JPH01290698A - 抗ストレプトリジンｏ モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、溶血性連鎖球菌（以下、溶連菌と省略する。

）の産生ずる溶血性毒素であるストレプトリジン０（以
下、ＳＬＯと省略する。）の非溶血活性部位を認識する
モノクローナル抗体に関する。

（従来の技術） ＳＬＯに対する抗体（以下、ＡＳＯと省略する。）は従
来の動物血液由来の抗血清、あるいはＢ細胞（抗体産生
細胞）ハイプリドーマ法の確立により、ハイプリドーマ
由来のモノクローナル抗体も取得されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、通常動物血液由来の抗血清を取得するた
めには、毎回多量の免疫抗原であるＳＬＯを必要とする
。さらに、またこの免疫抗原用のＳＬＯの精製が困難で
あるため、粗精製のものが使用されることが多く、取得
される抗血清は、ＳＬＯ以外の夾雑物質との反応性があ
る場合があり、特異性に欠ける等の問題が生じている。

また、ＳＬＯに対するハイプリドーマ由来のモノクロー
ナル抗体である抗ＳＬＯモノクローナル抗体（以下、Ｍ
Ａｂと省略する。）も取得されているものの、かならず
しもそれらの性質について明らかにされていない。

（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らは、特異性の高い数種のＭＡｂを得、
諸性質について検索し、更にその有用性について検討し
た。その結果、非溶血活性部位を認識するため溶血阻止
能が無いＭＡｂをＳＬＯの精製に供した場合等に、他の
　ＭＡｂと異なる利点を有することを見出し、本発明を
完成するに到った。

以下、本発明のＭＡｂについて、１．ＭＡｂ産生細胞株
の作製およびｎ、ＭＡｂの諸性質の検索の段階について
説明する。

ｉＭＡｂ産生細胞株の作製 ＭＡｂ産生ハイブリドーマの作製は、Ｋｏｈ　１ｅｒＧ
、と旧１ｓｔｅｉｎ　Ｃ，（Ｎａｔｕｒｅ、２５６４９
５．１９７５）らの方法に準じて行う。免疫抗原として
ＳＬＯを用い、この免疫抗原を哺乳動物に投与して作製
した免疫動物由来のＢ細胞を、哺乳動物の骨髄腫細胞と
融合させてハイブリドーマを作成する。次いで、抗体産
生細胞を限界希釈法に従い、目的とする抗体の産生株を
クローニングする。そして、得られたＭＡｂ産生細胞株
を増殖培養、継代培養および保存する。

本性において、免疫抗原としてのＳＬＯは、公知の各種
のもの、例えば文献等に記述のものやこの記述に準じて
得られるＳＬＯを含有する培養液、粗精製品および高度
精製品のいずれも使用できる。

この際、Ｓ’ＬＯ産生最産生−溶連菌としてＡ群溶連菌
３型および６型が産生株として好適に用いられる。溶連
菌培養用培地としては通常用いられているＴｏｄｄ　−
１１ｅｗｉ　Ｌｔ　Ｂｒｏｔｈ培地およびＢｒａｉｎ　
−１１ｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ培地等が好適である。

また、免疫抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限
定されないが、細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合
性を考慮して選択するのが好ましい。

一般には、ネズミ科のラットおよびマウスが好適に用い
られる。免疫は一般的方法により行う。哺乳動物の静豚
内、皮内あるいは腹腔内注射でよい。

免疫抗原の投与量は、免疫動物の種あるいは抗原の精製
度により異なる。ネズミ科の場合は、場合によってはア
ジュバントと併用して蛋白質として１０〜５００μｇを
数回投与する。その後、抗体価の上昇が確認された免疫
動物の肺細胞を最終投与の約３日後に摘出してＢ細胞を
得る。

また、上記Ｂ細胞と融合される他方の親細胞の哺乳動物
の骨髄腫細胞としては、既に公知の細胞株あるいは細胞
銀行より入手しやすい細胞株を用いればよい。この際、
マウスではＳＦ３系、Ｎ５−１系およびＰ３Ｕ１系が入
手が容易である。またラットではＹ３系等を使用するこ
とができる。

上記Ｂ細胞と骨髄腫細胞との融合反応は、公知の方法に
従って行う。この際、融合促進剤の存在下に通常の栄養
培地中で行い、融合促進物質としては、例えばポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ
）等を用いればよい。

また、Ｂ細胞と骨髄腫細胞の融合の際の混合比は、通常
の方法と変りがなく、例えば骨髄腫細胞に対し、Ｂ細胞
を約１〜１０倍程度用いればよい。次いで、Ｂ細胞と骨
髄腫細胞をよく混合したものに、融合促進物質を添加す
る。この際、ＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１　、００
０〜６，０００程度のものを、通常約３０〜６０ｗ／ｖ
％の濃度で加えて混合させる。以後、適当な培地で洗浄
する。

ハイブリドーマを選択するために、通常の選択用培地、
例えばＨＡＴ培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジンを含む）で培養することにより行う。培養
期間はハイプリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅
するのに充分な期間であって、通常数日〜数週間行なえ
ばよい。

ハイブリドーマは、まず下記に示す方法で検索した抗体
産生細胞について、限界希釈法でクローニングする。次
いで目的とする抗体産生株を下記に示す方法で検索する
。クローン化されたＭＡｂ産生細胞株はまず試験管内培
養で増殖させ、目的とするＭＡｂを得る。大量のＭＡｂ
を得る場合は試験管内の外、動物体内でＭＡｂ産生細胞
を増殖させるのもよい。

抗体産生陽性細胞の検索は、一般に抗体の検出に用いら
れている方法に従って行う。ＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｓｈ、
　ｏｆ　Ｅｎｚｙｎｏｌ、、　　７０．　４１９〜４３
９゜１９８０）　、プラーク法、スポット法、凝集法、
ＲＩＡ法等を用いることができる。この際、ＡＳＯであ
ることは、免疫抗原等の反応性でみればよい。

ＡＳＯ産生細胞株を限界希釈法でクローニングし、ＭＡ
ｂ産生細胞株とする。

ＭＡｂ産生細胞株からのＭＡｂの採取は、常法に従って
行なえばよく、試験管内増殖の場合は、その培養上清か
ら、また動物体内増殖の場合は細胞株をこれを適合性の
ある哺乳動物に投与し、その腹水として得る方法等が採
用される。

また上記により得られる抗体は更に、塩析法あるいはカ
ラムクロマトグラフィ等の通常の精製手段により精製す
ることもできる。

なお、ＭＡｂ産生細胞株は用事に具えて液体窒素で凍結
保存も可能である。

ｎ、ＭＡｂの諸性質の検索 ＭＡｂ産生細胞株の培養液中のＭＡｂの抗体の諸性質（
以下、Ａ３０価と省略する。）を、通常血清学用いられ
ている方法等に準じて行う（臨床検査法提要、改訂２９
版、　１１８０〜１１８２金原出版株式会社等参照）。

その際、■間接凝集法および■溶血阻止法によるＲａｎ
　ｔｚ　−Ｒａｎｄａ　Ｉ　Ｉ法の２方法で検索する。

■　間接凝集反応法によるＡ３０価の測定の場合は、Ｍ
Ａｂ産生細胞株培養液を用いて、培養液中の抗体による
反応を、′ａ集像で判定する。その際上記文献に報告さ
れている方法の外、市販のＡ３０価測定用キットを用い
てもよい。判定は凝集像の有無で行う。

■　Ｒａｎ　ｔｚ　−Ｒａｎｄａ　Ｉ　ｌ法によるＡ３
０価の測定の場合は、ＭＡｂ産生細胞株培養液を用いて
、培養液中の抗体によるＳＬＯ中和反応を行ない、溶血
阻止法によって抗体価を測定する。その際、ＳＬＯは市
販の溶連菌培養濾液より精製して、凍結乾燥しｋものを
溶解して用いてもよい。また、ＳＬＯの標的となる赤血
球はヒトまたはウサギ血液を低濃度に調整したものを一
定量反応液に加える。判定は赤血球が溶血を示さない検
体の最高希釈倍数をもってＡ３０価（Ｔｏｄｄ単位）と
する。

本発明のＭＡｂはＭＡｂの諸性質の検索の結果では、凝
集反応はみられるが、溶血阻止法では活性が無いもので
ある。なお、本発明のＭ　Ａ　ｂはＳＬＯの精製の他、
溶連菌感染症の臨床検査に用いることができる。

（作　用） 本発明のＭＡｂは、ＳＬＯの非溶血活性部位とのみ特異
的に反応する。このことは、抗原−抗体反応を応用した
イムノアフィニティークロマトグラフィーによる精製に
本ＭＡｂを供した場合にＳＬＯの溶血活性の温存された
ＳＬＯを得ることが出来る。また溶血阻止性以外のＡ３
０価の測定に用いることが出来る。

（実施例） 実施例 抗原調製：Ａ群溶連菌３型をＴｏｄｄ　−Ｈｅｗｉｔｔ
Ｂｒｏ　ｔｈ培地を用いて８時間培養後、遠心分離によ
り除菌し、更にフィルター濾過により完全に除菌した。

次いで、ＳＬＯを含む培養上清を５０％硫安塩折し、遠
心分離の沈査を０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐｌ＋６．
８）に溶解し、粗精製ＳＬＯを得た。

ＭＡｂ産生細胞株：粗精製ＳＬＯを蛋白質として１００
μｇをマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）腹腔内に注射し、３週間
後さらに５０μｇ腹腔内注射した。Ａ３０価の上昇を、
粗精製ＳＬＯ感作赤血球との凝集能で確認後、マウス肺
臓を摘出し、Ｂ細胞を得た。

Ｂ細胞とミエローマ細胞（Ｂａｌｂ／　ｃ、　ＮＳ　−
１系）をポリエチレングリコール（平均分子Ｌ　５．０
００）を用いて融合後、ＨＡ　Ｔ選択培地中で増殖させ
た。

抗体産生ハイブリドーマであることを培養上清を用いて
ＩＥＬＴＳＡ法による確認後、さらにクローニングし、
ＭＡｂ産生細胞株とした。

ＭＡｂ諸性質の検索：ＭＡｂ産生細胞株培養上清につい
て、Ａ３０価を■間接凝集法および■溶血阻止法で検索
した。その結果、■間接凝集法で凝集能を示すが、■溶
血阻止法では活性が異なる数種のＭＡｂ産生細胞株を得
た（第１表）。

第１表　ＭＡｂ産生細胞株培養上清中のＡＳＯの性質表
中、−は陰性、＋は陽性、＋＋は強拍性、また十′は弱
陽性。※はＲａｎｔｚ−Ｒａｎｄａｌｌ法によるＬＳＯ
中和反応における抗体価（Ｔｏｄｄ単位）およびその段
階。

ＭＡｂの精製：ＭＡｂ産生細胞株の各々をマウス（Ｂａ
ｌｂ／ｃ）腹腔内に５Ｘ１０’個注射し、１週間後ＭＡ
ｂを含んだ腹水を得た。各々のＭＡｂを含む腹水を５０
％硫安塩折後、沈査をさらにＤＥＡＥイオン交換クロマ
トグラフィーにより精製した。

以下に参考例を示して、実施例で示した種々のＭＡｂを
更に具体的に説明する。

（参考例） ＭＡｂを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィ
ｍ： 数種のＭＡｂの各々を蛋白質として２−５■を支持体の
ボルミルセルロファイン１１１１１ゲル当りに結合させ
、カラムに充填した。吸着用緩衝液に０、０２　Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，Ｏ）を用い、粗精製ＳＬＯを蛋白質
量として３〜６ｍｇ吸着させた。次いで、吸着用緩衝液
を用いて未吸着の夾雑物を洗浄後、グリシン−塩酸酸液
（ｐＨ２，８）を用いて溶出した。溶出液を６Ｍグアニ
ジン−塩酸溶液と０．１Ｍリン酸緩衝液で処理した。

溶血阻止活性の差異による種々のＭＡｂを以下の３分類
し、イムノアフィニティ精製用に供した場合の結果を示
す（第２−ａ表、第２−ｂ表、第２−ｃ表）。３分類は
、■細胞株夏由来　ＳＬＯの非溶血活性部位を認識する
ＭＡｂ（以下、非溶血阻止性ＭＡｂと省略する。）、　
■細胞株■由来　ＳＬＯの非溶血活性部位を認識するが
、溶血活性部位も僅かに抑制するＭＡｂ（以下、弱熔血
阻止性ＭＡｂと省略する。）および　■細胞株■−１由
来ＳＬＯの溶血活性部位を認識するＭＡｂ（以下、溶血
阻止性ＭＡｂと省略する。）とする。

第２−ａ表　非溶血阻止性ＭＡｂによるＳＬＯの精製※
はＨｅｍｏｌｙｔｉｃ　Ｕｎｉｔ 第２−ｂ表　弱溶血阻止性ＭＡｂによるＳＬＯの精製筒
２−ｃ表　溶血阻止性ＭＡｂによるＳＬＯの精製非溶血
阻止性ＭＡｂによるＳＬＯの精製は、比活性も高＜　　
（６６，２００ＨＵ／■蛋白質）、また収率も７２％と
高値を示す。また弱溶血阻止性ＭＡｂの場合もその比活
性は次に高＜　　（４７，３００ＨＵ／■蛋白質）、収
率も３０％にとどまるものの、非溶血阻止性ＭＡｂ同様
に良い結果が得られる。しかしながら、溶血阻止性ＭＡ
ｂの比活性は低く（９，３００ＨＵ／■蛋白質）、さら
に収率も７％と低値を示す。

（発明の効果） 溶血阻止法による活性の差異に基づ＜ＭＡｂをＳＬＯの
精製に供した場合に、いずれを使用しても特異性の高い
ＳＬＯが得られる。しかしながら、使用されたＭＡｂの
差異に依存して、得られるＳＬＯの生物活性は異なり、
また収率も著しく異なっている。

すなわち、本発明である、ＳＬＯの非溶血活性部位を認
識するＭＡｂは、ＳＬＯの生物活性をよく保存する状態
で結合するという性質を示すので、ＳＬＯの精製あるい
は溶連菌怒染症の臨床診断への応用等に供された場合に
有意な効果を示す。

特許出願人　富士レビオ株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ストレプトリジンＯの非溶血活性部位を認識することを
   特徴とする抗ストレプトリジンＯモノクローナル抗体。