JPH01124395A - 脂質基材による放射線の防護 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、表面、たとえば微生物培養物及び哺乳型の皮
膚への放射線誘発性損傷を防止することに向けられ、そ
して特に、立玉ム１：Ｌ＆　５ンオｊとユｊＬイ２２か
らの脂質抽出物を用いることによって、紫外線誘発性損
傷を防止することに向けられる。

〔従来の技術〕

以来ヱｊ」乙且ｐ二二立２２　　ラ〉寝虹ン）こｌン２
ヨ（迷は１■μ殺ｓ　ｒａｃｌｉｏｄｕｒａｎｓ）とし
て知られているディノコ−カス　ラｌｕ二Ｅ／’２う≦
（２、は、＾ｎｄｅｒｓｏｎなど、、隙舖に吐収抜江（
１９５６）璋：５７５〜５７７ページによって報告され
ているように、１９５６におけるその単離以来、高い放
射線耐性有機体であることが知られて来た。それは、Ｅ
、コリ（Ｅ、　Ｃｏ１１）の放射線耐性Ｂ　／　ｒ株よ
りも紫外線及びγ線に対してそれぞれ約３３倍及び５５
倍より耐性である。

種々の出版物は、生化学的成分、たとえばそれらの分類
に使用されるメナキノン系（Ｙａｍａｄａ’、＜ζ、。

Ｊ、　Ｇｅｎ、＾　１．　Ｍｉｃｒｏｂｉｌ、　（１９
７７）２３　：　１０５〜１０８）及びそれらの構造の
他の観点（Ｓｌｅｙｔｒ　ｆ（ｇ、。

＾ｒｃｆ＋、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９７６）１０
７　：　３１３）について報告して来た。

多くの研究が、放射線に対する耐性を担当する、Ｄ、Ｚ
Σ　Ｅ／”　ｘ　−：／　２に存在する成分を決定する
ことに向けられて来た。＾ｎｄｅｒｓｏｎによる初期研
究は、耐性がサルファ含有アミノ酸の代謝生成物に関与
したことを提案した。これらの結果は、＾ｎｄｅｒｓｏ
ｎｌ４．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｐｒｏｃ、　１９５
９　２０（１９５９）及びＲａｊ　欠並、、　Ｃａｎ、
　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

（１９６０）６　二２８９〜２９８に報告された。Ｋ１
１ｂｕｒｎｉど−。

Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ、　（１９５８）９　：　
２０９〜２１５は、エネルギーとして作用する色素が陰
性結果を弱める可能性を調査した。Ｂｒｕｃｅ、　Ｒａ
ｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９６４）２２
　：　１５５〜１６４は、紫外線の効果から他の細菌を
保護することができる、Ｄ、１区をン三久乙入の水性抽
出物を得た。のちの研究において、水性抽出物における
放射線保護物質の実証の前、細菌がｎ−ブタノールによ
り抽出され、次に該ブタノールが除去されることが同じ
著者によってＧｕｌｓｔｅｉｎ７ＬＥ　、、　Ｉｎｔ、
　Ｊ、　Ｒａｄｉａｔ、　Ｂｉｏｌ、（１９７８）３４
　：　３７５〜３８０に報告された。Ｌｅｗｉｓｌ、、
　Ｃａｎ　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ（１９７４）竣：
４５５〜４５９は、カロチノイド色素がり。

１２１１工孟入及びり、文オ土オ止孟Ｚ囚の放射線耐性
に何の有意な役割も示さないことを報告した。

上記に示された報告は、デ（／ニアー７種の完全な放射
線耐性を説明していないので、己ＬＬに立人種の他の放
射線耐性成分を同定する必要が存在する。

〔発明の要約〕

本発明は、Ｔ工Ｚユニ左ス１からの脂質抽出物を表面に
適用することによって該表面への放射線誘発性損傷を防
止する方法を提供する。放射線損傷に対して一部卓越し
た保護性を有する、完全な脂質抽出物の特定の画分が同
定された。

多くの個々の脂質成分が薄層クロマトグラフィーによっ
て単層された。好ましい放射線保護性化合物は、位置２
でイソプレノイド置換基及び位ｆ３で低級アルキル、好
ましくはメチル置換基を有する１、４−ナフトキノン基
である。放射線誘発性損傷に対する本発明の脂質組成物
による保護は、微生物細胞及び哺乳類細胞の両者のため
に示された。

〔好ましい態様の記載〕

本発明者は、これまでの水性抽出物に対立するものとし
て、テコ−ｌコニ−ｌり２種からの脂質抽出物が放射線
損傷から表面を保護することができることを発見した。

放射線耐性成分は、典型的な脂質溶媒、たとえばクロロ
ホルム及びメタノールの混合液により、云工Ｚユニ左ス
貝、たとえばり、　　。

う〉膨１２１：とン２２又はり、之乏オコヨＣ乙んから
細胞を抽出することによって容易に得られる。炭化水素
溶媒又はハロゲン化されたく特に塩素化された）炭化水
素溶媒のいづれかとアルコールとの混合液は、広い範囲
の極性を有する脂質を抽出するために一連の抽出を提供
するように該混合液中の成分の割合を変えることができ
ることにおいて特に有用である。有用な炭化水素は、Ｃ
６〜ＣＩＧのアルカン及びシクロアルカンであり、特に
シクロヘキサンが有用である。ハロゲン化された炭化水
素の例として、塩素化されたメタン及びエタン誘導体、
たとえばジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、
ジクロロエタン及びトリクロロエタン、及びフルオロク
ロロカーボン、たとえば液体フレオン化合物を挙げるこ
とができる。８０℃又はそれ以下の温度で（場合によっ
ては、減圧下で）、抽出された脂質を蒸発することによ
り除去され得る溶媒混命液が好ましい。

典型的には、細胞は破壊され、そして脂質溶媒及び水又
は場合によっては塩を含む水溶液のいづれかと共に混合
され、後での層の分離を促進される。十分に平衡化され
た後、その層は分離され、そして脂質を含む有機層は保
持される。抽出された脂質は５回転熱発器上で乾燥せし
める方法によって溶媒から分離され得る。脂質の抽出の
ための本発明の好ましい方法は、ＴｈｏｌＩｌｐｓｏｎ
など、、恒ＬＪ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８０）
２６　：　１４０８〜１４１１に記載されている。デコ
ニ乙２：二ｌり、の脂質は完全な脂質抽出物として利用
され得、又は該完全な脂質抽出物は、脂質化学の標準技
法、たとえばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマト
グラフィー、溶媒−溶媒抽出法又はそれらの組合せによ
って分別され得る。

好ましい脂質画分は、６５：３５：５の比のクロロホル
ム：メタノール：２８％アンモニア溶媒系中でシリカゲ
ルＨ薄層クロマトグラフィーによって測定される場合、
０．５又はそれ以上のｒｆを有する脂質を含むものであ
る。

第１図は、仄、久２本２Ｌｉ乙＆からの完全な脂質抽出
物の薄層クロマトグラフィーによって同定された１３個
の個々の脂質を示す。その脂質は第１図に示されるよう
に４領域に任意に分割され、そしてそれぞれは、脂質１
〜５（領域１）、脂質６〜７（領域２）、脂質８〜９（
領域３）及び脂質１０〜１３（領域４）を含んだ。

指貫領域１及び２は、放射線損傷に対して卓越した保護
性を示すことが実験的に実証された。これらの領域の脂
質のすべては、前記示されたシステムにより測定される
場合、０．５又はそれ以上のｒｆ値を有する。減少する
移動度の順に番号をつけられた脂質１〜７に相当する個
々のｒｆ値は、０．９８゜０．９４　、０．９２　、０
．８８　、０．８４　、０．７０及び０．５０である。

これらの脂質の１つの構造はすでに決定され、そして下
記に示される： 以下全白 ○ 〔式中、それぞれのＲは、特に１２〜２２個の炭素原子
及び０〜３個の２重結合を有する脂肪酸のアルキル又は
アルケニル残基である〕。これらは第１図に示されてい
るような脂質７である。

化学的研究は、有意な放射線保護効果を示す脂質抽出物
中に特別な化合物型（ビタミンに化合物）を同定しな。

これらのビタミンに化合物は、位置２でイソプレノイド
置換基及び位置３で典型的には１〜４個の炭素原子を含
む低級アルキル置換基、特にメチル基を有する１、４−
ナフトキノン環系である。この化合物型のための一般式
は、下記−般式： 〔式中、ｎは０〜１４、好ましくはＯ〜１０、より好ま
しくは約７の整数である〕で示される。正。

うｌｌｉンノＪλンノ、からの抽出物、すなわち画分ｎ
２において、ｎは７に等しい。

上記式において、５ｅｂｒｅｌｌ及びＨａｒｒｉｓ、　
Ｔｈｅ１抹料邦二助↓ｊ旦Ｌノ号側立凹ｌ」Ｎ（ト）壮
岨ＬＭｅｔｈｏｄｓ、チャプター１０、“Ｖｉｔａｍｉ
ｎ　Ｋグループ、”第２版−第３巻（１９７１）＾ｃａ
ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋａｎｄ　
Ｌｏｎｄｏｎ、　４１６〜４６５ページに記載されてい
るように、Ｒはビタミンに化合物に典型的に見出される
いづれかの置換基である。

Ｄ、ヲ〉長し２ノーとンクヨからの抽出物において、Ｒ
はメチル基である。従って、低級アルキル基、特に１〜
４個の炭素原子を有するアルキル基が好ましい。

インブレノイド基中において、又は他の分子中において
Ｒとして存在する置換基は、放射線保護効果を決定する
ために特に重要なものではないと思われる。１，４−ナ
フトキノン環系は、放射線保護効果を担当するように思
われる。従って、ナフトキノンのフェニル環上の置換基
は、最大保護゛の波長を変えるために単に作用し、そし
て芳香族環上に通常見出されるいづれが安定した置換基
、たとえばハロゲン、アルキル、アルキルカフレボニル
、ニトロ、シアノ、アミノ、アルコキシ、カルボキシレ
ート及び目標のものであり、ここで前記置換基く存在す
る場合）のヒドロカルビル部は、１〜６、より好ましく
は１〜４個の炭素原子を好ましくは含む。

その指摘された置換基から選択することによって得られ
る種々の分子のすべてが仄、ラジオシュランスから得ら
れることを指摘する意思が本明細書に存在しないことが
認識されるべきである。むしろ、これらは、放射線保護
の性質がビタミンに化合物のなめに示された、現在調製
され得る同等の化合物の例である。

未知の構造の脂質が、本発明に記載されるように、天然
源から本明細書に示されるクロマトグラフィー技法を用
いて調製され得る。特定の指摘された構造を有する脂質
は、天然源からの単離及び有機化学による合成技法によ
って容易に調製され得る。たとえば特定の単離及び合成
技法のためには、上記に引用された５ｅｂｒｅｌｌ及び
Ｈａｒｒｉｓのテキストを参照のこと。典型的には、合
成は２つの部分に分けられ、すなわちナフトキノン核の
調製、続いて、調製されたイソプレノイド−置換性前駆
体による前記該のアルキル化である。

ｎ＝７及びｎ＝Ｃ１１３である特定のビタミンに化合物
は、２５４ｎｍで放射線保護活性を提供する、Ｄ。

う）膨しジノ＝と乞り、からの主な脂質であることが示
された。この波長は、一般的に、核酸及び生存細胞のＵ
Ｖ−破壊において最っとも活性的である１つのものであ
るとして許容される。ビタミンに化合物は、２５４ｎｍ
で放射線保護活性を有する主な脂質であると示されたけ
れども、他の波長での放射線保護活性は、他の脂質及び
本発明に記載された脂質画分のためにも存在する。

多くの組合せが、脂質、たとえば単一の脂質、２〜１０
（好ましくは２〜３）の混合物及び完全な脂質抽出物か
ら形成され得る。放射線誘発性損傷に対する保護におけ
るいづれが単一の成分又は成分の混合物の有効性は、こ
の明細書中に後で記載されている技法によって容易に測
定され得る。

放射線（保護がこれに対して示される）は、紫外線に存
在する波長〜γ放射線に存在する波長の範囲の波長を有
する電磁線を包含する。紫外線に対して表面を保護する
ことにおける脂質抽出物の使用は、特に好ましい。

本発明の脂質は、放射線の効果に対してぃづれの表面（
たとえば、ペイント、プラスチック、染色された表面及
び同様のもの）をも保護することに使用され得るけれど
も、経済的な考慮は、生存有機体、特に微生物、たとえ
ば細菌及び酵母及び動物細胞、特に哺乳類細胞（＋１７
乳類の細胞培養物又は哺乳類の表面、たとえば上皮の形
で）を保護するのに使用する本発明の方法をたぶん制限
するであろう、細胞培養物を保護するのに使用される場
合、バイプリドーマ、発酵細菌及び酵母及び同様のもの
の保護が可能である。ヒト又は他の動物への局所的な適
用のために向けられている日光遮断への使用が好ましい
使用である。生存細胞に関してのこれらの使用のすべて
は、保護される表面が外因性細胞の表面である（これに
よっては、脂質が得られる細胞よりも他の細胞を意味す
る）ことを指摘することによって要約され得る。本発明
は、有機体を含む７ａ胞培養物に外来性脂質を添加する
ことによって、放射線効果からＬＬＡユニがと種をさら
に保護するなめに使用され得るけれども、微生物及び哺
乳類細胞の他の種の保護も好ましい。

表面を保護するのに使用される脂質の最適量は、精製さ
れた脂質又は本明細書に記載のような脂質抽出物のいづ
れかを使用する間車な実験によって容易に決定され得る
。そめ脂質又は脂質抽出物は、一定の初期割合で、好ま
しくは保護される表面０ｍ２当り０．０８〜１２＋ｏｇ
の範囲で表面に適用される。溶液ｍ１当り少なくとも１
．５、好ましくは３．０及びより好ましくは６．０ｍｇ
の脂質を含む溶液が、液体層による保護が可能な場合、
たとえば細胞培養培地を保護する場合、特に好ましい、
これらの量の活性物質を含む日当遮断ローションもまた
好ましい。

活性成分は、０．２〜１８重量％、好ましくは０．５〜
２０重量％の本発明の組成物を含有することができる。

微生物細胞が保護される場合、効力は、特に次の実験部
分に記載されているように、紫外線への暴露の後、培養
培地中に残存する活性細胞の数を測定することによって
容易に決定され得る。他の表面の保護を決定し、たとえ
ば色採形成又は喪失を測定しくたとえば基準分光測光に
よって）、架橋により溶解性を高め（たとえば、抽出検
定によって）、そして放射線への暴露に通常関連される
他の効果を測定するために、他の方法が使用され得る。

脂質材料はいづれの形ででも適用され得る。なぜならば
保護性は、使用されるビヒクルに付随しているように思
われないからである。しかしながら、水性懸濁液又はエ
マルジョン、特に細胞学的又は医薬的に許容できる水性
キャリヤーの形で脂質を使用することが好ましい。この
脂質は、所望によりリポソームの形で使用され得る。リ
ポソームは、脂質と水性キャリヤー、たとえば水又は緩
衝液、塩、分散剤又は同様のものを含む水溶液との混合
物を音波処理又は他の方法で処理することによって典型
的には調製される。リポソームは、脂質を含む有機溶媒
の溶液、たとえばクロロホルム溶液を表面上で乾燥せし
め、そして次に該表面上に水性キャリヤーを添加するこ
とによって容易に産生され得る。次に、水性エマルジョ
ンく水性キャリヤーマトリックス中において脂質のリポ
ソーム又はミセルから成る）の形で脂質を生成するため
に、急速な混合又は音波処理が行なわれる。

クリーム状で使用される場合、本発明の脂質は、ミセル
含有溶液又はリポソーム含有懸濁液が生成される場合よ
りもより高い濃度で一般的に存在する。

脂質を含有する溶液、分散液、クリーム、軟膏及び同様
のものを調製するための技法は、当業界において十分に
知られていて、そして本明細書に詳しく説明する必要は
ない。

微生物を保護するために使用される場合、リポソーム又
はミセルの形で存在する又は細胞が調製される増殖培地
中に懸濁されている、脂質を含む懸濁液又は溶液を調製
することが好ましい。たとえば、本発明の脂質は、最少
必須培地（ＭＥＭ）中に懸濁されたリポソームを供給す
ることによって、細胞培養培地、たとえばＭＥＭ中、哺
乳類細胞に供給され得る。マウスの繊維芽細胞の有意な
保護は、５ｍｇ／ｍＡ’の濃度で本発明の乳化された脂
質を含む培地を用いて例示された。

本発明はまた、本発明の脂質分含む組成物も包含する。

特に、本発明の脂質組成物は、元４　、／ユ二り人種か
らの完全な脂質抽出物及び完全な脂質の一部のみを含む
画分脂質抽出物を含む。画分抽出物が放射線保護物質と
して後で使用される場合、６５：３５：５の比のクロロ
ホルム：メタノール：２８％アンモニア溶媒系の溶液中
でシリカゲルＨ薄層クロマトグラフィーによって測定さ
れる場合、０．５又はそれ以上のｒｆを有する脂質を含
む画分を使用することが好ましい。上記方法の討論で指
摘されたように、そのような画分脂質抽出物は、このシ
ステムで測定される場合、０．５０　、０．７０　、０
．８４゜０．８８　、０．９２　、０．９４及び０１９
８のｒｆ値を有する多くの脂質を含む。組成物は、これ
らのｒｆ値の１つを有する単一の脂質、そのような脂質
の混合物及び完全な脂質抽出物から実質的に成る分離さ
れた成分を含む。

本発明の組成物は、活性脂質画分の他に、相溶性問題を
避けるなめに使用される他の脂質、オイル、有機又は水
性溶媒、安定剤、医薬担体、他の放射線保護物質、たと
えば天然又は人工的な日光遮断剤、及び同様のものを含
むことができる。キャリヤー脂質の例として、ジオレオ
イルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ＞及び無視してよ
いほどの放射線保護性効果を有するが、しかしより低い
極性の脂質画分（たとえば、上記のＴＬＣ領域１及び２
からの）のいくらかとの相溶性問題を避けるために使用
され得る他の材料を挙げることができる。

前述の発明は、明確に理解するために例示的及び測的に
いくらか詳細に記載されているけれども、これによって
この発明の範囲を限定するものではない。

いくつかの実験が、完全な脂質抽出物又はその画分のい
づれかとして、ガニｌユニＬん　之ン土２Ｌ久Ｚムから
の脂質によって微生物細胞及び１４ｍ乳類細胞の両者の
保護性を示すために行なわれた。

杯社文囚友汲 脈江 ■、１ＺｔｚＬ久Ｚみの細胞を、標準培養培地上で増殖
し、そして改良されたＦｏｌｓｃｈの方法によって抽出
した。細胞（およそ２ｇの湿量）を、（’ＩＩＣ’ム：
、　Ｃ１，０１１（２：　Ｉ　Ｖ／Ｖ）　ノ溶液１０　
ｔｌＪｌ　（およそ２０ｍｊり中に再懸濁し、そして室
温で１２時間、穏やかに振盪した。残る細胞材料を濾過
により集め、そして次に同じ条件下でＣＨｆｊ！３：　
ＣＨ，ＯＨ（１：　２Ｖ／Ｖ）の溶液２０社により抽出
した。クロロホルム：メタノール抽出物を一緒にし、そ
して蒸発乾燥せしめた。脂質残留物を、ＣｌＩＣ１，：
　Ｃ１＋、Ｏｌｌ　：　１１２０（８：４：３　Ｖ／Ｖ
）混合溶液２０社と共に混合し、そして静直し、相の分
離を可能にした。低い相を脂質抽出物と選定した。有機
溶媒をその低い層から分離し、完全な脂コ抽出物を得な
。この詳細な方法は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎｒζ、、　Ｃａ
ｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９８０）２６　
：　１４０８〜１４１７に記載されている。

その完全な脂質抽出物を、いくつかの段階で分別した。

クロロホルム中に再懸濁された乾燥脂質を、薄層クロマ
ｌ−グラフィープレート　（シリカゲル６０又はシリカ
ゲルトＩ）の起点に適用し、そしてクロロホルム：メタ
ノール：２８％アンモニア（６５：　３５　：　５　、
　Ｖ／Ｖ）の溶液中で展開せしめた。

１３種の脂質がこの方法で展開されたシリカゲルプレー
ト上で見られ、そして最つども高い移動度から最っとも
低い移動度の順に１から１３までの番号が付けられた。

この方法で展開されたプレートは第１図中に示される。

第１図中に示されるように最っとも高い移動度から最っ
とも低い移動度の領域１〜４を選定されている、シリカ
ゲルプレートの４種の領域を分離し、そして下記実験に
おける画分として使用した。

その脂質は、クロロホルムにより調製された、Ｂｌｏ−
５ｉ１八（ｂｉｏ−ｒａｄ）珪酸のカラムにその完全な
脂質抽出物のクロロホルム溶液を適用することによって
、画分に分離された。このカラムからの脂質の連続的な
溶離が、次の比：　９　：　１０：　１．８０：２０：
　２．７０：３０：　３．６０：４０：　４及び５０：
５０：５（Ｖ／Ｖ）でのクロロホルム：メタノール：２
８％アンモニアの溶液の不連続２体積により行なわれた
。

脂質は異なった画分中に溶離された。たとえば１．６０
：４０：４の溶出液は、２種の脂質（第１図中において
脂質６及び７として命名されている）の混合物を含んだ
。

比較するために、精製された脂質を次の源から得た。ジ
オレオイルホスファチジルコリン（ＳｉｇｍａＣａｔ、
　ｔ’ｋｘ　Ｐ−１０１３）　；シリルオイル　ホスフ
ァチジル　コリン（Ｓｉｇｍａ　Ｃａｔ、　ｋ　Ｐ−７
６４９）　；卵ホスファチジルコリン（分取薄層クロマ
トグラフィーによって精製された）。

雁肚汲 照射は、２４−ウェルのプラスチックマイクロタイター
プレー１〜（Ｎｕｎｃ　Ｐｌａｓｔｉｃｓ）のウェル中
に行なわれた。Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｇ
３０Ｔ８の３０ワツトの殺菌ランプを用いて、指示され
た時間、室温で、１０〜１２又は２０ｃｍ（旦、ユ火研
究）もしくは３０ｃ＋ｎ（繊維芽細胞研究）の距離で、
空気を通して上記マイクロタイタープレートのウェルを
照射した。サンプルを、指示された間隔（通常、１０秒
間隔）で除去し、そしてアリコートの生存度を決定した
。

先正支＠夾足 照射法からのアリコートを、旦−、ジ丈及び繊維芽細胞
についての種々の検定と利用して生存度について分析し
た。

Ｅ、ニア１Ｊに関しては、アリコート（一般的に１０μ
！）を、栄養寒天上にプレー１−　Ｌ、そして３７℃で
一晩インキュベー１−　した。生存度を、コロニー計数
によって決定した。

繊維芽細胞に関しては、生存度は、放射性チミジンの導
入によって測定された。照射後、個々のウェルからのア
リコートを、３Ｈ−チミジン１μＣｉにより補充し、そ
して３７℃で３０分間インキュベートした。放射性チミ
ジンの細胞性ＤＮＡ中への導入が、トリクロロ酢酸によ
る標準沈澱法分用いて、検定された。放射能の測定はシ
ンチレーション分光光測定によって行なわれた。

繊皿」」■ト１接五− Ｒｏｔｈｆｅｌｓｌ、、　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｃａｎｃ
ｅｒ　Ｃｏｎｒ、（１９５９）３　：　１８９〜２１４
に記載のマウスＬ−２繊維芽細胞を、５％ウシ胎児血清
（Ｆｅ２）により補充されたイーグルの最少必須培地（
ＭＥＭ）中で培養した。上記の照射法のために、培養物
を、２４−ウェルのマイクロタイタープレートのウェル
中に確立した。

集密性に達しな後（２〜４Ｘ１０５個の細胞／つエル）
、その培地を、脂質の補充及び照射のすぐ前で、ＭＥＭ
（Ｆｅ２を含まない）に変えた。０．５ｍｌの体ｆｌ（
ＭＥＭ）が、ウェル当りに使用された。

：　　び　　丈　・のための ジオレオイルホスファチジルコリンスは上記のようにし
て調製された、Ｄ、う盛り１２ノこと２クヨからの脂質
抽出物のいづれかを、’５ｍｇ／ｍｅの濃度でＭＥＮ　
（Ｆｉｓｌ＋ｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　”Ｖｏｒｔ
ｅｘ−Ｇｅｎｉｅ”　Ｃｕｔ。

ｉ　１ｚ−８ｔｚと共に２〜４分の混合）中に乳化した
。

マウスＬ−２ｍ胞への脂質の添加のために、培地を、マ
イクロタイタープレートのウェルがら除去し、そして乳
化された脂質又は複数の脂質を含むＭＥＭ　０．５ｍｌ
と交換した。

＝′　　びＥ、コリへの 脂質を上記のようにして調製した。０．５％トリプトン
（Ｄｉｆｃｏ　Ｃａｔ、　Ｉｂ　０１２３−０１）及び
０．３％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ　Ｃａｔ、　Ｎａ　０
１２７−０１）上で増殖された。

旦２１火細胞を水により洗浄し、そして水０．２５ｍｊ
Ｆ中において３Ｘ１０’〜ｌＸｌ０’の間の細胞計数で
ウェル中に添加した。次に、指示された量の脂質を、そ
れぞれのウェルに添加した。

周−刺 紫外線感受性標的に放射線保護性を付与する、以、乏〉
ジＬジノ翳とンク、からの膜脂質の能力を評価するため
の予備試験においては、完全な脂質抽出物を仄、グ乏オ
”；　ｘ　５　：４入から調製し、リポソーム懸濁液を
生成するために水中で音波処理し、そしてその得られた
リポソームを、比、工火からの細胞（水３００μｌ中に
おいて７Ｘ１０’個の細胞）と共に混合した。この混合
物は、サンプルの上１２ｃｍの位置で紫外線ランプから
約６．３Ｗ／ｍ２の流束で０．１０，２０、又は３０秒
間、照射された。

照射の後、生存するＥ、ニア！Ｊの数を、コロニー計数
によって検定した。たとえ最っとも低濃度（４００μｇ
／ｍ１）でさえ、その結果はひじように強い放射線保護
性効果を示しな。８００及び４００μｇ／ｍｌの両リポ
ソーム調製物は、３０秒間の照射の後でさえ、高い生存
率（７０％以上）を示した。対照的に、生存度における
対数的減少が、Ｄ、５Ｅ／”、’ｚ５７人の脂質から調
製された保護性リポソームを含まない旦、ジ丈細胞に関
して見られた。３０秒間の照射後の生存率は、対照サン
プルのためには２％よりも低かった。

比、１火の保護が一般的に脂質によって与えられるか、
又はり、−”、；　　’、；ｘ”’７入からの脂質に特
異的であるかいづれかを決定するために、さらに実験を
行なった。

これらの実験の最初に、Ｄ、１ン土／主ランスからの種
々の濃度の完全な脂質抽出物を、旦−１１丈細胞の調製
に関して使用した。予測されるように、保護性は、使用
される脂質の濃度で異なった。

たとえば、上記のように２０ｃｍの距離で８０秒間、照
射した後、８０％以上の旦−１■細胞（初めに３Ｘ１０
’個の細胞及び０．２５ｒ＠１の水）が、Ｄ、７区−”
；ｘ５＞入からの脂質抽出物が１３．６ａ＋ｇ／ｍ１の
濃度で存在する場合、生存した。５．４ｍｇ／ｍｅの濃
度で、約２０％が生存し、そして２．７ｍｇ／ｍｌの濃
度で０．２％が生存した。対照的に、脂質を含まないウ
ェルは、同じ条件下で約０．００３％の生存率を有した
。

対照的に、統計的に有意に高められた生存率は、１０ｍ
ｇ／ｎｌｌの濃度でのジオレオイルホスファジルコリン
スはシリルオイルホスファジルコリンに関して見られな
かった。卵ホルファチジルコリンは、いくらかの保護性
を示したが、しかしり、１２本シュランスから抽出され
た脂質に関する保護性よりも低かった。１０ｍｇ／ｍ（
ｌの濃度での卵ポルファチジルコリンは、８０秒の照射
の後、１％以下の生存率及び５ｍｇ／ｍｌの濃度で同じ
時間の照射後、０．０１％以下の生存率をもたらした。

対照的に、上記のように、５．４ｍｇ／Ｉｆｌｆの濃度
での、Ｄ、−１７２土シユランスからの流体抽出物の存
在下で照射された細胞に関しては、２０％以上の生存率
が存在し、この増強された生存率は、これらの同じ照射
の条件下で、前の生存率の２，０００倍であった。

類似する結果が、Ｄ、ｉ茗−’、；ｘ５７入からの画分
液体抽出物又はジオレオイルホスファデジルコリンのい
づれかを用いて、マウスＬ−２１維細胞の保護性を測定
する研究において見られた。

より保護された細胞に関して見られ、ところがジオレオ
イルホスファチジルコリンを含む細胞培養物は、添加さ
れる脂質を含まない対照サンプルと相当に異なった。

上記に示された実験は、完全な脂質抽出物を使用した。

種々の成分の間での保護の変動性を決定するために、脂
質を、第１図に示されるように薄層クロマトグラフィー
上で４種の領域に分割した。

より低い極性画分（すなわちＴＬＣ領域１及び２からの
脂質）のいくらかとの相溶性問題を避けるために、上記
実験でわずかな放射線保護効果を示すことが示された、
キャリヤーのジオレオイルホスファチジルコリンを用い
て、リポソームを調製した。Ｄ、乏些シ仁ン］＝と７７
２からの画分された脂質（薄層クロマトグラフィーによ
る画分１〜４）のアリコートを、ジオレオイルホスファ
チジルコリンと共に１＝１の重量比で混合し、そして室
温で２〜４分間、水中での機械的攪拌によって乳化した
。脂質の最終濃度は１．８ｍＨ／ｍ１であった（ジオレ
オイルホスファチジルコリを含まない）。

その脂質調製物を、新しく収穫された旦−、ジ去細胞（
最終体１ｚｏｏμ！中においてＩ　Ｘ　１０’個の細胞
）に添加した。そのウェルを、２５ｃｍの距離から０〜
８０秒間、室温で照射した。アリコートを定期的に取り
、そして栄養寒天中でのコロニー計数形成によって、細
胞の生存率について検定した。

この研究において、使用される脂質の濃度（１，８Ｂ／
ｍ１）は、上記の初期研究のために記載された濃度（２
，７〜１３．６ｍｇ／ｍＮ）よりも低かったことが注目
されるべきである。従って、より低い放射線保護性が予
期され、そしてより低い放射線保護性が観察された。そ
れにもかかわらず、画分１及び２（薄層クロマトグラフ
ィー領域１及び２からの）が、等重量を基に画分３及び
４よりも、より効果的な放射線保護剤であったことが明
らかであった。しかしながら、すべての４種の画分は、
いづれの脂質も含まない対照サンプルと比較して、いく
らかの保護性を提供した。２０秒の照射後、画分１及び
２は、画分３及び４よりも約４０％より一層保護した。

６０秒の照射の後、保護性は、画分３及び４対画分１及
び２のために、１０倍以上異なった。

匠−λ いくつかの追加の実験が、個々の脂質を展開し、そして
単離するために異なったクロマトグラフィーシステムを
用いて行なわれた。

林社又囚友汲 証ｉ Ｔｈｏｍｐｓｏｎｒζ、、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、（１９８０＞２８　：１４０８〜１４１１
の方法に従って、Ｄ、グｊシをン］二Σン一みから抽出
された全脂質を、非極性脂質（システムＢ）と極性脂質
くシステムＡ）とを区別するために、２種の溶媒系中に
おいて平面薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）を用
いて分離した。システムＡは、第１次元でクロロホルム
／メタノール／２８％アンモニア（６５：３５：５）の
溶媒及び第２次元でクロロホルム／アセＩ・ン／メタノ
ール／酢酸／水（１０：４：２：２：１）の溶媒を使用
した。システムＢは、第１次元でヘキサン／エーテル／
酢酸（５０：５０：１；半分の展１７Ｆｉ）及びヘキサ
ン／エーテル／酢酸（９０：　１０：　１　；完全な展
開）の溶媒及び第２次元でクロロホルム／エーテル（９
０：　１０）の溶媒を用いた。クロマトグラム上で脂質
を検出する上で便利なように、Ｄ、う」已オ）ξ入ｊし
乙２２を”ｃ　−アセテ−１〜の存在下で培養した。次
に、放射性ラベルされた脂質を、オートラジオグラフィ
ーＴＬＣ（第２図）によって検出した。

第２図の左側部分において、１３個のそれぞれの脂質は
、極性脂質を示す図面の上部左側部分におけるプロット
と共に見られ、そしてこれは−緒に進行する非極性脂質
のすべてを表わす。これらの非極性脂質は、溶媒システ
ムＢを用いて第２図の左側部分に示されるクロマトグラ
フ上で拡げられる。極性脂質は、非極性図面の下部右側
部分において単一のじみとｊ７て見られる。

選択された脂質又は脂質のグループの予備の単離のため
に、カラムクロマトグラフィーを用いた。

氏、うｊ乙ＡＩ２」Ｌう＞２２から抽出され、そしてヘ
キサン／酢酸（９９：１）中に溶解された全脂質を、［
１ｉｏｓｉｌ＾（ｌｌｉｏＲａｄ＞のカラムに適用し、
そしてヘキサン／酢酸（９９：１）中における増大する
クロロホルムのグラジェント及び最終的にクロロホルム
中におけるメタノール／２８％アンモニア（１０：１）
の増大するグラジェントにより連続的に溶離した。

画分９社をカラムから集め、そしてプールし、下記のよ
うに放射線保護活性について試験される脂質グループを
得た。

カラムクロマトグラフィーからの脂質のプールを、ジオ
レオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）リポソーム
中に導入し、そして２５４ｎｍでＵＶ線による殺害から
旦、ジ丈を防護するそれらの能力について検定した。そ
れぞれの脂質又は脂質混合物を、水中ｌｌｌ１ｇ／ｍ１
の濃度でＤＯＰＣリポソーム（４ｍｇ／ｍｌ）中に導入
した。新しく増殖され、そして水により洗浄された、旦
、２ｉの懸濁液（１社当り１０８個のコロニー形成単位
）を、種々の時間、ＵＶ線下で照射し、そしてそれらの
生存時間を、コロニー計数により定量化した。Ｄ３７値
分、照射線量に対する対数生存数のプロットから決定し
た。Ｄ３゜は、生存細胞の数を元の数の３７％に減じる
ために必要とされる、Ｊ／ｍ２における紫外線の照射線
量である。下記の第１表から見られ得るように、最っと
も高い放射線保護活性は、ｎ２として命名された脂質に
関連されることが見出された。

るＥ、コリの　・　　ラ ＤＩＰＣすボッ゛−ムのみ　　　　　　６７±２０　　
　　　　（３）＋ｎ１　　　　　　　７８±２９　　　
（２）＋　０２（ヒ゛タミンＫ）　　　　　　　３１０
±１７　　　　　　（２）十ｎ　３−　ｎ　８　　　　
７７±１７　　　（２）＋　１−５　　　　　　１０５
±３５　　　（２）＋　６−７　　　　　　９８±２９
　　　（６）＋　８−９　　　　　　７８±２９　　　
（３）＋１０−１３　　　　　　７５±７　　（２）−
０２はビタミンにで　る 単離された脂質ｎ２の核磁気共鳴分光学（ＮＭＲ）は、
ナフトキノン環構造の存在を示し、従って化合物のビタ
ミンにクラスを定義する。紫外線分光計がまた、ナフト
キノン環構造を確認した。

脂質ｎ２は、２種の溶媒系： ヘキサン／エーテル／酢酸（９０：１０：１）及びクロ
ロホルム／エーテル（９０：　１０）中においてＴＬＣ
上で本物のビタミン■ぐ＋　（Ｓｉｇｍａ）と共に同時
クロマトグラフィー処理された。ビタミンＫ　（ＭＫ−
８’）は、種類を同定することに使用するためのマーカ
ーとしてくしかし、明らかに放射線保護活性の源として
ではない）　、Ｄ、　”：ｙ’、；本’、；　ｘ　５ｔ
　７　、；ｌ　（ＹａｍａｄａｆＬζ、、　Ｃ１，ｃｉ
ｔ、）に以前同定された。

ヌードマウスの　　のビタミンＫによる　・護− ８力月の雌のヌードマウス（アルピノＳＫｈ　：ヌード
ー１）を、２０ｃｍの距離から２分間紫外線によりそれ
らの背中に照射した（ＵＶの強さ、５讐／ｍ２）。

照射の前、それらのマウスは、０．０．２，０．５．１
又は２ａ＋ｇ／ｍＮの濃度でビタミン■ぐを含む水性Ｄ
ＯＰＣ混合物（１０ｍｇ／　ｍｌ）３５１１１（１５ａ
ｍ２上に拡げた）により処理した。照射の後、それらの
マウスを、正常なかごにもどし、そしてＵＶによる皮膚
の損傷（紅斑及び浮腫）の形跡について試験した。５−
プラススケーリングシステム（５−ｐｌｕｓ　ｓｃａｌ
ｉＢｓｙｓｔｅｍ）を用いて、損傷の程度を評価した。

試験は、合計８人の研究者によって盲目的に（すなわち
、実験者による処理法の知識なしに）及び独自に行なわ
れた。下記の第２表に見られるように、ＵＶ誘導性皮膚
損傷とビタミンにの減少量との間に明確な相互関係が存
在する。

μ下奈白 １１表 の裁冴ｌ■別ｌ 処　　理　　　ＵＶ−誘発された損傷の重症度８（浮腫
及び紅斑） ＤＯＰＣのみ　　　　　　　　　　　　４．５±０．７
ＤＯＰＣ＋０．２１１１［？／ｍＮのビタミ’Ｊ　　　
　　　　　３．９±０．８ＤＯＰＣ＋　０．５ｍｇ／ｌ
ｎ／！のヒ゛タミンＫ　　　　　　３．０±０．９ＤＯ
ＰＣ＋　１．０ｍｇ／ｍｌのビタミンＫ　　　　　　　
２，０±１．１ＤＯＰＣ＋　２．０ｍｇ／＋ｎｌのビタ
ミンＫ　　　　　　　　１．５±０．６＊：１〜５の重
症度スケールを用いて照射後２４時間で評価された。結
果は、８人のそれぞれ、手はどきを受けていない観察者
の評価の平均±凛準偏差として表わされる。

すべての出版物及び本明ｌ１ＩＩＩ書で言及された特許
出願は、本発明が関係する当業者の熟練のレベルのしる
しである。それぞれ個々の出版物又は特許出願が特別に
且つ個々に引用によりこの明細書中に組み入れられてい
るかのように、すべての出版物及び特許出願を、ある程
度まで引用により本明細書中に組み入れる。

本発明は十分に記載されたが、これによってこの発明の
範囲を限定するものではなく、そして多くの変更及び修
飾が行なわれ得ることは、当業者にとっては明らかであ
ろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クロロホルム：メタノール：２８％アンモニ
ア（６５二３５：５）の溶媒中で展開された、シリカゲ
ルＨ４層クロマトグラフィープレートの図式的な図面で
あり、そして本明細書に論議される個々の脂質及び脂質
フラグメントを同定する。 第２図は、異なった溶媒系により平面で展開された２つ
のシリカゲルＨ薄層クロマトグラフィープレートの図式
的な図面であり、この１つは極性脂質の分離を示し、そ
して他は非極性脂質を示す。 これらの図は、図面に代わる写真である。 以下余白 手続補正書（方式） 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第２５０８１２号 ２、発明の名称 脂質基材による放射線の防護 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　ザ　ユニバージデイ　オブ　カルガリー４、代理
人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正命令のＥｌ付 ６、補正の対象 （１）願書 （２）明細書 （３）明細書の「図面の簡単な説明」の欄（４）図　面 ７、補正の内容 （１）願書の浄書 （２）明細書の浄書（内容に変更なし）（３）明細書第
４０頁第１６行の「これらの図は、図面に代わる写真で
ある。」を削除する。 （４）図面の浄書（内容に変更なし） ８、　添付書類の目録 （１）浄書した願書　　　　　　　　　　　　１通（２
）浄書明細書　　　　　　　　　　１通（３）浄書図面
　　　　　　　１通 学ｌ″す（

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表面への紫外線誘発性放射線損傷を防止するための
   方法であって、 ディノコーカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種からの脂
   質抽出物を前記損傷を減じるのに十分な量、前記表面に
   適用することを含んで成る。 ２、前記種がディノコーカス　ラジオジュランス（Ｄｅ
   ｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記種がディノコーカス　ラジオフィラス（Ｄｅｉ
   ｏｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｐｈｉｌｕｓ）である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、前記脂質抽出物が完全な脂質抽出物である特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５、前記脂質抽出物が画分脂質抽出物である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ６、前記画分脂質抽出物中に存在する脂質が、６５：３
   ５：５の比のクロロホルム：メタノール：２８％アンモ
   ニア溶媒系の溶液中でシリカゲルＨ薄層クロマトグラフ
   ィーによって測定される場合、０．５又はそれ以上のｒ
   ｆを有する特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記画分脂質抽出物が前記システムにより測定され
   る場合、０．５０、０．７０、０．８４、０．８８、０
   ．９２、０．９４又は０．９８のｒｆ値を有する脂質を
   含む特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、前記抽出物が前記ｒｆ値の単一の脂質から実質的に
   成る特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記脂質が位置２でイソプレノイド置換基及び位置
   ３で低級アルキル置換基を有する１，４−ナフトキノン
   である特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、表面への放射線損傷を防止するための方法であっ
   て、下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは０〜１４の整数であり、そしてＲはＣ＿１
   〜Ｃ＿４のアルキル基である〕で表わされる化合物を、
   前記損傷を減じるのに十分な量、前記表面に適用するこ
   とを含んで成る方法。 １１、ｎが７であり、そしてＲがメチル基である特許請
   求の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記表面が外因性細胞の表面である特許請求の範
   囲第１又は第１０項記載の方法。 １３、前記細胞が細菌又は酵素である特許請求の範囲第
   １２項記載の方法。 １４、前記細胞が哺乳類上皮細胞である特許請求の範囲
   第１２項記載の方法。 １５、前記量がｃｍ＾２当り０．０８〜１２ｍｇである
   特許請求の範囲第１又は第１０項記載の方法。 １６、前記脂質抽出物が水性エマルジョンの形で適用さ
   れる特許請求の範囲第１項記載の方法。 １７、表面への紫外線誘発性損傷を防止することができ
   る組成物であって、ディノコーカス種からの脂質抽出物
   を含有する組成物。 １８、前記抽出物が、６５：３５：５の比のクロロホル
   ム：メタノール：２８％アンモニア溶媒系の溶液中でシ
   リカゲルＨ薄層クロマトグラフィーによって測定される
   場合、０．５又はそれ以上のｒｆを有する特許請求の範
   囲第１７項記載の組成物。 １９、前記脂質が位置２でイソプレノイド置換基及び位
   置３で低級アルキル置換基を有する１，４−ナフトキノ
   ンである特許請求の範囲第１７項記載の組成物。 ２０、表面への放射線損傷を防止することができる組成
   物であって、下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、ｎは０〜１４の整数であり、そしてＲはＣ＿１
   〜Ｃ＿４のアルキル基である〕で表わされる脂質をキャ
   リヤー中に含んで成る組成物。