JPH01112986A - 組換えウイルスベクター - Google Patents
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
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- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
近代の分子生物学の出現（＝伴い、外来ＤＮＡを真核生
物細胞特１：動物細胞中に導入するための。
物細胞特１：動物細胞中に導入するための。
およびかかるＤＮＡをこれら細・胞により発現させるた
めのベクターとしてウィルスを活用する多くの試みがな
されて来た。それらの試みにおいて使用されてきたウィ
ルスには８’Ｖ４０ 、アデノクイルス、レトロクイル
ス、ヘルはスウイルス。
めのベクターとしてウィルスを活用する多くの試みがな
されて来た。それらの試みにおいて使用されてきたウィ
ルスには８’Ｖ４０ 、アデノクイルス、レトロクイル
ス、ヘルはスウイルス。
ワクシニアおよびバキュロウィルスが包含される。これ
ら系での成功ははるかにより簡単な細菌ファージでの成
功には匹敵しなかった。
ら系での成功ははるかにより簡単な細菌ファージでの成
功には匹敵しなかった。
これらの系の多くで繰返して発生する問題はそのベクタ
ーＤＮＡの寸法が大きいゆえにＤＮＡの外因性フラグメ
ントを導入することがしばしば困難であるか、非効率で
あるかまたはその両方であることである。例えば１代表
的にはへルＲスクイルスのゲノムは約１５０キロベース
（ｋｂ）のＤＮＡを含有している。従って、制限酵素／
リガーゼ技術を用いる伝統的なイン・ビトロ連結法はフ
ィルス類があまりに多くの制限酵素開裂部位を有するゆ
えセ複雑である。・従ってウィルスベクター中に異種Ｄ
ＮＡを導入する場合、外来ＤＮＡセグメントがベクター
ＤＮＡと相同のＤＮＡではさまれることを必要とする相
同組換えに最もしばしば頼ってきた。相同組換えは本来
非効率的で、遺伝子の置換が最良の系でも１００モル中
約１モル以下の頻度でしか起らない。従って、基本的な
問題は任意のＤＮＡセグメントを正確、高収率、効率的
かつ容易に挿入および回収できないことであった。劇的
に改良された組換え系に対する要求がなお存在していた
。
ーＤＮＡの寸法が大きいゆえにＤＮＡの外因性フラグメ
ントを導入することがしばしば困難であるか、非効率で
あるかまたはその両方であることである。例えば１代表
的にはへルＲスクイルスのゲノムは約１５０キロベース
（ｋｂ）のＤＮＡを含有している。従って、制限酵素／
リガーゼ技術を用いる伝統的なイン・ビトロ連結法はフ
ィルス類があまりに多くの制限酵素開裂部位を有するゆ
えセ複雑である。・従ってウィルスベクター中に異種Ｄ
ＮＡを導入する場合、外来ＤＮＡセグメントがベクター
ＤＮＡと相同のＤＮＡではさまれることを必要とする相
同組換えに最もしばしば頼ってきた。相同組換えは本来
非効率的で、遺伝子の置換が最良の系でも１００モル中
約１モル以下の頻度でしか起らない。従って、基本的な
問題は任意のＤＮＡセグメントを正確、高収率、効率的
かつ容易に挿入および回収できないことであった。劇的
に改良された組換え系に対する要求がなお存在していた
。
ファージＰ１はｌ ｏｘＰと呼ばれる短い非対称、ＤＮ
ＡおよびＣｒｅと呼ばれる３８キロダルトンのタンパク
質を包含する効率的な部位特異的組換え系をコーディン
グしている。この細菌組換え系はｓｔｅｒｎｂｅｒｇ氏
他、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＰＩ ８１ｔｅ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ １．
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ １ｏｘ
Ｐ ５ｉｔｅｓ、 Ｊ、 Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、 １５０
： ４６７〜４８６ （１９７１） ； Ａｂｒｅｍｓ
ｋｉ氏他、８ｔｕ（ｉｉｅ８０ｎｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒ
ｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｉ ５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｒｅｃｏｍ−ｂｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ
ｆｏｒ Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｕｎｌ−１
ｎｋｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ。
ＡおよびＣｒｅと呼ばれる３８キロダルトンのタンパク
質を包含する効率的な部位特異的組換え系をコーディン
グしている。この細菌組換え系はｓｔｅｒｎｂｅｒｇ氏
他、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ＰＩ ８１ｔｅ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ １．
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎ １ｏｘ
Ｐ ５ｉｔｅｓ、 Ｊ、 Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、 １５０
： ４６７〜４８６ （１９７１） ； Ａｂｒｅｍｓ
ｋｉ氏他、８ｔｕ（ｉｉｅ８０ｎｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒ
ｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｉ ５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｒｅｃｏｍ−ｂｉｎａｔｉｏｎ： Ｅｖｉｄｅｎｃｅ
ｆｏｒ Ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｕｎｌ−１
ｎｋｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ。
Ｃｅ１ｌ ３２： １３０１〜１３１１（１９８５）；
ＨＯａｓｓ氏他、 Ｍｅ−ｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
ａｔｒａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｅｘｃ
ｈａＨｅｉｎ ｔｈｅ Ｃｒｅ−ｌｏｘ ５ｉｔｅ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙ
ｓｔｅｍ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １８１
： ３５１〜３６２（１９８５）およびＳｔｅｒｎｂｅ
ｒｇ氏他、 Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １８７：１９
７〜２１２（１９Ｂ６）に記載されている。
ＨＯａｓｓ氏他、 Ｍｅ−ｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ
ａｔｒａｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｅｘｃ
ｈａＨｅｉｎ ｔｈｅ Ｃｒｅ−ｌｏｘ ５ｉｔｅ
−ｓｐｅｃｉｆｉｃｏｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙ
ｓｔｅｍ、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 １８１
： ３５１〜３６２（１９８５）およびＳｔｅｒｎｂｅ
ｒｇ氏他、 Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １８７：１９
７〜２１２（１９Ｂ６）に記載されている。
１ｏ：ｃＰ部位は非対称のａｂｐコア配列により分離さ
れた２個の１３ｂｐの逆方向反復単位からなる３４ ｂ
ｐの配列である。ファージ中の１０ＩＰ部位間の組換え
は り 分子間または分子内のいずれでも起りうる。
れた２個の１３ｂｐの逆方向反復単位からなる３４ ｂ
ｐの配列である。ファージ中の１０ＩＰ部位間の組換え
は り 分子間または分子内のいずれでも起りうる。
２）その部位がスーパーコイル状あるいは線状ＤＮＡの
いずれで存在する場合でも起りうる。そして ５） ＤＮＡ分子上の１．ｏｘＰ部位の相対的な配向
と関わりない、但しかかる配向は組換えの性質を決定し
ようが、同じＤＮＡ分子上の２個の同じ配向をした１ｏ
ｘＰ部位間の組換えはその部位間にあるＤＮＡセグメン
トの欠失を生ずる。１ｏｘＰ部位が相互に関して反対の
配向にあるＤＮＡ分子上では。
いずれで存在する場合でも起りうる。そして ５） ＤＮＡ分子上の１．ｏｘＰ部位の相対的な配向
と関わりない、但しかかる配向は組換えの性質を決定し
ようが、同じＤＮＡ分子上の２個の同じ配向をした１ｏ
ｘＰ部位間の組換えはその部位間にあるＤＮＡセグメン
トの欠失を生ずる。１ｏｘＰ部位が相互に関して反対の
配向にあるＤＮＡ分子上では。
組換えは間にあるＤＮＡセグメントの逆電を生ずる。１
ｏｘＰ部位間の細菌による組換えはＣｒｅタンパク質の
みしか必要とせずかつインビトロで効率的に進行する。
ｏｘＰ部位間の細菌による組換えはＣｒｅタンパク質の
みしか必要とせずかつインビトロで効率的に進行する。
どの宿主因子に対しても何の要求も存在しない。Ｃｒｅ
−１ｏｗ組換え系の特別の利点は、Ｃｒｅタンパク質が
Ａｂｒｅｍｓｋｉ氏他のＪ。
−１ｏｗ組換え系の特別の利点は、Ｃｒｅタンパク質が
Ａｂｒｅｍｓｋｉ氏他のＪ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５９： １５０９〜１５１
４ （１９８４）に記載されるように大腸菌の適当に操
作された菌株から大量に調製されうろことである。
４ （１９８４）に記載されるように大腸菌の適当に操
作された菌株から大量に調製されうろことである。
Ｃｒｅ−ＩＱｘ系は酵母および補乳動物細胞を含む真核
細旭中においてＤＮＡの部位特異的組換えを行うのに普
及されてきた（米国出願４０４３．７９５号（１９８７
年４月２９日出Ｈ）および同７８４．９５１号（１９８
５年１０月７日出願）参照）。必要な１０Ｍ部位および
Ｃｒｅ遺伝子を付与するのに用いられるベクターは、本
願発明の一部分である特異的なベクターを用いる一例を
除き前記された慣用の方法により調製される。安定であ
りかつ生存能力のある組換え動物細胞ウィルスベクター
の調製へのＣｒｅ−１０Ｘの応用法は本発明以前には示
唆されていなかった。
細旭中においてＤＮＡの部位特異的組換えを行うのに普
及されてきた（米国出願４０４３．７９５号（１９８７
年４月２９日出Ｈ）および同７８４．９５１号（１９８
５年１０月７日出願）参照）。必要な１０Ｍ部位および
Ｃｒｅ遺伝子を付与するのに用いられるベクターは、本
願発明の一部分である特異的なベクターを用いる一例を
除き前記された慣用の方法により調製される。安定であ
りかつ生存能力のある組換え動物細胞ウィルスベクター
の調製へのＣｒｅ−１０Ｘの応用法は本発明以前には示
唆されていなかった。
従って本発明の目的は核酸セグメントを好都合で効率的
な方法で動物細胞ウィルスはフタ−中に部位特異的に挿
入して、生存能力を有しかつ安定である、選択可能な組
換えベクターを生成させる方法を提供することである。
な方法で動物細胞ウィルスはフタ−中に部位特異的に挿
入して、生存能力を有しかつ安定である、選択可能な組
換えベクターを生成させる方法を提供することである。
本明細書をさらに調べれば１本発明の他の目的および利
点が当業者（＝は明らかとなろう。
点が当業者（＝は明らかとなろう。
これらの目的は、フィルスベクターのＤＮＡ中にＤＮＡ
セグメントを部位特異的に挿入することにより動物細胞
）二とって安定でかつ生存能力のある組換えウィルスベ
クターを調製するに当たり、Ｃｒｅを 前記動物細胞ウィルスベクターのＤＮＡ中に導入された
第１のｌＯｘ部位、および 環状でありかつ前記ＤＮＡセグメン）（＝隣接する第２
のｌＯｘ部位を含有する別のＤＮＡ分子中の該第２のｌ
Ｏｘ部位 と接触させ、それによりＣｒｅが前記第１のｌＯｘ部位
で前記環状ＤＮＡと前記ウィルスベクターＤＮＡとの組
換えを行い、かくして生存可能でありかつ安定である組
換え動物細胞ウィルスはフタ−と生成させること４ｂｉ
らなる方法を提供することにより達成された。
セグメントを部位特異的に挿入することにより動物細胞
）二とって安定でかつ生存能力のある組換えウィルスベ
クターを調製するに当たり、Ｃｒｅを 前記動物細胞ウィルスベクターのＤＮＡ中に導入された
第１のｌＯｘ部位、および 環状でありかつ前記ＤＮＡセグメン）（＝隣接する第２
のｌＯｘ部位を含有する別のＤＮＡ分子中の該第２のｌ
Ｏｘ部位 と接触させ、それによりＣｒｅが前記第１のｌＯｘ部位
で前記環状ＤＮＡと前記ウィルスベクターＤＮＡとの組
換えを行い、かくして生存可能でありかつ安定である組
換え動物細胞ウィルスはフタ−と生成させること４ｂｉ
らなる方法を提供することにより達成された。
他の局面においては、これらの目的はこの方法に、例え
ばＤＮＡセグメントまたは出発ウィルスベクターのいず
れか、好ましくは後者におけるマーカーに基づき組換え
ベクターを続いて選択し、および／またはウィルスベク
ター中にｌａｘ部位を予め挿入する付加的な工程を包含
させることにより達成された。本発明はさらｌ’ｌ−。
ばＤＮＡセグメントまたは出発ウィルスベクターのいず
れか、好ましくは後者におけるマーカーに基づき組換え
ベクターを続いて選択し、および／またはウィルスベク
ター中にｌａｘ部位を予め挿入する付加的な工程を包含
させることにより達成された。本発明はさらｌ’ｌ−。
本発明方法により調製された組換えベクター。
１０Ｘ部位を含有する動物細胞ウィルスにフタ−および
本発明の組換えベクターを利用°する外来ＤＮＡの発現
法にも関する。特に好ましいベクターはシュードラビー
ズウィルス（ｐｎｖ）４２である。
本発明の組換えベクターを利用°する外来ＤＮＡの発現
法にも関する。特に好ましいベクターはシュードラビー
ズウィルス（ｐｎｖ）４２である。
以下に示されるようシニ、本発明方法は驚くべきことに
好都合で速やかでかつ非常に効率良く進行することが見
出された。これは１例えば非常に著逼的な制限エンドヌ
クレアーゼ法を用いるウィルスベクター中への外来ＤＮ
Ａの挿入（二これまで必要であった操作体系および時間
をかなり単純化しかつ短縮させるものである。本発明方
法を任意の動物細胞ウィルスベクターＣ：効率的に適用
するには、そのベクター中にｌｏｘを挿入するための部
位を位置選定することしか必要でなく、そうすれば組換
え後にそのクイルスベク′ターは生存能力を保持してい
る。以下に記載されるようζ二条くのベクター中に多く
のかかる部位が存在している。
好都合で速やかでかつ非常に効率良く進行することが見
出された。これは１例えば非常に著逼的な制限エンドヌ
クレアーゼ法を用いるウィルスベクター中への外来ＤＮ
Ａの挿入（二これまで必要であった操作体系および時間
をかなり単純化しかつ短縮させるものである。本発明方
法を任意の動物細胞ウィルスベクターＣ：効率的に適用
するには、そのベクター中にｌｏｘを挿入するための部
位を位置選定することしか必要でなく、そうすれば組換
え後にそのクイルスベク′ターは生存能力を保持してい
る。以下に記載されるようζ二条くのベクター中に多く
のかかる部位が存在している。
従って本発明はＤＮＡのｌｏｘフラグメントがウィルス
の増巾に影響しないような位置でウィルスの１）ＮＡ中
１＝置かれ、そしてもう一方のｌＯｘ部位が該ウィルス
ＤＮＡ中に挿入されるべきＤＮＡのフラグメント（フラ
グメントＸ）に隣接して置かれることからなる、異種Ｄ
ＮＡのフラグメントをＤＮＡを含有する動物ウィルスの
Ｉ）ＮＡ中の正確な位置に効率的に挿入する方法を提供
するものである。後者ｌＯｘ部位および前記フラグメン
トは環状ＤＮＡ構造物中に含有される。ｌｏｘを含有す
るフィルスＤＮＡを、２つの核酸の間での組換えを起さ
せるの（＝適当な知られた条件下にＣｒｅタンパク質の
存在下環状１ｏｘ−フラグメントＸＤＮＡと接触させる
＠ 本発明の好ましい態様においては、１ＯＸｃ２部位がＰ
ＲＶのベラカー（ＢｅＣｋｅｒ）株のｇｉｌｌ遺伝子中
に置かれてＰＲＶ４２を形成する。
の増巾に影響しないような位置でウィルスの１）ＮＡ中
１＝置かれ、そしてもう一方のｌＯｘ部位が該ウィルス
ＤＮＡ中に挿入されるべきＤＮＡのフラグメント（フラ
グメントＸ）に隣接して置かれることからなる、異種Ｄ
ＮＡのフラグメントをＤＮＡを含有する動物ウィルスの
Ｉ）ＮＡ中の正確な位置に効率的に挿入する方法を提供
するものである。後者ｌＯｘ部位および前記フラグメン
トは環状ＤＮＡ構造物中に含有される。ｌｏｘを含有す
るフィルスＤＮＡを、２つの核酸の間での組換えを起さ
せるの（＝適当な知られた条件下にＣｒｅタンパク質の
存在下環状１ｏｘ−フラグメントＸＤＮＡと接触させる
＠ 本発明の好ましい態様においては、１ＯＸｃ２部位がＰ
ＲＶのベラカー（ＢｅＣｋｅｒ）株のｇｉｌｌ遺伝子中
に置かれてＰＲＶ４２を形成する。
本発明方法の好ましい態様は、それ自身何ら選択可能な
マーカーを有しないＤＮＡセグメントなＰＲＶワイルス
中に挿入するのに特に好都合である。
マーカーを有しないＤＮＡセグメントなＰＲＶワイルス
中に挿入するのに特に好都合である。
本発明の種々の他の目的、ＩＦｉ徴および付随する利点
のよりよき理解を助ける目的で図面を添付しである。
のよりよき理解を助ける目的で図面を添付しである。
第１図はｇｌｌｌ−１ｏｘＣ２遺伝子の構成を示す。構
成の詳細は本明細書中（二記載されている。１ＯＸ０２
部位およびその方向はその配列を囲む大きな矢印で表わ
される。
成の詳細は本明細書中（二記載されている。１ＯＸ０２
部位およびその方向はその配列を囲む大きな矢印で表わ
される。
第２図）ま大腸菌中におけるｃｒｏ−ｇｒＪＪ融合タン
パク質の合成を証明する写真である。集合タンノ２り質
請製物をＳＤＳ含有８チポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動した。矢印はｐＡＬＭ３およびｐＢｓ１０９から
のｃｒｏ −ｇ［Ｉ融合タンパク質の位置を示す。タン
パク質分子量マーカーは横に示す。
パク質の合成を証明する写真である。集合タンノ２り質
請製物をＳＤＳ含有８チポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動した。矢印はｐＡＬＭ３およびｐＢｓ１０９から
のｃｒｏ −ｇ［Ｉ融合タンパク質の位置を示す。タン
パク質分子量マーカーは横に示す。
第５Ａ図はＰＲＶ４２中へのｐＢ８６４の組込みを示す
写真である。ＰＲＶ ＤＮＡ ２ μｇおよびｐＢ８６
４０．２５μｇを含有するＣｒｅ反応物をＢｇｌｌｌお
よびＥＣ０ＲＩでの消化後にＭａｎｉａｔｉｓ氏他のＭ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＣ１ｏ−ｎ１ｎ： ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ
８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ。
写真である。ＰＲＶ ＤＮＡ ２ μｇおよびｐＢ８６
４０．２５μｇを含有するＣｒｅ反応物をＢｇｌｌｌお
よびＥＣ０ＲＩでの消化後にＭａｎｉａｔｉｓ氏他のＭ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣＣ１ｏ−ｎ１ｎ： ａ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ
８ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ。
Ｎ、Ｙ、） １９８２（二記載されるようにして０．５
ｆｉｇ／ｍｌのエチジクムプロマイドを含有するα７
チアガロースゲル上で分析した。レーン１はＰＲＶ４２
を用いる完全な反応を示し、レーン２はＰＶＡが除かれ
ており、レー／３はＣｒｅが除かれており、レーン４は
ｐＢｓ６４が除かれておりそしてレーン５はＰＲＶ４２
１：代えてＰＢｖ−Ｂｅ ＤＮＡが用イラレタ。
ｆｉｇ／ｍｌのエチジクムプロマイドを含有するα７
チアガロースゲル上で分析した。レーン１はＰＲＶ４２
を用いる完全な反応を示し、レーン２はＰＶＡが除かれ
ており、レー／３はＣｒｅが除かれており、レーン４は
ｐＢｓ６４が除かれておりそしてレーン５はＰＲＶ４２
１：代えてＰＢｖ−Ｂｅ ＤＮＡが用イラレタ。
第３Ｂ図はＰＲｖ４２：：ｐＢ８６４カら（Ｄ ｐＢ８
６４ （Ｄ 切−り出しを示す写真である。Ｃｒｅ反応
は０．６μｇのＰＲＶ４２：：ｐＢＢ６４ ＤＮＡを用
いて遂行されセしてＯ，Ｓμｇ７ｍｌのエチジクムブロ
マイドを含有する０、７チアガロースゲル上で分析した
。レーン１はＣｒｅタン、２り質が除かれており、レー
ン２は完全なる反応を示しそしてレーン３はレーン２と
同じであるが但しＢｇｌ ｎおよびＥｃｏＲＩで消化さ
れた。スーパーコイル（ＳＣ）状、ニックの入った環状
（ＮＣ） 、弛緩した環状（Ｅｔｃ’）、および線状（
ｌｉｎ）のｐＢＳ（５４の移動度が示される。
６４ （Ｄ 切−り出しを示す写真である。Ｃｒｅ反応
は０．６μｇのＰＲＶ４２：：ｐＢＢ６４ ＤＮＡを用
いて遂行されセしてＯ，Ｓμｇ７ｍｌのエチジクムブロ
マイドを含有する０、７チアガロースゲル上で分析した
。レーン１はＣｒｅタン、２り質が除かれており、レー
ン２は完全なる反応を示しそしてレーン３はレーン２と
同じであるが但しＢｇｌ ｎおよびＥｃｏＲＩで消化さ
れた。スーパーコイル（ＳＣ）状、ニックの入った環状
（ＮＣ） 、弛緩した環状（Ｅｔｃ’）、および線状（
ｌｉｎ）のｐＢＳ（５４の移動度が示される。
第３Ｃ図は環状プラスミドｐＢ８６４およびＰＲＶ４２
ケ゛ツム間のＣｒｅにより仲介されたインビトロでの組
換えを示す。Ｃｒｅタンパク質が、ｇｌ■遺伝子中Ｅ
ｌｏｘ部位を含有する線状分子（ＰＷ４２ ＤＮＡ）中
への環状プラスミドｐＢｓ６４の組み込みを触媒しうる
ことを概略して示す。同様に、Ｃｒｅはｌｏｘ２基質、
すなわち２個の同じ方向に反復する１ｏｘ部位を含有す
る基質からの環状分子の切り出しをも触媒しうる。
ケ゛ツム間のＣｒｅにより仲介されたインビトロでの組
換えを示す。Ｃｒｅタンパク質が、ｇｌ■遺伝子中Ｅ
ｌｏｘ部位を含有する線状分子（ＰＷ４２ ＤＮＡ）中
への環状プラスミドｐＢｓ６４の組み込みを触媒しうる
ことを概略して示す。同様に、Ｃｒｅはｌｏｘ２基質、
すなわち２個の同じ方向に反復する１ｏｘ部位を含有す
る基質からの環状分子の切り出しをも触媒しうる。
第４図は１個の１ｏｘＰ部位を有するプラスミドを示す
。プラスミドｐＢ８６４はｐ８Ｐ６４から誘導される。
。プラスミドｐＢ８６４はｐ８Ｐ６４から誘導される。
このものはポリリンカー領域に挿入された１個の１ｏｘ
Ｐ部位を含有する。さらに、このプラスミドはＡｍｐｒ
遺伝子および、 ｐＢＲ３２２からの複製起点およびＢ
Ｐ６プロモーターエレメント（転写の方向を示す波状矢
印を含有する白地枠により示される）を担持する。
Ｐ部位を含有する。さらに、このプラスミドはＡｍｐｒ
遺伝子および、 ｐＢＲ３２２からの複製起点およびＢ
Ｐ６プロモーターエレメント（転写の方向を示す波状矢
印を含有する白地枠により示される）を担持する。
本発明は知られたＣｒｅ−ｌｏｘ技法を用いる、動物フ
ィルスベクターの高度に好都合な製法１選択法および／
または使用法を提供するものである。２個のｌｏｘ部位
によりはさまれた。挿入されたＤＮＡセグメントが生成
するフィルス中（二安定に組み込まれたままであること
が見用されたことは驚くべきことであった。ＤＮＡクイ
ルスが高い組換え率を有することはよく知られているの
で（例えば、ヘルはスクイルスに関してはＢｅｎ ｆ’
ｏｒａｔ氏他（１９８５）Ｃ以下参照）に、そしてワク
シニアワイルスに関してはり、 Ａ、 Ｂａ１１氏のＧ
、 ｏｆ Ｖｉｒａｌ、 ６１：１７８８〜１７９５
（１９８７）に示されるように）１本発明の組換えベク
ターは安定でなかろうしそして相同の組換えによりそれ
が切り出されることが予測されるゆえに回収され得なか
ろうことが当業者（二より予想された。このことがその
系をかなり不安定にしそして回収率を低くするであろう
ことが予想されよう。
ィルスベクターの高度に好都合な製法１選択法および／
または使用法を提供するものである。２個のｌｏｘ部位
によりはさまれた。挿入されたＤＮＡセグメントが生成
するフィルス中（二安定に組み込まれたままであること
が見用されたことは驚くべきことであった。ＤＮＡクイ
ルスが高い組換え率を有することはよく知られているの
で（例えば、ヘルはスクイルスに関してはＢｅｎ ｆ’
ｏｒａｔ氏他（１９８５）Ｃ以下参照）に、そしてワク
シニアワイルスに関してはり、 Ａ、 Ｂａ１１氏のＧ
、 ｏｆ Ｖｉｒａｌ、 ６１：１７８８〜１７９５
（１９８７）に示されるように）１本発明の組換えベク
ターは安定でなかろうしそして相同の組換えによりそれ
が切り出されることが予測されるゆえに回収され得なか
ろうことが当業者（二より予想された。このことがその
系をかなり不安定にしそして回収率を低くするであろう
ことが予想されよう。
ところがこれと反対に１本発明により調製されうる組換
えベクターは高度に安定で生存可能であることが見出さ
れた。その結果、本発明によりフィルスベクター中での
部位特異的な組換えが可能となり１組換え動物細胞フィ
ルスベクターが非常に好都合で、速やかで、かつ効率的
に形成されうる。本発明によりフィルスベクターの特異
的な位置（すなわちｌｏｘ部位）中への実質上すべての
ＤＮＡの挿入および回収が可能となった。効率は相同組
換えのそれに比較して代表的には５〜１００倍優れてい
る。本発明の組換え事象がそのように効果的で、かつ生
成物が安定であることが信頼できるので１組換え生成物
を選択するのにかなり時間を節約することもできる。こ
のように１本発明は大きなりＮＡクイルスをベクターと
して使用する場合に固有の問題を含む前記論蘭された問
題を解決するのみならずそれを驚くべき好都合な方法で
達成している。
えベクターは高度に安定で生存可能であることが見出さ
れた。その結果、本発明によりフィルスベクター中での
部位特異的な組換えが可能となり１組換え動物細胞フィ
ルスベクターが非常に好都合で、速やかで、かつ効率的
に形成されうる。本発明によりフィルスベクターの特異
的な位置（すなわちｌｏｘ部位）中への実質上すべての
ＤＮＡの挿入および回収が可能となった。効率は相同組
換えのそれに比較して代表的には５〜１００倍優れてい
る。本発明の組換え事象がそのように効果的で、かつ生
成物が安定であることが信頼できるので１組換え生成物
を選択するのにかなり時間を節約することもできる。こ
のように１本発明は大きなりＮＡクイルスをベクターと
して使用する場合に固有の問題を含む前記論蘭された問
題を解決するのみならずそれを驚くべき好都合な方法で
達成している。
本発明によれば、任意の知られたＣｒｅタンパク質、お
よびｌｏｘ部位に関するその官能性を保持するその突然
変異体または変種が使用されうる。Ｃｒｅタンパク質は
ｌｏｘ部位ＤＮＡセグメントがそうであるように容易に
入手しうる。組換えＤＮＡ技術Ｃ：関するよく知られた
方法がｌｏｘ部位を有する動物細胞フィルスベクター核
酸の調製およびそれに挿入すべきかつ同じ＜ｌｏｘ部位
を含有する別の環状核酸分子の調製に用いられうる。例
えばＭａｎｉａｔｉＳ氏他の前記引用文献を参照された
い。
よびｌｏｘ部位に関するその官能性を保持するその突然
変異体または変種が使用されうる。Ｃｒｅタンパク質は
ｌｏｘ部位ＤＮＡセグメントがそうであるように容易に
入手しうる。組換えＤＮＡ技術Ｃ：関するよく知られた
方法がｌｏｘ部位を有する動物細胞フィルスベクター核
酸の調製およびそれに挿入すべきかつ同じ＜ｌｏｘ部位
を含有する別の環状核酸分子の調製に用いられうる。例
えばＭａｎｉａｔｉＳ氏他の前記引用文献を参照された
い。
Ｃｒｅタンパク質の製法の一つはそれを大腸菌から発現
させることである（Ａｍｂｒｅｓｋｉ氏他、前記引用文
献参照）。プラスミドｐＢＳ！＋９ （Ｃｒｅ遺伝子お
よびＧＡＬ１調節ヌクレオチド配列な担持）で形質転換
された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＤＨｌおよび酵母菌株
ＢＳＹ９０はＡ’ｌ’ＣＣにそれぞれ寄託番号５５２５
５および２０７７２の下に寄託されている。これらのプ
ラスミドからのＣｒｅタンパク質の詳細な取得法は米国
特許出願第０４３，７９５号に記載されておりそして当
業上よく知られている。
させることである（Ａｍｂｒｅｓｋｉ氏他、前記引用文
献参照）。プラスミドｐＢＳ！＋９ （Ｃｒｅ遺伝子お
よびＧＡＬ１調節ヌクレオチド配列な担持）で形質転換
された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ） ＤＨｌおよび酵母菌株
ＢＳＹ９０はＡ’ｌ’ＣＣにそれぞれ寄託番号５５２５
５および２０７７２の下に寄託されている。これらのプ
ラスミドからのＣｒｅタンパク質の詳細な取得法は米国
特許出願第０４３，７９５号に記載されておりそして当
業上よく知られている。
本発明で使用するのに適切なｌｏｒ部位の詳細も米国特
許出願第０４３．７９５号に記載されている。「１ｏｘ
部位」なる表現はその部位でＣｒｅ遺伝子のタンパク遺
伝子産物が部位特異的な組換えを触媒しうるすべてのヌ
クレオチド配列を包含するものとする。ｒｏ’ｎ部位は
画業上知られた方法によりバクテリオファージＰ１から
単離されうる３４塩基対のヌクレオチド配列である。バ
クテリオファージＰＬから１０）ＣＰ部位を単離する方
法の一つはＨｏｅｓｓ氏他のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
許出願第０４３．７９５号に記載されている。「１ｏｘ
部位」なる表現はその部位でＣｒｅ遺伝子のタンパク遺
伝子産物が部位特異的な組換えを触媒しうるすべてのヌ
クレオチド配列を包含するものとする。ｒｏ’ｎ部位は
画業上知られた方法によりバクテリオファージＰ１から
単離されうる３４塩基対のヌクレオチド配列である。バ
クテリオファージＰＬから１０）ＣＰ部位を単離する方
法の一つはＨｏｅｓｓ氏他のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、 ７９：５５９８ （１９８２）に記載されて
いる。１ｏｘＰ部位は８塩基対スに一す−領域により分
離された１３塩基対を有する逆方向反復単位２個からな
る。反復単位およびスは−サー領域のヌクレオチド配列
は次のとおりである。
いる。１ｏｘＰ部位は８塩基対スに一す−領域により分
離された１３塩基対を有する逆方向反復単位２個からな
る。反復単位およびスは−サー領域のヌクレオチド配列
は次のとおりである。
ＡＴＡＡＣ！’Ｌ”ｒＣＧＴＡＴＡ ＡＴＧＴＡＴＧＣ
ＴＡＴＡＣ（）ＡＡＧＴＴＡＴＩＪＵ２遺伝子で連結さ
れた２個のｌ０ＸＰ部位を担持するシラスミドｐＢｓ４
４で形質転換された大腸菌ＤＩ（５Δｌａｃおよび酵母
菌株ＢＳＹ２５はＡＴＣＣにそれぞれ寄託番号５３２５
４および２０７７５の下に寄託されている。これらｌＯ
ｘ部位はプラスミドｐＢ８４４から制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌ Ｉ、あるいはｘｈｏ ｔおよびＢａｍ
ｌを用いて単離されうる。
ＴＡＴＡＣ（）ＡＡＧＴＴＡＴＩＪＵ２遺伝子で連結さ
れた２個のｌ０ＸＰ部位を担持するシラスミドｐＢｓ４
４で形質転換された大腸菌ＤＩ（５Δｌａｃおよび酵母
菌株ＢＳＹ２５はＡＴＣＣにそれぞれ寄託番号５３２５
４および２０７７５の下に寄託されている。これらｌＯ
ｘ部位はプラスミドｐＢ８４４から制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＳａｌ Ｉ、あるいはｘｈｏ ｔおよびＢａｍ
ｌを用いて単離されうる。
さら（二、予め選択されたｆ）ＮＡ上セグメント当業上
知られた技法書二よりｐＢ８４４中の８ａｌ ｌまた）
まＢａｍ ｌ制限酵素部位のどちらにでも挿入されうる
。他の適当な１０１部位には大腸菌から単離されるヌク
レオチド配列であるｌｏｘＢ 、１ｏｘＬおよび１ｏｘ
Ｐ部位が包含される。これらの配列はＨｏｅｓａ氏他に
よりＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ、 ７９：５３９８（１９８２）に開示されている
。
知られた技法書二よりｐＢ８４４中の８ａｌ ｌまた）
まＢａｍ ｌ制限酵素部位のどちらにでも挿入されうる
。他の適当な１０１部位には大腸菌から単離されるヌク
レオチド配列であるｌｏｘＢ 、１ｏｘＬおよび１ｏｘ
Ｐ部位が包含される。これらの配列はＨｏｅｓａ氏他に
よりＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ、 ７９：５３９８（１９８２）に開示されている
。
１０Ｘ部位はまた当業上知られた種々の合成技術によっ
ても生成されうる。ｌＯｘ部位を生成させるための合成
技術はｌｔｏ氏他のＮｕｃ、 Ａｃ１ｄＲｅｓ、、 １
０：１７５５ （１９８２）および０ｇ１ｌｖｉｅ氏他
の５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１４：２７０ （１９８１）
ｌ二記載されている。
ても生成されうる。ｌＯｘ部位を生成させるための合成
技術はｌｔｏ氏他のＮｕｃ、 Ａｃ１ｄＲｅｓ、、 １
０：１７５５ （１９８２）および０ｇ１ｌｖｉｅ氏他
の５ｃｉｅｎｃｅ、 ２１４：２７０ （１９８１）
ｌ二記載されている。
他のかかる部位の例にはｌｏｗΔ８６およびＩＯＸΔ１
１７がある。ＩＯＸ△８６部位は３４塩基対位置中のう
ち７つで異なるｉ基対を有する点でｌ０ＸＰと相異する
。たとえそうであってもｌｏｘΔ８６部位はＯｒｅによ
り仲介された細菌組換えにおいてｌ０ＸＰ部位とうまく
組換わる。
１７がある。ＩＯＸ△８６部位は３４塩基対位置中のう
ち７つで異なるｉ基対を有する点でｌ０ＸＰと相異する
。たとえそうであってもｌｏｘΔ８６部位はＯｒｅによ
り仲介された細菌組換えにおいてｌ０ＸＰ部位とうまく
組換わる。
それ°ゆえｌＯｘ部位はここではＣｒｅタンパク質がそ
れと同じ部位とあるいは他のｌＯｘ部位例えば１ｏｘＰ
と部位特異的なりＮＡ組換えを惹起する部位であるＤＮ
Ａ配列と定義される。その上、前記したように、ｌＯｘ
部位間でなお組換えを惹起しうる突然変異Ｃｒｅタンパ
ク質を生成するＣｒｅ遺伝子の突然変異体も存在する。
れと同じ部位とあるいは他のｌＯｘ部位例えば１ｏｘＰ
と部位特異的なりＮＡ組換えを惹起する部位であるＤＮ
Ａ配列と定義される。その上、前記したように、ｌＯｘ
部位間でなお組換えを惹起しうる突然変異Ｃｒｅタンパ
ク質を生成するＣｒｅ遺伝子の突然変異体も存在する。
それらも本発明で使用されうる。それゆえＣｒｅタンパ
ク質はＣｒｅ遺伝子の生産１１！！！ｙ（８ｔｅｒｎｂ
ｅｒｇ氏他のＪ、Ｍｏｌ。
ク質はＣｒｅ遺伝子の生産１１！！！ｙ（８ｔｅｒｎｂ
ｅｒｇ氏他のＪ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、 １８７：１９７〜２１２ （１９８１５）
参照）あるいはその生産物がｌＯｘ部位で部位特異′的
な組換えを行う突然変異Ｃｒｅ遺伝子の生産物と定義さ
れる。
参照）あるいはその生産物がｌＯｘ部位で部位特異′的
な組換えを行う突然変異Ｃｒｅ遺伝子の生産物と定義さ
れる。
組換え分子を生成させる効率が比較的高いことはＣｒｅ
−１ｏｘ系の固有の性質でありそして驚くべきことに本
発明において保持されている。
−１ｏｘ系の固有の性質でありそして驚くべきことに本
発明において保持されている。
ｌ０ＸＰ部位以外の特異的なｌＯｘ部位でＣｒｅにより
惹起される効果的な組換えについて記載している例えば
Ｈｏｅｓｓ氏他のＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１４ ：２２８７〜２５００ （１９８６）および８ｔ
ｅｒｎｂｅｒｇ氏他のＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄ
ＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍ−
ｔ）ｉｎａｔｉＯｎ、 ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ
ｏｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙｓ １０： Ｎ、 Ｒ，Ｃｏｚｚａｒｅｌ
ｌｉ、 ＩＭ。
惹起される効果的な組換えについて記載している例えば
Ｈｏｅｓｓ氏他のＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、
１４ ：２２８７〜２５００ （１９８６）および８ｔ
ｅｒｎｂｅｒｇ氏他のＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄ
ＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍ−
ｔ）ｉｎａｔｉＯｎ、 ＵＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｉａ
ｏｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙｓ １０： Ｎ、 Ｒ，Ｃｏｚｚａｒｅｌ
ｌｉ、 ＩＭ。
（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５ｓ）、
６７１〜６８４頁（１９８３）を参照されたい。
６７１〜６８４頁（１９８３）を参照されたい。
インビトロＣｒｅ−１ｏｘ組換え系に適する条件はよく
知られておりそしてここにあげられた文献例えばＡｂｒ
ｅｍｓｋｉ氏他のＪ、阻ｏ１． ｃｈｅｍ、 ２５９：
１５０９〜１５１４（１９８４）に論議されている。簡
単に言えば、組換えるべきＤＮＡを混合して、５０ｍＭ
のト リ ス − ＨＣＪ（ｍ７．５） 、 ３５
ｍＭ の ＮａＣ１、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および精製
Ｃｒｅタン、Ｊり質の存在下に３０℃で３０分間インキ
ュベーションする。分子間組換えの場合、完全な反応物
は、Ｔａｎｆｏｒｄ。
知られておりそしてここにあげられた文献例えばＡｂｒ
ｅｍｓｋｉ氏他のＪ、阻ｏ１． ｃｈｅｍ、 ２５９：
１５０９〜１５１４（１９８４）に論議されている。簡
単に言えば、組換えるべきＤＮＡを混合して、５０ｍＭ
のト リ ス − ＨＣＪ（ｍ７．５） 、 ３５
ｍＭ の ＮａＣ１、１０ｍＭのＭｇＣｌ２および精製
Ｃｒｅタン、Ｊり質の存在下に３０℃で３０分間インキ
ュベーションする。分子間組換えの場合、完全な反応物
は、Ｔａｎｆｏｒｄ。
Ｃ０氏によりＰｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ｏｆ Ｍａｃｒ−ｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ｗｉ
ｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） １９６１に記載される
ように恐らくは容量効果が排除されることＣ二より組換
えを促進させるために１．７チのポリビニルアルコール
（ＰＶＡ）を紙含有する。反応は試料を７０Ｃで５分間
加熱してＣｒｅを不活化させることにより停止させうる
。次に組換え混合物中のＤＮＡを動物細胞の変換に使用
するかまたは適切な制限酵素で消化することにより分析
する。以下で記載されるＤＮＡ試料は電気泳動の前（：
１容量のクロロホルム／イソアミルアルゴール（２４／
１）混合物を用いて抽出された。
ｒｙ ｏｆ Ｍａｃｒ−ｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ｗｉ
ｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） １９６１に記載される
ように恐らくは容量効果が排除されることＣ二より組換
えを促進させるために１．７チのポリビニルアルコール
（ＰＶＡ）を紙含有する。反応は試料を７０Ｃで５分間
加熱してＣｒｅを不活化させることにより停止させうる
。次に組換え混合物中のＤＮＡを動物細胞の変換に使用
するかまたは適切な制限酵素で消化することにより分析
する。以下で記載されるＤＮＡ試料は電気泳動の前（：
１容量のクロロホルム／イソアミルアルゴール（２４／
１）混合物を用いて抽出された。
、外来遺伝子、遺伝子セグメントまたは合成りＮＡフラ
グメントが操作して挿入されうる任意の動物ウィルスベ
クターがｌｏｘ部位の受容体として役立てられうる。か
かるウィルスベクターには、それら署；限定されるわけ
ではないが、５ｖ４０、ジュードラビーズウィルス（Ｐ
ＲＹ） 、 、Ｎリオーマクイルス、アデノフィルス、
アデノ関連フィルス、ヘルにスウイルス、ワクシニアク
イルス、クシハヒローマクイルス、エプスタイン−バー
ルフィルス、バキュロウィルスまたはレトロウィルスが
包含される。上記したウィルスベクターのいくつかの特
徴はｗｅｙｍｏｕｔｈ氏他、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅ
１ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｇａ、ｗ、Ｇ、Ｔｈ１ｌ
ｌｙ。
グメントが操作して挿入されうる任意の動物ウィルスベ
クターがｌｏｘ部位の受容体として役立てられうる。か
かるウィルスベクターには、それら署；限定されるわけ
ではないが、５ｖ４０、ジュードラビーズウィルス（Ｐ
ＲＹ） 、 、Ｎリオーマクイルス、アデノフィルス、
アデノ関連フィルス、ヘルにスウイルス、ワクシニアク
イルス、クシハヒローマクイルス、エプスタイン−バー
ルフィルス、バキュロウィルスまたはレトロウィルスが
包含される。上記したウィルスベクターのいくつかの特
徴はｗｅｙｍｏｕｔｈ氏他、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅ
１ｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｇａ、ｗ、Ｇ、Ｔｈ１ｌ
ｌｙ。
３９〜５５頁（１９８＜Ｓ） 、 Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒ
ｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ＋ ８０Ｍｏｎｔｖａｌｅ
Ａｖｅ、、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ ０２１８０；
Ｂ、Ｍｏ５ｓ氏のＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅ
ｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅＥｎｖｉｒｏ
ｎｍｅｎｔ、Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ２２：
２９１〜３００（１９８５）、Ｃｏ１ｄ ８ｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｏｘｌｏ
ｏ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ １１
７２４； Ｐ、Ｍ。
ｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ＋ ８０Ｍｏｎｔｖａｌｅ
Ａｖｅ、、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、ＭＡ ０２１８０；
Ｂ、Ｍｏ５ｓ氏のＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅ
ｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅＥｎｖｉｒｏ
ｎｍｅｎｔ、Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ２２：
２９１〜３００（１９８５）、Ｃｏ１ｄ ８ｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｏｘｌｏ
ｏ、Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、ＮＹ １１
７２４； Ｐ、Ｍ。
Ｈｏｗｌｅｙ氏のＧｏｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅｒ
ｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔ、Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ２２：３０
１〜３１２（１９８５）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｏｘｌｏｏ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ １１
７２４； Ｌｏｇａｎ氏他のＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ
Ａｌｔｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅＥｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ
２２： ５１＋ 〜３１８（１９８５）ｅ Ｃｏ１
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｂｏｘｌｏｏ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ、ＮＹ １１７２４； Ｓｕｍｍｅｒｓ氏他のＧ
ｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ ａｎｄ ｔｈｅＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｂａｎｂ
ｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ２２： ！１１９〜３２８（
１９８５）＋ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓ Ｂｏｘｌｏｏ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ １１７２４；
およびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ氏他のＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒ１ｎ−ｃｉｐｌｃｓおよび
Ｍｅｔｈｏｄｓ ７： ２３５〜２６１（１９８５）−
Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、 ２３３ Ｓｐｒｉｎｇ
５ｔｒｅｅｔ、 Ｎｅｗ ＹｏｒｋｅＮＹ １００１
３；に記載されている０Ｖａｃｃｉ、ｎｅｓ ８６゜２
８５〜３１０ （１９８６）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、 Ｂｏ
ｘ １００． Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
ＮＹｌ １７２４に記載されるいくつかの報告も参照
されたい。
ｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔ、Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ２２：３０
１〜３１２（１９８５）、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂｏｘｌｏｏ、
Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ １１
７２４； Ｌｏｇａｎ氏他のＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ
Ａｌｔｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅＥｎ
ｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｂａｎｂｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ
２２： ５１＋ 〜３１８（１９８５）ｅ Ｃｏ１
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、Ｂｏｘｌｏｏ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ、ＮＹ １１７２４； Ｓｕｍｍｅｒｓ氏他のＧ
ｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ａｌｔｅｒｅｄ Ｖｉｒｕｓｅ
ｓ ａｎｄ ｔｈｅＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｂａｎｂ
ｕｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ２２： ！１１９〜３２８（
１９８５）＋ Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓ Ｂｏｘｌｏｏ、 Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ １１７２４；
およびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ氏他のＧｅｎｅｔｉｃ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐｒ１ｎ−ｃｉｐｌｃｓおよび
Ｍｅｔｈｏｄｓ ７： ２３５〜２６１（１９８５）−
Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、 ２３３ Ｓｐｒｉｎｇ
５ｔｒｅｅｔ、 Ｎｅｗ ＹｏｒｋｅＮＹ １００１
３；に記載されている０Ｖａｃｃｉ、ｎｅｓ ８６゜２
８５〜３１０ （１９８６）、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、 Ｂｏ
ｘ １００． Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
ＮＹｌ １７２４に記載されるいくつかの報告も参照
されたい。
外来のＤＮＡのフラグメントをＣｒｅ−１ｏｘ系を用い
て動物ウィルスベクター中に速やかで、好都合で効率的
ζ＝伝達させることを包め１本発明の利点を達成するた
めには、ベクターウィルスはそのＤＮＡ中にＩＯＸ部位
を有しておりしかも複製可能でなければならない。幾つ
かのライｌレスでは、ｌｏｘ部位は例えば慣用の相同組
換えにより。
て動物ウィルスベクター中に速やかで、好都合で効率的
ζ＝伝達させることを包め１本発明の利点を達成するた
めには、ベクターウィルスはそのＤＮＡ中にＩＯＸ部位
を有しておりしかも複製可能でなければならない。幾つ
かのライｌレスでは、ｌｏｘ部位は例えば慣用の相同組
換えにより。
ウィルスのゲノムな包含するＤＮＡ中（＝直接式れられ
うる。任意のウィルスにとって、ウィルスベクターのＤ
ＮＡ中に１０ｘ部位を入れるための第１段階はプラスミ
ド中にクローニングされたウィルスＤＮＡのフラグメン
ト中にｌｏｘ部位を入れることでありうる。次にウィル
スＤＮＡのｌｏｘ部位含有フラグメントをウィルスのゲ
ノムな包含するＤＮＡ中に再び組み込まねばならない。
うる。任意のウィルスにとって、ウィルスベクターのＤ
ＮＡ中に１０ｘ部位を入れるための第１段階はプラスミ
ド中にクローニングされたウィルスＤＮＡのフラグメン
ト中にｌｏｘ部位を入れることでありうる。次にウィル
スＤＮＡのｌｏｘ部位含有フラグメントをウィルスのゲ
ノムな包含するＤＮＡ中に再び組み込まねばならない。
このことは細胞をｌｏｘ部位を含有するプラスミドＤＮ
Ａでトランスフェクションさせそして次に完全無傷のウ
ィルスで感染させるかあるいはウィルスＤＮＡでトラン
スフェクションさせることによりルーチン的かつ慣用的
に達成されうる。組換え体を容易に検出できるウィルス
を使用するのが最良である。組換え体を検出する手段は
前記したすべてのウィルスベクターに関して知られてい
る。前記引用文献を参照されたい。
Ａでトランスフェクションさせそして次に完全無傷のウ
ィルスで感染させるかあるいはウィルスＤＮＡでトラン
スフェクションさせることによりルーチン的かつ慣用的
に達成されうる。組換え体を容易に検出できるウィルス
を使用するのが最良である。組換え体を検出する手段は
前記したすべてのウィルスベクターに関して知られてい
る。前記引用文献を参照されたい。
レトロウィルスに関しては、ＤＮＡセグメントの挿入は
勿論ウィルスＲＮＡのｃＤＮＡ形で行われねばならない
。本発明セ従いＤＮＡ組換え後、完全に慣用の操作を用
いてレトロウィルスを再び組み換える。本発明のすべて
のウィルスについて再組立ては完全に慣用の操作に従い
行われる。
勿論ウィルスＲＮＡのｃＤＮＡ形で行われねばならない
。本発明セ従いＤＮＡ組換え後、完全に慣用の操作を用
いてレトロウィルスを再び組み換える。本発明のすべて
のウィルスについて再組立ては完全に慣用の操作に従い
行われる。
Ｍａｎｉａｔｉｓ氏の前記引用文献を参照されたい。
多くの動物ウィルスベクターに関し、外来Ｉ）ＮＡが挿
入された部位はそのベクターの複製能を排除することな
く確認されてきた。前記文献を参照されたい。
入された部位はそのベクターの複製能を排除することな
く確認されてきた。前記文献を参照されたい。
例えば、真核生物細胞に生きたウィルスを感染させるこ
とによる外来遺伝子の導入は所望のタンパク質を生成さ
せる知られた方法である。
とによる外来遺伝子の導入は所望のタンパク質を生成さ
せる知られた方法である。
遺伝子操作によりハイブリッドのワクシニアウィルスを
構成させて生ワクチンを生成させることはＳｍ１ｔｈ氏
他のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ａＡ＊８０： ７１５５〜７１５９． （１９８！ｌ）
に記載されている。彼らはインフルエンザウィルス赤血
球凝集素遺伝子をワクシニアウィルスすなわち、大きな
りＮＡゲノムを有しておりそして非緊縮性包装系を有す
るので感染性を損うことなく外来ＤＮＡを挿入できるウ
ィルスであるワクシニアウィルスに挿入し発現させた。
構成させて生ワクチンを生成させることはＳｍ１ｔｈ氏
他のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ
ａＡ＊８０： ７１５５〜７１５９． （１９８！ｌ）
に記載されている。彼らはインフルエンザウィルス赤血
球凝集素遺伝子をワクシニアウィルスすなわち、大きな
りＮＡゲノムを有しておりそして非緊縮性包装系を有す
るので感染性を損うことなく外来ＤＮＡを挿入できるウ
ィルスであるワクシニアウィルスに挿入し発現させた。
外来遺伝子はウィルス複製にとって必須なわけではない
のでチミジンキナーゼ遺伝子中に挿入され、そして同時
に組換えウィルスの選択法を提供した。遺伝子操作され
たワクシニアウィルスに感染した細胞はグリコジル化さ
れた赤血球凝集素を産生じ、そしてそのウィルスはイン
フルエンザウィルスでの感染に対してハムスターを効果
的に免疫した。後続の研究には幾つかの付加的な外来遺
伝子のワクシニア’７（シス中への挿入および発現が記
載されている。そのウィルスはヒトに感染力がありそし
て多数の動物種および鳥種の細胞中で生長しつる。
のでチミジンキナーゼ遺伝子中に挿入され、そして同時
に組換えウィルスの選択法を提供した。遺伝子操作され
たワクシニアウィルスに感染した細胞はグリコジル化さ
れた赤血球凝集素を産生じ、そしてそのウィルスはイン
フルエンザウィルスでの感染に対してハムスターを効果
的に免疫した。後続の研究には幾つかの付加的な外来遺
伝子のワクシニア’７（シス中への挿入および発現が記
載されている。そのウィルスはヒトに感染力がありそし
て多数の動物種および鳥種の細胞中で生長しつる。
Ｒｏ ｉ ｚｍａｎ氏他の５ｃｉｅｎｃｅ ２２９：１
２０８〜１２１４（１９８５）には、ワクチンを提供す
るかまたは感染性疾患に対する保護を付与する生成物を
生ずる遺伝子のベク″ターを提供する目的で、他の大き
なりＮＡクイルスである単純へルはスクィルス１ ｇ（
ａｓｖ−１）を操作する方法が記載されている。５ｈｉ
ｈ氏他のＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ、 ８１：５８６７〜５８７０、 （１９
８４）にも操作されたＨ８Ｖ−１が記載されている。そ
れにより感染された細胞がＢ型肝炎りイルス表面抗原を
１２時間にわたり生成し排泄した。Ｂ型肝炎フィルス表
面抗原をコーディングするＤＮＡ配列はウィルスの極初
期プロモーターの制御の下にあるように操作された。挿
入された表面抗原遺伝子は単純ヘル堅スウイルス極初期
遺伝子として調節された。
２０８〜１２１４（１９８５）には、ワクチンを提供す
るかまたは感染性疾患に対する保護を付与する生成物を
生ずる遺伝子のベク″ターを提供する目的で、他の大き
なりＮＡクイルスである単純へルはスクィルス１ ｇ（
ａｓｖ−１）を操作する方法が記載されている。５ｈｉ
ｈ氏他のＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ
ｉ、 ＵＳＡ、 ８１：５８６７〜５８７０、 （１９
８４）にも操作されたＨ８Ｖ−１が記載されている。そ
れにより感染された細胞がＢ型肝炎りイルス表面抗原を
１２時間にわたり生成し排泄した。Ｂ型肝炎フィルス表
面抗原をコーディングするＤＮＡ配列はウィルスの極初
期プロモーターの制御の下にあるように操作された。挿
入された表面抗原遺伝子は単純ヘル堅スウイルス極初期
遺伝子として調節された。
Ｈｏｌｌａｎｄ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、、 ４６ ：
６４９〜６５２゜（１９８３）ｔ：ハ単Ｍヘルイスウ
ィルス１型の糖タンパク質Ｃ突然変異体が組織培養細胞
中で増殖しうることが記載されている。組換えベクター
の選択法、すなわち糖タンパク質Ｃ遺伝子中に多種類の
突然変異を担持する感染性ウィルスを選択するのに糖タ
ンパク質Ｃに対するモノクローナル抗体を使用する方法
も開示されている。
６４９〜６５２゜（１９８３）ｔ：ハ単Ｍヘルイスウ
ィルス１型の糖タンパク質Ｃ突然変異体が組織培養細胞
中で増殖しうることが記載されている。組換えベクター
の選択法、すなわち糖タンパク質Ｃ遺伝子中に多種類の
突然変異を担持する感染性ウィルスを選択するのに糖タ
ンパク質Ｃに対するモノクローナル抗体を使用する方法
も開示されている。
本発明において使用される代表的な動物細胞およびそれ
らのウィルスには、それらに限定されるわけではないが
、晴乳動物例えばマウス、ラット、霊長類、豚、ヒトそ
の他の細胞、ならびに非曙乳動物細胞例えば昆虫の細胞
が包含される。
らのウィルスには、それらに限定されるわけではないが
、晴乳動物例えばマウス、ラット、霊長類、豚、ヒトそ
の他の細胞、ならびに非曙乳動物細胞例えば昆虫の細胞
が包含される。
実質的にすべての外来、外因性、異種あるいは合成のＤ
ＮＡフラグメントが１選択された動物ウイルスベクター
中に本発明に従い特異的な位置であるそのｌＯｘ部位で
挿入されうる。かがるＤＮＡには構造タンパク質、酵素
、調節分子等をコードするＩ）ＨＡ 、ならびにそれら
の任意の断片が包含されよう。かかるＤＮＡをｌｏｘ含
有ウィルスベクター中に挿入するための唯一の要件は、
挿入されるべきＤＮＡがｌＯｘ部位に隣接した環状形で
あるべきことである。ＤＮＡ組換えによく知られた任意
の方法が環状核酸の調製に用いられうる。本発明の好ま
しい観点においては、挿入されたＤＮＡセグメントが抗
原をコードしていることで、それにより本発明の相当す
る操作されたウィルスが生ワクチンとして有用であろう
。
ＮＡフラグメントが１選択された動物ウイルスベクター
中に本発明に従い特異的な位置であるそのｌＯｘ部位で
挿入されうる。かがるＤＮＡには構造タンパク質、酵素
、調節分子等をコードするＩ）ＨＡ 、ならびにそれら
の任意の断片が包含されよう。かかるＤＮＡをｌｏｘ含
有ウィルスベクター中に挿入するための唯一の要件は、
挿入されるべきＤＮＡがｌＯｘ部位に隣接した環状形で
あるべきことである。ＤＮＡ組換えによく知られた任意
の方法が環状核酸の調製に用いられうる。本発明の好ま
しい観点においては、挿入されたＤＮＡセグメントが抗
原をコードしていることで、それにより本発明の相当す
る操作されたウィルスが生ワクチンとして有用であろう
。
ｌｏｘ部位を含有するｐＢｓ６４のようなプラスミド中
（二異種ＤＮＡのフラグメントをクローニングさせるこ
とにより、異種ＤＮＡのフラグメントおよびｌｏｘ部位
を含有する環状分子を生成させることが好都合である。
（二異種ＤＮＡのフラグメントをクローニングさせるこ
とにより、異種ＤＮＡのフラグメントおよびｌｏｘ部位
を含有する環状分子を生成させることが好都合である。
あるいはまた、異種ＤＮＡのフラグメントが環状プラス
ミド上にすでに存在する場合は、 ｌｏｘを該プラス
ミド中にクローニングすることができる。第３の方法は
例えばｐＢＳ４４ （ＡＴＣｏ ５３２５４）に見られ
るように、ＤＮＡ分子上の２つの同じ方向に反復するｌ
Ｏｘ部位の間に異種ＤＮＡのフラグメントを挿入するこ
とである。このＤＮＡをインビトロでＣｒｅタン／セク
質で処理するとｌＯｘ部位間で部位特異的な組換えが生
じて、異種ＤＮＡのフラグメントおよびｌＯｘ部位を含
有する環状ＤＮＡ分子が生成されよう。
ミド上にすでに存在する場合は、 ｌｏｘを該プラス
ミド中にクローニングすることができる。第３の方法は
例えばｐＢＳ４４ （ＡＴＣｏ ５３２５４）に見られ
るように、ＤＮＡ分子上の２つの同じ方向に反復するｌ
Ｏｘ部位の間に異種ＤＮＡのフラグメントを挿入するこ
とである。このＤＮＡをインビトロでＣｒｅタン／セク
質で処理するとｌＯｘ部位間で部位特異的な組換えが生
じて、異種ＤＮＡのフラグメントおよびｌＯｘ部位を含
有する環状ＤＮＡ分子が生成されよう。
同様に、ルーチンのよく知られた方法もｌＯｘ部位を選
択された動物ウィルスベクター中に挿入するのに用いら
れうる。異種ＤＮＡのフラグメントをＤＮＡおよびレト
ロヮイルス性ウィルスベクター中に好都合かつ効率的に
挿入するには。
択された動物ウィルスベクター中に挿入するのに用いら
れうる。異種ＤＮＡのフラグメントをＤＮＡおよびレト
ロヮイルス性ウィルスベクター中に好都合かつ効率的に
挿入するには。
該ベクターは最初にｌｏｘ部位を含有していなければな
らない。ｌＯｘ部位は、ｐＲＨ４３（８ｔｅｒｎｂｅｒ
ｇ氏他によりＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｒ
ｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ、ＵＣＬＡ ＳｙｍｐＯｓｉａ ｏｎ Ｍｏ１
ｅ−ｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ １０ ： ６７１〜６８４（１９８５）に
記載）あるいはここに論議されるその他のような１０！
部位を含有するプラスミドから適当な制限酵素を用いる
ことにより開裂させることによるか、あるいは合成によ
り得られうる。
らない。ｌＯｘ部位は、ｐＲＨ４３（８ｔｅｒｎｂｅｒ
ｇ氏他によりＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｒ
ｅｐｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ、ＵＣＬＡ ＳｙｍｐＯｓｉａ ｏｎ Ｍｏ１
ｅ−ｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ １０ ： ６７１〜６８４（１９８５）に
記載）あるいはここに論議されるその他のような１０！
部位を含有するプラスミドから適当な制限酵素を用いる
ことにより開裂させることによるか、あるいは合成によ
り得られうる。
ｌＯｘ部位を取得するこの２つの方法は共に当業上よく
知られている。
知られている。
ｌＯｘ部位を包含するＤＮＡフラグメントが該１ｏｘ含
有ＤＮＡが翻訳コードの読み枠中（二あり。
有ＤＮＡが翻訳コードの読み枠中（二あり。
そして挿入に際してアンバーコドン、オーカーコドンあ
るいは他の停止コドンを生成しないような様式で受容Ｄ
ＮＡ中に挿入されることが好ましい。以下に論議される
好ましい場合においては、 ｌＯｘ部位を包含するＤ
ＮＡのフラグメントは５′末端で２個のヌクレオチドに
よりそして３′末端で６個のヌクレオチドによりはさま
れた１０！部位（第１図参照）から成っていて、従って
そのフラグメントの配列が受容ウィルスＤＮＡと共に枠
内にあり、そして挿入に際してナンセンスコドンな生成
させるのを回避するように合成された。前記要件に合致
する方法は当業上よく知られている。ｌＯｘ部位の方向
性を示す第１図の大きな矢印で囲まれたｌＯｘ部位は１
個の位置が野生型１ｏｘＰとは相異する。すなわちｌｏ
ｘ配列の第２のｉ基がＴからＣに変えられていることで
ある。それゆえこのものは１ｏｘＣ２と呼はれる。
るいは他の停止コドンを生成しないような様式で受容Ｄ
ＮＡ中に挿入されることが好ましい。以下に論議される
好ましい場合においては、 ｌＯｘ部位を包含するＤ
ＮＡのフラグメントは５′末端で２個のヌクレオチドに
よりそして３′末端で６個のヌクレオチドによりはさま
れた１０！部位（第１図参照）から成っていて、従って
そのフラグメントの配列が受容ウィルスＤＮＡと共に枠
内にあり、そして挿入に際してナンセンスコドンな生成
させるのを回避するように合成された。前記要件に合致
する方法は当業上よく知られている。ｌＯｘ部位の方向
性を示す第１図の大きな矢印で囲まれたｌＯｘ部位は１
個の位置が野生型１ｏｘＰとは相異する。すなわちｌｏ
ｘ配列の第２のｉ基がＴからＣに変えられていることで
ある。それゆえこのものは１ｏｘＣ２と呼はれる。
この変化により有効なＴＡＡオーカー終止シグナルがグ
ルタミンコドンに変えられる。さらに。
ルタミンコドンに変えられる。さらに。
この４２一体はＫｐｎ １部位にアニール化される（し
かしＫｐｎ １部位を修復しない）６′末端、およびｌ
Ｏｘ部位の５′末端でＫｐｎ １部位を再生せしめる５
’ Ｃ残基な含有するよう・に設定された。
かしＫｐｎ １部位を修復しない）６′末端、およびｌ
Ｏｘ部位の５′末端でＫｐｎ １部位を再生せしめる５
’ Ｃ残基な含有するよう・に設定された。
ＤＮＡフラグメントは適当な制限酵素、ＤＮＡ合成酵素
および連結酵素を用いることにより受容体ｆ）ＮＡ中に
挿入される。ｌａｘ部位を包含するＤＮＡフラグメント
は取扱いおよび増巾が容易なように通常プラスミド中に
含有される受容体ウィルスＤＮＡ中に挿入されよう。ウ
ィルスベクターＤＮＡを含有するプラスミドおよび組換
えウィルスを回収する手段はここに記載されるすべての
ウィルスおよび他の多くのウィルスについて知られてい
る。
および連結酵素を用いることにより受容体ｆ）ＮＡ中に
挿入される。ｌａｘ部位を包含するＤＮＡフラグメント
は取扱いおよび増巾が容易なように通常プラスミド中に
含有される受容体ウィルスＤＮＡ中に挿入されよう。ウ
ィルスベクターＤＮＡを含有するプラスミドおよび組換
えウィルスを回収する手段はここに記載されるすべての
ウィルスおよび他の多くのウィルスについて知られてい
る。
本発明による方法を用いると、ＤＮＡを動物ウィルスベ
クター中に組換えるのに現在慣用の制限酵素法に比較し
てかなり改良された方法が提供される。例えば、完結に
５〜６日を要する代表的な制限法に対し、本発明方法は
３〜４日しか要しないであろう。相同組換えを用いる代
表的な効率＜１％（例えば０．１〜１％）を有する組換
えに対し１本発明は同じ組換えを例えば５゜チまで１代
表的（二は５チから５０％までのかなり高い効率で行う
ことができる。
クター中に組換えるのに現在慣用の制限酵素法に比較し
てかなり改良された方法が提供される。例えば、完結に
５〜６日を要する代表的な制限法に対し、本発明方法は
３〜４日しか要しないであろう。相同組換えを用いる代
表的な効率＜１％（例えば０．１〜１％）を有する組換
えに対し１本発明は同じ組換えを例えば５゜チまで１代
表的（二は５チから５０％までのかなり高い効率で行う
ことができる。
本発明に用いるのに好ましいベクターはジュードラビー
ズウィルス（以下ＰＲＶと略記する）から導かれる。Ｐ
ＲＶはＢｅｎ−Ｐｏｒａｔ氏他のＭｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ
Ｂｌｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ
Ｖｉｒｕｓ、 Ｒｏｉ−ｚｍａｎ、 （Ｅｄ、）ｅ Ｔ
ｈｅ Ｈｅｒｐｅａｖｉｒｕｓｅｓ、 ＰｌｅｎｕｍＰ
ｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＊ １０５〜１７３頁（
１９８ｓ） ；およびＲｏ ｉ ｚｍａｎ氏他のＩｎｔ
ｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ １６： ２０ｉ〜２１７（１９
８１）に論議されるように豚とって重要な病原体でもあ
るアルファヘルにスウィルスである。
ズウィルス（以下ＰＲＶと略記する）から導かれる。Ｐ
ＲＶはＢｅｎ−Ｐｏｒａｔ氏他のＭｏ１ｅ−ｃｕｌａｒ
Ｂｌｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ
Ｖｉｒｕｓ、 Ｒｏｉ−ｚｍａｎ、 （Ｅｄ、）ｅ Ｔ
ｈｅ Ｈｅｒｐｅａｖｉｒｕｓｅｓ、 ＰｌｅｎｕｍＰ
ｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ＊ １０５〜１７３頁（
１９８ｓ） ；およびＲｏ ｉ ｚｍａｎ氏他のＩｎｔ
ｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ １６： ２０ｉ〜２１７（１９
８１）に論議されるように豚とって重要な病原体でもあ
るアルファヘルにスウィルスである。
ジュードラビーズクイルスゲツムはＢｅｎ−ｐｏｒａｔ
氏他のＶｉｒｏｌｏｇｙ ４１： ２６５〜２７５（１
９７０）およびＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ＋Ｒｏｉ
ｚｍａｎ、 （Ｅｄ、）、 Ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅａｖｉ
ｒｕｓ、 ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ、 １０５〜１７５頁（１９８５）に記載されている
。これは長さ１５０ｋｂで、２個の独特の配列領域ＵＬ
およびＵ８ 、および９ｋｌ）のＵ８配列を囲む２個の
１５ｋｂの逆方向反復配列を含有する線状の二本鎖１）
ＮＡ分子である。
氏他のＶｉｒｏｌｏｇｙ ４１： ２６５〜２７５（１
９７０）およびＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ＋Ｒｏｉ
ｚｍａｎ、 （Ｅｄ、）、 Ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅａｖｉ
ｒｕｓ、 ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ、 １０５〜１７５頁（１９８５）に記載されている
。これは長さ１５０ｋｂで、２個の独特の配列領域ＵＬ
およびＵ８ 、および９ｋｌ）のＵ８配列を囲む２個の
１５ｋｂの逆方向反復配列を含有する線状の二本鎖１）
ＮＡ分子である。
ＰＲＹは下記のことを含めた幾つかの理由で好ましい、
すなわち、そのウィルスＤＮＡが感染性であること、培
養された細胞の多くの種類に感染すること、ヒトの病原
体であるとは知られていないこと、容易かつ速やかにプ
ラークを形成すること（２０〜２４時間）、組織培養物
中で速やかに生長して高力価となること、高頻度の組換
えを促進する遺伝子構成および分析を有すること、およ
び単純へルペスワイルスにより示される４個に比較して
２個しかＤＮＡ構造異性体を有しないことである（ Ｐ
ＲＶのこれら特徴の概略はＰｏｒａｔ氏他のＭｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｓｅｕ−ｄｏｒａ
ｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ、 Ｒｏｉｚｍａｎ、 （Ｅｄ、
）、 Ｔｈｅ Ｈｅｒ−ｐｅｓｖｉｒｕｓｅａ、Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１０５〜１７
３頁（１９８５）を参照されたい）。
すなわち、そのウィルスＤＮＡが感染性であること、培
養された細胞の多くの種類に感染すること、ヒトの病原
体であるとは知られていないこと、容易かつ速やかにプ
ラークを形成すること（２０〜２４時間）、組織培養物
中で速やかに生長して高力価となること、高頻度の組換
えを促進する遺伝子構成および分析を有すること、およ
び単純へルペスワイルスにより示される４個に比較して
２個しかＤＮＡ構造異性体を有しないことである（ Ｐ
ＲＶのこれら特徴の概略はＰｏｒａｔ氏他のＭｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｓｅｕ−ｄｏｒａ
ｂｉｅｓ Ｖｉｒｕｓ、 Ｒｏｉｚｍａｎ、 （Ｅｄ、
）、 Ｔｈｅ Ｈｅｒ−ｐｅｓｖｉｒｕｓｅａ、Ｐｌｅ
ｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１０５〜１７
３頁（１９８５）を参照されたい）。
さらに、感染された細胞中におけるＰＲＶ糖タン・署り
質ｇｌＴｌ遺伝子の発現を判定するのに特異的な抗体を
使用する簡単な検出系が利用できる（Ｒｏｂｂｉｎｓ氏
他、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ５９： ６５５〜６４５（１
９８６））。
質ｇｌＴｌ遺伝子の発現を判定するのに特異的な抗体を
使用する簡単な検出系が利用できる（Ｒｏｂｂｉｎｓ氏
他、 Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、 ５９： ６５５〜６４５（１
９８６））。
ｇｍ遺伝子は、たとえそれがＲｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ。
Ｖｉｒｏｌ、 ５８： ５５９−５４７ （１９８６）
およびＪ、 Ｖｉｒｏｌ。
およびＪ、 Ｖｉｒｏｌ。
５９： ６３５〜６４５ （１９８６）に指摘されるよ
うに感染された細胞の表面上（二見出される主要なりィ
ルスエンベロープ糖タンパク質をコードしているとして
も培養された細胞中（＝おけるＰＲＶの生長にとっては
必須物でない。エンベロープ糖タンパク質はウィルスの
生存能にとって必須要件でないので、ｇｌ［［遺伝子の
エンベロープ糖タンパク質の合成を妨げるかあるいは生
成されたエンベロープ糖タンパク質が特定の抗体と反応
する能力を破壊するような変更が、七のウィルスのプラ
ーク形成能を破壊することなく ｇｉｌｌ遺伝子に対し
て行われうる。ｇｌ［ｌ遺伝子のこれらの性質はＲｏｂ
ｂｉｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５９： ６５５〜
６４５（１９８６）に記載されるようにｇｍ遺伝子を含
有する適当にあつらえられたＤＮＡフラグメントとウィ
ルスＤＮＡとを唾乳動物細胞中に同時形質転換させたの
ち、これら２つのＤＮＡ分子間での相同組換えによりＰ
ＲＶゲノム中に外来ＤＮＡを挿入するための有用な方法
の基礎となっている。組換えプラークの検出は１ｇ１ｌ
ｌ抗原の存在について多くのそれぞれのプラークを非破
壊的にスクリーニングしうるので大変容易である。しか
しながら、従来法システムは比較的非効率的で、不都合
でそして遅い。
うに感染された細胞の表面上（二見出される主要なりィ
ルスエンベロープ糖タンパク質をコードしているとして
も培養された細胞中（＝おけるＰＲＶの生長にとっては
必須物でない。エンベロープ糖タンパク質はウィルスの
生存能にとって必須要件でないので、ｇｌ［［遺伝子の
エンベロープ糖タンパク質の合成を妨げるかあるいは生
成されたエンベロープ糖タンパク質が特定の抗体と反応
する能力を破壊するような変更が、七のウィルスのプラ
ーク形成能を破壊することなく ｇｉｌｌ遺伝子に対し
て行われうる。ｇｌ［ｌ遺伝子のこれらの性質はＲｏｂ
ｂｉｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５９： ６５５〜
６４５（１９８６）に記載されるようにｇｍ遺伝子を含
有する適当にあつらえられたＤＮＡフラグメントとウィ
ルスＤＮＡとを唾乳動物細胞中に同時形質転換させたの
ち、これら２つのＤＮＡ分子間での相同組換えによりＰ
ＲＶゲノム中に外来ＤＮＡを挿入するための有用な方法
の基礎となっている。組換えプラークの検出は１ｇ１ｌ
ｌ抗原の存在について多くのそれぞれのプラークを非破
壊的にスクリーニングしうるので大変容易である。しか
しながら、従来法システムは比較的非効率的で、不都合
でそして遅い。
本発明（二より、外来ＤＮＡを本発明の好ましいＰＲＶ
ベクターに挿入する方法が従来法に比較して特に劇的
に改良される。ＰＲＶ系の独特な性質および本発′明の
それとの組み合せにより高度に有利な組換えベクター系
が生成される。本発明の組換え工程の異例の容易さおよ
び効率に加え、ｐＢｖの使用により所望の組換え体を検
出するための簡単な方法が提供される。３つのファクタ
ーがこの簡単な選択系の原因である。第１番目は、ＰＲ
Ｖｇ［ｌ遺伝子中へのＤＮＡの挿入が黒色プラークアッ
セイにより容易に検出されうろことである。第２は、Ｐ
ＲＶ ＤＮＡが感染性であり、それゆえ個々の組換え事
象が迅速に評価されうろことである。その上、 Ｃｒｅ
により仲介された組換えが起こるｌａｘ部位は充分に小
さくそして組換え部位の実際のヌクレオチド配列に対す
る制約が充分に厳格でないので、ｌｏｘ部位は、その部
位が前記したようにタンパク質の構造を大きく変えるこ
となくそのタンパク質のコーディング領域中に枠内翻訳
融合されうるように設定されつる。勿論、本発明の方法
は、 ｌｏｘ部位を含有する任意の非必須動物ウィルス
核酸セグメント中に任意のＩＯ！含有環状ＤＮＡ分子を
効率的に挿入するのに一般的に適用できる。
ベクターに挿入する方法が従来法に比較して特に劇的
に改良される。ＰＲＶ系の独特な性質および本発′明の
それとの組み合せにより高度に有利な組換えベクター系
が生成される。本発明の組換え工程の異例の容易さおよ
び効率に加え、ｐＢｖの使用により所望の組換え体を検
出するための簡単な方法が提供される。３つのファクタ
ーがこの簡単な選択系の原因である。第１番目は、ＰＲ
Ｖｇ［ｌ遺伝子中へのＤＮＡの挿入が黒色プラークアッ
セイにより容易に検出されうろことである。第２は、Ｐ
ＲＶ ＤＮＡが感染性であり、それゆえ個々の組換え事
象が迅速に評価されうろことである。その上、 Ｃｒｅ
により仲介された組換えが起こるｌａｘ部位は充分に小
さくそして組換え部位の実際のヌクレオチド配列に対す
る制約が充分に厳格でないので、ｌｏｘ部位は、その部
位が前記したようにタンパク質の構造を大きく変えるこ
となくそのタンパク質のコーディング領域中に枠内翻訳
融合されうるように設定されつる。勿論、本発明の方法
は、 ｌｏｘ部位を含有する任意の非必須動物ウィルス
核酸セグメント中に任意のＩＯ！含有環状ＤＮＡ分子を
効率的に挿入するのに一般的に適用できる。
本発明直二より調製されうる組換え動物細胞ウィルスベ
クターは代表的にはＣｒｅ接触工程後に任意の知られた
マーカー選択技術を用いて選択される。慣用のマーカー
はウィルスベクターおよび／′！たはＤＮＡセグメント
上に存在しうる。
クターは代表的にはＣｒｅ接触工程後に任意の知られた
マーカー選択技術を用いて選択される。慣用のマーカー
はウィルスベクターおよび／′！たはＤＮＡセグメント
上に存在しうる。
本発明の特Ｉ：好ましい態様（：おいては、マーカーは
例えば以下１ｎ ＰＲＶ系（：ついて論議されるように
ウィルスベクター上に置かれる。ベクターそれ自身が選
択マーカーを含有する場合の本発明の特に重要な利点は
、セグメントそれ自身がマーカーを含有するか否か（二
関わりなく任意のＤＮＡセグメントを含有する組換えベ
クターのｉ製ができることである。黒色プラークアッセ
イまたはモノクローナル抗体（：基づく他のアッセイが
好ましいが、任意の慣用のマーカー系および技法が本発
明で用いられうる。
例えば以下１ｎ ＰＲＶ系（：ついて論議されるように
ウィルスベクター上に置かれる。ベクターそれ自身が選
択マーカーを含有する場合の本発明の特に重要な利点は
、セグメントそれ自身がマーカーを含有するか否か（二
関わりなく任意のＤＮＡセグメントを含有する組換えベ
クターのｉ製ができることである。黒色プラークアッセ
イまたはモノクローナル抗体（：基づく他のアッセイが
好ましいが、任意の慣用のマーカー系および技法が本発
明で用いられうる。
本発明の好ましい方法Ｃ二おいては、ｌｏｘ部位を包含
する合成りＮＡフラグメントはｐＡｕ１５のＤＮＡ中（
二含有されるＰＲＹ （ＩＶＩ −１００４９）のｇｍ
遺伝子中にＫｐｎ １部位で挿入された（第１図参照）
。
する合成りＮＡフラグメントはｐＡｕ１５のＤＮＡ中（
二含有されるＰＲＹ （ＩＶＩ −１００４９）のｇｍ
遺伝子中にＫｐｎ １部位で挿入された（第１図参照）
。
これはＫｐｎ Ｉで開裂されたｐＡＬＭ３１ニー−本鎖
４，２体をアニール化および連結させ、そして生成する
５′−オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼのフレノウ
フラグメントで充填すること（二よりなされた。Ｋｐｎ
Ｉと同じ配列を認識するがしかし５′−オーバーハン
・グを残すＡｓｐ７１８もｐＡＬＭ３を開裂させるの（
＝用いられそして５′−オーバーハングも同様１；充填
された。両方のプラスミド消化物を次（二Ｐｓｔ Ｉで
消化しそして適当なフラグメントな精製および連結して
第１図の下に示される構成物となした。官能性１ｏｘ部
位がＫｐｎ １部位でｐＡＬＭ Ａ中４＝挿入されたか
判定しそしてその配向を証明する（二は、精製ｃｒｅタ
ンパク質および１ｏｘＰ含有テスタープラスミドｐＢ８
６４を用い、Ａｂｒｅｍｓｋｉ氏他のＪ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２５９： １５０９〜１５１４ （１９
８４） ｌニー記載されるよう：二してインビトロで組
換えアッセイを行った。それによりその部位が事実機能
していること、および第１図４二示される配向が正しい
ことが確認された。生成するプラスミドはｐＢ８１０９
と呼ばれる。
４，２体をアニール化および連結させ、そして生成する
５′−オーバーハングをＤＮＡポリメラーゼのフレノウ
フラグメントで充填すること（二よりなされた。Ｋｐｎ
Ｉと同じ配列を認識するがしかし５′−オーバーハン
・グを残すＡｓｐ７１８もｐＡＬＭ３を開裂させるの（
＝用いられそして５′−オーバーハングも同様１；充填
された。両方のプラスミド消化物を次（二Ｐｓｔ Ｉで
消化しそして適当なフラグメントな精製および連結して
第１図の下に示される構成物となした。官能性１ｏｘ部
位がＫｐｎ １部位でｐＡＬＭ Ａ中４＝挿入されたか
判定しそしてその配向を証明する（二は、精製ｃｒｅタ
ンパク質および１ｏｘＰ含有テスタープラスミドｐＢ８
６４を用い、Ａｂｒｅｍｓｋｉ氏他のＪ、 Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｍ、 ２５９： １５０９〜１５１４ （１９
８４） ｌニー記載されるよう：二してインビトロで組
換えアッセイを行った。それによりその部位が事実機能
していること、および第１図４二示される配向が正しい
ことが確認された。生成するプラスミドはｐＢ８１０９
と呼ばれる。
本発明のこの好ましい観点（二訃いては、プラスミドｐ
Ｂｓ １０９からＰＲｖへのｇ［ｌｌ−１ｏｘｃ２遺伝
子の伝達は先ζ二簡単（二述べたように野生型ｇ１１Ｉ
遺伝子の性質およびその種々の突然変異体（二より促進
された。ＰＲＹのペラカー（Ｂｅａｋｅｒ）株（ＰＲＶ
−Ｂｅ）は野生型８ｍ遺伝子を含有しており、このもの
はウィルスエンベロープの主要構成分として発現され、
そしてまた感染された細胞の表面上にも発現される。そ
の結果、ＰＲＶ−Ｂｅは黒色プラークアッセイ１二おい
てＭ１抗体と黒色プラークを形成する。突然変異体ウィ
ル、＊ ＰＲＶ２ （ＡＴＣＣＶＲ２１４３）はｇＩＩ
遺伝子のコーディング配列内１：、 ４０２ ｂｐ欠失
がある（ Ｋｐｎ １部位の５１側だがそれを包含しな
い）。Ｍ１モノクローナル抗体と反応させると、ＰＲＶ
２はＲｏｂｂｉｎｇ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５９：
６３５〜６４５ （１９８６）に記載されるように白色
プラークを形成する、何故ならこの抗体はＰＲＶ２によ
り形成される突然変異ｇｌ［Ｉタンパク質とはたとえそ
のタンパク質が合成されたとしても反応しないからであ
る。さらに、Ｋｐｍ １部位でＥｃｏＲＩリンカ−が非
終止的に挿入されたウィルスはＭ１モノクローナル抗体
と黒色プラークを形成する。・（米国特許出願煮８８６
．＜５９１号（１９８６年７月１８日出願）参照）。そ
の上、Ｋｐｎ Ｉ部位で非終止性挿入物としてｇｌｉ
−１ｏｘＣ２遺伝子を含有するＰ’ＲＶも黒色プラーク
を形成する。この後者知見は最も驚くべきことであり、
それＣ；よりＤＮＡセグメントが組換えられたＰＲ’Ｖ
−ｇｉｎ−１ｏｘｃ２ベクターな選択するのに黒色プラ
ークアッセイが使用できるよう１：なった。このアッセ
イは極度（：速やかかつ信頼でき、そして組換え操作（
二要する時間を大きく減少させる。
Ｂｓ １０９からＰＲｖへのｇ［ｌｌ−１ｏｘｃ２遺伝
子の伝達は先ζ二簡単（二述べたように野生型ｇ１１Ｉ
遺伝子の性質およびその種々の突然変異体（二より促進
された。ＰＲＹのペラカー（Ｂｅａｋｅｒ）株（ＰＲＶ
−Ｂｅ）は野生型８ｍ遺伝子を含有しており、このもの
はウィルスエンベロープの主要構成分として発現され、
そしてまた感染された細胞の表面上にも発現される。そ
の結果、ＰＲＶ−Ｂｅは黒色プラークアッセイ１二おい
てＭ１抗体と黒色プラークを形成する。突然変異体ウィ
ル、＊ ＰＲＶ２ （ＡＴＣＣＶＲ２１４３）はｇＩＩ
遺伝子のコーディング配列内１：、 ４０２ ｂｐ欠失
がある（ Ｋｐｎ １部位の５１側だがそれを包含しな
い）。Ｍ１モノクローナル抗体と反応させると、ＰＲＶ
２はＲｏｂｂｉｎｇ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５９：
６３５〜６４５ （１９８６）に記載されるように白色
プラークを形成する、何故ならこの抗体はＰＲＶ２によ
り形成される突然変異ｇｌ［Ｉタンパク質とはたとえそ
のタンパク質が合成されたとしても反応しないからであ
る。さらに、Ｋｐｍ １部位でＥｃｏＲＩリンカ−が非
終止的に挿入されたウィルスはＭ１モノクローナル抗体
と黒色プラークを形成する。・（米国特許出願煮８８６
．＜５９１号（１９８６年７月１８日出願）参照）。そ
の上、Ｋｐｎ Ｉ部位で非終止性挿入物としてｇｌｉ
−１ｏｘＣ２遺伝子を含有するＰ’ＲＶも黒色プラーク
を形成する。この後者知見は最も驚くべきことであり、
それＣ；よりＤＮＡセグメントが組換えられたＰＲ’Ｖ
−ｇｉｎ−１ｏｘｃ２ベクターな選択するのに黒色プラ
ークアッセイが使用できるよう１：なった。このアッセ
イは極度（：速やかかつ信頼でき、そして組換え操作（
二要する時間を大きく減少させる。
１ｏｘ部位の挿入後の黒色プラークの維持はＰＲＶ２
ＤＮＡおよびｐＢｓ１０９のＮｃｏ Ｉ消化物をＰＫ１
５細胞中に同時トランスフェクションさせて、プレート
ストックを調製しそして次に黒色プラークアッセイを行
うことにより判定された。１ｏｘＣ２の挿入がＭ１エピ
トープの崩壊を生ずる筈でない場合は、ＰＲＶ２との相
同組換えにより生ずるＰＲＶ ｇｌ−１ｏｘＣ２組換え
体は黒色プラーク表現型を生ずることが予想されよう。
ＤＮＡおよびｐＢｓ１０９のＮｃｏ Ｉ消化物をＰＫ１
５細胞中に同時トランスフェクションさせて、プレート
ストックを調製しそして次に黒色プラークアッセイを行
うことにより判定された。１ｏｘＣ２の挿入がＭ１エピ
トープの崩壊を生ずる筈でない場合は、ＰＲＶ２との相
同組換えにより生ずるＰＲＶ ｇｌ−１ｏｘＣ２組換え
体は黒色プラーク表現型を生ずることが予想されよう。
これがまさ（二得られた結果である。スクリーニングさ
れた約１０００個のプラークのうち５個が黒色であった
。
れた約１０００個のプラークのうち５個が黒色であった
。
ｐＢ８１０９ ＤＮＡが除かれた対照実験においては、
１０００個のプラークをスクリーニングしても何ら黒色
プラークは得られなかった。かくして得られた黒色プラ
ークの３個からのウィルスをプラーク精製した。ウィル
スＤＮＡを調製しセしてｌＯｘ部位の存在なＣｒｅによ
り仲介された組換えによりインビトロでそれぞれの単一
物について証明した（以下にかかる単離物の一つについ
て示す）。単離物の一つＰＦｔＶ４２を選択して実施例
ζ−おけるウィルスベクターとして使用した。
１０００個のプラークをスクリーニングしても何ら黒色
プラークは得られなかった。かくして得られた黒色プラ
ークの３個からのウィルスをプラーク精製した。ウィル
スＤＮＡを調製しセしてｌＯｘ部位の存在なＣｒｅによ
り仲介された組換えによりインビトロでそれぞれの単一
物について証明した（以下にかかる単離物の一つについ
て示す）。単離物の一つＰＦｔＶ４２を選択して実施例
ζ−おけるウィルスベクターとして使用した。
本発明（；関し、異種ＤＮＡのウィルスベクター中への
好ましい挿入（二おいては、小さな環状プラスミドｐＢ
Ｒ６４中のｌＯｘ部位（：ｌ−１ｉ４接したＤＮＡがＦ
ＲＶ４２中に挿入された。プラスミドｐＢ８６４は第４
図に示される。線状ＰＲＶ４２ゲノム上の１ＯＸ０２部
位と小さな環状プラスミドｐＢ８６４上の１０ＸＰ部位
との間のＣｒｅにより仲介された組換えが実施例に記載
されるよう（；シてインビトロで実施され、そして第３
０図Ｃ二概略が示されるようＨＰＲＹゲノム中書二環状
プラスミドが組み込まれた。挿入されたＤＮＡ ７ラグ
メントを含有するウィルスを回収するには、組換え実験
から得られるＤＮＡをＰＫ１５細胞中（二慣用法により
トランスフェクションさせた。感染性中心および子孫ウ
ィルスの両方を黒色プラークアッセイによりスクリーニ
ングした。その結果を第１表（＝示す。
好ましい挿入（二おいては、小さな環状プラスミドｐＢ
Ｒ６４中のｌＯｘ部位（：ｌ−１ｉ４接したＤＮＡがＦ
ＲＶ４２中に挿入された。プラスミドｐＢ８６４は第４
図に示される。線状ＰＲＶ４２ゲノム上の１ＯＸ０２部
位と小さな環状プラスミドｐＢ８６４上の１０ＸＰ部位
との間のＣｒｅにより仲介された組換えが実施例に記載
されるよう（；シてインビトロで実施され、そして第３
０図Ｃ二概略が示されるようＨＰＲＹゲノム中書二環状
プラスミドが組み込まれた。挿入されたＤＮＡ ７ラグ
メントを含有するウィルスを回収するには、組換え実験
から得られるＤＮＡをＰＫ１５細胞中（二慣用法により
トランスフェクションさせた。感染性中心および子孫ウ
ィルスの両方を黒色プラークアッセイによりスクリーニ
ングした。その結果を第１表（＝示す。
ＰＲＶ４２はｇｌｌｌ−１ｏｘ融合遺伝子を含有しそし
て黒色プラークを形成するが、ｇｌｌｌ遺伝子中への異
種ＤＮＡの挿入（二よりｇ■糖タンパク質（ｇｌｌｌ遺
伝子生成物）のＭ１エピトープが破壊され、そしてウィ
ルスは白色プラークを生成するようＣ：なる。この結果
は予想され得なかった。しかしながら、この特徴により
挿入された異種ＤＮＡを含有スるウィルスをスクリーニ
ングするのが便利亀；なるのでこのことはとても有益で
ある。一般（二、組換えウィルスの生成はインビトロで
検出される組換えの量を正確に反映すると思われる。
て黒色プラークを形成するが、ｇｌｌｌ遺伝子中への異
種ＤＮＡの挿入（二よりｇ■糖タンパク質（ｇｌｌｌ遺
伝子生成物）のＭ１エピトープが破壊され、そしてウィ
ルスは白色プラークを生成するようＣ：なる。この結果
は予想され得なかった。しかしながら、この特徴により
挿入された異種ＤＮＡを含有スるウィルスをスクリーニ
ングするのが便利亀；なるのでこのことはとても有益で
ある。一般（二、組換えウィルスの生成はインビトロで
検出される組換えの量を正確に反映すると思われる。
白色プラーク形成性ウィルスが事実予測された組換え体
であるということは４種のそれぞれの単離物のゲノム構
造を決定することにより確認された。各単離物をプラー
ク精製しそしてＰＫ１５ａ胞上に高力価ストックを調製
した。ウィルスＤＮＡをそれぞれのウィルスからとりそ
してＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ ＩＩで消化した。４種す
べての単離物が前記した分析目安となる制限フラグメン
トを生成した。
であるということは４種のそれぞれの単離物のゲノム構
造を決定することにより確認された。各単離物をプラー
ク精製しそしてＰＫ１５ａ胞上に高力価ストックを調製
した。ウィルスＤＮＡをそれぞれのウィルスからとりそ
してＥｃｏＲＩおよびＢｇｌ ＩＩで消化した。４種す
べての単離物が前記した分析目安となる制限フラグメン
トを生成した。
本発明で動物ウィルスベクター中に挿入されたＤＮＡの
７ラグメントが原物どおりか否か検査せねばならない理
由が存在する場合はいつでも、インビトロＣｒｅ−１ａ
ｘ組換え系の使用によりそれが非常に好都合な様式で正
確に切り出されそして回収されうる。ウィルスＤＮＡは
知られた方法（二よりウィルスにフタ−から得られそし
てすでに記載された条件下にＣｒｅタンパク質と接触さ
せる。２個のｌＯｘ部位間のＤＮＡフラグメントは環状
形で切り出され、そして細菌中で複製できる。このもの
は容易に回収して分析されうる。
７ラグメントが原物どおりか否か検査せねばならない理
由が存在する場合はいつでも、インビトロＣｒｅ−１ａ
ｘ組換え系の使用によりそれが非常に好都合な様式で正
確に切り出されそして回収されうる。ウィルスＤＮＡは
知られた方法（二よりウィルスにフタ−から得られそし
てすでに記載された条件下にＣｒｅタンパク質と接触さ
せる。２個のｌＯｘ部位間のＤＮＡフラグメントは環状
形で切り出され、そして細菌中で複製できる。このもの
は容易に回収して分析されうる。
本発明方法の好ましい点（＝おいては、これは以下のよ
うに遂行された。前記した組換えＰＲＶベクターの一つ
を単離してＰＲＶ４２ ： ： ｐＢｓ６４と名づけた
。ｐＲＶ４２： ：ｐＢ８６４の８厘領域の予想される
構造を第３Ｃ図Ｃ示す。ＰＲＶ４２： ：ｐＢＢ６４中
のプラスミドｐＢ８６４配列は同方向ζ二反復するｌＯ
ｘ部位によりはさまれている。この構造にエリ、インビ
トロでのＣｒｅ仲介組換えがＰＲＶ４２： ：ｐＢ８６
４からプラスミドｐＢ８６４を正確Ｃ：切り出す筈であ
ること、および線状分子から得られる切り出された猿が
ＡｂｒｅｍＳｋｉ氏他のＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
２５９： １５０９〜１５１４ （１９８４）および
Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ氏他のＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ
ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃ
ｏｍｂｉ−ｎａｔｉｏｎ、ＵＣＬＡ ８ｙｍｐｏｍｉａ
ｏｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０： Ｎ、Ｗ、Ｃｏｚｚａｒｅ
ｌｌｉ、Ｅｄ。
うに遂行された。前記した組換えＰＲＶベクターの一つ
を単離してＰＲＶ４２ ： ： ｐＢｓ６４と名づけた
。ｐＲＶ４２： ：ｐＢ８６４の８厘領域の予想される
構造を第３Ｃ図Ｃ示す。ＰＲＶ４２： ：ｐＢＢ６４中
のプラスミドｐＢ８６４配列は同方向ζ二反復するｌＯ
ｘ部位によりはさまれている。この構造にエリ、インビ
トロでのＣｒｅ仲介組換えがＰＲＶ４２： ：ｐＢ８６
４からプラスミドｐＢ８６４を正確Ｃ：切り出す筈であ
ること、および線状分子から得られる切り出された猿が
ＡｂｒｅｍＳｋｉ氏他のＪ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、
２５９： １５０９〜１５１４ （１９８４）および
Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ氏他のＭｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ
ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃ
ｏｍｂｉ−ｎａｔｉｏｎ、ＵＣＬＡ ８ｙｍｐｏｍｉａ
ｏｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＣｅｌｌｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０： Ｎ、Ｗ、Ｃｏｚｚａｒｅ
ｌｌｉ、Ｅｄ。
（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｌａｎ Ｒ，Ｌｉ５）、 ６
７１〜６８４頁（１９８３）に記載されうるように弛緩
状態である筈であることが予測される。
７１〜６８４頁（１９８３）に記載されうるように弛緩
状態である筈であることが予測される。
ＰＲＶ４２ ： ： ｐＢｓ６４ ＤＮＡからのＣｒｅ
仲介によるｐＢｓ６４の切り出しＣ：より弛緩した環状
プラス°ミドとしてｐＢＳ６４が再生されるのみならず
、親ＰＲＶ４２と同一である線状ＰＲｖ分子も生成され
る。特（二、かかるＰＲＶ分子は黒色プラークアッセイ
舊＝おいてＭ１モノクローナル抗体と反応した場合に黒
色プラークを形成するウィルスを生ずる筈である。
仲介によるｐＢｓ６４の切り出しＣ：より弛緩した環状
プラス°ミドとしてｐＢＳ６４が再生されるのみならず
、親ＰＲＶ４２と同一である線状ＰＲｖ分子も生成され
る。特（二、かかるＰＲＶ分子は黒色プラークアッセイ
舊＝おいてＭ１モノクローナル抗体と反応した場合に黒
色プラークを形成するウィルスを生ずる筈である。
それゆえＰＲＶ４２：：ｐＢＢ６４ ＤＮＡをインビト
ロでＣｒｅで処理し七して次１：、 ＰＫ１５ ＩＩａ
ｌ胞中にトランスフェクションさせた。生成するウィル
スを黒色プラーク生成能力の有無１二ついてアッセイし
た（第２表）。
ロでＣｒｅで処理し七して次１：、 ＰＫ１５ ＩＩａ
ｌ胞中にトランスフェクションさせた。生成するウィル
スを黒色プラーク生成能力の有無１二ついてアッセイし
た（第２表）。
それ以上骨折ることなく、ここまでの記述を用いて当業
者が本発明を最大限Ｃ：利用できる。
者が本発明を最大限Ｃ：利用できる。
それゆえ以下の好ましい詳細な態様は本発明を説明する
ため艦−のみ掲げられているのであって、本発明を如何
なる程度Ｃ二も限定するものではない。
ため艦−のみ掲げられているのであって、本発明を如何
なる程度Ｃ二も限定するものではない。
すべての温度は摂氏で未補正である。
実施例
動物細胞およびウィルス
豚腎細胞（ＰＫ１５）、ＰＲＶのＢｅｃｋｅｒ株（ｐＨ
ｖ−Ｂｅ）、ＰＲＶ２およびそれらの培養は先にＲｏｂ
ｂｉｎｓ氏他のＬ Ｖｉｒｏｌ、 ５８： ３３９〜５
４７ （１９８６）およびＲｏｂｂｉｎ１３氏他のＪ、
Ｖｉｒｏｌ、翌：６３５〜６４５ （１９８（Ｓ）
（二記載されている。機能性ｌｏｘ部位を担持する組換
えシェードラビーズウイルスＰＲＶ４２は先１＝Ｂｏｂ
ｂ１ｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 ｓ８： ３３９〜
３４７ （１９８６） ｌ二記載される方法Ｃ二従い、
ＰＲＶ２ ＤＮＡおよびＮｃｏｌ消化ｐＢｓ１０９ Ｄ
ＮＡをＰＸ１５細胞中Ｃ二同時トランスフェクションさ
せること１：より生成された。ＰＲＶＤＮＡはＢｅｎ−
Ｐｏｒａｔ氏他のＶｉｒｏｌｏｇｙ ４１： ２６５
〜２７３ （１９７０） ｌ二記載されるようにしてヌ
クレオキャプシドから調製された。ＰＲＶ２ はＡＴ
ＣＣｌ二寄託番号ＶＲ２１４３の下に寄託されている。
ｖ−Ｂｅ）、ＰＲＶ２およびそれらの培養は先にＲｏｂ
ｂｉｎｓ氏他のＬ Ｖｉｒｏｌ、 ５８： ３３９〜５
４７ （１９８６）およびＲｏｂｂｉｎ１３氏他のＪ、
Ｖｉｒｏｌ、翌：６３５〜６４５ （１９８（Ｓ）
（二記載されている。機能性ｌｏｘ部位を担持する組換
えシェードラビーズウイルスＰＲＶ４２は先１＝Ｂｏｂ
ｂ１ｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ、 ｓ８： ３３９〜
３４７ （１９８６） ｌ二記載される方法Ｃ二従い、
ＰＲＶ２ ＤＮＡおよびＮｃｏｌ消化ｐＢｓ１０９ Ｄ
ＮＡをＰＸ１５細胞中Ｃ二同時トランスフェクションさ
せること１：より生成された。ＰＲＶＤＮＡはＢｅｎ−
Ｐｏｒａｔ氏他のＶｉｒｏｌｏｇｙ ４１： ２６５
〜２７３ （１９７０） ｌ二記載されるようにしてヌ
クレオキャプシドから調製された。ＰＲＶ２ はＡＴ
ＣＣｌ二寄託番号ＶＲ２１４３の下に寄託されている。
細菌菌株
大腸菌ＮＦ１８２９はＦ’ １ａｃＩｑｌａｃＺ：：Ｔ
ｎ５／ＭＣ１０００である。ＤＨ５ΔｌａｃはＨａｎａ
ｈａｎ氏のＭｏ１． Ｂｉｏｌ。
ｎ５／ＭＣ１０００である。ＤＨ５ΔｌａｃはＨａｎａ
ｈａｎ氏のＭｏ１． Ｂｉｏｌ。
１６＜Ｓ： ５５７〜５８０ （１９８５） （二記載
されるＤＨｌの誘導体でありそしてＭ、 Ｂｅｒｍａｎ
から得られた。用いられた他の菌株はＢｏｙｅｒ氏他の
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。
されるＤＨｌの誘導体でありそしてＭ、 Ｂｅｒｍａｎ
から得られた。用いられた他の菌株はＢｏｙｅｒ氏他の
Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ。
４１ ： ４５９ （１９６９） （：、記載されるＨ
Ｂｌｏｌ、およびＭｅｓｓｉｎｇ氏他のＮｕｃｌ Ａｃ
１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９ ： ３０９ （１９８１）：；
記載されるＪＭｌｏｌであった。１ａｃＩｑ遺伝子を含
有する大腸菌の他の菌株も、１ａｃＩｑ遺伝子５二より
抑制されうるプロそ一ターの制御の下１：、 ｇｍ遺伝
子な発現するｐＡＬＭ３およびｐＢｓ１０９のようなプ
ラスミドを増殖させるの：；使用されうる。
Ｂｌｏｌ、およびＭｅｓｓｉｎｇ氏他のＮｕｃｌ Ａｃ
１ｄｓ Ｒｅｓ、 ９ ： ３０９ （１９８１）：；
記載されるＪＭｌｏｌであった。１ａｃＩｑ遺伝子を含
有する大腸菌の他の菌株も、１ａｃＩｑ遺伝子５二より
抑制されうるプロそ一ターの制御の下１：、 ｇｍ遺伝
子な発現するｐＡＬＭ３およびｐＢｓ１０９のようなプ
ラスミドを増殖させるの：；使用されうる。
細菌プラスミド
すべてのプラスミドはＲｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉ
ｒｏｌ。
ｒｏｌ。
５９＝６３５〜６４５（１９８６）およびＭａｎｉａｔ
ｉｓ氏他のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏ１ｄ！３ｐｒｉｎｇ ）ｉａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ
、） １９８２ に記載される標準的技法Ｃ二より構
成および調製された。ｔａｃプロモーターの制御の下ζ
二Ｃｒｏ−ｇｌｌｌ 融合タンパク質を生成するプラ
スミドｐＡＬＭ３はＲｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒ
ｏｌ、 ５９： ６５５〜６４５ （１９８６） （二
記載されている６ｐＡＬＭ３はヨーロッパ特許出願（Ｅ
ＰＡ ）０．１６２，７３８号（１９８５年１１月２７
日出願）に記載されている（以下ｐＮＴ ７／１２３と
称する）。ＥＰＡＯ，１６２，７３８号に記されるよう
に、プラスミドｐＡＬＭ３ （ｐＮＴ ７／１２３ ）
を担持する大腸菌株に１２であるＮＦ１８２９はイン・
ビトロ・インターナショナル（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） Ｉｎｃ、、 Ａｎｎ Ａｒ
ｂｏｒ。
ｉｓ氏他のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏ１ｄ！３ｐｒｉｎｇ ）ｉａｒｂｏｒ、 Ｎ、Ｙ
、） １９８２ に記載される標準的技法Ｃ二より構
成および調製された。ｔａｃプロモーターの制御の下ζ
二Ｃｒｏ−ｇｌｌｌ 融合タンパク質を生成するプラ
スミドｐＡＬＭ３はＲｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒ
ｏｌ、 ５９： ６５５〜６４５ （１９８６） （二
記載されている６ｐＡＬＭ３はヨーロッパ特許出願（Ｅ
ＰＡ ）０．１６２，７３８号（１９８５年１１月２７
日出願）に記載されている（以下ｐＮＴ ７／１２３と
称する）。ＥＰＡＯ，１６２，７３８号に記されるよう
に、プラスミドｐＡＬＭ３ （ｐＮＴ ７／１２３ ）
を担持する大腸菌株に１２であるＮＦ１８２９はイン・
ビトロ・インターナショナル（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） Ｉｎｃ、、 Ａｎｎ Ａｒ
ｂｏｒ。
ＭＩ、に寄託番号ＩＶＩ−１００４９で寄託されている
。
。
プラスミドｐＢＳ６４はＭｅｌｔＯｎ氏他のＮｕｃｌ、
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 １２： ７０３５〜７０５６（
１９８４） に記載されるプラスミドであるｐ８Ｐ６
４のポリリンカー領域中Ｃ：１ｏｘＰ部位を挿入するこ
とにより構成された。これは１ｏｘＰ部位を含有するｐ
Ｂ８３０の５９塩基対（ｂｐ） Ｘｈｏ Ｉ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントをｐＳＰ６４の大＠ ｆｌ Ｓａｌ
Ｉ −Ｂａｍ ＨＩフラグメント中Ｃ二導入することに
より達成された。これによりＳＰ６プロモーター、１個
の１ｏｘＰ ｓ位およびいくつかの非反復制限部位Ｈｉ
ｎｄ ｍ、 Ｐｓｔｌ、 Ｂａｍ ＨＩ、 Ｓｍａｌ、
Ｓａｃ ＩおよびＥｃｏＲＩを含有する３、１ｋｂの
プラスミドが得られる。このプラスミドの概略を第４図
（：示す。
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 １２： ７０３５〜７０５６（
１９８４） に記載されるプラスミドであるｐ８Ｐ６
４のポリリンカー領域中Ｃ：１ｏｘＰ部位を挿入するこ
とにより構成された。これは１ｏｘＰ部位を含有するｐ
Ｂ８３０の５９塩基対（ｂｐ） Ｘｈｏ Ｉ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメントをｐＳＰ６４の大＠ ｆｌ Ｓａｌ
Ｉ −Ｂａｍ ＨＩフラグメント中Ｃ二導入することに
より達成された。これによりＳＰ６プロモーター、１個
の１ｏｘＰ ｓ位およびいくつかの非反復制限部位Ｈｉ
ｎｄ ｍ、 Ｐｓｔｌ、 Ｂａｍ ＨＩ、 Ｓｍａｌ、
Ｓａｃ ＩおよびＥｃｏＲＩを含有する３、１ｋｂの
プラスミドが得られる。このプラスミドの概略を第４図
（：示す。
本発明の実施例において、プラスミドｐＢ８６４はｌａ
ｘ部位および受容体ウィルスＤＮＡ中に挿入すべき付加
的なりＮＡのフラグメントを含有する環状ＤＮＡとして
作用する。しかしながら、もちろん本発明を実施するに
は、ｌｏｘ部位および異種ＤＮＡのフラグメントな含有
する任意の環状のＤＮＡフラグメントが使用されうる。
ｘ部位および受容体ウィルスＤＮＡ中に挿入すべき付加
的なりＮＡのフラグメントを含有する環状ＤＮＡとして
作用する。しかしながら、もちろん本発明を実施するに
は、ｌｏｘ部位および異種ＤＮＡのフラグメントな含有
する任意の環状のＤＮＡフラグメントが使用されうる。
プラスミドｐＢｓ１０９の構成の概略は第１図に示され
る。１個のｌｏｘ部位、２個の５′塩基および６個の３
′塩基を包含する４２ヌクレオチドの一本鎖オリゴマー
（１０ＸＣ２の欄ζ二示される）が１ｏｘ部位なｇＩＩ
ｌ遺伝子遺伝子犬するのに用いられた。前記したようＣ
二、このｌｏｘ部位（矢印内の塩基配列）は第１図Ｃ二
示されるｉうｌ：、３４ｂｐ１ｏｘＰ配列の左端から第
２番目のＴに代えてＣを有することが１ｏｘＰとは相異
する。この変えられ・た部位は１ｏｘｃ２と呼ばれる。
る。１個のｌｏｘ部位、２個の５′塩基および６個の３
′塩基を包含する４２ヌクレオチドの一本鎖オリゴマー
（１０ＸＣ２の欄ζ二示される）が１ｏｘ部位なｇＩＩ
ｌ遺伝子遺伝子犬するのに用いられた。前記したようＣ
二、このｌｏｘ部位（矢印内の塩基配列）は第１図Ｃ二
示されるｉうｌ：、３４ｂｐ１ｏｘＰ配列の左端から第
２番目のＴに代えてＣを有することが１ｏｘＰとは相異
する。この変えられ・た部位は１ｏｘｃ２と呼ばれる。
このオリゴヌクレオチドの３′末端（矢印の右方）はＫ
ｐｎｌｌ二より生成されたＤＮＡ末端Ｃニアニール化す
ることが計画されたが、それがアニール化した場合はＫ
ｐｎ １部位を修復しない。プラスミドｐＡＬＭ３をＫ
ｐｎ Ｉで消化すると末端に５’ＤＮＡオーバーハング
が残る。−本鎖オリゴマーをＫｐｎ Ｉ消化ｐＡＬＭ５
ＤＮＡにアニール化させ、次にＤＮＡポリメラーゼ１の
フレノウフラグメントで処理してプラントエンドの二本
鎖ＤＮＡを生成させた。得られるＤＮＡをＰｓｔ ｌで
消化して２個の７ラグメントとなしそしてそのうち大き
い方を回収し、精製しそして以後１：使用するために保
留した。別（＝、ｐＡＬＭ３を、Ｋｐｎ Ｉと同じＤＮ
Ａ配列（ＧＧＴＡＣＣ）を認識するがしかし３′−張出
し末端よりも５′−張出し末端を残すＡｓｐ７１Ｂで消
化した。Ａｓｐ７１８で消化したｐＡＬＭ３ ＤＮＡを
同様（：フレノウフラグメントで処理して末端を充填し
た。次Ｃ；得られるＤＮＡを非反復Ｐｓｔ１ 部位で切
断しそして生成される２個のフラグメントの小さい方を
回収し精製した。次Ｃ二第１のＰｓｔｌ消化で得られる
大きい方のフラグメントを第２のＰｓｔｌ消化で得られ
た小さい方の７ラグメントに連結してｐＢｓ１０９を生
成させた。プラントエンドを適正に接続させると挿入さ
れたオリゴマーの５′にＫｐｎ １部位が再構成される
ことが予測される。これはＫｐｎ １での消化Ｃ；より
証明された。
ｐｎｌｌ二より生成されたＤＮＡ末端Ｃニアニール化す
ることが計画されたが、それがアニール化した場合はＫ
ｐｎ １部位を修復しない。プラスミドｐＡＬＭ３をＫ
ｐｎ Ｉで消化すると末端に５’ＤＮＡオーバーハング
が残る。−本鎖オリゴマーをＫｐｎ Ｉ消化ｐＡＬＭ５
ＤＮＡにアニール化させ、次にＤＮＡポリメラーゼ１の
フレノウフラグメントで処理してプラントエンドの二本
鎖ＤＮＡを生成させた。得られるＤＮＡをＰｓｔ ｌで
消化して２個の７ラグメントとなしそしてそのうち大き
い方を回収し、精製しそして以後１：使用するために保
留した。別（＝、ｐＡＬＭ３を、Ｋｐｎ Ｉと同じＤＮ
Ａ配列（ＧＧＴＡＣＣ）を認識するがしかし３′−張出
し末端よりも５′−張出し末端を残すＡｓｐ７１Ｂで消
化した。Ａｓｐ７１８で消化したｐＡＬＭ３ ＤＮＡを
同様（：フレノウフラグメントで処理して末端を充填し
た。次Ｃ；得られるＤＮＡを非反復Ｐｓｔ１ 部位で切
断しそして生成される２個のフラグメントの小さい方を
回収し精製した。次Ｃ二第１のＰｓｔｌ消化で得られる
大きい方のフラグメントを第２のＰｓｔｌ消化で得られ
た小さい方の７ラグメントに連結してｐＢｓ１０９を生
成させた。プラントエンドを適正に接続させると挿入さ
れたオリゴマーの５′にＫｐｎ １部位が再構成される
ことが予測される。これはＫｐｎ １での消化Ｃ；より
証明された。
Ｃｒｙ−ｇｕｌｌタンパク質はＲｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ
、Ｖｉｒｏｌ。
、Ｖｉｒｏｌ。
５８： ３３９〜３４７ （１９Ｂ６）に記載されるよ
うにしてｔａｃプロモーターの制御の下、不溶性集合物
としてまたは封入体として大腸菌中でｐＡＬＭ３ ’！
たはｐＢ８１０９から生成される。その産生はＢｏｂｂ
ｉｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ。５８：３３９〜５４７
（１９８６）ｌ二記載されるよう（ニして、１ｍＭ濃
度のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
Ｉ Ｐ’ｌ’（））を用いて訪発されそして集合タンパ
ク質を＊失する。融合タンパク質の存在はＬａｅｍｍｌ
ｉ Ｕ、に、氏のＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ２２
７： ６８０〜６８５（１９７０）に記載されるよう感
；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下Ｃ二ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析することＣ二より判
定される。
うにしてｔａｃプロモーターの制御の下、不溶性集合物
としてまたは封入体として大腸菌中でｐＡＬＭ３ ’！
たはｐＢ８１０９から生成される。その産生はＢｏｂｂ
ｉｎｓ氏他のＪ、 Ｖｉｒｏｌ。５８：３３９〜５４７
（１９８６）ｌ二記載されるよう（ニして、１ｍＭ濃
度のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（
Ｉ Ｐ’ｌ’（））を用いて訪発されそして集合タンパ
ク質を＊失する。融合タンパク質の存在はＬａｅｍｍｌ
ｉ Ｕ、に、氏のＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ２２
７： ６８０〜６８５（１９７０）に記載されるよう感
；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下Ｃ二ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析することＣ二より判
定される。
変えられたｇＩＩＩタンノセク質を有するウィルスを検
出することは、Ｒｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ、 民地ｒｏｌ
。
出することは、Ｒｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ、 民地ｒｏｌ
。
５９ ： ６５５〜６４５ （１９８６）およびＧｒａ
ｈａｍ氏他のＶｉ民地ｌｏｇｙ ５２ ： ４５６〜４
６７ （１９７３） ｌ二記載されるよつ（二ＤＮＡを
ＰＫ１５ａ胞中にトランスフェクションさせたのち、Ｒ
ｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ、 民地ｒｏｌ、 ｓｓ：５３９
〜３４７（１９８６）、Ｈｏｌｌａｎｄ氏他のＪ、 Ｖ
ｉｒｏｌ、 ４６：６４９〜６５２（１９８３）および
Ｓｍｉ ｔｈ氏民地Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ。
ｈａｍ氏他のＶｉ民地ｌｏｇｙ ５２ ： ４５６〜４
６７ （１９７３） ｌ二記載されるよつ（二ＤＮＡを
ＰＫ１５ａ胞中にトランスフェクションさせたのち、Ｒ
ｏｂｂｉｎｓ氏他のＪ、 民地ｒｏｌ、 ｓｓ：５３９
〜３４７（１９８６）、Ｈｏｌｌａｎｄ氏他のＪ、 Ｖ
ｉｒｏｌ、 ４６：６４９〜６５２（１９８３）および
Ｓｍｉ ｔｈ氏民地Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏ ｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ４０： ２９７〜３０５ （１９８１
） （：記載されるよう（ニして黒色プラークアッセイ
を用いる。この方法はＨａｍｐ １民地のＪ、 Ｖｉｒ
ｏｌ、 ５２： ５６６〜５７４（１９８４）ζ：記載
されるｇＩｌＩに対するＭ１モノクローナル抗体、およ
びＭ１抗原を検出するためのセイヨウワサビペルオキシ
ダーゼに結合した第２の抗体を用いる。Ｍ１モノクロー
ナル抗体は自由（二明布してくれるＤｒ、 Ｔａｍａｒ
Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ、 Ｖａｎｄｅｒ −ｂｉｌｔ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの贈物であり、さもなくば例
えば当業者がルーチン操作しうる知られた方法を用いて
容易に入手しうる。
） （：記載されるよう（ニして黒色プラークアッセイ
を用いる。この方法はＨａｍｐ １民地のＪ、 Ｖｉｒ
ｏｌ、 ５２： ５６６〜５７４（１９８４）ζ：記載
されるｇＩｌＩに対するＭ１モノクローナル抗体、およ
びＭ１抗原を検出するためのセイヨウワサビペルオキシ
ダーゼに結合した第２の抗体を用いる。Ｍ１モノクロー
ナル抗体は自由（二明布してくれるＤｒ、 Ｔａｍａｒ
Ｂｅｎ−Ｐｏｒａｔ、 Ｖａｎｄｅｒ −ｂｉｌｔ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙからの贈物であり、さもなくば例
えば当業者がルーチン操作しうる知られた方法を用いて
容易に入手しうる。
実施例 １
４２ヌクレオチドの一本鎖オリゴマー１ｏｘＣ２は画業
上よく知られた（前記参照）方法により合成されそして
第１図に示されるヌクレオチド配列からなる。
上よく知られた（前記参照）方法により合成されそして
第１図に示されるヌクレオチド配列からなる。
４２ヌクレオチド配列を以下のようＣ二してｐＲＶのｇ
ｉｌｌ遺伝子遺伝子中入口だ。すなわちｐＡＬＭ３５．
０μｇを２０単位のＫｐｎ Ｉを用いて３７℃で１時間
開裂させた。この反応混合物を６８℃で１粉間加熱しそ
して次にオリゴヌクレオチド１μｇ ’ｋ Ｋｐｎ １
消化ｐＡＬＭ３１５μｇおよびＴ４リガーゼ２００単位
と容Ｉｋ３０μを中で混合した。この混合物を１６℃で
一夜インキエベーションし、次Ｃ二６８℃で１時間加熱
した。この混合物中１：：１００μＭ濃度でデオキシヌ
クレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウフラ
グメント５単位を、最終容量７０μＬとなすためのＭａ
ｎｉａｔｉｓ氏他のＭｏ１ｅ民地ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ
）（１９８２）に記載される適当な緩衝液と共（二加え
た。この混合物を１６℃で１時間インキエベーションし
そして８ＤＳを添加し６８℃（；加熱することにより反
応を停止させた。この混合物をフェノールで抽出し、次
に２容量のエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。
ｉｌｌ遺伝子遺伝子中入口だ。すなわちｐＡＬＭ３５．
０μｇを２０単位のＫｐｎ Ｉを用いて３７℃で１時間
開裂させた。この反応混合物を６８℃で１粉間加熱しそ
して次にオリゴヌクレオチド１μｇ ’ｋ Ｋｐｎ １
消化ｐＡＬＭ３１５μｇおよびＴ４リガーゼ２００単位
と容Ｉｋ３０μを中で混合した。この混合物を１６℃で
一夜インキエベーションし、次Ｃ二６８℃で１時間加熱
した。この混合物中１：：１００μＭ濃度でデオキシヌ
クレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウフラ
グメント５単位を、最終容量７０μＬとなすためのＭａ
ｎｉａｔｉｓ氏他のＭｏ１ｅ民地ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ
）（１９８２）に記載される適当な緩衝液と共（二加え
た。この混合物を１６℃で１時間インキエベーションし
そして８ＤＳを添加し６８℃（；加熱することにより反
応を停止させた。この混合物をフェノールで抽出し、次
に２容量のエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。
生成するＤＮＡの沈殿を集めた。この沈殿を乾燥させそ
してＴＥ （ｌｌＨ８，０のトリスＨＣＬ１０ｍＭ 、
ＦｉＤＴＡ １ｍＭ）−１０ｐＬ中に再懸濁した。次
にこのＤＮＡを２５μを量中１５単位のＰｓｔｌで１時
間開裂させて２個のＤＮＡフラグメントな生成させた。
してＴＥ （ｌｌＨ８，０のトリスＨＣＬ１０ｍＭ 、
ＦｉＤＴＡ １ｍＭ）−１０ｐＬ中に再懸濁した。次
にこのＤＮＡを２５μを量中１５単位のＰｓｔｌで１時
間開裂させて２個のＤＮＡフラグメントな生成させた。
次にこれらフラグメントな０．８％アガロースゲル上で
分離して大きい方のフラグメントをゲルから回収し、Ｔ
ＥＩＯｇ中に再懸濁させた。このＤＮＡフラグメントを
「ＩＡＨｌ」と呼ぶ。
分離して大きい方のフラグメントをゲルから回収し、Ｔ
ＥＩＯｇ中に再懸濁させた。このＤＮＡフラグメントを
「ＩＡＨｌ」と呼ぶ。
ｐＡＬＭ３５．７５μｇを１５μｔｉｌ中でＡｓｐ７１
８Ｙ用い２時間開裂させそして次に６８℃で１５分間加
熱した。デオキシヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラー
ゼ！のフレノウフラグメント４単位を加え、容量な２５
μｔとなしそしてこの混合物を１６℃で３０分間インキ
エベートし、次に６８℃で２０分間加熱した。次にＤＮ
Ａを３０ ｐＬ ｉ中でＰｓｔ Ｉを用い３７℃で２時
間消化して２個のＤＮＡ７ラグメントを生成させた。こ
れらを０．８％アガロースゲル上で分離して小さい方の
フラグメントを精製し、そしてＴＥ１０μを中ζ二再懸
濁させた。このＤＮＡフラグメントな「ＬＯ」と呼ぶ。
８Ｙ用い２時間開裂させそして次に６８℃で１５分間加
熱した。デオキシヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラー
ゼ！のフレノウフラグメント４単位を加え、容量な２５
μｔとなしそしてこの混合物を１６℃で３０分間インキ
エベートし、次に６８℃で２０分間加熱した。次にＤＮ
Ａを３０ ｐＬ ｉ中でＰｓｔ Ｉを用い３７℃で２時
間消化して２個のＤＮＡ７ラグメントを生成させた。こ
れらを０．８％アガロースゲル上で分離して小さい方の
フラグメントを精製し、そしてＴＥ１０μを中ζ二再懸
濁させた。このＤＮＡフラグメントな「ＬＯ」と呼ぶ。
３．０μｔのｒＬｏＪおよび６．０μｔのｒｌＡ ！（
ｉＪを・Ｍａｎｉａｔｉｓ氏他のＭｏ１ｅ民地ｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ） １９８２．に記載されるよう
（ニジて総量１５μＬ中で２００単位のＴ４リガーゼお
よびＴ４９ガーゼ緩衝液と混合しそして１６℃で一夜イ
ンキエベーションした。大腸菌ＪＭ１０１をこの連結混
合物５μｔを用いて形質転換して約１４０個の形質転換
体を得た。これら形質転換体の一つ（＆６）が機能性ｌ
ａｘ部位を含有していることが示され、そして新たにｐ
Ｂｓ１０９と命名した。
ｉＪを・Ｍａｎｉａｔｉｓ氏他のＭｏ１ｅ民地ｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ、 ＮＹ） １９８２．に記載されるよう
（ニジて総量１５μＬ中で２００単位のＴ４リガーゼお
よびＴ４９ガーゼ緩衝液と混合しそして１６℃で一夜イ
ンキエベーションした。大腸菌ＪＭ１０１をこの連結混
合物５μｔを用いて形質転換して約１４０個の形質転換
体を得た。これら形質転換体の一つ（＆６）が機能性ｌ
ａｘ部位を含有していることが示され、そして新たにｐ
Ｂｓ１０９と命名した。
上記の反応は第１図Ｃ＝概略して示されている。
ｐＢｓ １０９がＩＯＸ部位を含有することを示すため
（；、ｐＢｓ １０９ ＤＮＡをｐＢｓ６４ ＤＮＡ
（３，１ｋｂプラスミド上Ｐｓｔｌに隣接した１個のＬ
ＱＸＰ部位を含有）と混合しそしてこの混合物をＰｓｔ
Ｉで消化した。次（二この混合物をＣｒｅとインキユ
ベーショイすると、もし機能性１ｏｘ部位がｐＡＬＭ３
のＫｐｎ １部位で予想された方向に存在しているなら
ば２．３ ｋｌ：＋と７．Ｏｋｂの寸法の特徴的な組換
えＤＮＡフラグメントが得られる。このことが正しく観
察された。
（；、ｐＢｓ １０９ ＤＮＡをｐＢｓ６４ ＤＮＡ
（３，１ｋｂプラスミド上Ｐｓｔｌに隣接した１個のＬ
ＱＸＰ部位を含有）と混合しそしてこの混合物をＰｓｔ
Ｉで消化した。次（二この混合物をＣｒｅとインキユ
ベーショイすると、もし機能性１ｏｘ部位がｐＡＬＭ３
のＫｐｎ １部位で予想された方向に存在しているなら
ば２．３ ｋｌ：＋と７．Ｏｋｂの寸法の特徴的な組換
えＤＮＡフラグメントが得られる。このことが正しく観
察された。
挿入された１ｏｘｃ２部位が翻訳終止シグナルを導入し
ないことも示された。もしそうであるならばｐＢｓ １
０９は大腸菌中に新規な融合タンパク質を発現しよう。
ないことも示された。もしそうであるならばｐＢｓ １
０９は大腸菌中に新規な融合タンパク質を発現しよう。
ｇｍ遺伝子のＫｐｎ １部位で枠内（＝１０ＸＣ２部位
を付加すると、予想される４７９アミノ酸タンパク質の
アミノ酸４３１のあと（：幾つかの余分のアミノ酸が挿
入される筈である。この予測を証明するためＣ二ｐＢｓ
１０９から生成されたタンパク質の寸法を測定した。第
２図は親ｐＡＬＭ３が先Ｃ二ＲｏｂｂｉｎＳ民地のＪ、
’Ｖｉｒｏ１．５９： ６３トロ４５（１９８６）に
より示されるよう（二、見かけの分子量５７キロダルト
ンを有する８ｍタンパク質を生成することを示している
。ｐＢｓ１０９ （二より発現されたタンパク質はそ
れがｇ■タンパク質よりわずか（二大きいかの如く移動
する。
を付加すると、予想される４７９アミノ酸タンパク質の
アミノ酸４３１のあと（：幾つかの余分のアミノ酸が挿
入される筈である。この予測を証明するためＣ二ｐＢｓ
１０９から生成されたタンパク質の寸法を測定した。第
２図は親ｐＡＬＭ３が先Ｃ二ＲｏｂｂｉｎＳ民地のＪ、
’Ｖｉｒｏ１．５９： ６３トロ４５（１９８６）に
より示されるよう（二、見かけの分子量５７キロダルト
ンを有する８ｍタンパク質を生成することを示している
。ｐＢｓ１０９ （二より発現されたタンパク質はそ
れがｇ■タンパク質よりわずか（二大きいかの如く移動
する。
ＰＲＹ４２の生成
ｐＢ８１０９からのＤＮＡ １８ μｇをＮｃｏ１１５
単位で４．５時間消化しそして消化されたＤＮＡ １μ
ｔをＰＲＹ２からのＤＮＡ ２μｇと混合し、そしてＲ
ｏｔ）ｂｉｎｓ氏他の民地、 Ｖｉｒｏｌ ５８ ：
５５９〜！＋４７（１９８６）（；記載されるようにし
てＰＫ１５Ｍ胞中にトランスフェクションさせた。得ら
れるウィルス子孫（二ついて黒色プラークアッセイを行
った。スクリーニングされた１０００個のプラークのう
ち５個が黒色であった。黒色プラークの一つからのＰＲ
Ｙ４２で表示されるウィルスを単離した。これを増殖さ
せて分析した。
単位で４．５時間消化しそして消化されたＤＮＡ １μ
ｔをＰＲＹ２からのＤＮＡ ２μｇと混合し、そしてＲ
ｏｔ）ｂｉｎｓ氏他の民地、 Ｖｉｒｏｌ ５８ ：
５５９〜！＋４７（１９８６）（；記載されるようにし
てＰＫ１５Ｍ胞中にトランスフェクションさせた。得ら
れるウィルス子孫（二ついて黒色プラークアッセイを行
った。スクリーニングされた１０００個のプラークのう
ち５個が黒色であった。黒色プラークの一つからのＰＲ
Ｙ４２で表示されるウィルスを単離した。これを増殖さ
せて分析した。
Ｃｒｅ緩衝液を含有する総反応容量４５μを中で、ＰＲ
ＶＡ２またはＰＲＹ−Ｂｅ ＤＮＡのいずれか５．０μ
ｇをｐＢ８６４ ＤＮＡ ５１４ｎｇ 、ｔ ７ ％ポ
リビニルアルコールおよび約６０ ｎｇのＣｒｅタンパ
ク質と混合した。
ＶＡ２またはＰＲＹ−Ｂｅ ＤＮＡのいずれか５．０μ
ｇをｐＢ８６４ ＤＮＡ ５１４ｎｇ 、ｔ ７ ％ポ
リビニルアルコールおよび約６０ ｎｇのＣｒｅタンパ
ク質と混合した。
３０℃で２０分間インキエベーションしたのち、この混
合物を７０℃で１０分間加熱した。各反応混合物からの
２μｇをＰＫ１５細胞中にトランスフェクションさせた
。反応混合物の半分をＰｃｏＲＩおよびＢｇｌｌｌで消
化しそして生成するＤＮＡフラグメントな０．７ ％ア
ガロースゲル上分離することシーより組換え体の生成Ｃ
二ついて分析した。この反応は第５Ｃ図Ｃ：概略して示
されている。
合物を７０℃で１０分間加熱した。各反応混合物からの
２μｇをＰＫ１５細胞中にトランスフェクションさせた
。反応混合物の半分をＰｃｏＲＩおよびＢｇｌｌｌで消
化しそして生成するＤＮＡフラグメントな０．７ ％ア
ガロースゲル上分離することシーより組換え体の生成Ｃ
二ついて分析した。この反応は第５Ｃ図Ｃ：概略して示
されている。
結果
感染中心および子孫ウィルスを黒色プラークアッセイに
よりスクリーニングした。その結果を第１表Ｃ：示す。
よりスクリーニングした。その結果を第１表Ｃ：示す。
第１表
ＰＲＶ中へのプラスミドＤＮＡの挿入。インビトロにお
けるＤＮＡ組換えの量は各反応Ｃ二おける新規な１６．
５ ｋｂ ＢｇｌトＥｃｏＲＩフラグメントの量を第３
Ａ図に示されるようにＰＲＶの１３．２ ｋｔ） Ｂｇ
ｌｉｌ Ｆ ７ラグメントと比較して測定することによ
り決定した。
けるＤＮＡ組換えの量は各反応Ｃ二おける新規な１６．
５ ｋｂ ＢｇｌトＥｃｏＲＩフラグメントの量を第３
Ａ図に示されるようにＰＲＶの１３．２ ｋｔ） Ｂｇ
ｌｉｌ Ｆ ７ラグメントと比較して測定することによ
り決定した。
ＰＲＶ−Ｂｅ Ｏ７５０００１１０００００完全
−ＰＶＡ ０ ４２００ ６１５０５９ １
５．０−Ｃｒｅ ０ ６５００ ０ ４３００
０ −０−ｐＢ８６４ ０ ７７００ ０ ５
５００ ０ ０２個の新規ＤＮＡ ７ラグメン
）２０．６ｋｂおよび１６．５ｋｂの形成が組換えを示
す指標である。第３Ａ図Ｃ：示されるようにかかるフラ
グメントが見出された。生じた組換えの量はエチジウム
ブロマイド染色ゲルのネガ写真を濃度測定することによ
り測定した（Ｈｏｅｆｅｒ Ｇ３３００走査濃度計使用
）。生成される１６．５ｋｂの組換えフラグメントの量
をＣｒｅにより仲介された組換え事象に影響されないＰ
ＲＶの１５．２ ｋｌ） Ｂｇｌ…フラグメントと比較
した。反応混合物の構成分は表１＝示されるように除外
した。組換え頻度は８．１％であり組換えウィルスは２
．６％であった。
５．０−Ｃｒｅ ０ ６５００ ０ ４３００
０ −０−ｐＢ８６４ ０ ７７００ ０ ５
５００ ０ ０２個の新規ＤＮＡ ７ラグメン
）２０．６ｋｂおよび１６．５ｋｂの形成が組換えを示
す指標である。第３Ａ図Ｃ：示されるようにかかるフラ
グメントが見出された。生じた組換えの量はエチジウム
ブロマイド染色ゲルのネガ写真を濃度測定することによ
り測定した（Ｈｏｅｆｅｒ Ｇ３３００走査濃度計使用
）。生成される１６．５ｋｂの組換えフラグメントの量
をＣｒｅにより仲介された組換え事象に影響されないＰ
ＲＶの１５．２ ｋｌ） Ｂｇｌ…フラグメントと比較
した。反応混合物の構成分は表１＝示されるように除外
した。組換え頻度は８．１％であり組換えウィルスは２
．６％であった。
ＰＲＶＡ２ ： ： ｐＢ８６４から０） ｐＢＢ６４
ノ切り出シ挿入反応Ｃ二ついて前記したと同じ方法で
Ｃｒｅ反応を行うが、但しポリビニルアルコールを除外
しそして反応容量を１３５μｔ（二増大させた。
ノ切り出シ挿入反応Ｃ二ついて前記したと同じ方法で
Ｃｒｅ反応を行うが、但しポリビニルアルコールを除外
しそして反応容量を１３５μｔ（二増大させた。
反応体の濃度は挿入反応（二おけると同じであるが、但
ｊ、＆１／ＪｇのＰＲＶ４２ ： ： ｐＢｓ６４ Ｄ
ＮＡが包含された。５．１ ｋｂ ｐＢｓ６４プラスミ
ドの生成が切り出しを示す指標である。ｐＢｓ６４中番
二唯−のＥｃｏＲ１部位が包含されるゆえに、切り出さ
れた分子はＥｃｏＲＩでの消化後は直線状となって＆１
ｋｋ）線状フラグメントを生成しなければならない。こ
れが起こったことを第３Ｂ図（二示す。ＰＲＶ４２：：
ｐＢｓ６４ ＤＮＡをインビトロでＣｒｅとインキエ
ベーションすると弛緩、ＩＩ ｐＢ８６４ ＤＮＡとい
っしょに移動する新しいＤＮＡ分子（レーン２）が生成
される。この新規分子の生成は、Ｃｒｅを除外するとそ
の生成が阻止されるので（レーン１ ） Ｃｒｅタンパ
ク質依存性である。この分子はＢｇｌｉｌおよびＥｃｏ
ＲＩで消化すること（二より確認した（レーア３）。生
成する分子の移動度は予想されるようｉ二、線状ｐＢｓ
６４のそれの方Ｃニシフトする。
ｊ、＆１／ＪｇのＰＲＶ４２ ： ： ｐＢｓ６４ Ｄ
ＮＡが包含された。５．１ ｋｂ ｐＢｓ６４プラスミ
ドの生成が切り出しを示す指標である。ｐＢｓ６４中番
二唯−のＥｃｏＲ１部位が包含されるゆえに、切り出さ
れた分子はＥｃｏＲＩでの消化後は直線状となって＆１
ｋｋ）線状フラグメントを生成しなければならない。こ
れが起こったことを第３Ｂ図（二示す。ＰＲＶ４２：：
ｐＢｓ６４ ＤＮＡをインビトロでＣｒｅとインキエ
ベーションすると弛緩、ＩＩ ｐＢ８６４ ＤＮＡとい
っしょに移動する新しいＤＮＡ分子（レーン２）が生成
される。この新規分子の生成は、Ｃｒｅを除外するとそ
の生成が阻止されるので（レーン１ ） Ｃｒｅタンパ
ク質依存性である。この分子はＢｇｌｉｌおよびＥｃｏ
ＲＩで消化すること（二より確認した（レーア３）。生
成する分子の移動度は予想されるようｉ二、線状ｐＢｓ
６４のそれの方Ｃニシフトする。
反応混合物の棒をＰＫ１５細胞中Ｃ；形質転換しそして
得られるウィルス子孫を黒色プラークアッセイにより分
析した。その結果１に：第２表（：示す。
得られるウィルス子孫を黒色プラークアッセイにより分
析した。その結果１に：第２表（：示す。
黒色プラーク形成性（組換え）ウィルスは頻度５６％で
Ｃｒｅ により生成され、この値はインビトロで起った
組換え量とほぼ同じである。この組換え事象は完全（二
Ｃｒｅタンパク質依存性である。Ｃｒｅの非存在下では
、ＰＲＶ４２： ：ｐＢＳ６４は安定した白色プラーク
表現型を示す。このことはＣｒｅ ｉ：より仲介された
ＤＮＡの挿入および切り出しが正確にｌｏｘ部位で起る
ことを証明している。
Ｃｒｅ により生成され、この値はインビトロで起った
組換え量とほぼ同じである。この組換え事象は完全（二
Ｃｒｅタンパク質依存性である。Ｃｒｅの非存在下では
、ＰＲＶ４２： ：ｐＢＳ６４は安定した白色プラーク
表現型を示す。このことはＣｒｅ ｉ：より仲介された
ＤＮＡの挿入および切り出しが正確にｌｏｘ部位で起る
ことを証明している。
Ｃｒｅで処理されなかったＰＲＶ４２ ： ： ｐＢｓ
６４による黒色プラークの形成が存在しないことは同じ
方向に反復する３４ｂｐｌｏｘ部位（しかし１ｂｐのミ
ス゛マツチ含有）の間の相同組換えが哺乳動物細胞では
容易には起らないことを示唆している。事実、約１００
，０００個（７） ＰＲＶ４２ ： ： ｐＢＳ６４ブ
ラークヲスクリーニングしても何ら黒いのは観察されな
かった。
６４による黒色プラークの形成が存在しないことは同じ
方向に反復する３４ｂｐｌｏｘ部位（しかし１ｂｐのミ
ス゛マツチ含有）の間の相同組換えが哺乳動物細胞では
容易には起らないことを示唆している。事実、約１００
，０００個（７） ＰＲＶ４２ ： ： ｐＢＳ６４ブ
ラークヲスクリーニングしても何ら黒いのは観察されな
かった。
反応混合物の他の狛を切り出された環状体を検出するた
め３１０．７％アガロースゲル上で操作した。Ｃｒｅと
反応させたＤＮＡの残る棒はＢｇｌ ｎおよびＥｃｏＲ
Ｉで消化し次にｐＢＢ６４の線状化により生ずる特徴的
″ｌｋ＆１ ｋｂ ＤＮＡフラグメントを検出するため
に０．７ ％アガロースゲル上で操作シた。観察された
３、１ｋｂのバンドを挿入反応に記載された方法で量で
表わした。ゲル分析による量化の結果および相当する形
質転換データも第２表に示す。さらに、もとの反応混合
物の４．５μｔを大腸菌ＨＢ １０１ 中に形質転換し
た（ＭａｎｄｅｌおよびＨｌ ｇａ氏による操作、注：
宿主制限（＝おいては欠乏しているｒ−大腸菌株を用い
ることが重要）。アンピシリン抵抗性細菌のコロニーが
得られるということがインビトロでＣｒｅにより切り出
された分子が事実環状であることの指標である。さらに
、ＰＲＶからの環状プラスミドＤＮＡの放出は哨乳動物
細胞で継代されたＤＮＡの有用な回収技術である。かか
る回収されたプラスミドはかくの如く哺乳動物細胞中で
起りうる何らかの突然変異性事象について容゛易信：分
析されうる。
め３１０．７％アガロースゲル上で操作した。Ｃｒｅと
反応させたＤＮＡの残る棒はＢｇｌ ｎおよびＥｃｏＲ
Ｉで消化し次にｐＢＢ６４の線状化により生ずる特徴的
″ｌｋ＆１ ｋｂ ＤＮＡフラグメントを検出するため
に０．７ ％アガロースゲル上で操作シた。観察された
３、１ｋｂのバンドを挿入反応に記載された方法で量で
表わした。ゲル分析による量化の結果および相当する形
質転換データも第２表に示す。さらに、もとの反応混合
物の４．５μｔを大腸菌ＨＢ １０１ 中に形質転換し
た（ＭａｎｄｅｌおよびＨｌ ｇａ氏による操作、注：
宿主制限（＝おいては欠乏しているｒ−大腸菌株を用い
ることが重要）。アンピシリン抵抗性細菌のコロニーが
得られるということがインビトロでＣｒｅにより切り出
された分子が事実環状であることの指標である。さらに
、ＰＲＶからの環状プラスミドＤＮＡの放出は哨乳動物
細胞で継代されたＤＮＡの有用な回収技術である。かか
る回収されたプラスミドはかくの如く哺乳動物細胞中で
起りうる何らかの突然変異性事象について容゛易信：分
析されうる。
第２表
ＰＲＹからのプラスミドＤＮＡのＣｒｅにより仲介され
た切り出し。指示されたＰＲＶ ＤＮＡを第３Ｂ図に記
載されるようにしてインビトロで処理した。
た切り出し。指示されたＰＲＶ ＤＮＡを第３Ｂ図に記
載されるようにしてインビトロで処理した。
ＰＫ１５細胞を１μｇのＤＮＡでトランスフェクション
させてウィルスストックを調製し、次？＝これを黒色プ
ラークアッセイにより分析した。インビトロでのＤＮＡ
組換え量は第３Ｂ図に示されるようＣ二切り出された線
状ｐＢｓ６４の量をＰＲＹの１＆２ｋｂ Ｂｇｌｎ Ｆ
’フラグメントに比較して測定することζ：より判定し
た。大腸菌ＨＢ１０１を、ｐＢｓ６４を含有するＤＮＡ
配列ｔ２ｎｇ（二相当する指示されたＰＲＶ４２： ：
ｐＢ８６４ ＤＮＡ １００ｎｇで形質転換した。平行
実験（：おいて、精製ｐＢｓ６４ ＤＮＡ １ｎｇは外
因性ＰＲＹ ＤＮＡの存在下でも非存在下でも１２００
偶のコロニーを生成した。
させてウィルスストックを調製し、次？＝これを黒色プ
ラークアッセイにより分析した。インビトロでのＤＮＡ
組換え量は第３Ｂ図に示されるようＣ二切り出された線
状ｐＢｓ６４の量をＰＲＹの１＆２ｋｂ Ｂｇｌｎ Ｆ
’フラグメントに比較して測定することζ：より判定し
た。大腸菌ＨＢ１０１を、ｐＢｓ６４を含有するＤＮＡ
配列ｔ２ｎｇ（二相当する指示されたＰＲＶ４２： ：
ｐＢ８６４ ＤＮＡ １００ｎｇで形質転換した。平行
実験（：おいて、精製ｐＢｓ６４ ＤＮＡ １ｎｇは外
因性ＰＲＹ ＤＮＡの存在下でも非存在下でも１２００
偶のコロニーを生成した。
ＰＲＶ−４２： ：
ｐＢｓ６４ ０１６００ ０ ０ １Ｐ
ＲＶ−４２： ： Ｂ８６４ ＋Ｃｒｅ １７９４ １４６８ ５６ ５７
４３４前出の実施例で用いられたものζ二代えて本発明
で一般的あるいは詳細に記載された反応体および／また
は操作条件を用いること（；より前出の実施例を反復し
て同様の成功を収めた。
ＲＶ−４２： ： Ｂ８６４ ＋Ｃｒｅ １７９４ １４６８ ５６ ５７
４３４前出の実施例で用いられたものζ二代えて本発明
で一般的あるいは詳細に記載された反応体および／また
は操作条件を用いること（；より前出の実施例を反復し
て同様の成功を収めた。
これまでの記載から、当業者が本発明の本質的な特徴を
容易に確認でき、そして本発明の精神および範囲から逸
脱することなく本発Ｆ！Ａ（二ｍ種の変化および改良を
加えて本発明を種々の使用法および条件に適合させるこ
とができる。
容易に確認でき、そして本発明の精神および範囲から逸
脱することなく本発Ｆ！Ａ（二ｍ種の変化および改良を
加えて本発明を種々の使用法および条件に適合させるこ
とができる。
本発明の態様を要約して示せば下記のとおりである。
１）ウィルスベクターのＤＮＡ中にＤＮＡセグメントを
部位特異的（二挿入することにより動物細胞Ｃ二とって
安定でかつ生存能力のある組換えウィルスベクターを調
製するに当たり、Ｃｒｅを前記動物細胞ウィルスベクタ
ーのＤＮＡ中（：導入された第１のｌｏｘ部位、および 環状でありかつ前記ＤＮＡセグメント５：隣接する第２
のｌａｘ部位を含有する別のＤＮＡ分子中の該第２のｌ
ｏｘ部位 と接触させ、それＣ：よりＣｒｅが前記第１の１０Ｘ部
位で前記環状ＤＮＡと前記ウィルスベクターＤＮＡとで
組換えを行い、かくして生存可能でありかつ安定である
組換え動物細胞ウィルスベクターを生成させることから
なる方法。
部位特異的（二挿入することにより動物細胞Ｃ二とって
安定でかつ生存能力のある組換えウィルスベクターを調
製するに当たり、Ｃｒｅを前記動物細胞ウィルスベクタ
ーのＤＮＡ中（：導入された第１のｌｏｘ部位、および 環状でありかつ前記ＤＮＡセグメント５：隣接する第２
のｌａｘ部位を含有する別のＤＮＡ分子中の該第２のｌ
ｏｘ部位 と接触させ、それＣ：よりＣｒｅが前記第１の１０Ｘ部
位で前記環状ＤＮＡと前記ウィルスベクターＤＮＡとで
組換えを行い、かくして生存可能でありかつ安定である
組換え動物細胞ウィルスベクターを生成させることから
なる方法。
２）前記第１のｌｏｘ部°位を含有する出発ウィルスベ
クターが前記組換えベクター中シーおける前記挿入され
たＤＮＡセグメントの存在を検出するのに使用されうる
マーカーを包含することからなる前記１項記載の方法。
クターが前記組換えベクター中シーおける前記挿入され
たＤＮＡセグメントの存在を検出するのに使用されうる
マーカーを包含することからなる前記１項記載の方法。
３）前記ＤＮＡセグメント、および前記第１のｌｏｘ部
位を含有する出発ウィルスベクターＤＮＡ 、の少なく
とも一方が組換えベクターを確認するのに有効なマーカ
ーを含有しており、かつ前記方法がさらに前記マーカー
を使用して前記組換えベクターを選択することからなる
前記１項記載の方法。
位を含有する出発ウィルスベクターＤＮＡ 、の少なく
とも一方が組換えベクターを確認するのに有効なマーカ
ーを含有しており、かつ前記方法がさらに前記マーカー
を使用して前記組換えベクターを選択することからなる
前記１項記載の方法。
４）前記ＤＮＡセグメントが前記マーカーを欠くことか
らなる前記３項記載の方法。
らなる前記３項記載の方法。
５）さら（：、前記接触工程Ｃ二先立ち、前記第１のｌ
ｏｘ部位を前記動物細胞ウィルスベクターのＤＮＡの非
必須領域中Ｃ二導入し、それＣ二より生存可能でありか
つ安定である組換えベクターを生成させることからなる
前記１項記載の方法。
ｏｘ部位を前記動物細胞ウィルスベクターのＤＮＡの非
必須領域中Ｃ二導入し、それＣ二より生存可能でありか
つ安定である組換えベクターを生成させることからなる
前記１項記載の方法。
６）前記ＤＮＡセグメントが異種、合成または外因性Ｄ
ＮＡであることからなる前記１項記載の方法。
ＮＡであることからなる前記１項記載の方法。
７）前記ＤＮＡセグメントが構造タンパク質、酵素、調
節分子、またはそれらの断片をコーディングすることか
らなる前記１項記載の方法。
節分子、またはそれらの断片をコーディングすることか
らなる前記１項記載の方法。
８）前記１０Ｘ部位のそれぞれがｌｏｘ Ｐ部位または
１ｏｘ０２部位であることからなる前記７項記載の方法
。
１ｏｘ０２部位であることからなる前記７項記載の方法
。
９）前記ウィルスベクターが５ｖ４０、ジュードラビー
ズウィルス（ＰＲＶ） 、ポリオーマウィルス、アデノ
ウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワ
タシニアウイルス、クシパピローマウィルス、エプスタ
イン−バールウィルス、バキュロウィルスまたはレトロ
ウィルスであることからなる前記１項記載の方法。
ズウィルス（ＰＲＶ） 、ポリオーマウィルス、アデノ
ウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワ
タシニアウイルス、クシパピローマウィルス、エプスタ
イン−バールウィルス、バキュロウィルスまたはレトロ
ウィルスであることからなる前記１項記載の方法。
１０） 前記ウィルスベクターが、そのｇｌｌ遺伝子
中Ｃ二前記第１のＩＯＸ部位を含有するジュードラビー
ズウィルス（ＰＲＶ）であることからなる前記２項記載
の方法。
中Ｃ二前記第１のＩＯＸ部位を含有するジュードラビー
ズウィルス（ＰＲＶ）であることからなる前記２項記載
の方法。
１１）前記第１のｌｏｘ部位が１ＯＸ０２部位であるこ
とからなる前記１０項記載の方法。
とからなる前記１０項記載の方法。
１２）前記ウィルスベクターがＰＲＶ４２であることか
らなる前記１１項記載の方法。
らなる前記１１項記載の方法。
１３）さらＣ二、前記組換え動物細胞ウィルスベクター
を黒色プラークアッセイにおいて白色プラークＩ：つい
てスクリーニングすること（二より選択することからな
る前記１０項記載の方法。
を黒色プラークアッセイにおいて白色プラークＩ：つい
てスクリーニングすること（二より選択することからな
る前記１０項記載の方法。
１４） さらＣ＝、前記組換え動物細胞ウィルスベク
ターを黒色プラークアッセイにおいて白色プラーク（二
ついてスクリーニングすることＣ：より選択することか
らなる前記１２項記載の方法。
ターを黒色プラークアッセイにおいて白色プラーク（二
ついてスクリーニングすることＣ：より選択することか
らなる前記１２項記載の方法。
１５）前記ＤＮＡセグメントが前記組換えベクターを確
認するのＣ二有効なマーカーを欠いていることからなる
前記１４項記載の方法。
認するのＣ二有効なマーカーを欠いていることからなる
前記１４項記載の方法。
１６）そのＤＮＡ中シ＝１０ｘ部位が導入された生存可
能な、安定した動物細胞ウィルスベクター。
能な、安定した動物細胞ウィルスベクター。
１７）そのウィルスが８Ｖ４０．ジュードラビーズウィ
ルス（ＰＲＶ） 、ポリオーマウィルス、アデノウィル
ス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワタシニ
アウイルス、ウシパピローマウィルス、エプスタイン−
パールウィルス、バキュロウィルスまたはレトロウィル
スであることからなる前記１６項記載のベクター。
ルス（ＰＲＶ） 、ポリオーマウィルス、アデノウィル
ス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワタシニ
アウイルス、ウシパピローマウィルス、エプスタイン−
パールウィルス、バキュロウィルスまたはレトロウィル
スであることからなる前記１６項記載のベクター。
１８）そのｇｍ遺伝子中Ｅ ｌｏ：ｃ部位を含有するＰ
ＲＶであることからなる前記１６項記載のベクター〇 １９−） ＰＲＶ４２である前記１８項記載のベクタ
ー。
ＲＶであることからなる前記１６項記載のベクター〇 １９−） ＰＲＶ４２である前記１８項記載のベクタ
ー。
２０）前記１項記載の方法により生成された組換え動物
細胞ウィルスベクター。
細胞ウィルスベクター。
２１）前記３項記載の方法により生成された組換え動物
細胞ウィルスベクター。
細胞ウィルスベクター。
２２）前記４項記載の方法３二より生成された組換え動
物細胞ウィルスベクター。
物細胞ウィルスベクター。
２３） 前記１０項記載の方法により生成された組換
え動物細胞ウィルスベクター。
え動物細胞ウィルスベクター。
２４）前記１２項記載の方法により生成された組換え動
物細胞ウィルスベクター。
物細胞ウィルスベクター。
２５）前記２０項記載のウィルスベクターでトランスフ
ェクションされた動物細胞。
ェクションされた動物細胞。
２６） 外来ＤＮＡセグメントを動物細胞中で発現さ
せるにあたり、該細胞を該ＤＮＡセグメントを含有する
前記２０項記載のウィルスベクターに感染させることか
らなる方法。
せるにあたり、該細胞を該ＤＮＡセグメントを含有する
前記２０項記載のウィルスベクターに感染させることか
らなる方法。
２７）外来ＤＮＡセグメントを動物細胞中で発現させる
１二あたり、該細胞を該ＤＮＡセグメントを含有する前
記２４項記載のウィルスベクターに感染させることから
なる方法。
１二あたり、該細胞を該ＤＮＡセグメントを含有する前
記２４項記載のウィルスベクターに感染させることから
なる方法。
第１図はｇｍ−１ｏｘＣ２遺伝子が構成される径路の一
つを示す。 第２図は大腸菌中におけるＣｒｏ−ｇｌｌ融合タンパク
質の合成を証明する写真である。 第３Ａ図はＰＲＶ４２中へのｐＢ８６４の組み込みを示
す写真である。 第３Ｂ図はＰＲＶ４２：：ｐＢｓ６４からのｐＢ８６４
の切り出しを示す写真である。 第３Ｃ図は環状プラスミドｐＢｓ６４およびＰＲＶ４２
ケノム間のＣｒｅ Ｃより仲介されたインビトロでの組
換えを示す。 第４図は１個のＩＯＸ Ｐ部位を有するプラスミドｐＢ
ｓ６４を示す。 ９７．４− →飢ダ ・ Ｆ Ｉ Ｇ、 ２ Ｆ’ＩＣ，３Ａ１．−□。、３Ｂ ＦＩＧ、３Ｃ ３３，９ｋｂ
つを示す。 第２図は大腸菌中におけるＣｒｏ−ｇｌｌ融合タンパク
質の合成を証明する写真である。 第３Ａ図はＰＲＶ４２中へのｐＢ８６４の組み込みを示
す写真である。 第３Ｂ図はＰＲＶ４２：：ｐＢｓ６４からのｐＢ８６４
の切り出しを示す写真である。 第３Ｃ図は環状プラスミドｐＢｓ６４およびＰＲＶ４２
ケノム間のＣｒｅ Ｃより仲介されたインビトロでの組
換えを示す。 第４図は１個のＩＯＸ Ｐ部位を有するプラスミドｐＢ
ｓ６４を示す。 ９７．４− →飢ダ ・ Ｆ Ｉ Ｇ、 ２ Ｆ’ＩＣ，３Ａ１．−□。、３Ｂ ＦＩＧ、３Ｃ ３３，９ｋｂ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ウイルスベクターのＤＮＡ中にＤＮＡセグメントを
部位特異的に挿入することにより動物細胞にとつて安定
でかつ生存能力のある組換えウイルスベクターを調製す
るに当たり、Ｃｒｅを 前記動物細胞ウイルスベクターのＤＮＡ中に導入された
第１のｌｏｘ部位、および 環状でありかつ前記ＤＮＡセグメントに隣接する第２の
ｌｏｘ部位を含有する別のＤＮＡ分子中の該第２のｌｏ
ｘ部位 と接触させ、それによりＣｒｅが前記第１のｌｏｘ部位
で前記環状ＤＮＡと前記ウイルスベクターＤＮＡとで組
換えを行い、かくして生存可能でありかつ安定である組
換え動物細胞ウイルスベクターを生成させることからな
る方法。 ２）そのＤＮＡ中にｌｏｘ部位が導入された生存可能な
、安定した動物細胞ウイルスベクター。 ３）請求項１記載の方法により生成された組換え動物細
胞ウイルスベクター。 ４）請求項５記載のウイルスベクターでトランスフエク
シヨンされた動物細胞。 ５）外来ＤＮＡセグメントを動物細胞中で発現させるに
あたり、該細胞を該ＤＮＡセグメントを含有する請求項
５記載のウイルスベクターに感染させることからなる方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7714587A | 1987-07-21 | 1987-07-21 | |
| US077,145 | 1987-07-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01112986A true JPH01112986A (ja) | 1989-05-01 |
Family
ID=22136338
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63179319A Pending JPH01112986A (ja) | 1987-07-21 | 1988-07-20 | 組換えウイルスベクター |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0300422B1 (ja) |
| JP (1) | JPH01112986A (ja) |
| KR (1) | KR890002404A (ja) |
| AT (1) | ATE83008T1 (ja) |
| AU (1) | AU610608B2 (ja) |
| DE (1) | DE3876327D1 (ja) |
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