JPH0146120B2

JPH0146120B2 -

Info

Publication number: JPH0146120B2
Application number: JP4627781A
Authority: JP
Inventors: Yoshisumi Ueno; Hajime Yoshimura
Original assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK
Current assignee: SHINOTESUTO KENKYUSHO KK
Priority date: 1981-03-31
Filing date: 1981-03-31
Publication date: 1989-10-05
Also published as: JPS57163500A

Description

[Detailed description of the invention]

本発明は血清中の総コレステロールの酵素的測
定方法に関する。血清コレステロールの測定は臨床診断上極めて
重要である。血清コレステロール値が増加を示す場合は動脈
硬化症、閉塞性黄疸、ネフローゼ症候群、甲状腺
機能低下、糖尿病等が疑われ、肝硬変症、重症な
肝機能障害等では血清コレステロール値は減少を
示すといわれている。何れにしてもコレステロー
ルの測定は病気の診断、あるいは病態の把握のう
えから極めて有意義であり、ますます迅速でかつ
正確なコレステロールの測定法が望まれている。コレステロールの酵素的測定法は遊離型の場合
はそのままの状態で、またエステル型の場合はコ
レステロールエステラーゼを用いてエステルを分
解し遊離型のコレステロールにした後、これらの
コレステロールにコレステロールオキシダーゼを
作用させ生成する過酸化水素を比色することによ
りコレステロールを測定するものである。かかる測定法における酵素反応系の問題点は、
コレステロールエステラーゼ及び／又はコレステ
ロールオキシダーゼの反応速度を促進化させるこ
とと、該酵素を活性化させることにある。特に、
酵素反応時間を短縮させることは自動分折機器が
普及した今日において避けられない課題である。この点に関し、従来試みられている方法は酵素
反応に市販のある種の公知界面活性剤を任意に添
加使用すると同時に、アルコール類及びコール酸
化合物等を併用したり、或はイオン強度を高める
ためにアルカリ金属塩を使用することにより解決
することが知られている。〔久城英人他：臨床病
理、24巻、645頁、荻三男：Medical
Technology、７巻、585頁、特開昭55−127987号
明細書等〕本発明者らは、かかる点について種々検討した
結果、従来の酵素反応に用いられていた界面活性
剤等はアルキル鎖（親油基）が12個以上の炭素数
があること、及びポリオキシエチレン鎖（親水
基）が単一でなく広範囲の分布をもつことを理解
した。この検討に鑑み従来の界面活性剤の構造と異な
る新規な界面活性剤を種々研究したところ、ポリ
オキシエチレン鎖を単一にした場合、従来法と比
べて酵素の反応速度に与える効果が優れているこ
とを見い出し本発明を完成した。即ち、本発明は血清中のコレステロールをコレ
ステロールエステラーゼ及び／又はコレステロー
ルオキシダーゼの酵素反応系における反応の促進
化と活性化を目的として、ポリオキシエチレン鎖
が単一の次の一般式で表わされる界面活性剤、一般式Ｒ−Ｏ−（C₂H₄O）nH （式中、Ｒは炭素数９〜12個のアルキル基、ｎは
６〜７の整数を表わす）を用いることを特徴とする血清コレステロールの
測定法である。本発明の方法では、コレステロールオキシダー
ゼの作用により酸化し生ずる過酸化水素をペルオ
キシダーゼの存在下で４−アミノアンチピリンと
カツプリングするパートナーは公知のフエノール
系、アニリン系の色素の何れでも可能である。本発明に使用する酵素コレステロールエステラ
ーゼ及び／又はコレステロールオキシダーゼは何
れの起源のものも使用でき、その使用量は特別な
厳密さを要求しないが、実用上コレステロールエ
ステラーゼは１検体当り0.4ユニツト、コレステ
ロールオキシダーゼは0.5ユニツト位で可能であ
る。使用する緩衝液としては３−（Ｎ−モルフオ
リノ）プロパンスルホン酸、２−（Ｎ−モルフオ
リノ）エタンスルホン酸、Ｎ−トリス（ヒドロキ
シメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン
酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
N′−２−エタンスルホン酸等の有機酸及びリン
酸緩衝液が用いられる。本発明で用いる界面活性剤の許容量は0.05〜
0.5％の範囲であるが、通常0.1〜0.2％（重量）の
濃度で使用するのが最も妥当である。また、界面
活性剤のポリオキシエチレン鎖の単一性の確認は
ガスクロマトグラフイーによつて行つた。次に、従来の界面活性剤と酵素活性を比較した
結果を表１に示す。 The present invention relates to a method for enzymatically measuring total cholesterol in serum. Measurement of serum cholesterol is extremely important for clinical diagnosis. If the serum cholesterol level shows an increase, arteriosclerosis, obstructive jaundice, nephrotic syndrome, hypothyroidism, diabetes, etc. are suspected, and it is said that the serum cholesterol level shows a decrease in liver cirrhosis, severe liver dysfunction, etc. There is. In any case, measuring cholesterol is extremely meaningful from the standpoint of diagnosing a disease or understanding its pathological condition, and there is a desire for an increasingly rapid and accurate method for measuring cholesterol. In the enzymatic measurement method for cholesterol, cholesterol is measured as is in the case of free form, or in the case of ester form, the ester is broken down to free form of cholesterol using cholesterol esterase, and then cholesterol oxidase is applied to the cholesterol to generate it. Cholesterol is measured by colorimetrically comparing hydrogen peroxide. The problems with the enzyme reaction system in this measurement method are:
The purpose is to accelerate the reaction rate of cholesterol esterase and/or cholesterol oxidase and to activate the enzyme. especially,
Shortening the enzyme reaction time is an unavoidable issue in today's world where automatic fractionation instruments have become widespread. In this regard, the methods that have been tried in the past include optionally adding certain commercially known surfactants to the enzymatic reaction, and at the same time using alcohols, cholic acid compounds, etc., or using methods to increase ionic strength. It is known that this can be solved by using alkali metal salts. [Hideto Kujo et al.: Clinical Pathology, vol. 24, p. 645, Mitsuo Ogi: Medical
Technology, vol. 7, p. 585, Japanese Patent Application Laid-open No. 127987/1987, etc.] As a result of various studies on this point, the present inventors found that surfactants used in conventional enzymatic reactions do not have alkyl chains ( I understood that the number of carbon atoms in the lipophilic group (lipophilic group) is 12 or more, and that the polyoxyethylene chain (hydrophilic group) is not single but has a wide distribution. In view of this consideration, we conducted various studies on new surfactants with a structure different from that of conventional surfactants, and found that when the polyoxyethylene chain is made into a single chain, it has a superior effect on the enzyme reaction rate compared to the conventional method. The present invention was completed based on this discovery. That is, the present invention aims at promoting and activating the reaction of cholesterol esterase and/or cholesterol oxidase in the enzyme reaction system of cholesterol in serum. A serum characterized by using a general formula R-O-(C ₂ H ₄ O) nH (wherein R represents an alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, and n represents an integer of 6 to 7). This is a method for measuring cholesterol. In the method of the present invention, the partner that couples hydrogen peroxide produced by oxidation with the action of cholesterol oxidase with 4-aminoantipyrine in the presence of peroxidase can be any of the known phenolic and aniline dyes. The enzymes cholesterol esterase and/or cholesterol oxidase used in the present invention can be of any origin, and the amount used does not require any particular strictness, but in practice, cholesterol esterase should contain 0.4 units per sample, and cholesterol oxidase should contain 0.4 units per sample. It is possible with about 0.5 units. Buffers used include 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid, and N-2-hydroxyethyl. Piperazine
Organic acids such as N'-2-ethanesulfonic acid and phosphate buffers are used. The allowable amount of surfactant used in the present invention is 0.05~
It is most reasonable to use concentrations of 0.5%, but usually 0.1-0.2% (by weight). Furthermore, the identity of the polyoxyethylene chain of the surfactant was confirmed by gas chromatography. Next, Table 1 shows the results of comparing the enzyme activity with conventional surfactants.

【表】表１より、本発明の界面活性剤は従来用いられ
ていた界面活性剤と較べ、１分当り1.7〜2.8倍程
度の酵素の活性化が見られ、よつてコレステロー
ルの測定において第１図に示す如く反応時間の短
縮が可能になり、簡単な操作で迅速かつ正確に検
体の処理ができるため、昨今ますます普及してい
る自動分折機への応用にも適している。本発明の界面活性剤はコレステロールの測定法
のために開発されたものであるが、HDL−コレ
ステロール、リポ蛋白、リン脂質、レシチン−コ
レステロール・アシルトランスフエラーゼ等の酵
素反応を利用して測定する方法においても勿論適
用することが可能である。次に実施例により本発明を説明するが、これに
よつてなんら本発明は限定されるものではない。実施例１ (1) 試薬の調製コレステロールエステラーゼ 13ユニツトコレステロールオキシダーゼ 16ユニツトパーオキシダーゼ 280ユニツト４−アミノアンチピリン 6.5mg フエノール 100mg ３−（Ｎ−モルフオリノ）プロパンスルホン
酸 420mg 塩化ナトリウム 1.2g コール酸ナトリウム 3.9g ヘプタオキシエチレンデシルエーテル 200mg 上記の試薬を精製水100mlに溶解し、測定試
薬とする。 (2) 操作法試験管に血清を0.02ml取り、次いで(1)で調整
した測定試薬を3.0ml加える。試薬ブランク用
として試験管に蒸留水を0.02ml取り、(1)の試薬
を同様に加える。標準液の場合も同様に行い、
37℃10分間加温後、試薬ブランクを対照として
500nmにて吸光度を測定する。[Table] From Table 1, the surfactant of the present invention activates the enzyme approximately 1.7 to 2.8 times per minute compared to the conventionally used surfactant. As shown in the figure, the reaction time can be shortened and samples can be processed quickly and accurately with simple operations, making it suitable for application to automatic fractionators, which are becoming increasingly popular these days. The surfactant of the present invention was developed for the measurement of cholesterol, and the measurement is performed using enzyme reactions such as HDL-cholesterol, lipoprotein, phospholipid, and lecithin-cholesterol acyltransferase. Of course, it can also be applied to methods. EXAMPLES Next, the present invention will be explained with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto in any way. Example 1 (1) Preparation of reagents Cholesterol esterase 13 units Cholesterol oxidase 16 units Peroxidase 280 units 4-aminoantipyrine 6.5 mg Phenol 100 mg 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid 420 mg Sodium chloride 1.2 g Sodium cholate 3.9 g Hepta Oxyethylene decyl ether 200mg Dissolve the above reagent in 100ml of purified water and use it as a measurement reagent. (2) Procedure Take 0.02ml of serum in a test tube, then add 3.0ml of the measurement reagent prepared in (1). Place 0.02 ml of distilled water in a test tube as a reagent blank, and add the reagent from (1) in the same manner. Perform the same procedure for the standard solution.
After heating at 37℃ for 10 minutes, use the reagent blank as a control.
Measure the absorbance at 500nm.

[Brief explanation of drawings]

第１図は血清における本発明法と従来法との界
面活性剤の効果を反応時間で比較を示したもので
ある。 FIG. 1 shows a comparison of the surfactant effects of the present invention method and the conventional method on serum in terms of reaction time.

Claims

[Scope of Claims] 1. A system for hydrolyzing ester cholesterol in serum into free cholesterol by cholesterol esterase, a system for oxidizing free cholesterol by cholesterol oxidase to generate hydrogen peroxide, and a system for producing hydrogen peroxide by comparing the hydrogen peroxide. A method for measuring total cholesterol comprising a coloring system, characterized in that a surfactant having a single polyoxyethylene chain having the following general formula is added together with cholesterol esterase and/or cholesterol oxidase. General formula R-O-(C ₂ H ₄ O) nH (In the formula, R represents an alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, and n represents an integer of 6 to 7)