JPH01199996A - ペプチドおよびその製法 - Google Patents
ペプチドおよびその製法Info
- Publication number
- JPH01199996A JPH01199996A JP63316586A JP31658688A JPH01199996A JP H01199996 A JPH01199996 A JP H01199996A JP 63316586 A JP63316586 A JP 63316586A JP 31658688 A JP31658688 A JP 31658688A JP H01199996 A JPH01199996 A JP H01199996A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- sequence
- amino acid
- amino acids
- ala
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8132—Plasminogen activator inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は内皮性プラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビター（ＦＡＩ−１）の活性中心のアミノ酸配列を含有
するペプチド、その製法、該ペプチドで動物を免疫する
ことにより得られる抗体、ならびにヒトの血液中のＦＡ
Ｉ−１を遮断することへのこれら抗体の使用に関する。
ビター（ＦＡＩ−１）の活性中心のアミノ酸配列を含有
するペプチド、その製法、該ペプチドで動物を免疫する
ことにより得られる抗体、ならびにヒトの血液中のＦＡ
Ｉ−１を遮断することへのこれら抗体の使用に関する。
生理学的に最重要な２種類のヒトプラスミノーゲンアク
チベーターであるｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡの活性は血液
中にある２種類の特異的なインヒビターにより調節され
ることが最近知られている。
チベーターであるｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡの活性は血液
中にある２種類の特異的なインヒビターにより調節され
ることが最近知られている。
これらは、一方は特に内皮細胞および血小板により生成
され放出されるＰＡｉｌと呼ばれる内皮性プラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビターであり、もう一方は胎
盤の栄養芽層細胞から放出されるＦＡＩ２と呼ばれる胎
盤性プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターであ
る。これら２種のインヒビターはプラスミノーゲンアク
チベーターとの高い会合定数を有する点で相互に類以す
るが、しかしながら免疫学的には関連しない。
され放出されるＰＡｉｌと呼ばれる内皮性プラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビターであり、もう一方は胎
盤の栄養芽層細胞から放出されるＦＡＩ２と呼ばれる胎
盤性プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターであ
る。これら２種のインヒビターはプラスミノーゲンアク
チベーターとの高い会合定数を有する点で相互に類以す
るが、しかしながら免疫学的には関連しない。
臨床的にはこれらインヒビターには重大な意味があると
思われる、なぜなら特にＦＡＩ−１濃度が強く高まると
生命に関わる合併症を生じ得るからである。かかる関係
はすでに深部下肢静脈血栓症、急性心筋梗塞、菌血症、
肝臓疾患、すい臓炎または癌の患者ならびに妊娠後期患
者および妊娠中毒症患者において記載されている。
思われる、なぜなら特にＦＡＩ−１濃度が強く高まると
生命に関わる合併症を生じ得るからである。かかる関係
はすでに深部下肢静脈血栓症、急性心筋梗塞、菌血症、
肝臓疾患、すい臓炎または癌の患者ならびに妊娠後期患
者および妊娠中毒症患者において記載されている。
このインヒビターの活性を特異的に遮断しうる物質が診
断上および治療上重要である。
断上および治療上重要である。
今驚くべきことに、例えば、場合により担体分子に結合
されていてもよいペプチド配列５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ｖａｌ Ｉ ｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
＋１ｅを免疫原として使用シタ場合に得られる抗体を用
いてＦＡＩ−１活性が遮断され得ることが見出された。
されていてもよいペプチド配列５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ
−Ｖａｌ Ｉ ｌｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
＋１ｅを免疫原として使用シタ場合に得られる抗体を用
いてＦＡＩ−１活性が遮断され得ることが見出された。
それゆえ本発明は４〜４０個のアミノ酸を含有しており
、その配列がペプチド５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ
−１１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｅのア
ミノ酸配列またはこの配列の一部分と一致しているペプ
チドに関する。
、その配列がペプチド５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ
−１１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｅのア
ミノ酸配列またはこの配列の一部分と一致しているペプ
チドに関する。
−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−なる配列が特に重要と思われるので
、この配列を含有するペプチドが好ましい。
、この配列を含有するペプチドが好ましい。
６〜２５個のアミノ酸を有しており、−Ａｒｇ−ＭｅＬ
−配列が各側面でそれぞれ少なくとも２個のアミノ酸に
より挟まれているペプチドが好ましい。
−配列が各側面でそれぞれ少なくとも２個のアミノ酸に
より挟まれているペプチドが好ましい。
特に好ましいペプチドは５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−１１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｅ−
またはＣｙｓ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−＋１
ｅ−ＶａｉＳｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−ＧＬＵ−Ｇｌｕ−１１ｓ−Ｉ Ｉｓである。
ｌ−１１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ
−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｅ−
またはＣｙｓ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−＋１
ｅ−ＶａｉＳｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ−ＧＬＵ−Ｇｌｕ−１１ｓ−Ｉ Ｉｓである。
かかるペプチドは本発明の抗体を取得するのに使用され
得る。
得る。
かかる抗体は対応するペプチドを用いる免疫吸着により
精製され得る。これらの抗体はヒトの血液中に存在する
ＦＡＩ−１の活性を特異的に遮断する。
精製され得る。これらの抗体はヒトの血液中に存在する
ＦＡＩ−１の活性を特異的に遮断する。
本発明によるペプチドはそれ自体知られた方法、例えば
古典的な、溶液中で操作する方法により製造され、その
場合保護されたアミノ酸またはペプチドセグメントを相
互に縮合させそして保護基を除去した後に所望のペプチ
ドが得られる。しかしながら本発明によるペプチドは固
相法により特に好都合に製造され、従って本発明はこれ
らペプチドの製法にも関する。
古典的な、溶液中で操作する方法により製造され、その
場合保護されたアミノ酸またはペプチドセグメントを相
互に縮合させそして保護基を除去した後に所望のペプチ
ドが得られる。しかしながら本発明によるペプチドは固
相法により特に好都合に製造され、従って本発明はこれ
らペプチドの製法にも関する。
個相ペプチド合成においては、場合によりアンカー分子
を備えていてもよい架橋ポリスチレン、ポリアクリルア
ミド等のようなマトリックス上にペプチドを合成しそし
てそこからとり外す。この合成には樹脂１ｇ当たり０．
１−１ミリモル好ましくは０．４〜０．６ミリモルのレ
ベルにＣ−末端アミノ酸が負荷された不溶性ポリスチレ
ンマトリックス（ジビニルベンゼンで１％架橋）が用い
られるのが好都合であった。ペプチドの合成は塩基に不
安定なＦｍｏｃ基（９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル基）を用いて行われるので、アンカー分子として
は従来法のＰ−アルコキシベンジルエステル化合物が用
いられた。
を備えていてもよい架橋ポリスチレン、ポリアクリルア
ミド等のようなマトリックス上にペプチドを合成しそし
てそこからとり外す。この合成には樹脂１ｇ当たり０．
１−１ミリモル好ましくは０．４〜０．６ミリモルのレ
ベルにＣ−末端アミノ酸が負荷された不溶性ポリスチレ
ンマトリックス（ジビニルベンゼンで１％架橋）が用い
られるのが好都合であった。ペプチドの合成は塩基に不
安定なＦｍｏｃ基（９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル基）を用いて行われるので、アンカー分子として
は従来法のＰ−アルコキシベンジルエステル化合物が用
いられた。
合成における溶媒としては好ましくはジクロロメタン、
Ｎ−メチルピロリドン、および特に好ましくはジメチル
ホルムアミドが用いられた。
Ｎ−メチルピロリドン、および特に好ましくはジメチル
ホルムアミドが用いられた。
洗浄および反応の各階段において通常樹脂１ｇ当たりｌ
Ｏ〜２５ｒＲＱの溶液または溶媒が用いられ、特に１５
ｍＱが好ましい。アミノ酸のσ−ＮＨ，基はＦｍｏｃ基
で保護されているので、トリ官能性アミノ酸の側鎖官能
基には下記保護基が選択される。
Ｏ〜２５ｒＲＱの溶液または溶媒が用いられ、特に１５
ｍＱが好ましい。アミノ酸のσ−ＮＨ，基はＦｍｏｃ基
で保護されているので、トリ官能性アミノ酸の側鎖官能
基には下記保護基が選択される。
セリン、トレオニン 第三ブチルエーテルグルタミン
酸 第三ブチルエステルアルギニン
４−メトキシ−２，３，６−）リメチルフェニルスルホ
ニル（Ｍｔｒ） システィン 第三ブチルメルカプトアミノ酸は
例えば活性エステル、混合無水物または対称無水物によ
り活性化およびカップリングが行われるが、しかしなが
らＨＯＢｔ／カルボジイミド、特にＮ、Ｎ’−ジイソプ
ロピルカルボジイミドを用いてその場で活性化されるの
が好ましい。
酸 第三ブチルエステルアルギニン
４−メトキシ−２，３，６−）リメチルフェニルスルホ
ニル（Ｍｔｒ） システィン 第三ブチルメルカプトアミノ酸は
例えば活性エステル、混合無水物または対称無水物によ
り活性化およびカップリングが行われるが、しかしなが
らＨＯＢｔ／カルボジイミド、特にＮ、Ｎ’−ジイソプ
ロピルカルボジイミドを用いてその場で活性化されるの
が好ましい。
α−ＮＨ，保護基は塩基を用いて除去され特に好ましく
は室温でＤＭＦ中の２０％ピペリジンが用いられた。各
反応段階の後で樹脂を好ましくはＤＭＦおよびイソプロ
ピルアルコールを用いて洗浄した。
は室温でＤＭＦ中の２０％ピペリジンが用いられた。各
反応段階の後で樹脂を好ましくはＤＭＦおよびイソプロ
ピルアルコールを用いて洗浄した。
ペプチドは好ましくはアシドリシスにより除去され、側
鎖基の保護基も同時に除去された。
鎖基の保護基も同時に除去された。
システィンのスルフヒドリル基はジチオトレイトールの
ようなチオールによるかまたは好ましくはブチルホスフ
ィンにより遊離された。本発明によるペプチドはそれ自
体知られた方法、例えばアガロースゲルでのゲル透過に
よるか、好ましくは高性能液体クロマトグラフィーによ
り精製された。
ようなチオールによるかまたは好ましくはブチルホスフ
ィンにより遊離された。本発明によるペプチドはそれ自
体知られた方法、例えばアガロースゲルでのゲル透過に
よるか、好ましくは高性能液体クロマトグラフィーによ
り精製された。
この合成ペプチドをその化学的組成および純度に関して
検べた。ペプチドの組成はアミノ酸分析により決定され
た。この目的には少量の試料をフェノールの存在下に６
Ｎ塩酸と１１０℃で２４または７２時間加熱した。
検べた。ペプチドの組成はアミノ酸分析により決定され
た。この目的には少量の試料をフェノールの存在下に６
Ｎ塩酸と１１０℃で２４または７２時間加熱した。
それによりアミノ酸が予想される範囲内でペプチド鎖に
とり込まれていることが確認され、そして同じくそれに
より合成抗原のペプチド含量が８５％に等しいかまたは
それ以上であることが判定された。
とり込まれていることが確認され、そして同じくそれに
より合成抗原のペプチド含量が８５％に等しいかまたは
それ以上であることが判定された。
ペプチドの純度はＣ１８逆相での高性能液体クロマトグ
ラフィーにより測定された。この目的には燐酸塩／アセ
トニトリルグラジェントが用いられた。ペプチドは８５
％より高い純度を有することが判明した。
ラフィーにより測定された。この目的には燐酸塩／アセ
トニトリルグラジェントが用いられた。ペプチドは８５
％より高い純度を有することが判明した。
抗体を得るには、かかるペプチドを場合によりシスティ
ン基を介して高分子担体に結合させる。かかる生成物を
用いて動物を免疫し、そして本発明で使用されうる抗体
を取得する。
ン基を介して高分子担体に結合させる。かかる生成物を
用いて動物を免疫し、そして本発明で使用されうる抗体
を取得する。
かかる高分子担体は例えばアルブミンまたはキーホール
リンペット ヘモシアニンでアリ、これらにペプチド
がチオエーテル結合によって結合される。ペプチドがア
ミノ基によって担体タンパク質に結合される方法、例え
ばグルタルアルデヒド法も結合法として適する。
リンペット ヘモシアニンでアリ、これらにペプチド
がチオエーテル結合によって結合される。ペプチドがア
ミノ基によって担体タンパク質に結合される方法、例え
ばグルタルアルデヒド法も結合法として適する。
免疫化抗原としてこれらの生成物を用いてポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体が生成されうる。これ
ら抗体はアフイニテイクロマトグラフイーにより精製さ
れうる。前記したペプチドをリガンドとして有するもの
あるいはこの目的にタンパク質Ａを使用するものがアフ
イニチイ物質として適当であることが判明しＩこ 。
ル抗体またはモノクローナル抗体が生成されうる。これ
ら抗体はアフイニテイクロマトグラフイーにより精製さ
れうる。前記したペプチドをリガンドとして有するもの
あるいはこの目的にタンパク質Ａを使用するものがアフ
イニチイ物質として適当であることが判明しＩこ 。
本発明ははまたかがる抗体ならびに薬剤としてのその使
用にも関する。
用にも関する。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。アミ
ノ酸の三文字略語はすべてＬ一体とする。
ノ酸の三文字略語はすべてＬ一体とする。
実施例 ｌ
ａ） Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−１
１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍａｔ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｅの合成合
成は半自動式ペプチドシンセサイザーを用いて実施され
た。１ｇのＦｍｏｃ−１１ｅ−１）−アルコキシベンジ
ルエステル−ポリスチレン（１％ジビニルベンゼン架橋
）を２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ １５ｍＱ
処理しそしてＤＭＦおよびイソプロパツールで洗浄した
。これに１．６５ミリモルのＦｍｏｃ−１１ｅ８よび２
．２５ ミ！ｊ モルノＨＯＢｔヲＤＭＦ １４ｍＱ
ｊ：ｍ解したものおよび１Ｍジイソプロピルカルボジイ
ミド溶液１．１ｍＱを加えた。この混合物を室温で１時
間振盪しそしてすべての過剰の試薬および可溶性副生物
が除去されるまでＤＭＦおよびインプロパツールで洗浄
した。下記アミノ酸誘導体： Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔ
Ｂｕ）、 Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、 Ｆｍｏｃ−Ａｌａ。
１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｍａｔ−Ａｌ
ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−１１ｅの合成合
成は半自動式ペプチドシンセサイザーを用いて実施され
た。１ｇのＦｍｏｃ−１１ｅ−１）−アルコキシベンジ
ルエステル−ポリスチレン（１％ジビニルベンゼン架橋
）を２０％（Ｖ／Ｖ）ピペリジン／ＤＭＦ １５ｍＱ
処理しそしてＤＭＦおよびイソプロパツールで洗浄した
。これに１．６５ミリモルのＦｍｏｃ−１１ｅ８よび２
．２５ ミ！ｊ モルノＨＯＢｔヲＤＭＦ １４ｍＱ
ｊ：ｍ解したものおよび１Ｍジイソプロピルカルボジイ
ミド溶液１．１ｍＱを加えた。この混合物を室温で１時
間振盪しそしてすべての過剰の試薬および可溶性副生物
が除去されるまでＤＭＦおよびインプロパツールで洗浄
した。下記アミノ酸誘導体： Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏｔ
Ｂｕ）、 Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、 Ｆｍｏｃ−Ａｌａ。
Ｆｍｏｃ−１ｉｅ、 Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、 Ｆｍｏｃ−
Ａｒｇ（Ｍｔｒ）、 Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、 Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＳｔＢｕ）を使用してＮ−末端アミ
ノ酸に到達するまでこの方法を続けた（ＳｔＢｕは第三
ブチルメルカプトである）。
Ａｒｇ（Ｍｔｒ）、 Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、
Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、 Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＳｔＢｕ）を使用してＮ−末端アミ
ノ酸に到達するまでこの方法を続けた（ＳｔＢｕは第三
ブチルメルカプトである）。
この保護されたペプチド樹脂にトリフルオロエタ／−ル
１５ｍｆｆ、水２００１． Ｎ−１チルモル＊リン３０
μａおよびブチルホスフィン１００μαを加え、室温で
１２時間振盪した。樹脂をメタノール中の１％（ｖ／ｖ
）氷酢酸で洗い、高真空下に乾燥した。
１５ｍｆｆ、水２００１． Ｎ−１チルモル＊リン３０
μａおよびブチルホスフィン１００μαを加え、室温で
１２時間振盪した。樹脂をメタノール中の１％（ｖ／ｖ
）氷酢酸で洗い、高真空下に乾燥した。
その樹脂をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ） Ｌ８ｒｔｒＱ
、チオアニソールｌ ｍＱ、ジメルカプトエタン５００
μａおよびレゾルシノール５００ｍｇと混合しそして３
５°Ｃで３時間撹拌した。とり外されたペプチドを枦遇
しそしてジエチルエーテル３００ｍＱを用いテ結晶化さ
せた。結晶化した生成物をセファデックス０２５カラム
（３Ｘ １００ｃｍ、 ０．５％（ｖ／ｖ）酢酸）での
ゲル透過により一部分（１００ｒＡｇ）ずつ精製した。
、チオアニソールｌ ｍＱ、ジメルカプトエタン５００
μａおよびレゾルシノール５００ｍｇと混合しそして３
５°Ｃで３時間撹拌した。とり外されたペプチドを枦遇
しそしてジエチルエーテル３００ｍＱを用いテ結晶化さ
せた。結晶化した生成物をセファデックス０２５カラム
（３Ｘ １００ｃｍ、 ０．５％（ｖ／ｖ）酢酸）での
ゲル透過により一部分（１００ｒＡｇ）ずつ精製した。
凍結乾燥後に３２８ｍｇのペプチドが得られた。
ｂ）接合体の調製
３０ｍｇのキーホール リンペット ヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）をｐＨ８，０の０．０５ミリモル／１２燐酸ナト
リウム緩衝液中に溶解させそしてγ−アレイミド酪酸Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＩＢｓ） ３
ｍｇを１時間撹拌した。このタンパク質をセファデック
ス０５０カラム（２Ｘ ３０ｃｍＸ０．１モル／ａ燐酸
ナトリウム、０．５ミ！Ｊ ％、ル／Ｑ ＥＤＴＡ。
ＬＨ）をｐＨ８，０の０．０５ミリモル／１２燐酸ナト
リウム緩衝液中に溶解させそしてγ−アレイミド酪酸Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＩＢｓ） ３
ｍｇを１時間撹拌した。このタンパク質をセファデック
ス０５０カラム（２Ｘ ３０ｃｍＸ０．１モル／ａ燐酸
ナトリウム、０．５ミ！Ｊ ％、ル／Ｑ ＥＤＴＡ。
ｐＨ６，０）でクロマトグラフィーした。この活性化さ
れたタンパク質を５１１Ｉ１２となるまで濃縮し、ペプ
チドの３０ｒｎ９と１時間インキュベーションした。
れたタンパク質を５１１Ｉ１２となるまで濃縮し、ペプ
チドの３０ｒｎ９と１時間インキュベーションした。
透析および凍結乾燥後に免疫化抗原３５ｍｇが得られた
。
。
実施例 ２
ウサギの免疫化
ウサギ５匹を１西漸たり抗原それぞれ１．５ｍｇを用い
４時間免疫した。ペプチド−ＫＬＨ接合体を皮下および
静脈から投与した。次に動物がら放血させ、そして粗製
抗血清を防腐剤で安定化した。１西漸たりの収量：抗血
清１５０ｍｆｆ。
４時間免疫した。ペプチド−ＫＬＨ接合体を皮下および
静脈から投与した。次に動物がら放血させ、そして粗製
抗血清を防腐剤で安定化した。１西漸たりの収量：抗血
清１５０ｍｆｆ。
実施例 ３
免疫吸着剤の調製
実施例２に記載されるようにして得られた粗製抗血清を
アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。この
目的には、１６−ペプチドであるＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
１１ｅ ８０ｍｇをＡｘｅｎ氏他の方法（Ｎａｔｕｒｅ
２１４．１３０２１９６７）に従い、ブロムシアンで
活性化されたセファロース２５ｍ１２ｉ：ｉ合させた。
アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。この
目的には、１６−ペプチドであるＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
１１ｅ ８０ｍｇをＡｘｅｎ氏他の方法（Ｎａｔｕｒｅ
２１４．１３０２１９６７）に従い、ブロムシアンで
活性化されたセファロース２５ｍ１２ｉ：ｉ合させた。
次にこの免疫吸着剤を燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、 １
５０ミリモル／Ｑ％ｐＨ７，２）および酢酸（５００ミ
リモル／Ｑ、 ｐＨ２，５）で洗いそしてゲル量の３倍
のＰＢＳで平衡となした。
５０ミリモル／Ｑ％ｐＨ７，２）および酢酸（５００ミ
リモル／Ｑ、 ｐＨ２，５）で洗いそしてゲル量の３倍
のＰＢＳで平衡となした。
実施例 ４
抗体の取得
ＰＢＳで平衡となしたセファロース（実施例３記載）に
２３°Ｃで流速毎時約６０ｍ（ｌで粗製抗血清５０ｒａ
（１を通した。次にカラムの３倍量のＰＢＳ、ＬＭＮａ
ＣＱおよび蒸留水（ｐＨ７，０）で洗った。抗体を水（
ｐＨ２，５）で溶離させた。溶出液を固形トリスＨＣｆ
ｆを用いてｐＨ７，５に調整しそして一２０°Ｃで貯蔵
した。収量：抗体的４０ｍｇ。
２３°Ｃで流速毎時約６０ｍ（ｌで粗製抗血清５０ｒａ
（１を通した。次にカラムの３倍量のＰＢＳ、ＬＭＮａ
ＣＱおよび蒸留水（ｐＨ７，０）で洗った。抗体を水（
ｐＨ２，５）で溶離させた。溶出液を固形トリスＨＣｆ
ｆを用いてｐＨ７，５に調整しそして一２０°Ｃで貯蔵
した。収量：抗体的４０ｍｇ。
実施例 ５
免疫吸着により得られた抗体の検査
ａ）機能試験におけるＰＡｉｌ活性の遮断ウロキナーゼ
４０１Ｕ／ｍＱ血漿を予備インキュベーションしそして
次に抗−ウロキナーゼ抗体−セファロースに免疫吸着さ
せることにより調製されたＦＡＩ欠乏血漿５０μＱをお
よびＰＡＩに富んだ血＃ （１０単位／ ｍ（２） ５
０ｇｆｆを、ＰＢＳ中の抗体溶液（実施例４）、そのｌ
： １０． ｌ ：１００および１ ： １０００
希釈物ならびに対照としてのＰＢＳのみの５０μａずつ
と２３°Ｃで１５分間インキュベーションしそして次に
ＰＡ［活性の機能試験を行った。この目的にはトリス緩
衝液（１００ミリモル１０トリス、１００ミリモル／
Ｑ Ｎａ（Ｊｌ、 １％ポリゼリン、０．１％（ｗ／
ｖ）トリトン×１００中のＩＩＵのウロキナーゼを加え
、２３°Ｃで１０分間インキュベーションし、ｌＯミリ
モル／ＱのクロラミンＴ２Ｏ０μＱ１ および１０ミリ
モル／Ｑのトラネキサム酸を含有するトリス緩衝液中の
ｌ０ｃＴＡ−Ｕ／ ｍＱのプラスミノーゲン２００μα
を加工、２３°Ｏ’ｔ’ｌＱ分間インキュベーションし
た。
４０１Ｕ／ｍＱ血漿を予備インキュベーションしそして
次に抗−ウロキナーゼ抗体−セファロースに免疫吸着さ
せることにより調製されたＦＡＩ欠乏血漿５０μＱをお
よびＰＡＩに富んだ血＃ （１０単位／ ｍ（２） ５
０ｇｆｆを、ＰＢＳ中の抗体溶液（実施例４）、そのｌ
： １０． ｌ ：１００および１ ： １０００
希釈物ならびに対照としてのＰＢＳのみの５０μａずつ
と２３°Ｃで１５分間インキュベーションしそして次に
ＰＡ［活性の機能試験を行った。この目的にはトリス緩
衝液（１００ミリモル１０トリス、１００ミリモル／
Ｑ Ｎａ（Ｊｌ、 １％ポリゼリン、０．１％（ｗ／
ｖ）トリトン×１００中のＩＩＵのウロキナーゼを加え
、２３°Ｃで１０分間インキュベーションし、ｌＯミリ
モル／ＱのクロラミンＴ２Ｏ０μＱ１ および１０ミリ
モル／Ｑのトラネキサム酸を含有するトリス緩衝液中の
ｌ０ｃＴＡ−Ｕ／ ｍＱのプラスミノーゲン２００μα
を加工、２３°Ｏ’ｔ’ｌＱ分間インキュベーションし
た。
５００ミリモル／ＱのＮａＣＱ中の０．６μモル／αの
色原体プラスミン基質Ｎｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ
（Ｎｖａ ＝ノルバリン、ＣＨＡ＝シクロへキシルア
ラニン、ｐＮＡ＝ｐ−ニトロアニリド）５００μαによ
り検出反応を開始させ、２３℃で１０分後に８．５Ｍ酢
酸１００μαを用いて停止させた。試料の機能的なＦＡ
Ｉの含量は４０５ｎｍで測定された吸光変化と直線状の
反比例関係にある。
色原体プラスミン基質Ｎｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ
（Ｎｖａ ＝ノルバリン、ＣＨＡ＝シクロへキシルア
ラニン、ｐＮＡ＝ｐ−ニトロアニリド）５００μαによ
り検出反応を開始させ、２３℃で１０分後に８．５Ｍ酢
酸１００μαを用いて停止させた。試料の機能的なＦＡ
Ｉの含量は４０５ｎｍで測定された吸光変化と直線状の
反比例関係にある。
結果：
添加物： ＰＢＳ ８００ ３５
０抗体 １ ： １０００ ８０５
３６８抗体 １ ： ｔｏｏ ７９３
５９０抗体 １：１０ ８１０
６８５未希釈 ８０２ ７
００ＦＡＩに富んだ血漿の迅速な阻害能力の約８０％が
抗体により遮断できた。
０抗体 １ ： １０００ ８０５
３６８抗体 １ ： ｔｏｏ ７９３
５９０抗体 １：１０ ８１０
６８５未希釈 ８０２ ７
００ＦＡＩに富んだ血漿の迅速な阻害能力の約８０％が
抗体により遮断できた。
ｂ）生物学的液体からのＦＡＩ−１活性の免疫吸着によ
る除去 抗体Ｌ４ｒｎｇをブロムシアンにより活性化されたセフ
ァロース１０ｍ１２に固定した。ＦＡＩに富んだ血漿５
ｍ（２を毎時ＬＯｍＱの流速でセファロースに通した。
る除去 抗体Ｌ４ｒｎｇをブロムシアンにより活性化されたセフ
ァロース１０ｍ１２に固定した。ＦＡＩに富んだ血漿５
ｍ（２を毎時ＬＯｍＱの流速でセファロースに通した。
希釈度を顧慮して溶出液の試料を機能的なＰＡｉｌ活性
について検査した。血漿はそのＰＡ［活性の約７０％を
失っていた。
について検査した。血漿はそのＰＡ［活性の約７０％を
失っていた。
実施例 ６
ａ） Ａｌａ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａ
ｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｃ
ｙｓの合成 １ｇのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＳｔＢｕ）−ｐ−アルコキ
シベンジルエステルポリスチレンから出発し、ペプチド
を実施例１ ａ）におけると同様にして合成し、とり外
しそして精製した。収量２４５ｍｇ。
ｌａ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｃ
ｙｓの合成 １ｇのＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＳｔＢｕ）−ｐ−アルコキ
シベンジルエステルポリスチレンから出発し、ペプチド
を実施例１ ａ）におけると同様にして合成し、とり外
しそして精製した。収量２４５ｍｇ。
ｂ）接合体の調製
実施例１ｂ）におけるようにして接合体を調製した。収
量３６ｍ９゜ 実施例２〜４に記載されるようにウサギの免疫化、免疫
吸着剤の調製および抗体の取得を行った。免疫吸着によ
り得られた抗体を実施例５の記載に従い検査すると、１
：２０の力価までＦＡＩ活性を遮断する抗体（ＦＡＩ活
性の約８０％遮断）が見られた。
量３６ｍ９゜ 実施例２〜４に記載されるようにウサギの免疫化、免疫
吸着剤の調製および抗体の取得を行った。免疫吸着によ
り得られた抗体を実施例５の記載に従い検査すると、１
：２０の力価までＦＡＩ活性を遮断する抗体（ＦＡＩ活
性の約８０％遮断）が見られた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）４〜４０個のアミノ酸を含有しており、その配列が
ペプチド【遺伝子配列があります】 のアミノ酸配列またはこの配列の一部分と一致しており
、そして場合によりＮ−またはＣ−末端にシステインが
結合されており、かつ場合により担体に結合されている
ペプチド。 ２）配列−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−を含有することからなる請
求項１記載のペプチド。 ３）６〜２５個のアミノ酸および配列−Ａｒｇ−Ｍｅｔ
−を含有しており、この配列は少なくとも２個のアミノ
酸により挟まれていることからなる請求項１記載のペプ
チド。 ４）【遺伝子配列があります】 ５）Ｎ−またはＣ−末端がシステインであることからな
る請求項１記載のペプチド。 ６）一方の末端がポリマーに結合したシステインである
ことからなる請求項１記載のペプチド。 ７）ポリマーに結合された【遺伝子配列があります】。 ８）保護されたアミノ酸誘導体またはペプチドセグメン
トを溶液中でまたは固相上で相互に結合させ、そして保
護基を除去しかつ固相の場合は担体樹脂からとり外すこ
とにより、請求項１記載のペプチドを得ることからなる
請求項１記載のペプチドの製法。 ９）場合により担体に結合されていてもよい請求項１記
載のペプチドを抗原として使用して得られた抗体。 １０）請求項９記載の抗体を薬剤としてまたは診断に使
用すること。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873742997 DE3742997A1 (de) | 1987-12-18 | 1987-12-18 | Peptide, verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung zur gewinnung von antikoerpern sowie deren verwendung zur blockierung der pai-1-aktivitaet menschlichen blutes |
| DE3742997.3 | 1987-12-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01199996A true JPH01199996A (ja) | 1989-08-11 |
Family
ID=6342939
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63316586A Pending JPH01199996A (ja) | 1987-12-18 | 1988-12-16 | ペプチドおよびその製法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0320840A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01199996A (ja) |
| KR (1) | KR890009972A (ja) |
| AU (1) | AU634955B2 (ja) |
| DE (1) | DE3742997A1 (ja) |
| DK (1) | DK703588A (ja) |
| FI (1) | FI885797A7 (ja) |
| PT (1) | PT89224B (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU739373B2 (en) * | 1997-10-17 | 2001-10-11 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Compositions and methods for promoting internalization and degradation of urokinase-type plasminogen activator |
| US6750201B1 (en) | 1997-10-17 | 2004-06-15 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for promoting internalization and degradation of urokinase-type plasminogen activator |
| WO2001051085A1 (en) * | 2000-01-14 | 2001-07-19 | Tanox, Inc. | Use of antagonists of plasminogen activator inhibitor-1 (pai-1) for the treatment of asthma and chronic obstructive pulmonary disease |
| EP2566890A4 (en) * | 2010-05-03 | 2013-11-20 | Abbvie Inc | ANTI-PAI-1 ANTIBODIES AND METHOD FOR THEIR USE |
| TR201907379T4 (tr) * | 2014-02-21 | 2019-06-21 | Astellas Pharma Inc | Yeni anti-insan PAI-1 antikoru. |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4923807A (en) * | 1984-05-18 | 1990-05-08 | New England Medical Center Hospitals Inc. | Arg-Serpin human plasminogen activator inhibitor designated PAI-2 |
| DK319685A (da) * | 1985-07-12 | 1987-01-13 | Fonden Til Fremme Af Eksperime | Monoklonale antistoffer, fremgangsmaade til frembringelse af antistofferne, hybridomaceller, der producerer antistofferne, og anvendelse af antistofferne |
| WO1990013648A1 (en) * | 1989-05-11 | 1990-11-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | HIGH LEVEL EXPRESSION OF FUNCTIONAL HUMAN PLASMINOGEN ACTIVATOR INHIBITOR (PAI-1) IN $i(E. COLI) |
| NL8902454A (nl) * | 1989-10-03 | 1991-05-01 | Stichting Centraal Lab | Mutanten van de humane plasminogeen activator inhibitor 1 (pai-1), hun bereiding en toepassing, en recombinante polynucleotiden die voor deze mutanten coderende genetische informatie omvatten. |
-
1987
- 1987-12-18 DE DE19873742997 patent/DE3742997A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-12-10 EP EP88120699A patent/EP0320840A3/de not_active Withdrawn
- 1988-12-15 PT PT89224A patent/PT89224B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-12-15 FI FI885797A patent/FI885797A7/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-12-16 DK DK703588A patent/DK703588A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-12-16 JP JP63316586A patent/JPH01199996A/ja active Pending
- 1988-12-16 KR KR1019880016760A patent/KR890009972A/ko not_active Withdrawn
- 1988-12-16 AU AU26955/88A patent/AU634955B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0320840A2 (de) | 1989-06-21 |
| AU2695588A (en) | 1989-06-22 |
| DE3742997A1 (de) | 1989-06-29 |
| DK703588A (da) | 1989-06-19 |
| PT89224A (pt) | 1989-12-29 |
| AU634955B2 (en) | 1993-03-11 |
| FI885797L (fi) | 1989-06-19 |
| PT89224B (pt) | 1993-07-30 |
| FI885797A7 (fi) | 1989-06-19 |
| FI885797A0 (fi) | 1988-12-15 |
| KR890009972A (ko) | 1989-08-05 |
| EP0320840A3 (de) | 1990-04-25 |
| DK703588D0 (da) | 1988-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4916070A (en) | Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies | |
| FI100184B (fi) | Ihmisen kudostekijään liittyvä DNA-kappale ja yhdistelmä-DNA-molekyyli sekä menetelmä proteiinin valmistamiseksi | |
| CA2021912C (en) | Erythropoietin (epo) peptides and antibodies directed against these | |
| US6001978A (en) | Human tissue factor related DNA segments polypeptides and antibodies | |
| JPS61501912A (ja) | 合成ポリペプチドにより誘発されたヒトインタ−ロイキン−２に対する抗体 | |
| EP0658168B1 (en) | Antibodies specific for a haemostatic protein, their use for isolating intact protein, haemostatic compositions devoid of proteolytic cleavage products of the protein | |
| JP2002517245A (ja) | 治療的および診断的ドメイン１β２ＧＰＩポリペプチドおよびその使用の方法 | |
| US4980279A (en) | Cellular fibronectin: polypeptides, anti-polypeptide antibodies and assay methods | |
| EP0203587A2 (en) | Ras oncogene peptides and antibodies | |
| JP2008110986A (ja) | 長期持続性抗新脈管形成ペプチド | |
| JP2009001576A (ja) | 癌、関節炎および網膜症の治療用抗脈管形成薬 | |
| JP2735233B2 (ja) | 合成ペプチドおよびそれに対する抗体 | |
| EP1780219A2 (en) | Protein S polypeptides and uses thereof | |
| JPH01199996A (ja) | ペプチドおよびその製法 | |
| US5620688A (en) | Methods of inhibiting the activation of Factor XIII | |
| JPH04505614A (ja) | タンパク質複合体 | |
| JP2634683B2 (ja) | フイブリンに対する抗体；抗体の調製に適当な免疫原ペプチド、フイブリンを決定する方法および抗体に基づく製剤 | |
| EP0188589A1 (en) | Immunopurification process | |
| WO1993001209A1 (en) | Proteins s polypeptides and uses thereof | |
| JP2530714B2 (ja) | フイブリンに対する抗体；抗体の製造に使用される免疫原、抗体及び抗体を基剤とした製薬学的製剤でフイブリンを測定する方法 | |
| US5254672A (en) | Synthetic peptides which contain sequences from factor VIIa, and the use thereof | |
| JPH0570484A (ja) | ペプチドおよびその塩 | |
| JPH05252984A (ja) | スロンビンとスロンビン阻害物質とにより形成された複合体に対して向けられたモノクローナル抗体 | |
| JPH0291097A (ja) | プロウロキナーゼ配列を有するペプチドおよびその製法 | |
| JPH0575394B2 (ja) |