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JP7721637B2 - トランスサイレチン遺伝子における認識配列に対する特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼ - Google Patents

トランスサイレチン遺伝子における認識配列に対する特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼ

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JP7721637B2 JP2023512371A JP2023512371A JP7721637B2 JP 7721637 B2 JP7721637 B2 JP 7721637B2 JP 2023512371 A JP2023512371 A JP 2023512371A JP 2023512371 A JP2023512371 A JP 2023512371A JP 7721637 B2 JP7721637 B2 JP 7721637B2
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Description

本発明は、腫瘍学、分子生物学および組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子内の認識配列に対する特異性を有する、最適化された操作されたメガヌクレアーゼに関する。そのような操作されたメガヌクレアーゼは、トランスサイレチンアミロイドーシスを処置するための方法において有用である。
ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年８月２０日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１０９０７００３４ＷＯ００－ＳＥＱ－ＥＰＧと名付けられ、サイズは５９，８７６バイトである。
トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）は、アミロイド原線維の生成および沈着が身体の様々な組織および器官系において生じる、進行性アミロイド型の疾患である。通常、ＴＴＲタンパク質は、チロキシンおよびレチノールの輸送を担う血清／血漿および脳脊髄液タンパク質である。これは、主に肝臓や脳の脈絡叢によって合成され、ヒトの網膜ではわずかに合成される。肝臓で合成されたＴＴＲは血液中に分泌され、脈絡叢起源のＴＴＲは脳脊髄液に向かう。
ＴＴＲ疾患は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）タンパク質における１００を超える既知の点突然変異によって引き起こされる。これらの点突然変異は、タンパク質のミスフォールディングおよびアミロイド原線維の形成をもたらす。ＡＴＴＲ疾患は、ミスフォールドタンパク質の凝集によって引き起こされ、この凝集は、ＴＴＲタンパク質の機能の喪失ではなく、むしろニューロンおよび細胞の機能不全を引き起こすと考えられる。主に、神経障害性ＡＴＴＲ、軟膜ＡＴＴＲおよび心臓ＡＴＴＲを含む３つの形態の疾患が存在する。さらに、ＡＴＴＲは、比較的一般的な障害である、老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）および家族性アミロイド心疾患（ＦＡＣ）に関連する。最近の疫学的研究は、ＴＴＲ関連ＳＳＡ障害が高齢集団の２５％もの人々に影響を及ぼし得ることを示している（非特許文献１）。生化学的には、ＴＴＲが、ＦＡＰ患者のアミロイド沈着物における主要なタンパク質成分として特定された（非特許文献２）。
後に、タンパク質の位置３０（Ｖ３０Ｍ）でのバリンの代わりのメチオニンが、疾患を引き起こす最も一般的な分子欠陥であることが見出されたことが発見された（非特許文献３）。ＦＡＰでは、ＴＴＲ凝集物およびアミロイド原線維の広範な全身性細胞外沈着が、結合組織全体にわたって、特に末梢神経系において生じる（非特許文献４）。ＴＴＲ沈着後、直径の小さい無髄線維および有髄線維から始まって軸索変性が生じ、最終的には神経節部位におけるニューロン喪失をもたらす。
この疾患の神経障害型は、末梢神経系および自律神経系に影響を及ぼし、末梢神経障害および身体機能の制御の低下（とりわけ、性的インポテンス、下痢、便秘、排尿の問題および起立性低血圧を含む）をもたらす。さらに、腎臓、眼、および手首（手根管症候群）の問題が一般的である。軟髄膜におけるＴＴＲタンパク質の蓄積は、脳卒中および脳内出血、水頭症、運動失調、痙性麻痺、発作、認知症、および様々な眼障害を引き起こし得る。心臓アミロイドーシス患者は、不整脈、心臓肥大、または起立性高血圧を呈し、心不全および死亡につながる可能性がある。
ＴＴＲアミロイドーシスは、典型的には、診断または症状の発現から１０年以内に死亡に至り、最近まで、不治であると考えられていた。肝臓は典型的にはアミロイド形成性ＴＴＲの源であるため、肝臓移植は、家族性症例において疾患関連対立遺伝子を野生型（ＷＴ）対立遺伝子によって置き換える有効な手段となり得る。肝臓移植は遺伝子治療の一形態として有効であるが、問題がないわけではない。移植は、レシピエントおよびドナーに対する侵襲的手術の必要性、長期にわたる移植後免疫抑制療法、ドナーの不足、高コスト、ならびに進行した疾患増悪のために良好な候補ではない多数のＴＴＲ患者によって複雑化する。残念ながら、心臓アミロイドーシスは、ＷＴ ＴＴＲがしばしば沈着し続けるため、肝臓移植後でさえも一部の家族性患者において進行する。移植は、ＷＴ ＴＴＲの沈着のために８０歳を超える者のおよそ２５％が罹患している、最も一般的なＴＴＲ疾患である老年性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）には実行可能な選択肢ではない。
開発中のＡＴＴＲのための代替的な処置選択肢としては、例えば、特許文献１に記載されるようなアンチセンス技術、および、非特許文献５によって説明されているような脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）封入ｓｉＲＮＡパチシランが挙げられる。加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集システムが、マウスにおける血清ＴＴＲレベルを低減するために使用されている（非特許文献６を参照されたい）。これらの最近の取り組みにもかかわらず、ＡＴＴＲ疾患を有する患者においてＴＴＲレベルの安定した低減を達成する代替療法が依然として必要とされている。
したがって、操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（「メガヌクレアーゼ」とも呼ばれる）を使用してＴＴＲレベルの低減を達成するための方法および組成物が本明細書に記載される。ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物および真菌のゲノムに一般的に見られる１５～４０塩基対の切断部位を認識する天然に存在するヌクレアーゼのグループである。それらはしばしば、グループ１自己スプライシングイントロンおよびインテイン等の寄生性ＤＮＡエレメントに関連する。それらは、染色体に二本鎖切断を生成することによって、宿主ゲノムの特定の位置で相同組換えまたは遺伝子挿入を自然に促進し、これにより細胞のＤＮＡ修復機構が動員される（非特許文献７）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、一般に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ－ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフのいずれか１つまたは２つのコピーを有することを特徴とする（非特許文献８を参照されたい）。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフの単一のコピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフの２つのコピーを有するメンバーはモノマーとして見出される。ホーミングエンドヌクレアーゼを生成するための方法は、当技術分野で公知である。
Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）は、藻類クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の葉緑体染色体中の２２塩基対認識配列を認識してそれを切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーである。野生型Ｉ－ＣｒｅＩ切断部位の優先性を改変するために、遺伝子選択技術が使用された（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１、非特許文献１２）。哺乳動物、酵母、植物、細菌およびウイルスゲノムの部位を含む広く多様なＤＮＡ部位を標的とするように、Ｉ－ＣｒｅＩおよび他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計するための方法が説明された（特許文献２）。
特許文献３に最初に記載されているように、Ｉ－ＣｒｅＩおよびその操作された誘導体は通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末端に結合する短いペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに融合され得る（非特許文献１３；非特許文献１４）。したがって、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼが、単一の転写物から発現することができる。これにより、操作されたメガヌクレアーゼで観察される標的外切断の極めて低い頻度と相まって、それらは本発明にとって好ましいエンドヌクレアーゼとなる。
したがって、本発明は、当該分野における、ＡＴＴＲまたは他のＴＴＲ関連疾患を処置するための遺伝子治療アプローチの必要性を満たす。
米国特許出願公開第２０１１／０２９４８６８号公報 国際公開ＷＯ２００７／０４７８５９号公報 国際公開ＷＯ２００９／０５９１９５号公報
Ｔａｎｓｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ Ｍｅｄ．２００８；４０（３）：２３２－９ Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９７８，７５：４４９９－４５０３ Ｓａｒａｉｖａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８４，７４：１０４－１１９ Ｓｏｕｓａ ａｎｄ Ｓａｒａｉｖａ，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２００３，７１：３８５－４００ Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ １０：１０９，ｐｐ．１－９（２０１５） Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２２，ｐｐ．２２２７－２２３５（２０１８） Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５ Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７－３７７４ Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１ Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８ Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９ Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２ Ｇｒｉｚｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９
本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子のエクソン１またはエクソン３中の認識配列（例えば、マウス、ヒトおよび非ヒト霊長類のＴＴＲ遺伝子において保存されているＴＴＲ １５－１６認識配列（配列番号７）またはＴＴＲ ５－６認識配列（配列番号９））に結合しそれを切断する、操作されたメガヌクレアーゼを提供する。本明細書で開示される操作されたメガヌクレアーゼによる認識配列における切断は、切断部位における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に起因してＴＴＲの発現を改変することができる。ＮＨＥＪは、遺伝子発現に干渉し得る挿入、欠失またはフレームシフト突然変異をもたらし得る。あるいは、目的の配列を、相同組換えによってＴＴＲ遺伝子に導入することができる。したがって、正常な遺伝子発現を中断することによって、内因性ＴＴＲポリペプチドの発現を本明細書に開示される方法に従って低減することができる。したがって、そのようなメガヌクレアーゼは、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）または他のＴＴＲ関連疾患、例えば老年性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）または家族性アミロイド心疾患（ＦＡＣ）を有する個体におけるＴＴＲポリペプチドレベルを低減するのに有用である。したがって、本発明はまた、ＡＴＴＲまたは他のＴＴＲ関連疾患を有する対象を処置するための医薬組成物および方法であって、ＴＴＲ遺伝子内に配列番号７または９を含む認識配列に対する特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼを利用する医薬組成物および方法を提供する。
したがって、一態様において、本発明は、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子内の認識配列を認識してそれを切断する操作されたメガヌクレアーゼであって、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、上記第１のサブユニットは、上記認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、上記第２のサブユニットは、上記認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、操作されたメガヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態において、認識配列は、配列番号７を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。
ある特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基４８，５０、および７１～７３に対応する１つまたは複数の残基を含む。
ある特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２４～７９を含む。
特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基７～１５３に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１１～１４のいずれか１つの残基７～１５３に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。
いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基１９および１３９に対応する残基を含む。
ある特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。
いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか一つの残基８０に対応する残基を含む。特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基７～１５３を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個のアミノ酸置換を有する配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つまたは複数の残基を含む。ある特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。
ある特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。
特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つのいずれか１つの残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１１～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。
ある特定の実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１のいずれか１つの残基２７１に対応する残基を含む。
特定の実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基７～１５３に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、第２のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、第１のサブユニットおよび／または第２のサブユニットは、配列番号１１～１４のいずれか１つのそれぞれ残基７～１５３および残基１９８～３４４に対する最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を含み得る。
ある特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを共有結合する。
特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１１～１４のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１１～１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６６～６９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６６～６９のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、認識配列は、配列番号９を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１５の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。
ある特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４～７９を含む。
特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第１のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１５の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。
ある特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基８０に対応する残基を含む。
特定の実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基７～１５３を含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１５の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する１つまたは複数の残基を含む。ある特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６および２６８に対応する残基を含む。
ある特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。
特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２３９、２４１および２６３～２６５に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２３９、２４１および２６３～２６５に対応する残基を含む。
特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５～２７０を含む。
いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、第２のサブユニットは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を有する配列番号１５の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２１０に対応する残基を含む。
ある特定の実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２７１に対応する残基を含む。
特定の実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基１９８～３４４を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１５の残基７～１５３に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基１９８～３４４に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、第１のサブユニットおよび／または第２のサブユニットは、配列番号１５のそれぞれ残基７～１５３および残基１９８～３４４に対する最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸置換を含み得る。
ある特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを共有結合する。
いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７０の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７０の核酸配列によってコードされる。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡコンストラクトを提供する。
ある特定の実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトは、本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスをコードする。いくつかの態様において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。特定の態様において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡコンストラクトによってコードされる組換えＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型を有する。いくつかの実施形態において、上記核酸配列は、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモータ配列を含む。いくつかの実施形態において、プロモータは、肝臓特異的プロモータである。いくつかの実施形態において、肝臓特異的プロモータは、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、ヒトアルファ－１アンチトリプシンプロモータ、ハイブリッド肝臓特異的プロモータ、またはアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータを含む。
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを提供する。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型を有する。
別の態様において、本発明は、遺伝子改変真核細胞の染色体中に妨害された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を生成するための方法であって、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入するステップであって、操作されたメガヌクレアーゼは真核細胞において発現されるステップを含み；操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または９を含む認識配列で染色体に切断部位を生成し、標的配列は、上記切断部位での非相同末端結合によって改変される、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、方法は、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない改変されたＴＴＲ遺伝子を生成する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞における内因性ＴＴＲポリペプチドのレベルを、参照レベルに対して少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％低減するのに有効である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲポリペプチドレベルは、参照レベルに対して約１～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％または７０％～８０％低減される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。１つのそのような実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。一実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞である。ある特定の実施形態において、肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。
いくつかの実施形態において、核酸は、ｍＲＮＡまたは組換えウイルスによって真核細胞に導入される。１つのそのような実施形態において、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にパッケージングされる。別のそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
別の態様において、本発明は、遺伝子改変真核細胞の染色体中に妨害された標的配列を有する遺伝子改変真核細胞を生成するための方法であって、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼを真核細胞に導入するステップを含み；操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または９を含む認識配列で染色体に切断部位を生成し、標的配列は、切断部位での非相同末端結合によって改変される、方法を提供する。
１つの実施形態において、方法は、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない改変されたＴＴＲ遺伝子を生成する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞における内因性ＴＴＲポリペプチドの発現を低減し、それにより、ＴＴＲポリペプチドレベルを、参照レベルに対して少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％低減するのに有効である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲポリペプチドレベルは、参照レベルに対して約１～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％または７０％～８０％低減される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。
別の態様において、本発明は、遺伝子改変真核細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む上記遺伝子改変真核細胞を生成する方法であって、（ａ）本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼをコードする第１の核酸配列であって、操作されたメガヌクレアーゼは真核細胞において発現される、第１の核酸配列と；（ｂ）上記目的の配列を含む第２の核酸配列とを含む１つまたは複数のポリヌクレオチドを真核細胞に導入するステップを含み；操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または９を含む認識配列で染色体に切断部位を生成し；目的の配列は、上記切断部位で上記染色体に挿入される、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、第２の核酸配列は、上記切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列をさらに含み、上記目的の配列は、相同組換えによって上記切断部位に挿入される。
いくつかの実施形態において、方法は、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない改変されたＴＴＲ遺伝子を生成する。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、方法は、細胞における内因性ＴＴＲポリペプチドの発現を低減し、それにより、ＴＴＲポリペプチドレベルを、参照レベルに対して少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはそれ以上低減するのに有効である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲポリペプチドレベルは、参照レベルに対して約１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、または７０％～８０％、またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは組換えウイルスによって真核細胞に導入される。１つのそのような実施形態において、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にパッケージングされる。別のそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、第２の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、組換えウイルスによって真核細胞に導入される。１つのそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
別の態様において、本発明は、遺伝子改変真核細胞の染色体に挿入された目的の外因性配列を含む上記遺伝子改変真核細胞を生成する方法であって、（ａ）本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼ真核細胞に導入するステップと、（ｂ）目的の配列を含む核酸配列を含むポリヌクレオチドを真核細胞に導入するステップとを含み、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または９を含む認識配列で染色体に切断部位を生成し目的の配列は、切断部位で染色体に挿入される、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列をさらに含み、目的の配列は、相同組換えによって切断部位に挿入される。いくつかの実施形態において、方法は、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない改変されたＴＴＲ遺伝子を生成する。いくつかの実施形態において、方法は、細胞におけるＴＴＲポリペプチドレベルを、参照レベルに対して少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはそれ以上低減するのに有効である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲポリペプチドレベルは、参照レベルに対して約１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは組換えウイルスによって真核細胞に導入される。１つのそのような実施形態において、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にパッケージングされる。別のそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
別の態様において、本発明は、改変ＴＴＲ遺伝子を含む遺伝子改変真核細胞を生成するための方法であって、真核細胞に、（ａ）ＴＴＲ遺伝子内の認識配列に対する特異性を有する操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、上記操作されたヌクレアーゼは真核細胞において発現される、ポリヌクレオチド；または（ｂ）ＴＴＲ遺伝子内の認識配列に対する特異性を有する操作されたヌクレアーゼを導入するステップを含み、操作されたヌクレアーゼは、認識配列内に切断部位を生成し、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない改変ＴＴＲ遺伝子を生じさせる、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、改変ＴＴＲ遺伝子は、エクソン１またはエクソン３内に挿入または欠失を含む。
いくつかの実施形態において、挿入または欠失は、操作されたヌクレアーゼ切断部位に導入される。
いくつかの態様において、操作されたヌクレアーゼは、配列番号７または９を含む認識配列に対する特異性を有する操作されたヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、配列番号７を含む認識配列に対する特異性を有する。他の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、配列番号９を含む認識配列に対する特異性を有する。
いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態において、方法は、細胞におけるＴＴＲポリペプチドレベルを、参照レベルに対して少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはそれ以上低減するのに有効である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲポリペプチドレベルは、参照レベルに対して約１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞等の肝臓細胞である。いくつかの実施形態において、肝臓細胞または肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。いくつかの実施形態において、肝臓細胞は、肝前駆細胞または幹細胞である。
いくつかの実施形態において、方法は、インビトロで実行される。いくつかの実施形態において、方法は、インビボで実行される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、組換えＤＮＡコンストラクトである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって上記真核細胞に導入される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは組換えウイルスによって真核細胞に導入される。１つのそのような実施形態において、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にパッケージングされる。別のそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
別の態様において、本発明は、本発明の任意の方法によって調製された遺伝子改変真核細胞を提供する。
別の態様において、本発明は、改変ＴＴＲ遺伝子を含む遺伝子改変真核細胞であって、上記改変ＴＴＲ遺伝子は、配列番号７または配列番号９内の操作されたメガヌクレアーゼ切断部位における挿入または欠失を含み、上記改変ＴＴＲ遺伝子は、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない、遺伝子改変真核細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真核細胞は、参照レベルに対して少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはそれ以上のＴＴＲポリペプチドレベルの低減を有する。いくつかの実施形態において、ＴＴＲポリペプチドレベルは、参照レベルに対して約１％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態において、真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞等の肝臓細胞である。いくつかの実施形態において、肝臓細胞または肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。いくつかの実施形態において、肝臓細胞は、肝前駆細胞または幹細胞である。
別の態様において、本発明は、改変ＴＴＲ遺伝子を含む霊長類の肝臓内の遺伝子改変真核細胞であって、改変ＴＴＲ遺伝子は、エクソン１またはエクソン３内に挿入または欠失を含み、上記改変ＴＴＲ遺伝子は、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない、遺伝子改変真核細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、挿入または欠失は、操作されたヌクレアーゼ切断部位に位置する。いくつかの実施形態において、挿入または欠失は、エクソン３内にある。ある特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼ切断部位は、配列番号７を含む操作されたメガヌクレアーゼ認識配列内にある。
いくつかの実施形態において、挿入または欠失は、エクソン１内にある。ある特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼ切断部位は、配列番号９を含む操作されたメガヌクレアーゼ認識配列内にある。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真核細胞は、参照レベルに対して少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはそれ以上のＴＴＲポリペプチドレベルの低減を有する。いくつかの実施形態において、ＴＴＲポリペプチドレベルは、参照レベルに対して約１～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真核細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞等の肝臓細胞である。いくつかの実施形態において、肝臓細胞または肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。いくつかの実施形態において、肝臓細胞は、肝前駆細胞または幹細胞である。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変真核細胞は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体と、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼ、または任意のそのような操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。１つのそのような実施形態において、ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子内にパッケージングされる。
医薬組成物のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、ポリヌクレオチドを含む組換えＤＮＡコンストラクトを含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを含む。いくつかのそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または１×１０１４ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ（例えば、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
医薬組成物のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を有する対象を処置するためのものである。
別の態様において、本発明は、対象におけるＴＴＲレベルを低減するための方法であって、本発明の任意の操作されたメガヌクレアーゼ、または操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを対象における標的細胞に送達するステップを含み、参照レベルに対して対象におけるＴＴＲレベルを低減するのに有効である方法を提供する。
方法のいくつかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態において、肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に封入され、脂質ナノ粒子は、対象の標的細胞に送達される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを使用して標的細胞に送達される。いくつかのそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または１×１０１４ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが、対象に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが、対象に投与される。いくつかの実施形態において、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが、対象に投与される。ある特定の実施形態において、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ（例えば、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが、対象に投与される。
いくつかの実施形態において、循環ＴＴＲレベルが、参照対照に対して対象において低減される。
いくつかの実施形態において、対象の１つまたは複数の器官におけるレベルが低減される。いくつかの実施形態において、器官は、脳、心臓、腎臓、眼、大腸、小腸、肝臓、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲレベルが、参照対照に対して対象の１つまたは複数の組織において低減される。いくつかの実施形態において、組織は、神経組織、筋肉組織、結合組織、または髄膜の組織、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかのそのような実施形態において、ＴＴＲのレベルは、参照対照に対して約１０％～約８０％低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲのレベルは、参照レベルに対して約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、またはそれ以上低減される。いくつかのそのような実施形態において、ＴＴＲのレベルは、参照レベルに対して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成が、参照対照に対して対象において低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成は、参照対照に対して約１０％～約１００％低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成は、参照レベルに対して約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成は、参照レベルに対して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。
別の態様において、本発明は、ＴＴＲアミロイドーシスまたはＴＴＲ関連疾患の処置を必要とする対象におけるＴＴＲアミロイドーシスまたはＴＴＲ関連疾患を処置するための方法であって、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを上記対象における標的細胞に送達するステップを含み、上記操作されたメガヌクレアーゼは、上記標的細胞において発現され、上記操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または配列番号９を含む認識配列でＴＴＲ遺伝子に切断部位を生成し、上記ＴＴＲ遺伝子の発現は、上記切断部位での非相同末端結合によって妨害される、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、方法は、有効量の本発明の任意の医薬組成物を対象に投与するステップを含む。
いくつかの実施形態において、方法は、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない標的細胞における改変されたＴＴＲ遺伝子を生成する。いくつかの実施形態において、標的細胞による完全長内因性ＴＴＲタンパク質の発現は、対照細胞と比較して低減される。いくつかの実施形態において、完全長内因性ＴＴＲタンパク質の発現は、対照対象に対して対象において低減される。
方法のいくつかの実施形態において、標的細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞から選択される。特定の実施形態において、哺乳動物細胞は、肝細胞等の肝臓細胞である。いくつかの実施形態において、肝細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスの肝臓内にある。いくつかの実施形態において、肝臓細胞は、肝前駆細胞または幹細胞である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（すなわち組換えＤＮＡコンストラクト）である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子に封入され、脂質ナノ粒子は、対象の標的細胞に送達される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスにより標的細胞に送達される。いくつかのそのような実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、または組換えＡＡＶである。特定の実施形態において、組換えウイルスは、組換えＡＡＶである。
いくつかの実施形態において、方法は、参照レベルに対して対象におけるＴＴＲレベルを低減するのに有効である。
いくつかの実施形態において、循環ＴＴＲレベルが、参照対照に対して対象において低減される。
いくつかの実施形態において、対象の１つまたは複数の器官におけるＴＴＲレベルが、参照対照に対して低減される。いくつかの実施形態において、器官は、脳、心臓、腎臓、眼、大腸、小腸、肝臓、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲレベルが、参照対照に対して対象の１つまたは複数の組織において低減される。いくつかの実施形態において、組織は、神経組織、筋肉組織、結合組織、または髄膜の組織、またはそれらの組み合わせを含む。
いくつかのそのような実施形態において、ＴＴＲのレベルは、参照対照に対して約１０％～約８０％低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲのレベルは、参照レベルに対して約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、または７０％～８０％低減される。いくつかのそのような実施形態において、ＴＴＲのレベルは、参照レベルに対して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、またはそれ以上低減される。
いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成が、参照対照に対して対象において低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成は、参照対照に対して約１０％～約１００％低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成は、参照レベルに対して約１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％低減される。いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成は、参照レベルに対して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒト対象である。
いくつかの実施形態において、対象は、末梢神経系、自律神経系、軟膜または心臓を含む１つまたは複数の組織に影響を及ぼすＴＴＲ遺伝子における突然変異を有する。
いくつかの実施形態において、対象は、Ｇｌｙ６Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１０Ａｒｇ、Ｌｅｕ１２Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８Ｇｌｙ、Ｖａｌ２０Ｉｌｅ、Ａｌａ２５Ｔｈｒ、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｖａｌ３０Ａｌａ、Ｖａｌ３０Ｌｅｕ、Ｖａｌ３０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ３３Ｌｅｕ、Ａｌａ３６Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４２Ｇｌｙ、Ｐｈｅ４４Ｓｅｒ、Ａｌａ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｇｌｙ４７Ａｌａ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｔｈｒ４９Ａｌａ、Ｓｅｒ５０Ａｒｇ、Ｓｅｒ５０Ｉｌｅ、Ｇｌｙ５３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ５５Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５８Ｈｉｓ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｔｈｒ６０Ａｌａ、Ｇｌｕ６１Ｌｙｓ、Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｐｈｅ６４Ｓｅｒ、Ｉｌｅ６８Ｌｅｕ、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓ、Ｌｙｓ７０Ａｓｎ、Ｖａｌ７１Ａｌａ、Ｓｅｒ７７Ｔｙｒ、Ｉｌｅ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ８９Ｇｌｎ、Ｈｉｓ９０Ａｓｎ、Ａｌａ９７Ｇｌｙ、Ａｌａ９７Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、Ａｌａ１０９Ｔｈｒ、Ａｌａ１０９Ｖａｌ、Ｌｅｕ１１１Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１１４Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１１４Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１１６Ｖａｌ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ、Ｖａｌ１２２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１２２Ｄｅｌ、またはそれらの組み合わせを含むＴＴＲポリペプチドをコードするＴＴＲ遺伝子における突然変異を有する。
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼを提供する。本発明はさらに、疾患の処置を必要とする対象（例えば、トランスサイレチンアミロイドーシスを有する対象）における疾患を処置するための、および／または対象におけるＴＴＲのレベルを低減するための医薬の製造における、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、医薬として使用するためのポリヌクレオチドであって、本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに、疾患の処置を必要とする対象（例えば、トランスサイレチンアミロイドーシスを有する対象）における疾患を処置するための、および／または対象におけるＴＴＲのレベルを低減するための医薬の製造における、ポリヌクレオチドの使用を提供する。
別の態様において、本発明は、対象における標的細胞においてＴＴＲ遺伝子を改変するための方法を提供し、この方法は、標的細胞に、（ａ）本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、操作されたメガヌクレアーゼは標的細胞において発現される、ポリヌクレオチド；または（ｂ）本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼを送達するステップを含み、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７または配列番号９を含む認識配列でＴＴＲ遺伝子に切断部位を生成し、標的細胞において改変されたＴＴＲ遺伝子を生じさせる。
いくつかの実施形態において、切断部位は、非相同末端結合によって修復され、改変ＴＴＲ遺伝子は、コードされたＴＴＲタンパク質の発現を妨害する挿入または欠失を含む。
いくつかの実施形態において、改変ＴＴＲ遺伝子は、完全長内因性ＴＴＲタンパク質をコードしない。
いくつかの実施形態において、標的細胞による完全長内因性ＴＴＲタンパク質の発現は、対照細胞と比較して低減される。
いくつかの実施形態において、完全長内因性ＴＴＲタンパク質の発現は、対照対象に対して対象において低減される。
いくつかの実施形態において、対象は、哺乳動物である。
いくつかの態様において、標的細胞は、肝臓細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は、肝前駆細胞または幹細胞である。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のｍＲＮＡ等のｍＲＮＡである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の組換えＤＮＡコンストラクト等の組換えＤＮＡコンストラクトである。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子によって標的細胞に送達される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の任意の組換えウイルス等の組換えウイルスによって標的細胞に送達される。
いくつかの実施形態において、改変ＴＴＲ遺伝子を含む標的細胞は、対象細胞と比較して、低減されたレベルの完全長内因性ＴＴＲタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、標的細胞におけるＴＴＲ遺伝子の改変後、対照対象と比較して、低減された血清レベルの完全長内因性ＴＴＲタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、標的細胞におけるＴＴＲ遺伝子の改変後、対照対象と比較して、ＡＴＴＲまたはＴＴＲ関連疾患の１つまたは複数の症状の低減を示す。
いくつかの実施形態において、対象は、末梢神経系、自律神経系、軟膜または心臓を含む１つまたは複数の組織に影響を及ぼすＴＴＲ遺伝子における突然変異を有する。
いくつかの実施形態において、対象は、Ｇｌｙ６Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１０Ａｒｇ、Ｌｅｕ１２Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８Ｇｌｙ、Ｖａｌ２０Ｉｌｅ、Ａｌａ２５Ｔｈｒ、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｖａｌ３０Ａｌａ、Ｖａｌ３０Ｌｅｕ、Ｖａｌ３０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ３３Ｌｅｕ、Ａｌａ３６Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４２Ｇｌｙ、Ｐｈｅ４４Ｓｅｒ、Ａｌａ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｇｌｙ４７Ａｌａ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｔｈｒ４９Ａｌａ、Ｓｅｒ５０Ａｒｇ、Ｓｅｒ５０Ｉｌｅ、Ｇｌｙ５３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ５５Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５８Ｈｉｓ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｔｈｒ６０Ａｌａ、Ｇｌｕ６１Ｌｙｓ、Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｐｈｅ６４Ｓｅｒ、Ｉｌｅ６８Ｌｅｕ、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓ、Ｌｙｓ７０Ａｓｎ、Ｖａｌ７１Ａｌａ、Ｓｅｒ７７Ｔｙｒ、Ｉｌｅ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ８９Ｇｌｎ、Ｈｉｓ９０Ａｓｎ、Ａｌａ９７Ｇｌｙ、Ａｌａ９７Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、Ａｌａ１０９Ｔｈｒ、Ａｌａ１０９Ｖａｌ、Ｌｅｕ１１１Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１１４Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１１４Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１１６Ｖａｌ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ、Ｖａｌ１２２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１２２Ｄｅｌ、またはそれらの組み合わせを含むＴＴＲ遺伝子における突然変異を有する。
ヒトＴＴＲ遺伝子におけるＴＴＲ１５－１６認識配列を示す図である。本発明の組換えメガヌクレアーゼによって標的化されるＴＴＲ１５－１６認識配列は、２つの認識半部位を含む。各認識半部位は、４塩基対の中心配列によって分離された９塩基対を含む。ＴＴＲ１５－１６認識配列（配列番号７）は、ヒトＴＴＲ遺伝子（配列番号３）のヌクレオチド３，３７７から３，３９８に及び、ＴＴＲ１５－１６（１）およびＴＴＲ１５－１６（２）と称される２つの認識半部位を含む。 ヒトＴＴＲ遺伝子におけるＴＴＲ５－６認識配列を示す図である。本発明の組換えメガヌクレアーゼによって標的化されるＴＴＲ５－６認識配列は、２つの認識半部位を含む。各認識半部位は、４塩基対の中心配列によって分離された９塩基対を含む。ＴＴＲ５－６認識配列（配列番号９）は、ヒトＴＴＲ遺伝子（配列番号３）のヌクレオチド１７０から１９１に及び、ＴＴＲ５－６（１）およびＴＴＲ５－６（２）と称される２つの認識半部位を含む。 本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼは２つのサブユニットを含み、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは第１の認識半部位（例えばＴＴＲ５－６（１））に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは第２の認識半部位（例えばＴＴＲ５－６（２））に結合する。組換えメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態において、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端サブユニットのいずれかとして配置され得る。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端またはＣ末端サブユニットのいずれかとして配置され得る。 ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼの配列を示す図である。 ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１およびＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１メガヌクレアーゼの間の多重配列アラインメントを示す図である。アスタリスクは、すべての整列したヌクレアーゼの間で保存された残基を示し、スペースは、少なくとも１つのアミノ酸がメガヌクレアーゼの間で異なることを示す。 ＴＴＲ遺伝子において見出される認識配列（配列番号３）を標的とする組換えメガヌクレアーゼを評価するための、ＣＨＯ細胞におけるレポータアッセイの概略図である。本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼについて、レポータカセットが細胞のゲノムに安定に組み込まれたＣＨＯ細胞株を作製した。レポータカセットは、５´から３´の順序で、ＳＶ４０初期プロモータ、ＧＦＰ遺伝子の５´ ２／３、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＴＴＲ５－６または１５－１６認識配列）；ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（ＷＯ／２０１２／１６７１９２）；およびＧＦＰ遺伝子の３´ ２／３を含んでいた。このカセットで安定にトランスフェクトした細胞は、ＤＮＡ離断誘導剤の非存在下でＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの形質導入によって導入された。ＤＮＡ離断がメガヌクレアーゼ認識配列のいずれかで誘導されると、ＧＦＰ遺伝子の重複領域が互いに再結合し、機能的ＧＦＰ遺伝子が生成された。次いで、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的な尺度として、ＧＦＰ発現細胞の割合をフローサイトメトリーによって決定することができた。 ＣＨＯ細胞レポータアッセイにおいて、ヒトおよび非ヒト霊長類（ＮＨＰ）認識配列を認識してそれを切断するための、本明細書に記載の操作されたＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼの効率を示す図である。活性指数は、メガヌクレアーゼの毒性の原因となるＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼを発現する細胞株に対して正規化された試験メガヌクレアーゼを発現する各細胞株についての％ＧＦＰ陽性細胞を表す。図６Ａは、ヒト認識配列を使用した結果を示し、図６Ｂは、モデルＮＨＰ認識配列を使用した結果を示す。 ＨｅｐＧ２細胞（図７Ａ）およびＨＥＫ２９３細胞（図７Ｂ）における、ＴＴＲ５－６認識配列を標的とする試験されたメガヌクレアーゼの挿入および欠失（インデル）の頻度のパーセンテージを示す棒グラフである。メガヌクレアーゼのトランスフェクション後の３つの時点（２、６、および９日目）でメガヌクレアーゼを試験した。 ＣＨＯ細胞レポータアッセイにおいてＴＴＲ１５－１６認識配列を認識してそれを切断するための、本明細書に記載の操作されたＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼの効率を示す図である。活性指数は、メガヌクレアーゼの毒性の原因となるＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼを発現する細胞株に対して正規化された試験メガヌクレアーゼを発現する各細胞株についての％ＧＦＰ陽性細胞を表す。 ＨｅｐＧ２細胞（図９Ａ）およびＨＥＫ２９３細胞（図９Ｂ）におけるＴＴＲ１５－１６認識配列を標的とするＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼの挿入および欠失（インデル）の頻度のパーセンテージを示す棒グラフである。メガヌクレアーゼを、図９Ａおよび図９Ｂにおけるメガヌクレアーゼのトランスフェクション後の２つの時点（２日目および７日目）で試験した。ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３およびＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼの用量応答曲線を図９Ｃに示す。 示される量のＴＴＲ１５－１６ｘ．８１ ｍＲＮＡによりトランスフェクトされた初代ヒト肝細胞におけるインデル頻度を示すグラフである。図１０Ａにおいて、灰色および黒色のバーは、それぞれトランスフェクション後１日目（Ｄ１）および７日目（Ｄ７）に測定されたインデルを示す。図１０Ｂにおいて、バーは、投与されたメガヌクレアーゼの示された濃度でＤ７で測定されたインデルを示す。 ５×１０１１のＶＧ ＡＡＶ８ ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４を投与したＦＶＢマウスにおけるインデル頻度を示すグラフである。ＡＡＶ投与の４週間後にマウスを安楽死させ、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によるｇＤＮＡ単離およびインデル分析のために肝臓組織を採取した。 剖検（ＡＡＶ投与後３６４日目）で採取した肝臓ｇＤＮＡからのアンプリコンシーケンシングＰＣＲ分析による５－６標的部位での内因性非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における標的挿入および欠失のパーセンテージを示す棒グラフである。５－６認識配列を標的とするＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼを含有するＡＡＶを、２つの濃度（６×１０１２（動物ＲＡ３３３０およびＲＡ３３８５）ならびに３×１０１３ＧＣ／ｋｇ（動物１５Ｄ００３および１５Ｄ０２０））でアカゲザルに導入した。 剖検（３６４日目）で採取された各動物からの肝臓試料でｄｄＰＣＲによって測定された、二倍体細胞当たりのＡＡＶゲノムの存在量を示す棒グラフである。ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼを含有するＡＡＶを、２つの濃度（６×１０１２［黒色バー］および３×１０１３ＧＣ／ｋｇ［灰色バー］）でアカゲザルに導入した。 ＡＡＶ投与後１８日目（ｄ１８）に採取された肝臓生検からのアンプリコンＮＧＳシーケンシング（図１４Ａ）およびｄｄＰＣＲ（図１４Ｂ）によるＴＴＲ１５－１６認識配列における標的挿入および欠失のパーセンテージを示す棒グラフである。１５－１６認識配列を標的とするＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼを含有するＡＡＶを、２つの濃度（６×１０１２［黒色バー］および３×１０１３ＧＣ／ｋｇ［灰色バー］）でアカゲザルに導入した。図１４Ｃは、２つの異なる用量（６×１０１２［動物１３０５０４８および１４０４１２８］ならびに３×１０１３ＧＣ／ｋｇ［動物１３０５１６８およびＴ１４６６２２４］）でのｄｄＰＣＲによって評価された、図１４Ｂに示すのと同じデータを表すｄ１８、およびＡＡＶ投与後１２８日目（ｄ１２８）のインデルのパーセンテージを示す。 ｄ１８およびｄ１２８で採取された各動物からの肝臓試料でｄｄＰＣＲによって測定された、二倍体細胞当たりのＡＡＶゲノムの存在量を示す棒グラフである。ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼを含有するＡＡＶを、２つの濃度（６×１０１２［動物１３０５０４８および１４０４１２８］ならびに３×１０１３ＧＣ／ｋｇ［動物１３０５１６８およびＴ１４６６２２４］）でアカゲザルに導入した。 ６×１０１２ＧＣ／ｋｇ（黒色の線）または３×１０１３ＧＣ／ｋｇ（灰色の線）のＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼを含有するＡＡＶ８を投与したＮＨＰにおける血清ＴＴＲレベルを示す線図である。ｘ軸は、ベクター投与前（－７）およびベクター投与後（７～２５９）の日数を示す。
配列の簡単な説明
配列番号１は、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）由来の野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトＴＴＲ遺伝子配列（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７２７６）の核酸配列を示す。
配列番号４は、ヒトＴＴＲタンパク質配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、成熟ヒトＴＴＲタンパク質配列（プレセグメントの一部である最初の２０個のアミノ酸を伴わない１２７個のアミノ酸プロセシングされたタンパク質）のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、アミノ酸置換Ｖ３０Ｍを有する成熟ヒトＴＴＲタンパク質配列のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＴＴＲ１５－１６認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号８は、ＴＴＲ１５－１６認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号９は、ＴＴＲ５－６認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１０は、ＴＴＲ５－６認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号１１は、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼＴＴＲ１５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１メガヌクレアーゼＴＴＲ１５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４メガヌクレアーゼＴＴＲ１５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１メガヌクレアーゼＴＴＲ１５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼＴＴＲ１６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１メガヌクレアーゼＴＴＲ１６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４メガヌクレアーゼＴＴＲ１６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１メガヌクレアーゼＴＴＲ１６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼＴＴＲ５結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼＴＴＲ６結合サブユニットのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＴＴＲ１５半部位認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２７は、ＴＴＲ１５半部位認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２８は、ＴＴＲ１６半部位認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号２９は、ＴＴＲ１６半部位認識配列のセンスアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３０は、ＴＴＲ５半部位認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３１は、ＴＴＲ５半部位認識配列のアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３２は、ＴＴＲ６半部位認識配列のセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３３は、ＴＴＲ６半部位認識配列のセンスアンチセンス鎖の核酸配列を示す。
配列番号３４は、実施例１および３のＧＦＰレポータアッセイにおいて使用されるＴＴＲ５－６モデルＮＨＰ認識配列を示す。
配列番号３５は、ヒト細胞におけるＴＴＲ５－６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号３６は、ヒト細胞におけるＴＴＲ５－６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号３７は、ヒト細胞におけるＴＴＲ５－６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号３８は、ヒト細胞におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号３９は、ヒト細胞におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４０は、ヒト細胞におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４１は、ヒト細胞におけるＴＴＲ１５－１６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号４２は、ヒト細胞におけるＴＴＲ１５－１６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４３は、ヒト細胞におけるＴＴＲ１５－１６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４４は、ヒト細胞におけるＴＴＲ１５－１６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号４５は、ヒト細胞におけるＴＴＲ１５－１６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４６は、ヒト細胞におけるＴＴＲ１５－１６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４７は、マウス細胞におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４８は、マウス細胞におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号４９は、マウス細胞におけるＴＴＲ５－６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号５０は、マウス細胞におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号５１は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号５２は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号５３は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ５－６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号５４は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号５５は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ５－６部位のインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号５６は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ５－６部位でのインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号５７は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４またはＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶを形質導入された非ヒト霊長類におけるＡＡＶコピー数を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号５８は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４またはＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶを形質導入された非ヒト霊長類におけるＡＡＶコピー数を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号５９は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４またはＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶを形質導入された非ヒト霊長類におけるＡＡＶコピー数を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号６０は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４またはＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶを形質導入された非ヒト霊長類におけるＡＡＶコピー数を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号６１は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４またはＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶを形質導入された非ヒト霊長類におけるＡＡＶコピー数を評価する上で参照レベルのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号６２は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４またはＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼをコードするＡＡＶを形質導入された非ヒト霊長類におけるＡＡＶコピー数を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工プローブの核酸配列を示す。
配列番号６３は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ１５－１６部位のインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工フォワードプライマーの核酸配列を示す。
配列番号６４は、非ヒト霊長類におけるＴＴＲ１５－１６部位のインデル％を評価するためのデジタルＰＣＲアッセイにおいて使用される人工リバースプライマーの核酸配列を示す。
配列番号６５は、ポリペプチドリンカーのアミノ酸配列を示す。
配列番号６６は、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６７は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６８は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６９は、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７０は、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
発明の詳細な説明
１．１ 参照および定義
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む参考文献は、それぞれが参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。例えば、一実施形態に関して示された特徴は、他の実施形態に組み込むことができ、特定の実施形態に関して示された特徴は、その実施形態から削除することができる。さらに、本発明から逸脱しない、本明細書で提案される実施形態に対する多数の変形および追加は、本開示に照らして当業者には明らかであろう。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における本発明の説明で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」は、１つまたは複数を意味し得る。例えば、「１つの（ａ）」細胞は、単一の細胞または複数の細胞を意味し得る。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「または」という単語は、「および／または」の包括的な意味で使用され、「いずれか／または」の排他的な意味では使用されない。
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在するまたは操作された酵素を指すように、交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「切断する」または「切断」という用語は、本明細書で「切断部位」と呼ばれる、標的配列内の二本鎖離断をもたらす標的配列内の認識配列の骨格内のホスホジエステル結合の加水分解を指す。
本明細書で使用される場合、「メガヌクレアーゼ」という用語は、１２塩基対を超える認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態において、本開示のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）から得られるエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ結合親和性、または二量体化特性に関して天然Ｉ－ＣｒｅＩに対して改変されたＩ－ＣｒｅＩの操作された変異体を指し得る。Ｉ－ＣｒｅＩのそのような改変された変異体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、参照によりその全体が組み込まれるＷＯ２００７／０４７８５９）。本明細書で使用されるメガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌクレアーゼはまた、一対のＤＮＡ結合ドメインがペプチドリンカーを使用して単一のポリペプチドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本開示のメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の方法を使用して測定した場合、細胞生存率への有害な影響またはメガヌクレアーゼ切断活性の有意な低減を観察することなく、細胞をトランスフェクトし、３７℃で維持できるように、本明細書に記載の標的化細胞で発現させた場合に実質的に非毒性である。
本明細書で使用される場合、「単鎖メガヌクレアーゼ」という用語は、リンカーによって連結された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドを指す。一本鎖メガヌクレアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは、一般に、アミノ酸配列が同一ではなく、非同一ＤＮＡ配列に結合する。したがって、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似回文または非回文認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼは、実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」または「一本鎖ヘテロ二量体メガヌクレアーゼ」と呼ばれる場合がある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体または一本鎖メガヌクレアーゼを指し得る。
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つのヌクレアーゼサブユニットを単一のポリペプチドに結合するために使用される外因性ペプチド配列を指す。リンカーは、天然タンパク質に見られる配列を有していてもよく、または天然タンパク質には見られない人工配列であってもよい。リンカーは、柔軟で二次構造を欠いていてもよく、または生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していてもよい。リンカーは、これらに限定されないが、米国特許第８，４４５，２５１号、第９，３４０，７７７号、第９，４３４，９３１号および第１０，０４１，０５３号に包含されるものを含むことができ、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号１１～１５のいずれか１つの残基１５４～１９５を示す配列番号６５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、配列番号１１～１５のいずれか１つの残基１５４～１９５を示す配列番号５１を含むアミノ酸配列を有し得る。
本明細書で使用される場合、タンパク質に関する「組換え」または「操作された」という用語は、タンパク質をコードする核酸およびタンパク質を発現する細胞または生物への遺伝子操作技術の適用の結果として変化したアミノ酸配列を有することを意味する。核酸に関して、「組換え」または「操作された」という用語は、遺伝子操作技術の適用の結果として変化した核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作技術には、これらに限定されないが、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング技術；トランスフェクション、形質転換および他の遺伝子導入技術；相同組換え；部位特異的突然変異誘発；ならびに遺伝子融合が含まれる。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主でのクローニングおよび発現によって産生されるタンパク質は、組換えまたは操作されていると見なされない。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドがその元の機能を有する、同じタイプの遺伝子の対立遺伝子集団における最も一般的な天然に存在する対立遺伝子（すなわちポリヌクレオチド配列）を指す。「野生型」という用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。野生型対立遺伝子（すなわちポリヌクレオチド）およびポリペプチドは、野生型配列に対して１つまたは複数の突然変異および／または置換を含む突然変異または変異対立遺伝子およびポリペプチドと区別され得る。野生型対立遺伝子またはポリペプチドは、生物において正常な表現型を付与し得るが、突然変異または変異対立遺伝子またはポリペプチドは、場合によっては、変化した表現型を付与し得る。野生型ヌクレアーゼは、組換えヌクレアーゼまたは天然に存在しないヌクレアーゼと区別され得る。「野生型」という用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、および／もしくは対象、または比較目的で使用される細胞、生物、および／もしくは対象を指し得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている、またはその先祖においてゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている細胞または生物を指す。本明細書で使用される場合、「遺伝子改変」という用語は、「トランスジェニック」という用語を包含する。
本明細書で使用される場合、組換えタンパク質に関する用語である「改変」という用語は、参照配列（例えば、野生型配列または天然配列）に対する組換え配列内のアミノ酸残基の任意の挿入、欠失、または置換を意味する。
本明細書で使用される場合、「認識配列」または「認識部位」という用語は、ヌクレアーゼによって結合および切断されるＤＮＡ配列を指す。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対によって分離された逆位９塩基対の「半部位」の対を含む。単鎖メガヌクレアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインは第１の半部位と接触し、タンパク質のＣ末端ドメインは第２の半部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩基対の３´オーバーハングを生じる。「オーバーハング」または「粘着末端」は、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断によって生成され得る短い一本鎖ＤＮＡセグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩから得られるメガヌクレアーゼおよび一本鎖メガヌクレアーゼの場合、オーバーハングは、２２塩基対の認識配列の塩基１０～１３を含む。
本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、ヌクレアーゼの認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域を指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合親和性」または「結合親和性」という用語は、ヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列または任意の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用される場合、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して統計的に有意なパーセント変化だけ増加または減少する場合、ヌクレアーゼは「変化した」結合親和性を有する。
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、ヌクレアーゼが認識配列と呼ばれる塩基対の特定の配列でのみ、または認識配列の特定のセットでのみ二本鎖ＤＮＡ分子に結合しそれを切断する能力を意味する。認識配列のセットは、ある特定の保存された位置または配列モチーフを共有するが、１つまたは複数の位置で縮重することができる。高度に特異的なヌクレアーゼは、１つのみまたはごく少数の認識配列を切断することができる。特異性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。
本明細書で使用される場合、「相同組換え」または「ＨＲ」という用語は、修復テンプレートとして相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡ切断が修復される自然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。相同ＤＮＡ配列は、細胞に送達された内因性染色体配列または外因性核酸であってもよい。
本明細書で使用される場合、「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」という用語は、２本鎖ＤＮＡ切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接的結合によって修復される自然の細胞プロセスを指す（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照されたい）。非相同末端結合によるＤＮＡ修復はエラーを起こしやすく、修復部位でのＤＮＡ配列の鋳型なしの付加または欠失を頻繁にもたらす。いくつかの例では、標的認識配列での切断は、標的認識部位でＮＨＥＪをもたらす。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレアーゼ誘導切断とそれに続くＮＨＥＪによるＤＮＡ修復は、遺伝子機能を妨害するフレームシフト突然変異などの突然変異をコード配列に導入し得る。したがって、操作されたヌクレアーゼを使用して、細胞集団中の遺伝子を効果的にノックアウトすることができる。
本明細書で使用される場合、「相同アーム」または「ヌクレアーゼ切断部位に隣接する配列に相同な配列」という用語は、ヌクレアーゼによって生成された切断部位への核酸分子の挿入を促進する、核酸分子の５´および３´末端に隣接する配列を指す。一般に、相同アームは、少なくとも５０塩基対、好ましくは少なくとも１００塩基対、最大２０００塩基対またはそれ以上の長さを有することができ、ゲノム中のそれらの対応する配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％またはそれ以上の配列相同性を有し得る。いくつかの実施形態において、相同アームは、約５００塩基対である。
本明細書で使用される場合、アミノ酸配列および核酸配列の両方に関して、「パーセント同一性」、「配列同一性」、「パーセンテージ類似性」、「配列類似性」などの用語は、整列したアミノ酸残基またはヌクレオチド間の類似性を最大にし、同一または類似の残基またはヌクレオチドの数、残基またはヌクレオチドの総数、ならびに配列アラインメントにおけるギャップの存在および長さの関数である配列のアラインメントに基づく２つの配列の類似性の程度の尺度を指す。標準的なパラメータを使用して配列類似性を決定するために、様々なアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用される場合、配列類似性は、アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴｐプログラムおよび核酸配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方とも国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して利用可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：２０３－１４において説明されている。本明細書で使用される場合、２つのアミノ酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝３；ギャップオープニングペナルティ＝－１１；ギャップ伸長ペナルティ＝－１；およびスコア行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２。本明細書で使用される場合、２つの核酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムについての以下のパラメータに基づくスコアである：ワードサイズ＝１１；ギャップオープニングペナルティ＝－５；ギャップ伸長ペナルティ＝－２；マッチ報酬＝１；ミスマッチペナルティ＝－３。
本明細書で使用される場合、２つのタンパク質またはアミノ酸配列の改変に関する「対応する」という用語は、第１のタンパク質の特定の改変が第２のタンパク質の改変と同じアミノ酸残基の置換であること、および、２つのタンパク質が標準的な配列アラインメントに供される場合（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラムを使用して）、第１のタンパク質の改変のアミノ酸位置が第２のタンパク質の改変のアミノ酸位置に対応するかまたは整列することを示すために使用される。したがって、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、残基ＸおよびＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、ＸおよびＹが異なる数であり得るという事実にもかかわらず、第２のタンパク質における残基「Ｙ」のアミノ酸「Ａ」への改変に対応する。
本明細書で使用される場合、「認識半部位」、「認識配列半部位」または単に「半部位」という用語は、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体メガヌクレアーゼのモノマーによって、または一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって、または一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識および結合される二本鎖ＤＮＡ分子内の核酸配列を意味する。
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、比較的高い可変性を有するアミノ酸を含むメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニット内の局在配列を指す。超可変領域は、約５０～６０個の連続残基、約５３～５７個の連続残基、または好ましくは約５６個の残基を含み得る。いくつかの実施形態において、超可変領域の残基は、配列番号１１～１５のいずれか１つの２４～７９位または２１５～２７０位に対応し得る。超可変領域は、認識配列中のＤＮＡ塩基と接触する１つまたは複数の残基を含み得、モノマーまたはサブユニットの塩基優先性を変化させるように改変され得る。超可変領域はまた、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と会合する場合にＤＮＡ骨格に結合する１つまたは複数の残基を含み得る。そのような残基は、ＤＮＡ骨格および標的認識配列に対するメガヌクレアーゼの結合親和性を変化させるように改変され得る。本発明の様々な実施形態において、超可変領域は、可変性を示し、塩基優先性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変され得る１～２０残基を含み得る。特定の実施形態において、超可変領域は、可変性を示し、塩基優先性および／またはＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変され得る約１５～２０残基を含む。いくつかの実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号１１～１５のいずれか１つの２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５および７７位のうちの１つまたは複数に対応する。ある特定の実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号１１～１５のいずれか１つの残基４８、５０、および７１～７３にさらに対応し得る。他の実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号１１～配列番号１５のいずれか１つの２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２５９、２６１、２６２、２６３、２６４、２６６および２６８位のうちの１つまたは複数に対応する。ある特定の実施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号１５の残基２３９、２４１および２６３～２６５にさらに対応し得る。
本明細書で使用される場合、「トランスサイレチン」または「ＴＴＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、哺乳動物ＴＴＲ、例えばヒトＴＴＲ、マウスＴＴＲもしくは非ヒト霊長類ＴＴＲを含むがそれらに限定されない任意のＴＴＲポリヌクレオチドもしくはポリペプチド（例えば、前駆体ポリペプチドもしくは成熟ポリペプチド）、または、その病原性変異体もしくは潜在的病原性変異体を含み、これらには、Ｇｌｙ６Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１０Ａｒｇ、Ｌｅｕ１２Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８Ｇｌｙ、Ｖａｌ２０Ｉｌｅ、Ａｌａ２５Ｔｈｒ、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｖａｌ３０Ａｌａ、Ｖａｌ３０Ｌｅｕ、Ｖａｌ３０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ３３Ｌｅｕ、Ａｌａ３６Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４２Ｇｌｙ、Ｐｈｅ４４Ｓｅｒ、Ａｌａ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｇｌｙ４７Ａｌａ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｔｈｒ４９Ａｌａ、Ｓｅｒ５０Ａｒｇ、Ｓｅｒ５０Ｉｌｅ、Ｇｌｙ５３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ５５Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５８Ｈｉｓ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｔｈｒ６０Ａｌａ、Ｇｌｕ６１Ｌｙｓ、Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｐｈｅ６４Ｓｅｒ、Ｉｌｅ６８Ｌｅｕ、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓ、Ｌｙｓ７０Ａｓｎ、Ｖａｌ７１Ａｌａ、Ｓｅｒ７７Ｔｙｒ、Ｉｌｅ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ８９Ｇｌｎ、Ｈｉｓ９０Ａｓｎ、Ａｌａ９７Ｇｌｙ、Ａｌａ９７Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、Ａｌａ１０９Ｔｈｒ、Ａｌａ１０９Ｖａｌ、Ｌｅｕ１１１Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１１４Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１１４Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１１６Ｖａｌ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ、Ｖａｌ１２２ＩｌｅまたはＶａｌ１２２Ｄｅｌから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有するＴＴＲポリペプチドが含まれる。ＴＴＲは、とりわけ、プレアルブミン、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢおよびＴＢＰＡとしても知られている。通常、ＴＴＲタンパク質は、チロキシンおよびレチノールの輸送を担う血清／血漿および脳脊髄液タンパク質である。これは、主に肝臓や脳の脈絡叢によって合成され、ヒトの網膜ではわずかに合成される。肝臓で合成されたＴＴＲは血液中に分泌され、脈絡叢起源のＴＴＲは脳脊髄液に向かう。ヒトＴＴＲ ｍＲＮＡ転写物の配列は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００３７１．３で見出すことができる。マウスＴＴＲ ｍＲＮＡの配列は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０１３６９７．５で見出すことができる。アカゲザルＴＴＲ ｍＲＮＡの配列は、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿００１２６１６７９．１で見出すことができる。
「ＴＴＲ関連疾患」は、本明細書で使用される場合、ＴＴＲ遺伝子またはポリペプチドにおける１つまたは複数の突然変異によって引き起こされるか、またはそのような突然変異と相関する任意の疾患または症状、ならびに、野生型または突然変異ＴＴＲタンパク質によって引き起こされる任意の疾患または症状を含む。そのような疾患は、例えば、野生型または別様の突然変異ＴＴＲタンパク質の過剰な産生、アミロイド沈着物としての野生型または別様の突然変異ＴＴＲタンパク質の蓄積によって、ＴＴＲ遺伝子突然変異によって、ＴＴＲタンパク質の異常な切断によって、ＴＴＲと他のタンパク質または他の内因性もしくは外因性物質との間における異常な相互作用によって引き起こされ得る。「ＴＴＲ関連疾患」は、ＴＴＲが異常な細胞外凝集物またはアミロイド沈着物の形成において役割を果たす任意の種類のＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を含む。ＴＴＲ関連疾患は、とりわけ、老年性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心疾患（ＦＡＣ）、軟膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、アミロイド性硝子体混濁、手根管症候群および高チロキシン血症を含む。ＡＴＴＲの症状は、感覚性ニューロパチー（例えば四肢遠位部の知覚異常または知覚鈍麻）、自律神経ニューロパチー（例えば胃腸機能障害、例えば胃潰瘍または起立性低血圧）、運動ニューロパチー、発作、認知症、脊髄症、多発性ニューロパチー、手根管症候群、自律神経機能不全、心疾患、硝子体混濁、腎機能不全、腎症、実質的に低下したｍＢＭＩ（修正ボディーマス指数）、脳神経機能不全および角膜格子状ジストロフィーを含む。
「ＴＴＲレベル」という用語は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の細胞、組織、器官および／または生物学的流体（例えば、血液、血清、肝臓、または脳脊髄液）において測定されるようなＴＴＲレベルを指す。ＴＴＲレベルは、対照において、または、本発明の任意のメガヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼをコードする核酸により処置される細胞もしくは対象において測定され得る。ＴＴＲレベルは、ＴＴＲ遺伝子発現に伴う任意の変数のレベル、例えば、ＴＴＲ ｍＲＮＡレベル、ＴＴＲタンパク質レベル、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベル、またはアミロイド沈着物の数もしくは範囲に基づいて評価され得る。
ＴＴＲレベルの「減少」または「低減」という用語は、参照レベルまたは対照と比較した場合の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％のＴＴＲ発現の低減を含む、参照レベルと比較したＴＴＲ発現のレベルの任意の減少を指す。いくつかの実施形態において、ＴＴＲレベルの減少は、参照レベルまたは対照と比較した場合の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の全長ＴＴＲポリペプチド発現の低減を含む、参照レベルと比較した全長ＴＴＲポリペプチド発現の減少を指す。ある特定の実施形態において、全長ポリペプチドではないＴＴＲポリペプチドは、全長ＴＴＲポリペプチドのアミロイド形成と比較した場合、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の低減したアミロイド形成を有する。
本明細書で使用される場合、「改変ＴＴＲ遺伝子」という用語は、ＴＴＲ遺伝子に対する任意の改変、例えば、ＴＴＲ遺伝子内での挿入、欠失または置換を指す。いくつかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子に対する改変は、参照レベルと比較して、細胞または対象におけるＴＴＲレベルを変化（例えば減少）させる、または別様にはＴＴＲアミロイドのレベルを低減する。
本明細書で使用される場合、「参照レベル」という用語は、例えば、対照細胞、対照細胞集団もしくは対照対象において、対照細胞、対照細胞集団もしくは処置を受けている対象における以前の時点で測定されるようなＴＴＲのレベル（例えば、対照細胞、対照細胞集団もしくは対象から得られる投薬前ベースラインレベル）、またはＴＴＲの予め定義された閾値レベル（例えば、以前の実験を通して特定された閾値レベル）を指す。
本明細書で使用される場合、「対照」または「対照細胞」という用語は、遺伝子改変細胞の遺伝子型または表現型の変化を測定するための参照点を提供する細胞を指す。対照細胞は、例えば、（ａ）野生型細胞、すなわち遺伝子改変細胞をもたらした遺伝子変化のための出発物質と同じ遺伝子型のもの；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌルコンストラクトで（すなわち、目的の形質に既知の影響を及ぼさないコンストラクトで）形質転換されたもの；あるいは（ｃ）遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、変化した遺伝子型もしくは表現型の発現を誘導する条件もしくは刺激またはさらなる遺伝子改変に曝露されていない細胞を含み得る。対照対象は、例えば、野生型対象、すなわち、遺伝子改変対象（例えば、ＴＴＲ遺伝子において同じ突然変異を有する対象）をもたらした遺伝子改変のための出発対象と同じ遺伝子型であり、対象において変化した遺伝子型または表現型の発現を誘導する条件もしくは刺激またはさらなる遺伝子改変に曝露されていないものを含み得る。
本明細書で使用される場合、「組換えＤＮＡコンストラクト」、「組換えコンストラクト」、「発現カセット」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡ断片」という用語は、本明細書で互換的に使用され、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドである。組換えコンストラクトは、天然には一緒に見られない調節配列およびコード配列を含むがこれらに限定されない核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、組換えＤＮＡコンストラクトは、異なる源から得られる調節配列およびコード配列、または同じ源から得られ、天然に見られるものとは異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含み得る。そのようなコンストラクトは、単独で使用されてもよく、またはベクターと組み合わせて使用されてもよい。
本明細書で使用される場合、「ベクター」または「組換えＤＮＡベクター」という用語は、所与の宿主細胞においてポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳が可能な複製系および配列を含むコンストラクトであってもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用される方法に依存する。ベクターには、限定されないが、プラスミドベクターおよび組換えＡＡＶベクター、または遺伝子を標的細胞に送達するのに適した当技術分野で公知の任意の他のベクターが含まれ得る。当業者には、本発明の単離されたヌクレオチドまたは核酸配列のいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝的要素が十分に認識される。いくつかの実施形態において、「ベクター」は、ウイルスベクターも指す。ウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」という用語は、２つ以上の要素間の機能的連結を意味することを意図している。例えば、本明細書に開示されるヌクレアーゼをコードする核酸配列と調節配列（例えばプロモータ）との間の動作可能な連結は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列の発現を可能にする機能的連結である。動作可能に連結された要素は、連続していても不連続であってもよい。２つのタンパク質コード領域の連結を指すために使用される場合、作動可能に連結されるとは、コード領域が同じリーディングフレーム内にあることを意図する。
本明細書で使用される場合、「自己切断」組換えＤＮＡコンストラクトという用語は、ヌクレアーゼの少なくとも１つのコード配列および同じヌクレアーゼの少なくとも１つの認識配列を含むＤＮＡコンストラクトを指す。細胞（すなわちインビボ）で発現された場合、ヌクレアーゼは認識配列を認識して切断し、ＤＮＡコンストラクトの線状化をもたらす。
本明細書で使用される場合、「治療」または「対象を治療する」という用語は、対象のＴＴＲレベルを低減する目的で、ＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）を有する対象に、本発明の操作されたメガヌクレアーゼ、または本発明の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を投与することを指す。そのような治療はＴＴＲレベルを低減し、これらに限定されないが、感覚性ニューロパチー（例えば四肢遠位部の知覚異常または知覚鈍麻）、自律神経ニューロパチー（例えば胃腸機能障害、例えば胃潰瘍または起立性低血圧）、運動ニューロパチー、発作、認知症、脊髄症、多発性ニューロパチー、手根管症候群、自律神経機能不全、心疾患、硝子体混濁、腎機能不全、腎症、実質的に低下したｍＢＭＩ（修正ボディーマス指数）、脳神経機能不全および角膜格子状ジストロフィーを含む対象のＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）の１つまたは複数の症状の部分的または完全な軽減を提供する。ＴＴＲレベルの低減を評価する手段は、ＴＴＲ遺伝子発現に伴う任意の変数のレベル、例えば、ＴＴＲ ｍＲＮＡレベル、ＴＴＲタンパク質レベル、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベル、またはアミロイド沈着物の数もしくは範囲に基づくＴＴＲレベルの測定を含み得る。「治療」または「対象を治療する」という用語はさらに、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む細胞（例えば肝細胞）の投与を指し得、細胞は標的組織（例えば肝臓）に送達され、対象のＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）を治療するのに十分な量で操作されたメガヌクレアーゼを産生し、それによりＴＴＲ関連疾患の１つまたは複数の症状の部分的または完全な軽減をもたらす。いくつかの態様では、本発明の操作されたメガヌクレアーゼ、それをコードする核酸、または本明細書に記載される遺伝子改変細胞もしくは遺伝子改変細胞集団は、本発明の医薬組成物の形態で治療中に投与される。
本明細書で使用される場合、「ｇｃ／ｋｇ」または「遺伝子コピー／キログラム」という用語は、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸のコピー数、または操作されたヌクレアーゼおよび／もしくは鋳型核酸をコードする核酸が投与される対象の体重１キログラム当たりの本明細書に記載の鋳型核酸のコピー数を指す。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、有益または望ましい生物学的および／または臨床的結果をもたらすのに十分な量を指す。治療有効量は、使用される製剤または組成物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重、体調および応答性に応じて変動する。具体的な実施形態において、本明細書中に開示される操作されたメガヌクレアーゼまたは医薬組成物の有効量は、対象におけるＴＴＲのレベルを低減する、ＴＴＲアミロイドのレベルを低減する、またはＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）の少なくとも１つの症状を低減する。いくつかの特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸の有効量は、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または１×１０１４ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸を含むポリヌクレオチドまたは鋳型ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよび／もしくは鋳型ポリヌクレオチド、または本明細書に開示される操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドおよび／もしくは鋳型ポリヌクレオチドを含む医薬組成物の有効量は、対象の疾患の少なくとも１つの症状を低減する。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という用語は、１０～１０００ナノメートルの平均直径を有する典型的には球形の構造を有する脂質組成物を指す。いくつかの製剤では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１種のカチオン性脂質、少なくとも１種の非カチオン性脂質、および少なくとも１種の複合脂質を含み得る。ｍＲＮＡなどの核酸を封入するのに適した当技術分野で公知の脂質ナノ粒子が、本発明における使用のために企図される。
本明細書で使用される場合、変数の数値範囲の列挙は、その範囲内の値のいずれかに等しい変数で本開示が実践され得ることを伝えることを意図する。したがって、本質的に離散的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の整数値に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数の場合、変数は、範囲の終点を含む数値範囲内の任意の実数値に等しくなり得る。一例として、限定されないが、０～２の値を有すると説明される変数は、その変数が本質的に離散的である場合、０、１または２の値をとることができ、その変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、または０以上２以下の任意の他の実数値をとることができる。
２．１ 発明の原理
本発明は、操作されたメガヌクレアーゼが、ＴＴＲ遺伝子内（例えばヒトＴＴＲ遺伝子；配列番号３）、特にエクソン１またはエクソン３内に見出される認識配列に結合しそれを切断するように設計され得るという仮説に部分的に基づく。本明細書中にさらに記載されるように、メガヌクレアーゼをＴＴＲ遺伝子のエクソン１またはエクソン３内の認識部位に標的化することは、ＴＴＲの発現を妨害するための効果的なアプローチである。ＴＴＲタンパク質の発現の妨害は、ＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシスなど）を有する対象においてＴＴＲレベルを低減し得るか、またはＴＴＲアミロイドを低減し得る。
特に、ＴＴＲ遺伝子（例えば、ＴＴＲ５－６またはＴＴＲ１５－１６認識配列において）のエクソン１またはエクソン３内での切断は、切断部位における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を可能にし得、挿入、欠失またはフレームシフト突然変異をもたらす切断部位におけるＮＨＥＪに起因するＴＴＲの発現を妨害することができる。加えて、ＴＴＲ遺伝子（例えば、ＴＴＲ５－６またはＴＴＲ１５－１６認識配列において）のエクソン１またはエクソン３内での切断は、ＴＴＲ発現を妨害するためのＴＴＲ遺伝子への外因性核酸配列の直接的な相同組換えをさらに可能にし得る。
したがって、本発明は、ＴＴＲ遺伝子（例えば、ＴＴＲ５－６またはＴＴＲ１５－１６認識配列において）のエクソン１またはエクソン３内に結合してそれを切断する操作されたメガヌクレアーゼを包含する。本発明はまた、遺伝子改変細胞を生成するためにそのような操作されたメガヌクレアーゼを使用する方法も包含する。さらに、本発明は、操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、または操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む医薬組成物、およびトランスサイレチンアミロイドーシス等のＴＴＲ関連疾患の処置のためのそのような組成物の使用を包含する。
２．２ ＴＴＲ遺伝子内の認識配列に結合して切断するメガヌクレアーゼ
部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノム内でＤＮＡ切断を行うことが可能であり、そのようなＤＮＡ切断は、トランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの永久的な改変をもたらし得ることが当技術分野で公知である。標的遺伝子座において二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的に相同な配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが知られている。このようにして、外因性核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。
部位特異的ヌクレアーゼを使用して生細胞のゲノム内でＤＮＡ切断を行うことが可能であり、そのようなＤＮＡ切断は、突然変異原性ＮＨＥＪ修復を介して、またはトランスジェニックＤＮＡ配列との相同組換えを介してゲノムの永久的な改変をもたらし得ることが当技術分野でさらに公知である。ＮＨＥＪは、切断部位で突然変異誘発を生じさせ、対立遺伝子の不活性化をもたらし得る。ＮＨＥＪ関連突然変異誘発は、初期終止コドンの生成、異常な非機能性タンパク質を産生するフレームシフト突然変異を介して対立遺伝子を不活性化し得るか、またはナンセンス媒介ｍＲＮＡ分解などの機構を誘因し得る。ＮＨＥＪを介して突然変異誘発を誘導するヌクレアーゼの使用は、野生型対立遺伝子に存在する特定の突然変異または配列を標的とするために使用され得る。さらに、標的遺伝子座において二本鎖切断を誘導するためのヌクレアーゼの使用は、特にゲノム標的に相同な配列に隣接するトランスジェニックＤＮＡ配列の相同組換えを刺激することが知られている。このようにして、外因性核酸配列を標的遺伝子座に挿入することができる。そのような外因性核酸は、目的の任意の配列またはポリペプチドをコードすることができる。
いくつかの実施形態において、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである。特定の実施形態において、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは、一本鎖メガヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって連結されたＮ末端サブユニットおよびＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインの各々は、認識配列の半分（すなわち認識半部位）を認識してそれに結合し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユニットの界面付近の認識配列の中央にある。ＤＮＡ鎖切断は、メガヌクレアーゼによるＤＮＡ切断が一対の４塩基対の３´一本鎖オーバーハングを生成するように、４塩基対によって相殺される。
他の実施形態において、本発明のヌクレアーゼは、ＴＴＲ１５－１６認識配列（配列番号７）に結合してそれを切断するように操作されている。ＴＴＲ１５－１６認識配列は、ＴＴＲ遺伝子のエクソン３内に位置する。例示的なＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼ（例えば、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４およびＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１）が、配列番号１１～１４に提供される。
いくつかの実施形態において、本発明のヌクレアーゼは、ＴＴＲ５－６認識配列（配列番号９）に結合してそれを切断するように操作されている。ＴＴＲ５－６認識配列は、ＴＴＲ遺伝子のエクソン１内に位置する。例示的なＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼ（例えばＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４）が配列番号１５に提供される。
本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む第１のサブユニットと、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットとを含む。さらに、第１のサブユニットは、認識配列中の第１の認識半部位（すなわちＴＴＲ５またはＴＴＲ１５半部位）に結合し、第２のサブユニットは、認識配列中の第２の認識半部位（すなわちＴＴＲ６またはＴＴＲ１６半部位）に結合する。操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態において、第１および第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置付けられ、ＨＶＲ２領域を含み第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置付けられるように配向され得る。代替の実施形態において、第１および第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第１の半部位に結合する第１のサブユニットがＣ末端サブユニットとして位置付けられ、ＨＶＲ２領域を含み第２の半部位に結合する第２のサブユニットがＮ末端サブユニットとして位置付けられるように配向され得る。本発明の例示的なＴＴＲメガヌクレアーゼが配列番号１１～１５において提供され、表１および表２ならびに下記の説明において要約される。














「ＴＴＲ１５サブユニット％」および「ＴＴＲ１６サブユニット％」は、各メガヌクレアーゼのＴＴＲ１５結合サブユニット領域およびＴＴＲ１６結合サブユニット領域と、それぞれＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼのＴＴＲ１５結合サブユニット領域およびＴＴＲ１６結合サブユニット領域との間のアミノ酸配列同一性をそれぞれ表す。

本発明のある特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＴＲ遺伝子内の配列番号７を含む認識配列に結合してそれを切断し、操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。
ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１（配列番号１１）
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基４８、５０、および７１～７３に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基４８、５０、および７１～７３に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１１の残基２４～７９を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１１の残基２１５～２７０を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基７～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１１の残基１９および１３９に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１１の残基１９および１３９に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１１の残基８０に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１１の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを共有結合する。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６６の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６６の核酸配列によってコードされる。
ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１（配列番号１２）
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基４８、５０、および７１～７３に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基４８、５０、および７１～７３に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１２の残基２４～７９を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１２の残基２１５～２７０を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基７～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１２の残基１９および１３９に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１２の残基１９および１３９に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１２の残基８０に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１２の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを共有結合する。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６７の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６７の核酸配列によってコードされる。
ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４（配列番号１３）
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１３の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１３の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１３の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１３の残基４８、５０、および７１～７３に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１３の残基４８、５０、および７１～７３に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１３の残基２４～７９を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１３の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１３の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１３の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１３の残基２１５～２７０を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１３の残基７～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号１３の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１３の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１３の残基１９および１３９に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１３の残基１９および１３９に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１３の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１３の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１３の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１３の残基８０に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１３の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを共有結合する。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６８の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６８の核酸配列によってコードされる。
ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１（配列番号１４）
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１４の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１４の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１４の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１４の残基４８、５０、および７１～７３に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ１領域は、配列番号１４の残基４８、５０、および７１～７３に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１４の残基２４～７９を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１４の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１４の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１４の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１４の残基２１５～２７０を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１４の残基７～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号１４の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１４の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１４の残基１９および１３９に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第１のサブユニットは、配列番号１４の残基１９および１３９に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１４の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１４の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１４の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１４の残基８０に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１４の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを共有結合する。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６９の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号６９の核酸配列によってコードされる。
本発明のある特定の実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＴＲ遺伝子内の配列番号９を含む認識配列に結合してそれを切断し、操作されたメガヌクレアーゼは、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットは、認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニットは、認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む。
ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４（配列番号１５）
いくつかの実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、および７７に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基６６に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４～７９を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、および２６８に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２５７に対応する残基にＹ、Ｒ、ＫまたはＤを含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２３９、２４１、および２６３～２６５に対応する１つまたは複数の残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２３９、２４１、および２６３～２６５に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５～２７０を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基７～１５３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基１９８～３４４と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基１９に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基８０に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２１０に対応する残基にＧ、ＳまたはＡを含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２７１に対応する残基にＥ、ＱまたはＫを含む。いくつかのそのような実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１５の残基８０に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、上記第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２１０に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１５の残基２７１に対応する残基を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、リンカーを含む一本鎖メガヌクレアーゼであり、リンカーは第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを共有結合する。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのそのような実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７０の核酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号７０の核酸配列によってコードされる。
２．３ メガヌクレアーゼを送達および発現するための方法
本発明は、ＴＴＲ遺伝子（例えばヒトＴＴＲ遺伝子；配列番号３）内に見出される認識配列に結合しそれを切断する操作されたヌクレアーゼを使用して遺伝子改変細胞を生成するための方法を提供する。そのような認識配列における切断は、切断部位におけるＮＨＥＪおよび／または相同組換えによる外因性配列の挿入を可能にし、それにより、遺伝子改変細胞における内因性ＴＴＲポリペプチドの発現を妨害することができる。本発明はさらに、薬学的に許容される担体と、操作されたヌクレアーゼまたは操作されたヌクレアーゼポリペプチドをコードする核酸とを含む医薬組成物を投与することによって、対象の疾患を治療するための方法を提供する。それぞれの場合において、本発明は、本発明の操作されたヌクレアーゼ、または操作されたヌクレアーゼをコードする核酸が、典型的にはＴＴＲ遺伝子産物（例えばＴＴＲポリペプチド）を産生するであろう細胞に送達され得る（すなわち導入され得る）ことを含む。
したがって、本明細書では、対象におけるＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）を治療するための方法、ＴＴＲのレベルを低減するための方法、ＴＴＲアミロイドのレベルを低減するための方法、またはＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）に伴う症状を低減するための方法が提供される。特に、薬学的に許容される担体と、本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼ（または操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸または操作されたメガヌクレアーゼを発現する細胞）とを含む医薬組成物を投与するための方法が提供される。本発明の操作されたヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または好ましくは操作されたヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。そのような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状もしくは線状プラスミドＤＮＡもしくはＰＣＲ産物）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。
本発明の方法は、ＴＴＲが異常な細胞外凝集物またはアミロイド沈着物の形成において役割を果たす任意のＴＴＲ関連疾患、例えばＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）の治療において使用することができる。ＴＴＲ関連疾患は、老年性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）、全身性家族性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）、家族性アミロイド心疾患（ＦＡＣ）、軟膜／中枢神経系（ＣＮＳ）アミロイドーシス、アミロイド性硝子体混濁、手根管症候群および高チロキシン血症を含む。ある特定の実施形態において、方法は、ＡＴＴＲを治療するのに効果的である。特定の実施形態において、ＡＴＴＲは、神経障害性ＡＴＴＲ、軟膜ＡＴＴＲまたは心臓ＡＴＴＲである。
さらに、方法は、感覚性ニューロパチー（例えば四肢遠位部の知覚異常または知覚鈍麻）、自律神経ニューロパチー（例えば胃腸機能障害、例えば胃潰瘍または起立性低血圧）、運動ニューロパチー、発作、認知症、脊髄症、多発性ニューロパチー、手根管症候群、自律神経機能不全、心疾患、硝子体混濁、腎機能不全、腎症、実質的に低下したｍＢＭＩ（修正ボディーマス指数）、脳神経機能不全および／または角膜格子状ジストロフィーを含むＴＴＲアミロイドーシスの１つまたは複数の症状を低減するのに効果的となり得る。
ＴＴＲ関連疾患を有する対象または本明細書における操作されたメガヌクレアーゼによる治療を特に受け入れることができる対象は、１つまたは複数の危険因子、診断指標または予後指標、例えば本明細書中に記載されるものの存在または非存在を確認することによって特定され得る。例えば、いくつかの場合において、対象は、末梢神経系、自律神経系、軟膜および／または心臓に影響を及ぼすＴＴＲ遺伝子における突然変異を有する。ある特定の場合において、本明細書で提供される方法および組成物による治療を受けている対象は、ＴＴＲ遺伝子またはポリペプチドにおける１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、または２７）の突然変異によって特徴づけられ得る。例えば、治療を受けている対象は、Ｇｌｙ６Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１０Ａｒｇ、Ｌｅｕ１２Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８Ｇｌｙ、Ｖａｌ２０Ｉｌｅ、Ａｌａ２５Ｔｈｒ、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｖａｌ３０Ａｌａ、Ｖａｌ３０Ｌｅｕ、Ｖａｌ３０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ３３Ｌｅｕ、Ａｌａ３６Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４２Ｇｌｙ、Ｐｈｅ４４Ｓｅｒ、Ａｌａ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｇｌｙ４７Ａｌａ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｔｈｒ４９Ａｌａ、Ｓｅｒ５０Ａｒｇ、Ｓｅｒ５０Ｉｌｅ、Ｇｌｙ５３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ５５Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５８Ｈｉｓ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｔｈｒ６０Ａｌａ、Ｇｌｕ６１Ｌｙｓ、Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｐｈｅ６４Ｓｅｒ、Ｉｌｅ６８Ｌｅｕ、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓ、Ｌｙｓ７０Ａｓｎ、Ｖａｌ７１Ａｌａ、Ｓｅｒ７７Ｔｙｒ、Ｉｌｅ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ８９Ｇｌｎ、Ｈｉｓ９０Ａｓｎ、Ａｌａ９７Ｇｌｙ、Ａｌａ９７Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、Ａｌａ１０９Ｔｈｒ、Ａｌａ１０９Ｖａｌ、Ｌｅｕ１１１Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１１４Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１１４Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１１６Ｖａｌ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ、Ｖａｌ１２２Ｉｌｅ、またはＶａｌ１２２Ｄｅｌ突然変異から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を有するＴＴＲポリペプチドをコードするＴＴＲ遺伝子を有し得る。ある特定の実施形態において、治療を受けている対象は、ＴＴＲポリペプチド（配列番号６）においてＶａｌ３０Ｍｅｔ（Ｖ３０Ｍ）アミノ酸置換を有する。
遺伝子改変細胞または対象におけるＴＴＲ発現は、当技術分野における標準的な方法を使用して検出され得る。例えば、ＴＴＲレベルは、ＴＴＲ遺伝子発現に伴う任意の変数のレベル、例えば、ＴＴＲ ｍＲＮＡレベル、ＴＴＲタンパク質レベル、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベル、またはアミロイド沈着物の数もしくは範囲に基づいて評価され得る。ＴＴＲレベルまたは発現の低減は、参照レベルと比較したこれらの変数の１つまたは複数の絶対レベルまたは相対レベルの減少によって評価され得る。ＴＴＲレベルは、対象から単離された生物学的試料例えば組織生検、または血液、血清、血漿、脳脊髄液もしくは尿を含む体液において測定されてもよい。任意選択で、ＴＴＲレベルは、試料中の標準的なタンパク質または物質に対して正規化される。さらに、ＴＴＲレベルは、本明細書における方法に従う治療前、治療中または治療後の任意の時点で評価され得る。
方法は、遺伝子改変細胞または対象（例えば、対象から得られた細胞、組織、器官、または生物学的試料で測定される場合）におけるＴＴＲレベルを参照レベルに対して例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％低減するため、またはＴＴＲアミロイド形成を低減するための、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼのいずれか、またはメガヌクレアーゼをコードする核酸の投与を含む。いくつかの実施形態において、本明細書における方法は、ＴＴＲのレベルを参照レベルに対して約１０％～約８０％（例えば、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、またはそれ以上）低下させるのに効果的である。いくつかの実施形態において、ＴＴＲレベルの減少は、参照レベルまたは対照と比較した場合の少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の全長ＴＴＲポリペプチド発現の低減を含む、参照レベルと比較した全長ＴＴＲポリペプチド発現の減少を指す。ある特定の実施形態において、全長ポリペプチドではないＴＴＲポリペプチドは、全長ＴＴＲポリペプチドの活性と比較した場合、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％の低減した活性を含む、低減した活性を有する。
ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、対象におけるＴＴＲアミロイド形成を低減するのに効果的となり得る。例えば、ＴＴＲアミロイド形成は、参照レベルに対して約１０％～約１００％（例えば、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％）低減され得る。いくつかの実施形態において、ＴＴＲアミロイド形成は、参照レベルに対して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％低減される。
本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、または好ましくは操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸として細胞に送達され得る。そのような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状もしくは線状プラスミドＤＮＡもしくはＰＣＲ産物）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であってもよい。操作されたメガヌクレアーゼコード配列がＤＮＡ形態で送達される実施形態の場合、それは、ヌクレアーゼ遺伝子の転写を促進するためにプロモータに動作可能に連結されるべきである。本発明に適した哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（３）：６５９－６３）またはＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４－１０）等の構成的プロモータ、およびテトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４５）等の誘導性プロモータが含まれる。本発明の操作されたヌクレアーゼはまた、合成プロモータに動作可能に連結され得る。合成プロモータには、限定されないが、ＪｅＴプロモータ（ＷＯ２００２／０１２５１４）が含まれ得る。特定の実施形態において、本発明の操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列は、肝臓特異的プロモータなどの組織特異的プロモータに動作可能に連結される。肝臓特異的プロモータの例には、限定されないが、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、ヒトアルファ－１アンチトリプシンプロモータ、ハイブリッド肝臓特異的プロモータ（ＡｐｏＥ遺伝子由来の肝臓遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ－ＨＣＲ）および肝臓特異的アルファ１－アンチトリプシンプロモータ）、ならびにアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータが含まれる。
特定の実施形態では、少なくとも１つの操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列は、組換えＤＮＡコンストラクトまたは発現カセット上に送達される。例えば、組換えＤＮＡコンストラクトは、プロモータおよび本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現カセット（すなわち「カセット」）を含み得る。
いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼをコードする遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれる可能性が低減されるため、操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは細胞に送達される。
操作されたメガヌクレアーゼをコードするそのようなｍＲＮＡは、インビトロ転写等の当技術分野で公知の方法を使用して生成され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、７－メチル－グアノシン、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）（ＵＳ７，０７４，５９６）、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）アナログ、例えばＣａｐ１アナログ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて５´キャップされるか、またはワクシニアキャッピング酵素または同様のものを用いて酵素的にキャップされる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化され得る。ｍＲＮＡは、コードされた操作されたメガヌクレアーゼの発現および／またはｍＲＮＡ自体の安定性を高めるために、様々な５´および３´非翻訳配列要素を含有し得る。そのような要素には、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節要素などの翻訳後調節要素が含まれ得る。ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルウリジンまたは２－チオウリジン等のヌクレオシド類似体または天然に存在するヌクレオシドを含有し得る。さらなるヌクレオシド類似体には、例えば、ＵＳ８，２７８，０３６に記載されているものが含まれる。
精製されたヌクレアーゼタンパク質を細胞に送達してゲノムＤＮＡを切断することができ、これにより、本明細書にさらに詳述されるものを含む、当技術分野で公知の様々な異なる機構によって、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードする外因性核酸分子との切断部位での相同組換えまたは非相同末端結合が可能になる。
別の特定の実施形態において、本発明のヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。一本鎖ＤＮＡは、操作されたヌクレアーゼをコードする配列の上流および／または下流に５´および／または３´ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）をさらに含み得る。一本鎖ＤＮＡは、操作されたメガヌクレアーゼをコードする配列の上流および／または下流に５´および／または３´相同アームをさらに含み得る。
別の特定の実施形態において、本発明のヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入される。そのような線状ＤＮＡ鋳型は、当技術分野で公知の方法によって生成され得る。例えば、ヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡは、環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるように、１つ以上の制限酵素によって消化され得る。
精製された操作されたヌクレアーゼタンパク質、または操作されたヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書で以下にさらに詳述されるものを含む、当技術分野で公知の様々な異なる機構によってゲノムＤＮＡを切断するために細胞に送達され得る。
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼタンパク質、ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡ、またはヌクレアーゼタンパク質を発現する細胞は、既知の技術に従って、薬学的に許容される担体中で全身投与または標的組織への投与のために製剤化される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質／ＲＮＡ／ｍＲＮＡ／細胞は、典型的には薬学的に許容される担体と混合される。担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、患者に有害であってはならない。担体は、固体もしくは液体、またはその両方であり得、単位用量製剤として化合物と共に製剤化され得る。
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞取り込みを促進するために細胞透過性ペプチドまたは標的化リガンドに結合される。当技術分野で公知の細胞透過性ペプチドの例には、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（Ｈｕｄｅｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４３：７６９８－７７０６）、およびＨＳＶ－１ ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９）が含まれる。代替の実施形態において、操作されたヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細胞によって内在化されるように、標的細胞上に発現される特定の細胞表面受容体を認識する抗体に共有結合または非共有結合される。代替として、操作されたヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡは、そのような細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）に共有結合または非共有結合され得る（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１２６４－７４；Ｋａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１－５０８）。
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、肝臓の所望の領域（例えば、肝類洞内皮細胞もしくは造血内皮細胞、またはそれらに分化する前駆細胞に近接する）内への注射または移植のために、生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは、頻繁な注射を必要とせずに標的組織の所望の領域への治療ペイロードの持続的かつ調整可能な放出を提供することができ、刺激応答性材料（例えば、温度およびｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的または外部から加えられたキューに応答してペイロードを放出するように設計され得る（Ｋａｎｇ Ｄｅｒｗｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１０６：２０６－２１４）。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、当技術分野で公知の方法を使用して、ナノ粒子に共有結合もしくは好ましくは非共有結合されるか、またはそのようなナノ粒子内に封入される（Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）。ナノ粒子は、長さスケールが１μｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満であるナノスケール送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、または生物学的高分子から構成されるコアを使用して設計され得、メガヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡの複数のコピーがナノ粒子コアに結合または封入され得る。これは、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数を増加させ、したがって、各メガヌクレアーゼの細胞内発現を増加させて、標的認識配列が切断される可能性を最大にする。そのようなナノ粒子の表面は、ポリマーまたは脂質（例えば、キトサン、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質）でさらに修飾されて、その表面が細胞送達およびペイロードの取り込みを増強するための追加の機能性を付与するコア－シェルナノ粒子を形成し得る（Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１－３０）。ナノ粒子は、ナノ粒子を適切な細胞型に指向させるために、および／または細胞取り込みの可能性を高めるために、標的化分子にさらに有利に結合され得る。そのような標的化分子の例には、細胞表面受容体および細胞表面受容体の天然リガンド（または天然リガンドの一部）に特異的な抗体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレアーゼタンパク質またはＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、またはカチオン性脂質を使用して複合体化される（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２０１１：８６３７３４を参照）。リポソームおよびリポプレックス製剤は、ペイロードを分解から保護し、標的部位での蓄積および保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合および／またはその妨害を通じて細胞取り込みおよび送達効率を促進することができる。
いくつかの実施形態では、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えばＰＬＧＡ）内に封入されるか、またはカチオン性ポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を使用して複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）。ポリマー担体は、ポリマー侵食および薬物拡散の制御によって調整可能な薬物放出速度を提供するように設計することができ、高い薬物封入効率は、所望の標的細胞集団への細胞内送達まで治療ペイロードの保護を提供することができる。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼタンパク質、または操作されたメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組み合わされる（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）：９５６－６６）。ポリマーミセルは、凝集を防止し、電荷相互作用をマスクし、非特異的相互作用を低減することができる親水性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）で形成されたミセルシェルを含み得る。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与および／または送達のためにエマルジョンまたはナノエマルジョン（すなわち、１ｎｍ未満の平均粒径を有する）に製剤化される。「エマルジョン」という用語は、限定されないが、水不混和性相が水相と混合された場合に、無極性残基（例えば長い炭化水素鎖）を水から遠ざけ、極性頭部基を水に向ける疎水力の結果として形成し得る脂質構造を含む、任意の水中油型、油中水型、水中油中水型、または油中水中油型の分散液または液滴を指す。これらの他の脂質構造には、単層、少層、および多層の脂質小胞、ミセル、およびラメラ相が含まれるが、これらに限定されない。エマルジョンは、水相および親油性相（典型的には油および有機溶媒を含有する）で構成される。エマルジョンはまた、１種または複数種の界面活性剤を含むことが多い。ナノエマルジョン製剤は、例えば、米国特許第６，０１５，８３２号、米国特許第６，５０６，８０３号、米国特許第６，６３５，６７６号、米国特許第６，５５９，１８９号、および米国特許第７，７６７，２１６号に記載されているように周知であり、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマー、およびポリマーデンドリマーに共有結合する、または非共有結合的に会合する（Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８４５－５６；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１）：１２３－４３）。デンドリマー生成は、ペイロード容量およびサイズを制御することができ、高いペイロード容量を提供することができる。さらに、複数の表面基の表示を利用して、安定性を改善し、非特異的相互作用を減少させ、細胞特異的標的化および薬物放出を増強することができる。
いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、組換えウイルス（すなわち組換えウイルスベクター）を使用して細胞に導入される。そのような組換えウイルスは当技術分野で公知であり、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３ Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２）において考察されている）。本発明において有用な組換えＡＡＶは、標的細胞型へのウイルスの形質導入および標的細胞におけるヌクレアーゼ遺伝子の発現を可能にする任意の血清型を有し得る。例えば、いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９の血清型を有する。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは標的組織に直接注射される。代替の実施形態において、組換えウイルスは、循環系を介して全身に送達される。異なるＡＡＶが異なる組織に局在する傾向があることは、当技術分野で公知である。肝臓標的組織では、肝細胞の効果的な形質導入が、例えば、ＡＡＶ血清型２、８および９で示されている（Ｓａｎｄｓ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０７：１４１－１５７）。したがって、いくつかの実施形態において、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ２である。代替の実施形態において、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ６である。他の実施形態において、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ８である。さらに他の実施形態において、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ９である。ＡＡＶはまた、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。組換えＡＡＶによって送達される核酸分子は、左（５´）および右（３´）逆方向末端反復配列を含み得る。
一実施形態において、メガヌクレアーゼ遺伝子送達に使用される組換えウイルスは、自己制限組換えウイルスである。自己制限ウイルスは、ウイルスゲノム内に操作されたメガヌクレアーゼの認識配列が存在するため、細胞または生物において限られた持続時間を有し得る。したがって、自己制限組換えウイルスは、ＩＴＲ内のプロモータ、本明細書に記載のメガヌクレアーゼ、およびメガヌクレアーゼ認識部位をコードするように操作され得る。自己制限組換えウイルスは、メガヌクレアーゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように、メガヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、または生物に送達する。送達されたメガヌクレアーゼはまた、自己制限組換えウイルスゲノム内にその標的部位を見つけ、この標的部位で組換えウイルスゲノムを切断する。切断されると、ウイルスゲノムの５´および３´末端が露出し、エキソヌクレアーゼによって分解され、したがってウイルスが死滅し、メガヌクレアーゼの産生が停止する。
メガヌクレアーゼ遺伝子がＤＮＡ形態（例えばプラスミド）で、および／または組換えウイルス（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに動作可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、これは、組換えウイルス（例えばレンチウイルスのＬＴＲ）由来の内因性プロモータまたは周知のサイトメガロウイルスもしくはＳＶ４０ウイルス初期プロモータなどのウイルスプロモータであり得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞において遺伝子発現を優先的に駆動するプロモータに動作可能に連結される。肝臓特異的プロモータの例には、限定されないが、ヒトアルファ－１アンチトリプシンプロモータ、ハイブリッド肝臓特異的プロモータ（ＡｐｏＥ遺伝子由来の肝臓遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ－ＨＣＲ）および肝臓特異的アルファ１－アンチトリプシンプロモータ）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、ならびにアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータが含まれる。
いくつかの実施形態において、対象は、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または１×１０１４ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの用量で、医薬組成物を投与される。いくつかの実施形態において、対象は、少なくとも約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの用量で、医薬組成物を投与される。いくつかの実施形態において、対象は、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの用量で、医薬組成物を投与される。ある特定の実施形態において、対象は、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ（例えば、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの用量で、医薬組成物を投与される。
いくつかの実施態様において、対象は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇの操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの用量で、脂質ナノ粒子製剤を投与される。いくつかの実施態様において、対象は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２．５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約３．０ｍｇ／ｋｇの操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの用量で、脂質ナノ粒子製剤を投与される。いくつかの実施態様において、対象は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ～約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ～約３．０ｍｇ／ｋｇの操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの用量で、脂質ナノ粒子製剤を投与される。
本発明の操作されたメガヌクレアーゼの送達のための標的組織は、限定されないが、肝細胞または好ましくは初代肝細胞、より好ましくはヒト肝細胞またはヒト初代肝細胞、ＨｅｐＧ２．２．１５またはＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞などの肝臓の細胞を含む。議論されるように、本発明のメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、またはメガヌクレアーゼをコードするＲＮＡもしくはＤＮＡとして送達され得る。一実施形態において、メガヌクレアーゼタンパク質、またはメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡベクターは、標的組織への直接注射を介して標的細胞（例えば肝臓の細胞）に供給される。代替として、メガヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはメガヌクレアーゼを発現する細胞は、循環系を介して全身に送達され得る。
本明細書に開示されるヌクレアーゼを対象の肝臓に送達するための方法および組成物が提供される。一実施形態において、哺乳動物から取り出した天然肝細胞に、操作されたヌクレアーゼをコードするベクターを形質導入することができる。代替として、対象の天然肝細胞に、操作されたヌクレアーゼおよび／または肝毒素などの肝臓再生を刺激する分子をコードする組換えウイルス、例えば組換えＡＡＶをエクスビボで形質導入することができる。好ましくは、肝毒素はｕＰＡであり、組換えウイルスによって一旦発現されると、肝細胞からのその分泌を阻害するように改変されている。別の実施形態において、組換えウイルスは、肝細胞再生をデノボで刺激することができるｔＰＡをコードする核酸配列を含む。次いで、哺乳動物から取り出された形質導入肝細胞を哺乳動物に戻すことができ、そこで操作されたヌクレアーゼの発現を促す条件が提供される。典型的には、形質導入された肝細胞は、脾臓または門脈管構造を介した注入によって患者に戻すことができ、投与は１～５日間またはそれ以上の期間にわたり単回または複数回であり得る。
本発明の方法のインビボ態様において、操作されたヌクレアーゼをコードし、対象に投与されるレトロウイルス、偽型または組換えＡＡＶが構築される。操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む組換えウイルスの投与は、例えば、分泌障害型肝毒素をコードするか、または肝毒素として作用することなく肝細胞再生を刺激するｔＰＡをコードする核酸配列を含む組換えＡＡＶの投与と共に行うことができる。
本明細書に記載の方法の様々な実施形態において、本明細書に記載の１つもしくは複数の操作されたヌクレアーゼ、そのような操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、またはそのような操作されたヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスは、当技術分野で公知の任意の適切な投与経路を介して投与され得る。したがって、本明細書に記載の１つもしくは複数の操作されたヌクレアーゼ、そのような操作されたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、またはそのような操作されたヌクレアーゼをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含むベクターは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、肝臓内、経粘膜、経皮、動脈内および舌下を含む投与経路によって投与され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼタンパク質、またはヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡもしくはＤＮＡベクターは、標的組織への直接注射を介して標的細胞（例えば肝臓の細胞）に供給される。操作されたヌクレアーゼ、そのような操作されたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、またはそのような操作されたヌクレアーゼをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスの他の適切な投与経路は、必要に応じて治療医によって容易に決定され得る。
いくつかの実施形態において、治療有効量の本明細書に記載の操作されたヌクレアーゼが、それを必要とする対象に投与される。必要に応じて、操作されたヌクレアーゼの投薬量または投薬頻度は、投与する医師の判断に基づいて、治療の経過にわたって調整され得る。適切な用量は、他の要因の中でも、選択される任意のＡＡＶの詳細（例えば血清型など）、投与経路、治療される対象（すなわち対象の年齢、体重、性別および全身状態）、ならびに投与様式に依存する。したがって、適切な投与量は、患者によって異なり得る。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであってもよい。さらに、対象は、適切な場合には何回投与されてもよい。当業者は、適切な投与回数を容易に決定することができる。投薬量は、代替の投与経路を考慮に入れるか、または治療上の利益と任意の副作用とのバランスをとるために調整する必要があり得る。
いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド）、ならびに目的の配列をコードする核酸配列およびメガヌクレアーゼ切断部位に隣接する核酸配列に相同な核酸配列を含むポリヌクレオチドを送達することを含み、操作されたメガヌクレアーゼは、ＴＴＲ遺伝子内の配列番号７または配列番号９を含む認識配列を認識してそれを切断し、したがってＴＴＲ遺伝子を切断し、目的の配列は相同組換えによって切断部位に挿入される。
本発明の外因性核酸分子は、前述の手段のいずれかによって細胞に導入され得る、および／または対象に送達され得る。特定の実施形態において、外因性核酸分子は、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノウイルス、または組換えＡＡＶなどの組換えウイルス（すなわちウイルスベクター）によって導入される。外因性核酸分子を導入するのに有用な組換えＡＡＶは、ウイルスの細胞への形質導入および外因性核酸分子配列の細胞ゲノムへの挿入を可能にする任意の血清型を有し得る。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９の血清型を有する。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ２の血清型を有する。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ６の血清型を有する。いくつかの実施形態において、組換えＡＡＶは、ＡＡＶ８の血清型を有する。組換えＡＡＶはまた、宿主細胞において第２鎖ＤＮＡ合成を必要としないように自己相補的であり得る。組換えＡＡＶを使用して導入された外因性核酸分子は、５´（左）および３´（右）逆方向末端反復に隣接し得る。
別の特定の実施形態において、外因性核酸分子は、一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用して細胞に導入され得る。一本鎖ＤＮＡは、外因性核酸分子を含み得、特定の実施形態において、相同組換えによってヌクレアーゼ切断部位への核酸配列の挿入を促進するために５´および３´相同アームを含み得る。一本鎖ＤＮＡは、５´相同アームの５´上流に５´ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、および３´相同アームの３´下流に３´ＡＡＶ ＩＴＲ配列をさらに含み得る。
別の特定の実施形態では、本発明のヌクレアーゼおよび／または本発明の外因性核酸分子をコードする遺伝子は、線状ＤＮＡ鋳型によるトランスフェクションによって細胞に導入され得る。操作されたヌクレアーゼおよび／または外因性核酸分子をコードするプラスミドＤＮＡは、例えば、環状プラスミドＤＮＡが細胞へのトランスフェクションの前に線状化されるように、１つまたは複数の制限酵素によって消化され得る。
細胞に送達される場合、本発明の外因性核酸は、前述の哺乳動物プロモータおよび誘導性プロモータを含む、細胞におけるコードされたポリペプチドの発現に適した任意のプロモータに動作可能に連結され得る。本発明の外因性核酸はまた、合成プロモータに動作可能に連結され得る。合成プロモータには、限定されないが、ＪｅＴプロモータ（ＷＯ２００２／０１２５１４）が含まれ得る。特定の実施形態において、本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列は、肝臓特異的プロモータに動作可能に連結され得る。肝臓特異的プロモータの例には、限定されないが、ヒトアルファ－１アンチトリプシンプロモータおよびアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータが含まれる。
２．４ 医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体と、本発明の操作されたメガヌクレアーゼとを含む医薬組成物、または薬学的に許容される担体と、本発明の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドとを含む医薬組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される担体と本発明の遺伝子改変細胞とを含む医薬組成物であって、細胞が本明細書に開示される操作されたメガヌクレアーゼを発現する標的組織に送達され得る医薬組成物を提供する。特に、薬学的に許容される担体と、治療有効量の操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸または操作されたメガヌクレアーゼとを含む医薬組成物が提供され、操作されたヌクレアーゼは、ＴＴＲ５－６（配列番号９）またはＴＴＲ１５－１６（配列番号７）などのＴＴＲ遺伝子内の認識配列に対する特異性を有する。
したがって、本発明の医薬組成物は、対象におけるＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）を治療するため、ＴＴＲのレベルを低減するため、ＴＴＲアミロイドのレベルを低減するため、またはＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）に伴う症状を低減するために有用となり得る。ＴＴＲ関連疾患を有する対象または本明細書における操作されたメガヌクレアーゼによる治療を特に受け入れることができる対象は、１つまたは複数の危険因子、診断指標または予後指標、例えば本明細書中に記載されるものの存在または非存在を確認することによって特定され得る。例えば、いくつかの場合において、対象は、末梢神経系、自律神経系、軟膜および／または心臓に影響を及ぼすＴＴＲ遺伝子における突然変異を有する。ある特定の場合において、本明細書で提供される方法および組成物による治療を受けている対象は、ＴＴＲ遺伝子における１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、またはそれ以上）の突然変異によって特徴づけられ得る。例えば、治療を受けている対象は、Ｇｌｙ６Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１０Ａｒｇ、Ｌｅｕ１２Ｐｒｏ、Ａｓｐ１８Ｇｌｙ、Ｖａｌ２０Ｉｌｅ、Ａｌａ２５Ｔｈｒ、Ｖａｌ３０Ｍｅｔ、Ｖａｌ３０Ａｌａ、Ｖａｌ３０Ｌｅｕ、Ｖａｌ３０Ｇｌｙ、Ｐｈｅ３３Ｉｌｅ、Ｐｈｅ３３Ｌｅｕ、Ａｌａ３６Ｐｒｏ、Ｇｌｕ４２Ｇｌｙ、Ｐｈｅ４４Ｓｅｒ、Ａｌａ４５Ｔｈｒ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｇｌｙ４７Ａｌａ、Ｇｌｙ４７Ａｒｇ、Ｔｈｒ４９Ａｌａ、Ｓｅｒ５０Ａｒｇ、Ｓｅｒ５０Ｉｌｅ、Ｇｌｙ５３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ５５Ｐｒｏ、Ｌｅｕ５８Ｈｉｓ、Ｌｅｕ５８Ａｒｇ、Ｔｈｒ６０Ａｌａ、Ｇｌｕ６１Ｌｙｓ、Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｐｈｅ６４Ｓｅｒ、Ｉｌｅ６８Ｌｅｕ、Ｔｙｒ６９Ｈｉｓ、Ｌｙｓ７０Ａｓｎ、Ｖａｌ７１Ａｌａ、Ｓｅｒ７７Ｔｙｒ、Ｉｌｅ８４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ８９Ｇｌｎ、Ｈｉｓ９０Ａｓｎ、Ａｌａ９７Ｇｌｙ、Ａｌａ９７Ｓｅｒ、Ａｒｇ１０４Ｈｉｓ、Ｉｌｅ１０７Ｖａｌ、Ａｌａ１０９Ｔｈｒ、Ａｌａ１０９Ｖａｌ、Ｌｅｕ１１１Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１１４Ｃｙｓ、Ｔｙｒ１１４Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１１６Ｖａｌ、Ｔｈｒ１１９Ｍｅｔ、Ｖａｌ１２２Ｉｌｅ、またはＶａｌ１２２Ｄｅｌ突然変異を含む１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＴＴＲポリペプチドをコードするＴＴＲ遺伝子内に突然変異を有する。
ＴＴＲレベルは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、本明細書における方法に従う治療前、治療中または治療後の任意の時点で評価され得る。ＴＴＲレベルは、ＴＴＲ遺伝子発現に伴う任意の変数のレベル、例えば、ＴＴＲ ｍＲＮＡレベル、ＴＴＲタンパク質レベル、レチノール結合タンパク質レベル、ビタミンＡレベル、またはアミロイド沈着物の数もしくは範囲に基づいて評価され得る。ＴＴＲレベルまたは発現の低減は、参照レベルと比較したこれらの変数の１つまたは複数の絶対レベルまたは相対レベルの減少によって評価され得る。ＴＴＲレベルは、対象から単離された生物学的試料例えば組織生検、または血液、血清、血漿、脳脊髄液もしくは尿を含む体液において測定されてもよい。任意選択で、ＴＴＲレベルは、試料中の標準的なタンパク質または物質に対して正規化される。いくつかの実施形態において、特許請求される方法は、対象におけるＴＴＲレベルを参照レベルに対して少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％低減するための、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼをコードする核酸のいずれかの投与を含む。
そのような医薬組成物は、公知の技術に従って調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ ｅｄ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造では、メガヌクレアーゼポリペプチド（またはそれをコードするＤＮＡ／ＲＮＡもしくはそれを発現する細胞）が典型的には薬学的に許容される担体と混合され、得られた組成物が対象に投与される。担体は、製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容されなければならず、対象に有害であってはならない。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象の疾患の治療に有用な１つまたは複数の追加の薬剤または生物学的分子をさらに含み得る。同様に、追加の薬剤および／または生物学的分子は、別個の組成物として同時投与され得る。
本明細書に記載の医薬組成物は、有効量の本発明の任意のメガヌクレアーゼ、または任意のメガヌクレアーゼをコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇ（例えば、１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または１×１０１４ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、少なくとも約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または少なくとも約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１×１０１０ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１１ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ～約１×１０１４ｇｃ／ｋｇの、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、医薬組成物は、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ～約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ（例えば、約１×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約９×１０１２ｇｃ／ｋｇ、約１×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約２×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約３×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約４×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約５×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約６×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約７×１０１３ｇｃ／ｋｇ、約８×１０１３ｇｃ／ｋｇ、または約９×１０１３ｇｃ／ｋｇ）の、操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。
本発明の特定の実施形態において、医薬組成物は、本明細書の他の箇所に記載されている脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に記載の１つまたは複数のｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２つ以上のｍＲＮＡを含み得る。他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、少なくとも２つのｍＲＮＡを含み得、少なくとも１つの第１のｍＲＮＡは、ＴＴＲ５－６認識配列を認識してそれを切断する本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼをコードする本明細書に記載のｍＲＮＡであり、少なくとも１つの第２のｍＲＮＡは、ＴＴＲ５－６認識配列以外のＴＴＲ遺伝子内の認識配列（例えばＴＴＲ１５－１６）を認識してそれを切断する第２の操作されたメガヌクレアーゼをコードする。
本発明における使用に企図されるいくつかの脂質ナノ粒子は、少なくとも１種のカチオン性脂質、少なくとも１種の非カチオン性脂質、および少なくとも１種の複合脂質を含み得る。より特定の例において、脂質ナノ粒子は、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、および約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質複合体を含み得、非ラメラ（すなわち非二重層）の形態を有するような様式で製造される。他の特定の例において、脂質ナノ粒子は、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％のカチオン性脂質、約１３ｍｏｌ％～約４９．５ｍｏｌ％の非カチオン性脂質、および約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％の脂質複合体を含み得、非ラメラ（すなわち非二重層）の形態を有するような様式で製造される。
カチオン性脂質は、例えば、以下のうちの１つまたは複数を含み得る：パルミトイル－オレオイル－ノル－アルギニン（ＰＯＮＡ）、ＭＰＤＡＣＡ、ＧＵＡＤＡＣＡ、（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）（ＭＣ３）、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４およびＰａｎ ＭＣ５、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１、３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１、３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１、３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５´－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３´－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９´，１－２´－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ´－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ´－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、またはそれらの混合物。カチオン性脂質はまた、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「ＸＴＣ２」）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、Ｐａｎ ＭＣ５、またはそれらの混合物であり得る。
様々な実施形態において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し得る。
他の実施形態において、カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を構成し得る。
非カチオン性脂質は、例えば、１つまたは複数のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。特定の実施形態において、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質成分のうちの１つを含む：（１）コレステロールもしくはその誘導体；（２）リン脂質；または（３）リン脂質およびコレステロール若しくはその誘導体の混合物。コレステロール誘導体の例には、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２´－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４´－ヒドロキシブチルエーテル、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、およびそれらの混合物を含むがこれらに限定されない中性脂肪であってもよい。ある特定の実施形態において、リン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、またはそれらの混合物である。
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質（例えば、１つまたは複数のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成し得る。非カチオン性脂質がリン脂質およびコレステロールまたはコレステロール誘導体の混合物である場合、混合物は、粒子中に存在する全脂質の最大約４０、５０または６０ｍｏｌ％を構成し得る。
粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質複合体、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質複合体、カチオン性ポリマー－脂質複合体（ＣＰＬ）、またはそれらの混合物の１つまたは複数を含み得る。１つの特定の実施形態において、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質複合体またはＡＴＴＡ－脂質複合体のいずれかを含む。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ－脂質複合体またはＡＴＴＡ－脂質複合体は、ＣＰＬと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むＰＥＧ－脂質を含み得る。ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体は、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）、またはそれらの混合物であってもよい。
本発明における使用に適したさらなるＰＥＧ－脂質複合体には、ｍＰＥＧ２０００－１、２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６に記載されている。本発明における使用に適したさらなるＰＥＧ－脂質複合体には、１－［８´－（１，２－ジミリストイル－３－プロパノキシ）－カルボキサミド－３´，６´－ジオキサオクタニル］カルバモイル－ω－メチル－ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）が含まれるが、これらに限定されない。２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載されている。
いくつかの場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えばＰＥＧ－脂質複合体）は、粒子中に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９もしくは２ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくは範囲）を構成し得る。典型的には、そのような場合において、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えばＰＥＧ－脂質複合体）は、粒子中に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくは範囲）を含み得る。典型的には、そのような場合において、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
他の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの正電荷担体および正電荷担体とは異なる少なくとも１つの負電荷担体を含有する両性リポソームを含み得、リポソームの等電点は４～８である。この目的は、リポソームがｐＨ依存性の変化する電荷を用いて調製されるという事実によって達成される。
所望の特性を有するリポソーム構造は、例えば、膜形成または膜ベースのカチオン性電荷担体の量が低ｐＨではアニオン性電荷担体の量を超え、高ｐＨでは比が逆転する場合に形成される。これは、イオン化可能な成分が４～９のｐＫａ値を有する場合に常に当てはまる。媒体のｐＨが低下すると、すべてのカチオン性電荷担体がより多く帯電し、すべてのアニオン性電荷担体がその電荷を失う。
両性リポソームに有用なカチオン性化合物には、本明細書において上述されたカチオン性化合物が含まれる。限定されないが、強カチオン性化合物には、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´－ジメチルメタン）カルバモイル］コレステロール、ＴＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´，Ｎ´－トリメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール、ＢＧＳＣビスグアニジニウム－スペルミジン－コレステロール、ＢＧＴＣビス－グアニジニウム－トレン－コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＳＰＥＲ（１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）－プロピルアルニド、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標））、ＤＯＲＩＥ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＳＣ（１，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセリルコリンエステル）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－スクシニル－２－ヒドロキシエチルジスルフィドオミチン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリコール－スペルミン（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標））（Ｃ１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリシン、ＣＴＡＢセチルトリメチルアンモニウムブロミド、ＣｐｙＣセチルピリジニウムクロリド、ＤＯＥＰＣ １，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリンまたは他のＯ－アルキル－ホスファチジルコリンもしくはエタノールアミン、リジン、アルギニンもしくはオルニチンおよびホスファチジルエタノールアミンからのアミドが含まれ得る。
弱カチオン性化合物の例には、限定されないが、Ｈｉｓ－Ｃｈｏｌ（ヒスタミン－コレステロールヘミスクシネート）、Ｍｏ－Ｃｈｏｌ（モルホリン－Ｎ－エチルアミノ－コレステロールヘミスクシネート）またはヒスチジニル－ＰＥが含まれる。
中性化合物の例には、限定されないが、コレステロール、セラミド、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、またはジアシルグリセロールが含まれる。
両性リポソームに有用なアニオン性化合物には、本明細書において前述された非カチオン性化合物が含まれる。限定されないが、弱アニオン性化合物の例には、ＣＨＥＭＳ（コレステロールヘミスクシネート）、８～２５個の炭素原子を有するアルキルカルボン酸、またはジアシルグリセロールヘミスクシネートが含まれ得る。さらなる弱アニオン性化合物には、アスパラギン酸またはグルタミン酸のアミド、ならびにＰＥおよびＰＳおよびグリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、グルタミン酸、アスパラギン酸または他のアミノ酸もしくはアミノジカルボン酸とのそのアミドが含まれ得る。同様の原理により、ヒドロキシカルボン酸またはヒドロキシジカルボン酸とＰＳとのエステルも弱アニオン性化合物である。
いくつかの実施形態において、両性リポソームは、本明細書において上述されたものなどの複合脂質を含有し得る。有用な複合脂質の特定の例には、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミド複合体（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミンおよびＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが含まれるが、これらに限定されない。特定の例は、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロールである。
いくつかの実施形態において、中性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％または約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を構成し得る。
いくつかの場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えばＰＥＧ－脂質複合体）は、粒子中に存在する全脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏｌ％、または約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９もしくは２ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくは範囲）を構成し得る。典型的には、そのような場合において、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えばＰＥＧ－脂質複合体）は、粒子中に存在する全脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、または約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、もしくは１０ｍｏｌ％（またはその任意の分数もしくは範囲）を含み得る。典型的には、そのような場合において、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
中性脂質および複合脂質の総量を考慮すると、両性リポソームの残りの残部は、様々な比率で製剤化されたカチオン性化合物およびアニオン性化合物の混合物を含み得る。カチオン性脂質対アニオン性脂質の比は、核酸封、ゼータ電位、ｐＫａ、または荷電脂質成分の存在に少なくとも部分的に依存する他の物理化学的特性の所望の特性を達成するために選択され得る。
いくつかの態様において、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達および取り込みを特異的に増強する組成物を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象のＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）の治療に有用な１つまたは複数の追加の薬剤をさらに含み得る。
本開示はまた、医薬品として使用するための本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸もしくは操作されたメガヌクレアーゼを発現する細胞）を提供する。本開示はさらに、ＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）を治療するための医薬、ＴＴＲのレベルを低減するための医薬、ＴＴＲアミロイドのレベルを低減するための医薬、またはＴＴＲ関連疾患（例えばトランスサイレチンアミロイドーシス）に伴う症状を低減するための医薬の製造における、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼ（またはそれをコードする核酸もしくは操作されたメガヌクレアーゼを発現する細胞）の使用を提供する。
２．５ 組換えウイルスを生成するための方法
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の方法で使用するための組換えウイルス（すなわち組換えウイルスベクター；例えば組換えＡＡＶベクター）を提供する。組換えＡＡＶは、典型的には、ＨＥＫ－２９３等の哺乳動物細胞株で生成される。ウイルスのｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子は、その自己複製を防止して治療遺伝子（例えばメガヌクレアーゼ遺伝子）を送達する余地を作るために組換えウイルスから除去されるため、これらをパッケージング細胞株にトランスで提供する必要がある。さらに、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」（例えばアデノウイルス）成分を提供する必要がある（Ｃｏｔｓ Ｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－８１）。多くの場合、組換えＡＡＶは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプラスミド、ｃａｐ遺伝子およびｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、ならびにウイルスにパッケージングされる介在ＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドで細胞株をトランスフェクトするトリプルトランスフェクションを使用して生成される。次いで、カプシドに包まれたゲノム（目的のＩＴＲおよび介在遺伝子）を含むウイルス粒子が、凍結融解サイクル、超音波処理、界面活性剤、または当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離される。次いで、粒子は塩化セシウム密度勾配遠心分離またはアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され、続いて細胞、組織またはヒト患者などの生物の目的の遺伝子に送達される。
組換えＡＡＶ粒子は典型的には細胞内で生成される（製造される）ため、本発明を実践するにあたり、操作されたメガヌクレアーゼがパッケージング細胞内で発現されないことを確実にするように注意を払わなければならない。本発明の組換えウイルスゲノムはメガヌクレアーゼの認識配列を含み得るため、パッケージング細胞株で発現される任意のメガヌクレアーゼは、ウイルス粒子にパッケージングされ得る前にウイルスゲノムを切断することが可能となり得る。これは、パッケージング効率の低減および／または断片化されたゲノムのパッケージングをもたらす。パッケージング細胞におけるメガヌクレアーゼ発現を防止するために、いくつかのアプローチを使用することができる。
ヌクレアーゼは、パッケージング細胞において活性でない組織特異的プロモータの制御下に置くことができる。例えば、筋肉組織へのメガヌクレアーゼ遺伝子の送達のために組換えウイルスを開発する場合、筋肉特異的プロモータを使用することができる。筋肉特異的プロモータの例には、Ｃ５－１２（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ（Ｙｕａｓａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５７６－８８）、または平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）が含まれる。ＣＮＳ（ニューロン）特異的プロモータの例とには、ＮＳＥ、シナプシンおよびＭｅＣＰ２プロモータ（Ｌｅｎｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７９－８８）が含まれる。肝臓特異的プロモータの例には、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂ等）、ヒトα１－アンチトリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、およびヘモペキシン（Ｐｈｐｘ等）が含まれる（Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ７：３７５－８５）、ハイブリッド肝臓特異的プロモータ（ＡｐｏＥ遺伝子由来の肝臓遺伝子座制御領域（ＡｐｏＥ－ＨＣＲ）および肝臓特異的アルファ１－アンチトリプシンプロモータ）、ヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、ならびにアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータが含まれる。眼特異的プロモータの例には、オプシン、および角膜上皮特異的Ｋ１２プロモータ（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，９：９５６－６６）が含まれる。これらのプロモータ、または当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ－２９３細胞において高度に活性ではなく、したがって、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッケージング細胞において有意なレベルのメガヌクレアーゼ遺伝子発現を生じることは予想されない。同様に、本発明の組換えウイルスは、適合しない組織特異的プロモータ（すなわち、周知のＨｅＬａ細胞株（ヒト上皮細胞）および肝臓特異的ヘモペキシンプロモータの使用）を使用した他の細胞株の使用を意図する。組織特異的プロモータの他の例には、滑膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、ＡＤＰＲＨＬ１（心臓）、および一遺伝子性奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が含まれる（Ｊａｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。
代替として、組換えウイルスは、メガヌクレアーゼが発現されにくい様々な種由来の細胞にパッケージングされ得る。例えば、ウイルス粒子は、非哺乳動物パッケージング細胞では活性ではない周知のサイトメガロウイルスまたはＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等の哺乳動物プロモータを使用して、微生物、昆虫または植物細胞で生成され得る。特定の実施形態では、ウイルス粒子は、Ｇａｏら（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８－４３）により説明されているようなバキュロウイルス系を使用して昆虫細胞で生成される。哺乳動物プロモータの制御下にあるメガヌクレアーゼは、これらの細胞で発現される可能性は低い（Ａｉｒｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（４）：７３９－４９）。さらに、昆虫細胞は、哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシングモチーフを利用する。したがって、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）イントロンまたはＳＶ４０ラージＴ抗原イントロン等の哺乳動物イントロンを、メガヌクレアーゼのコード配列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞内のプレｍＲＮＡ転写物から効率的にスプライシングされないため、昆虫細胞は機能的メガヌクレアーゼを発現せず、全長ゲノムをパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達される哺乳動物細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライシングし、機能的メガヌクレアーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、昆虫パッケージング細胞における毒性タンパク質バルナーゼおよびジフテリア毒素フラグメントＡの発現を減弱させるためのＨＧＨおよびＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用を報告しており、これらの毒素遺伝子を有する組換えＡＡＶベクターの生成を可能にしている（Ｃｈｅｎ，Ｈ（２０１２）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
メガヌクレアーゼ遺伝子は、小分子誘導物質がメガヌクレアーゼ発現に必要とされるように、誘導性プロモータに動作可能に連結され得る。誘導性プロモータの例には、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４）、およびＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈシステム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｓｐｉｎｅ，３６（１０）：Ｅ６２３－８）が含まれる。両方の系、ならびに当技術分野で公知の同様の系は、小分子活性化因子（それぞれドキシサイクリンまたはエクジソン）に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれＴｅｔリプレッサおよびエクジソン受容体の変異体）に依存する。そのようなリガンド誘導性転写活性化因子を使用して本発明を実践することは、１）メガヌクレアーゼ遺伝子を、対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に置くこと（メガヌクレアーゼ遺伝子は、転写因子に対する（１つまたは複数の）結合部位を有する）、および２）パッケージングされたウイルスゲノムに転写因子をコードする遺伝子を含めることを含む。後者のステップは、転写活性化因子が同じ細胞にも提供されない場合、メガヌクレアーゼが組換えＡＡＶ送達後に標的細胞または組織で発現されないため、必要である。次いで、転写活性化因子は、同族小分子活性化因子で処理された細胞または組織においてのみメガヌクレアーゼ遺伝子発現を誘導する。このアプローチは、小分子誘導物質がいつどの組織に送達されるかを選択することによって、メガヌクレアーゼ遺伝子発現を時空間的に制御することを可能にするため、有利である。しかしながら、運搬能力が著しく制限されているウイルスゲノムに誘導物質を含める必要性は、このアプローチに欠点をもたらす。
別の特定の実施形態において、組換えＡＡＶ粒子は、メガヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサを発現する哺乳動物細胞株で生成される。転写リプレッサは当技術分野で公知であり、Ｔｅｔリプレッサ、Ｌａｃリプレッサ、Ｃｒｏリプレッサおよびラムダリプレッサを含む。エクジソン受容体等の多くの核ホルモン受容体は、それらの同族ホルモンリガンドの非存在下で転写抑制因子としても作用する。本発明を実践するために、パッケージング細胞は、転写リプレッサをコードするベクターでトランスフェクト／形質導入され、ウイルスゲノム内のメガヌクレアーゼ遺伝子（パッケージングベクター）は、リプレッサがプロモータをサイレンシングするように、リプレッサの結合部位を含むように改変されたプロモータに動作可能に連結される。転写リプレッサをコードする遺伝子は、様々な位置に配置され得る。これは、別個のベクター上にコードされ得るか、ＩＴＲ配列の外側のパッケージングベクターに組み込まれ得るか、ｃａｐ／ｒｅｐベクターもしくはアデノウイルスヘルパーベクターに組み込まれ得るか、または構成的に発現されるようにパッケージング細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。転写リプレッサ部位を組み込むように一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＣｈａｎｇおよびＲｏｎｉｎｓｏｎは、強力な構成的ＣＭＶおよびＲＳＶプロモータを、Ｌａｃリプレッサのオペレータを含むように改変し、改変されたプロモータからの遺伝子発現が、リプレッサを発現する細胞において大きく減衰されることを示した（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｒｏｎｉｎｓｏｎ（１９９６），Ｇｅｎｅ １８３：１３７－４２）。非ヒト転写リプレッサの使用は、メガヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッサを発現するパッケージング細胞でのみ抑制され、得られた組換えＡＡＶで形質導入された標的細胞または組織では抑制されないことを確実にする。
２．６ 操作されたメガヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼおよびその変異体を包含する。本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載のメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。
本明細書で使用される場合、「変異体」は、実質的に類似の配列を意味することを意図する。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１つもしくは複数の内部部位での１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、および／または天然ポリペプチドの１つもしくは複数の部位での１つもしくは複数のアミノ酸の置換によって「天然」ポリペプチドから得られるポリペプチドを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それから変異体が得られる親配列を含む。実施形態に包含される変異体ポリペプチドは、生物学的に活性である。換言すれば、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわちＴＴＲ遺伝子またはＴＴＲ１５－１６認識配列（配列番号９）内のＴＴＲ５－６認識配列（配列番号７）に結合してそれを切断する能力を保持し続ける。そのような変異体は、例えば、人為的なマニピュレーションから生じ得る。実施形態の天然ポリペプチド（例えば配列番号１１～１５）の生物学的に活性な変異体、または本明細書に記載の認識半部位結合サブユニットの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される場合、天然ポリペプチド、天然サブユニット、天然ＨＶＲ１領域および／または天然ＨＶＲ２領域のアミノ酸配列と少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチドまたはサブユニットの生物学的に活性な変異体は、わずか約１～４０アミノ酸残基、わずか約１～２０アミノ酸残基、わずか約１～１０アミノ酸残基、わずか約５アミノ酸残基、わずか４アミノ酸残基、３アミノ酸残基、２アミノ酸残基、またはさらには１アミノ酸残基だけ、そのポリペプチドまたはサブユニットと異なり得る。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断および挿入を含む様々な方法で改変され得る。そのようなマニピュレーションのための方法は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡ内の突然変異によって調製され得る。突然変異誘発およびポリヌクレオチドの変化のための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８－４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。１つのアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸と交換する等の保存的置換が最適であり得る。
いくつかの実施形態において、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に開示されるＨＶＲ１およびＨＶＲ２領域の変異体を含み得る。親ＨＶＲ領域は、例えば、例示の操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０を含み得る。したがって、変異体ＨＶＲは、変異体ＨＶＲ領域が操作されたメガヌクレアーゼの生物学的活性（すなわち、認識配列への結合およびその切断）を維持するように、本明細書に例示される操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９または残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、変異体ＨＶＲ１領域または変異体ＨＶＲ２領域は、親ＨＶＲ内の特定の位置に見られるアミノ酸残基に対応する残基を含み得る。これに関連して、「～に対応する」とは、変異体ＨＶＲ中のアミノ酸残基が、同じ相対位置で（すなわち、親配列中の残りのアミノ酸に対して）親ＨＶＲ配列中に存在する同じアミノ酸残基（すなわち別個の同一の残基）であることを意味する。例として、親ＨＶＲ配列が２６位にセリン残基を含む場合、残基２６「に対応する残基を含む」変異体ＨＶＲはまた、親の２６位に対して親の２６位に対して相対的な（すなわち対応する）位置にセリンを含む。
特定の実施形態において、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１１～１５のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するＨＶＲ１を含む。
ある特定の実施形態において、本発明の操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１１～１５のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有するＨＶＲ２を含む。
野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当数のアミノ酸修飾が以前に同定されており（例えば米国特許第８，０２１，８６７号）、これは単独でまたは組み合わせて、ＤＮＡ認識配列半部位内の個々の塩基で特異性が変化した操作されたメガヌクレアーゼをもたらし、その結果、得られた合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、野生型酵素とは異なる半部位特異性を有する。表３は、認識半部位の各半部位位置（－１～－９）に存在する塩基に基づいて特異性を高めるために、操作されたメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットにおいて行われ得る潜在的な置換を示す。

太字のエントリーは野生型接触残基であり、本明細書で使用される「改変」を構成しない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖上の塩基と接触することを示す。
ＤＮＡ結合親和性および／または活性を調節するために、操作されたメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットにおいてある特定の修飾を行うことができる。例えば、本明細書に記載の操作されたメガヌクレアーゼモノマーまたはサブユニットは、Ｉ－ＣｒｅＩの１９位に対応する残基もしくは配列番号１１～１５のいずれか１つにＧ、Ｓ、もしくはＡを（ＷＯ２００９００１１５９）、Ｉ－ＣｒｅＩの６６位に対応する残基もしくは配列番号１１～１５のいずれか１つにＹ、Ｒ、Ｋ、もしくはＤを、および／またはＩ－ＣｒｅＩの８０位に対応する残基もしくは配列番号１１～１５のいずれか１つにＥ、Ｑ、もしくはＫを含み得る（ＵＳ８０２１８６７）。
ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然ポリヌクレオチド内の１または複数の部位に１つまたは複数のヌクレオチドの欠失および／または付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の変異体が、オープンリーディングフレームが維持されるように構築されることを認識するであろう。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体は、遺伝コードの縮重のために、実施形態のポリペプチドの１つのアミノ酸配列をコードする配列を含む。変異体ポリヌクレオチドは、例えば部位指向型突然変異誘発を使用することによって生成されるが、依然として実施形態の組換えヌクレアーゼをコードするもの等の合成的に得られたポリヌクレオチドを含む。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体は、本明細書の他の箇所に記載の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定される場合、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれ以上の配列同一性を有するであろう。実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体（すなわち参照ポリヌクレオチド）もまた、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性の比較によって評価することができる。
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、ポリペプチドの特徴に根本的な変化をもたらすとは予想されない。しかしながら、置換、欠失または挿入の正確な効果を事前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果がポリペプチドをその意図された活性でスクリーニングすることによって評価されることを理解するであろう。例えば、操作されたヌクレアーゼの変異体は、ＴＴＲ遺伝子内に見出される認識配列に優先的に結合してそれを切断するそれらの能力についてスクリーニングされるであろう。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは限定として解釈されるべきではない。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の特定の物質および手順の多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることが意図される。
実施例１
ＴＴＲ５－６認識配列に結合してそれを切断するメガヌクレアーゼの特徴づけ
１．ＴＴＲ５－６認識配列に結合してそれを切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において集合的に「ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼ」と称される、ＴＴＲ５－６認識部位（配列番号１５）を標的とする組換えメガヌクレアーゼを、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ゲノムにおけるＴＴＲ５－６認識配列（配列番号９）に結合してこれを切断するように操作した。各認識配列は、ＴＴＲ遺伝子、具体的にはエクソン１内に存在する。各ＴＴＲ５－６組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０から得られたＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列および第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼにおける第１のサブユニットは、第１のＴＴＲ５－６認識半部位（配列番号３０）に結合し、一方、第２のサブユニットは、第２のＴＴＲ５－６認識半部位（配列番号３２；図１を参照されたい）に結合する。
ＴＴＲ５－６結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１およびＨＶＲ２とそれぞれ称される５６塩基対超可変領域を含む。各ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼ結合サブユニットのＨＶＲ１領域は、配列番号１５の残基２４～７９からなる。各ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼのＨＶＲ２領域は、配列番号１５の残基２１５～２７０からなる。配列番号１５のＴＴＲ５－６結合領域は、配列番号２４～２５として提供される。
２．ＣＨＯ細胞レポータアッセイにおけるＴＴＲ５－６認識配列の切断
ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼがヒトおよびと非ヒト霊長類５－６認識配列（配列番号９）の両方に結合してそれらを切断することができるかどうかを決定するために、各組換えメガヌクレアーゼを、以前に説明されたＣＨＯ細胞レポータアッセイ（ＷＯ／２０１２／１６７１９２および図５を参照されたい）を使用して評価した。アッセイを行うために、細胞のゲノムに組み込まれた非機能性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセットを有するＣＨＯ細胞レポータ株を生成した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認識配列の細胞内切断が相同組換えイベントを刺激して機能的ＧＦＰ遺伝子をもたらすように、各細胞株のＧＦＰ遺伝子を一対の認識配列によって中断した。
この研究のために開発されたＣＨＯレポータ細胞株では、ＧＦＰ遺伝子に挿入された１つの認識配列は、ヒト５－６認識配列（配列番号９）またはモデルＮＨＰ標的配列（配列番号３４）であった。ヒト、マウスおよびＮＨＰにおける５－６標的部位は保存されており、配列番号９と同一である。しかしながら、マウスおよびＮＨＰにおけるすぐ上流のゲノム配列は、メガヌクレアーゼの結合および切断に影響を及ぼし得る潜在的なメチル化部位を表し得るＣｐＧアイランドを含む。したがって、モデルＮＨＰ標的配列（配列番号３４）を調製して、ＧＦＰレポータアッセイにおける５－６メガヌクレアーゼの効率を決定した。ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列は、「ＣＨＯ－２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識および切断されるＣＨＯ－２３／２４認識配列であった。ヒトＴＴＲ５－６認識配列およびＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポータ細胞は、「ＴＴＲ５－６ｈ細胞」と称される。モデルＮＨＰ５－６認識配列およびＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポータ細胞は、「ＴＴＲ５－６ｎｈｐ細胞」と称される。
ＣＨＯレポータ細胞を、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。また、ＣＨＯレポータ細胞を、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでもトランスフェクトした。各アッセイにおいて、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者の指示に従って使用し、９６ウェルプレート内で５ｅ４ ＣＨＯレポータ細胞を９０ｎｇのｍＲＮＡでトランスフェクトした。ＴＴＲ５～６ｈおよびＴＴＲ５～６ｎｈｐ細胞を、トランスフェクションの２日後、５日後および７日後にフローサイトメトリーによって評価して、トランスフェクトされていない陰性対照と比較してＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを決定した。各時点で得られたデータを、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼを使用して観察されたＧＦＰ陽性細胞％に対して正規化して「活性スコア」を決定し、最も早い時点からの正規化データを最新の時点から差し引いて「毒性スコア」を決定した。次いで、活性および毒性スコアを一緒に加算して「活性指数」を決定し、次いでこれをＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの活性指数に対して正規化して、細胞株間のデータを比較した。
３．結果
図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼは、ヒト（図６Ａ）およびモデルＮＨＰ（図６Ｂ）の両方の認識配列を高頻度で切断した。
４．結論
これらの研究は、本発明に包含されるＴＴＲ５－６認識部位（例えば、配列番号１５のメガヌクレアーゼ）を標的化する操作されたメガヌクレアーゼが、ヒトまたはモデルＮＨＰ認識配列を有する細胞においてそれらのそれぞれの認識配列を効率的に標的化および切断し得ることを実証した。
実施例２
ＴＴＲ５－６認識配列に結合してそれを切断するメガヌクレアーゼの挿入および欠失の特徴づけ
１．方法
ＴＴＲ５－６ヌクレアーゼを評価するために、Ｌｏｎｚａ Ａｍａｘａ ４Ｄシステムを使用して、１ｅ６ ＨｅｐＧ２細胞に、各ＴＴＲヌクレアーゼまたはＧＦＰをコードする５００ｎｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。さらに、７ｅ５ ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＴＲヌクレアーゼまたはＧＦＰの７００ｎｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。ｇＤＮＡ調製のためにエレクトロポレーションの２日後に細胞を収集し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓサイトメータを使用してトランスフェクション効率について評価した。トランスフェクション効率は両方の細胞株で９０％を超えた。追加の時点を、ｇＤＮＡ抽出のためにエレクトロポレーションの６日後および９日後に収集した。ｇＤＮＡは、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅキットを用いて調製した。
デジタル液滴ＰＣＲを利用して、ＴＴＲ５－６結合部位における標的挿入および欠失の頻度（インデル％）を、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためのプライマーＰ１、Ｆ１およびＲ１、ならびに参照アンプリコンを生成するためのプライマーＰ２、Ｆ２、Ｒ２を使用して決定した。１×ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし、ＢｉｏＲａｄ）、２５０ｎＭの各プローブ、９００ｎＭの各プライマー、５ＵのＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ、および約５０ｎｇの細胞ｇＤＮＡを含有する２０μＬの反応液中で、増幅を多重化した。ＱＸ１００液滴生成器（ＢｉｏＲａｄ）を使用して液滴を生成した。サイクル条件は以下の通りであった：９５℃（２℃／秒の傾斜）で１０分間の１サイクル、９４℃（２℃／秒の傾斜）で１０秒間の４５サイクル、６０℃（２℃／秒の傾斜）で３０秒間、７２℃（２℃／秒の傾斜）で１分間、９８℃で１０分間の１サイクル、４℃保持。液滴をＱＸ２００液滴リーダ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して分析し、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ分析ソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用してデータを取得および分析した。結合部位プローブの陽性コピー数を参照プローブの陽性コピー数で除し、ヌクレアーゼ処理細胞におけるＦＡＭ＋コピーの喪失を疑似ランスフェクト細胞と比較することによってインデル頻度を計算した。
Ｐ１：５６－ＦＡＭ／ＴＧＣＴＧＧＡＣＴ／ＺＥＮ／ＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号３５）
Ｆ１：ＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号３６）
Ｒ１：ＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＧＴＡＧＧ（配列番号３７）
Ｐ２：５ＨＥＸ／ＡＡＡＴＴＣＣＴＣ／ＺＥＮ／ＣＴＣＡＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＣ／３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号３８）
Ｆ２：ＡＧＴＣＴＧＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＴ（配列番号３９）
Ｒ２：ＣＣＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣ（配列番号４０）
２．結果
操作されたメガヌクレアーゼを、ＴＴＲ５－６結合部位に対して設計し、２つの細胞株におけるインデル形成について評価した。ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４は、各細胞株において活性を示し、ＨｅｐＧ２細胞において約２５％のインデルを生じ（図７Ａ）、ＨＥＫ２９３細胞において約１５％のインデルを生じた（図７Ｂ）。このメガヌクレアーゼは、両方の細胞株においてエレクトロポレーションの２、６、および９日後に安定なインデルを示し、それらが十分に忍容されることを示した（図７Ａおよび７Ｂを参照されたい）。
３．結論
これらのデータは、ＴＴＲメガヌクレアーゼがインビトロでＴＴＲ５－６部位において高レベルのオンターゲット編集を生じさせることを示している。試験したヌクレアーゼは、実験の過程を通して一貫した編集を示し、これは、細胞によって十分に忍容され、ゲノム編集が持続的であることを示していた。
実施例３
ＴＴＲ１５－１６認識配列に結合してそれを切断するメガヌクレアーゼの特徴づけ
１．ＴＴＲ１５－１６認識配列に結合してそれを切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において集合的に「ＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼ」と称される、ＴＴＲ１５－１６認識部位（配列番号１１～１４）を標的とする組換えメガヌクレアーゼを、ヒトゲノムにおけるＴＴＲ１５－１６認識配列（配列番号７）に結合してこれを切断するように操作した。各認識配列は、ＴＴＲ遺伝子、具体的にはエクソン３内に存在する。各ＴＴＲ１５－１６組換えメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０から得られたＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列および第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼにおける第１のサブユニットは、第１のＴＴＲ１５－１６認識半部位（配列番号２６）に結合し、一方、第２のサブユニットは、第２のＴＴＲ１５－１６認識半部位（配列番号２８；図２を参照されたい）に結合する。
ＴＴＲ１５－１６結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１およびＨＶＲ２とそれぞれ称される５６塩基対超可変領域を含む。各ＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼ結合サブユニットのＨＶＲ１領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２４～７９からなる。各ＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼのＨＶＲ２領域は、配列番号１１～１４のいずれか１つの残基２１５～２７０からなる。配列番号１１～１４のＴＴＲ１５－１６結合領域は、それぞれ配列番号１６～２３として提供される。
２．ＣＨＯ細胞レポータアッセイにおけるＴＴＲ１５－１６認識配列の切断
ＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼがヒト１５－１６認識配列（配列番号７）に結合してそれを切断することができるかどうかを決定するために、組換えメガヌクレアーゼＴＴＲ１５－１６ｘ．８１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４およびＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１を、以前に説明されたＣＨＯ細胞レポータアッセイ（ＷＯ／２０１２／１６７１９２、図５を参照されたく、上記の実施例１に記載される通りである）を使用して評価した。
この研究のために開発されたＣＨＯレポータ細胞株では、ＧＦＰ遺伝子に挿入された１つの認識配列は、ヒト ＴＴＲ １５－１６認識配列（配列番号７）であった。実施例１について説明されたように、ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列は、「ＣＨＯ－２３／２４」と呼ばれる対照メガヌクレアーゼによって認識および切断されるＣＨＯ－２３／２４認識配列であった。ＣＨＯレポータ細胞を、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４およびＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトした。また、ＣＨＯレポータ細胞を、ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡでもトランスフェクトし、実施例１に記載されるようにデータを得て分析した。
３．結果
図９に示されるように、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６１、ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１６４およびＴＴＲ１５－１６Ｌ．１８１のメガヌクレアーゼは、ヒトＴＴＲ１５－１６認識配列を高頻度で切断した。
３．結論
これらの研究は、本発明に包含されるＴＴＲ１５－１６認識部位（例えば、配列番号１１～１４のメガヌクレアーゼ）を標的化する操作されたメガヌクレアーゼが、細胞においてそれぞれの認識配列を効率的に標的化および切断し得ることを実証した。
実施例４
ＴＴＲ１５－１６認識配列に結合してそれを切断するメガヌクレアーゼの挿入および欠失の特徴づけ
１．方法
ＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼを評価するために、ＨｅｐＧ２細胞およびＨＥＫ２９３細胞に、各ＴＴＲ１５－１６メガヌクレアーゼまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、回収し、実施例３に記載のようにトランスフェクション効率について分析した。トランスフェクション効率は両方の細胞株で９０％を超えた。実施例３に記載のように、ｇＤＮＡ抽出のためにエレクトロポレーションの６日後または７日後に追加の時点を収集した。さらなる実験を行って、ＨｅｐＧ２、ＨＥＫ２９３およびＨｅｐ３Ｂ細胞における異なる投薬量にわたるインデル頻度を決定した。
デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を利用して、ＴＴＲ１５－１６結合部位におけるインデル頻度を、結合部位を取り囲むアンプリコンを生成するためのオリゴＰ３、Ｆ３およびＲ３、ならびに参照アンプリコンを生成するためのＰ４、Ｆ４、Ｒ４を使用して決定した。実施例２に記載のようにｄｄＰＣＲアッセイを行った。
Ｐ３：５６－ＦＡＭ／ＡＴＧＧＧＣＴＣＡ／ＺＥＮ／ＣＡＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＴ／３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号４１）
Ｆ３：ＴＣＣＡＧＡＣＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＴＡＴＡＧ（配列番号４２）
Ｒ３：ＴＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＣＴＴＣＴＡＣ（配列番号４３）
Ｐ４：５ＨＥＸ／ＴＧＣＴＧＧＡＣＴ／ＺＥＮ／ＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＡ／３ＩＡＢｋＦＱ（配列番号４４）
Ｆ４：ＣＣＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号４５）
Ｒ４：ＣＡＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＧＴＡＧＧ（配列番号４６）
２．結果
ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼは、ＨＥＫ２９３細胞において約８５％のインデルで高レベルの活性を示した（図９Ａを参照されたい）。この高い効力を有するヌクレアーゼをＨｅｐＧ２細胞においてさらに評価して、肝細胞株における活性を確認した。この場合もやはり、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１は７０％～８５％の高い頻度のインデルを生じた（図９Ｂを参照されたい）。最後に、インデル頻度は、試験した３つの細胞株において増加したインデル％を提供する増加量のヌクレアーゼによる用量応答を示した（図９Ｃ）。
３．結論
これらの研究は、ＴＴＲ１５－１６結合部位の編集を成功させるために操作されたメガヌクレアーゼを利用する能力を例示している。試験したＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼは、ＨＥＫ２９３細胞およびＨｅｐＧ２肝細胞株において高レベルのオンターゲット編集を示し、７５～８５％の編集が％インデルによって評価された。ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１は、エレクトロポレーションの２日後に高レベルのインデルを示し、インデルは７日目まで維持された。％インデルに対する用量応答が、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１ヌクレアーゼについて実証された。まとめると、これらのデータは、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１の操作されたメガヌクレアーゼによる処理後のＨＥＫ２９３細胞株、ＨｅｐＧ２細胞株およびＨｅｐ３Ｂ細胞株の両方における非常に高い頻度のオンターゲットインデルを実証している。
実施例５
初代ヒト肝細胞におけるＴＴＲ編集
１．方法
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を、２４ウェルプレートに３．５ｅ５細胞／ウェルの密度で播種した。播種の２時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および様々な量のＴＴＲ１５－１６ｘ．８１ ｍＲＮＡ（０．５～２μｇ）を用いて細胞を２通りでトランスフェクトした。細胞を収集し、実施例４に記載のプライマーおよびプローブならびに実施例２に記載の方法を用いて、ｄｄＰＣＲを使用するインデル分析のためにトランスフェクションの１日後および７日後に前述のようにｇＤＮＡを単離した。
２．結果
ＰＨＨ細胞を、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１をコードするｍＲＮＡでトランスフェクトし、ＴＴＲ１５－１６標的部位におけるインデルを、ｄｄＰＣＲを使用して定量した。試験した全ての用量で、トランスフェクションの１日後に約４５％の編集が観察され、トランスフェクションの７日後に約３０～３５％のインデルが観察された（図１０Ａ）。Ｄ７におけるさらなる濃度のヌクレアーゼでのさらなる用量拡大分析は、０．５ｕｇのメガヌクレアーゼで同様の結果を提供した。しかしながら、インデルのパーセンテージは、０．０１０μｇのメガヌクレアーゼまで低用量で実質的に減少した（図１０Ｂ）。
３．結論
これらのデータは、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１ヌクレアーゼが初代ヒト肝細胞におけるＴＴＲ１５－１６標的部位を編集する能力を裏付けている。興味深いことに、トランスフェクションの１日後に高レベルの切断が見られ、これは７日目までに低減する。本発明者らは、より早い時点が、標的部位で生じた挿入および欠失の両方、ならびにまだ修復されていないデノボ編集を表すと仮定する。７日目までに、解消されていない編集の一部が野生型配列に修復された可能性があり、これはこの時点で観察される編集の減少を説明し得る。さらに、０．５ｕｇ未満のメガヌクレアーゼのレベルは、インデル活性の用量依存的減少をもたらす傾向がある。
実施例６
ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼを有するＦＶＢマウスの肝臓におけるインデルの定量
１．方法
マウスにおける標的化インデルを特徴づけることを目的として、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼ（配列番号１５）をＦＶＢマウスにおいて試験した。合計６匹のマウスに、ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼを発現するＡＡＶ８の５×１０１１ウイルスゲノムを尾静脈を介して注射した。ＡＡＶは、ＡＡＶ８キャプシドを使用したＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトリプルトランスフェクションによって生成された。さらに、３匹のＦＶＢマウスの対照群にＰＢＳの対照注射を行った。ＡＡＶ投与の４週間後に動物を屠殺し、ゲノムＤＮＡ単離のために肝臓を収集した。
１．１ マウス肝臓からのｇＤＮＡ単離
Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ製のＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅキット（参照番号７４０９５２．２５０）を使用して、マウス肝臓からｇＤＮＡを単離した。キット製造業者の製品マニュアルに沿ってプロトコルに従った。簡単に説明すると、肝臓の小切片を１．５ｍｌチューブに入れた。ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを含有する溶液中で６５℃で試料をインキュベートすることによって、溶解を達成した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｕｍｎのシリカ膜にＤＮＡを結合させるのに適切な条件は、大量のカオトロピックイオンおよびエタノールを溶解物に添加することによって形成した。結合プロセスは可逆的であり、核酸に特異的である。緩衝液で効率的に洗浄することによって汚染物を除去した。最後に、純粋なゲノムＤＮＡを低イオン強度条件下で水中に溶出した。
１．２ ｄｄＰＣＲによるインデル分析
Ｂｉｏ－ＲａｄのＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステムを使用したインデルの定量のために、ゲノムＤＮＡを使用した。インデルを定量するために、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、ＴＴＲ５－６標的部位を取り囲むアンプリコンを生成した。加水分解プローブを、野生型ＴＴＲ５－６標的部位を認識するように設計した。参照として機能するように、アンプリコン内に別のプローブを設計した。二重陽性である液滴をから単一陽性である液滴と比較することによって、ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼについてインデルを計算した。このアッセイのためのプライマーおよびプローブ配列を以下の表４に示す：

デジタルＰＣＲ反応を、ｄｄＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ｆｏｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ｄＵＴＰなし）（Ｂｉｏ－Ｒａｄからのカタログ番号１８６３０２４）、プライマー、標的プローブ（ＦＡＭ中）、参照プローブ（ＨＥＸ中）およびＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦ酵素（ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１０４Ｓ）を使用してセットアップし、ゲノムＤＮＡを断片化した。疑似および処理サンプルの合計５０００個のゲノムコピーを、ＰＣＲ反応の鋳型として投入した。
２．結果
マウス肝臓から単離されたｇＤＮＡを、オンターゲットインデルを定量するためのデジタル液滴ＰＣＲドロップオフアッセイにおける鋳型として使用した（図１１）。ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼＡＡＶを受けているマウスは、オンターゲットインデルを示した。ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４は、約１２％インデルの編集を示した。ＰＢＳ擬似注射を受けたマウスでは、編集は検出されなかった。
３．結論
これらの結果は、ＴＴＲ５－６メガヌクレアーゼがインビボで活性であり、ＴＴＲ５－６認識部位の切断に成功したことを示している。まとめると、これらのデータは、ＴＴＲメガヌクレアーゼがインビボにおいてＴＴＲ遺伝子を編集する能力を実証している。
実施例７
非ヒト霊長類における標的化インデルのインビボ生成
１．方法
１．１ 実験デザイン
次に、５－６認識部位を標的とする操作されたメガヌクレアーゼの投与が、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における内因性ＴＴＲ遺伝子を標的とし得るかどうかを試験した。３´ＷＰＲＥを有するＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼをコードし、ＴＢＧプロモータによって駆動されるＡＡＶ８ベクターを、６×１０１２ＧＣ／ｋｇまたは３×１０１３ＧＣ／ｋｇのいずれかでアカゲザルに投与した。ベクターの投与前に動物に肝臓超音波を実行し、試験全体を通して６ヶ月ごとに実行し続けた。ベクター投与の日から８～１２週目まで、全てのＮＨＰに１ｍｇ／ｋｇ／日の用量のプレドニゾロンを経口投与した。ベクター投与の８～１２週間後、動物を１日用量の段階的低減によってプレドニゾロンから漸減させた。肝臓生検を１８日目および１２８日目に行った。ＡＡＶ投与の１年後に剖検を行った。剖検で収集した肝臓組織を使用して、ＡＡＶコピー数およびオンターゲットインデル頻度を決定した。
１．２ インビボインデル％オンターゲット分析
肝臓組織を３６４日目に剖検時のインデル分析のために収集した。Ｇｅｎｏ Ｇｒｉｎｄｅｒ（ＳＰＥＸ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ）を使用してゲノムＤＮＡを単離して組織およびＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｂｌｏｏｄ ＱｕｉｃｋＰｕｒｅミニキット（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）をホモジナイズした。５－６認識配列内の標的切断部位におけるインデル％を、下記の表５中のプライマーで前述のようにドロップオフｄｄＰＣＲを使用して求めた。ＦＡＭ陽性液滴に正規化したＨＥＸ陽性液滴の損失を用いてインデルを計算した。

１．３ 肝臓ＡＡＶコピー数分析
３６４日目に剖検で収集した肝臓組織および細胞ＤＮＡを、５８℃のアニーリング温度で、以下の表６に列挙するプライマーで前述のようにｄｄＰＣＲを用いてＡＡＶコピー数について分析した。

２．結果
図１２に示されるように、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼの投与は、用量依存的インデル頻度をもたらした。剖検では、６×１０１２ＧＣ／ｋｇ（動物ＲＡ３３３０およびＲＡ３３８５）でインデルは観察されなかった。より高用量の３×１０１３ＧＣ／ｋｇを投与された動物（動物１５Ｄ００３および１５Ｄ０２０）では、オンターゲットＴＴＲ５－６部位におけるインデルが約１５～２０％であった（図１２）。
ＡＡＶコピー数を、剖検時に収集した肝臓組織において決定した。図１３は、検出されたＡＡＶの量が用量と相関することを示し、３６４日目の剖検で、３×１０１３ＧＣ／ｋｇ動物は約２および８ＡＡＶゲノム／二倍体細胞を有することが判明し、６×１０１２ＧＣ／ｋｇ動物は約０．５および１ＡＡＶゲノム／二倍体細胞を有していた。
３．結論
この研究は、ＴＴＲ５－６部位を標的とする操作されたメガヌクレアーゼが、ＮＨＰ中の内因性ＴＴＲ遺伝子の編集を用量依存的にもたらし、ベクター投与後３６４日まで高用量ＡＡＶで処置された動物においてインデルが持続することを実証している。
実施例８
非ヒト霊長類におけるＴＴＲ１５－１６部位での標的化インデルのインビボ生成
１．方法
１．１ 実験デザイン
次に、１５－１６認識部位を標的とする操作されたメガヌクレアーゼの投与が、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における内因性ＴＴＲ遺伝子を編集し得るかどうかを試験した。３´ＷＰＲＥを有するＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼをコードし、ＴＢＧプロモータによって駆動されるＡＡＶ８ベクターを、６×１０１２ＧＣ／ｋｇまたは３×１０１３ＧＣ／ｋｇのいずれかでアカゲザルマカクに投与した。ベクターの投与前に動物に肝臓超音波を実行し、試験全体を通して６ヶ月ごとに実行し続けた。ベクター投与の日から８～１２週目まで、全てのＮＨＰに１ｍｇ／ｋｇ／日の用量のプレドニゾロンを経口投与した。ベクター投与の８～１２週間後、動物を１日用量の段階的低減によってプレドニゾロンから漸減させた。肝臓生検を１８日目に行った。各肝生検から、次世代シークエンシングおよびｄｄＰＣＲを行って、インビボインデル％を決定した。さらに、ｄ１８およびｄ１２８肝生検におけるＡＡＶベクターコピー数を決定した。研究の経過を通して、血清中のＴＴＲレベルを測定するために血液を収集した。
１．２ インビボインデル％オンターゲット分析
ベクター投与後１８日目および１２８日目に、上述の実験プロトコルに従って肝生検を行った。１５－１６認識配列内の標的切断部位でのインデル％を、以下に示すプライマーＦ９およびＲ９を使用したアンプリコンシーケンシング分析によって決定した。また、実施例６に記載のｄｄＰＣＲならびにプライマーおよびプローブを使用してインデルを定量した。ＨＥＸ陽性コピーに対するＦＡＭ陽性コピーの損失を用いて、ＴＴＲ１５－１６インデルを計算した。
Ｆ９：ＧＣＣＡＴＧＣＣＡＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＧ（配列番号６３）
Ｒ９：ＧＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＴＧＧＧ（配列番号６４）
１．３ ＡＡＶコピー数分析
ＡＡＶコピー数を、実施例６で前述されたように、１８日目および１２８日目の生検で収集された肝臓組織において定量した。
１．４ 血清ＴＴＲ分析
研究の過程を通して、すべての動物から血清を収集した。ハイブリッドリガンド結合アッセイ／液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析（Ｌａｎｓｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１７，８９，４，２６２８－２６３５）を用いて血清分析を完了した。
２．結果
図１４に示されるように、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼを有するＡＡＶ８の投与は、すべての動物において高レベルのオンターゲット編集をもたらした。６×１０１２ＧＣ／ｋｇ（黒色バー）を投与された２匹の動物において、本発明者らは、ＮＧＳにより２１％および５２％のインデル（図１４Ａ）ならびにｄｄＰＣＲにより３５％および６７％のインデル（図１４Ｂ）をそれぞれ認めた。３×１０１３ＧＣ／ｋｇ用量（灰色バー）では、本発明者らは、ＮＧＳにより３０％および４２％のインデル（図１４Ａ）ならびにｄｄＰＣＲにより５６％および６２％のインデル（図１４Ｂ）をそれぞれ見出した。ｄｄＰＣＲ分析によってさらに評価すると、これらのインデルパーセンテージは、ほとんど変化せずに１２８日間維持された（図１４Ｃ）。
図１５は、各生検での肝臓に存在するＡＡＶゲノムの定量を示す。２倍体細胞あたりのＡＡＶの量は、ＡＡＶの用量と相関した。６×１０１２ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８用量を投与された動物は、二倍体細胞あたり約１２および１９ＡＡＶコピーを有したが、３×１０１２ＧＣ／ｋｇ用量は、ｄ１８で二倍体細胞あたり約１０６および１０８ＡＡＶコピーを示した。ＡＡＶコピー数は実質的に減少し、両方の用量でｄ１２８で０に近づいた。
これらの動物の血清中に存在するＴＴＲタンパク質の存在量を調べると、本発明者らは、ベクター投与の７日前（－７日目）に採取されたベースライン出血からの大きな低減を認める（図１６）。４匹の動物のうちの３匹において、本発明者らは、２１日目までに血清ＴＴＲタンパク質レベルの９０％超の低減を認め、この低減は、ベクター投与後の２５０日を超える期間にわたって維持される。６×１０１２ＧＣ／ｋｇ群の１匹の動物は、血清ＴＴＲタンパク質レベルにおけるより穏やかな低減を示し、平均してベースラインからの約４０％の低減を示す。
３．結論
まとめると、これらのデータは、操作されたメガヌクレアーゼがインビボでＴＴＲ１５－１６標的部位を首尾よく編集する能力を実証している。ｄｄＰＣＲおよびＮＧＳの両方を使用して、本発明者らは、処置されたすべての動物において高レベルの編集を検出することができる。ｄｄＰＣＲ法は、ＮＧＳと比較して、ＴＴＲ１５－１６標的部位におけるより大きな挿入および欠失を検出するアッセイの能力に起因して、より高い編集率をもたらす。興味深いことに、本発明者らは、６×１０１２ＧＣ／ｋｇで処置した２匹の動物において可変レベルの編集を認めたが、これはＡＡＶコピー数データによって裏付けられるように、１匹の動物における形質導入の低減に起因する可能性が高い。すべての動物において、循環血清ＴＴＲレベルの持続的な低減が認められ、この低下は、肝臓における編集頻度と相関する。有利には、低用量および高用量の両方で、注射後１２８日までにＡＡＶコピー数の実質的にほぼ完全な低減が観察された。この結果は、細胞内のＡＡＶゲノムの量が減少している一方で、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼで処置している動物では高レベルのインデルが維持されていることを示している。加えて、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼを用いて認められたＴＴＲ１５－１６部位におけるインデルのレベルは、実施例７において実証されるようにＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４操作メガヌクレアーゼを有するＴＴＲ５－６部位において認められるレベルよりも有意に大きかった。その例において、ＴＴＲ５－６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼは、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼを有するＴＴＲ１５－１６部位における最大６７％のインデルと比較して、６×１０１２ＧＣ／ｋｇの用量において、インデルをほとんどまたは全く示さなかった。ＴＴＲ１５－１６Ｌ．１２０４メガヌクレアーゼは、約１５％～２０％の３×１０１３ＧＣ／ｋｇのより高い用量でインデルを示したが、これは、ＴＴＲ１５－１６ｘ．８１メガヌクレアーゼを有するＴＴＲ１５－１６部位で観察されたインデルよりも有意に低く、これもまた注射から１２８日後までに６０％超のインデルを生じた。これらの結果は、インビボＮＨＰ動物モデルにおいてＴＴＲ１５－１６部位を標的とする操作されたメガヌクレアーゼが、ＴＴＲ遺伝子座における別の部位（例えばＴＴＲ５－６部位）と比較して予想外に高いインデルをもたらすことを示している。

Claims (15)

  1. トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子内の認識配列と結合してそれを切断する操作されたメガヌクレアーゼであって、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットは、前記認識配列の第１の認識半部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認識半部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、操作されたメガヌクレアーゼであって、
    （ａ）前記認識配列が、配列番号７からなり、且つ前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号１１～１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む；又は、
    （ｂ）前記認識配列が、配列番号９からなり、且つ前記操作されたメガヌクレアーゼが、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、操作されたメガヌクレアーゼ。
  2. 請求項１に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
  3. ｍＲＮＡである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 請求項１に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えＤＮＡコンストラクト。
  5. 請求項１に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、組換えウイルス。
  6. 組換えＡＡＶである、請求項５に記載の組換えウイルス。
  7. 前記組換えＡＡＶが、ＡＡＶ８血清型を有する、請求項６に記載の組換えウイルス。
  8. 前記核酸配列が、前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸配列に動作可能に連結されたプロモータ配列を含む、請求項５に記載の組換えウイルス。
  9. 前記プロモータが、肝臓特異的プロモータである、請求項８に記載の組換えウイルス。
  10. インビトロで、改変ＴＴＲ遺伝子を含む遺伝子改変ヒト肝臓細胞を生成するための方法であって、ヒト肝臓細胞に、
    （ａ）請求項１に記載の操作されたヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、前記操作されたヌクレアーゼは前記ヒト肝臓細胞において発現される、ポリヌクレオチド、または
    （ｂ）請求項１に記載の操作されたヌクレアーゼ
    を導入するステップを含み、
    前記操作されたヌクレアーゼは、配列番号７又は９からなる前記認識配列内に切断部位を生成し、完全長内因性ＴＴＲポリペプチドをコードしない、エクソン１又はエクソン３内に挿入又は欠失を含む改変ＴＴＲ遺伝子を生じさせる、方法。
  11. 前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡまたは組換えウイルスによって前記ヒト肝臓細胞に導入される、請求項１０に記載の方法。
  12. 請求項１０に記載の方法によって調製された遺伝子改変ヒト肝臓細胞。
  13. 薬学的に許容される担体と、請求項１に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼ、または前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドとを含む医薬組成物。
  14. ポリヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子を含む脂質ナノ粒子組成物であって、前記ポリヌクレオチドは、請求項１に記載の前記操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む、脂質ナノ粒子組成物。
  15. 前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項１４に記載の脂質ナノ粒子組成物。
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