７ノシンジ７オス７エー）（ＧＤＰ）との結合活性お
よびＧ　Ｔ　Ｉ）加水分解（Ｇ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ）活性
を持つ、いわゆるＧ蛋白質の性質を有している。

Ｇ蛋白質は、ホルモンなどいわゆる第１次情報伝達物質
の刺激を細胞内の真の標的物質へ伝達する仲立ちの役帛
を果すと考えられているが、例えば、ヒト癌から単離さ
れた点突然変異ｒａｓ蛋白質はそのＧ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ
活性が極めて低い恒常的活性型であり、そのため常に細
胞増殖を促すシグナルを送り続け、細胞を癌化へ導くも
のと４１測されている。

このｒａｓ遺伝子の機能を詳細に解析するために種々の
検討が行われ、その結果、該遺伝子に近縁な遺伝子がい
くつか同定されている。その１つとしてパン酵母の遺伝
子ライブラリーがらＹＰＴ−１遺伝子が単離・同定され
でいる。

ＹＰＴ−１遺伝子は、分子贋約２３，５００の蛋白質を
コードしており、細胞膜に局在する点、或いはＧＴＰ−
ＧＤＰ結合活性およびＧ　Ｔ　Ｐ　ａｓｅ活性を有する
点でｒａｓ遺伝子産物と同様の酵素蛋白質である。その
細胞内での機能はｒａｓ同様詳細は不明であるが、細胞
骨格の構築、細胞分裂および細胞内蛋白輸送への関与が
Ｍ＃測されている。

高等哺乳動物細胞のＹＰＴ−１様遺伝子としては、）Ｉ
ａｎｂｒｕｃｋらによりマウス由来の遺伝子［イー　エ
ム　ビー　オー（ＥＭＢＯ）Ｊ、（＞、、４０４９−４
０５３．１９８７１や’ｌ”　Ｂｃｌｌｏｔらによりラ
ット由来の遺伝子［プロシーディングズオプザナショナ
ルアカデミーサイエンシズオブザユーエスエー（Ｐ　ｒ
ｏｅ。

Ｎ　ａｔｌ、Ａ　ｅａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　
）４−４，８２１０−８２１４．１９８７１が単離され
ている６そして、Ｔｏｕｃｂｃｔらは、４種類あるラッ
トＹＰＴ−１様遺伝子（ｒａｂ−１。

−２、＋　３、−４　）のうちｒａｂ　−１に相当する
ヒト細胞白米相補Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃＤ　Ｎ　Ａ　）を単
離したと報告している。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、ヒトバーキットリンパ腫における癌化機
構について染色体転座との関連を解析すべく鋭意検討し
ていたところ、新規なし）　ＹＰＴ−１様遺伝子の存在
を初めて見い出し、本発明を完成するに至った。

即旭、本発明の要諭は、後述の第１図のアミノ酸配列で
表わされる蛋白質をコードするＹＰＴ−１様遺伝子およ
び第２図のＤＮＡ配列で表わされる蛋白質をコードする
ＹＰＴ−１様遺伝子に存する。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明のヒトＹＰＴ−１様遺伝子は次のようにして得ら
れる。即ち、先ずヒトバーキットリンパ腫細胞、例えば
細胞株ＫＯＢＫ１０１［ノヤパニーズノヤーナルオブキ
ャンサー　リサーチ（Ｊ　ｐｎ、　Ｊ　、Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、　Ｌ″７７．２４−２７．１９８６１、或い
はヒト前骨髄単核球性細胞、例えば細胞株Ｕ−９３７［
インターナシ謄ナルノヤーナルオブキャンサー（Ｉ　ｎ
ｔ、　Ｊ　、Ｃａｎｃｅｒ）、３７．５６５−５７７．
１９７６１等を培養し、全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴ
セルロースカラムでポリＡ”　ＲＮＡを単離する。これ
を用いて常法により、例えばλｇｔｌ１７ｙ−ノにパッ
ケージングしてｃＤＮＡライブラリーを作成する。

得られたｅＤＮＡライブラリーを寒天培地上で培養しで
、プラークが出現した時点でニトロセルロースフィルタ
ーに移し、細胞株ＫＯＢＫＩＯＩのｃＤＮＡライブラリ
ーの場合は、ヒト免疫グロブリンに遺伝子、例えばその
コンスタント領域の則９０Ｒｇ断片を、或いは第４図に
示すＤＮＡ配列で表わされるＤＮＡのＢ　ｓａ、ｒ　−
１見Ｒ１断片を常法に従いラフオアイソトープでラベル
して、それをプローブとして使用し、ハイブリダイズし
て強いシグナルを与えるプラークを得る。尚、本発明に
於いてヒトＹＰＴ−１様遺伝子の塩基配列を後述の通り
決定したので、ヒ記プローブとしでかかる塩基配列の一
部のＤＮＡ断片、例えば第２図に示すＤＮＡ配列で表わ
されるＤＮＡをその３°末端側にある制限酵素切断部忙
Ｑす１１、ｋｉ、　ｉ　ｎ−ｄ　ｍ、む１．１等）で切
断したＤＮＡ断片を２個以ト用いることによって、容易
に目的とするｃＤＮＡをスクリーニングすることができ
る。

得られたプラークから７７−ノＤＮＡを単離し、Ｅｃｏ
ＲＩ等でＤＮＡを切断して目的ＤＮＡ１１片を得、これ
を例えばＭ１３ベクター等に組み込み、増幅して該ＤＮ
Ａ断片を得てタデオキシ法等の常法に従い塩基配列を決
定する。

本発明のヒトＹＰＴ−１様遺伝子は、第２図に示すＤＮ
Ａ配列を有し、ラット由来のｒａｓ遺伝遺伝子実つであ
るＹＰＴ関連遺伝子のｒａｌ）−２遺伝子と約９２．２
％のホモロジーを示す。

また、本発明のヒトＹＰＴ−１様遺伝子がコードする７
ミ／酸配列は第１図に示す通りで、２１２個のアミノ酸
から成る蛋白質である。そして、このアミノ酸コード領
域中には他のｒａｓ遺伝遺伝子実様、４つのＧＴＰ結合
領域があり、ＧＴＰ結合蛋白質の１つとして、細胞のシ
グナル伝達の経路に重要な役割をもつものと考えられる
。

しかし、エフェクター領域のｒａｓ共通のコンセンサス
配列は見い出されないので、本発明のアミノ酸２１２個
の蛋白質は、ＹＰＴ−１遺伝子の蛋白質と類似した機能
を有し、狭義のｒａｓ蛋白質のエフェクターとは異なる
エフェクターにシグナル伝達を行）ものと考えられる。

更に、この２１２個のアミノ酸から成る蛋白質のＣ末端
にはりガン２つの一→−残基が連って見い出された。これはｒａｓ
遺伝遺伝子実通の性質で、パルミチン酸と結合し、細胞
形質膜の内側にこの蛋白質が局在する可能性を示唆して
いる。

（発明の効果）本発明のヒトＹＰＴ−１様遺伝子は新規であり、該遺伝
子によりコードされている蛋白質はＹＰＴ−１蛋白質と
同様、細胞のシグナル伝達に関与し、細胞の情報伝達の
調節剤としての用途が期待される。

（実施例）以下に実施例を挙げて更に本発明を具体的に説明する。

実施例１１、ポリＡ＋ＲＮＡの単離（１）バーキラ）　＋７ンパ肝細胞株ＫＯＢＫＩＯ１を
細胞培養液（１０％牛脂児血清、ＲＰＭＩ１１００Ｕ／
ｍｌぺ二ンリン、０．００２％炭酸水素ナトリウム、５
％二酸化炭素）中、３６．５℃で浮遊培養して、約１０
６細胞／１の培養液３００ｍ１を得た。

この培養液を遠心して細胞を集め、４Ｍグアニジン溶液
（４Ｍグアニノンチオシ７ネート、１０曽Ｍトリスー塩
酸（ｐＨ７、４）、７％β−フルカプトエタノール）お
よび２０％サルコシン溶液を加え、シリンジを用いて１
９デージ、２２デーノおよび２６デーシ針を３回ずつ通
した。

得られた処理液を５．７Ｍ塩化セシウム溶液１−。

に重層した後、３０＊０００ｒｐｍで１６時間遠心した
（０守４０Ｔ１０−ター）。

１−清を除去して沈澱したＲＮＡに７．５Ｍ塩塩酸グア
ノノン溶液加えて溶解し、ＩＭ＃酸、エタノールを加え
、−２０℃で保存した。

（２）沈澱した細胞全ＲＮへを遠心して集め、水に溶解
した。ここで得られた細胞全ＲＮＡの量は約３．３　ｍ
ｇであった。

（３）得られた細胞全ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカ
ラムにかけて、溶出ａｍ液（１０ｉ＊Ｍ）リス−塩酸（
１）Ｈ７，４）、１＋＊ＭＥＤＴＡ）でポリＡ÷ＲＮＡ
（約４１μｇ）を得た。

１１、ｃＤＮＡライブラリーの作成（１）　　　ｅＤＮ　　Ａ　　５ｙｎｔｌ＋ｅｓｉｓ　
　Ｓｙｓｔｅｍ　　Ｐｌｕｓ　　（アマジャム社！りを
用いて１−記１．で得たポリＡ”ＲＮＡの２本［ｅＤＮ
Ａを合成した。即ち、該ポリＡ”ＲＮＡ５μｇに１０μ
ｍの５倍希釈第１鎖合成反応液、２．５μｍビロリン酸
ナトリウム、２．５μｍ　ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻
害剤、５μｍデオ斗シヌクレオンドトリ７オス７二−ト
混合物、２．５μｍオリゴｄＴ、６０Ｕリバーストラン
スクリプターゼおよ１１．２５μｍ　５°−［α−”２
Ｐ　１ｃｌＣＴ　Ｐ　（アマジャム社製）を加え、４２
℃で５０分間反応させてｃＤＮＡの第１鎖を合成した。

次いで、９３．５μｍの第２頻今成反応液、５μＩ５゛
−［α−コ’ＰｌｄＣＴＰ、４Ｕ大腸菌ＲＮ　ａｓｅ　
ｔ−１，１１５Ｕ大ｖｋ菌ＤＮＡボｌｊ／？−ゼｌを加
え、更に水を加えて全量を２５０μｍとして１２℃で１
時間、次いで２２℃で１時間反応させてｃＤＮＡ第２鎖
を合成し、更に２Ｕの７４　　ＤＮＡポリメラーゼを加
え３７°Ｃに保温し、冷却後３．５Ｕの大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片、（１，５ＭＥＤＴＡを加
えて良く混合した。

７１〕−ル：クロロホルム：イソアミルアルコール（２
５：２４：１　）でＤＮＡを抽出し、エタノールで沈澱
させて２本領ｃＤＮＡを得た。５μｄのポリＡ”ＲＮＡ
から約２．４μｇのｃＤＮＡが得られた。

（２）　ヒ記２本４１’（ｃＤＮＡを１９μｍの水に溶
Ｍ！ｆ＆、ｃＤ　Ｎ　Ａクローニングシステム（アマジ
ャム社製）を用いてｃＤＮＡライブラリーを得た。即ｈ
、５倍希釈の７チレーシタン溶液６μｌ、Ｓ−７デ７シ
ルメチオニン溶液３μｍ、５０Ｕ大腸薗ＥｃａＲＩメチ
ラーゼを加えて３７℃で１時間反応させた後、７０°Ｃ
で１０分間保温しメチラーゼを失活させた。

次いで、１０倍希釈のライデージコン溶液４μ１１Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−２，５μｌ、（３ＵＴ４　　ＤＮＡす〃
−ゼを加え、１５℃で１６時間保温した。ライデースを
失活させた後、ＥｃｏＲｌでリンカ−を切断し、リンカ
−分離用カラム（７マシヤム社製）により　ｃＤＮＡを
分離した。このｃＤＮＡの一部を７〃ロース電気泳動に
かけたところ、平均の大きさは約１　、２　ｋｂｐであ
った。

（３）ｊ−記ｃＤＮＡ２００ｎｇに１μＨのＥｃ。

Ｒ１切断５′−脱リン酸λｇｔｌｌＤ　Ｎ　Ａおよび１
μライプ−ジョン溶液、２，５ＵＴ４　　ＤＮＡリガー
ゼを加え、水で全量１０μｍとして１５℃で１６時間反
応した後、Ｇｉｇａ　Ｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　（パッケー
ジングキット、ストラテジーン社！りを用いてλ７Ｔ−
）にパッケージングして、７アーノｃＤＮＡライブラリ
ーを得た。

［７，ｅＤＮＡライブラリーのスクリーニング２３Ｘ２
３ｃ輸角シヤーレにＬプロス寒天培地を固めた１−に、
１１のブレーティングバクテリアと３７℃で２０分間反
応させた７Ｔ−）ｃＤＮＡライブラリーを２０１の（１
，７％アがロースを含む１．ブロスと混合して流しいれ
た。固まった後培重してプラークが出現した時点で４℃
に冷却し、ニトロセルロースメンブレンフィルターに移
した。

このフィルターを［モレキュラー　クローニング１（コ
ールド　スプリングハーバ−ラボラトリ−〆、１９８２
年）に記載の方法に従って変性処理し、ヒト免疫グロブ
リンに遺伝子のコンスタント領域の旦ｊ、ρＲ１２，７
ｋｂｐ断片をマルチプライマー法でラジオアイソトープ
ラベルしたプローブと６５℃で１２時闇ハイブリグイズ
させ、強いシグナルを与える約４０個のプラークを得た
。これらのプラークより一１１記［モレキュラー　クロ
ーニング１に記載の方法で７７−）ＤＮＡを単離した。

Ｗ、ｃＤＮＡクローンの同定得られた７Ｔ−ノＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断してのクロ
ーンは、免疫グロブリンに鎖Ｃ領域の３゛側非翻訳頌域
をアンチセンスに読んだ後方に第４図に示すＤＮＡ配列
（直後にポリＡ及びＥｅｏＲＩリンカ−が付いている）
が連絡していることが分つた。この塩基配列は、シーン
バンクデータベースのラットのｒｕｂ−２遺伝子とホモ
ミノ−が高いことが分った。

Ｖ、ｅＤＮＡライブラリーの作成上記■、で得られたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンにｒａｂ−
２様蛋白質のコーティング領域全長を含んでいるものが
なかったので、ノザン法によるＲＮＡの解析の結果、該
遺伝子ｍＲＮＡの発現量が多かったヒト前骨髄単核球性
白血病細胞Ｕ９３７のｃＤＮＡライブラリーを作成して
、それからスクリーニングすることにした。

（１）約２×１０−個のｔＪ　９３７　ＩＩ胞から前記
ｉ、と同様の方法で約２８μｇのポＩＪＡ”ＲＮＡを得
た。このうち３μｇのポリＡ”ＲＮＡを用い、前記■、
と同様にしてｃＤＮＡライブラリーを作成した。３μｇ
のポリＡ”ＲＮＡより約２μｇの２本領ｃＤＮＡが得ら
れた。

このｃＤＮＡを前記と同様にしてアマジャム社９！ｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングキットを用いて−ｐｃ＋＞Ｒｒメ
チル化、ＥｃｏＲ１リンカ−付加、ＥｃｏＲＩ切断した
後、リンカ−分離用カラムにより　ｃＤＮＡを分離した
。このｃＤＮＡの平均の大きさは約１　、５　ｋｂｐで
あった。

このｃＤＮＡ２００ｎｇを前記と同様にしてλＨｔｌ１
７ｙ−ジにパッケージングして７アージｃＤＮＡライブ
ラリーを得た。

（２）　このｅＤＮＡライブラリーを前記■、と同様に
して培養し、ニトロセルロースメンブレンフィルターに
移した。このフィルターを前記と同様に変性処理し、マ
ルチプライマー法でラジオアイソトープラベルしたＰＩ
Ｓ４図に示すＤＮＡ配列でりを得た。

かくして得られたクローンのうち１０個を前記■、と同
様にしてＤＮＡ配列を決定したところ、その内の１つが
蛋白質コーディング全領域を含んでいることが分った。

その結果をｆｆ１３図に示した。

第３図から分るように、本発明の遺伝子は２１２個のア
ミノ酸をコードしており、４つのＧＴＰ結合領域を有し
ている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＹＰＴ−１様遺伝子のコードするア
ミノ酸配列を示す図面である。但し、図中でＡはアラニ
ン、Ｒはフルギニン、Ｎは７スバラギン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｃはシスティン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタ
ミン酸、Ｇはグリシン、■１はヒスチジン、■はインロ
イシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、Ｍはメチオニン、
Ｆはフェニルアラニン、Ｐはブａリン、Ｓはセリン、Ｔ
はスレオニン、Ｗはトリプト７Ｔン、Ｙはチロシン、■
はバリンのそれぞれのアミノ酸を表わす。第２図は、本発明のＹＰＴ−１様遺伝子のＤＮＡ配列を
示す図面である。＃Ｓ３図は、実施例１で得られたｃＤ　Ｎ　ＡのＤＮＡ
配列を示す図面である。図中、本発明のＹＰＴ−１様遺
伝子のコードするアミノ酸配列を第１図と同様に１文字
表記で塩基配列の対応部分に示した。また、ＧＴＰ結合
領域を下線で示した。第４図は、実施例１の■、で得られたＤＮＡ男因の部分ＤＮＡ配列を示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記アミノ酸配列で表わされる蛋白質をコードす
るヒトＹＰＴ−１様遺伝子。【遺伝子配列があります】（式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラ
ギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグル
タミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチ
ジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン、
Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリン
、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｗはトリプトファン、
Ｙはチロシン、Ｖはバリンのそれぞれのアミノ酸を表わ
す。）
（２）下記ＤＮＡ配列で表わされるヒトＹＰＴ−１様遺
伝子。【遺伝子配列があります】