JPH01258627A - 組換え体肝炎抗原の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願はケース番号１６９９８ＩＡ、出願番号第６，３
６．５１４号（出願日１９８４年８月１日）及びケース
番号１７４７５、出願番号第０１９．８２０号（出願日
１９８７年２月２７日）及びケース番号１７５２１に関
連するものである。

Ｂ型肝炎表面抗原は、それ以後のＢ型肝炎ウィルスの感
染による病理学的影響に対する免疫というものを与える
糖タンパクータンパク複合体をよく生じる。ワクチン接
種を目的とした抗原の安全、迅速かつ安価なる製造に対
する供給源は、これまで通常２２ｎｎ＋の粒子を形成し
ている、必要な抗原を大量に作り出していた患者の血清
あるいは血漿に限られていた。しかし組換えＤＮＡ技術
の出現に伴ない、表面抗原をコードしているＤＮＡが酵
母、大腸菌、あるいはその他の細胞系へ挿入され、発現
される様になった。得られるポリペプチド産物は挿入Ｄ
ＮＡの発現に使用される宿主あるいは細胞系と同様に挿
入されるＤＮＡの構築によって実質的に変化しうるちの
である。

ＨＢウィルス粒子は、コアタンパク及びエンベロープあ
るいは表面（“Ｓ”）タンパクなる２種類の構造タンパ
クグループより構成されている。

ウィルスの主要な表面抗原であるという事に加え、すな
わちゾーン粒子、′Ｓ″タンパクはオーストラリア抗原
の唯一の構成要素であり、あるいは２２ｎｍの粒子であ
る。“Ｓ”タンパクは血清型に依存し、３８９から４０
０個のアミノ酸をコードしているラージオーブンリーデ
ィングフレーム（ＯＲＦ）からの翻訳産物である。この
ＯＲＦは３つの領域に分けられており、それぞれが、イ
ンビボにおける翻訳開始部位となる機能を持つＡＴＧコ
ドンより始まっている。これらの領域はｐｒｅ　−５ｌ
ｃｉｏｓから１１９個のアミノ酸）、ｐｒｅ　−５２（
５５個のアミノ酸）及び５（２２６個のアミノ酸）とし
て、遺伝子の５′から３′への配列に従がって表示され
ている。このＯＲＦからの６個の産生タンパクを以下に
成分とともに示す。

１）　ｇｐ４２　　（４２，０００ダルトンの糖タンパ
ク）＝　ｐｒｅ−Ｓｌ／Ｓ２／Ｓ　　（これはｐｒｅ−
５ｌはｐｒｅ　−８２に、又ｐｒｅ　−Ｓ２はさらにＳ
へと隣接している事を意味するものである）、 ２）ｐ３９　　（ｐ＝タンパク）　　＝　ｐｒｅ−５ｌ
／Ｓ２／Ｓ　。

３　）　ｇｐ３６　＝　ｐｒｅ−５２／Ｓ　（グリコシ
レージョン部位を２つ持つ）、 ４　）　ｇｐ３３　＝　ｐｒｅ−Ｓ２／Ｓ　（グリコシ
レージョン部位を１つ持つ）、 ５）ｇｐ２７＝Ｓ（グリコシレージョン部位を１つ持つ
）、 ６）ｐ２４＝ｓ。

ＨＢＶゾーン粒子中においては、６個のタンパクすべて
がほぼ等モル存在している。しかし２２ｎｍ粒子中にお
いては、４個の小さなタンパクがほぼ等モル存在してい
るだけで、ｇｐ４２及びｐ３９については、せいぜい粒
子あたり１モルか２．３モルにしかすぎない。ｐｒｅ　
−Ｓｌ及びｐｒｅ　−Ｓ２領域はＳ領域の分泌を促進さ
せる機能をもっている。このタンパクに関する根本的特
性についての参考用資料として、次の文献がある。チオ
ライス、ビー。

（Ｔｉｏｌｌａｉｓ、Ｐ、）等、サイエンス、第２１３
巻、第４０６頁、（１９８１）、及びミリチ、デイ−。

アール、（Ｍｉｌｉｃｈ、Ｄ、Ｒ，）等ブロク、ナトル
、アヵド。

サイ、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）
、第８２巻、第８１６８頁（１９８５）。

Ｂ型肝炎抗原のｐｒｅ−３２領域は約５５ＡＡ（アミノ
酸）残基より構成されている。この存在がインビボにお
けるＳタンパクの抗原決定基よりも免疫原性のある主要
な抗原決定基を提供するものであり、ニューラス、ニー
、アール、　（Ｎｅｕｒａｔｈ、Ａ、Ｒ，）等、サイエ
ンス、第２２４巻、第３９２頁（１９８４）、ニューラ
ス、ニー、アール、等、ネイチャー、第３１５巻、第１
５４頁（１９８５）、及びミリチ。

デイ−、アール、等、上記記載、などに報告されている
。　　ｐｒｅ−Ｓ２ポリペプチドは重合ヒト血清アルブ
ミン（Ｐ）ＩＳＡ）に対するリセブター様特性をも持ち
、ＰＩＩＳＡと結合すると知られている肝臓細胞が所有
している特性でもあり、マチダ、ニー。

（Ｍａｃｈｉｄａ、Ａ、）等、ガストロエンテロロジー
（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）　、第８６巻、
第９１０頁（１９８４）に報告されている。

表面抗原中におけるｐｒｅ　−Ｓ２配列の存在は、免疫
処置の目的に際して好ましい特性であることから、゛ｐ
ｒｅ−５ｔ／Ｓ２／Ｓタンパク及び他の異なるタンパク
を発現する発現系というものが開発されている。例えば
米国出願番号筒８２４，４０５号、１９８６年１月３１
日出願参照。

本発明の方法は酵母細胞膜由来のＢ型肝炎つィルス組換
え体表面抗原（ｒｌｌｂｓＡｇ）の選択的抽出に関する
ものであり、次に可溶化するものである。

部分的精製ｒＨｂｓＡｇ沈殿物は尿素及びＤＴＴとの併
用及び同時使用による処理によって可溶化される。

酵母及びその他の発現、系由来のｒ　Ｈｂ　ｓ　Ａ　ｇ
精製過程において沈殿物形成あるいは他の不溶性物の存
在が、たびたび生ずる。本発明は肝炎関連疾患に対する
より良好かつ安価なワクチン製造目的に際して、その様
な形成された沈殿物を溶解し、精製する方法を提供する
ものである。

部分的精製組換え体表面抗原の選択的抽出及び可溶化に
ついての技術的利点には高度の産生量及び精製純度の獲
得が含まれている。そして、その上回溶化生成物はより
安定である。選択的抽出及び可溶化の技術は迅速かつ前
便である。組換え体形成のための供給源、たとえば酵母
の構成成分は従来の供給源、たとえば血清とは異なるた
め、組換え体タンパクの精製には新たらしい方法あるい
は、これまでの方法における新たらしい組合わせがしば
しば必要となってくる。古典的あるいは他の通常的供給
源由来のタンパクの分離に対して有効な方法についての
知識やノウ−ハウを基礎としたのでは、組換え体細胞培
養由来のタンパクの分離に対してどの様な方法が有効で
あるか予測はしにくいものである。ワクチン調製を目的
とした精製過程には、その産物において、これまでとは
異なった純度というものが必要であり、公知の技術にお
いては、予期出来ない他の方法が必要である。

同様な考え方として、米国特許第４，６２４．９１８号
参照。

本出願において組換え体ｐｒｅ−３ｔ／Ｓ２　　Ｂ型肝
炎抗原、あるいはその部分的抗原の実質的精製方法を以
下のステップにより表わした。

ａ）抗原結合酵母膜の抽出、 ｂ）ステップ（ａ）の抽出における細胞片の遠心による
除去、 Ｃ）不必要な酵母膜結合タンパク質のａ離に効果的な溶
液存在下で上清液をダイアフィルトレーション（ｄｉａ
ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）にかけ、その後当該不必要酵母
結合タンパク質を除去し、保留生成物としての洗浄済み
酵母膜を作成、 ｄ）ステップ（ｃ１の保留生成物を膜結合表面抗原の遊
離に効果的な第２の溶液と混合、 ｅ）ステップ（ｄｌで遊離された表面抗原を、ダイアフ
ィルトレーション膜に対する当該表面抗原の通過を促進
する第３の溶液を用いたダイアフィルトレーションにか
け、濾液として獲得、ｆ）当該濾液を可溶化するのに効
果的な還元剤の存在下で濾液を若干量の変性剤で処理、
及びｇ）変性剤及び還元剤を除去し、実質的精製された
組換え体ｐｒｅ−Ｓｌ／Ｓ２／Ｓ　Ｂ型肝炎抗原あるい
は、その部分的抗原の作成よりなるステップで表わされ
ている。これらの方法による生成物は免疫学的能力を持
ちＢ型肝炎に対するワクチンとして有効である。

比活性：免疫学的に反応しうるｓＡｇと総タンパクとの
重量対重量の比率 へへ　　　アミノ酸 ＤＴＴ　　　ジチオスレイトール ＨＤ、。　　５０％有効量 １１ｉＤＴＡ　　　エチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム塩 Ｌ　　　リッター Ｍｒ　　　　移動度 １　　　分子量 ＮＭＷ　　　名目上の分子量カットオフＰＨ５Ａ　　　
重合ヒト血清アルブミンＰＢＳ　　　リン酸緩衝生理食
塩水、０．１５Ｍ　Ｎａ（Ｊを含む７ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐｌ（約７．２ ＰＭＳＦ　　　フン化フェニルメチルスルホニルｐｓｉ
　　　平方インチあたりのボンドｒＨｂｓＡｇ　　組換
え体Ｂ型肝炎表面抗原Ｓ　　　表面 ５Ｏ５−ＰＡＧＥ　　ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動： 本発明の方法には酵母膜由来のｒＨｂｓＡＨの選択的抽
出、その次の変性剤及び還元剤との併用処理による可溶
化という酵母抽出物由来の組換え体Ｂ型肝炎表面抗原（
ｒＨｂｓＡｇ）の精製方法を包含する。

本発明の新規精製方法が、組換え体Ｓタンパクあるいは
組換え体ｐｒｅ−５ｌ／Ｓ２／Ｓタンパクを含む、ｒＨ
ｂｓＡｇの発現という領域に対して適応しうるものであ
ることが理解されるであろう。一つの根本的実施例とし
て酵母細胞により生成されるｒＨｂｓＡｇがある。この
系はＳあるいはｐｒｅ−５ｌ／Ｓ２／Ｓアミノ酸配列を
発現する。Ｓタンパクあるいはｐｒｅ−３Ｌ／Ｓ２／Ｓ
タンパクにおける他の変異アミノ酸配列に対する精製方
法も本発明中に含まれる９本発明の方法は、本発明の原
理に従ってｐｒｅ−３ｌ／Ｓ２／Ｓタンパク変異体と同
様にＳタンパク変異体の精製に対して迅速かつ効果的な
方法を提供する事を目的としている。例えば、アミノ酸
配列中における保存性のある置換〔ティラー、ダブル、
アール、　（Ｔａｙｌｏｒ、Ｗ、Ｒ，）、ジエイ、　モ
ル、　ｒ：イオル。

（Ｊ、Ｍｏ１．８ｉｏ１）、第１８８巻、第２３３頁（
１９８６）の第１図において明らかにされている〕とい
・うちのは、一般的に本発明の原理及び実施におけるい
かなる実質的あるいは新規な改良をもたらすものではな
い。

肝炎表面抗原の保存性のある置換として知られているも
のについては、エルファジー、イ。

（Ｅｌｆａｓｓｉ、　Ｅ）等、ジェイ、七オル、パイオ
ル。

、　（Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、）　、第１２１巻、
第３７１頁（１９８６）参照。また別なものとして、Ｓ
、ｐｒｅ　　Ｓｌあるいはｐｒｅ　−Ｓ２領域における
欠損についても、本明細書中における精製方法のいかな
る改良をも、一般的には、必要としないであろう。

もしｒｌｌｂｓＡｇ、　　ｐｒｅ−５ｌ／Ｓ２／Ｓタン
パク、表面抗原、あるいはその部分的抗原が、Ｓタンパ
ク、２２ｎｍ粒子、オーストラリア抗原、ゾーン粒子あ
るいはその他自然界に存在する肝炎表面抗原配列を持つ
ものに対して特異的な抗体と免疫学的に反応するのなら
ば本願におけるｒ）！ｂｓＡｇ、、ｐｒｅ−Ｓｌ／Ｓ２
／Ｓタンパク、表面抗原あるいはその部分的抗原は、保
存性のある置換、欠損、あるいは他の作用を受けたもの
であろうと、そのアミノ酸配列中においである種の変異
を含んでいる事は、よく知られている所である。

酵母による発現系の多くは、ｒ　ｌ（ｂ　ｓ　Ａ　ｇの
供給源として明らかに適切である。本明細書で使用され
ているニス、セレビシェ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖ　ｉｓ　
１ａｅ）発現系は酢に１つの臨時的な供給源を意味する
ものである。

その他の酵母のベクターとして、シャトルベクター、コ
スミドブラスミド、キメラプラスミド及び２−ミクロン
環状プラスミド由来の配列を含むベクター等を限定する
ものではない。種々のプロモーターや、その他の酵母に
おける転写制御配列は、ＧＡＬＩＯあるいはα接合因子
を含み、表面抗原をコードしている挿入ＤＮＡ配列の発
現に使用される。

サツカロミセス属にはいろいろな種があり、最も一般的
に使用されるものとして、サツカロミセスセレビシェ（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｅｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
　、あるいはパン酵母などがあり、種々の外来性ポリペ
プチドに関する組換え体ＤＮＡ媒介発現における宿主と
して働く。しかしながらサツカロミセス属における他の
種との相違関係については、あまりよく明らかにされて
いない。これらの種の大部分はニス・セレビシェとの交
配が可能であり、ニス・セレビシェがもっているプロモ
ーターと類似のあるいは同一の制御プロモーターを所有
しうるものであり、ＧＡＬ　１０．ＡＤＨ２、ＧＡＰ及
び／あるいはα接合因子プロモーターに限定されるもの
ではない。よってｐｒｅ　−Ｓ−含有ポリペプチドの発
現に対して、宿主株の選択範囲をサツカロミセス属の他
の種にまで広げられかつ、カルスベルゲンシス（ｃａｒ
ｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）　、ラバラム（ｕｖａｒｕｍ
）、ローキジ（ｒｏｕｘｉｉ）　、モンタナス（ｍｏｎ
ｔａｎｕｓ）、クロイベリー（Ｋｌｕｙｖｅｒｉ）　、
エロンギスボラス（ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ）、ノル
ベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）　、オビホルミス（ｏ
ｖｉｆｏｒｍｉｓ）及びシアスタテイカス（ｄｉａｓｔ
ａｔｉｃｕｓ）に限定されるものでない事は当業者にと
っては明白である。

幾つかの酵母属、例えばハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ）、カンジダ（ｃａｎｄｉｄ、ａ）　、）ルロブシス
（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びビヒア（Ｐｉｃｈｉａ
）などは増殖に際して唯一の炭素源としてメタノールを
有効に使用する同様の代謝経路を持つ事が示されている
。この代謝経路に関与している酵素であるアルコールオ
キシダーゼの遺伝子がピヒアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ
　ｐａｓｔｏｒｉｓ）より分離されている。ビー、バス
トリスのアルコールオキシダーゼプロモーターが分離さ
れしかもメタノール誘発による発現に対して感受性であ
る事が示されている。この様な誘発可能なプロモーター
は酵母中において選択性の得られないポリペプチドの発
現に対して有効である。特にこのプロモーターは粒子形
態をとるビー・バストリス中のＳ領域の誘発的発現に対
するプラスミドにおいて活動的であるとされている。こ
の所見により強調されるのは、免疫学的形態をとるＳポ
リペプチドの組換え体ＤＮＡ媒介発現に対する宿主とし
て機能する、他の酵母属の能力である。それ故、ｒＨｂ
ｓＡｇの発現に対して、宿主株の選択範囲をサソカロミ
セタシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）科
の他の酵母属の種や、クリプトコツカシェ（ｃｒｙｐｔ
ｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）科の種に至るまで広げられ、ビ
ヒア、カンジダ、ハンゼヌラ、トルロプシス、クロイベ
ロマイセス及びサフカロミコブシス（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｏｐｓ　ｉｓ）に限定されるものでない事は当業
者にとって明白である。

肝炎表面抗原の精製方法には、その表面抗原の過度の不
安定性や、崩壊がつきものである。この問題点を解消す
る為に、溶媒に代表的な緩衝作用をもたせ、さらにＰＭ
ＳＦ及びＥＤＴＡなどの様なプロテアーゼインヒビター
を含ませた。更にタンパク分解を抑えるためには、すべ
ての精製段階を約４℃において行なう事が好ましい。

本発明の方法及び手順において適切な代表的プロテアー
ゼインヒビターが含まれているが、金属キレート剤、重
金属イオン、ＳＨ保護剤、プロテアーゼの基質様化合物
、プロテアーゼ阻害ポリペプチドに限定されるものでは
ない。

幾つかの有効なプロテアーゼインヒビターを以下に示す
と、 Ａ’ｇ〜、ｌＩｇ“、Ｃｕ−及び他の重金属イオンアン
チスロンビン■ アンチスロンビン■−ヘパリン α１−アンチトリプシン アプロチニン 塩基性アミノ酸 ベンズアミジン ベスタチン α、α１−ビピリジル、Ｎａ−フロライド４−プロモー
フェナ°シルブロマイド ニワトリ卵白トリプシンインヒビター キモスタチン クエン酸 システィン ４−ジニトロフェノールリン酸ジエチル叶Ｐ（ジイソプ
ロピルホスフォフルオリデート）ＴＴ Ｅ−６４（ベーリンガーマンハイム） ＥＤＴＡ及び他のキレート剤 ホルムアルデヒド グアニジニウムクロライド ヘパリン ヒルジン ４−ヒドロキシ水銀ベンゾエート ヨードアセトアミド ヨード酢酸 ロイペプチン α２−マクログロブリン メルカプトエタノール ｐ−水銀ベンゾエート 塩化水銀（ＩＩ） α−ミクログロブリン α−Ｎ　−（ｐ−ニトロベンジル−オキシカルボニル）
−Ｌ−アルギニルクロロメチルケトンオキサレート ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含む
種々の供給源からのペプスタチン １．１０−フェナンスロリン ２−フェナンスロリン フェノチアジン−Ｎ−カルボニルクロライドホスフォル
アミトン ＰＭＳＦ プリロホスフエート ＳＨ保護剤 硝酸銀 ソイビーントリプシンインヒビター フッ化ｐ−１ルエンスルホニル ＴＰＣＫ　（Ｌ　−１−クロロ−３−（４−トシルアミ
ド）−７−アミノ−２−へブタノン−塩酸塩〕トリトン
Ｘ−１００及び低濃度における他の界面活性剤 ＴＰＣＫ（Ｌ−１−クロロ−３−（４−）シルアミド）
−４−フェニル−２−ブタノン〕 鶏卵由来トリプシンインヒビター ＺＰＣＫ　（ベンジルオキシカルボニル−し−フェニル
アラニン）などがある。

上記記載のインヒビターを１つ、あるいは幾つかを含ん
だ緩衝溶液は表面抗原の精製方法における、１つあるい
は幾゛つかの段階で適用されうるちのである。

ｐｒｅ−５ｌ／　Ｓ２／　Ｓタンパク１．Ｓタンパク、
あるいはその変異種タンパクをコードしている発現ベク
ターによりトランスホームされた酵母細胞を増殖し補集
した。もし細胞を保存するのならば、ＰＢＳの様な緩衝
液で細胞を洗浄し、細胞ペーストとして保存する。代表
的な方法としてその細胞ペーストは液体窒素中において
凍結保存される。

代表的な精製手順を以下に示す。凍結細胞ベーストの１
バツチを融解し、タンパク分解阻害剤を含む２ｍＭ　Ｐ
ＭＳＦ含有ＰＢＳ、あるいは高張リン酸緩衝液などの緩
衝液により懸濁する。細胞は、機械的に破砕した方が好
ましい。細胞破砕の際のゆるやかなビーズ破壊法は大量
処理には不適当である。細胞破壊機による破砕が、その
迅速な操作により最も好ましい方法である。

酵母細胞分解により粗抽出を行なう。この時に必要な事
はそれ以後の精製段階における機械的障害を避ける為に
、抽出液中の細胞片を除去するという事である。約４＋
　４００　×ｇ、５分間の遠心が適切であるとされてい
るが、異なった遠心速度及び遠心時間でも、同様に溶か
して精製するという方法においては、可能性を持ち簡便
に実施されるという事は、たやすく判断しうるちのであ
る。

ｐｒｅ　−Ｓポリペブチドエビトーブの存在は、これら
のエピトープが重合ヒト血清アルブミン（ＰＨ３Δ）に
結合するという事よりＨＢＶ表面抗原に特異的な標識抗
体を用いたＲＩＡサンドインチ法のアッセイにより確認
する事が出来る。上記記載にある様に、粗抽出から４．
４００　Ｘ　ｇ、５分間の遠心で細胞片を除去し、残っ
た４、　４００　Ｘ　ｇ上清液について、更にその後も
精製方法を遂行していく。

酵母細胞膜由来の膜結合（ＭＢ）タンパクになっている
ｒＨｂｓＡｇの選択的抽出方法は、最初に不必要なＭＢ
タンパクの除去、その後のＭＢｒＨｂｓＡｇの取り出し
と、単離より成っている。もっと詳しく述べると、ＭＢ
ｒＨｂｓＡｇの選択的抽出段階は以下の代表的な操作に
よってなされる。

１゜４．４００　Ｘ　ｇ上清液などの上清液を不必要な
酵母膜結合タンパクの遊離に効果的な溶液の存在下でダ
イアフィルトレーションにかけ、当該不必要酵母膜結合
タンパクを除去し、保留生成物としての洗浄済み酵母膜
を作成する。

２、　ステップ（１）の保留生成物を膜結合表面抗原の
遊離に効果的な第２の溶液と混合する。そして　−３、
ステップ（２）で遊離された表面抗原を、ダ・イアフィ
ルトレージョン膜に対する当該表面抗原の通過を促進す
る第３の溶液を用いたダイアフィルトレーションにかけ
、濾液として獲得する。

ステップ（１１の前に、あらかじめ上清液の可溶性画分
は、場合に応じて超遠心、濾過、ダイアフィルトレーシ
ョン、陽圧あるいは減圧下においてそれぞれ、常法に従
がい取り出し膜結合成分として獲得する。緩衝液にはプ
ロテアーゼのインヒビターを加えておく。好ましい可溶
性画分の取り出し方法としては４．４００　Ｘ　ｇ上清
液を０．２μｍポアーサイズを持つダイアフィルトレー
ション装置に約１Ｏ−１５ｐｓｉの陽圧下でポンプで送
り込み、タンパクインヒビターを含むＰＢＳで洗浄する
ことである。圧力は可溶性成分のダイアフィルトレーシ
ョン装置の膜壁通過を促進するものである。

ダイアフィルトレーションの実際的な利点は透析と濾過
が同時に行なわれるという事である。多数のタイプのダ
イアフィルトレーション装置が使用可能である。遊離し
てくる可溶性成分は吸光度によりモニターする事が出来
る。

ステップ（１）の洗浄済み酵母膜の調製に際して、膜結
合成分は穏やかな変性剤でＭＢ表面抗原の遊離なしに、
その他程んどのＭＢタンパクを遊離するに十分な濃度に
おいて、処理されるものである。

適切な薬剤としては、界面活性剤あるいはタンパク変性
剤、あるいは両者の混合液が考えられる。

いろいろな種類の中性あるいは非イオン性界面活性剤が
用いられ、しかもノンオキシツール系、オクトオキシツ
ール系、ポリオキシエチレンアルコール系、ポリオキシ
エチレン（２０）ソルビタンモノ−オリエート系、デオ
キシコレート、あるいはオクチルグルコピラノシド、あ
るいは類似物などに限定されるものではない。両極性界
面活性剤も同様に有効でありかつ適切な薬剤である。

目的としない不必要なＭＢタンバグを遊離するステップ
（１）において適切なタンパク変性剤、上記記載、は以
下の構造式を持つ、−船釣化合物のクラスを含んでいる
。

式中Ｒはアミノ、低級アルキルチオ、低級アルキルオキ
シ、あるいは硫黄、 Ｘはアミノ、硫黄あるいは酸素、及び Ｙは水素あるいはアミノである。

本構造式には好ましいタンパク変性剤としてグアニジン
・ＨＣＩも含まれ、最も好ましい使用濃度勾配は約７Ｍ
から約１Ｍである。その他適切なタンパク変性剤として
ｃｉｏａ−の様な陰イオン中カオトロピックな薬剤もあ
る。

洗浄済み酵母膜調製に関するステップ（１）の好ましい
手順は、プロテアーゼインヒビターを含んだＰＢＳを約
７Ｍのグアニジン・Ｈ（［から約１Ｍのグアニジン・Ｈ
ＣＩ！の変性剤濃度勾配をつけた溶液として、膜結合成
分をダイアフィルトレーションにかける事である。

ステップ（２）において、ＭＢ表面抗原遊離の為に、洗
浄済み酵母膜は界面活性剤あるいはタンパク変性剤、あ
るいは両者の混合液により抽出される。

種々の非イオン性あるいは中性界面活性剤はどれも抽出
には適当な薬剤であり、ノンオキシツール系、オクトオ
キシツール系、ポリオキシエチレンアルコール系、ポリ
オキシエチレン（２０）ソルビタンモノ−オリエート系
、デオキコレート、あるいはオクチルグルコピラノシド
あるいは類似物に限定されるものではない。両極性界面
活性剤も同様に有効かつ適切な薬剤である。ステップ（
２）、上記記載、の第２の溶液に相当する、洗浄済み酵
母膜からのｒ）ｆｂｓＡｇ抽出用の好ましい溶液とはプ
ロテアーゼインヒビター、及び約２％（１１／ν）と約
０．０５％（ｓｖ／ｖ）　、最も好ましくは約０．５％
（１１／ｖ）、なる濃度範囲を持ったトリトンＸ−１０
０を含む緩衝液である。

ＭＢｒＨｂｓＡｇあるいは表面抗原を遊離するステップ
（２）において適切なタンパク変性」１は構造式■なる
一般的化合物のクラスを含んでいる。その他適切なタン
パク変性剤としてＣｌ０ａ−の様な陰イオンやカオトロ
ピックな薬剤もある。

ステップ（３）の操作時には遊離したｒＨｂｓＡｇがダ
イアフィルトレーション膜をうまく通過する様な処理を
行なう。その際、ステップ（３）、上記記載、の第３の
溶液に相当する最も好ましい溶液は、約０、１　％　（
ｗ／ｖ）　）リドンｘ−ｔ　ｏ　ｏを含むｐＨ７，５の
１０ｍＭリン酸緩衝液である。他の低濃度の界面活性剤
あるいは変性剤を含んだ低塩緩衝液もこのステップにお
いてはたやすく適応しうるものであり、それらの正確な
形式も十分に、本発明の原理に基づく変化及び適応の範
囲内である。同様に、もしステップ（２）の第２溶液が
ＭＢｒＨｂｓＡｇの遊離とそれらのダイアフィルトレー
ションあるいは透析膜に対する通過を促進させるという
２重の効果を持つのならば、ステップ（３）は全く行な
わな（てもよい。他の方法として、遊離したｒＨｂｓＡ
ｇは単純に物理的な手段でダイアフィルトレーション膜
の内部より取り出してもよい。

ステップ（１１−（３１の洗浄済み酵母膜からのＭＢ表
面抗原の抽出あるいは遊離過程には、更に洗浄、濃縮あ
るいは抽出ステップが必要であろう。洗浄済み酵母膜か
らのＭＢ表面抗原の選択的抽出にはダイアフィルトレー
ションの必要はない。適切な界面活性剤あるいは変性剤
が使用されているならば、遠心及び透析もまた別な方法
として有効である。ステップ（１）　−（３）は十分に
改良されるものと期待している。場合に応、じては、１
回あるいは数回の濃縮ステップが更に必要となるであろ
う。

選択的抽出ｒＨｂｓＡｇの可溶化過程は以下の手順によ
る。

４、その中でｒｌｌｂｓＡｇを可溶化するのに効果的な
還元剤の存在下で、ステップ（３）の濾液あるいは他の
選択的抽出ｒＨｂｓＡｇを若干量の変性剤で処理する。

そして ５、変性剤及び還元剤を除去し、実質的精製された組換
え体ｐｒｅ−５ｌ／Ｓ２／Ｓ　Ｂ型肝炎抗原あるいは、
その部分的抗原を作成する。

可溶化は１つあるいは数種の変性剤及び１つあるいは数
種の５元剤、あるいは両者の混合液の存在下で行なわれ
る。好ましい試薬の選択とＬ２では尿素及び・ジチオス
レイトール（ＤＴＴ）であり、濃度範囲はそれぞれ、約
１Ｍ−８Ｍ及び１−１０ｍＭの間である。最も好ましい
可溶化の為の溶液は約４Ｍの尿素及び約５ｍＭのＤＴＴ
を含むものである。緩衝液及びプロテアーゼインヒビタ
ーは必要に応じて加えられる。

一般的に、構造式Ｉなる変性剤はどれも皆可溶化の目的
には、適当なものでありかつ便利なものである。この構
造式には尿素も含まれ、式中Ｒはアミノ、Ｘは０及びＹ
はＨとなる。可溶化手順において使用されるその他の変
性剤は界面活性剤をも含むが、ノンオキシツール系、オ
クトオキシツール系、ポリオキシエチレンアルコール系
、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ−オリエ
ート系、デオキシコレート、あるいはオクチルグルコピ
ラノシドあるいは類似物に限定されるものではない。両
極性界面活性剤も同様に有効かつ適切な薬剤である。

ｒＨｂｓＡｇの可溶化に有効な還元剤はチオール試薬で
あり、これはタンパクｒＨｂｓＡｇのＳＨ基を実質的に
修飾しない物である。システィン、ホモシスティン、β
−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、ジチオ
エリスリトール及び重亜硫酸ナトリウムはチオール試薬
のカテゴリーに入れられる試薬の幾つかである。一方、
エルマン（Ｅｌ１ｍａｎ’　ｓ）試薬及び水素化ホウ素
ナトリウムはそれぞれ可溶化反応には強すぎる試薬であ
る。つまり、それらの試薬とｒＨｂｓＡｇとの反応は、
元通りに再配列する事の出来ない実質的な不可逆修飾し
た生成物を生じ、ｒＨｂｓＡｇにおけるシスティン残基
間に新たらしいジスルフィド結合をもたらすからである
。

組換え体タンパクの精製に普通に用いられるその他の一
般的あるいは既知のステップがｒＨｂｓＡｇ精製方法に
付は加えられる。これらのステップを以下に記載するが
、それに限定されるものではない。

（ａ）　　固相上、例えばシリカゲル、リン酸カルシウ
ム活性炭、あるいはセライトアルミナ、における選択的
吸着あるいは分離。

（ｂ）　　疎水性クロマトグラフィー、例えばブチルア
ガロース、ヘキシルアガロース、オクチルアガロースあ
るいはフェニルアガロース。及び（ｃ１不必要な膜結合
タンパクを遊離する溶媒あるいは試薬による選択的抽出
、その次に膜結合ｒｌｌｂｓＡｇを遊離するその他の溶
媒あるいは試薬による選択的抽出。他の目的の為に他の
溶媒あるいは試薬による抽出は別のステップにおいても
必要になるであろう。

（ｄ）　　沈殿法はｒｔ（ｂｓＡｇＯ単離にとっては有
効な他のステップの１つである。沈殿法は硫酸アンモニ
ウムの様な塩の使用あるいは等電点沈殿であるｐＨ勾配
により遂行される。他の方法としては次のものがある。

ｔｅｌ　　標準的方法によるクロマトグラフィー、ペー
パー、薄層、ゲル、分子ふるい、分子排斥、イオン−交
換、リガンドアフィニティー、イムノアフィニティー、
あるいは電気泳動。

（ｆ）　　二層分配抽出による溶媒分画、例えばＰＥＧ
とデキストラン〔アンダーソン、イー（Ａｎｄｅｒｓｏ
ｎ　＋　Ｅ　、　）等、アン、エヌ、ワイ、アカド。

サイ（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、第４１
３巻、第１１５頁（１９８３））。

ｔｇｌ　　ｉ３析、ウルトラフィルトレージョン（Ｕｌ
ｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）　、あるいはグイヤフィ
ルトレーション。

（ｗ）　　密度勾配遠心法。

（１１エレクトロフォーカソシング法。

（」）フリーズドライ、凍結乾燥法。あるいは（ｋ）　
　結晶化法。

このリストは決してすべての方法を述べたものではない
。記載されている順番は精製における好ましい順に示し
であるわけではない。ｒ　Ｈｂ　ｓ　Ａ　ｇの精製で好
結果を得る為にはステップ（ａ）　−（ｋ）のどれかあ
るいはすべてを行なうことや、しかも上記記載にもある
様に原理的に、可溶化は、いかなる場合においても付加
的ステップとして、取り扱かわれるであろう事はよく知
られている。

実施例中における以下の材料は市販品より入手した。尿
素及びグアニジン何ＩＣ４！、シュワルツ／マンバイオ
チク　（Ｓｃｈｗａｒｔｚ／Ｍａｎｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ
）　；　）リドンＸ−１００、フィンシャーサイエンテ
イフインクカンパ−−−（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔ
ｉｆｉｃ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　　；ジチオスレイトール
、バイオ−ラッド。

本中請書中の全操作において糖タンパク質は過ヨウ素酸
−シッフ塩基法により測定される〔ネビーレ、デイ−、
エム、　　（Ｎｅｖｉｌｌｅ、Ｄ、Ｍ、）等、メソッズ
インエンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ）、第３２巻、第９２頁（１９７４））
。タンパク濃度は５ＤＳ−ローリ−法〔例えばローリ−
、オー。

エッチ（Ｌｏｗｒｙ、０．Ｈ，）等、ジエイ、パイオル
、ケム。

（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、第１９３巻、第２６
５頁（１９５１））、またはクーマジーブルー結合法〔
例えばブラッドフォード、エム、エム、　（Ｂｒａｄｆ
ｏｒｄ。

Ｍ、Ｍ、）　、アナル、バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）、第７２巻、第２４８頁（１９７６））な
どにより測定される。

免疫化学的試験は精製されたロットに対して以下の方法
で行なわれる。重合ヒト血清アルブミン（円１ｓＡ）に
対する結合はバレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）等
、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
、第３巻、第３１７頁（１９８５）の報告に従がって行
なう。免疫化学的決定基は、ＡＵＳＲＩＡ　ｎ　−１２
５（アボットラプス（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ））　、
及びＡＵＳＡＢ　（アボットラプス）などを含む、いろ
いろな−船釣方法により測定される。生物学的活性はマ
ウスにおけるボテンシー試験により測定される。

本実施例中における全精製ステップは４℃で行なう。酵
母細胞で合成されたＳ抗原を含む凍結細胞ペースト（５
２ｇ）を１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭ
ＳＦ）及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む３１５１１１のＰ
ＢＳに懸濁し細胞を破砕する。破壊細胞を細胞破砕機か
ら１　ｍＭ　ＰＭＳＦ及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１
．５ＬのＰＢＳで洗浄する事により除去する。

得られた粗抽出液を４．４ＯＯＸｇ、５分間の遠心にか
け、細胞片を除去する。４．４００　Ｘ　ｇ上清液の一
部分（総容量の３％）を更に１００，０ＯＯＸ　ｇ、１
時間の遠心にかけ、沈殿物（酵母膜画分）として可溶性
画分より分離する。組換え体肝炎Ｓ抗原の存在をＡＵＳ
ＲＩＡ　（商標名）（アボット）により、それぞれ検討
する。

第土衷 酵母における組換え体肝炎Ｓ抗原の存在に対する遠心の
効果 酵母膜画分　３５．４　　　４．６　　　　　７．８可
溶性画分　１．５　　　１４．２　　　　　０．１細胞
片　　　０．９５　　　５．８　　　　　０．２第■表
はＳポリペプチドの大部分が酵母膜タンパク中に集まっ
て存在している事を示している。

１００．０００ｘ　ｇの遠心ステップを省く為に４，４
００ｘｇ上清液に対して更に操作を加える。

（ａｌ　　洗浄済み酵母膜の調製 ４．４ＯＯＸｇの上清液をホローファイバー膜−（０，
２μｍ、ｌｆｔ”）を持つダイヤフィルトレージョン装
置（４５０ｍｌ容量）に１Ｏ−１５ｐｓｉの陽圧下でペ
リスタ栄ンブを用いて送り込む。グイヤフイルトレーシ
ョンを以下の手順によって行なう。０．２　ｍＭ　ＰＭ
ＳＦ及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２．５ＬのＰＢＳ　
。

７Ｍグアニジン１ｌｃＩ！２５０　ｍｌ、３．５Ｍグア
ニジン・ＨＣｌ２００ＩＩ１１．１Ｍグアニジン・ＨＣ
Ｎ　　２Ｌ。

ＩＩｌ１ＭＥＤＴ＾を含む２ＬのＰＢＳ　、の順に使用
し膜からの抗原の離脱なしに、膜結合酵母不純物を除去
する。得られた保留生成物が膜に結合している精製抗原
となる（洗浄済み酵母膜）。

（ｂ）　　酵母膜からの抗原の抽出 本実施例中のパラグラフ（ａｌにおける生成物である洗
浄済み酵母膜を０．５％（ｗ／ｖ）のトリトンｘ−１０
０及び１ｍＭＥＤＴ八を含むＰＢＳＩＬ中で３０分間、
４℃でインキュベートする。可溶化された抗原をボロー
ファイバーユニット　（０，２μｍ）上で２００　ｍ（
！　ニマテ４縮し、次に０．１％（−／ν）のトリトン
Ｘ−１００を含むｐｌ（７，５の１０ｍＭリン酸緩衝液
２．５Ｌを用いて酵母膜をダイヤフィルトレージョンし
、酵母膜より可溶化された抗原を分離する。Ｓ抗原を含
む濾液を、ホローファイバー膜（１００，０００１μＭ
Ｗ　、　０．６　ｆｔ２）上で２０ｏｒＩｌｌにまで濃
縮し、次に２ＬのＰＢＳでダイヤフィルトレージョンす
る。得られた保留生成物はＳ抗原を含み、それを５ｍＭ
ＤＴＴを含む４Ｍ尿素中で１５分間インキュベーション
し、次にボローファイバー膜（１００，０００ＮＭＷ、
　０．６　ｆｔジ上テ２ｍＭＤＴＴを含む２Ｍ尿素７０
０ｍ（ｆ、２Ｍ尿素７００　ｍｌ、　ＰＢＳ　２１、の
順で使用しダイヤフィル（・レーションをする。得られ
た精製抗原（Ｓ−３１と表記）は、第Ｈ表の結果が示す
ように高い比活性を持っている。

第」−表 ０．５％トリトンＸ−１００の存在下で酵母゛由来の膜
結合組換え体肝炎Ｓ抗原の、膜から遊離する事による精
製１ 粗抽出液　　１２．８　　　７．９００　　　　　１．
６１抗原ロット番号５−３１ 精製抗原の一部分を３ＭＫＳＣＮを含むＰＢＳで１６時
間使用し、十ローフアイバー膜（１００，０００ＮＭＷ
。

０．６　ｆｔ”）上で、３ＭＫＳＣＮを含むＰＢＳ５０
０ｍｌ、Ｉ　Ｍ　ＫＳＣＮを含むＰｕｓ　７５０　　ｍ
ｌ　、　ＰＢＳ　２　Ｌの順でダイアフィルトレーシゴ
ンを行ない、ロフト番号ｓ−３１／ＫＳＣＮとした。精
製抗原（Ｓ−３１及びＳ−３１／ＫＳＣＮ）の両ロフト
とも、電子顕微鏡により２０ｎｍ粒子を含む事が確認さ
れた。

尖止肛 精製Ｓ抗原（実施例１）のマウスボテンシーを以下の手
順により測定した。テストすべき抗原サンプルを滅菌濾
過し、各サンプル２０ｍ１に対して１　ｍ！！のアルヒ
ドロゲル（ＡＬ）ＩＹＤＩ？０ＧＥＬ）　　（スバーホ
ススペシャリティーケミカルズ　ニー／ニス（Ｓｕｐｅ
ｒｆｏｓ　５ｐｅｃｉａｌｔｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　
ａ／ｓ）　、フエドバエク（Ｖｅｄｂａｅｋ）、デンマ
ーク（Ｄｅ＋ｔｍａｒｋ）　）を加え、吸着させ、２時
間、室温で攪拌する。

更にチメロサールをサンプルに対して１：２０，０００
の濃度で加える。調製サンプルはアラムブラシボーで希
釈あるいは希釈なしで、マウスで試験をし、それぞれ、
０．　Ｏ２５，０，００６及び０．００１６μｇ／ｍｌ
とする。各調製サンプルあるいはアラムブラシボーの１
ＩＩ１１をそれぞれ１０匹のマウスに腹腔内注射する。

２８日後に個々のマウスから採血し、抗体力価をＡＵＳ
ＡＢ　　（商標名）ラジオイミュンアッセイにより測定
する。データーを解析し、サブユニッ）　ＨＢｓＡｇの
異なった用量に対する抗体陽転率を計算した。そのデー
ターに基づき用量に対して実測プロビットをブロフトと
、最小二乗法による回帰式より推定プロビットを求めＥ
Ｄ、。用量（μｇ）を得る。

マウスポテンシーテストの結果よりロフト５−３１のＥ
Ｄ、、は１．３μｇでありロットＳ−３１／ＫＳＣＮは
１．２μｇであった。これは、インビボで明らかに効果
のある事を示している。

酵母細胞で合成されたｐｒｅ　−ＳＬ／　Ｓ２／　Ｓタ
ンパクを含む凍結細胞ペース）（９０ｇ）を１．０　ｍ
ＭＰＭＳＦ、　１０ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ及び０．１　Ｍ　
）リス・ＨＣｌを含む、ｐｉ（７，５のＰＢＳ９０　ｍ
ｌ　（“緩衝液″）に懸濁する。細胞にダイノーミル（
ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ）で、３０秒、５回の破壊を加え、
次に破壊細胞をダイノーミルから１．２Ｌの緩衝液で洗
浄する事により、除去する。得られた粗抽出液を４．４
００　Ｘ　ｇ、１０分間の遠心にかけ、細胞片を除去す
る。

４、４００　Ｘ　ｇの上清液をホローファイバー膜（０
，２μｍ、ｌｆｔ”）を持つダイヤフィルトレージョン
装置（４５０＋７！容量）に１０　１５ｐｓｉの陽圧下
でペリスタポンプを用いて送り込み、１．０ｍＭＰＭＳ
Ｆを含むＰＢＳｌ、５Ｌ、７Ｍグアニジン・）ｌ（１３
００ｍ＃、１Ｍグアニジン・ＨＣｌ　２　Ｌ、　０．２
ｍＭＰＭＳＦ及び１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰ　Ｉ３３
１．５　Ｌの順にダイアフィルトレーションを行なう。

得られた保留生成物（洗浄済み酵母膜）を０．５％トリ
トンＸ−１００、プロテアーゼインヒビターを含むＰＢ
Ｓｌ、６Ｌ中で、２０分間、４℃でインキュベーション
するＣＰＢＳ中における最終濃度、０．２　ｍＭ　ＰＭ
ＳＦ　。

１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０．１％（ｗ／ｖ）ペブスタ
チインＡ１０．０１３％（ｗ／ｖ）アプロチニン及び１
０ｍＭベンズアミジン・ＨＣｌ）。この可溶化された抗
原をホローファイバーユニット（０，２μｍ）上で２０
０ｎｊ！にまで濃縮し、次に０．１％軸／ｖ）トリトン
Ｘ−１００、及び上記プロテアーゼインヒビターを含む
ｐＨ７，５の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で酵母膜
をダイヤフィルトレージョンし、酵母膜より可溶化され
た抗原を分離する。抗原を含む濾液をホローファイバー
膜（１００，０００Ｎｈｈ　、０．６ｒｔ２）上で２０
０　ｍｌにまで濃縮し、次に７容量のＰＢＳでダイヤフ
ィルトレージョンで行なう。抗原を含む保留生成物を５
ｍＭＤＴＴを含む４Ｍ尿素中で、１５分間インキュベー
ションし、ホローファイバー膜（１００，０００ＮＭＷ
　、０．６ｆｔ”）上で２００ｍｊ２にまで濃縮、最終
ステップとして２ｍＭＤＴＴを含む、２Ｍ尿素５容世、
ＰＢＳ１０容量、の順でダイヤフィルトレージョンを行
ない、精製抗原として獲得。

得られた生成物には電子顕微鏡により２０ｎｍ直径以下
の凝集した形態がおもに確認された。

裏旅拠土 酵母細胞で合成されたｐｒｅ−３ｔ／Ｓ２／Ｓタンパク
が酵母細胞で合成されたＳ抗原におき変えられたという
点を除けば、あとはすべて、実施例１における精製ステ
ップそのものである。その時の生成物は、実質的に精製
された組換え体ｐｒｅ−３ｌ／Ｓ２／Ｓタンパクであり
、表面抗原としての２０ｎｍ粒子を形成している。

上記は、説明を目的とした実施例をもって本発明の原理
を示すものであるが、本発明の実施は、ここに記載され
ている方法や手順における、−Ｓ的な変法、適応、改良
、省略あるいは追加操作などにより遂行されることはよ
く知られている所であり、特許請求の範囲に包含される
ものである。

出願人　　メルク　エンド　カムパニーインコーポレー
テッド 手続角ｎ正置（方式） ％式％ １、本件の表示　昭和６３年特許願第２６８３５５号２
、発明の名称　組換え体肝炎抗原の精製方法３、補正を
する者 事件との隔　　特許出願人 住　所　　　アメリカ合衆国、ニュージャーシイ、ロー
ウェイ。

イースト　リンカーン　アヴエニュー　１２６４、代理
人 （発送口：モ成１年３月　７日） （１）別紙の通り、明細占１通を提出致し・ます。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換え体ｐｒｅ−Ｓ１／Ｓ２／ＳＢ型肝炎抗原ある
   いはその部分的抗原の実質的精製方法において ａ）抗原結合酵母膜の抽出、 ｂ）ステップ（ａ）の抽出における細胞片の遠心による
   除去、 ｃ）不必要な酵母膜結合タンパク質の遊離に効果的な溶
   液存在下で上清液をダイアフィルトレーションにかけ、
   その後当該不必要酵母結合タンパク質を除去し、保留生
   成物としての洗浄済み酵母膜を作成、 ｄ）ステップ（ｃ）の保留生成物を膜結合表面抗原の遊
   離に効果的な第２の溶液と混合、ｅ）ステップ（ｄ）で
   遊離された表面抗原を、ダイアフィルトレーション膜に
   対する当該表面抗原の通過を促進する第３の溶液を用い
   たダイアフィルトレーションにかけ、濾液を獲得、 ｆ）当該濾液を可溶化するのに効果的な還元剤の存在下
   で濾液を若干量の変性剤で処理、及び ｇ）変性剤及び還元剤を除去し、実質的精製された組換
   え体ｐｒｅ−Ｓ１／Ｓ２／ＳＢ型肝炎抗原あるいは、そ
   の部分的抗原の作成することよりなる方法。 ２、ステップ（ｃ）のダイアフィルトレーションが約１
   ０−１５ｐｓｉの陽圧下で行なわれる請求項１記載の方
   法。 ３、ステップ（ｃ）のダイアフィルトレーションが約０
   ．２μｍのポアー直径を持つホローファイバー膜使用の
   ダイアフィルトレーション装置で行なわれる請求項１記
   載の方法。４、ステップ（ｃ）における不必要な酵母膜
   タンパク質の遊離に効果的な溶液がタンパク質変性剤あ
   るいは界面活性剤あるいはその両方の混合液より成る請
   求項１記載の方法。 ５、当該溶液がタンパク質変性剤を含有する請求項４記
   載の方法。 ６、当該タンパク質変性剤がグアニジン−ＨＣｌであり
   ステップ（ｃ）のダイアフィルトレーション過程におい
   てその濃度が約７Ｍから１Ｍの間である請求項５記載の
   方法。 ７、ステップ（ｄ）における膜結合表面抗原の遊離に効
   果的な第２の溶液がタンパク質変性剤あるいは界面活性
   剤あるいはその両方の混合液より成る請求項１記載の方
   法。 ８、当該第２溶液が約０．５％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ
   −１００を含むリン酸緩衝液より成る請求項７記載の方
   法。 ９、当該第２溶液が約１．０％（ｗ／ｖ）のトリトンＸ
   −１００を含むリン酸緩衝液より成る請求項７記載の方
   法。 １０、当該第２溶液が約０．５％（ｗ／ｖ）及び１．０
   ％（ｗ／ｖ）の間の濃度を持つトリトンＸ−１００を含
   む緩衝溶液より成る請求項７記載の方法。 １１、当該第２溶液が緩衝液及び約１％（ｗ／ｖ）と約
   ０．１％（ｗ／ｖ）の間での濃度範囲を持つトリトンＸ
   −１００及びプロテアーゼインヒビターより成る請求項
   １記載の方法。 １２、当該第２溶液が本質的に約０．５％（ｗ／ｖ）の
   トリトンＸ−１００及び約１ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ
   より成る請求項１１記載の方法。 １３、ステップ（ｅ）のダイアフィルトレーションが約
   ０．２μｍのポアー直径を持つホローファイバー膜使用
   のダイアフィルトレーション装置で行なわれる請求項１
   記載の方法。 １４、ステップ（ｅ）の第３の溶液が約０．０５％と０
   ．５％の間のトリトンＸ−１００を含む緩衝液より成る
   請求項１記載の方法。 １５、ステップ（ｅ）の第３の溶液が約０．１％のトリ
   トンＸ−１００を含むリン酸緩衝液より成る請求項１記
   載の方法。 １６、ステップ（ｆ）の変性剤が尿素である請求項１記
   載の方法。 １７、ステップ（ｆ）の還元剤がジチオスレイトールで
   ある請求項１記載の方法。 １８、ステップ（ｆ）における変性剤が尿素であり及び
   ステップ（ｆ）における還元剤がジチオスレイトールで
   ある請求項１記載の方法。 １９、尿素の最終濃度が約４Ｍでありジチオスレイトー
   ルの最終濃度が約５ｍＭである請求項１８記載の方法。 ２０、肝炎ワクチンより成る請求項１−１９記載の方法
   の生成物。