JPH01316400A

JPH01316400A - 修飾ポリペプチド

Info

Publication number: JPH01316400A
Application number: JP1079748A
Authority: JP
Inventors: Motoo Yamazaki; 基生山崎; Yoshiharu Yokoo; 義春横尾; Makoto Morimoto; 森本　眞; Masami Okabe; 正実岡部
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-30
Publication date: 1989-12-21
Anticipated expiration: 2010-10-18
Also published as: JPH0796558B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、ヒト頚粒球コロニー刺激因子（以下ｈＧ−Ｃ
３Ｆと略記する）活性を有するポリペプチドの分子中の
少なくとも１個のアミノ基を化学修飾して得られる化学
修Ｍ５ｈＧ−Ｃ３Ｆポリペブチドおよびその製造法に関
する。

ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆは、造血幹細胞を増殖・分化させ種々
の血球を形成させる際に必須なポリペプチドの１種で、
主として頚粒球、なかでも好中球の増加を促進する効果
をもつ。好中球は生体の感染防御において重要な役割を
担っているが寿命が短く、前駆細胞の恒常的な増殖・分
化によって常に補給されていなければならない。近年広
く行われている増殖性腫瘍に対する治療は、同時に好中
球前駆細胞の増殖を阻止するため、担癌患者の感染防御
機能を低下させるという重篤副作用をもつ。ｈＧ−Ｃ５
Ｆは、好中球の増加を促進することにより、この副作用
を軽減し、他方、感染症を予防・治療する効果を持つも
のと期待される。さらに、ｈＧ−Ｃ８Ｆには、白血病細
胞株をｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて分化させる活性があり
、白血病に対する治療薬となる可能性もあるものとみら
れる。本発明の化学修飾ｈＧ−Ｃ５Ｆポリペプチドは、
既知のｈＧ−Ｃ５ＦよりすぐれたｈＧ−Ｃ３Ｆ活性をを
しており、医薬品としての利用が期待される。

従来の技術近年急速に発展してきた組換えＤ　Ｎ　Ａ技術により、
血球の増殖・分化に係わるタンパク質性の因子の遺伝子
が次々と単離されてきた。それらの因子は、微生物や動
物細胞を利用して遺伝子工学の手法で生産されている。

ｈＧ−Ｃ３Ｆは、長田らがヒト扁平上皮癌細胞株ＣＨＵ
−ｎよりｃＤＮＡを単離してその塩基配列を決定し、Ｃ
Ｏ５細胞での発現を報告している〔長田ら：ネイチ＋　
−（Ｎａｔｕｒｅ）　３１９．　４１５　（１９８６）
］。

また、ススープＳｏｕｚａ）らはヒト膀胱癌細胞株５６
３７よりｃＤＮＡを単離してその塩基配列を決定し、犬
ｌｌ１３菌での発現を報告している〔スープら：サイエ
ンス　（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　　２３２．　６１　（１９
８６）］。

このようにして得られたｈＧ−Ｃ３Ｆは、生体内に投与
した場合、効果の持続には連続投与が必要であり、投与
を中止すると効果はすみやかに消失するという報告があ
る〔ジャーナル・オブ・エックスヘリメンタル・メディ
スン（Ｊ、　ＥＸＩＴ、　１ｃｅｄ、）１６５、９４１
−９４８　（１９８７）　〕。これは、ｈＧ−Ｃ５Ｆの
血中における持続性が低いためと考えられる。

また、アスパラギナーゼ［Ｉｎａｄａ、　Ｙ、、　　ｅ
ｔ　　ａｌ、。

トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ　
ｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、　４．６８−７３
．　　（１９８６））　、　　アルギナーゼ［５ａｖｏ
ｃａ、　Ｋ、Ｖ、、　ｅｔ　　ａｌ、、　　バイオケミ
力・エト・バイオフィジカ・アクタ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａ　ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ＞、　　
５７８．　４７−５３．　　（１９７９）：ｌ　、　　
バトロキソビンｌ：ＮｉｓｈＮ１５ｈｉ、　ＩＩ、、　
　ｅｔ　　ａｔ、、　　ライフ・サイエンス　（Ｌｉｆ
ｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）、　　３３．　１４６７−１４７
３゜（１９８３）１などの酵素類について、ポリエチレ
ングリコールで化学修飾を行うことにより血中持続性の
向上、抗原性の減弱がδ忍められている。

一般にタンパク質を医薬として用いる場合、凍結乾燥剤
として供給されることが多い。ところが、凍結乾燥時あ
るいは凍結乾燥後に温度、湿度、酸素、紫外線等の外的
因子により影響を受け、会合、重合あるいは酸化などの
物理的、化学的変化を受け、活性の低下を招く場合があ
る。いくつかの添加剤による凍結乾燥時の安定化が試み
られている（ｈＧ−Ｃ３Ｆについては、例えば特開昭６
３−１４６８２６、特開昭６：３−１４６８２９等に添
加剤の例がある）が、実用上更に安定化された製剤が望
まれている。

発明が解決しようとする課題医薬品としてｈＧ−Ｃ３Ｆを用いる場合、生体内に投与
されたｈＧ−Ｃ３Ｆが、その活性を保持したまま、血中
での安定性が高く、高い持続性を有し、さらにその抗原
性が減弱されたものであることが望ましい。また、ｈＧ
−Ｃ３Ｆを医薬として用いる場合、通常凍結乾燥製剤と
して供給されるので、凍結乾燥時ならびに凍結乾燥後に
安定性を向上させることは有用である。しかしながら、
そのような性質を有するｈＧ−Ｃ５Ｆおよびその製造法
は開発されていない。

課題を解決するための手段本発明者は、ｈＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチドの
分子中の少なくとも１個のアミノ基を化学修飾すること
により、未修飾のｈ　（、−ＣＳ　Ｆに比して、血中に
おける持続性を向上させることができることおよび凍結
乾燥時ならびに凍結乾煙後において安定性を向上させる
ことができることを見出し、本発明を完成した。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、ｈＧ−Ｃ５Ｆ活性を有するポリペプチドの分
子中の少なくとも１個のアミノ基に式ＲＴ（ＯＣＨ，Ｃ
Ｈ２−）−、Ｘ−Ｒ２−（Ｔ）（式中Ｒ１はアルキル基
またはアルカノイル基、一〔式中Ｒ３はＯＨ，ＣＩ！、Ｏ（ＣＨ＝ＣＨ２０）ｎ　
　ＲＩ（式中Ｒ，，ｎは前記と同意義を表す）を表し、
Ｙは存在しないか、またはＺ　　（ＣＨ２）ｐＣＯ（式
中Ｚは０．ＳまたはＮＨを表し、ｐは任意に変わりうる
正の整数を表す）を表す〕または（ＣＯ）ｍ　　（ＣＨ
２）　ｔ　ＣＯ（式中、ｍは０または１、ｌは任意に変
わりつる正の整数を表す）を表す）で表される基を結合
してなる修飾ポリペプチドを提供する。

本発明に使用するｈ（、−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプ
チドは、第１表に示されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドや、第２表に代表されるような、第１表のアミノ
酸配列中で少なくとも１個のアミノ酸が他種のアミノ酸
に置換されたポリペプチドまたはＮ末端アミノ酸が１−
１１個欠失したポリペプチドでｈＧ−Ｃ３Ｆ活性を有す
るものであればよい。さらに特開昭６３−２９９　、特
公表６３−５００６３６に記載のｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆｍ導
体も用いることができる。

第　　　　１　　　　表ＡｌａＧｌｎＰｒ。

（Ｘ＝Ｈまたは！Ｊｅｔ）本発明に用いられる化学修飾基に関し、Ｒ１で示される
末端酸素の保護基としてのアルキル基、アルカノイル基
としては、具体的にはアルキル基は０１〜ｌ（メチル、
エチル、プロピルなど）のもの、アルカノイル基はＣ１
〜５．のもの（ホルミル。

アセチル、プロピオニルなど）があげられる。

ｎで表される正の整数は、５００以下である。

とりわけ７〜２３０が好ましい。

βで表される正の整数は、１００以下であり、好ましく
は、０〜６である。ｐは表される正の整数は１〜１８、
好ましくは１〜６である。本発明の化学修飾基の分子量
は、３０，０００以下であり、好ましくは３００〜１０
，０００の範囲内にあるものである。

本発明の化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆは、例えばｈｃＣβ （Ｒ，、ｎ、Ｘ、Ｒ，は前記と同意義である）で示され
るハロゲン化物との縮合あるいはｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆと、
Ｒｒ−（ＯＣＨ，ＣＨ２）、、−Ｘ−（Ｃｏ）、（ＣＨ
，）７！−ＣＯＯＨ（Ｉｎ）（Ｒ，、ｎ、Ｘ、ｍ、１．
は前記と同意義である）で示されるカルボン酸との縮合
あるし）はｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆと（式中Ｒ１，ｎ、　　Ｘ、　　Ｒ３、Ｚ、　　ｐは前記
と同意義である）で示されるカルボン酸との縮合により
製造される。

式（Ｕ）のハロゲン化物は、Ｒ３−（○ＣＨ２ＣＨ−）
　ｎ−ＸＨ（Ｒ２，ｎ、Ｘは前記と同意義である）と塩
化シアヌルとの縮合で得られる〔例えば、！Ｊａｔｓｕ
ｓｈｉｍａ。

Ａ、、　ｅｔ　　ａｌ、、ケミストリー・レターズ（Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ。

Ｌｅｔｔｅｒｓ）、　７７３−７７６、　　（１９８０
）、＾ｂｕｃｈｏｗｓｋｉ、　Ａ、、ｅｔａｌ、、　　
ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、　　２５２．　　（１
２）　３５７８−３５８１　（１９７７）　］。このハ
ロゲン化物は反応性を有するので、ｈＧ−Ｃ３Ｆ活性を
有するポリペプチドと直接反応させることができる。

式（■）のカルボン酸は、Ｒ，−（ＯＣ８２ＣＨ，）、
、−ＸＨ（Ｒ，、ｎ、Ｘは前記と同意義である）とアル
カンジカルボン酸のカルボキシル基の脱水縮合によりカ
ルボキシル基を導入するか、へロゲル化モノカルボン酸
によりカルボキシル基を導入するか、あるいは末端の水
酸基を酸化し、カルボキシル基に変換することにより得
られる。このカルボン酸は反応性を有さないので、活性
化して用いる必要がある。カルボン酸の活性化法として
は、例えばＮ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロ
キシフタル酸イミド、ｌ−ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル、ｐ−ニトロフェノールなどとの活性エステルとする
方法、イソブチルクロロホルメート、エチルクロロホル
メートとの混合酸無水物とする方法、または塩化チオニ
ルなどのハロゲン化剤を作用させて、酸ハロゲン化物と
する方法〔いずれも「ペプチド合成」　（泉屋信夫ほか
著、丸善刊）参照〕などがあげられる。

前述の式（ｒＶ）のカルボン酸は式（ＩＩ）の塩化物と
Ｒ２（Ｃｉ（２）ｐ　　Ｃ０２Ｈ（ＺＳｐは前記と同義
である）との縮合により得られる。この式（ｒＶ）のカ
ルボン酸は式（ＩＩＩ）のカルボン酸と同様に、活性化
して用いる。

これらのハロゲン化物あるいはカルボン酸活性化物を、
ｈＧ−Ｃ３Ｆ活性を有するポリペプチドの分子中に存在
するアミノ基の２〜１００倍量（モル比）加え、４〜３
７℃、好ましくは４〜１０℃、ｐＨ７〜１０で１時間〜
２日間好ましくは１〜２４時間反応させることにより目
的とする化学修飾ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆを製造することがで
きる。

化学修飾ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆまたは化学修飾ｈ　Ｇ−Ｃ３
Ｆｉ導体において、式■のハロゲン化物との反応物を■
型、弐■のカルボン酸との反応物を■型、弐■のカルボ
ン酸との反応物を■型と、それぞれ称する。

化学修飾の程度は遊離アミノ基の減少債をトリニトロベ
ンゼンスルホン酸で定量することにより、あるいは、ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いて、化学！飾ｈＧ−Ｃ３Ｆの移動度の変化を
追うことにより確認される。

化学修飾ｈＧ−Ｃ５Ｆおよび化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導
体は水または適当な緩衝液に溶解した液剤または凍結乾
煙剤として医薬用途に供される。

凍結乾燥の条件はとくに限定しないが、通常は一５０℃
以下で１〜５時間凍結し、棚温−２０℃〜０℃、真空度
５０〜１５０ｍＴｏｒｒで２４〜４８時間乾燥し、つい
で側温ｌＯ〜３０℃、真空度５　（１〜１００ｍＴｏｒ
ｒで１６〜２４時間乾燥し、凍結乾燥品を得る。

液剤はそのまま無菌濾過して注射剤として用い凍結乾煙
剤は水または適当な緩衝液に溶解した後無菌濾過して注
射剤として使用する。

なお、本発明において使用するｈＧ−Ｃ３Ｆは：通常の
各種製薬担体、賦形剤、希釈剤、安定化剤あるいは吸着
防止剤などを含むことができる。

本誘導体の投与量は、その対象となる疾患および患者の
病状にあわせて決められるが、通常の成人−人当り０．
１〜５００μｇ１好ましくは０．５〜２００μｇの化学
修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆおよび化学修飾ｈＧ−Ｃ５Ｆ誘導体含
を製剤を１週間当り１〜７回投与する。

化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆおよび化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導
体にはポリエチレングリコール誘導体が一分子〜三分子
結合する。したがって、本修飾ｈＧ−Ｃ５Ｆならびに修
飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体は一分子結合体〜三分子結合体の
混合物で用いるか、あるいは−分子結合体〜三分子結合
体をそれぞれ分離して用いる。

本発明における蛋白質量の測定は以下に記載する実験方
法によって測定する。

実験方法ｌ。

オ・エッチ・ローリ−の方法［Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，
。

ｅｔ　　ａｌ、、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー　（Ｊ、　　Ｒｉａｌ、　　Ｃｈｅｍ、）
、　　１９３．　２６５　（１９５１＞１により行う。

実験方法２゜レムリの方法〔口、に、（４Ｃ＋＋＋ｍｌ　ｉ　：ネイ
チ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）２２７、６８０　（１９７０
）　〕により〕５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
を行った後、クロマトスキャナー＜Ｃ５−９３０島津製
作所）で測定する。

本発明におけるＧ−Ｃ３Ｆ活性の測定は以下のように行
った。８〜１２週令のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（静岡実験
動物協同組合）の大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出
し、牛胎児血清（ＦＢＳ）を１０％添加したａ　−！Ｊ
ｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｆ
ｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、以下Ｕ　−Ｍ　Ｅ
　Ｍ培地と略す）に懸濁した。この細胞（約５Ｘ１０’
個）！ｇ４液１．５ｍｌをナイロン・ウール（Ｎｙｌｏ
ｎ　ｗｏｏｌ）　（和光純薬、Ｎｙｌｏｎ　Ｆｉｂｅｒ
　１４６−０４２３１＞をつめたカラム（０，３ｇ）に
浸漬し、５％ＣＯ。インキュベーター内にて３７℃９０
分間反応させた。次いで予め３７℃に加温したα−ＭＥ
Ｍ培地をカラムに流し、溶出してくるナイロン・ウール
非吸着性の骨髄細胞を得た。この細胞をα−ＭＥＭ培地
で一回洗浄し、所定の濃度に調製した。

次いで、間部らの方法［０ｋａｂｅ　Ｔ、　　ｅｔ　　
ａｔ、。

キ丁ンサーｅリサーチ　（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ）　　４４゜４５０３−４５０６　（１９８６）］
に準じて骨髄造血幹細胞コロニー形成能を測定した。す
なわち、α−ＭＥＭ培地０．２ｍｌ、　　ＦＢＳ　　０
．４ｍｌおよび２段階希釈した各サンプル０．２ｍｌの
混液に、上記の方法で調製した骨髄細胞（２Ｘ１０ｇ個
／ｍ１）の０．２ｍｌを混和した。これに４２℃に保温
した０、６％寒天（Ｄｉｆｃｏ。

Ａｇａｒ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　：　０５６０−０１）溶
液を等’７１　（１，０ｍｌ）混和し、その０．５ｍｌ
を２４穴マルチデイツシユ（Ｎｕｎｃ社製、＄　１４３
９８２）に播種した（５Ｘ１０’個／ｗｅｌｌ、　　ｎ
＝３）　、　　５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃
７日間培養し、４０個以上の細胞からなるコロニーの数
を顕微鏡（Ｏ１ｙｍｐｕｓ社製、×４０）で計数した。

コロニー計数後、注意深くスライドグラス上にとり出し
、アセトン・ホルマリン混液で３０秒間固定後、Ｋｕｂ
ｏＬａらの方法［Ｋｕｂｏｔａ　Ｋ、。

ｅｔ　　ａｌ、、エックスペリメンタル・ヘマトロジイ
（Ｅｘｐ、）Ｉｅｍａｔｏｌｏｇｙ）　８．３３９−３
４４　（１９８０）］でエニステラー２重染色を施し、
各コロニーの同定を行った。

各サンプルの力価は、コロニー形成試験の２段階稀釈に
於ける計数結果から以下のように算出した。スタンダー
ドとして用いたインタクトＧ−ＣＳＦのコロニー形成の
最大値の２値を与える活性を５０単位と定義し、これに
各サンプルの稀釈率および単位ｍ１当りの活性に換算す
るため、２０を乗じて力価（単位）とした。比活性は、
単位蛋白質（ｍｇ）当りの力価（単位／ｍｇ）で表示し
た。

以下に実施例、参考例、実験例を示す。

実施例１゜第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−Ｃ５Ｆ１８６　μ
ｇ／ｍｌを含む０．ＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）３ｍ
ｌに後述の参考例１で得られたクロル化物５６ｍｇを添
加し、攪拌しながら４℃で２４時間反応させた。

限外濾過（分画分子量３万）により、未反応のりＤＪＩ
、化物を除去後、Ｍ　Ｍ　Ｃ−ＰａｃｋΔＭ−３１２０
ＤＳ（栗田工業社製）を用いるアセトニ）　ＩＪル０−
７０％の直線匂配による逆相ＨＰＬＣを行った。化学修
飾ｈＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドは、アセトニトリル約５０
％の溶出分画に溶出された（収量３０μｇ、収率５％）
。得られた化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドは、ｈＧ
−Ｃ３ＦＩ分子に対し、クロル化物１分子結合している
ことが、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確
Ｊ忍された。

純度は９０％以上であった。

実施例２゜第１表のアミノ酸配列を有するｈＧ−Ｃ５Ｆ５７０　ｑ
／ｍｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）５０
ｍｌに、後述の参考例２で得られた活性エステル２４０
ｍｇを添加し、攪拌しながら４℃で６時間反応させた。

１０ｍＭＩＪス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アンモニウム
（ｐＨ８，０）５０ｍｌを加えた後、ｌＱｍＭトリス・
塩酸−〇、３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８，０）で充
たされたブチル−トヨパール６５０Ｍ（東ソーり（２，
２ｃｍｘ２６ｃｍ＞に１００ｍ１／ｈｒの流速で通塔し
た。次いで１０ｍＭ）ＩＪス・塩酸−０，３５Ｍ硫酸ア
ンモニウム（ｐＨ８，０）１００ｍｌを１００ｍ１／ｈ
ｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍ　Ｍ　ト’）ス・塩
酸（ｐＨ８，０＞系に直線匂配で０．３５Ｍ硫酸アンモ
ニウムから０Ｍ硫酸アンモニウムを総１ｔ４００ｍｌか
けて加え、１００ｍｌ／ｈｒの流速で溶出を行った。目
的物は、硫酸アンモニウム５０ｍＭから１３０ｍＭで溶
出された。溶出画分１３０ｍ１を限外濾過〔分子量分画
１万；膜ＹＭ１０　（アミコン社製）〕シ、７　ｍｌま
でａ縮した。

次いで、ａ縮液を１０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液−生理食塩水
（ｐＨ７，２）　　（ＰＢＳ）で充たされたセファクリ
ルＳ−２００（ファルマシア社ｍ）　　（２，８ｃｍＸ
７Ｑｃｍ）に１２０　ｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次
いで、同流速でＰＢＳを通塔した。

化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆポリペプチドはポリエチレングリ
コール誘導体三分子結合体（Ｔ「１体）がＰＢＳを流し
始めて１５０ｍ＆から１６０ｔｒｌｆ！あたりに溶出さ
れたく収ｌ　２　ｍｇ　　収率７％）。次いで、ポリエ
チレングリコール誘導体二分子結合体（Ｄｉ体）が１６
５Ｍから１８５−あたりに溶出された（収５４１．５　
ｍｇ　　収＝１！５％）。次いで、ポリエチレングリコ
ール誘導体−分子結合体（！、ｌ　ｏ　ｎ　ｏ体）が１
９０ｍｆ＋から２１０ｍ１あたりに溶出された（収量４
、５　ｍｇ　　収率１６％）。得られたポリペプチドは
＋１１ｏｎｏ体ではｈＧ−Ｃ５Ｆ−分子に対し、ポリエ
チレングリコール誘導体のカルボン酸が一分子結合して
おり、Ｄｉ体では二分子結合しており、Ｔｒｉ体では三
分子結合していることが５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で確認された。それぞれの純度は９０％以上
であった。

実施例３゜後述の参考例３で得られたｈＧ−ＣＳＦ誘導体（５７０
μｇ／ｍｌ）を含む０．１Ｍホウ酸緩１軒液（ｐＨ９＞
ｌｏｍｌに、後述の参考例２で得られた活性エステル５
４ｍｇを添加し、４℃で１０時間反応させた。

限外濾過膜ＹＭ３０（アミコン社製）を用いて、未反応
の活性エステルおよびその分解物を除去後、間膜を用い
て１０　ｍＭ　）　ＩＪス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）に内
液の交換を行った。残液を、１０ｍＭ）リス・塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で充たされたＤＥＡＥ−トヨパール６
５０Ｍ（東ソー１）　（１，７ａｍ　ｘ　４．４Ｃ［ｌ
ｌ）にｌｏｍｌ／ｈｒの流速で通塔した。次いでｌＯｍ
Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）２０ｍｌを５ｍｌ／ｈ
ｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭ）リス・塩酸（ｐ
Ｈ８）の緩（ｌ？液系に、直線匂配で０ＭＮａＣｆから
０．４Ｍ　　ＮａＣｊ！を総量１００ｍ１かけて加え、
５ｍｌ／ｈｒの流速で溶出を行った。化学修飾ｈＧ−Ｃ
ｓｐポリペプチドはＮａＣｌ１１００〜１２０ｍＭで溶
出された（収量ｏ、ａ５ｍｇ、収率１５％）。得られた
ポリペプチドは、ｈＧ−Ｃ５Ｆ誘導体１分子に対し、ポ
リエチレングリコール誘導体のカルボン酸１分子結合し
ていることが、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で確認された。純度は９０％以上であった。

実施例４゜参考例３で得られたｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体（５７０μｇ　
／　ｒｒｄｌ　）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，２）５０−に、参考例２で得られた活性エステル３０
０ｍｇを添加し、４℃で６時間反応させた。

１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液−０，７Ｍ硫酸アンモニウム
（ｐＨ８，０）５０−を加えた後１０ｍＭ）リス塩酸緩
衝液−０，３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８，０）で充
たされたブチル−トヨバール６５０Ｍ（東ソー製）　　
（２，２ｃｍＸ　２６ｃｍ）に１００　Ｉｎ１／ｈｒの
流速で通塔した。次いで１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液−０
，３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８，０）１００ｍｌを
１００ｍ＆／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、１０ｍＭ）
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に直線勾配で０．３５Ｍ
硫酸アンモニウムから０Ｍ硫酸アンモニウムを総量４゛
００−かけて加え、１００ｍ＆／ｈｒの流速で溶出を行
った。目的物は、硫酸アンモニウム５０ｍＭから１５０
ｍＭで溶出された。溶出画分１５０ｍ１２を限外濾過〔
分子量分画１万：ＹＭｌｏ　（アミコン社製）〕シ、１
０ｍ１２まで濃縮した。

ついで、濃縮液をＰＢＳで充たされたセファクリルＳ−
２００（ファルマシアＭ）　　（２，８ｃｍｘ　７０ｃ
Ｉ１１）に１２０ｍｆｆ／ｈｒの流速で通塔した。次い
で、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ−Ｃ５Ｆ
ポリペプチドはポリエチレングリコール誘導体三方子結
合体（Ｔｒｉ体）がＰＢＳを流し始めて１５０−から１
６０−あたりに溶出されたく収量１、５　ｍｇ　　収率
５％）。次いで、ポリエチレングリコール誘導体二分子
結合体（Ｄｉ体）が１６５−から１８５ｍ１！あたりに
溶出された（収量３ｍｇ　　収率１１％）。次いで、ポ
リエチレングリコール誘導体−分子結合体（Ｍ　ｏ　ｎ
　ｏ体）が１９０ｍ１から２１０−あたりに溶出された
（収量４ｍｇ　　収率１４％）。

得られたポリペプチドはｈｌｏｎｏ体ではｈＧ−Ｃ３Ｆ
−分子に対し、ポリエチレングリコール誘導体のカルボ
ン酸が一分子結合しており、０１体では二分子結合して
おり、Ｔｒｉ体では３分子結合していることが５ＤＳ−
ボアクリルアミドゲル電気泳動で確認された。それぞれ
の純度は９０％以上であった。

実施例５゜参考例３で得られたｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体（３００ｕｇ／
　ｍｌ　）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
１００ｍｌに、参考例４で得られた活性エステル８００
ｍｇを添加し、４℃で２４時間反応させた。

１０　ｍＭ　）　’Ｊス塩酸緩衝液−０．７Ｍ硫酸アン
モニウム（ｐＨ８，０）ｌｏｏｍ＆を加えた後、１０ｍ
１トリス塩酸緩衝液−０，３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐ
Ｈ８，０）で充たされたブチル−トヨパール６５０Ｍ（
東ソー製）（２，２ｃｍＸ２６ｃｍ）に１００ｍ１／ｈ
ｒの流速で通塔した。次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液
−０，３５Ｍ硫酸アンモニウム（ｐＨ８，０）１００−
を１００ｄ／ｈｒの流速で通塔して洗浄後、ｌ　ＯｍＭ
　）　’Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）系に直線勾配で
０．３５Ｍ硫酸硫酸アンモニウム０Ｍ硫酸アンモニウム
を＆ｅ量４００＋ｎ＋２かけて加え、１００ｄ／ｈｒの
流速で溶出を行った。目的物は、硫酸アンモニウムＯｍ
Ｍから２５０ｍＭで溶出された。溶出画分２５０−を限
外−過〔分子量分画１万：ＹＭｌｏ（アミコン社製）〕
シ、ＩＯ−まで濃縮した。ついで、ＰＢＳで充たされた
セファクリルＳ−２００（ファルアシア製）　（５，６
ｃｍＸ４０ｃｍ＞に１６０ｍ１２／ｈｒの流速で通塔し
た。次いで、同流速でＰＢＳを通塔した。化学修飾ｈＧ
−Ｃ３Ｆポリペプチドはポリエチレングリコール誘導体
三方子結合体（Ｔ「１体）がＰＢＳを流し始めて３６０
−から４００ｍ１あたりに溶出された（収量２．１　ｆ
ｆ１ｇ収率７％）。次いで、ポリエチレングリコール誘
導体二分子結合体（Ｄｉ体）が４２０ｍ１から４５０ｍ
１あたりに溶出された（収１１．５　ｍｇ収率５％）。

次いで、ポリエチレングリコール誘導体−分子結合体（
Ｍｏｎｏ体）が５００ｍ１から５３０ｍ１あたりに溶出
された（収５１１．５　ｍｇ　　収量５％）。

得られたポリペプチドは！、ｔ　ｏ　ｎ　ｏ体ではｈ（
、−Ｃ５Ｆ−分子に対し、ポリエチレングリコール誘導
体のカルボン酸が一分子結合しており、Ｄｉ体では三方
子結合しており、Ｔｒｉ体では三方子結合していること
が５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認され
た。それぞれの純度は９０％以上であった。

実施例６゜化学修飾ｈＣ，Ｃ３Ｆ凍結乾燥標品の製造およびその保
存安定性実施例２と同様の方法で、ｈ　Ｇ−ＣＳ　Ｆと活性エス
テルとを反応させ、限外−過膜を用いて未反応の活性エ
ステルおよびその分解物を除去した。

間膜を用いて、ＩＭ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐ　Ｈ７，２＞で内液の交換を行った。

得られた修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ２００μｇ／ｍｌ含有溶液を
凍結乾燥し凍結乾燥剤を製造した。対照とじてｈＧ−Ｃ
３Ｆとポリエチレングリコールとの混液の凍結乾怪を同
様に行い凍結乾燥剤を製造した。

それぞれの凍結乾燥剤を６５℃で放置後、経時的に溶解
し、ｈＧ−Ｃ５Ｆの残存活性を前述の活性測定法に従い
測定した。結果は第３表に示す。

残存活性（％）は、凍結乾煙前の初期活性に対する相対
割合であり、以下の式で定義される。

凍結乾爆条件：未修＃ｈＧ−Ｃ３Ｆ溶液、修飾ｈＧ−Ｃ
３Ｆ溶液とも以下の条件で行う。ｈｃ−Ｃ３Ｆ溶液をガ
ラスバイヤルに入れ、−５０℃以下で２時間凍結する。

次いで、棚温−２０℃下真空度１００　Ｔｏｒｒで２４
時間乾燥する。次いで、２０℃下真空度８０ｍＴｏｒｒ
で２４時間乾燥し、凍結乾迷品を得る。

（５０ｍＭリン酸緩衝液、　ｐＨ７，２，ＬＭ　ＮａＣ
ｊり（１）　　ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ　１部当り２．５部
（重量比）（２）　　ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ　１部当り　
５部　（重量比）実施例７゜化学修飾ｈｃ−Ｃ３Ｆ、ｔＭ導体の凍結乾燥条件の製造
およびその保存安定性実施例３と同様の方法で、ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体と活性エ
ステルとを反応させ、限外濾過膜を用いて未反応の活性
エステルおよびその分解物を除去した。間膜を用いて、
１Ｍ塩化す）　ＩＪウム含有、１）　Ｏｍ　Ｍ　リン緩
衝液（ｐＨ７，２）で内液の交換を行った。得られた修
飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体２００μｇ／ｍ＆含有溶液を凍結
乾燥し、凍結乾燥剤を製造した。また、対照としてｈＧ
−Ｃ３Ｆ誘導体およびポリエチレングリコール添加溶液
の凍結乾燥を同様に行い凍結乾燥剤を製通した。それぞ
れ凍結乾燥剤を３７℃で７日間放置し、経時的に溶液中
のｈＧ−Ｃ５Ｆの残存活性を前述の活性測定法に従い測
定した。結果は第４表に示す。表中残存活性（％）およ
び凍結乾燥条件は実施例５と同じである。

（５０ｍＭリン酸緩衝液、　ｐａｌ　７．２　、　１！
、ｌ　Ｎａ１Ｊ）（１）　　ｈＧ−Ｃ３Ｆ１部当り２．
５部（重量比）（２）　　ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ　１部当
り　５部　（重量比）参考例１゜２．４−ビス（０−メトキシポリエチレングリコール）
−６−クロル−８−トリアジンの製造１０ｇの無水炭酸
ナトリウムを含む１００ｍ１の無水トルエンに平均分子
１４０００のモノメトキシポリエチレングリコール（日
本油脂社製）２０ｇを溶解し、１１０℃で３０分間加熱
した後、塩化シアヌル５００ｍｇを加え、２４時間、１
１０℃で加熱した。反応残留物を戸去し、石油エーテル
３００ｍ１を加えて、沈澱を生じさせ、その沈澱を数回
石油エーテルで洗浄し、２．４−ビス（０−メトキシポ
リエチレングリコール）−６−クロル−５−）リアジン
を１０ｇ取得した（収率５０％）。

参考例２゜モノメトキシポリエチレングリコールサクンニルーＮ−
ヒドロキシサクシンイミドエステルの合成充分脱水した平均分子ｆｆ１５０００のモノメトキシポ
リエチレングリコール（Ｌｉｎｉｏｎ　Ｃａｒｂｉｄｅ
社製）２０ｇ、無水コハク酸２ｇを無水トルエン５０ｍ
１に加え、１５０℃に加熱し５時間還流した。トルエン
を減圧下留去した残渣に塩化メチレン３０ｍ１添加し、
完全可溶化後、無水エチルエーテル４００−を加えて、
沈澱を生じさせた。この沈澱物を塩化メチレン：エチル
エーテル系（１：３容量比）で再結晶を行い、サクシニ
ル化モノメトキシポリエチレングリコール１０ｇ　（収
率約５０％）を得た。このサクシニル化物３．３ｇとＮ
−ヒドロキシコハク酸イミド１００ｍｇを無水塩化メチ
レン５ｍｌに可溶化し、水冷下ジシクロへキシルカルボ
ジイミド（ＤＣＣ＞２００ｍｇを添加後、室温下２０時
間攪拌した。生じたジシクロへキシルウレア（ＤＣＵ＞
を戸別し、ｐ液に　エチルエーテルを加えて沈澱を生じ
させた。得られた沈澱物を塩化メチレン：エチルエーテ
ル系で再結晶を行い、モノメトキシポリエチレングリコ
ール−サクシニル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエス
テル２．５ｇ（収率７２％）を得た。

参考例３゜第１表に示したアミノ酸配列を有するｈＧ−Ｃ５Ｆの１
１目のスレオニンをアラニンに、３番目のロイシンをス
レオニンに、４番目のグリシンをチロシンに、５番目の
プロリンをアルギニンに、１７７番目シスチンをセリン
にそれぞれ置換したｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体を以下のように
して得た。

上記のｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体をコードするＤＮＡを含むプ
ラスミドｐｃ　ｆ　ＢＤ２８を保有する大腸菌’ｖＶ３
１１０５ｔｒＡ株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　［１ＣｆＢ口２８ＦＥＲｊｌ　ＢＰ−１４７９）をＬ
Ｇ培地〔バタトトリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎ
ａＣｊ！　　５ｇ、グルコース１ｇを水１１に溶かし、
ＮａＯＨにてｐＨを７，０とする。〕で３７℃、１８時
間培養し、この培養液５ｍｌを２５μｇ　／　ｍ　ｌの
トリプトファンと５０ｇｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
ＭＣＧ培地（Ｎａ２８Ｐ０．０．６％、ＫＨ，Ｐｏ、０
．３％。

ＮａＣＡ　　０．５％、カザミノ酸０．５％、Ｍｇ５Ｏ
＜１　ｍＭ、　　ビタミンＢ＋　　４μｇ／ｍ！、ｐＨ
７，２）　　１００ｍｌに接種し、３０℃で４〜８時間
培養後、トリプトファンの誘導物質である３β−インド
ールアクリル酸（３β−１ｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ　
ａｃｉｄ、以下ＩＡＡと略す）を１０■／ｍｌ加え、さ
らに２〜１２時間培養を続けた。培養液を８．００　Ｏ
ｒｐｍ　、　　１０分間遠心して集菌し、３０　ｍＭ　
　Ｎ　ａ　Ｃｊ！　、　　３０　ｍＭトリス・塩酸緩衝
液（ｐ　Ｈ７，’　５　）で洗浄した。洗浄菌体を上記
緩衝液３０ｍ１に懸濁し、０℃で超音波破砕（ＢＲＡＮ
ＳＯＮ　５ＯＮＩＣＰＯＩ髪ＩＥＲＣＯＭＰＡＮＹ社５
ＯＮＩＰＩＥＲＣＥＬＬ　　ＤＩＳＲＵＰＴ［ｌＲ２０
０，０ＵＴＰＵＴ　　［：０ＮＴＲＣＩＬ２．　１０　
　分間処理）した。これを９．００Ｏｒρｍ、３０分間
遠心して菌体残渣を得た。この菌体残渣からマーストン
らの方法ＣＦ、Ａ０口０Ｍａｒｓｔｏｎら：バイオ・チ
クノロシイ　（ＢＩＯ／ＴＥＣＩＩＮＯＬＯＧＹ）　　
２．８００　（１９８４）］によりｈＧ−Ｃ５Ｆ誘導体
を抽出・精製・可溶化・再生した。

参考例４゜２．４−ビス（０−メトキシポリエチレングリコール）
　−６−（３−カルボキシブチルアミノ）−Ｓ−）リア
ジン（ＩＶａ）のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステ
ル（ｒＶ　ｂ　）の製造参考例１で得られた塩化物５０
０ＩＩ１ｇを無水テトラヒドロフラン９ｍ１２に溶解し
た。一方、ｒ−アミノ酪酸ｌｏｎｇ、）リエチルアミン
２８μｇを無水ジメチルアミド１ｍｌに溶解した液に上
記溶液を添加後、室温下１６時間攪拌した。次いで、減
圧乾固の後、塩化メチレン３０ｍｆ、１０ｍＭ’）ン酸
緩衝液（ｐＨ１０）１５ｍ＆を加え分配した。上層を２
ＮＨＣ１でｐＨ１にした後、塩化メチレン３０ｍ１を加
え、再び分配した。下層を分画し、無水硫酸す）　ＩＪ
ウムで乾燥後、戸別し、減圧濃縮を行い、上記カルボン
酸（ＩＶａ）　　１５０ｍｇ　（収率３０％）を（ｌた
。次いで乾燥したカルボン酸（ｒＶａ）　１５０ｍｇと
Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド３ｍｇを堵水塩化メチレ
ン１ｍｆ！に可溶化し、水冷下ジシクロヘキ。

ジルカルボジイミド（ＤＣＣ）６ｍｇを添加後、室温下
１２時間攪拌した。生じたジシクロへキシルウレア（Ｄ
ＣＵ）を戸別し、ｐ液にエチルエーテルを加えて、沈澱
を生じさせた。次いで、沈澱をρ別後、減圧乾燥し、目
的のエステル（ｒＶｂ）１００ｍｇ（収率６７％）を得
た。

実験例１゜化学修飾ｈＧ−Ｃ５Ｆ誘導体の比活性及びマウス白血病
細ＭＩＮＦＳ６０の増殖促進活性実施例３と同様の方法
で、ｈＧ−Ｃ３Ｆ！Ｓ導体と活性エステルを反応させ、
限外ｐ過膜を用いて未反応の活性エステルおよびその分
解物を除去した。同腹を用いて、ＰＢＳに内液の交換を
行い、得られた残液中の化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体の
Ｇ−Ｃ３Ｆ活性及びＮＦＳ６０細抱に対する増殖促進活
性［Ｋ、Ｌ、Ｈｏｌｍｅｓ、　ｅｔ　　ａｌ、、　　プ
ロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカテ′ミイ
・オブ・サイエンス　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、　　ｌｌ５Ａ　）８２、６６８７　（１
９８５）　］を測定し、結果を第５表に示した。

第５表ｈＧ−ＣＳＦ誘導体　　　　　　１００％　　　　１０
０％化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体は、マウス骨髄幹細胞
に対してあきらかにＣ５Ｆ活性を保持していた。さらに
、Ｇ−Ｃ５Ｆ依存性の増殖を示すＮＦＳ６０細胞に対し
ても増殖促進活性を有していた。

実験例２゜白血球（頚粒球）増加効果実験例１で用いた化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体をＣ３Ｈ
／Ｈｅ７ウス（雄、ｎ＝３）の皮下に単回または一日一
回６日間投与し、以下経時的に採血して末梢血中の白血
球（’ｖＶＢＣ）を計数した。

その結果を第６表（単回投与）及び第７表（連日投与）
に示した。

第６表　単回投与（皮下）時の白血球（Ｗ　Ｂ　Ｃ）散
策７表　６日間連日投与（皮下）時の白血球（ＷＢＣ）
敗ｈ（ｉ−［：ＳＦ誘導体　１　７９．３　　！１５．
５　　ｇ５．１　９１．２　７９．１　１１Ｂ、８ｈＧ
−［：ＳＦ誘導体＋０　１６３．０　２２１．５　２２
０．：ｌ　　２８９．３　２７３．０　２Ｂ４．０単回
投与では、投与後８時間をピークとする白血球数の増加
が認められたが、その後ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体では４８時
間でほぼ正常レベルに低下したのに対して、化学修飾ｈ
Ｇ−Ｃ３Ｆ誘導体では４８時間においても有意に高値の
白血球増加の持続効果を示した。

連日投与では、特に低用量投与群において、化学修飾ｈ
ＧＣ５Ｆ誘導体はｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体に比べてあきらか
に有意な白血球増加効果を示した。

実験例３゜血中濃度の推移実験例１で用いた化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体をＣ３Ｈ
／　Ｈｅ　７ウス（雄、ｎ＝３）の皮下に単回または連
日６回投与し、以下経時的に採血し血漿中のＧ−Ｃ５Ｆ
ａ度を測定した。その結果を第８表（単回投与）及び第
９表（連日投与）に示した。また、一部の実験では静脈
内に単回投与（第１０表）した実験も行った。

第８表　　単回投与（皮下投与）誘導体１０２４８．３７７２．７２７４４．５　２１４
．０　１６３Ｊ　　４９．７　　６．２注）ａ）　　ｈ
Ｇ−Ｃ３Ｆ蛋白として同一重量を投与した。

ｂ）　　ＮＦＳ６０細胞の増殖促進活性（Ｈａｌｆ　ｍ
ａｘ＝＝５０１１＞より算出した。

第９表　　連日投与（皮下投与）４゜８　　２．２　　ＮＴ、　　−リ　　−−１４，２
１１Ｊ　　ＮＴ、　　　４．７　　２．２　　２．２注
ａ）ｈＧ−Ｃ３Ｆ蛋白として同一重量を投与した。

ｂ）上役、投与後１時間での血中濃度下段、投与後２４時間での血中濃度ｃ）ＮＦＳ６０細胞の増殖促進活性（ｌｌａｌｆ　ｍａ
ｘ−５０ｕ）より見出した。

ｄ）　ＮＴ、　　（Ｎｏｔ　Ｔｅ５ｔｅｄ）ｅ）＝（検
出限界以下）第１Ｏ表　　単回投与（静脈内投与）誘導体　１０　１３０７　　１：１５６　　９０１　　
６３１Ｊ　　５６３　　３５５．８誘導体注　ａ）ｈＧ−Ｃ３Ｆ蛋白として同一重量を投与した。

ｂ）　　ＮＦＳ６０細抱の増殖促進活性（ｌｌａｌｆ　
ｍａｘ＝５０ｕ）より算出した。

単回投与（皮下）の場合、ｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体では１時
間をピークとして以下急速に血中濃度が低下したのに対
し、化学修＃ｈＧ−Ｃ５Ｆｌｉｌ導体では５〜７時間に
かけて徐々に血中濃度が上がり２４時間でも比較的高値
を維持した（第８表）。

一方、連日投与の実験では、１時間後血中濃度はいずれ
もｈＧ−Ｃ３Ｆ誘導体の方が高値であったが、２４時間
では低値であり、３日目以降は検出できなかった。これ
に対して、化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ、Ｉ導体では２４時間
後でも検出可能であり、かつｈＧ−Ｃ５Ｆ誘導体よりも
高値であった。

一方、静脈内投与の場合は、第１０表に示したように化
学修飾ｈＧ−Ｃ３ＦＸＮ導体の方があきらかに高い血中
濃度を示した。

実験例化化学修＃ｊｈＧ−Ｃ３Ｆおよび化学修飾ｈｃ−ｃＳＦ誘
導体の比活性及びマウス白血病細胞ＮＦＳ６０の増殖促
進活性（１）実施例２で得られた化学修飾ｈ（、−Ｃ３Ｆ（■
型）を用い、実験例１と同様の方法で比活性及び増殖促
進活性を測定した。結果を第１１表に示す。

第　　　１１　　　表（２）実施例４で得られた化学修飾ｈ　Ｇ　−ＣＳ　Ｆ
誘導体（■型）および実施例５で得られた化学修飾ｈＧ
−Ｃ３Ｆ誘導体（■型）を用い、実験例１と同様の方法
で比活性及び増殖促進活性を測定した。

結果を第１２表に示す。

第１２表：　　　　　未修飾体　１００％　　　　　　１００％
　　ｌ実験例５白血球（顆粒球）増加効果（１）実施例２で得られた化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ（■型
）（２，５μｇ／匹）をＢＡＬＢ／　Ｃマウス　（雄３
匹、対照群は４匹）の皮下に単回投与し、以下経時的に
採血して末梢血中の白血球（ＷＢＣ）数を係数した。そ
の結果を第１３表に示す。

第１３表　単回投与（皮下）時の白血球（ＷＢＣ）数（
２）実施例４でｉ５られた化学修飾ｈＧ−Ｃ５Ｆ誘導体
（１１１型）および実施例５で（）られた化学修飾ｈＧ
−Ｃ３Ｆ誘導体（■型）を２．５μｇ／匹用い上記（１
）と同様にして白血球（ＷＢＣ）数を計数した。

その結果を第１４表に示す。

第１４表　単回投与（皮下）時の白血球（＋−１［Ｉ　
Ｃ）敗発明の効果本発明の化学修飾ｈＧ−Ｃ３Ｆ及び化学修飾ｈＧ−Ｃ５
Ｆ誘導体は、末梢白血球（顆粒球）の増多効果が増大さ
れ、血中での安定性及び持続性が向上しており、凍結乾
員製剤として安定性が向上しているので、治験薬として
有利に使用できる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペ
プチドの分子中の少なくとも１個のアミノ基に式（ I
）で表される基を結合してなる修飾ポリペプチド。式▲数式、化学式、表等があります▼（ I ）式中Ｒ＿１はアルキル基またはアルカノイル基、ｎは任
意に変わりうる正の整数、ＸはＯ、ＮＨまたはＳ、Ｒ＿
２は▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中Ｒ＿３はＯＨ、Ｃｌ、Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ＿２Ｏ）
＿ｎ−Ｒ＿１（式中Ｒ＿１、ｎは前記と同意義を表す）
を表し、Ｙは存在しないか、またはＺ−（ＣＨ＿２）＿
ｐＣＯ（式中ＺはＯ、ＳまたはＮＨを表し、式中ｐは任
意に変わりうる正の整数を表す）を表す〕または（ＣＯ
）＿ｍ−（ＣＨ＿２）＿ｌＣＯ（式中、ｍは０または１
、ｌは任意に変わりうる正の整数を表す）を表す。
（２）請求項１記載の修飾ポリペプチドを含有する凍結
乾燥標品。
（３）請求項１記載の修飾ポリペプチドを含む白血球細
胞増殖促進剤。
（４）下式で示される新規カルボン酸 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１、ｎおよびＸは前記と同意義を表し、Ｚは
Ｏ、ＳまたはＮＨを表し、ｐは任意に変わりうる正の整
数を表す）