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JPH01150856A - 抗原および抗体の同時免疫定量法 - Google Patents

抗原および抗体の同時免疫定量法

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Publication number
JPH01150856A
JPH01150856A JP63276350A JP27635088A JPH01150856A JP H01150856 A JPH01150856 A JP H01150856A JP 63276350 A JP63276350 A JP 63276350A JP 27635088 A JP27635088 A JP 27635088A JP H01150856 A JPH01150856 A JP H01150856A
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JP
Japan
Prior art keywords
label
antibody
antigenic substance
substrate
enzyme
Prior art date
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Pending
Application number
JP63276350A
Other languages
English (en)
Inventor
Elliott Dawson
エリオツト　ダウソン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BioVentures Inc
Original Assignee
BioVentures Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BioVentures Inc filed Critical BioVentures Inc
Publication of JPH01150856A publication Critical patent/JPH01150856A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原および抗体の同時免疫測定法に関する。
〔従来の技術〕
抗原−抗体反応は、ヒトおよびその他の動物が異物に曝
露した時に自然に発現する免疫応答の一部である。抗体
はイムノグロブリンといわれる血清中に見られるタンパ
ク質の一部に由来する。宿主生物に抗原性物質が存在す
ると、抗原に結合し抗体−抗原複合体を形成するイムノ
グロブリンの合成が起こる。この結合は、抗原・抗体間
の特異性が高（かつ結合定数が大きいことが特徴である
。
結合に関与する抗原領域を抗原決定基といい、結合に関
与するイムノグロブリン領域を抗体結合部位とい５゜抗
体・抗原間の高度の特異性およびアフイニテイにより、
これらの物質の存在および／または濃度を測定する高感
度かつ特異性の高い方法が開発された。この方法は、病
気の診断において重要である。抗原または抗原性物質に
対する抗体の検出は、抗原−抗体複合体と抗原または抗
体の遊離型とを識別する能力に左右される。
抗原および抗体を検出する従来技術は、ｉ多い。
これらの方法処は、ラテックスまたはシリカの不溶性粒
子を形成する細胞凝集反応、ゲル分散、補体固定、免疫
電気泳動、ウェスタンブロッティング、螢光抗体法、ラ
ジオイムノアッセイ、サンドウィッチ＃累連結イムノソ
ルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）法および酵素モジュレ
ーション免疫定量法がある。
後天性免疫不全症候群〔エイズ（ＡＩＤＳ　）　］関連
ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ　）を検出する場合、免
役化学検査は重要な手段であった。汚染血液または汚染
血液製剤によりＨＩＶの侵入を受けＡＩＤＳ疾患に感染
した人数が結果的に減少していることから、血中または
血液製剤中にＨＩＭが存在していることを確認すること
の有用性が示唆される。ＨＩＶに対する抗体およびＨＩ
Ｖ産生抗原の検出法については、文献に記載されている
（参照。例、グループマンら（Ｇｒｏｏｐｍａｎ　ｅｔ
　ａｌ、　）　ｘイズおよび関連病、壱におけるＨＴＬ
Ｖ　−ｒｘ感染の血清学的特徴、’　　１５３　Ｊ、　
ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　７３
６　（１９８６）　ｐアレン（Ａ１１ｅｎ　）　、　　
”エイズ思考抗体で検出された新規ＨＴＬＶ　−ｌ　／
　ＬＡＶ分類抗原’　２３０５ｃｉｅｎｃｅ８１０　（
１９８５）　ｔサーンガドハランら（８ａｒｎｇａｄｈ
ａｒａｎｅｔａ１．）、’エイズ患者およびエイズ危険
群患者血清中の、ヒトＴ−リンパ球レトロウィルス（Ｈ
ＴＬＶ　−ｍ　）反応性抗体’　２２４５ｃｉｅｎｃｅ
　５０６（１９８４）　；ガロら（Ｇａ１ｌｏ　ｅｔ　
ａｌ、　）　、　　’ｘイズ患者およびエイズ危険群患
者からのサイクロパシツクレトロウイルス（ＨＴＬＶ−
１１［）の頻繁な検出・分９４７．　、２２４５ｃｉｅ
ｎｃｅ　５００　（１９８４）。
〔発明が解決しようとする課題〕
現在ＨＩＶ検邑に用いられているひとつの検査は、ＥＬ
ＩＳＡ（エリザ）法（酵素連結イムノソルベントアッセ
イ法）といわれる技？（ｆ　Ｋ基づいている。本法では
、破砕ウィルス粒子のウィルスタンパクをプラスチック
表面に被覆する。このタンパクを患者血清に４し、イン
キュベートする。これらのタンパクに対する抗体が患者
血清に含まれていると、プラスチック表面上のウィルス
タンパクに結合する。非結合抗体を洗浄し除去する。酵
素標識抗ヒト抗体（シグナル増感剤）を次に洗浄済のプ
ラスチック表面とインキュベートする。酵素標識抗体は
、ＨＩＶ被αプラスチック表面に保持されたＨＩＶ抗体
の全てに結合する。次に、非結合抗ヒト抗体を除去する
ため、もう−度洗浄を行う。基質を添加すると酵素標識
により有色物に変化し、サンプル中にＨＩＶ抗体が存在
することを示す。本法は感度・特異性ともに良好である
が、陽性サンプルについては全てウェスタンブロッティ
ングで確認しなければならない。このＨＩＶ検査法では
高価な装置を必要とし、時間のかかるグロトコールを用
いかつこの操作を行５には高度熟練技術者が必要となる
。医師が自らのオフィスで本法を簡単く行うことはでき
ず、検査施設で検査するため、サンプルを集めることが
必要となる。サンプルを運搬すると紛失することもあり
得るし、検査完了前にサンプルが傷んだりあるいは変性
することもあり得る。
エイズ感染過程においてＨＩＶに対する抗原および抗体
が検出可能な程存在することは確信を持って予測するこ
とは不可能であり、しかも患者間で異なっている。通常
、）ＨＶ抗原は感染過程において、終始検出可能である
が、感染後１４力月になるまで抗原もしくは抗体が出現
しない例外症例もあった。ＨＩＶに対するＩｇＭ抗体は
、曝露後２〜３週間で通常検出可能であり、工ｇＧ抗体
は１２週まで釦検出可能となる。現在のＦＤＡ承詔エイ
ズ検査類はＩｇＧ抗体のみを検出するので、つまり、感
染血液がスクリーニングで見落とされる期間があること
になる。本発明は、エリザ（ＥＬＩＳＡ）同様に、ＨＩ
Ｖに対するＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の双方を検出可能で
あるという利点を有している。さらに、ＨＩＶに対する
ＩｇＡ抗体とＩｇＥ抗体も検出可能である。
したがって、血液サンプル中にＨＩＶに対する抗体が検
出不可能な期間が、本発明の免疫定量法を用いることに
より、実質上短縮される。
ゆえに、高感度・高い特異性で、高度熟練者あるいは高
価な実験施設も必要とせず低価格で容易に実施でき、か
つ、例えばエイズウィルスの検出にも使用可能な免疫化
学定量法で、液体サンプル中の抗原もしくは抗体濃度を
定量する免疫化学定量法を提供するのが、本発明の目的
である。
〔課題を解決するための手段〕
本発明による免疫化学定量法操作の原理は、２つの異な
る標識抗体が同一の抗原に結合した場合、あるいは２つ
の異なる標識抗原が同一抗体く結合する場合、検出可能
なシグナルを産生ずることである。この技術は、微蓄濃
度の抗原あるいは抗体の存在もしくは量を決定するのに
用いることができる。
本発明による定量法は、同時免疫定量法（略して８ＩＡ
）と総称される。本発明は、以下の表示を参照して述べ
ることができる。
基質　　シグナル　　基質　　シグナルＬ、　　　　　
Ｌ２Ｌ、　　　　　Ｌ２Ａｇ　　　　　Ａｇ　　　　Ａ
ｂ　　　　ＡｂＡｂ　　　　　　　　　　Ａｇ ここで、Ａｂは抗体を、Ａｇは抗原を、Ａｂ−Ｌ。
は標識１に結合した抗体を、Ａｂ　−Ｌ２は標識２に結
合した抗体を、Ａｇ−Ｌ、は標識１に結合した抗原を、
そしてＡｇ　−Ｌ２は標識２に結合した抗原を表す。
この免疫化学定量法は、（１）第一標識結合抗原または
抗体断片（Ａｂ−Ｌ、）、第二標識結合第二抗原または
抗体断片（Ａｂ−Ｌ２）および液体中抗原性物質（Ａｇ
）の三重複合体を形成し、そして、（２）少なくとも１
基質の存在下において、第一標識と第二標識の相互作用
で産生され、抗原性物質に互いに近接して結合すること
により増感されたシグナルを検出すること忙より、液体
中抗原性物質の存在または濃度を検出するのに用いるこ
とができる。また、この免疫化学定量法は、（１）第一
標識に結合した抗原性物質（Ａｇ−Ｌ、）、第二標識に
結合した抗原性物質（Ａｇ−Ｌ２）および液体中の抗体
（Ａｈ　）の三重複合体を形成し、そして（２）少なく
とも１基質存在下で、第一標識と第二標識の相互作用で
産生され、抗体に互いに近接して結合することにより増
感されたシグナルを検出することにより、液体中抗体の
存在または濃度を検出するのに用いることができる。
また、この免疫化学定量法は、競合反応法において、（
１）決定すべき抗原性物質の存在下で、第一標識に結合
した抗原性物質、第二ｇ識に結合した抗原性物質および
抗原性物質に対する抗体の三重複合体を形成し、そして
、（２）少な（とも１基質の存在下で、該第一標識と該
第二標識の相互作用で産生され、抗体忙互い化近接し結
合することにより増感されたシグナルを検出することに
より、液体中抗原性物質の存在もしくは濃度を検出する
のに用いることができる。また、この免疫化学定量法は
、競合反応において、抗体に互いに近接して結合するこ
とにより増感された該第一標識と該第二標識との相互作
用により、少なくともひとつの基質の存在を検出するた
めにも用いることができる。また、この免疫化学定量法
は、競合反応法において、（１）決定すべき抗体の存在
下で、第一標識に結合した抗体、第二標識に結合した抗
体および抗原性物質の三重複合体を形成し、そして、（
２）少なくとも１基質の存在下で、該第一標識と該第二
標識間の相互作用により生成され、抗原性物質に結合し
互いに近接していることＫより増感されたシグナルを検
出することによって、液体中抗体の存在または濃度を検
出するために用いることができる。
抗原性物質の非競合免疫化学定量法では、第一標識（Ａ
ｂ−Ｌ、）に結合した抗体は抗原に結合し、第二Ｂ　Ｒ
（Ａｇ−Ｌ２　）　Ｋ結合した抗体も同一の抗原に結合
し三重の抗原−抗体複合体を形成する。
第一標識と第二標識間の相互作用により、検出可能なシ
グナルが出る。このシグナルは第一標識の第一基質上で
の作用により発生し、第二標識の第二基質上での作用が
続くが、これは第一反応において産生されたものである
。遊離溶液中で非結合抗体に結合した第一および第二標
識の相互作用は、こうした相互作用により誘起された検
出可能シグナルが最小となるようなものである。非結合
第一標識により産生された基質を全て溶液中から除去し
、第二Ｍｍとの反応を防止することができる。
シグナル産生は、協奏作用を行う標識に依存するが、こ
のシグナｐは抗原存在により増感され、三重り合体が形
成されるとこの抗原は抗体結合標訟を互いに近接するよ
うに持っていく。産生されるシグナル強度は、サンプル
中に存在する抗ｒＩＫ量に直接比例する。第一標識に結
合する抗原と、別の第二標ｍｔｉｃｌ：ｉ合する抗原が
同一の抗体に結合した時シグナルが出ること以外は、抗
体の非競合免疫化学定量法は同じように作用する。
本発明による輩合免疫化学定量法は、サンプル中で決定
すべき物質に標識が結合する以外は、非競合定量法と同
一の原理（結合標識の近位性）で行われる。したがって
、抗原もしくは抗体が存在すると、結合部位を標識抗ｙ
Ｘ、ｔたは榎Ω抗体と競合し、互いに近接し結合した標
識対の数がサンプル中に存在する抗原または抗体量に比
例して減少するため、このシグナルは少なくなる。
本発明による免疫化学定量法の１つの実施例では、この
ば識の少なくともひとつを基質反応な触媒する酵素とし
、その反応の進行をシグナルを出すことで測定する。
本発明の好適な実施例では、第一および第二標識を連続
反応を触媒する各＃素とし、この反応のうちの少なくと
も１つの進行をシグナルを出すことで測定する。この好
適な実施例では、シグナルを種々の方法で検出すること
ができる。第一に、第二基質に作用する第二酵素標識生
成物の出現を測定することができる。第二に１第一およ
び第二酵素標識の連続作用による第一基質の消失を測定
することもできる。第三に、第二酵素が第一基質を再生
するような酵素標識を選択すれば、その時には、シグナ
ルを構成し、連続反応全体の速度を測定することもでき
る。反応消失後の終点を検出するか、または好ましくは
反応生成物の蓄積を時間とともに測定する動力学的方法
で酵素反応の進行を測定することもできる。酵素反応生
成物の出現もしくは消失を直接測定するか、または別法
として、これら生成物による続発反応生成物または反応
の進行を測定することもできる。
本発明による免疫化学定量法において、抗原または抗体
に結合することのできる酵素標識対としては、グルコー
スオキシダーゼとホースラデイツシユ・パーオキシダー
ゼ、ホースラデイツシユ・パーオキシダーゼとルミノー
ル、およびホスホエノールピルピン酸キナーゼとルシフ
ェラーゼが挙げられる。
グルコースオキシダーゼは、グルコースと分子状酸素間
の反応を触媒し、過酸化水素を生成する。
パーオキシダーゼは、過酸化水素存在下で、踵々の発色
性基質の酸化を触媒する。グルコースオキシダーゼ作用
により、オルトフェニレンジアミンのような基質のパー
オキシダーゼ触媒酸化のひとつの基質として、過酸化水
素が生じる。パーオキシダーゼ触媒酸化速度は、グルコ
ースオキシダーゼ結合抗原をも結合する抗体に結合した
抗原に結合したパーオキシダーゼで触媒される反応より
も、有意忙速い。抗体−（酵素標識抗原）複合体中でグ
ルコースオキシダーゼとパーオキシダーゼが近接するこ
とで、遊離溶液中で起こる速度よりも連続触媒反応速度
が促進される。その理由は、パーオキシダーゼが容易に
過酸化水素を利用できるようになるからである。パーオ
キシダーゼ触媒酸化の進行度は、発色性基質の色の変化
を観察することで測定できる。カタラーゼのような過酸
化水素スカベンジャーの存在は、非結合抗原または抗体
忙結合したパーオキシダーゼの遊離溶液中での過酸化水
素に対する作用によって生じるバンクグラウンドを減少
させる。
パーオキシダーゼは、過酸化水素を酸素と水に分解する
。ルミノールは、酸素存在下で光を発する。したがって
、パーオキシダーゼとルミノールを、酵素標識の対とす
ることが可能である。抗体または抗原を含むサンプルに
過酸化水素を添加すると、光が生じ、その強度はフォト
ダイオードで測定可能である。パーオキシダーゼ標識抗
原とルミノール標識抗原を同一の抗体に結合すると、酸
素がルミノールに容易に利用できるようになるため、放
出光の強度は増加する。
ホスホフェノールピルピン酸キナーゼ（Ｅ、　）とルシ
フェラーゼ（Ｅ２）は以下の対処なった反応を触媒する
。
ホスホエノールピルピン［＋ＡＤＰ 一」→ピルピン酸＋ＡＴＰ ルシフェリン＋ＡＴＰ　十〇□ 一光＋Ｃｏ２＋　ＡＭＰ＋オキジルシフェリンルシフェ
ラーゼ触媒反応で生成した光は、同一抗体または抗原に
結合したピルピン酸キナーゼとルシフェラーゼ結合物が
近接することにより著明に増感される。この光は、シン
チレーションカウンターで測定することができる。
酵素結合物に加え、本発明の免疫化学定量法ではその他
の標識を用いることができる。例えば、ルミノールとフ
ルオレセインを標識として対にすることができるが、こ
の時には、化学ルミネサンス光が出る。ルミノール標識
抗体または抗原を、フルオレセイン標識抗体または抗原
に近接し結合すると、放出光の波長がシフトするが、こ
れはルミノメータ−で検出可能である。
標識と結合する抗原は、純度および特異性が最大のもの
がふされしい。不活化抗原を用いることができ、結合前
にクロラミンＴまたは過ヨウ素酸で酸化することができ
る。非結合標識および抗原を、標識の分子量に応じ、ゲ
ルろ過クロマトグラフィまたは透析で、標識抗原から分
離することができる。この標識もまた、純度最高でなけ
ればならない。もし標識に酵素を用いる場合には、これ
らは、合理的に達成可能な最高の純度と特異性を有して
いなければならない。抗体または抗原の標識との結合は
、従来技術で公知の技術を用いて行われる。酵素結合物
の場合については、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏ
１ｏｇｙ第３７巻、１３３頁（１９７５）を参照のこと
。フルオレセイン結合物については、Ｎ、Ｂ。
チェリーら（Ｎ、　Ｂ、　Ｃｈｅｒｒｙ　ｅｔ　ａｌ、
　）　ｆ）　Ｓｔａｉｎ（ｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ　４４巻、１７９頁（１９６２年）を参照のこと。
標識と結合する抗体は、同一抗原に反応可能であり、か
つアフイニテイで精製可能であるものが適切である。こ
の抗体は、同−抗原性物質上の異なる抗原決定基に特異
的なモノクローナル抗体でも良い。また、この抗体は、
パパインまたはペプシンでそれぞれ抗体を消化して生成
したＦａｂおよびＦａｂ、抗体フラグメントであっても
良い。
本発明による免疫化学定量法は、生成する′シグナル強
度が液体サンプル中（（存在する抗原または抗体量に比
例するので、抗体または抗原の定性・定量の双方に用い
ることができる。濃度既知の抗原または抗体シリーズで
生成するシグナルと、抗原！たは抗体サンプルで測定し
たシグナルを比較し濃度を決定することができる。
本発明は、以下の実施例を参照すればさらに良（理解で
きるが、これらの例は限定的なものではない。
〔実施例〕
実施例工 酵素標識ＨＩＶとＨＩＶ抗体との反応−Ｈ−９溶菌液か
ら具製し不活化したＨＩｖ抗原（濃度１　！ｎｙ　／　
ｒｒｔ　（サイトチック（ｃｙｔｏｔｅｋ　）　’］　
）をクロラミ・ンーＴ（２〜／ｌｄ）と氷上で２時間、
２−４℃で反応させた。セントリコンｌ　Ｏ（ｃＥＮＴ
几ＩＣ０Ｎ　１０　）　微ｔ６％縮装置（アミｉ　ｙ　
（１ｍ１ｃｏｎ　）含 製造）を用いて、７００１！！”汗壬で１０分間遠心し
、・未反応クロラミンＴを除去した。酸化ＨＩＭ抗原を
含む残液を、同装置を用い、水冷リン＃ｌ緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ　）で２度洗浄した。
酸化ｆ（ＩＶ抗原を元の体積に再調製し、Ｈ工ｖ抗原の
分子量を４万としこれを基準にビオチンヒドラジッド１
００等量と一晩（１６時間）、２−４℃で反応させた。
未反応ビオチンヒドラジッドと低分子量生成物を、上記
に述べた遠心分離釦より除去した。オルトフェニレンジ
アミン基債と３０分間インキュベートし、ｌ　：　６０
００　Ｋ希釈したアビジン・パーオキシダーゼ結合物を
用い、連続微量力価定量法でビオチン化を定量した。
ビオチン化ＨＩ　Ｖ抗原を２等分し、一方にモ／Ｉ／等
量のアビジン結合グルコースオキシダーゼを添加し、ピ
オチン化ＨＩＶ抗原の残りの半量にモル等量のアビジン
結合ホースラデイツシユ・パーオキシダーゼを添加した
。この溶液を２−４℃で一晩平衡とした。過剰の非標識
アビジンを添加し、アビジンに非結合のま普で残存して
いるビオチンを全てブロックした。標識抗原調製液の最
終濃度は、１　ｎｇ／μノであった。
ｌＩ″ＤＡ承認エリサ（ＥＬＩＳＡ　）検査法（アボッ
ト（ＡＢＢＯ’ｌ’Ｔ　）　）で決定され、かつウェス
タンブロッティングで確認されたＨＩＴ　１１性サンプ
ルと、エリザ（ＥＬＩＳＡ　）検査で陰性と決定された
１サンプルを、上記で述べた試薬類を用い検査した。試
薬ブランクをコントロールとし、単純な色の比較で結果
を調べた。
５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５，３）中１０
０　ｍＭグルフースとオルトフェニレンジアミン（１〜
／ゴ）を用い、基質溶液を調製した。
試薬類の反応最適容量および濃度を決めるため、４反応
性試料（１：１０、アボット（ｈＢＢＯＴ’ｆ）による
）と強度応性試料（１：　５０００　、アボット（ＡＢ
ＢＯＴＴ　）による）を原液濃度の１７１０および１／
２０　Ｋ希釈した。希釈試料の容量をさまざまに変え、
これを微量力価プレートに入れ、各酵素標識抗原調製液
１μｌを各プレートに添加した。
３７℃で５分間、希釈血清を標識抗原＃裂液でインキュ
ベートし、次いで基質溶ｇ　Ｚｏｏμｌを添加し室温（
２５℃±２℃）で５分間インキュベーションした。ブラ
ンクの微量力価プレート２七ツ′　　トを、連続希釈に
用いた容量と同量のＰＢ８　（ｐＨ７，４）で調製した
。第一のブランクブレー）（Ｇ列）に、各酵素−抗体結
合物１μｌを添加し３７℃で５分間インキュベートした
。次いで、基質溶液１００μｌを添加し室温（２５℃±
２℃）で５分間インキュベートした。第２のブランクプ
レート（Ｈ列）Ｋは、酵素−抗原結合物溶液を添加せず
、代わりに、基質溶ｆｉ　１００μｌと単にインキュベ
ートしただけであった。基質添加に先立ち、０．１％Ｔ
ＷＢＥＮ　２０・０．１％牛血清アルブミン結晶・４％
ポリエチレ／グリコール（分子ｉ−３５００）のＰＢＳ
溶液（ｐＨ７，４）　１００μノを各試料およびブラン
クプレートに添加した。２Ｎ　Ｈ２Ｓｏ４５０μノを添
加し、反応を止めた。この結表な表１に示す。
表　　工 試料　　　、５ｔｔｌ　１．０４’　１．５ｐｌ　２−
Ｏｔｔｌ　３．０ｔｔｌ　４．０ｐｌ　５．０ｔｔｌ各
グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダーゼ標識Ｈ
ＩＶ′Ｆｃ原溶ｆｒ１．　（１ｎｇ／ｌｔｌ　）　１　
μｉを各フレートに添加した。基質添加５分後に、２Ｎ
Ｈ２Ｓ０４５０μ！で本反応を止めた。
ＳＲ−エリザ（ＢＬＩＳＡ　）で強度応性ＷＲ−エリサ
（ＢＬＩＳＡ　）で弱反応性Ｎｅｇ、−色変化量が、コ
ントロール１で見られた色変化量以下 Ｐｏｓ、−色変化量が、コントロールｌで見られる色変
化量より大 コントロール１−　ＰＢＳ（ｐＨ７，４）十酵素−抗原
結合物十基質溶液 コントブール２−　ＰＢＳ（ｐＨ７，４）十基質溶液注
二強反応性試料は、弱反応性試料よりも、はるかに激し
い色調変化を示した。
上記に述べた操作を、微量力価プレートのも５−組のセ
ットについても行った。今度は、生肝カタラーゼ（Ｈ２
Ｏ２基質で６５１０００　ｕｎｉｔｓ　／ｌｎｙ、ベー
リンガー、−ｒ　ン／％　イＡ　（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ
、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）　）０．２５ユニツトを、基
質溶液を添加する前に各プレー）Ｋ添加したが、これは
溶液から過酸化水素をスカベンジするためである。これ
により、バックグラウンドを示すブランク溶液に見られ
た色変化が減じた。結果を表Ｈに示す。
表　　Ｂ 試料　　　０．５μ１１．０μ！１．５μｌ　１０μｌ
　３．０μ１４．０μｌ　５．０μノ各グルコースオキ
シダーゼおよびパーオキシダーゼ標識ＨＩＶ抗原溶液（
１ｎｇ／μｇ）を各プレートに１μｌ添加した。基質溶
液添加５分後に、２ＮＨ２３０，５０μノで本反応を止
めた。
実施例■ 酵素標識抗ＨＩＶ抗原抗体反応 抗ＨＩＶヤギ抗体（ポリクローナルＩｇＧ）を固相化パ
パインで酵素的に処理し、−価のＦａｂフラグメントを
得た。
このＦａｂフラグメントを１　ｎｇ／７μｌタンパク濃
度の濃度に調製し、Ｎ、Ｅ（Ｓ−ビオチンを用い２５℃
で１時間、かく拌しなからビオチン化した。セントク リコン（ｃＥＮＴＲ，ＩＣ０Ｎ　）−１０分離装置（７
００桐、＃　１０分間）を用い、未反応ＮＨ３−ビオチ
ンを除去した０ビオチン化抗体フラグメントなＰＢ　８
　（ｐＨ７，４）で３回洗浄した。全ての試薬類には、
アジ化物は含まれていなかった。Ｆａｂフラグメントへ
の抗原結合能不活化を防止するため、過剰にＮＨ３−ビ
オチンを使用することを避けた。
オルトフェニレンジアミン基質と３０分インキュベート
し、６０００倍に希釈したアビジンパーオキシダーゼを
用い、微量力価定量法で連続的に希釈してビオチン結合
物を求めた。
このＦａｂ−ビオチン結合物を１　ｎｇ／１１１１（１
１度とした。この溶液の半量を当量のアビジン−グルコ
ースパーオキシダーゼ結合物と反応させ、他の半量をア
ビジン−パーオキシダーゼ結合物と反応させた。非結合
アビジンを各反応溶液に過剰に加え、非結合ビオチンな
全てブロックした。Ｆａｂ分子量をｓｏ、ｏｏｏとし、
等量の計算を行った。
破砕し不活化したＨＩＶ抗原（サイトチック（ｃｙｔｏ
−ｔｅｋ　）　）を、（ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）＋０．
１％ＴＷＥＥＮ２０＋牛血清アルブミン０．１％結晶）
溶液で順次希釈し、１μｇ／−から１ｏ　ｐｇ／ｍｔ濃
度範囲の６つの希釈液を得た。各連続希釈液１００　ａ
ｌを４０の微量力価プレートに添加した。酵素標識Ｆａ
ｂフラグメントの各溶液５ｎｇ／ｌｎｔを希釈し、０．
５，１゜２．３ｔ４１５ｎｇ／μｌ溶液を得た。これら
の抗体フラグメント溶液の各１μノを、ＨＩ■抗原の各
連続希釈液に添加し、２７℃で５分間インキュベートし
た。次に、オルトフェニレンジアミン基質２００μノを
各プレートに添加し、２５℃±２℃で５分間インキュベ
ートした。２Ｎ　Ｈ２８０４５０μノを添加し、本反応
を止めた。さらに１過酸化水素スカベンジヤーとして、
生肝カタラーゼ０．２５ユニット（Ｈ２Ｏ，基質で、６
５＋　０００　ｕｎｉｔｓ　／　ｒｒ１９、ヘ−’）７
−）ｊ−、マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　、　Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ　）　）を各プレー）Ｋ添加した。結果
を表■に記す。
表　　■ （Ａｇ）ｇ／ｄ　　１０−’　　１０−’　　１０−’
　１０−’　　１０”　　１０−”実施例■ 血清中チロキシン濃度の定量 チロキシンはハプテン町溶性（ｈａｐｅｎｌｙｓａｂｌ
ｅ　）分子である。血清サンプル中チロキシンの存在を
、既知量のチロキシンをチロキシンフリーの血清に添加
し、ｌ−Ｉ　Ｑ　ｎ　ｍｏｌｅｓ　／　ｔｈｅの範囲と
したＩＩ！Ｉ清を用いて、測定した。この実股では、血
清サンプル中チロキシンは、血清に添加した酵素ｔ！ｙ
、識チロキシンと、抗チロヤシン抗体上の結合部位を競
合する。二つの標識酵素が触媒する連続反応の遮度は、
二つの酵素標識抗原の各抗原に結合している抗体の敗に
直接相関し、したがって、血清サンプル中非標識チロキ
シンの量に、負の相関を示す。
５ＰＤＰ（Ｎ−サクシイミジル−３−（２−ピロリルジ
チオ）プロピオン酸）を用い、チロキシンをホスホエノ
ールビルビル酸キナーゼに結合した。
結合物および非結合物をゲル口過クロマトグラフィで分
離した。同様の方法で、ルシフェラーゼをチロをシンに
結合した。
ピルピン酸キナーゼとルシフェラーゼ間の対反応定量に
用いる基質濃度は、パーグマイヤー（Ｂｅｒｇ−ｒａｅ
ｙｅｒ　）　、酵素分析法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅ
ｎｚ　ｍａｔｉｃＡｎａｌｙｓｊｓ　）、アカデミツク
プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　）　、ニューヨ
ーク（１９７４年）に記載されたものを用いた。各反応
で放出された光の量を、カウントを計測した。
抗チロキシンクサギ抗体の存在下、ピルピン酸キナーゼ
標識チロキシン７、５　ｎｍｏｌｅ当量とルシフェラー
ゼ標識チロキシン７、５　ｎｍｏ１６当量と血清を２０
分間室温でインキュベートし、血清サンプル中に存在す
るチロキシン量を定量した。次に基質を添加し、上記に
述べたように光放出反応を読み取った。スパイク４ンプ
ル中のチロキシンは、シンチレーションカウンターで計
測される光量に負の相関をすることがわかった。上記に
述べたルミネサンス法で判明した結果を、標準的なラジ
オイムノアッセイ法の結果と比較し、得られた値開に９
６％の相関比が認められた。
実施例■ 抗体検出 抗ウサギヤギ抗体（シグマ）を、ピルピン酸キナーゼ（
シグマ″：ウサギ筋）、ルシフェラーゼ（ＬＫＢ　）と
５ＰＤＰ法を用いそれぞれ反応させ、標識した。本定量
法で用いた基質溶液は、バーグマイヤ−（Ｂｅｒｇｍｅ
ｙｅｒ　）　、上記に記載されたものとした。ベル７リ
ーズ（Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚｅ　）から、正常ウサギ、ヒ
ト、マウス血清を得た。
シンチレーションバイアルに血清５０Ａｌを入れ、濃度
が１　？　Ｚｏｏから１　：　１，０００，０００　Ｖ
／Ｖ　）の範囲となるよ５　ＰＢＳ　（ｐｉ−ｆ　７．
４　）で希釈した。ヤギとウサギの酵素−抗体結合物を
１　：　５０００　Ｋ希釈し、各バイアルに２５μｊ添
加、キャップをしっかりと密封し、３７℃で３０分間、
平衡とした。
反応混合物中の最終濃度を最適となるよう、基質緩衝溶
液を濃縮した。基質溶液５０μｌを各バイアルに注入し
混合した。各バイアルをシンチレーションカウンターで
３０分間測定した。
１００倍から１０００倍希釈範囲のウサギ血清およびヤ
ギ血清双方ともに有意な反応を示した。１０００倍より
希釈したウサギ血清だけが、基質と結合物のみから成る
ブランクよりも大きいシグナルを出した。ウサギ血清の
最適希釈度は、１　：　５００，０００希釈であった。
上記に述べた実施例は、不発明を例示するもので、限定
するものではない。上記に述べた方法および物について
は、クレームの範囲内で多くの変更が可能であることが
、当業者に理解されるであろう。
代理人　三　宅　正　夫（他１名）

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）（ａ）第一標識結合抗体または抗体フラグメント
    、第二標識結合第二抗体または抗体フラグメントおよび
    該抗原性物質の三重複合体を形成すること、および （ｂ）少なくとも１つの基質存在下において、該第一標
    識と該標識の相互作用により産生され、該抗原性物質に
    これらの標識が互いに近接し結合することにより増感さ
    れたシグナルを検出すること、 を有する液体中抗原性物質の存在または濃度を決定する
    ための免疫化学定量法。
  2. （２）（ａ）第一標識に結合した抗原性物質、第二標識
    に結合した第二抗原性物質および該抗体の三重複合体を
    形成すること、および （ｂ）少なくとも１つの基質存在下において、該第一標
    識と該第二標識の相互作用により産生され、これらの標
    識が該抗体に互いに近接して結合することにより増感さ
    れたシグナルを検出すること、 を有する液体中抗体の存在または濃度を決定するための
    免疫化学定量法。
  3. （３）第一標識に結合した抗体が抗原性物質の第一抗原
    決定基に特異的なモノクローナル抗体で、第二標識に結
    合した抗体が抗原性物質の第二抗原決定基に特異的なモ
    ノクローナル抗体である請求項（１）に記載の免疫化学
    定量法。
  4. （４）抗体フラグメントが、抗体をパパインで消化する
    ことにより作製された１価のフラグメント（Ｆａｂ）で
    ある請求項（１）に記載の免疫化学定量法。
  5. （５）抗体フラグメントが、抗体をペプシンで消化する
    ことにより作製された２価のフラグメントである請求項
    （１）に記載の免疫化学定量法。
  6. （６）（ａ）決定すべき抗原性物質の存在下において、
    第一標識結合抗原性物質、第二標識結合抗原性物質およ
    び該抗原性物質に対する抗体の三重複合体を形成するこ
    と、および （ｂ）少なくとも１つの基質存在下において、該第一標
    識と該第二標識間の相互作用により産生され、これらの
    標識が該抗体に互いに近接して結合することにより増感
    されたシグナルを検出すること、 を有する液体中抗原性物質の存在または濃度を決定する
    ための免疫化学定量法。
  7. （７）（ａ）決定すべき抗体の存在下において、第一標
    識結合抗体、第二標識結合抗体および抗原性物質の三重
    複合体を形成すること、および （ｂ）少なくとも１つの基質存在下において、該第一標
    識と該第二標識間の相互作用で産生され、これらの標識
    が該抗原性物質に近接し結合することにより増感された
    シグナルを検出すること、を有する液体中抗体の存在ま
    たは濃度を決定するための免疫化学定量法。
  8. （８）該第一標識および該第二標識がそれぞれ酵素であ
    り、第一基質上または第一基質存在下における該第一酵
    素標識および第二基質上または第二基質存在下における
    該第二酵素標識の連続的作用により該シグナルが産生さ
    れ、該第二基質が、該第一酵素標識の該第一基質上での
    作用による産物である請求項（１）、（２）、（６）ま
    たは（７）に記載の免疫化学定量法。
  9. （９）該シグナルが該第二基質出現の増加率である請求
    項（８）に記載の免疫化学定量法。
  10. （１０）該シグナルが該第一基質消失の増加率である請
    求項（８）に記載の免疫化学定量法。
  11. （１１）該シグナルが一連の循環反応の増加率で、該第
    二基質上またはその存在下において該第二酵素標識で該
    第一標識が再生成される一連の循環反応である請求項（
    ８）に記載の免疫化学定量法。
  12. （１２）第一酵素標識がグルコースオキシダーゼで、第
    二酵素標識がホースラデイツシユ・パーオキシダーゼで
    、第一基質がグルコースで第二基質が過酸化水素であり
    、そして、シグナルが、オルトフェニレンジアミン存在
    下における色調変化である請求項（９）に記載の免疫化
    学定量法。
  13. （１３）第一酵素標識がホースラディッシュ・パーオキ
    シダーゼで、第二酵素標識がルミノールで、第一基質が
    過酸化水素で、第二基質が酸素であり、そして、シグナ
    ルが光である請求項（９）に記載の免疫化学定量法。
  14. （１４）第一酵素標識がホスホエノールピルピン酸キナ
    ーゼで、第二酵素標識がルシフエラーゼで、第一基質が
    ホスホエノール（ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌ）ピルピン酸
    であり、そして、シグナルが光である請求項（９）に記
    載の免疫化学定量法。
  15. （１５）（ａ）第一酵素標識結合抗原性物質および第二
    酵素標識結合抗原性物質を含有する抗原性物質溶液を液
    体に接触させてサンプル中抗体、第一酵素標識抗原およ
    び第二酵素標識抗原の三重複合体を形成すること、およ
    び （ｂ）該第一酵素標識の基質にこの三重複合体溶液を接
    触させ、該第一酵素標識と該基質の反応生成物を形成す
    ること、 （ｃ）（ｂ）段階で形成された反応生成物の存在下にお
    いて、該第二酵素標識反応により産生されたシグナルを
    測定すること、 （ｄ）（ｉ）段階（ｃ）で測定したシグナルと、段階（
    ａ）−（ｃ）により調製した該抗原性物質に対する抗体
    を含まないコントロールサンプルで測定したシグナルと
    を関連付け、該液体サンプル中における抗体の存在を決
    定することまたは、 （ｉｉ）段階（ｃ）で測定したシグナルと、段階（ａ）
    −（ｃ）により調製した既知量の抗体を含むサンプルで
    測定したシグナルとを関連付け、該液体中該抗体の濃度
    を決定すること を有する液体中抗原性物質に対する抗体の存在または濃
    度を決定する方法。
  16. （１６）（ａ）液体を、第一酵素標識結合抗体と第二酵
    素標識結合抗体を含有する抗原性物質に対する抗体溶液
    と接触させ、この液体中抗原性物質、第一酵素標識抗体
    および下記第二酵素標識抗体の三重複合体を形成するこ
    と、 （ｂ）該第一酵素標識の基質にこの三重複合体溶液を接
    触させ、該第一酵素標識と該基質の反応生成物を形成す
    ること、 （ｃ）（ｂ）段階で形成された反応生成物の存在下にお
    いて、該第二酵素標識反応により産生されたシグナルを
    測定すること、 （ｄ）（ｉ）段階（ｃ）で測定したシグナルと、段階（
    ａ）−（ｃ）により調製した抗原性物質を含まないコン
    トロールサンプルで測定したシグナルとを関連付け、該
    液体サンプル中における抗原性物質の存在を決定するこ
    と、または （ｉｉ）該液体中抗原性物質の濃度を決定するため、段
    階（ｃ）で測定したシグナルと、段階（ａ）−（ｃ）に
    より調製した既知量の抗原性物質を含むサンプルで測定
    したシグナルとを関連付けること、 を有する液体中抗原性物質の存在もしくは濃度を決定す
    る方法。
  17. （１７）液体中抗体がヒト免疫不全ウィルスに対する抗
    体である請求項（１２）に記載の方法。
  18. （１８）この液体中抗原がヒト免疫不全ウィルスである
    請求項（１３）に記載の方法。
  19. （１９）（ａ）第一酵素標識結合抗原性物質、第二酵素
    標識結合抗原性物質および該抗原性物質に対する抗体を
    含有する抗原性物質含有溶液と液体とを接触させ、サン
    プル中抗原性物質が抗体結合部位を酵素標識抗原と競合
    する三重複合体を形成すること、 （ｂ）該第一酵素標識の基質にこの三重複合体溶液を接
    触させ、該第一酵素標識と該基質の反応生成物を形成す
    ること、 （ｃ）段階（ｂ）で形成された反応生成物存在下におい
    て、該第一第二酵素標識で産生されたシグナルを測定す
    ること、 （ｄ）（ｉ）段階（ａ）−（ｃ）により調製した該抗原
    性物質を含まないコントロールサンプルで測定したシグ
    ナルと、段階（ｃ）で測定したシグナルとを関係付けて
    液体中における抗原性物質の存在を決定すること、また
    は （ｉｉ）段階（ａ）−（ｃ）により調製した該抗原性物
    質の既知量を含むサンプルで測定したシグナルと、段階
    （ｃ）で測定したシグナルとを関連付けて液体中におけ
    る抗原性物質の濃度を決定することを有する液体中抗原
    性物質の存在もしくは濃度を決定する方法。
  20. （２０）液体中抗原性物質がチロキシンである請求項（
    １９）に記載の方法。
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