JPH02101019A - 抗エイズ剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は抗エイズ剤に関する。より詳細には、エイズの
原因因子が感染したＴ４細胞を死滅させ、及び／又は、
Ｔ４細胞から当該因子を排除するという作用機序に基づ
きエイズを治癒し、かつ、原因因子感染者のエイズ発症
を阻止する抗エイズ剤に関する。

［従来の技術］ エイズと略称されている後天性免疫不全症候群は、その
第１例が１９８１年に確認された極めて新しい疾病であ
るが、患者が主として社会の生産年齢層に属し、又、母
子感染を通して次の世代も破壊されるという事実から、
人類全体へのカタストロフィになっている。

エイズの原因因子はレトロウィルスの１種であるヒト免
疫不全ウィルス（以下、１（ＩＶと表す）である。ＨＩ
Ｖ感染の全貌は未だ解明されていないが、エイズの発症
は、ＨＩＶの感染によりＴ４細胞の機能が低下し、この
ため患者の免疫機構に欠陥が生して、多くの感染から自
己を防御できなくなることにある。従って、ＨＩＶ感染
細胞を破壊するか、同感染細胞からＨＩＶを排除しない
かぎり、エイズの根本的な治癒は不可能である。

従来より抗ＨＩＶ側開発の研究はなされており、その成
果として、アジドチミジン（以下、ＡＺＴと表す）やス
ラミンに代表されるＨＩＶ逆転写酵素阻害剤（以下、Ｒ
Ｔ阻害剤と表す）が知られている。これらＲＴ阻害剤は
、レトロウィルスゲノムが生体の染色体ＤＮＡに組み込
まれるのを阻止する働きがあるので、ＨＩＶの感染を予
防する可能性や、ＨＩＶ感染者におけるＨＩＶの広がり
を阻止できる可能性はある。しかし、−旦組み込まれた
ＨＩＶを排除する働きはないので、使用を停止するとＨ
ＩＶが活動を再開して、エイズは進行する。即ち、ＲＴ
阻害剤ではエイズの根本的な治癒や、エイズの発症阻止
は不可能である。

ＨＩＶ感染からエイズ発症までの期間は、典型的には４
年以上であるので、現在報告されているエイズ患者の症
例は、予期されている犠牲者のうちのごく初めの一部に
過ぎない。即ち、有効なエイズ治療剤、エイズ発症阻止
剤が早急に開発されない限り、現在数百万人に達してい
ると推定されるＨＩＶ感染者が極めて絶望的に高い比率
で数年のうちに重症化して死に至り、大恐慌をきたすこ
とは目に見えている。ＨＩＶ感染細胞を特異的に破壊し
、或いは、同感染細胞からＨＩＶを排除することにより
、エイズを根本的に治癒できる薬剤、ＨＩＶ感染者のエ
イズ発症を阻止できる薬剤の開発は世界的な急務である
。

［発明が解決しようとする課題］ このような状況下において、本発明の目的は、エイズを
根本的に治癒するとともに、ＨＩＶ感染者のエイズ発症
をも阻止する、新規な抗エイズ剤を提供することにある
。その作用機序は未だ確定的に解明されたわけではない
が、ＨＩＶ感染細胞を特異的に破壊し、或いは、同感染
細胞からＨＩＶを排除することに基づくものと推定され
る。

［課題を解決するための手段］ 本発明の新規な抗エイズ剤は、ＴＮＦ−α、Ｔ　Ｎ　Ｆ
　ＡＭｌ、Ｔ　Ｎ　Ｆ　Ａｌａ、特定なサイモシンβ４
ＴＮＦ融合蛋白又はそれらの２種以上の混合物を主活性
成分として含む薬剤である。

ＴＮＦ−αは、下記アミノ酸配列Ａで表現される公知ポ
リペプチドである。

アミノ酸配列Ａ： Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒ　　−３ｅｒ
−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−５ｅｒ　　−Ａｓｐ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ　−Ｈｌｓ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｔ−Ａｌａ−Ａｓｎ　　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ　　−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ　　−Ａｓ　　ｎ−Ａｒ　　ｇ−Ａｒ　　ｇ−Ａ
　　ｌ　　ａ−Ａｓ　　ｎ　−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ａｌａ−Ａｓｎ　　−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｒｇ　−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｔ　　−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　　
−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−＋　　１　　ｅ−Ｔｙｒ　
　−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　　−Ｌ
ｙｓ−Ｇ　　Ｉ　　ｙ−Ｇ　　Ｉ’ｎ−Ｇ　　Ｉ　　ｙ
−Ｃｙｓ　　−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａ
ｔ　　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−）Ｔｉｓ−Ｔｈｒ　
　−１１ｅ−３ｅｒ−Ａｒｇ−１１ｅ−Ａｌａ　−Ｖａ
ｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ　　−Ｌｙｓ−Ｖ
ａ！−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　　−５ｅｒ−Ａｌａ−
１１ｅ−Ｌｙｓ−９ｅｒ　　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ
−Ａｒｇ−Ｇｌｕ　　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ　　−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｒｐＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ　　−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ　　−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ−Ａｒｇ−
Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ　−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−
Ａｒｇ−Ｐｒｏ　　−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｐｈｅ　　−Ａｌａ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｎ　　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ　　
−１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ ＴＮＦＡＭ１、Ｔ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２　は、次のアミノ酸
配列Ｂで表現されるポリペプチドである。

アミノ酸配列Ｂ： Ｍｅｔ−Ｖａｔ−Ａｒｇ−３ｅｒ−ｘ　−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ　−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ　−Ｈｌｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ　　−Ａ
ｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ　　−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ　　−Ｇｌｙ　−Ｖａ
ｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ　−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　　−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ　　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−
Ｔｙｒ　　−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
　　−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　　−
Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ　　−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ　　−１１ｅ−５ｅ
ｒ−Ａｒｇ−＋　　１ｅ−Ａｌａ　　−Ｖａｌ−３ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ　　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　　−３ｅｒ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌ
ｙｓ−５ｅｒ　　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−
Ｇｌｕ　　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
　　−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ　　−
Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ’−Ｔｙｒ　　−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ　　−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ　−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ　−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ　　−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ　−Ａｌａ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　
　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ　−１１
ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ （ｘ＝Ｓｅｔ　　の場合がＴ　Ｎ　ＦＡＭＩＳＸ　＝　
ＣｙＳの場合がＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭＩ！　に該当する）上
記アミノ酸配列Ｂにおいて、先頭から１９番目のアミノ
酸であるＡｌａから、最後のＬｅｕまでは、前記ＴＮＦ
−αの第４エクソン部分の塩基配列の先頭にグアニン（
Ｇ）を付加すると構成されるアミノ酸配列と同一である
。従って、本明細書の他の部分における記載においては
、上記Ａｌａ−Ｌｅｕ部分は、ｒＴＮＦ−ａの第４エク
ソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配
列に対応するアミノ酸配列」と表す。

本発明で使用できる特定なサイモシンβ４ＴＮＦ融合蛋
白は、次のアミノ酸配列Ｃで表される。

アミノ酸配列Ｃ： ５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ　−Ｍｅ　ｔ
−Ａｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｕ　−１１ｅ−Ｇ　Ｉ　ｕＬｙｓ
−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−３ｅｒ　−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈ　　ｒ　−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｒｏ−３ｅｒＬｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｔ　Ｉｅ−Ｇｌ
ｕＧｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−ＧＩｎ−Ａｌａ　−Ｇｌｙ
−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ　−ｘ−（ＴＮＦ−
αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結し
た形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） （式中、Ｘは次のアミノ酸配列のいずれかを表す。

１）Ｖａｔ−Ａｒｇ−５ｅｒ−３ｅｒ　−Ｔｈｒ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ　− ５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｔ　−Ｖａｌ： ２）Ｖａ　　ｌ−Ａｒ　　ｇ−５ｅ　　ｒ−Ｃｙｓ　　
−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒ。

Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ　− Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ Ｖａｌ　　。　） 上記アミノ酸配列Ｃにおいて、最初の４３個のアミノ酸
配列は、免疫能を回復させると報告されている胸腺ホル
モンであるサイモシンの１種であるサイモシンβ４　（
以下、Ｔｈβ４と表す）のアミノ酸配列に該当する（「
現代化学４１９８５年１２月号３４〜３８頁）。

本明細書の他の部分における記載においては、上記アミ
ノ酸配列Ｃにおいて、配列中のＸカ月）である場合に該
当する融合蛋白をＴｈβ４−ＡＭ１、Ｘが２）である場
合に該当する融合蛋白をＴｈβ４ＡＭ２と表す。

常法により、対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
をそれぞれ適当なベクターＤＮＡに組み込み、得られた
ｒＤＮＡを用いて、動物細胞、酵母、枯草菌、大腸菌等
の微生物等の宿主を形質転換し、発現を誘導することに
より、生産てきる。

Ｔ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ１、Ｔ　Ｎ　Ｆ　＊、ｅのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡをベクターＤＮＡに発現可能に組
み込むには、よく知られているように、プロモーター配
列（通常オペレータ配列の下流に存在している〉とその
下流にシャイン・ダルガルノ配列（以下、ＳＤ配列と記
す）を有するベクターＤＮＡのＳＤ配列の下流にそれら
ＤＮＡを組み込むか、ベクターＤＮＡにそれらＤＮＡを
組み込んだ後に、その上流にプロモータ配列（通常オペ
レータ配列も）及びＳＤ配列を挿入すればよい。

ｒＤＮＡ技術により外来遺伝子の遺伝情報を微生物細胞
内で発現させる方法は、「遺伝子組換え実用化技術（４
）Ｊ　　（１９８３年）（サイエンスフォーラム社）、
「モレキュラー　クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ）　Ｊ　　（１９８２年）［コールドス
プリング　ハーバ−ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ）　］、「組換え遺伝子の細
胞への導入と発現Ｊ　　（１９８３年）（共立出版株式
会社）等に記載されている。

大腸菌を宿主として用いた場合の例を参考例に示す。

又、酵母を宿主として用いる時は、以下のようにする。

アルコール脱水素酵素（ＡＤＨＩ）のプロモーターを挿
入したプラスミドベクターｐＭＡ５８［ネイチャー　（
Ｎａｔｕｒｅ）　１ＬｆＬ、３４７〜３５０頁（１９８
２年）］は、プロモーター下流にＥｃｏＲ１部位を有し
ているため、ＴＮＦＡＭ１、Ｔ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡを、例えば、参考例に記載
しである組換え体よりＢａｍＨＩ−Ｐｓｔｌ断片として
回収し、ｐＭＡ５６のＡＤＨＩプロモーター下流のＥｃ
ｏＲＩ部位にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩリンカ− Ｐｓｔｌ／ＥｃｏＲＩリンカ−を用いて挿入すれば、Ａ
ＤＨＩプロモーターの支配になり、当該ＤＮＡの遺伝情
報は発現可能となる。

又、抑制酸性フォスファターゼ（ＰＨ０５）ブロモータ
ーを有するｐＡＭ８２［プロシーディング　オブ　ナシ
ョナル　アカデミ−サイエンスオブ　ニーニスニー（Ｐ
ｒｏｃｉ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ＳｃＵ、　Ｓ、　
Ａ、　）ＪＬ！ｌ、１〜５頁（１９８３年）］は、ＰＨ
０５プロモーター下流にＸｈｏＩ部位を有するため、Ｔ
ＮＦＡＭ１、Ｔ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡをそれぞれ、例えば、参考例に記載しであ
る絹換え体よりＢａｍＨＩ−Ｐｓｔ■断片として回収し
、ｐＡＭ８２のＰＨ０５プロモーター下流のＸｈｏＩ部
位にＢ　ａｍＨＩ　／Ｘｈｏｌリンカー１Ｐｓ　ｔ　Ｉ
／Ｘｈｏ　Ｉリンカ−を用いて挿入すればＰＨ０５プロ
モーターの支配になり、その遺伝情報は酵母で発現可能
となる。

又、枯草菌を宿主として用いても、以下のようにして、
Ｔ　Ｎ　ＦＡＭＩＳＴ　Ｎ　ＦＡＭ２のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡの遺伝情報を発現させることができる
。

バチルス　サブチリス　マーパース（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｓ）株の有するα−ア
ミラーゼプロモーターを有するｐＴＵ８２８５　［ジー
ン（Ｇｅｎｅ）　、１土、１４８頁（１９８５年）］は
、プロモーター、及びシグナルペプチドの下流にＨｉｎ
ｃ１１部位を有しているため、Ｔ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ１、Ｔ
　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを
それぞれ、例えば、参考例に記載されている組換え体よ
りＢａｍＨＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片として回収し、ｐＴＵ
Ｂ２８５の）［ｊｎｃｌ１部にシグナルペプチドのアミ
ノ酸フレームと合うようなＨｉｎｃ１１／ＢａｍＨＩリ
ンカ−Ｈｉｎｃｌｌ／Ｐｓｔｌリンカ−を用いて挿入し
てやれば、α−アミラーゼプロモーターの支配をうけ、
枯草菌でも発現可能となる。

まず、形質転換された宿主細胞を遠心分離などによって
集め、超音波或いはリゾチームなどで破砕する。このと
き低張液を用いるが、ＳＤＳなどの界面活性剤や塩酸グ
アニジンなどの蛋白変性剤を共存させたほうが良い結果
が得られる場合もある。

細胞破砕液を遠心分離に付して上清液を得る。

このようにして得られるＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＮＩ　（又はＴ
ＮＦＡＭｐ）含有破砕上清液を通常の蛋白質精製法に準
じて精製する。

即ち、塩基性陰イオン交換体によるイオン交換クロマト
グラフィー、塩析法、透析法、ゲル濾過法、疎水クロマ
トグラフィー、高速分子篩クロマトグラフィー、電気泳
動法等を順次又は適宜組み合わせることによって精製で
きる。

例えば、塩基性陰イオン交換体としてはＤＥＡＥ−セフ
ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　　Ａ　−２５、Ａ−
５０ＳＤＥＡＥ−セファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　
）ＣＬ−６８，ＤＥＡＥ−セファミル（Ｓｅｐｈａｍ　
ｉ　Ｉ　）（以上、ファルマシア社製）が好ましく、そ
の他、ジエチルアミノ基、アミノエチル基又は四級化ア
ミノエチル基含有陰イオン交換体も使用できる。

使用される緩衝液としては、ｐＨ６，０〜９．０のトリ
ス−ＨＣｆｆｌ又はリン酸緩衝液が望ましく、これらの
０．０５Ｍ程度の希薄な緩衝液でポリペプチドの培養液
を希釈し、塩濃度０．１Ｍ以下の溶液として陰イオン交
換体と接触させてＴＮＦ＊ｘ＋（又はＴ　Ｎ　Ｆ　＊ｘ
ｅ　）を吸着させる。

ＴＮＦＡＭＩ（又はＴＮＦＡＭ２）の溶出は０．１〜０
．２ＭのＮａＣｆｆ１又はＫＣｆｆｉ等の塩類溶液で行
う。０．２Ｍ付近の塩濃度で溶出される。陰イオン交換
体との接触はカラム法が望ましいが、大量の場合はバッ
チ法も採用できる。

陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、前処理と
して限外濾過膜で低分子物質を除去することが望ましく
、精製効果を上げることが出来る。

陰イオン交換クロマトグラフィーで得られた溶液は透析
後、濃縮してゲル濾過に付す。ゲル濾適用の坦体として
は、セファデックスＧ−７５、Ｇ−１００（ファルマシ
ア社製）、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　）　Ｓ
　−２００（ファルマシア社製）、バイオゲル（Ｂｉｏ
ｇｅｌ）　Ｐ　−１００（バイオラット社製）及びトー
ヨーパールＨＷ−５０、ＨＷ−５５（東洋曹達工業社製
）等を使用する。

ゲル濾過に使用する緩衝液はｐＨ６，０〜９．０のトリ
ス−ＨＣｌまたはリン酸緩衝液である。吸着防止のため
、０．２〜０．５ＭのＮａＣｆ１等の塩類を添加して使
用することが望ましい。

又、陰イオン交換クロマトグラフィーで得られたＴＮＦ
ＡＭ１（又はＴＮＦＡＭ２）溶液は、疏水クロマトグラ
フィーで精製することもできる。この場合はブチルート
−ヨーバール６５０（東洋曹達工業社製）等を坦体とし
、硫安、ＮａＣ１等の塩類を用いてＴＮＦＡＭＩ（又は
ＴＮＦＡＩＩ）を溶出させる。

ゲル濾過或いは疏水クロマトグラフィーで精製したＴＮ
ＦＡＭ１（又はＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭＩ！　）含有液は、次
いでモノ（Ｍｏｎｏ）　Ｑ　　ＨＲ５１５カラム（ファ
ルマシア社製の高性能陰イオン交換体カラム）を使用す
るファルマシアＦ　Ｐ　Ｌ　Ｃ（Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ。

Ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、Ｌｉ
ｑｕｉｄ　　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａ−ｐｈｙ　）シス
テムによる高性能陰イオン交換体クロマトグラフィーに
付して、精製標品を得る。この高性能陰イオン交換体ク
ロマトグラフィーの条件は、最初のＤＥＡＥ−セファロ
ーズ等の坦体を使用する陰イオン交換クロマトグラフィ
ーの場合と同しである。

Ｔｈβ４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、ｘ−（
ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニン
を連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコ
ートするＤＮＡとを、ＡｓｐＰｒｏを連結部として連結
させて得られるｒＤＮＡの発現を、上記（１）に記載し
た方法と同し方法で誘導する。

当該ｒＤＮＡの生産方法としては、次の３つの形態が考
えられるが、そのいずれによってもよい。

ａ）（Ｔｈβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏをコ
ードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソンの
塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に対
応するアミノ酸配列）をコートするＤＮＡを連結する。

ｂ）（Ｔｈβ４のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと
、Ａｓ　ｐ−Ｐｒｏ−ｘ−（ＴＮＦ−ａの第４エクソン
の塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に
対応するアミノ酸配列）をコ一ドするＤＮＡを連結する
。

ｃ）（Ｔｈβ４のアミノ酸配列）をコードするＤＮＡと
、Ａｓｐ−ＰｒｏをコードするＤＮＡと、ｘ−（ＴＮＦ
−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結
した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列）をコート′
するＤＮＡとをその順位で同時に連結する。

ａ〉の場合の一例を説明すると、次の通りである。

悪性化骨髄細胞を生体外分化誘導物質で刺激して単球細
胞に分化する過程で合成されるｍＲＮＡの１種と相補的
なｃＤＮＡであるｐＨＨ５Ｂ　［バイオケミカル　アン
ド　バイオフィジカル　リサーチ　コミュニケーション
ズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ＡｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ）　、　ｖ　ｏ　Ｉ　。

１３２、Ｎｏ、１，１００〜１０９頁（１９８５年）コ
をＰｓｔｌで処理し、得られた約５３０ｂｐのＤＮＡ断
片を回収する。ついで、ＨｉｎｆＩで処理し、約２２０
ｂｐのＰｓｔＩ／ＨｉｎｆＩ断片と約３１０ｂｐのＨｉ
ｎｆｌ／Ｐｓｔｌ断片とを回収する。前者のＰｓ　ｔ　
Ｉ／Ｈ４ｎｆｌ断片をＭｎｆｆ１ｌ（米国ニューイング
ランドバイラボス社製）で切断して１２７ｂｌ）のＭ　
ｎ　Ｌ　Ｉ　／　Ｈｌｎ　ｆ　Ｉ断片を得、これをさき
ほとのＨｉｎｆｌ／Ｐｓｔｌ断片と連結させて、Ｔｈβ
４のアミノ酸配列をコードするＭｎＩＩ／Ｐｓｔｌ断片
を得る。この断片を、プラスミドベクターｐＵｃ５４０
のＭｎ１ｌ／Ｐｓｔｌ断片に連結させて、プラスミドｐ
Ｕｃ５４０Ｔｈβ４（約３．５ｋｂ）を生産する。

ｐＵｃ５４０は、ファルマシア社より市販されているプ
ラスミドベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ／Ｂ　ａｍＨ１
部位に、同じく同社より市販されている、ｔａｃプロモ
ーターを有するプラスミドｐＤＲ５４０のＥｃｏＲＩ／
ＢａｍＨｒ断片をクローニングしたものである。

ついでｐＵｃ５４０Ｔｈβ４から、ＢａｍＨＩリンカ−
との結合を含む処理により、Ｔｈβ４のアミノ酸配列と
、Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭に
グアニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配
列）との連結部となるアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｐｒｏとを
コードするＤＮＡを生産する。

Ｘ−（ＴＮＦ−αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグ
アニンを連結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列
）をコードするＤＮＡは、ヌクレイツク　アシッズ　リ
サーチ［（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）　、
１０，７４３９〜７４４Ｂ頁（１９８１年）コ、バイオ
ケミストリー［（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１７．
１２５７〜１２６７頁（１９７８年）］等に記載されて
いる方法に準拠して、化学的に合成できる。

例えば、特開昭６２−２８２５８７号公報（特願昭６１
−１６９５２２号出願）の実施例２に開示されているｐ
Ｕｃ５４０ＡＭ１　［ｘが前記１）に対応する］或いは
ＡＭ２［ｘが前記２〉に対応する］は、ｘ−（ＴＮＦ−
αの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結し
た形の塩基配列に対応するアミノ酸配列〉をコードする
ＤＮＡ部分がＴａｃプロモーターのＢ　ａｍＨＩ下流に
連結され、ＢａｍＨＩ切断点直後に開始コドンとしての
ＡＴＧを有し、これに続くアミノ酸の第１コドンがＧな
ので、それらをＮｃｏｌ［日本ジーン（株）製］、ムン
グ　ビーン（ＭｕｎｇＢｅａｎ　）ヌクレアーゼ、Ｐｓ
ｔｌで処理することにより目的とするｘ−（ＴＮＦ−α
の第４エクソンの先頭にグアニンを連結した形の塩基配
列に対応するアミノ酸配列）をコードするＤＮＡを得る
ことができる。

−例として、ｐＵｃ５４０ＡＭ１を使用した場合の例を
参考例で詳しく述べる。

上記（２）に記載した方法と同じ方法で分離、精製でき
る。

本発明のＴ　Ｎ　ＦＡＭｌｌＴ　Ｎ　ＦＡＭ２、Ｔｈβ
４ＡＭＩＳＴｈβａ　　Ａ　Ｍ　２の１回の投与量は、
成人に対してＩ　Ｘ　１０６単位（約１　ｍ　ｇに相当
）が標準である。これを１　ｍ　ｌの生理的食塩水に溶
解し、或いは、リポソームに封入して徐放化処理を施し
て、静注等の経路で投与できる。なお、上記投与量は一
応の目安であり、実際には、患者を担当する医師が、患
者の年齢、症状等を勘案して決定することは当然である
。

ＴＮＦＡＭ１のマウスに対するＬＤ５０は、９．５Ｘ１
０’単位／　ｋ　ｇ　（Ｂ　ａ　Ｑ、　ｂ　／　ｃ系統
）２．７Ｘ１０７単位／ｋｇ　（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統）５
．８Ｘ１０’単位／ｌｃｇ（Ｃ５７ＢＬ／６系統）ＴＮ
ＦＡＸ２のマウスに対するＬＤ５０は、２．９Ｘ１０’
単位／ｋｇ　（Ｂａｆｆｉｂ／ｃ系統）２．７Ｘ１０’
単位／ｋｇ　（Ｃ３Ｔ（／Ｈｅ系統）２．７Ｘ１０７単
位／ｋｇ　（Ｃ５７ＢＬ／６系統）であり、ＴＮＦ−α
の値、 １．０Ｘ１０’単位／ｋｇ　（Ｂａｆｂ／ｃ系統）？、
８Ｘ１０６単位／１＜ｇ（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統）１．５Ｘ
１０’単位／ｋｇ　（Ｃ５７ＢＬ／６系統〉に比べて非
常に小さいので、前２種の臨床での有用性は、ＴＮＦ−
αより極めて高い。融合蛋白の値はＴＮＦ−αの値とほ
ぼ同じだった。

以下、実施例等により本発明の詳細な説明する。

なお、各検体の濃度（単位／ｍｌりは、製造メカーであ
る（株）旭化成が表示しているＴＮＦ−αの濃度を指標
とし、Ｌ−９２９細胞［プロシーディング　オブ　ナシ
ョナル　アカデミ−サイエンス　オブ　ニーニスニー　
１．３６６６〜３６７０頁コに対する細胞毒性を基にし
て、次のようにして求めた。

Ｌ９２９細胞を、５％仔牛脂児血清を加えたイーグルミ
ニマムエッセンシャル培地（以下、ＭＥＭ培地と表す）
で育成し、８Ｘ１０’個の細胞が１００μＣの同上培地
に含まれる様にし、９６穴の平底プレートで育種する。

育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ２，１００％Ｈ２
０てあり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。そ
の後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１μｇ　／
　ｍ　Ｅとなるように加え、培養液の液量を１５０４１
！とする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈した
ものを５０μを加える（この際稀釈率を適宜調製し、Ｅ
Ｄ５０　を求める事ができる）。

更に、最終液量２００μｙとなったＬ９２９細胞を上記
条件で１８時間培養する。

細胞壊死活性を測定するには、まず全培地を除去し、つ
いて０．２％クリスタルバイオレットを含む２％メチル
アルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイ
オレットは全有核細胞を染色し、細胞壊死を生した結果
プレート底面より遊離した細胞は染色しないので、細胞
壊死活性を直接測定できる。この染色度をＯＤ５．ｏｎ
ｍでの吸収で測定し、対照群に対する染色度と比較する
事で細胞壊死活性を測定する。活性の定義は次の様に行
う。

Ｌ９２９細胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を
求める。対照としてウサギＴＮＳを使用し、このウサギ
ＴＮＳの活性ｎ（単位／　ｍ　Ｌ　）を２．４Ｘ１０’
単位／ｍｇ／ｍｅのＴＮＦ−ａを用いて決定する。この
ウサギＴＮＳのＥＤ５０　を与える稀釈率（Ｃ）を求め
る。

検体の活性（単位／　ｍ　１．　）は−×ｎて計算する
。

参考例１ １）ヒト急性単球性白血病細胞ＴＨＰ−１から精製され
た抗腫瘍性ポリペプチドのゲノム遺伝子（特開昭６２−
２８２５８７号公報）をＸｈｏｌ。

Ｐｓｔｌて切断し、第１図に示すＸｈｏｌ／Ｐｓｔ［断
片を回収した。次にこの断片を、Ｔ　ａ　ｃプロモータ
ー及びＳＤ配列を有するブラスミトヘクターｐ　Ｕ　Ｃ
５４０の５ａｆｆｉ　Ｉ／Ｐｓ　ｔ　１部位に挿入して
、プラスミドｐＵｃ５４０１Ｎ’″ｘ／ｐを調製した。

２）別途、第１図に示すＸｈｏｌ／Ｐｓｔｌ断片をＨｉ
ｎｃｌｌて切断し、２９４塩基対のＸｂｏ１／Ｈｉｎｃ
ｌｌ断片と、５２１塩基対のＨｉｎｃＩＩ／Ｐｓｔｌ断
片を回収し、２９４塩基対の該断片をＤｄｅ［で部分分
解して２０６塩基対のＤｄｅ　Ｉ／Ｈｉｎｃ　Ｉ　Ｉ断
片を回収した。

この様にして回収した５２１塩基対の Ｈ４ｎｃｌｌ／ＰｓｔＴ断片、２０６塩基対のＤｄｅｌ
／Ｈｉｎｃｌｌ断片を、ＡＢ１社（米国）の３８０Ａ型
ＤＮＡシンセサイザーで合成した、第１表に示す７２／
７３塩基対の２本鎖ＤＮＡと結合させた後に、ｐＵｃ５
４０ＴＮＦｘ／ｐのＢａｍＨＩ／Ｐｓ　ｔ　Ｉ部位に挿
入してｐＵＣ５４０ＴＮＦＡＭＩを生成した。

第　　　　１　　　　表 ７２／７３　　塩基対 ３）　ｐＵＣ５４０１ＮＦＡＭＩ　（１００μｇ）に１
２０単位のＮｃｏｌを加え、３７℃で一晩培養した。寒
天ゲル電気泳動で完全消化を確認後、フェノール抽出、
クロロホルム抽出を行い、セファデックスＧ５０カラム
でＤＮＡを精製した。

４）９０単位のムング　ビーン　ヌクレアーゼを加えて
３７℃で１０分間経過させた。次いて、７０℃で５分間
の加熱処理を行って、該ヌクレアゼを失活させた。

５）１６０単位のＰｓｔｌを加えて３７℃で一晩培養し
た。次いて、５％アクリルアミドゲルで、７７０塩基対
のＤＮＡ（約１μｇ）を回収した。

６）このＤＮＡを有する大腸菌ＪＭ１０３を、アンピシ
リン５０μｇ　／　ｍ　Ｕを含むＩ　ＸＹＴ培地（バ・
クトトリブトン　０．８％、バクトイ−ストエキス　０
．５％、ＮａＣ１Ｏ，５％）で３７℃で継代培養した後
、アンピシリン５０μｇ／　ｍ　１．を含むＩ　ＸＹＴ
培地１００ｍ１を含む５００　ｍ　Ｌ坂ロフラスコに１
％植菌し、同様に３７℃で培養し、０Ｄ６ａｏ　”０．
３に達した時にイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシトを最終濃度０．７ｍＭになるように添加し、更に
２４時間培養を続けた。大腸菌を遠心分離により集め、
ＩＸＰＢＳ　（ＮａＣｆｆｉ　　ｏ、８％、ＫＣＩ　　
０゜０２％、ＫＨａＰＯ４０，０２％、Ｎ　ａａＨＰ　
０４０．１１５％）で洗浄後、再び１０ｍｆｆ１のＩＸ
ＰＢＳに懸濁し、超音波で大腸菌を破砕した。次いて、
通常の蛋白質精製法により、当該ＤＮＡにより発現され
たポリペプチドを分離、精製した。このポリペボチドの
アミノ酸配列は次の通りであり、その分子量は１７５０
０±５００　（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
であった。

Ｖａｌ−Ａｒｇ−５ｅｒ−５ｅｒ−ＴｈｒＡｒｇ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−ＡｒｇＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ａｌａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−（ＴＮＦ−ａの
第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形
の塩基配列に対応するアミノ酸配列） 参考例２ 参考例１中の第１表に示された合成りＮＡの先頭から５
番目のアミノ酸であるＳｅｒをＣｙｓに代え、参考例１
の１）〜５）と同じ手順で得られたＤＮＡを有する大腸
菌ＪＭ１０３を、参考例１の６）と同し手順で処理して
、当該ＤＮＡにより発現されたＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２を分
離、精製した。このポリペボチドのアミノ酸配列は次の
通りであり、その分子量は１７５００±５００　（ＳＤ
Ｓポリアクリルアミド電気泳動法）であった。

Ｖａｌ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−（ＴＮ
Ｆ−ａの第４エクソンの塩基配列の先頭にグアニンを連
結した形の塩基配列に対応するアミノ酸配列） １）ｐＨＨ５Ｂ　（１００μｇ）を２５０単位のＰｓｔ
ｌて消化しく３７℃）、１．２％アガロースゲルで、５
３０塩基対からなるＰｓｔｌ／ＰｓｔＩ断片を分離した
。ゲルからこのＤＮＡを抽出し、ハイトロキシルアパタ
イトカラムで精製して、２．７μｇのＤＮＡを回収した
。

２）ついてこのＤＮＡを１２単位のＨｉｎｆｌで消化し
、８％アクリルアミドゲルで、２２０の塩基対からなる
５°Ｐｓｔｌ／Ｈｉｎｆｌ”　断片と、３１０塩基対か
らなる５°Ｈ４ｎｆｌ／Ｐｓｔｌ’°断片とを別々に回
収した。

なお、この回収は、ゲルから両断片を抽出後、ＤＥＡＥ
セルロースカラムを用いる通常の方法により実施した。

両断片の回収量は、紫外線吸収（ＯＤ２６０ｎｍ）での
検出が不可能と考え、回収率を１００％として、以下の
計算式により推定した。

Ｐｓｔｌ／Ｈｉｎｆｌ断片の回収量 Ｈｉｎｆｌ／Ｐｓｔｌ断片の回収量 ３）Ｐｓｔ　Ｉ／Ｈｉｎｆ　Ｉ断片を８単位のＭｎｆｆ
１Ｉで消化し、８％アクリルアミドゲルで、１２７塩基
対からなるＭｎｆｆ１ｌ／Ｈｉｎｆｌ断片を分離、回収
した。（回収量は約１００〜１５０ｎｇ）・ ４）２６ｎｇのＭｎ１ｌ／ＨｉｎｆＩ断片と、６５　ｎ
　ｇのＨｉｎｆｌ／Ｐｓｔｌ断片を混ぜ、８７単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃で１時間反応させた。

ついて、７０℃、５分の処理によって酵素を失活させた
後、１５単位のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間培養し
て約９０ｎｇのＤ　Ｎ　Ａを得た。

５）上記４）で得られたＤＮＡを、１００ｍＭのＮａＣ
Ｑの存在下、エタノール（終濃度７０％）中てｐＵｃ５
４０のＢａｍＨＩ／Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ断片（２６ｎｇ）と
混した。沈澱物を回収し、５μｔの蒸留水に溶かし、約
０．５μｔになる迄凍結乾燥して、エタノールと蒸留水
を除去した。ついで、１０×リガ一ゼ反応緩衝液［１０
ｍＭのＡＴＰ＋６６０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７，６
）＋６６ｍＭの塩化マグネシウム＋５０ｍＭのジチオス
レイトール］を０．４μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを３５
単位加えて、４℃で一晩培養して、約３．５ｋ　ｂのｐ
Ｕｃ５４０Ｔｈβ４を得た。

６）ｉｏｏｕｇのｐＵｃ５４０Ｔｈβ４を１９０単位の
Ｈｉｎｆｌにより、３７℃で−晩消化させ、そのうちの
５０μｇを、８０μＭのデオキシＡＴＰと８０μＭのデ
オキシＴＴＰの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノ
ウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（４０単位）と混し、室温で３
０分間培養した。

７）７０℃、５分間の加熱処理で上記フレノウ断片を失
活させた後、１２０単位のＢ　ａｍＨＩを加えて３７℃
で３時間培養した。

８）８％アクリルゲルを使い、ＢａｍＨ１部位、Ｈｉｎ
ｆＴ部位をＡ及びＴで修復して平滑末端として、ＤＥＡ
Ｅセルロースカラムを使い、約４５０ｎｇの１３５ｂｐ
のＤＮＡを分離、回収した。

９）上記８）で得られたＤＮＡの２７ｎｇと、１．６ｎ
ｇのＢａｍＨＩリンカ−とを、８７単位の７４ＤＮＡリ
ガーゼの存在下で合わせて、４℃で一晩培養して、（Ｔ
ｈβ４のアミノ酸配列）−Ａｓｐ−Ｐｒｏ　　をコード
するＤＮＡを生産した。

１０）このＤＮＡ　（２Ｂ、６ｎｇ）と、参考例１の１
）〜５）の手順で得られたＤＮＡ（１５７ｎｇ）を、８
７単位のＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、４℃で一晩培養
した。次いて、７０℃で１０分間の加熱処理により該リ
ガーゼを失活させた。

１１）０．８単位のＰｓｔｌを加え、３７℃で１２時間
培養した後、７０℃で１０分間の加熱処理によりＰｓｔ
ｌを失活させた。次いて、ブラスミトヘクターｐＵｃ５
４０のＢ　ａｍＨＩ　／ＰｓｔＩ断片（７６μｇ）と混
ぜ、９０単位のＴ４ＤＮＡリガーセの存在下、４℃で一
晩培養して、プラスミドｐＵｃ５４０　（Ｔｈβ４−Ａ
ＭＩ）を生成した。

１２）上記１１）で生成したプラスミドを有する大腸菌
（ＤＨ−１）を、アンピシリン（５０μｇ／ｍ　Ｑ　）
とカナマイシン（１０μｇ／ｍｘ）を含む１０ｍ１ｊの
ＮＺＹ培地［５ｇのＮａＣ１４，２ｇのＭｇＣ１！２争
７Ｈ２０、ｌｏｇのＮＺアミンＡ（株式会社和光純薬製
）、５ｇのイーストエキスを混合し、蒸留水で全量をｌ
ｌとした培地コで３７°Ｃて一晩、振どう培養した。こ
の培養液の１０ｍ１ｊを、アンピシリン（５０μｇ　／
　ｍ　Ｑ　）とカナマイシン（１０μｇ　／　ｍ　Ｑ　
）を含む１００ｍｆｆ１のＮＺＹ培地に加え、３７℃で
６時間振どう培養した。

次いて、この培養液の全量（約１００ｍｔ）を、０．７
ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、アン
ピシリン（５０μｇ／ｍ９．）、カナマイシン（１０μ
ｇ／ｍｌりを含む１ｉのＮＺＹ培地に加えて、３７℃で
一晩振どう培養した。

＋３）このようにして得られた大腸菌を遠心分離（５０
００ｒｐｍ、１０分）に付し、沈澱を１００ｍｆｆ１の
ＰＢＳ　（−）にッスイ社製）に懸濁した。この懸ｉＷ
液を遠心分離（５０００ｒｐｍ。

１０分）に付して菌体を集め、１ｍＭのフェニルメチル
スルホニルフルオライド（蛋白分解酵素阻害剤）に懸濁
した。得られた菌体浮遊液を１０ｍ１４ずつ超音波に付
して［ブランソン　ソニファイア（Ｂｒａｎｓｏｎ　５
ｏｎｉｆｉｅｒ）の目盛り４０て６分間を３回）、大腸
菌を破壊した。

＋４）　１００００　ｒ　ｐｍ、１時間の遠心操作に付
して上清を回収した。

１５）上記上清の硫安画分（６０％飽和）を分取した。

この両分を１０００Ｏｒ　ｐｍ、３０分の遠心処理に付
して沈澱を得、この沈澱を５　ｍ　ｌのＰＢＳ（−）に
溶かし、５ｔの１０ｍＭ）リスＨＣＩ！　（ｐＨ７，４
）＋１０ｍＭＮａＣｅに対して透析した。次いて、１３
０００ｒｐｍで一晩遠心処理に付して不溶物を除いて、
上清を回収した。

１６）この上清をファルマシア社製のモノＱＦＰＬＣカ
ラムクロマトグラフィーに付した。流速は２．０ｍ９．
７分とし、ＮａＣ１濃度を０．ＯＩＭからＩＭまで直線
的に上げる段階的溶出法により各２０ｍＥの画分を集め
た。溶出パターンを第２図に示す。

第２図において、横軸に沿った連続番号はそれぞれの画
分を表し、曲線は蛋白の溶出量を表し、直線は溶出液の
塩濃度（０，ＯＩＭ〜ＩＭ）を表している。

１７）Ｔｈβ４−ＡＭＩの構造をした蛋白を多量に含む
活性画分（２３〜２７）を集め、再度モノＱカラムにか
けて、はぼ単一ビーク（精製度〉９５％）を持つ画分（
７，５ｍｆｆ１）を分取した。

溶出パターンを第３図に示す。

第３図において、横軸に沿った連続番号、曲線、直線が
表すものは第２図におけると同じである。

上記画分をファルマシア　スペローズ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ）　１２カラ
ム（ゲル濾過）に付して分子量を調べたら６７０００ダ
ルトン以上であり、３量体ないし４量体の構造をとって
いるものと推定された。又、ＳＤＳ電気泳動法によると
、２２０００ダルトンであった。

１Ｂ）上記１）〜１７）に記載したと全く同様な方法で
、但し、１０）で使用した「参考例１のｌ）〜５）の手
順で得られたＤＮＡＪを、「参考例２で得られたＤＮＡ
Ｊに代えて、Ｔｈβａ　−Ａ　Ｍ　２を生成した。その
生成は、得られた融合蛋白の遺伝子の塩基配列をマクサ
ム・ギルバート法で調べ、Ｔｈβ４一連結部のアミノ酸
配列の末端から１゜番目に位置し、Ｔｈβ４−　Ａ　Ｍ
　２に固有なアミノ酸Ａｒｇに対応するＣＧＴ迄の塩基
配列を調べることにより確認した。

実施例１ １　Ｘ　１０６単位（約１　ｍ　ｇ　）のＴＮＦ−ａ、
Ｔ　Ｎ　ＦＡＩＩｌ、　Ｔ　Ｎ　ＦＡＮｅ、　Ｔ　ｈβ
−ＡＭｌまたはＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物を
１　ｍ　ｌの生理的食塩水に溶解して、静注液を調製し
た。

実施例２ １　Ｘ　１０６単位（約１　ｍ　ｇ　）のＴＮＦ−ａ、
Ｔ　Ｎ　ＦＡＭｌ、　Ｔ　Ｎ　ＦＡ）１２．　Ｔ　ｈβ
〜ＡＭＩまたはＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物を
リポソームに分散封入して、徐放剤を調製した。

実施例３ Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｊ１位（約１　ｍ　ｇ　）のＴＮＦ−
ａ、Ｔ　Ｎ　ＦＡＭｌ、　Ｔ　Ｎ　ＦＡＮｅ、　Ｔ　ｈ
β−ＡＭＩまたはＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物
を１　ｍ　ｌの生理的食塩水に溶解して、３ＸＩＱ６単
位のγ−ＩＮＦと同時に投与した。

実施例４ １　Ｘ　１０”単位（約１　ｍ　ｇ　）のＴＮＦ−ａ、
Ｔ　Ｎ　Ｐ＊ｘ＋、　Ｔ　Ｎ　ＦＡｘａ、　Ｔ　ｈβ−
ＡＭＩまたはＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物をリ
ポソームに分散封入し、３ＸＩＱ６単位のｒ−ＩＮＦと
共に投与した。

実施例５ １　Ｘ　１０’単位（約１ｍｇ）のＴＮＦ−ａ、Ｔ　Ｎ
　ＦＡＭＬ、　Ｔ　Ｎ　ＦＡｘａ、Ｔ　ｈβ−ＡＭＩま
たはＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物を１　ｍ　９
．の生理的食塩水に溶解して、ＡＺＴと共に投与した。

実施例６ １　Ｘ　１０６単位（約１　ｍ　ｇ　）のＴＮＦ−ａ、
Ｔ　Ｎ　ＦＡＮ１、　Ｔ　Ｎ　ＦＡｍｅ、　Ｔ　ｈβ−
ＡＭＩまたはＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物をリ
ポソームに分散封入し、ＡＺＴと共に投与した。

実施例７ １　Ｘ　１０’単位（約１ｍｇ＞のＴＮＦ−ａ、Ｔ　Ｎ
　ＦＡＭ１、Ｔ　Ｎ　ＦＡＮｅ、Ｔ　ｈβ−ＡＭＩまた
はＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物を１　ｍ　ｌ−
の生理的食塩水に溶解して、３×１０６単位のγ−ＩＮ
Ｆ及びＡＺＴと共に投与した。

実施例日 １　Ｘ　１０６単位（約１　ｍ　ｇ　）のＴＮＦ−ａ、
Ｔ　Ｎ　ＦＡＩＬ、　Ｔ　Ｎ　ＦＡＭＩ！、　Ｔ　ｈβ
−ＡＭＩまたはＴｈβ−ＡＭ２またはそれらの混合物を
リポソームに分散封入し、ＡＺＴと共に投与した。

ヒトＴ細胞白血病ウィルスタイプＩに陽性のＴ細胞系の
ＭＯＬＴ−４細胞［ジェイ、ナトゥル。

キャンサー　インストゥ、　　（Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃ
ａｎｃｅｒＩｎｓｔ、）　４９．８９１　（１９７２年
）に記載の、ミノワダ　ジエイ、（Ｍｉｎｏｗａｄａ　
　Ｊ、）等著、”ロゼツト　フォーミング　ヒューマン
リンフォイド　セル　ラインズ　■、　イスタブリッシ
ュメント　アンドウ　エヴイデンス　フォオリジン　オ
ブ　サマスーディライヴドゥリンフォサイッ（Ｒｏｓｅ
ｔｔｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　Ｉｙｍｐｈ。

ｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　１．　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ
ｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒ　ｏｒｉｇ
ｉｎ　ｏｆ　ｔｈｕｍｕｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｉｙｍｐ
ｈｏｃｙｔｅｓ）　］にＨＩＶ−１を０．００２の多重
度で感染させた。

９０％以上がＨＩＶ抗原に対して陽性であった。

（以下、コ（Ｄ　ｇ　染細胞をＭＯＬＴ−４／ＨＩＶ細
胞と表す。） この細胞を、１０％牛脂児血清、ペニシリン（１００１
Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ
）が補充されたＰＲＭＩ−１６４０にッスイ社製）（３
７℃）中に維持して、４日間継代培養した。ついて、初
期細胞数ｌＸｌ０’／ｍｉを０．１０−’　　１０又は
１０３ｎ　ｇ／　ｍ　１．の検体で処理し、その１．２
．３．４日後にメチレンブルー染色法に基づき細胞生存
率を計算し、第２〜４表に示す結果を得た。表中の値は
、細胞数（Ｘ　１０’／ｍ　Ｑ　）を表し、（）の中の
値は細胞生存率を表す。なお、投与直後の生存率はとも
に９６％であった 第４図は、第４表の結果をグラフ化したものである。

第２〜４表に示された結果から明らかな通り、１０ｎｇ
／ｍ９．ないし１０’ｎ　ｇ／ｍｌのＴＮＦ−α、ＴＮ
ＦＡＭＩ又はＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２の投与により、ＭＯＬ
Ｔ−４／ＨＩ　Ｖ細胞の生存率は驚異的に低下し、その
低下度はほぼ同一であった。

実験例１と同様にして、但し、検体濃度をＯｌｌ、１０
．１０２ｎ　ｇ／ｍ　ｆｌに変え、ＭＯＬＴ−４細胞、
Ｊｕｒｋａｔ細胞［イントウ、　ジエイ。

キャンサー（Ｉｎｔ、　　Ｊ、　　Ｃａｎｃｅｒ）。

１９．６２１　（１９７７年）に記載の、シュナイダー
　ニー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　　Ｕ、）等著、キャラク
タライゼイション　オブ　イービーヴイーーゲノム　ネ
ガテイヴヌル”　アンド”ティー　　セル　ライン１　
デイライヴドフロム　チルトレン　ウィズ　アキュート
リンフォプラスチック　ロイケミア　アンド０イケミツ
ク　トランスフォームド　ノン−ホジキン　リンフオー
マ（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆＥＢＶ
−ｇｅｎｏｍｅ　　ｎｅｇａｔｉｖｅ　　”ｎｕｌｌ”
　ａｎｄ　　”Ｔ”　　ｃｅｌｌｎｅｓ　　ｄｅｒｉｖ
ｅｄ　　ｆｒｏｍ　　ｃｈｉｌｄｒｅｎ　　ｗｉｔｈ　
　ａｃｕｔｅｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ　　ｌｅｕｋｅ
ｍｉａ　　ａｎｄ　　Ｉｅｕｋｅｍ＋ｃｔｒａｎｓｆｏ
ｒｍｅｄ　　ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ　　ｌｙｍｐｈｏ
ｍａ）　］に対し、ＨＩＶを感染させた場合と感染させ
ない場合とに分けてのＴｈβ４　ＡＭ１、Ｔｈβ４−Ａ
Ｍ２の効果を、細胞生存率を指標として第５〜８表に示
す。

（投与直後の生存率は９８％であった）（投与直後の生
存率は９８％であった）（投与直後の生存率は９６％で
あった）第５〜６表の結果を第５〜６図にグラフ化した
。

Ｔｈβ４−ＡＭ１、Ｔｈβ４−ＡＭ２はともに、１０ｎ
ｇないし１０２ｎ　ｇ／ｍｆｆ１の量でＨＴＶ感染細胞
の生存率を驚異的に低下させ、その低下度はほぼ同一で
あった。

実験例３ 実験例１を、条件を次の通りに変えて実施した。

すなわち、検体濃度を０．１０−’　　１．１０、１１
０２ｎ／ｍｆｆ１に変え、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞［キャ
ンサー（Ｃａｎｃｅｒ）、１Ｂ、５２２頁（１９６５年
）に記載の、フォーレイ　ジーイー、（Ｆｏｒｌｅｙ、
　　Ｇ、Ｅ、）等著、コンティニュアス　カルチャ　オ
ブ　ヒューマンリンフォプラスツ　フロム　ペリフェラ
ルブラッド　オブ　ア　チャイルド　ウィズ　アキュー
ト　ロイケミア　（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　　ｃｕｌｔ
ｕｒｅ　　ｏｆｈｕｍａｎ　　Ｉｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ
ｓ　　ｆｒｏｎ＋　　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　　ｂｌｏ
ｏｄｏｆ　　ａ　　ｃｈｉｌｄ　　ｗｉｔｈ　　ａｃｕ
ｔｅ　　ｌｅｕｋｅｍｉａ）　］、Ｈ９細胞［サイエン
ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２４．４９７　（１９８４年
）に記載の、ボボヴイック　エム（Ｐｏｐｏｖｉｃ　　
Ｍ、）等著、デイテクション、アイソレイション、アン
ド　コンティニュアス　プロダクション　オブ　サイド
パシック　レトロウイルシズ　（ＨＴＬＶ−１１１フロ
ム　ペイシャンツ　ウィズ　エイズ　アンドブレーエイ
ズ　（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、　１ｓｏｌａｔｉｏｎ、　
ａｎｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
　　ｏｆ　　ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｒｅｔｒｏｖｔｒｕ
ｓｅｓ　　（ＨＴ　Ｌ　Ｖ　−Ｉ　Ｉ　Ｉ　）　　ｆｒ
ｏｍｐａｔｉｅｎｔｓ　　　ｗｉｔｈ　　　ＡＩＤＳ　
　　ａｎｄ　　　ｐｒｅ−ＡＩＤＳ）］　　、Ｊｕｒｋ
ａｔ細胞、ＭＯＬＴ−４細胞につき、ＨＩＶを感染させ
た場合と感染させない場合とに分け、生存細胞数を３日
後に計数し、ついで、同一１度の検体を含む新鮮な培地
で１：４に希釈して、更に３日後に生存細胞数を再計数
した。結果を、生存率、増殖比（相対的増殖比）として
第９〜２４表に示す。増殖比は次式により計算した。

Ｔ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２不存在下での生存細胞数第７図は、
第９〜１６図に示された増殖比をグラフ化したものであ
る。第７図において、ム、口、閣、０１・はそれぞれ、
投与量０，１０１．１０．１０２ｎ　ｇ／ｍ（ｉでの結
果を示す。

どの細胞においても、１０ｎｇ／ｍ１以上の投与による
、ＨＩＶ感染細胞とＨＩＶ非感染細胞に対する細胞毒性
の差は顕著であり、Ｔ　Ｎ　Ｆ　Ａ１１２のＨＩＶ感染
細胞に対する優れた選択毒性が確認された。

第８図は、第１７〜２４図に示された増殖比をグラフ化
したものである。第８図において、ム、口、閣、○、・
はそれぞれ、投与量０．１０１．１０．１０２ｎ　ｇ／
ｍ　Ｑ、での結果を示す。

どの細胞においても、１０ｎｇ／ｍｆｆ１以上の投与に
よる、ＨＩＶ感染細胞とＨＩＶ非感染細胞に対する細胞
毒性の差は顕著であり、ＴＮＦＡＭ２のＨＩＶ惑染細胞
に対する優れた選択毒性が確認された。

実験例４ ＴＮＦ−α、Ｔ　Ｎ　ＦＡＭＩＳＴ　Ｎ　ＦＡＭ２、Ｔ
　ｂβ４−ＡＭ１、Ｔｈβ４−ＡＭ２がＨＩＶ感染細胞
に対して優れた細胞毒性を示すことは、前記実験例１〜
３に示された結果から明白である。更に、ＴＮＦＡＭ２
がＨＩＶ非感染細胞に対しては実質的に細胞毒性を持た
ないことも実験例３において確認された。

そこで、上記各種検体の、ＨＩＶ惑染細胞に対する選択
毒性を更に詳しく調へるために、上記検体に対するＨＩ
Ｖ非感染細胞の感受性をメチレンブルー染色法により、
０Ｄｅ３ｏｎイでの吸光度を指標とする細胞増殖比によ
り調へ、第２５〜２６表に示す結果を得た。表中の値は
、各検体における２回の測定値の平均を、対照における
値（０，９６）で較正しである。又、検体は次の通りで
ある。

検体１：ＴＮＦ−α　　検体２：ＴＮＦＡＭ２検体３：
Ｔｈβ４−ＡＭＩ （検体投与後１０日日の結果） （検体投与後１２日口の結果） 第９〜１０図は、第２５〜２６表に示された結果をグラ
フ化したものである。図中、・はＴＮＦ−αの、△はＴ
ＮＦＡＭ２の、■はＴｈβ４−ＡＭＩのデータを示す。

以上の結果から明らかな通り、ＴＮＦ−αは、ＨＩＶ感
染細胞に対する細胞毒性は地検体と同程度に強いが、同
時に、ＨＩＶ非感染細胞に対する細胞毒性が地検体とは
比較にならぬ程強く、即ち、ＨＩＶ感染細胞に対する選
択毒性が低く、従って、医薬としての有用性は地検体に
比べて劣ると思われる。

［発明の効果コ 本発明により、エイズの原因因子であるＨＩＶが感染し
たＴ４細胞を特異的に破壊し、及び／又は、ＨＩＶ感染
Ｔ４細胞からＨＩＶを取り除くという作用機序に基づき
、エイズを根本的に治癒するとともに、ＨＩＶ感染者の
エイズ発症も阻止できる新規な抗エイズ剤が提供される
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＴＨＰ−１細胞から精製された抗腫瘍性ポリ
ペプチドのゲノム遺伝子のＸｈｏ−Ｐｓｔｌ断片の塩基
配列を示す。 第２図は、Ｔｈβ４−ＴＮＦ融合蛋白を含む遠心分離の
上清を第１回のモノＱＦＰＬＣカラムクロマトグラフィ
ーに付した際の溶出パターンを示す。 第３図は、第２図に示された溶出パターンを参考にして
集められた活性画分を第２回のモノＱＦＰＬＣカラムク
ロマトグラフィーに付した際の溶出パターンを示す。 第４図は、本発明のＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２の、ＭＯＬＴ−
４／ＨＩＶ細胞に対する細胞毒性を細胞生存率（％）を
指標として表すグラフである。 第５図は、本発明のＴｈβ４−ＡＭＩの、ＭＯＬＴ−４
／ＨＩＶ細胞に対する細胞毒性を細胞生存率（％）を指
標として表すグラフである。 第６図は、本発明のＴｈβ４−ＡＭＩの、Ｊｕｒｋａｔ
／ＨＩＶ細胞に対する細胞毒性を細胞生存率（％〉を指
標として表すグラフである。 第７図は、本発明のＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２を投与して３日
経過後の、各種Ｔ４細胞の増殖比を示すグラフである。 第８図は、本発明のＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２を投与して６日
経過後の、各種Ｔ４細胞の増殖比を示すグラフである。 第９図は、本発明のＴＮＦ−αその他の、ＨＩＶ非感染
ＭＯＬ　Ｔ−４細胞に対する細胞毒性を、投与後１０日
日日おける細胞増殖比で示すグラフである。 第１０図は、本発明のＴＮＦ−αその他の、ＨＩＶ非感
染ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に対する細胞毒性を、投与後１
２日日日おける細胞増殖比で示すグラフである。 第４〜６図において、横軸は、検体投与後の経過日数を
、縦軸は、その検体を投与したときの細胞生存率（％）
を表す。 第７〜８図において、横軸は、細胞増殖比を表し、ム、
口、○、・はそれぞれ、投与量０．１０１０．１０２ｎ
　ｇ／ｍｌでの結果を示す。 第９〜１０図において、横軸は、検体の投与量（単位／
　ｍ　Ｉ’、　）を、縦軸は、細胞増殖比を表し、・は
ＴＮＦ−αの、ΔはＴ　Ｎ　Ｆ　ＡＭ２の、―はＴｈβ
、−ＡＭＩでの結果を示す。 特許出願人　柚　源一部　　　　（ほか１名）イ ド く ■ ■ く 第 図 第 図 （％） ！ ＋ Ｃロン 第 図 （％） 第 図 釆…　ｇｌ　す曾　ξ！　−５ 第 図 絆屹を量 ｉ直「乙 ｕｙｋＬｔ Ｊｌ、Ｌ？に２Ｌｔ　／ＨＩＶ ＭＯＬｔ−ヰ Ｍ　ｏｆｔ　−４／μｘｖ 飼Ｑ／ＨＸＶ ｃｃＲＦ−ＣＥＭ ＣＣにＦ　−ＣＥ　Ｍ／１−Ｉ　Ｘ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＴＮＦ−α、下記アミノ酸配列で表される ＴＮＦ＿Ａ＿Ｍ＿１、ＴＮＦ＿Ａ＿Ｍ＿２、Ｔｈβ＿４
   −ＡＭ１、Ｔｈβ＿４−ＡＭ２又はそれらの２種以上の
   混合物を含む抗エイズ剤。 ＴＮＦ＿Ａ＿Ｍ＿１： 【アミノ酸配列があります】（ＴＮＦ−αの第４エクソ
   ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
   に対応するアミノ酸配列） ＴＮＦ＿Ａ＿Ｍ＿２： 【アミノ酸配列があります】（ＴＮＦ−αの第４エクソ
   ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
   に対応するアミノ酸配列） Ｔｈβ＿４−ＡＭ１： 【アミノ酸配列があります】（ＴＮＦ−αの第４エクソ
   ンの塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列
   に対応するアミノ酸配列） Ｔｈβ＿４−ＡＭ２： 【アミノ酸配列があります】 （ＴＮＦ−αの第４エクソン の塩基配列の先頭にグアニンを連結した形の塩基配列に
   対応するアミノ酸配列）