【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔産業上の利用分野〕
本発明は、サフランの花筒を組織培養してサフラン柱頭
様組織を産生させる方法、及び、こうして産生させて得
たサフラン柱頭様組織から、色素等のサフラン有用成分
を採取し製造する方法に関する。
ここに得られるサフラン有用成分は、医薬（鎮静剤など
）、着色料、香料、苦味料などとして、医薬品、食品、
化粧品などの分野で使用される。
〔従来の技術と問題点〕
サフランのめしべは、上部より柱頭、花柱、子房の各部
から構成されているが、この柱頭は、深紅色を呈し、サ
フラン色素を含むほか、薬用成分、芳香成分などの有用
成分を含んでいる。
従来、このような有用成分を含むサフラン柱頭は、サフ
ランを栽培して花を咲かせ、そのめしべから採取されて
きた。
通常、３０ｇ程度の大きなサフランの球根を栽培しても
、花は６個程度しか着かないので、３個に分裂しためし
べ柱頭は１８本程度しか採れない。
仮に１ｋｇのめしべ柱頭を採ろうとすると、必要なサフ
ランの球根量は、約５００ ｋｇにもなる。従って、サ
フランのめしべ柱頭の生産では、広大な栽培面積が必要
となる。
しかも、天然の栽培生産では時間がかかり、天候にも大
きく影響を受け、かつ、サフランは極端に連作を嫌う植
物であるので、めしべ柱頭を効率的に栽培生産すること
がむずかしく、こうした点からもサフランのめしべ柱頭
は非常に高価な存在となっている。
最近、サフランの雌性器官（雌すい）をサイトカイニン
の存在下に組織培養してサフラン柱頭様組織（雌ずい様
器官）を生産する方法が提案されたが（特開昭６２−２
７５６１７号公報）、サフラン雌性器官の産生量及びサ
フラン色素の産生量の点で、まだ十分満足のいく技術は
確立されておらず、サフラン有用成分を得る効果的な生
産技術の開発が要望されている。
〔発明の目的〕
本発明は、この要望にこたえるもの５あって、サフラン
有用成分を含有する柱頭様組織を効率的に産生させる方
法、及び、該柱頭様組織からサフラン有用成分を効率的
に製造する方法を提供することを目的とする。
〔発明の構成及び効果〕
本発明は下記の構成のものである。
（１１サフランの花筒を組織培養してサフラン柱頭様組
織を産生させることを特徴とするサフラン柱頭様組織の
産生方法。
（２） 、Ｉ織培養をシａｔｌ濃変５重量％以上含む
培地で行う請求項（１１記載の産生方法。
（３）サフランの花筒を組織培養して産生させたサフラ
ン柱頭様組織からサフラン有用成分を採取することを特
徴とするサフラン有用成分の製造方法。
サフラン有用成分は、前述のように、天然産の場合、サ
フランのめしべを構成する柱頭の部分に含まれるが、本
発明によると、本来柱頭とは別異の部分（器官）である
花筒の部分を組織培養することによって柱頭様組織を効
率よく産生させ、この柱頭様組織から色素等のサフラン
有用成分を効率よく採取（製造）することができる。
前掲の特開昭６２−２７５６１７号公報では、サフラン
の雌性器官（雌ずい）を組織培養して、柱頭様組織（雌
すい様器官）を産生させ、そうして得た柱頭様組織から
色素等のサフラン有用成分を製造する方法が提案されて
いるが、本発明においては、サフランの雌性器官とは異
なる花筒の部分を組織培養することによって柱頭様組織
を産生させる点で、前記の提案と本質的に異なり、かつ
、本発明においては、雌性器官を組織培養する場合に比
して、より多数の柱頭様組織を容易に産生でき、そのう
え、色素の産生量をより多くすることができる点に特徴
がある。
本発明によれば、植物ホルモンを含有する培地を用い、
サフランの特定の器官を明所又は暗所で組織培養するこ
とにより、有色の柱頭様組織を産生し増殖させることが
できる。
本発明では、サフランの花筒を組織培養する。
ここで花筒とは、花弁が合着して筒状になっている部分
をいう、サフラン色素生産原料用や薬用などに通常使用
される有色の柱頭と花柱とを外側から包んでいる部分が
、花筒である。したがって花筒は、柱頭、花柱、子房か
らなる雌性器官とは異なる部分である。
サフランの雌性器官を組織培養すると、確かに柱頭様組
織を産生ずることができるが、産生ずる柱頭様組織の数
や色素産生の量の点で、本発明による方法の方がはるか
に優れているのである。
本発明では、サフランの開花前に、すなわち、つぼみの
状態の時に、花筒の部分を取り出し、これを通常の方法
にしたがって組織培養に付し、柱頭様組織を産生増殖さ
せる。サフランの開花後に同様な操作を行った場合でも
ほぼ同様な結果が得られるが、柱頭様組織の産生量はや
や低下する傾向がある。
本発明では、組織培養を５重量％以上の濃度でシｇ糖を
含有する培地で行うと、本発明の効果をより顕著に発揮
することができる。ちなみに、通常の場合のシラ糖濃度
は３重量％と低い。
本発明で得られる柱頭様組織の代表的な例について述べ
ると、形状は、サフランめしべの柱頭にきわめて類似し
ており、色は生成したサフラン色素の含有量に応じて、
黄色から赤色を呈する。
本発明で使用できる培地は、組織培養用の基本培地でよ
く、特に格別のものである必要はない。
植物のｍ織培養に通常用いられる例えばムラシゲ−スク
ーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ −Ｓｋｏｏｇ）の培地、ホ
ワイト（Ｗｈｉｔｅ）の培地、リンスマイヤー−スクー
グ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−５ｋｏｏｇ）の培地、ゴート
レー（Ｇａｕ ｔｈｅｒｅ ｔ）の培地、ツレッケ（Ｔ
ｕｌｅｃｋｅ）の培地、モーレル（Ｍｏｔｅｌ）の培地
などを使用することができる。なかでも、Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ −Ｓｋｏｏｇの培地が好適である。
本発明では、このような基本培地に、植物ホルモンのオ
ーキシン類やサイトカイニン類を添加して培養を行う。
本発明で使用できるオーキシン類としては、α−ナフタ
レン酢酸（ＮＡＡ） 、インドール酢酸（ＩＡＡ） 、
ｐ−クロロフェノキシイソ酪酸、２゜４−ジクロロフェ
ノキシ酢酸（２，４−Ｄ）などが例示され、また、サイ
トカイニン類としては、ベンジルアデニン（ＢＡ）、カ
イネチン（Ｋ ｉ）、ゼアチン、ジヒドロゼアチンなど
が例示される。
なかでも、ＮＡＡやＢＡは、本発明において特に好適に
使用することができる。
植物ホルモンの培地への添加量は、オーキシン類で０．
１ ｐｐｍ以上、特に０．１〜１０ｐｐｍを含有させる
のがよく、また、サイトカイニン類で１ ｐｐｍ以上、
特に２〜１５ｐｐｎ＋を含有させるのがよい。
培地中でのショ糖濃度は、３重量％以上、特に５〜１２
重量％が好適である。ショ糖濃度が３重量％より少ない
場合は、柱頭様組織の産生が低下し好ましくない。
本発明で行う組織培養の方法としては、例えば固体培地
を用いた静置培養方法でも、また、液体培地を用いた振
とう培養方法であってもよい。固体培地としては、例え
ば寒天を約０．８重量％含有するもの、又は、ゲランガ
ムを０．２重量％含有するＭｕｒａｓｈｉｇｅ −Ｓｋ
ｏｏｇの培地などが用いられる。
培養は、明所でも暗所でもよい。培養温度は１５〜３０
℃、好ましくは２０〜３０℃の範囲で行う。
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ −Ｓｋｏｏｇの培地における２５
℃、暗所での培養では、通常１〜２か月の経過により柱
頭様組織の産生が認められる。こうして産生させた柱頭
様組織を、引きつづき固体培地又は液体培地で、暗所又
は明所において培養することにより柱頭様組織を増殖さ
せることができる。
本発明により増殖させた有色の柱頭様ｍｍからサフラン
色素を取り出すには、柱頭様組織をそのまま、又は、す
りつぶして、溶剤、例えば水、含水エタノール、含水プ
ロピレングリコールなどを用いて、常温又は加熱下に抽
出すればよい。
本発明により産生させた柱頭様組織を水で抽出して得ら
れた黄色の着色液について、紫外部及び可視部の吸収ス
ペクトルをとり、これを天然のサフラン柱頭より抽出し
たサフラン色素水溶液の吸収スペクトルと比較したとこ
ろ、本発明で得られた色素が天然のサフラン色素と同等
のものであることが確認された。
本発明によれば、天然栽培を行ってサフラン色素を得る
場合に比べ、季節に左右されず短期間で大量の色素を得
ることが可能である。本発明で得られる柱頭様組織や、
これから抽出して得た色素は、食品、化粧品などの着色
や薬用原料として有効に使用できる。
〔実施例及び比較例〕
実施例Ｉ
Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ −Ｓｋｏｏｇの培地に、ベンジル
アデニン（ＢＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）を、
第１表に示す量になるようにそれぞれ添加し、かつ、シ
ョ糖濃度を同じく第１表に示す量になるように修正し、
さらに、これにゲランガム粉末を０．２重量％になるよ
うに加え、オートクレーブ中１２０℃で２０分間滅菌し
た。得られた溶液を直径５５鶴のプラスチック製シャー
レに分注し、冷却固化させて培地を調製した。
一方、サフランの開花前、まだつぼみの時に、つぼみの
部分を取り出し、これを０．５容量％次亜塩素酸ソーダ
水溶液に１０分間浸漬して滅菌し、ついで、これを水洗
したのち、孔筒部分を取り出し、約５ｆｉの大きさに切
り取って、これを上記の培地に置床した。
これを２５℃暗所で静置培養したところ、ＮＡＡ及びシ
ョ糖の量に応じて、早いものでは培養後６週間位経つと
、柱頭様組織の産生が認められ、８週間後にはこの組織
が生長し、かつ、赤色に着色して、サフラン色素がかな
り生成してきた。
柱頭様組織の培養８週間後における産生量及び色素濃度
に関し、それぞれ第１表及び第２表に示す結果を得た。
第 １ 表
（サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの産生量）（
注）サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの産生量
天然サフランのサフラン色素を含む柱頭の部分３本に相
当する量を（１０３、量的にないものを（０）とし、こ
の間を比例区分して１１段階の量を示す尺度とし、培養
に用いたサフランの孔筒部分の外植片１個当り発生した
サフラン色素を含む柱頭様組織当量を、目視によって判
定し、上記尺度に当てはめて数値とした。
第 ２ 表
（サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの色素濃度）
（注）サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの色素濃
度
天然サフランのサフラン色素を含む柱頭の部分の色の濃
さを〔ｌＯ〕、無色を[Industrial Application Field] The present invention provides a method for producing saffron stigma-like tissue by tissue culturing saffron flower tubes, and a method for collecting saffron useful components such as pigments from the saffron stigma-like tissue produced in this way. and a method for manufacturing the same. The useful saffron ingredients obtained here are used as medicines (sedatives, etc.), coloring agents, flavoring agents, bittering agents, etc., in pharmaceuticals, foods,
Used in fields such as cosmetics. [Conventional technology and problems] The saffron pistil is composed of the stigma, style, and ovary from the top.The stigma is deep red and contains saffron pigment, medicinal ingredients, and aromatic ingredients. Contains useful ingredients such as Conventionally, saffron stigmas containing such useful components have been collected from the pistils of saffron cultivated and blooming flowers. Normally, even if you grow a large saffron bulb weighing about 30g, it will only produce about 6 flowers, which means that it will only divide into 3 pieces and produce only about 18 pistil stigmas. If one were to collect 1 kg of pistil stigmas, the amount of saffron bulbs required would be approximately 500 kg. Therefore, the production of saffron pistil stigmas requires a large cultivation area. Moreover, natural cultivation takes time and is greatly affected by the weather, and saffron is a plant that strongly dislikes repeated cultivation, so it is difficult to cultivate and produce pistil stigmas efficiently. Saffron pistil stigmas are very expensive. Recently, a method has been proposed to produce saffron stigma-like tissue (gynoecium-like organ) by tissue culturing the female organ (gynoecium) of saffron in the presence of cytokinin (JP-A-62-2
No. 75617), in terms of the production amount of saffron female organs and the production amount of saffron pigment, a fully satisfactory technology has not yet been established, and there is a demand for the development of an effective production technology for obtaining saffron useful components. There is. [Object of the Invention] The present invention satisfies this need5, and provides a method for efficiently producing a stigma-like tissue containing a saffron useful component, and a method for efficiently producing a saffron useful component from the stigma-like tissue. The purpose is to provide a method for [Configuration and Effects of the Invention] The present invention has the following configuration. (11. A method for producing saffron stigma-like tissue, characterized by tissue culturing saffron flower tubes to produce saffron stigma-like tissue. (2) I tissue culture is carried out in a medium containing 5% by weight or more of satl concentration. The production method according to claim (11). (3) A method for producing a saffron useful ingredient, which comprises collecting a saffron useful ingredient from a saffron stigma-like tissue produced by tissue culturing a saffron flower tube. The saffron useful ingredient is , as mentioned above, in the case of natural production, it is contained in the stigma part that makes up the pistil of saffron, but according to the present invention, the part of the flower tube, which is originally a different part (organ) from the stigma, is tissue cultured. By doing so, stigma-like tissue can be efficiently produced, and useful components of saffron such as pigments can be efficiently collected (manufactured) from this stigma-like tissue. A method has been proposed in which the gynoecium is tissue cultured to produce stigma-like tissue (gynoecium-like organ), and saffron useful components such as pigments are produced from the stigma-like tissue obtained. The present invention is essentially different from the above-mentioned proposal in that the stigma-like tissue is produced by tissue culturing a part of the flower tube that is different from the female organs of saffron. The present invention is characterized in that it is possible to easily produce a larger number of stigma-like tissues and to increase the amount of pigment produced.According to the present invention, the culture medium containing plant hormones using
By culturing specific organs of saffron in the light or darkness, colored stigma-like tissues can be produced and grown. In the present invention, saffron flower tubes are tissue cultured. Here, the flower tube refers to the tube-shaped part where the petals are joined together, and the part that surrounds the colored stigma and style, which are usually used for saffron pigment production raw material and medicinal purposes, from the outside. It is a flower tube. Therefore, the flower tube is a different part from the female organ, which consists of the stigma, style, and ovary. It is true that stigma-like tissues can be produced by tissue culturing the female organs of saffron, but the method of the present invention is far superior in terms of the number of stigma-like tissues produced and the amount of pigment produced. It is. In the present invention, before flowering of saffron, that is, when the saffron is in the bud state, a portion of the flower tube is removed and subjected to tissue culture according to a conventional method to produce and proliferate stigma-like tissue. Similar results can be obtained when similar operations are performed after saffron flowers bloom, but the amount of stigma-like tissue produced tends to be slightly lower. In the present invention, when tissue culture is performed in a medium containing sig sugar at a concentration of 5% by weight or more, the effects of the present invention can be more significantly exhibited. Incidentally, the concentration of sila sugar in normal cases is as low as 3% by weight. Describing a typical example of the stigma-like structure obtained by the present invention, the shape is very similar to the stigma of a saffron pistil, and the color depends on the content of the produced saffron pigment.
Appears yellow to red. The medium that can be used in the present invention may be a basic medium for tissue culture and does not need to be particularly special. For example, Murashige-Skoog's medium, White's medium, Linsmaier-Skoog's medium, Gauthere's medium, Zrecke's medium, which are commonly used for the culture of plants. (T
Uecke's medium, Morel's (Motel) medium, etc. can be used. Among them, Murash
ige-Skoog's medium is preferred. In the present invention, culture is performed by adding plant hormones such as auxins and cytokinins to such a basic medium. Auxins that can be used in the present invention include α-naphthalene acetic acid (NAA), indole acetic acid (IAA),
Examples include p-chlorophenoxyisobutyric acid, 2゜4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and examples of cytokinins include benzyladenine (BA), kinetin (K i), zeatin, and dihydrozeatin. Examples include. Among them, NAA and BA can be particularly preferably used in the present invention. The amount of plant hormones added to the medium is 0.0 for auxins.
It is preferable to contain 1 ppm or more, especially 0.1 to 10 ppm, and for cytokinins, 1 ppm or more,
In particular, it is preferable to contain 2 to 15 ppn+. The sucrose concentration in the medium is 3% by weight or more, especially 5 to 12% by weight.
% by weight is preferred. If the sucrose concentration is less than 3% by weight, the production of stigma-like tissue will decrease, which is not preferable. The tissue culture method carried out in the present invention may be, for example, a static culture method using a solid medium or a shaking culture method using a liquid medium. Examples of solid media include those containing about 0.8% by weight of agar, or Murashige-Sk containing 0.2% by weight of gellan gum.
oog medium etc. are used. Culture may be carried out in the light or in the dark. Culture temperature is 15-30
The temperature is preferably 20 to 30°C. 25 in Murashige-Skoog's medium
When cultured at ℃ in the dark, production of stigma-like tissue is usually observed after 1 to 2 months. The stigma-like tissue thus produced can be grown by subsequently culturing it in a solid medium or liquid medium in the dark or in the light. In order to extract the saffron pigment from the colored stigma-like mm grown according to the present invention, the stigma-like tissue is either left as is or ground, and then treated with a solvent such as water, aqueous ethanol, aqueous propylene glycol, etc. at room temperature or under heating. You can extract it to The absorption spectra in the ultraviolet and visible regions of the yellow colored liquid obtained by extracting the stigma-like tissue produced according to the present invention with water are taken, and this is the absorption spectrum of an aqueous saffron dye solution extracted from natural saffron stigmas. It was confirmed that the pigment obtained in the present invention is equivalent to natural saffron pigment. According to the present invention, compared to the case where saffron pigment is obtained through natural cultivation, it is possible to obtain a large amount of pigment in a short period of time regardless of the season. Stigma-like tissue obtained by the present invention,
The pigments extracted from this can be effectively used to color foods, cosmetics, etc., and as medicinal raw materials. [Examples and Comparative Examples] Example I Benzyl adenine (BA) and α-naphthalene acetic acid (NAA) were added to the Murashige-Skoog medium.
Add each in the amount shown in Table 1, and correct the sucrose concentration so that it becomes the amount shown in Table 1,
Further, gellan gum powder was added thereto at a concentration of 0.2% by weight, and the mixture was sterilized in an autoclave at 120°C for 20 minutes. The obtained solution was dispensed into a plastic petri dish with a diameter of 55 mm, and the solution was cooled and solidified to prepare a culture medium. On the other hand, before flowering, when the saffron is still in bud, the bud part is taken out and sterilized by immersing it in a 0.5 volume % sodium hypochlorite aqueous solution for 10 minutes. A portion was taken out, cut into a size of about 5 fi, and placed on the above-mentioned medium. When this was cultured statically at 25°C in the dark, depending on the amount of NAA and sucrose, production of stigma-like tissue was observed as early as 6 weeks after culture, and after 8 weeks, the production of stigma-like tissue was observed. It has grown and is colored red, producing a considerable amount of saffron pigment. The results shown in Tables 1 and 2 were obtained regarding the production amount and pigment concentration after 8 weeks of culture of the stigma-like tissue, respectively. Table 1 (apparent production amount of stigma-like tissue containing saffron pigment) (
Note) Apparent production amount of stigma-like tissue containing saffron pigment The amount equivalent to three stigma parts containing saffron pigment of natural saffron is (103), those with no quantity are (0), and the proportion between these is divided into The equivalent amount of stigma-like tissue containing saffron pigment generated per explant of the saffron tube part used for culture was determined visually, and the value was calculated by applying it to the above scale. Table 2 (apparent pigment concentration of stigma-like tissue containing saffron pigment)
(Note) Apparent pigment concentration of the stigma-like tissue containing saffron pigment.
〔０〕とし、その間をサフラン色
素の濃度に比例するように１１段階に区分して色の濃さ
を示す尺度とし、組織培養によって発生したサフラン色
素を含む柱頭様組織の色の濃さを目視によって判定し、
上記尺度に当てはめて数値とした。
比較例１
実施例１でサフランの孔筒部分を培養するかわりに、実
施例１で用いたつぼみから採取した子房部分を用いて同
様な条件で培養を行った。結果を第３表及び第４表に示
す。
第 ３ 表
（サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの産生量）第
４ 表
（サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの色素濃度）
実施例２
実施例１でＭｕｒａｓｈｉｇｅ−５ｋｏｏｇの基本培地
（ＭＳ培地）を用いたかわりに、その無機塩部分の濃度
を第５表に示したように変えたＭＳ修正培地を用いて同
様な実験を行った。結果を第６表及び第７表に示した。
なお、本例ではショ糖濃度を６重量％で行った。
この例でも、実施例１と同様、良好な結果が得られた。
第 ５ 表
（無機塩濃度の変更部分のみを示す）
第 ６ 表
（サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの産生量）第
７ 表
（サフラン色素を含む柱頭様組織の見かけの色素濃度）
以上の実施例の結果と比較例のそれを対比すると、本発
明によって孔筒を用いて培養を行った場合が柱頭様組織
及び色素の産生量が多く、生産性に優れていることがわ
かる。[0] and divided into 11 levels proportional to the concentration of saffron pigment to indicate the depth of color, and visually check the depth of color of stigma-like tissue containing saffron pigment generated by tissue culture. Judging by
The values were calculated by applying the above scale. Comparative Example 1 Instead of culturing the saffron tube part in Example 1, the ovary part taken from the bud used in Example 1 was used and cultured under the same conditions. The results are shown in Tables 3 and 4. Table 3 (apparent production amount of stigma-like tissue containing saffron pigment) Table 4 (apparent pigment concentration of stigma-like tissue containing saffron pigment)
Example 2 Instead of using the Murashige-5koog basic medium (MS medium) in Example 1, a similar experiment was conducted using an MS modified medium in which the concentration of the inorganic salt portion was changed as shown in Table 5. went. The results are shown in Tables 6 and 7. In this example, the sucrose concentration was 6% by weight. In this example as well, similar to Example 1, good results were obtained. Table 5 (showing only the changed part of inorganic salt concentration) Table 6 (apparent production amount of stigma-like tissue containing saffron pigment) Table 7 (apparent pigment concentration of stigma-like tissue containing saffron pigment)
Comparing the results of the above Examples with those of Comparative Examples, it can be seen that when culture is performed using the well tube according to the present invention, a large amount of stigma-like tissues and pigments are produced, and the productivity is excellent.