[go: up one dir, main page]

JP7657287B2 - 組合せブタワクチン - Google Patents

組合せブタワクチン Download PDF

Info

Publication number
JP7657287B2
JP7657287B2 JP2023504581A JP2023504581A JP7657287B2 JP 7657287 B2 JP7657287 B2 JP 7657287B2 JP 2023504581 A JP2023504581 A JP 2023504581A JP 2023504581 A JP2023504581 A JP 2023504581A JP 7657287 B2 JP7657287 B2 JP 7657287B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
vaccine
pcv
antigen
animal
lawsonia intracellularis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2023504581A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2023535066A (ja
Inventor
エドガー ディアス
グレッグ スチュアート クライン
ジェレミー クロール
フェルナンド ロペス レイヴァス レイテ
マイケル ビー ルーフ
マイク アラン ステイレン
Original Assignee
ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド filed Critical ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド
Publication of JP2023535066A publication Critical patent/JP2023535066A/ja
Priority to JP2024193753A priority Critical patent/JP2025026461A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7657287B2 publication Critical patent/JP7657287B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10071—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

関連出願及び参照による組込み
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３９６２９、ＷＯ０５／０１１７３１、ＷＯ０６／０１２９４９、ＷＯ０６／０２０７３０、ＷＯ０６／０９９５６１、ＷＯ０７／０１１９９３、ＷＯ０７／０７６５２０、ＷＯ０７／１４０２４４、ＷＯ０８／０７３４６４、ＷＯ０９／０３７２６２、ＷＯ０９／１２７６８４、ＷＯ０９／１４４０８８、ＷＯ２０１１／０５４９５１、ＷＯ２０１５／０８２４５７、ＷＯ２０１５／０８２４５８、ＷＯ２０１５／０８２４６５、ＷＯ２０１６／１２４６２０、ＷＯ２０１６／１２４６２３、ＷＯ２０１７／０６８１２６、ＷＯ２０１７／１６２７４１、ＷＯ２０１８／１８９２９０、ＷＯ２０１８／１１５４３５及びＷＯ２０１９／１６６３６２並びに２０２０年４月６日に出願した国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６９３０を参照する。
前述の出願、及びそこに引用されている又はそれらの審査中の全ての文献（「出願引用文献」）、及び出願引用文献に引用されている又は出願引用文献で参照されている全ての文献、及び本明細書に引用される又は本明細書で参照される全ての文献（「本明細書に引用される文献」）、及び本明細書に引用される文献に引用されている又は本明細書に引用される文献で参照されている全ての文献は、本明細書で言及される又は本明細書に参照により組み込まれるいずれかの文献の中で言及されているあらゆる製品についてのあらゆる製造業者の使用説明書、説明、製品仕様書、及び製品シートと共に、これにより参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施の際に利用され得る。より具体的には、全ての参考文献は、個々の文献各々が参照により本明細書に組み込まれると具体的に且つ個々に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）抗原、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）抗原、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｍ．ｈｙｏ．）抗原及びブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）抗原を含む組合せブタワクウチン、その生産方法及びそれらの使用が、本明細書で開示される。
ブタ増殖性腸炎（「ＰＰＥ」）の原因物質であるローソニア・イントラセルラリスは、ヒト、ウサギ、フェレット、ハムスター、キツネ、ウマはもちろん、ダチョウ及びエミューのような多様な他の動物も含む、事実上、全ての動物に作用し、豚の群れの損失の特に大きな原因である。ＰＰＥの一貫した特徴は、腸の患部の腸細胞内の細胞質内に、膜に結合していない湾曲した桿菌が出現することである。ＰＰＥに関連する細菌は、「カンピロバクター様微生物」と呼ばれている。S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-64 (1989)。その後、この病原細菌は、新規の分類学上の属及び種として同定され、通俗的に回腸共生生物（ＩＳ） イントラセルラリスと呼ばれている。C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-38 (1993)。これら新規細菌に分類学名ローソニア（Ｌ．）イントラセルラリスが与えられた。S. McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-25 (1995)。これら３つの名称は、本明細書においてさらに同定及び記載される場合、同じ微生物を指すために同義で使用される。
ブタサーコウイルス型（ＰＣＶ）は、サーコウイルス科（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ）のサーコウイルス属（Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ）に属する、エンベロープを持たない正２０面体一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスである。ゲノムは、２つの主オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードし、ＯＲＦ１が複製関連タンパク質（ｒｅｐ）をコードし、ＯＲＦ２がウイルスカプシド（ｃａｐ）タンパク質をコードし、このタンパク質によってウイルスの抗原的特徴が決まる。ＰＣＶ２は、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）とおおよそ８０％の配列同一性を共有する。しかし、一般的に非毒性であるＰＣＶ１とは対照的に、ＰＣＶ２に感染した豚は、離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と一般に呼ばれる症候群を呈する。ＰＣＶ３は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）とは遺伝的に明確に異なり、具体的には、これら２種のウイルス間にはｒｅｐ遺伝子のアミノ酸同一性が４８％及びｃａｐ遺伝子のアミノ酸同一性が２６％しかない。
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ．）は、マイコプラズマ科（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ）に分類される小さい細菌（４００～１２００ｎｍ）である。Ｍ．ｈｙｏ．は、成長及び仕上げ期のブタに一般に見られる豚呼吸器疾患である流行性肺炎に関連している。Ｍ．ｈｙｏ．は、気管及び肺の上皮細胞の繊毛を攻撃し、その結果、繊毛のビーティングを停止させ（繊毛運動障害）、最終的に肺の部位の虚脱を引き起こす。Ｍ．ｈｙｏ．は、ＰＲＲＳＶ及び他の呼吸器病原体の肺への侵入を助長する一次病原体と考えられている。別々の分離株である２３２、Ｊ及び７４４８は、それらのゲノムが配列決定されている（Minion et al., J. Bacteriol. 186:7123-33, 2004；Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187:5568-77, 2005及びHan et al., Genome Announc. 2017 Sep; 5(38): e01012-17）。ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、多くの人から、世界中の養豚業界に影響を与える現在最も重要な疾患と見られている。ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）に分類される、エンベロープを持った一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＰＲＲＳＶの異なる分離株の抗原的特徴には大きなばらつきがあり、感染を予防するための有効な対策は限られている。弱毒化された改変生ワクチン（ＭＬＶ）、死滅ウイルスワクチン又は組換えワクチンという、ＰＲＲＳに利用可能な３つの主要なワクチン群がある。ＰＲＲＳＶのウイルスエンベロープタンパク質は、一般に、ビリオン内のタンパク質の存在量に基づいて主要及び微量タンパク質にカテゴリー分けされる。主要ウイルスエンベロープタンパク質は、ｇｐ５（ＯＲＦ ５）及びＭ（ＯＲＦ ６）であり、二量体を形成する。微量エンベロープタンパク質は、ｇｐ２（ＯＲＦ２）、ｇｐ３（ＯＲＦ３）、ｇｐ４（ＯＲＦ４）及びＥ（ＯＲＦ２ｂ）並びに恐らく新たに同定されるウイルスタンパク質ｇｐ５ａ（ＯＲＦ ５ａ）である。活性抗原成分は、ＰＲＲＳＶウイルスからのＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６又はＯＲＦ７を含み得る。
上記病原体に対して動物を免疫化する新たな方式が引き続き要求されている。
したがって、本発明の基礎となる技術的問題は、病原体に対して動物を免疫化するさらなる手段及び方法の提供である。特許請求の範囲で特徴付けられる及び本明細書において下記で提供されるような実施形態の提供により、この問題を解決し、上述の要求に対処する。
本願におけるいずれの文献の引用又は特定も、そのような文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
本発明は、ローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ．）及びブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の群から選択される少なくとも１種のさらなる病原体の１種又は複数種の抗原とを含むワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスの抗原が生菌ローソニア・イントラセルラリスである、前記ワクチンに関する。
したがって、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＣＶの抗原とを含み得る。
例えば、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質とを含み得る。
本ワクチンはまた、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＭ．ｈｙｏ．の抗原とを含み得る。
例えば、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＭ．ｈｙｏ．バクテリンとを含み得る。
本ワクチンはまた、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＲＲＳＶの抗原とを含み得る。
例えば、本ワクチンはまた、生菌ローソニア・イントラセルラリスと弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスとを含み得る。
本ワクチンはまた、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原と、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原とを含み得る。
例えば、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質と、Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンとを含み得る。
本ワクチンはまた、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原と、ＰＲＲＳＶの抗原とを含み得る。
例えば、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質と、弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスとを含み得る。
本ワクチンはまた、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＲＲＳＶの抗原と、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原とを含み得る。
例えば、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスと、Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンとを含み得る。
本ワクチンはまた、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原と、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原と、ＰＲＲＳの抗原とを含み得る。
例えば、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質と、Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンと、弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスとを含み得る。
好ましくは、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原とを含む。
より好ましくは、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２抗原とを含む。
より好ましくは、本ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２の組換えポリペプチドとを含む。
特に好ましい実施形態では、本ワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶ抗原とを含む。用語「生菌ローソニア・イントラセルラリス」は、「改変された生菌ローソニア・イントラセルラリス」及び「弱毒化ローソニア・イントラセルラリス」を含む。
本発明のワクチンは、約１０3～１０9細菌／Ｋｇ体重の、好ましくは約１０5～１０7細菌／Ｋｇ体重の、ローソニア・イントラセルラリスの投薬量を有し得る。本発明のワクチンはまた、ローソニア・イントラセルラリス菌約１０5～約１０7のローソニア・イントラセルラリスの抗原の投薬量を有し得る。ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、凍結乾燥されていることがある。好ましくは、ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれている抗原である。
本発明のワクチンのＰＣＶ抗原は、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２又はＰＣＶ３の抗原であり得る。好ましくは、ＰＣＶ抗原は、ＰＣＶ２抗原である。ＰＣＶ抗原は、組換えポリペプチドであり得る。前記組換えポリペプチドは、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子により発現され得る。好ましくは、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子は、ＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子である。ＰＣＶ組換えポリペプチドはバキュロウイルス細胞に発現され得る。好ましくは、ＰＣＶ抗原は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）に含まれている抗原、又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原である。本発明のワクチンでは、ＰＣＶの抗原は、約２μｇ～約４００μｇの投薬量を有し得る。
本発明のワクチンのＭ．ｈｙｏ．の抗原は、上清及び／又はバクテリンであり得る。上清及びバクテリンの詳細な説明は、本明細書において下記で提供される。好ましくは、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＭ．ｈｙｏ．の抗原、又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＭ．ｈｙｏ．の抗原である。
本発明のワクチンのＰＲＲＳＶ抗原は生ＰＲＲＳＶウイルスであり得る。前記生ウイルスは、改変及び／又は弱毒化ウイルスであり得る。本発明のワクチンは、１用量あたり約１０1～約１０7ウイルス粒子、好ましくは、１用量あたり約１０3～約１０5粒子、より好ましくは、１用量あたり約１０4～約１０5粒子のＰＲＲＳＶの抗原の投薬量を含み得る。本発明のワクチンはまた、１用量あたり約１０4～約１０7ウイルス粒子のＰＲＲＳＶの抗原の投薬量を含み得る。ＰＲＲＳＶの抗原は凍結乾燥されていることがある。好ましくは、ＰＲＲＳＶ抗原は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳＶ ＭＬＶに含まれているＰＲＲＳＶ抗原、又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＲＲＳＶ抗原である。
ＰＣＶの抗原、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原、及びＰＲＲＳＶの抗原は、３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれている抗原であり得る。
本発明のワクチンは、３ＦＬＥＸ（登録商標）に溶解されたローソニア・イントラセルラリスの凍結乾燥抗原であり得る。したがって、本発明のワクチンは、３ＦＬＥＸ（登録商標）に溶解された、凍結乾燥された生菌ローソニア・イントラセルラリスであり得る。さらに、本発明のワクチンは、３ＦＬＥＸ（登録商標）に溶解されたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓであり得る。
一実施形態では、本発明のワクチンは、薬学的に又は獣医学的に許容される担体をさらに含み得る。一実施形態では、本発明のワクチンは、１種又は複数種のアジュバントをさらに含み得る。好適なアジュバントは、当技術分野において公知であり、非限定的な例が本明細書に記載される。本発明のワクチンは、次のうちの１種又は複数種をアジュバントとして含み得る：アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー；架橋されているアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されているアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；カルボマー；少なくとも３個、多くとも８個のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物で架橋されているアクリルポリマーであって、少なくとも３個の前記ヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって置き換えられていてもよく、又は置き換えられており、前記基が２～４個の炭素原子を含有し、例えば、ビニル、アリル及び他のエチレン性不飽和基であり、前記不飽和基自体が他の置換基、例えばメチル、を含有し得る、アクリルポリマー；カルボポール（登録商標）；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９７４Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９３４Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９７１Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９８０；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９４１Ｐ；ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；サポニン；Ｑｕｉｌ Ａ；ＱＳ－２１；ＧＰＩ－０１００；油中水型エマルジョン；水中油型エマルジョン；水中油中水型エマルジョン；軽質流動パラフィン油に基づくエマルジョン又は欧州薬局方型アジュバント；イソプレン系の油；スクアラン；アルケン又はイソブテン又はデセンのオリゴマー化の結果として生じるスクアレン油；酸の又は直鎖アルキル基を含有するアルコールのエステル；植物油；オレイン酸エチル；ジ（カプリル酸／カプリン酸）プロピレングリコール；トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル；ジオレイン酸プロピレングリコール；分岐脂肪酸又はアルコールのエステル：イソステアリン酸エステル；非イオン性界面活性剤；ソルビタンの又はマンニットの又はグリコールの又はポリグリセロールの又はプロピレングリコールの又はオレイン酸若しくはイソステアリン酸の又はリシノール酸の又はヒドロキシステアリン酸のエステルであって、エトキシ化されていてもよいエステル、無水マンニトールオレイン酸エステル；ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、プルロニック（Pluronic)製品、ＲＩＢＩアジュバント系；ブロックコポリマー；ＳＡＦ－Ｍ；モノホスホリルリピッドＡ；アブリジン脂質－アミンアジュバント；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの易熱性エンテロトキシン（組換え又は非組換え）；コレラ毒素；ＩＭＳ １３１４、又はムラミルジペプチド。
好ましくは、アジュバントはカルボマーである。有利には、アジュバントは、ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）及び／又はカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）であり得る。
本発明のワクチンは、全身投与用の形態であり得る。
本発明のワクチンは、単回用量又はワンショット投与用に製剤化及び／又は包装され得る。
本発明のワクチンは、複数回用量投与レジメン、好ましくは２用量投与レジメン用に製剤化及び／又は包装され得る。
本発明のワクチンは投薬剤形として存在することができ、前記剤形は、より多量の本ワクチンを収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬剤形は、前記容器から供給可能である。前記容器は、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００又は少なくとも２５０用量の前記ワクチンを収容し得る。
本発明は、ワクチンを動物に投与するステップを含む、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための、本発明のワクチンも包含する。
本発明は、本発明のワクチンであって、前記ワクチンブタに投与するステップを含むブタの防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンも包含する。
本発明は、動物のローソニア・イントラセルラリス及び／又はＰＣＶ及び／又はＭ．ｈｙｏ．及び／又はＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための、本発明のワクチンも包含する。
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＭ．ｈｙｏ．に対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＲＲＳに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＭ．ｈｙｏ．に対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＰＲＲＳに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＲＲＳ及びＭ．ｈｙｏ．に対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
好ましい実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＭ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンも包含し、前記方法においてワクチンは全身投与される。
本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンも包含し、前記方法においてワクチンは１用量として投与される。
本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンも包含し、前記方法においてワクチンは少なくとも１用量として投与される。
本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンも包含し、前記方法において動物は１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置される。
本発明は、動物において少なくとも１種の病原体により引き起こされる臨床疾患に対して前記動物を免疫化するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記少なくとも１種の病原体の病原型に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導できるワクチンも包含する。
本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物における腸の病変を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して軽減するための防御免疫応答である、ワクチンも包含する。したがって、本発明のワクチンは、動物における腸の病変を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して軽減するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が前記ワクチンを動物に投与するステップを含む。腸の病変は、回腸の病変であり得る。
腸の病変及び／又は回腸の病変は、巨視的病変及び／又は微視的病変であり得る。本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物における糞便排出を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して低減させるための防御免疫応答である、前記ワクチンも包含する。したがって、本発明のワクチンは、動物における糞便排出を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して低減させるための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が前記ワクチンを動物に投与するステップを含む、前記ワクチンである。
本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物の１日あたりの平均体重増加を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して増加させるための防御免疫応答である、前記ワクチンも包含する。したがって、本発明のワクチンは、動物における１日あたりの平均体重増加を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して増加させるための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が前記ワクチンを動物に投与するステップを含む、前記ワクチンである。
本発明は、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、８×１０9のローソニア菌によるチャレンジに対して防御的であるワクチンも包含する。
本発明は、動物のローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫応答又は防御的免疫学的応答を惹起するための方法であって、本明細書で開示されるワクチンのいずれかを動物に投与するステップを含む方法も包含する。
本発明は、動物において少なくとも１種の病原体により引き起こされる臨床疾患に対して動物を免疫化する方法であって、本明細書で開示されるワクチンのいずれか１つのワクチンを動物に投与するステップを含み、前記ワクチンが、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記少なくとも１種の病原体の病原型に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導できる、前記方法も包含する。
したがって、本発明は、ローソニア・イントラセルラリス及び／若しくはＰＣＶ及び／若しくはＭ．ｈｙｏ．及び／若しくはＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を誘導するための組成物の調製における本発明のワクチンの使用、並びに／又はローソニア・イントラセルラリス及び／若しくはＰＣＶ及び／若しくはＭ．ｈｙｏ．及び／若しくはＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を誘導するための方法のための、本発明のワクチンの使用を包含する。
本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、前記方法が、動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置される、ワクチンも包含する。
さらに、本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンが、生菌ローソニア・イントラセルラリス及び／又はＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質及び／又はＭ．ｈｙｏ．バクテリン及び／又は弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスを含む、ワクチンを包含する。
さらに、本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質とＭ．ｈｙｏ．バクテリンと弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスとを含む。
本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質とを含む、ワクチンを包含する。
本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンが、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含む、ワクチンを包含する。
加えて、本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物がＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）及び／又はＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンが、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含む、ワクチンを包含する。
本発明は、ＵＳＰＴＯ（合衆国法典第３５巻第１１２条、第１パラグラフ）の記述要件及び実施可能要件を満たさないいずれかの製品、プロセス、又は製品の製造、又は製品の使用方法を本発明の範囲に包含するように意図されたものでないこと、したがって、本出願人は、一切の過去に記載された製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法の権利を留保し、その除外をこれにより開示することに、さらに留意されたい。本願の系統における又は、いずれかの他の系統における又は、いずれかの第三者のいずれかの先に出願された出願における、本出願人のいずれかの取得特許の対象であるいずれかの実施形態を明示的に放棄する全ての権利は、明示的に留保される。誓約とみなすべきものは、本明細書にはない。
本開示において、特に、特許請求の範囲、及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのような用語が米国特許法におけるそれに帰する意味を有し得ること、例えば、これらの用語が「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること、並びに「から本質的になること」及び「から本質的になる」のような用語が米国特許法におけるそれに帰する意味を有し得ること、例えば、これらの用語が、明示的に列挙される要素を考慮に入れるが、先行技術に見られる要素、又は本発明の基本的若しくは新規特徴に影響を与える要素を除外することに、留意されたい。
これら及び他の実施形態は、後続の詳細な説明で開示され又は後続の詳細な説明から明らかであり、後続の詳細な説明により包含される。
例として与えられるが、記載される特定の実施形態のみに本発明を限定するように意図されたものではない、後続の詳細な説明は、添付の図面と併用すると最もよく理解され得る。
図１は、回腸の平均肉眼的病変スコアを示す。異なる文字は、統計的優位性（ｐ＜０．０５）を示し、エラーバーは標本平均の標準誤差を表す。 図２は、回腸の平均肉眼的病変長を示す。異なる文字は統計的優位性（ｐ＜０．０５）を示し、エラーバーは、標準誤差を表す。 図３は、回腸の平均病変重症度を示す。異なる文字は統計的優位性（ｐ＜０．０５）を示し、エラーバーは、標準誤差を表す。 図４は、１日あたりの群平均体重増加（ｌｂ）を示す。異なる文字は統計的優位性（ｐ＜０．０５）を示し、エラーバーは、標準誤差を表す。 図５は、血清ＥＬＩＳＡがローソニア（Ｌａｗｓｏｎｉａ）について陽性の結果となった動物のパーセンテージを示す。 図６は、排出されたＬ．イントラセルラリスの平均量を日ごとに示す。異なる文字は統計的優位性（ｐ＜０．０５）を示し、エラーバーは、標準誤差を表す。 図７は、回腸終端部で測定された平均微視的病変スコアを示す。異なる文字は統計的優位性（ｐ＜０．０５）を示し、エラーバーは、標準誤差を表す。 図８は、回腸組織中のＬ．イントラセルラリス抗原の存在についての平均免疫組織化学スコアを示す。 図９は、ワクチンの配合を示す。 図１０は、研究のアウトラインを示す。ワクチン接種の１週間前及び後に、試料中のＥＩＩＭＡＴＢ群のみにチアムリン／ＣＴＣを与えた。両方の群（ＥＩＩＭ及びＥＩＩＭＡＴＢ）にチャレンジの４週間前に同時にワクチンを施した。全ての動物を感染後２１日目（ｄｐｉ）に安楽死させ、剖検した ＊＝血液及び糞便採取。臨床スコアリングを０～２１日目に毎日行った。
本発明は、ローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ．）及びブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の群から選択される少なくとも１種のさらなる病原体の１種又は複数種の抗原とを含むワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスの抗原が、生菌ローソニア・イントラセルラリスである、ワクチンに関する。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＣＶの抗原とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＭ．ｈｙｏの抗原とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＭ．ｈｙｏバクテリンとを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＲＲＳＶの抗原とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスとを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原と、Ｍ．ｈｙｏの抗原とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質と、Ｍ．ｈｙｏバクテリンとを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原と、ＰＲＲＳＶの抗原とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質と、弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスとを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＲＲＳＶの抗原と、Ｍ．ｈｙｏの抗原とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスと、Ｍ．ｈｙｏバクテリンとを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原と、Ｍ．ｈｙｏの抗原と、ＰＲＲＳＶの抗原とを含む。
一実施形態では、本発明のワクチンは、生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質と、Ｍ．ｈｙｏバクテリンと、弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスとを含む。
本発明のワクチンの成分に関して、用語「ワクチン」及び「抗原」は、本明細書では同義で使用されることがあることに留意されたい。したがって、「ワクチンは、ＰＣＶワクチンを含む」は、例えば、「ワクチンは、ＰＣＶ抗原を含む」と同義で使用され得る。
本発明のワクチンに関して、用語「ワクチン」及び「免疫原性組成物」は、本明細書では同義で使用され得る。
用語「抗原」、「免疫原」及び「免疫原性成分」は、本明細書では同義で使用され得る。
用語「免疫応答」、「免疫学的応答」、「防御免疫応答」及び「防御的免疫学的応答」は、本明細書では同義で使用され得る。
さらに、本明細書で提供される全ての開示を組み合わせることができることに留意されたい。したがって、例えば、ＰＣＶワクチン若しくは抗原に関連して本明細書で提供される特定の開示を、ＰＲＲＳＶワクチン若しくは抗原と組み合わせること、又は逆に、例えば、ＰＲＲＳＶワクチン若しくは抗原に関連して本明細書で提供される特定の開示を、ＰＣＶワクチン若しくは抗原と組み合わせることもできるが、ただし、そのような移行が、本明細書での教示に基づいて当業者により実行可能と考えられるものであることを条件とする。言い換えると、方法、技法、投与経路などが、例えばＰＣＶに関連して、開示される場合、それは、ＰＣＶに限定され得るのではなく、例えばＰＲＲＳＶに関連して、それを使用することもできる。さらに、単一の抗原を含む、ある特定の記載されるワクチンについて本明細書で提供される全ての開示は、１種より多くの抗原を含む、記載されるワクチンにも適用され得る。
本明細書に記載される本発明の方法の文脈での開示は、対応する使用に適用可能であり、逆に本明細書に記載される本発明の使用の文脈での開示は、対応する方法に適用可能である。
本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリスの抗原を含む。したがって、ローソニア・イントラセルラリスに対するブタの防御免疫応答を惹起するための免疫原性組成物が開示される。
本明細書で使用される場合、用語「ローソニア・イントラセルラリス」又は「Ｌ．イントラセルラリス」は、C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-38 (1993)及びS. McOrist et al. Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-25 (1995)（これら参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)によって詳細に説明されている、細胞内の湾曲したグラム陰性菌を意味し、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭｄにＡＴＣＣ ５５６７２として寄託された細菌；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ、ＬｏｎｄｏｎにＮＣＴＣ １２６５６及び１２６５７として寄託された細菌；当技術分野での知識及び本明細書での教示を考えると世界中でＰＰＥに感染したブタ又は他の動物から得ることができる原因菌；並びに自然発生的に得られるか、人工的に得られるかを問わず、上記細菌のいずれかのバリアント又は変異体を含むが、これらに限定されない。
「生菌Ｌ．イントラセルラリス」は、本明細書で使用される場合、Ｌ．イントラセルラリス菌が、生きている細菌であることを意味する。ＷＯ９６／３９６２９及びＷＯ０５／０１１７３１には、非病原性の生きている又は弱毒化されたＬ．イントラセルラリス株が記載されている。しかし、本明細書に記載の本発明のワクチン組成物は、生産／製剤化ステップに起因して不活性化された／死滅したＬ．イントラセルラリス菌を含み得る。本明細書で使用される場合、用語「弱毒化（された）株」は、宿主動物に投与されたときに免疫原性の特性を維持しながら毒性の低下、好ましくは、無毒性を達成するように、当技術分野において公知の及び／又は本明細書で教示される培養及び継代技法に従って調製される、あらゆるＬ．イントラセルラリス株を意味する。下記で実証されるように、様々な異なるＬ．イントラセルラリス株を本教示に従って培養及び弱毒化して、Ｌ．イントラセルラリスに感染しやすい豚及び他の動物においてワクチンとしての有効性を有する弱毒化された免疫原性の株が得られている。
遺伝子改変ウイルス及び／若しくは細菌、又は改変生ウイルス及び／若しくは細菌は、その未改変の親株より毒性が低い場合、「弱毒化」されている。株は、疾患重症度を決定する１種又は複数種のパラメーターの統計的に有意な減少を示す場合、「弱毒性」である。そのようなパラメーターとしては、ウイルス血症のレベル、菌血症、発熱、呼吸困難の重症度、生殖性症状の重症度、又は腸（特に、回腸）若しくは肺などの臓器における病変の数若しくは重症度などを挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明のワクチンにおける使用のための弱毒化株は、一般に、鳥類、魚類、畜牛、豚、馬、哺乳類及び霊長類、並びにヒトを含む、動物のための抗微生物ワクチンにおける免疫原として有用性があると予想される。そのようなワクチンは、本明細書に収載される教示を考えると、当業者に公知の技法により調製することができる。そのようなワクチンは、薬学的に許容される担体中の弱毒化株の免疫学的有効量を含むことになる。ワクチンを１又は複数用量で投与することができるだろう。免疫学的有効量は、本明細書に収載される教示を考えると、過度の実験を伴わずに当技術分野において公知の手段により決定可能である。無毒の細菌の量は、依然として無毒でありながら疾患にかかりやすい動物の免疫応答を刺激するのに十分な量である。これは、関与する特定の動物、細菌及び疾患に依存することになる。感受性動物に投与される推奨用量は、好ましくは、約１０3～１０9細菌／Ｋｇ体重、最も好ましくは、約１０5～１０7細菌／Ｋｇ体重である。担体は、当業者に公知であり、安定剤及び希釈剤を含む。そのようなワクチンは、適切なアジュバントも含有し得る。本発明のワクチンを、他のワクチンと組み合わせて、例えば、別の凍結乾燥ワクチンの希釈剤として、使用することができ、又は凍結乾燥の前に別のワクチンと併せることができ、又は単に混合することができる。別の実施形態では、２種又はそれより多種の液体ワクチンの混合物も企図される。ワクチン調製物を、例えば、保存を目的として又は後に液体ワクチンに製剤化するために、凍結乾燥により乾燥させることもできる。
したがって、本発明は、動物宿主の毒性野生型Ｌ．イントラセルラリス菌に対する免疫応答を、そのような細菌から宿主を防御することを目的として誘導するための方法も含む。生きている、改変された生きている、若しくは弱毒化された細菌の又は本明細書に記載される細菌の免疫学的有効量を宿主に投与するステップ、好ましくは、本発明のワクチンを宿主に投与するステップを含む。
本明細書で使用される場合、「大規模培養」は、おおよそ２．０～３．０リットルより多いＬ．イントラセルラリスの培養レベルを意味し、１００リットル又はそれを超える規模での生産を含む。「培養」は、本明細書で使用される場合、Ｌ．イントラセルラリスの増殖、再生及び／又は増殖を促進するプロセスを意味する。
本明細書に記載される細菌の培養のための方法を実施する場合、培養細胞を、Ｌ．イントラセルラリス菌を含む接種材料と先ず接触させて、細胞を細菌に感染させ得る。ＩＥＣ－１８（ＡＴＣＣ １５８９）－－ラット腸上皮細胞、ＨＥｐ－２（ＡＴＣＣ ２３）－－ヒト類表皮癌細胞、ＭｃＣｏｙ（ＡＴＣＣ １６９６）－－マウス（詳細不明）細胞、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ３４）－－メイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞、ＢＧＭＫ（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＃７１－１７６）－－バッファローミドリザル腎細胞、及び豚腸上皮細胞を含むがこれらに限定されない、非常に多くの細胞株を、本発明の実施の際に使用することができる。好ましい培養細胞は、ＨＥｐ－２、ＭｃＣｏｙ又はＩＥＣ－１８細胞である。或いは、細菌が本明細書で教示されるような適切な溶存Ｏ2濃度で維持されるのであれば、細菌を無細胞系で培養することができる。
培養細胞が使用される場合、接種される前に細胞は単層の形態であるのが好ましいが、そうである必要はない。単層を形成するために、細胞を従来のフラスコに播種することができる。一般に、２５ｃｍ2フラスコあたり約１×１０5～約１０×１０5個の間の細胞が増殖培地と混合されて各フラスコに播種される。増殖培地は、窒素源、選択された培養細胞に必要な増殖因子、及び炭素源、例えばグルコース又はラクトースを含む、細胞培養用の任意の培地であり得る。好ましい培地は、２～５％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭであるが、様々な他の市販の培地を使用して好結果を得ることができる。
本出願人は、Ｌ．イントラセルラリスの培養成功が、培養細胞を増殖し続ける状態に保つことによって後押しされることを見いだした。したがって、培養細胞単層は、接種時に約２０パーセント～約５０パーセントの集密度であるべきである。好ましくは、細胞は、接種時に約３０パーセント～約４０パーセントの集密度であるべきであり、約３０パーセントの集密度が最も好ましい。
接種材料は、例えば、ＡＴＣＣ寄託物５５６７２、ＮＣＴＣ寄託物１２６５６若しくは１２６５７から得られる、又は感染した豚若しくは他の動物から本明細書で論じられる単離及び精製を使用して得られる、Ｌ．イントラセルラリスの純粋な培養物であり得る。
一実施形態によれば、本発明を実施するための接種材料は、ＰＰＥに感染した豚又は他の動物の回腸の粘膜を擦過採取することにより調製された腸ホモジネートである。腸ホモジネートを調製する際、培養に選択される回腸切片は、消化管の肉眼的肥厚がある重度の病変を示すものであるべきである。細菌が脆弱性であることから、試料を、好ましくは、剖検後に可能な限り速やかに－７０℃で保存するべきである。Ｌ．イントラセルラリスが耐性である抗生物質、例えば、バンコマイシン、アンホテリシンＢ、又は抗生物質のアミノグリコシド群のメンバー（２～３例を挙げると、ゲンタマイシン及びネオマイシンが挙げられる）が、好ましくは、Ｌ．イントラセルラリスの増殖を可能にしつつ細菌の夾雑を抑制するために接種材料に添加される。接種材料が純粋な培養物であろうと、腸ホモジネートであろうと、培養細胞の接種は、本明細書における教示を考えると、当技術分野において公知の様々な技法により行うことができる。
次いで、細菌及び／又は接種された培養細胞は、低下した溶存Ｏ2濃度のもとでインキュベートされる。１８％より高い溶存酸素濃度では、Ｌ．イントラセルラリスの増殖は最適とは言い難く、この範囲外の酸素濃度では最終的に増殖の停止が起こる。好ましくは、接種された培養細胞は、約０％～約１０％の範囲の溶存酸素濃度でインキュベートされる。より好ましくは、細胞は、約０％～約８％の範囲の酸素濃度でインキュベートされ、約０％～約３．０％の酸素濃度が最も好ましい。
二酸化炭素の適切な濃度も、Ｌ．イントラセルラリスの適切な増殖にとって重要である。１０％より高い及び４％未満の二酸化炭素濃度では非最適増殖が起こり、この範囲外の二酸化炭素濃度では最終的に増殖の停止が起こる。好ましくは、二酸化炭素濃度は、約６％～約９％の範囲であり、約８．８％の二酸化炭素濃度が最も好ましい。
加えて、細胞は、好ましくは、約７３％～約９４％の範囲の水素濃度でインキュベートされる。存在する水素の一部又は全ての代わりに窒素を使用してもよい。特定の好ましい実施形態によれば、細胞は、約０～８．０％Ｏ2、約８．８％ＣＯ2、及び約８３．２％Ｈ2でインキュベートされる。
接種された細胞は、適切な酸素及び二酸化炭素濃度を有し、インキュベーション中に細胞を浮遊させることが可能である、デュアルガスインキュベーター又は他のガラスチャンバーの中で、インキュベートされ得る。チャンバーは、接種された細胞を浮遊状態で維持するための手段と、適切な気体濃度を供給し、維持するための、気体モニター及び供給源とを含むべきである。インキュベーション温度は、３０℃～４５℃の範囲であるべきで有り、より好ましくは、３６℃～３８℃の範囲である。最も好ましくは、温度は、約３７℃である。本発明の培養及び弱毒化方法に必要な機器は、本明細書での教示を考えると、当業者には容易に入手可能である。本発明を行うために好適な機器の一例は、細胞を浮遊状態で維持するためのスピナーフラスコを併用する、デュアルガスインキュベーター、例えば、Ｌａｂ－Ｌｉｎｅ、Ｍｅｌｒｏｓｅ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌから入手可能なモデル４８０である。現在好ましい機器は、少なくとも２リットルの培地を収容する、発酵槽、バイオリアクター又はロータリーシェーカーであって、適切な濃度のガスの散布又は他の機械攪拌手段によって培養細胞を浮遊状態で維持することができ、且つ培地中の溶存Ｏ2レベルを継続的にモニターすることができる、発酵槽、バイオリアクター又はロータリーシェーカーを含む。Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｂｒａｕｎ及び他の会社は、このために好適な発酵槽及びバイオリアクターを製造している。接種された細胞をインキュベーション中に浮遊状態で維持することにより、個々の細胞の増殖培地への及び酸素と二酸化炭素の適切な混合物への曝露を増加させることによって、細胞の、それ故、Ｌ．イントラセルラリスの最大増殖が、達成される。例えば、培養フラスコ、ローラーボトル、膜培養及びスピナーフラスコをはじめとする、当技術分野において公知の様々な方法により、培養細胞を攪拌することができ、浮遊状態で維持することができる。デュアルガスインキュベーター又は同様の装置の内部でスピナーフラスコの中の細胞をインキュベートすることにより、細胞を、インキュベーション中、浮遊状態に保つことができる。用語「スピナーフラスコ」は、本明細書で使用される場合、培養物を攪拌し、その中に含有されている細胞を浮遊状態に保つためにパドル、プロペラ又は他の手段を用いる、フラスコ又は他の容器を意味する。
本発明の特に好ましい実施形態では、接種細胞を、細胞が集密に至るまでインキュベートし、次いで、増殖培地が入っているスピナーフラスコに細胞を入れ、フラスコを回転させながらデュアルガスインキュベーターでインキュベートする。好ましくは、接種細胞をスピナーフラスコに擦過採取する。当技術分野において公知の様々な方法により、例えば、セルスクレーパーを使用して細胞を剥がすことにより、これを達成することができる。細胞をスピナーフラスコに導入し次第、スピナーフラスコのパドルを通常は約３０～約６０ｒｐｍの範囲で回転させて感染細胞を浮遊状態で維持する。
次いで、培養Ｌ．イントラセルラリスの一部分を新鮮培地に継代させてＬ．イントラセルラリス菌の生産を増加させる。本明細書における用語「継代させる（こと）」又はその語尾変化形は、培養Ｌ．イントラセルラリスの一部分を新鮮な培養細胞に、当該新鮮細胞を当該細菌に感染させるために移すプロセスを意味する。用語「新鮮（な）」は、本明細書で使用される場合、まだＬ．イントラセルラリスに感染していない細胞を意味する。好ましくは、そのような細胞は、平均で、おおよそ１日以下の日齢である。
浮遊培養でのＬ．イントラセルラリスの継代は、元の培養物の一部分を除去し、新鮮な培養細胞が入っている新しいフラスコにそれを添加することにより、遂行することができる。元の培養物が、１ｍｌあたり多数の細菌、例えば、１ｍｌあたり約１０4より多い細菌を有する場合、培養物の約１～１０％（体積対体積）の間の％を、感染フラスコから、新鮮細胞が入っている新しいフラスコに添加することが好ましい。これは、好ましくは、細胞の５０～１００％が感染しているときに行われる。細胞の５０％未満が感染している場合、継代は、好ましくは、培養物を１：２に分割して新しいフラスコに入れ、新鮮培地によりその体積の規模を拡大することにより遂行される。どちらにせよ、先行技術におけるような単層培養の継代とはまったく対照的に、細胞溶解及び他のステップを必要としない。
培養細胞を十分に増殖させ、その後、ＴＣＩＤ50又は他の匹敵する方法により判定して約７０％より高い細胞感染率でＬ．イントラセルラリスに感染させた後に、培養Ｌ．イントラセルラリス菌の少なくとも一部分が回収される。しかし、細胞感染度を決定するために異なる技法を使用して異なる結果が得られた場合には、ＩＦＡ法の結果を使用するものとする。回収ステップは、本明細書での教示を考えると、当業者に公知の様々な技法により浮遊液から細菌を分離することにより行うことができる。好ましくは、Ｌ．イントラセルラリス菌は、浮遊液の全て又は一部分の内容物を遠心分離して培養細胞をペレット化すること、得られた細胞ペレットを再浮遊させること、そして感染細胞を溶解することにより回収される。通常は、内容物の少なくとも一部分を約３０００×ｇで約２０分間遠心分離して細胞及び細菌をペレット化する。次いで、ペレットを、例えばスクロース－リン酸－グルタミン酸（ＳＰＧ）溶液に、再浮遊させ、おおよそ４回、２５ゲージ針を通過させて細胞を溶解することができる。さらなる精製が望まれる場合、試料を約１４５×ｇで約５分間、遠心分離して、細胞の核及び残屑を除去することができる。次いで、上清を約３０００×ｇで約２０分間、遠心分離し、得られたペレットを、適切な希釈剤に、例えば、ウシ胎仔血清（凍結により好適な、若しくは接種物としての使用により適好な、回収細菌を調製するために）を含有するＳＰＧ、又は増殖培地（新鮮な細胞への継代により好適な回収細菌を調製するために）を含有するＳＰＧに、再浮遊させることができる。
前述の通り、大規模生産のためのＬ．イントラセルラリスの有効な増殖は、組織細胞の活発な増殖を保つことによって増進される。単層で、培養物が集密になると、細胞分裂速度は大幅に低下する。単層組織培養でＬ．イントラセルラリスを増殖させようとする試みは成功が制限されてしまい、規模拡大ができないでいる。しかし、浮遊培養の使用は、細胞の活発な増殖を保つことを著しく助長し、持続的な培養の拡大及び規模拡大を可能にする。上記で説明したように発酵槽及び約０～３％の間の溶存Ｏ2を使用して、本出願人は、１０8細菌／ｍｌまで増やすことができた。本出願人はまた、培養細菌の活発な増殖を何カ月も保つことができており、無限にそうすることができると予想している。
以前は、細胞をＬ．イントラセルラリスに感染させるために表面に付着させなければならないと、一般に考えられていた。本明細書で開示される細胞浮遊液は、独特であり、この理論と矛盾する。ＭｃＣｏｙ又はＩＥＣ－１８細胞を使用する場合、ゼラチン、アガロース、コラーゲン、アクリルアミド、又はシリカビーズ、例えば、ＨｙＣｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈにより製造されているＣｕｌｔｉｓｐｈｅｒ－Ｇ多孔性マイクロキャリアを、増殖培地と共に添加することができる。一実施形態では、Ｌ．イントラセルラリスに感染したＭｃＣｏｙ細胞の細胞培養での増殖中に、未感染ＭｃＣｏｙ細胞が培地に添加され得る。しかし、ＭｃＣｏｙはもちろんＨＥｐ－２細胞も、本発明の培養方法で、マイクロキャリアを必要とすることなく使用することができる。これは、特に有利で経済的な大規模培養経路である。
培養維持を目的として、ＨＥｐ－２培養に関しては、好ましくは、一週間間隔で、培養物の２５～５０％が除去され、新鮮培地と置き換えられる。マイクロキャリア又はビーズを用いる細胞培養については、好ましくは、週に１～２回、培養物の２５～５０％が除去され、新しいマイクロキャリア及び新鮮培地と置き換えられる。規模拡大を目的として、追加の２５～５０％の培地、又はマイクロキャリアを伴う培地が、培養物に添加され得る。
培養細胞が感染する速度に依存して、新鮮培地への継代は、一般に、約２週間に１回～約５週間に１回の間で行われる。培養細胞が２～３週間以内に少なくとも７０％になると仮定すると、好ましくは、継代は、約３週間に１回～約４週間に１回の間で行われる。
本発明のワクチンにおける使用のための生菌Ｌ．イントラセルラリス抗原を、上にアウトラインを示した生産方法で生産することができる。特に好ましい実施形態によれば、感染細胞を長時間（例えば、６～８カ月）浮遊状態で維持した後、培養Ｌ．イントラセルラリス菌の少なくとも一部分が回収され、弱毒化の可能性についてモニターされる。そのようなモニタリングは、好ましくは、弱毒化株のために選択する宿主動物又は動物モデルチャレンジごとに遂行される。そのような弱毒化株は、本明細書で教示される方法に従ってワクチンに使用される。本発明による弱毒化Ｌ．イントラセルラリスワクチンは、様々な動物においてＬ．イントラセルラリス感染に対する有効性が示されており、ヒトにおいても有効であると予想される。
浮遊状態での培養は、急速な培養物の拡大、収率の１００～１０００倍の増加、及びコスト削減を可能にする。結果として、本明細書で開示される培養方法に従って生産されるＬ．イントラセルラリス菌の豊富な供給量がワクチン生産を目的として容易に弱毒化される。単層培養では、従来の単層増殖技法を使用して生産される細菌の収率が低いので、弱毒化は困難である。対照的に、開示されるＬ．イントラセルラリス増殖方法は、容易さ、速度、及びこのために利用可能な細菌の数を大きく増加させる。生じる細胞及び細胞分裂が多いほど、ワクチンの開発に有利である変異の発生レベルが高くなる。浮遊状態での増殖は、環境調節遺伝子及びそれらの発現産物により制御される重要な免疫原の発現を増加させる。
結果として得られる弱毒化株を、米国特許第５，８８５，８２３号の実施例１に記載されているような組織培養単層で培養することができるが、本明細書で開示される方法に従って浮遊培養で培養するのが好ましい。他の弱毒化方法としては、例えば、Ｎ－メチルニトロソグアニジンを用いる化学的弱毒化方法、及び当技術分野において公知の他の弱毒化方法を挙げることができる。複数の継代によるか化学的手段によるかを問わず、弱毒化Ｌ．イントラセルラリスがワクチン調製のために生産され、選択される。
本開示の１つのワクチン実施形態によると、抗原は、上記の遠心分離又は精密濾過により回収される。次いで、抗原は、宿主動物種における用量漸増により決定される、最適な宿主動物免疫応答に基づいて定義されたレベルで、標準化される。
以前に記載された培養方法を使用する特に好ましいワクチン実施形態によると、細菌は、弱毒化された無毒の生培養物の誘導及び選択のために連続継代される。培養物は、宿主動物において（好ましくは、浮遊培養で少なくとも６～８カ月又はそれより長く増殖させた後に）弱毒化の徴候について試験される。培養物は、以前に記載されたように回収され、希釈される。ブタに、例えば、少なくとも１×１０5～１×１０6の細菌による経口ワクチン接種を施すことができる。ワクチン接種の約２８日後、ブタに、Ｌ．イントラセルラリスの継代数の少ない（生じて約３０～４５日の）毒性培養物からの１×１０7の微生物が経口接種される。感染動物は、チャレンジの２１日後に剖検され、小腸が、肉眼的病変はもちろん微視的病変についても観察される。ＰＣＲも行うべきである。対照動物の約８０パーセントは、肉眼的又は微視的病変を示し、ＰＣＲ試験法又はＦＡ試験法のどちらかを使用する腸の粘膜細胞におけるＬ．イントラセルラリスの存在についての試験で陽性反応を示すことになる。ワクチン接種動物は、組織学的観察により判定して正常な粘膜表面を有することになり、ＰＣＲ試験により陰性となるであろう。
一般に、弱毒化された免疫原性Ｌ．イントラセルラリス株は、少なくとも約１５０～２５０日の間の日数の連続培養の後に生産され、この培養期間中に培養物は少なくとも約７～約１２回、継代される。本明細書で教示されるモニタリング及び選択方法を用いるのであれば、これらの数字を変えることにより他の弱毒化培養物を生産することができる。
次いで、薬学的に許容される担体中の弱毒化Ｌ．イントラセルラリスの免疫学的有効量を含むワクチンが調製される。併せられた免疫原と担体は、水溶液、エマルジョン又は懸濁液であり得る。免疫学的有効量は、本明細書に収載される教示を考えると、過度の実験を伴わずに当技術分野において公知の手段により決定可能である。一般に、免疫原の量は、精製された細菌が使用される場合、５０～５００マイクログラムの間、好ましくは、１０7～１０9ＴＣＩＤ50の間となる。
本発明の方法に従って増殖させたＬ．イントラセルラリス菌、又はそのような細菌に由来する成分をＥＬＩＳＡ又は他のイムノアッセイ、例えば免疫蛍光抗体検査（「ＩＦＡ」）において抗原として使用して、細菌による感染が疑われる動物の血清及び他の体液中のＬ．イントラセルラリスを検出することができる。現在好ましいイムノアッセイは、米国特許第５，８８５，８２３号の実施例１に記載されているようなＩＦＡである。或いは、本発明に従って増殖させた細菌をウェスタンブロットアッセイで使用することができる。
ＷＯ９６／３９６２９及びＷＯ０５／０１１７３１には、ローソニア・イントラセルラリスの培養、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス及びその投与が記載されている。
有利な実施形態では、生菌ローソニア・イントラセルラリスは、改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスである。別の有利な実施形態では、生菌ローソニア・イントラセルラリスは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリスである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、約１０3～１０9細菌／Ｋｇ体重の、好ましくは約１０5～１０7細菌／Ｋｇ体重の、ローソニア・イントラセルラリスの投薬量を有する。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス菌約１０5～約１０7のローソニア・イントラセルラリスの抗原の投薬量を有する。
有利な実施形態では、ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、凍結乾燥されている。
有利な実施形態では、本発明のワクチン中のローソニア・イントラセルラリスの抗原は、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれている抗原である。
有利な実施形態では、ローソニア・イントラセルラリスワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓワクチンである。
免疫化の又はワクチン接種の好ましい方法は、筋肉内経路などの全身投与による本発明によるワクチンの投与に存する。
一態様では、本発明のワクチンは、ＰＣＶの抗原を含み得る。したがって、本発明の一態様では、ＰＣＶに対するブタの防御免疫応答を惹起するための免疫原性組成物が提供される。本発明に関連して、ＰＣＶ免疫原（抗原）をコードする及び発現するプラスミド構築物を、使用することができる。さらに、ワクチン接種方法及びＤＮＡワクチンが本明細書に記載される。加えて、本発明は、これらのワクチンの産生方法又は製剤化方法に関する。不活性化ＰＣＶワクチン（例えば、米国特許第６，５１７，８４３号を参照されたい）も企図される。
Meehan 1998によると、ＰＣＶ ＯＲＦ１及びＯＲＦ２は、それぞれ、３７．７ｋＤ及び２７．８ｋＤの予測分子量を有するタンパク質をコードする。ＯＲＦ３及びＯＲＦ４（Meehan et al. 1998によると、ＷＯ９９１８２１４におけるＯＲＦ７及びＯＲＦ１０にそれぞれ対応する）は、それぞれ、１１．９及び６．５ｋＤの予測分子量を有するタンパク質をコードする。これらのＯＲＦの配列もＧｅｎｂａｎｋ ＡＦ０５５３９２で入手可能である。それらを、単独で、又は組み合わせて、例えば、ＯＲＦ１及び／又はＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ３と組み合わせて、プラスミドに組み込むこと及び本発明に従って使用することもできる。
米国特許第６，３９１，３１４号（ＷＯ９９１８２１４における第１～３及び５、６、８～９、１１～１２欄）で開示されている他のＰＣＶ ＯＲＦ １～３及び５、６、８～９、１１～１２を、ここに記載される条件下で、互いに又はここで定義されるＯＲＦ １及び２と組み合わせて又は別様に使用することができる。
これは、上記で与えられた知識の中での等価の配列の使用、特に、本明細書で言及される様々なＰＣＶに由来するＯＲＦの使用も包含する。用語「等価の配列」は、本明細書で使用される場合、Ｉｍｐ １０１０株の対応するＯＲＦとの下記でさらに説明するような相同性又は同一性を有するＯＲＦ２及び／又はＯＲＦ１を有するＰＣＶ株に由来する配列を指し得る。MeehanによるＯＲＦ３については、相同性又は同一性が、例えば、Ｉｍｐ１０１０株のＯＲＦ３と８０％に等しい又はそれより高い、特に８５％より高い、好ましくは９０％若しくは９５％より高い必要があると言うこともできる。Meehan 1998によるＯＲＦ４については、それがＩｍｐ１０１０株のＯＲＦ４と８６％に等しい又はそれより高い、特に、９０％より高い、好ましくは９５％より高いことがある。
ゲノムヌクレオチド配列、例えば、ＷＯ９９１８２１４で開示されているものから、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（商標）などの標準的なソフトウェアを使用してＯＲＦを決定することは、常套的である。また、ゲノムと１０１０株のゲノムとのアラインメント、及び１０１０株ＯＲＦとの比較によって、当業者は、別の株についてのゲノム上のＯＲＦ（例えば、ＷＯ９９１８２１４で開示されているもの）を容易に決定することが可能になる。アラインメントを行うためのソフトウェアの使用は、当業者には常套的であり、等価のＯＲＦに直接アクセスできるようにすることができる。
ＰＣＶ３ ＯＲＦ２及びＰＣＶ３ゲノム配列は、ＫＴ８６９０７７（ＧｅｎＢａｎｋ）から得られた。
好ましくは、本発明のワクチンのＰＣＶ抗原は、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２及び／又はＰＣＶ３抗原である。好ましくは、本発明のワクチンのＰＣＶ抗原は、組換えポリペプチドである。
好ましい態様では、本開示のポリペプチドは、組換えＰＣＶ１、ＰＣＶ２又はＰＣＶ３ ＯＲＦ２タンパク質、例えば、組換えバキュロウイルス発現ＰＣＶ３ ＯＲＦ２タンパク質、又は好ましくは、組換えバキュロウイルス発現ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質である。用語「組換えＯＲＦ２タンパク質」は、本明細書で使用される場合、組換えＤＮＡ技法により生産されるポリペプチドなどの、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。そのような技法の例は、発現されるタンパク質をコードするＤＮＡを好適な発現ベクター、例えば、バキュロウイルス発現ベクターに挿入し、そしてまたそのベクターを使用して宿主細胞にトランスフェクトして、又はバキュロウイルス発現の場合には宿主細胞を感染させて、ＤＮＡによりコードされるタンパク質又はポリペプチドを生産するケースを含み得る。したがって、用語「組換えＯＲＦ２タンパク質」は、本明細書で使用される場合、特に、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。
言い換えると、本発明のワクチンのＰＣＶ抗原は、好ましくは、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子、好ましくはＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子、最も好ましくはＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子により発現（コード）される組換えポリペプチドである。
本発明のワクチンのＰＣＶ抗原は、好ましくは、バキュロウイルス細胞から発現される（前記細胞によりコードされる）組換えポリペプチドである。
本発明のワクチンのＰＣＶ抗原は、好ましくは、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子、好ましくはＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子、最も好ましくはＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子から発現される（前記遺伝子によりコードされる）組換えポリペプチドであって、バキュロウイルス細胞に発現される組換えポリペプチドである。
本発明のワクチンのＰＣＶ抗原は、好ましくは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原である。
特定の例によると、組換えＰＣＶ１、ＰＣＶ２又はＰＣＶ３ ＯＲＦ２タンパク質は、以下のステップを有する方法により生産される：ＰＣＶ１、ＰＣＶ２又はＰＣＶ３ ＯＲＦ２の遺伝子をバキュロウイルス移入ベクターにクローニングするステップ、移入ベクターを使用して、昆虫細胞における相同組換えにより前記遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを調製するステップ、次いで、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２又はＰＣＶ３ ＯＲＦ２タンパク質を、組換えバキュロウイルスによる感染中に昆虫細胞に発現させるステップ。
用語「～の配列からなる組換えＰＣＶタンパク質」が、特に、ポリペプチドが発現される細胞による影響を受ける配列のあらゆる共翻訳及び／又は翻訳後改変（単数又は複数）にも関することは、さらに理解される。したがって、用語「～の配列からなる組換えＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質」は、本明細書に記載される場合、ポリペプチドが発現される細胞による影響を受ける１種又は複数種の改変、特に、タンパク質生合成及び／又はタンパク質プロセシングでもたらされるアミノ酸残基の改変、好ましくは、グリコシル化、リン酸化及びアセチル化からなる群から選択される改変、を有する配列も対象とする。
好ましくは、本開示による組換えＰＣＶ１、ＰＣＶ２又はＰＣＶ３ ＯＲＦ２タンパク質は、バキュロウイルス発現系により、特に、培養昆虫細胞において生産される、又は得ることができる。
本明細書において「プラスミド」という語は、発現されることになるＰＣＶ配列とそのｉｎ ｖｉｖｏ発現に必要なエレメントとを含むポリヌクレオチド配列の形態のあらゆるＤＮＡ転写ユニットに適用されるようにここでは意図される。超らせん型又は別の形の環状プラスミド形態も、好ましい。線状形態もまた本発明の範囲内に含まれる。
本発明に関連して、特に、米国特許第６，９４３，１５２号のプラスミドを使用することができる。各プラスミドはプロモーターを含み、このプロモーターは、その制御下にある挿入遺伝子の宿主細胞における発現を確実にすることができる。プロモーターは、一般に、強い真核生物プロモーター、特に、サイトメガロウイルス初期プロモーターＣＭＶ－ＩＥであって、ヒト若しくはマウス由来の、又はラット若しくはモルモットなどの他のものに由来してもよい、プロモーターである。より一般的には、プロモーターは、ウイルス由来のプロモーター又は細胞由来のプロモーターのどちらかである。ＣＭＶ－ＩＥ以外のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルス初期若しくは後期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーターを挙げることができる。プロモーターは、遺伝子が由来するウイルスからのプロモーター、例えば、その遺伝子に特異的なプロモーターであることもある。細胞プロモーターとしては、細胞骨格遺伝子のプロモーター、例えば、デスミンプロモーター、又は代替的にアクチンプロモーターなどを挙げることができる。幾つかの遺伝子が同じプラスミド内に存在する場合、それらは、同じ転写ユニットに備えられていることもあり、又は２つの異なるユニットに備えられていることもある。
プラスミドは、他の調節エレメント、例えば、イントロン型、好ましくは、ウサギベータ－グロビン遺伝子のイントロンＩＩの、安定化配列（van Ooyen et al. Science, 1979, 206: 337-344）、組織プラスミノゲンアクチベーター遺伝子によりコードされるタンパク質のシグナル配列（tPA; Montgomery et al. Cell. Mol. Biol. 1997, 43: 285-292）、及びポリアデニル化シグナル（ポリＡ）、特に、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子の（米国特許第５，１２２，４５８号）又はウサギベータ－グロビン遺伝子のポリＡなども、含み得る。
「配列同一性」は、当技術分野において公知であるように、２つ若しくはそれより多くのポリペプチド間の関係、又は２つ若しくはそれより多くのポリヌクレオチド配列間の関係、すなわち、参照配列と、その参照配列と比較されることになる所与の配列との関係を指す。配列同一性は、配列が、そのような配列のストリング間のマッチにより判定して高い配列類似性度を生じさせるように最適にアラインされた後、所与の配列を参照配列と比較することによって決定される。そのようなアラインメントによって、配列同一性は位置ごとに突き止められ、例えば、配列は、特定の位置において、その位置におけるヌクレオチド又はアミノ酸が同一である場合、「同一」である。次いで、そのような位置同一性の総数が、参照配列中のヌクレオチド又は残基の総数で割られて、配列同一性％が得られる。配列同一性は、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988)、Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；及びCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されているものを含むがこれらに限定されない、公知の方法によって容易に算出することができ、これらの参考文献の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大マッチをもたらすように設計される。配列同一性を決定するための方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する、公開されているコンピュータープログラムで体系化される。そのようなプログラムの例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の供給元（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、この参考文献の教示は、参照により本明細書に組み込まれる）から公開されている。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列との高い配列同一性レベルを生じさせるためにデフォルトギャップ重みを使用して配列を最適にアラインする。実例として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば、８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の「配列同一性」を有する、ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列に関しては、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のヌクレオチド１００個毎に１５以下、好ましくは１０以下、よりいっそう好ましくは５以下の点突然変異を含み得ることを除いて、参照配列と同一であるように意図される。言い換えると、参照ポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの場合、参照配列中のヌクレオチドの１５％以下、好ましくは１０％以下、よりいっそう好ましくは５％以下が欠失していること若しくは別のヌクレオチドで置換されていることがあり、又は参照配列中の全ヌクレオチドの１５％以下、好ましくは１０％以下、よりいっそう好ましくは５％以下の多数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていることがある。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端位置に存在することもあり、或いはこれらの末端位置の間のどこかに、参照配列内のヌクレオチド間、又は参照配列内の１つ若しくは複数の連続する基の中、どちらかに個々に散在して存在することもある。類似して、参照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の配列同一性を有する、所与のアミノ酸配列を有するポリヌクレオチド配列に関しては、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列は、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列のアミノ酸１００個毎に１５以下、好ましくは１０以下、よりいっそう好ましくは５以下の変更を含み得ることを除いて、参照配列と同一であるように意図される。言い換えると、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％の配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るために、参照配列中のアミノ酸残基の１５％以下、好ましくは以下１０％以下、よりいっそう好ましくは以下５％以下が、欠失され得るか若しくは別のアミノ酸で置換され得、又は参照配列中のアミノ酸残基の総数の１５％以下、好ましくは以下１０％以下、よりいっそう好ましくは以下５％以下の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ又はカルボキシ末端位置に存在することもあり、或いは、これらの末端位置の間のどこかに、参照配列内のヌクレオチド間、又は参照配列内の1つ若しくは複数の連続する基の中、どちらかに個々に散在して存在することもある。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。しかし、保存的置換は、配列同一性を決定する際にマッチとして含まれない。
「配列相同性」は、本明細書で使用される場合、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するために、２つ又はそれより多くの配列がアラインされ、必要に応じてギャップが挿入される。しかし、「配列同一性」とは対照的に、保存的アミノ酸置換は、配列相同性を決定する際にマッチとしてカウントされない。言い換えると、参照配列と９５％の配列相同性を有するポリペプチド又はポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの８５％、好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは９５％が、別のアミノ酸若しくはヌクレオチドとマッチしなければならないか、又は別のアミノ酸若しくはヌクレオチドでの保存的置換を含まなければならず、或いは、参照配列中の、保存的置換を含まない、全アミノ酸残基又はヌクレオチドの１５％以下、好ましくは以下１０％以下、よりいっそう好ましくは以下５％以下の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、５０、よりいっそう好ましくは１００、よりいっそう好ましくは２５０、よりいっそう好ましくは５００ヌクレオチドのストレッチを少なくとも含む。
配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって、又はそれら２つの配列の断片にわたって行われ得る。配列同一性は、ある領域、例えば、連続する２０、５０、１００又はそれを超えるアミノ酸残基にわたって行われることもあるが、通常は、その比較は、比較されることになる２つの配列の全長にわたって行われるであろう。
「保存的置換」は、あるアミノ酸残基又はヌクレオチドの、サイズ、疎水性などをはじめとする同様の特徴又は特性を有する別のアミノ酸残基又はヌクレオチドによる、全体的な機能を有意に変化させないような置換を指す。
本発明に関連して、変異を有する、例えば、これに限定されるものではないが、カプシドタンパク質の変異を有する、ＰＣＶ１又はＰＣＶ２又はＰＣＶ３も使用され得る。ＰＣＶ２と嘴羽毛病ウイルス（ＢＦＤＶ）とのカプシドアミノ酸配列の相違にもかかわらず、結晶構造は、それらの相違にもかかわらず、非常に類似している。有利なことに、ＰＣＶ３の変異は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を安定化する変異である。ＰＣＶ３カプシドタンパク質は、自己組織化してＶＬＰになるはずなのだが、ＰＣＶ３タンパク質の発現レベルは、ＰＣＶ２カプシドタンパク質と比較して有意に低い。具体的には、タンパク質の約２０％しか組織化してＶＬＰにならないが、タンパク質の残りの８０％が凝集して不溶性画分になる。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６９３０で開示されているＰＣＶ３カプシドタンパク質の変異は、本発明に関連して使用され得る。
本発明に関連しての使用に好適なアッセイ及び技法は、ブタサーコウイルスカプシド（ＯＲＦ２）タンパク質のウイルス様粒子（ＶＬＰ）の組み立て及びその分解の追跡又は定量化に使用されているものを含み、これらアッセイ及び技法には、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）；銀染色剤を用いてもよく、又はクマシー染色剤を用いてもよい、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ；ウェスタンブロット又は免疫ブロット；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）；動的光散乱（ＤＬＳ）又は多角度光散乱（ｍｕｌｔｉ－ａｎｇｌｅｄ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＭＡＬＳ）；透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）；分析用超遠心分離；及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）と連結されていてもよい蛍光分光分析（ＦＳＡ）が含まれる。追加の好適な技法としては、タンパク質－核酸複合体のアガロースゲル遅延試験、免疫拡散試験、例えば、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、ナノ粒子追跡分析法（ＮＴＡ）、代謝標識法、及び化学発光酵素ベースアッセイも、挙げることができる。これらのアッセイの各々は、当技術分野において周知であり、例えば、Fang, Mingli et al. “Detection of the Assembly and Disassembly of PCV2b Virus-Like Particles Using Fluorescence Spectroscopy Analysis” Intervirology vol. 58, 2015, pp. 318-323；Thompson, Christine et al. “Analytical technologies for influenza virus-like particle candidate vaccines: challenges and emerging approaches” Virology Journal vol 10, 2013, p. 141；Steppert, Petra et al. “Quantification and characterization of virus-like particles by size-exclusion chromatography and nanoparticle tracking analysis” Journal of Chromatography A vol. 1487, 2017, pp. 89-99；Yadav, Shalini et al. “A facile quantitative assay for viral particle genesis reveals cooperativity in virion assembly and saturation of an antiviral protein” Virology, vol 429, No. 2, 2012, pp. 155-162；及びZeltins, Andris “Construction and Characterization of Virus-Like Particles: A Review” Molecular Biotechnology vol. 53, 2013, pp. 92-107に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
バキュロウイルスポリへドリンプロモーターの制御下のＰＣＶ３ ＯＲＦ２遺伝子を含有する組換えバキュロウイルス（ＢａｃｕｌｏＧ／ＰＣＶ３ ＯＲＦ２ Ｃｌｏｎｅ ４Ｂ４－２Ｅ１２ Ｐｒｅ－ＭＳＶ ｐ８；ロット番号３６２４－０３９）の開発は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６９３０の実施例１に記載されている。一部の実施形態では、ワクチンにおける前記実施例１に記載されているそのような組換えバキュロウイルス発現タンパク質の使用は、組換えウイルスの死滅及び／又は不活性化バージョンを包含し得る。或いは、一部のワクチンには、組換えウイルス、例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６９３０の実施例１に示されているものに類似した組換えウイルスが、改変された生ウイルスとして使用され得る。
一部の実施形態では、増幅されたＰＣＶ ＯＲＦ２コード配列は、所望の移入ベクターを生成するために、隣接制限部位を利用してバキュロウイルス移入ベクターにサブクローニングされ得る。例えば、増幅されたＰＣＶ ＯＲＦ２コード配列は、移入ベクターを生成するために、隣接制限部位を利用してバキュロウイルス移入ベクターにサブクローニングされ得る。組換えバキュロウイルスは、移入ベクターとバキュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞に共トランスフェクトすることにより生成され得る。使用されるバキュロウイルスＤＮＡは、線状化及び／又は環状バキュロウイルスＤＮＡを含み得る。例えば、ある実施形態では、組換えバキュロウイルスは、移入ベクターと線状化ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）バキュロウイルスＤＮＡをＳｆ９（ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））昆虫細胞に共トランスフェクトすることにより生成され得る。線状化バキュロウイルスＤＮＡは、オートグラファ・カリフォルニア（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来し得、ポリへドリン遺伝子座に致命的な欠失を含有し得、したがって、移入ベクターとの共トランフェクションによって生存可能なバキュロウイルスのレスキューを生じさせることができる。結果として得られる組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルスポリへドリンプロモーターの制御下のＰＣＶ ＯＲＦ２コード配列を含み得る。組換えバキュロウイルスは、Ｓｆ９昆虫細胞を用いて増幅され、その後、Ｓｆ９昆虫細胞を用いて限界希釈クローニングにより精製され得る。一部の実施形態では、完全長環状バキュロウイルスＤＮＡ、例えば、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃが使用され得る。例えば、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃは、目的の遺伝子を多角体遺伝子座に挿入するためにトランスポゾン媒介組換えを使用し得る。当技術分野において公知の他の方法も使用することができる。一部の実施形態では、方法は、商業化されている方法の潜在的な安定性に基づいて選択され得る。例えば、ワクチンの安定性向上をもたらすバキュロウイルスが選択され得る。
一部の実施形態では、マスター細胞培養物をフラスコに播種した後、フラスコは、所定の温度で、特定の時間枠にわたってインキュベートされ得る。次いで、培養物は、２７℃で４時間、インキュベートされ得る。次いで、フラスコに、ＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを播種し得る。例えば、ＯＲＦ２遺伝子を含有するプラスミドがＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（登録商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）バキュロウイルスＤＮＡと共にＳｆ＋昆虫細胞（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）に共トランスフェクトして、ＯＲＦ２遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスが生成され得る。ＯＲＦ２遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスをプラーク精製し、ＳＦ＋細胞株を用いてマスターシードウイルス（ＭＳＶ）を増殖させ、小分けし、－７０℃で保存し得る。バキュロウイルス特異的プライマーを使用するＰＣＲ－ＲＦＬＰによって、ＭＳＶは、ＯＲＦ２バキュロウイルスとして明白に同定され得る。ＭＳＶ又は作業用シードウイルスを生成するためにＯＲＦ２バキュロウイルスに感染させた昆虫細胞は、間接蛍光抗体アッセイでポリクローナル血清又はモノクローナル抗体によって検出されるように、ＯＲＦ２抗原を発現し得る。加えて、ＯＲＦ２バキュロウイルスの同一性をＮ末端アミノ酸配列決定により確認することができる。ＯＲＦ２バキュロウイルスＭＳＶは、連邦規則第９巻１１３条２７項ｃ、１１３．２８項及び１１３．５５項に従って純度についても試験され得る。スピナーフラスコに播種された各組換えバキュロウイルスは、様々な感染多重度（ＭＯＩ）を有し得る。
バキュロウイルスを播種した後、フラスコは、２７±２℃で７日間インキュベートされ得、その間、１００ｒｐｍで攪拌され得る。フラスコは、空気の流れを可能にするために通気キャップを使用し得る。試料が、各フラスコからその後７日間にわたって２４時間おきに採取され得る。採取後、各試料は遠心分離され得、ペレットと上清の両方が分離され、次いで、細孔径０．４５～１．０μｍの膜に通して精密濾過される。
次いで、結果として得られた試料のＯＲＦ２の量が、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量化され得る。ＥＬＩＳＡアッセイは、０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１：６０００希釈された抗ＰＣＶ抗体を用いて行われ得る。次いで、１００μＬの抗体がマイクロタイタープレートのウェルに入れられ、密封され、一晩、３７℃でインキュベートされ得る。次いで、プレートが洗浄溶液で３回、洗浄され、この洗浄溶液は、０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００ｍＬの１０×Ｄ－ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及び８９９．５ｍＬの蒸留水を含んでいた。その後、２５０μＬのブロッキング溶液（蒸留水で１００ｍＬにされた、１０ｍＬのＤ－ＰＢＳ ＱＳ中の５ｇのＣａｒｎａｔｉｏｎ脱脂粉乳（Ｎｅｓｔｌｅ、Ｇｌｅｎｄａｌｅ、ＣＡ））が各ウェルに添加される。次のステップは、試験プレートを洗浄し、次いで、事前希釈抗原を添加するステップである。事前希釈抗原は、希釈プレートのウェルの各々に２００μＬの希釈用溶液（９９９．５ｍＬのＤ－ＰＢＳ中の０．５ｍＬのＴｗｅｅｎ ２０）を添加することにより生成される。次いで、試料は１：２４０比及び１：４８０比で希釈され、これらの希釈試料の各々の１００μＬが希釈プレートの最上部のウェルの１つに添加される（すなわち、一方の最上部ウェルは、１００μＬの１：２４０希釈物を受け、他方は、１００μＬの１：４８０希釈物を受けた）。次いで、プレートの残部について段階希釈が、連続するウェル各々から１００μＬを除去すること、及びそれをプレート上の隣のウェルに移入することにより、行われ得る。各ウェルは、次の移入が行われる前に混合される。試験プレートの洗浄は、プレートを洗浄緩衝液で３回、洗浄することを含む。次いで、プレートが密封され、１時間、３７℃でインキュベートされた後、さらに３回、洗浄緩衝液で洗浄される。使用する検出抗体は、ＰＣＶ ＯＲＦ２に対する抗体である。その抗体が、希釈溶液中、１対３００に希釈され、次いで、希釈された検出抗体１００μＬがウェルに添加される。次いで、プレートは密封され、１時間、３７℃でインキュベートされた後、洗浄緩衝液で３回、洗浄される。次いで、コンジュゲート希釈液が、正常ウサギ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を希釈溶液に添加して濃度１％にすることにより調製される。
コンジュゲート抗体ヤギ抗マウス（Ｈ＋１）－ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）は、このコンジュゲート希釈液中、１：１０，０００に希釈される。次いで、１００μＬの希釈されたコンジュゲート抗体がウェルの各々に添加される。次いで、プレートが密封され、４５分間、３７℃でインキュベートされた後、洗浄緩衝液で３回、洗浄される。等体積のＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂ（ＫＰＬ）と混合された１００μＬの基質（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｋｉｒｋｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＫＰＬ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）が、ウェルの各々に添加される。プレートが室温で１５分間インキュベートされる。次いで、反応を停止させるために、１００μＬのＩＮ ＨＣＬ溶液が全てのウェルに添加される。次いで、プレートはＥＬＩＳＡリーダーにかけられる。
有利なことに、米国特許第６，１０３，５２６号の無血清昆虫細胞（ｅｘｐｒｅｓＳｆ＋細胞株）などの、無血清条件下で、昆虫細胞を培養し、ＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質を生産することができる。他の昆虫細胞株としては、ツマジロクサヨトウ（Ｓｆ）細胞株、例えば、Ｓｆ２１、ｓｆ９が挙げられるが、これらに限定されず、イラクサキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）キャベツルーパーからのｅｘｐｒｅｓＳｆ＋１（ＳＦ＋）、ＢＴＩ－ＴＮ５Ｂ１（Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ）細胞、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（蚕）からのＢｍＮ細胞は、バキュロウイルス研究において及び組換えタンパク質生産のために広く使用されている。
米国特許第９６１０３４５号及び同第９６６９０８７号で開示されているアジュバント、細胞培養上清、保存薬、安定化剤、ウイルスベクター、免疫調節剤及び投薬量が企図され、両方の参考特許文献が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明に関連して、ＰＣＶ１又はＰＣＶ２又はＰＣＶ３免疫原のうちの１種、好ましくは上述のＯＲＦのうちの１つをコードし且つ発現する、本明細書で開示される少なくとも１つのプラスミドを含み、加えて、獣医学的に許容されるビヒクル又はアジュバントを含み、加えて、獣医学的に許容されるアジュバントを含んでいてもよい、免疫原性調製物及びＤＮＡワクチンも使用され得る。一実施形態では、アジュバントは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）又はＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）を含み得る。
ある実施形態では、免疫原性組成物は、１ｍｌ用量中に、ｉ）少なくともいくらかのＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質、ｉｉ）前記ＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質を発現するバキュロウイルス、ｉｉｉ）細胞培養物、ｉｖ）約２～約８ｍＭの範囲の濃度を有する不活性化剤（例えば、ＢＥＩ）、ｖ）不活性化剤と等量の中和剤（例えば、チオ硫酸ナトリウム）、及びｖｉ）所定量のアジュバント（例えば、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）９７１又はＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標））、及びｖｉｉ）生理学的に許容される濃度のリン酸塩を含む、組成物を指す。
最も好ましくは、ここで提供される組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞の上清から回収されたＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質であって、前記細胞はＰＣＶ ＯＲＦ２ ＤＮＡを含有する組換えウイルスベクターに感染しておりＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質を発現し、細胞培養物が、約２～約８ｍＭのＢＥＩで、好ましくは、約５ｍＭのＢＥＩでウイルスベクターを不活性化するように処理されたものである、ＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質と、当量濃度の中和剤、好ましくは、約２～約８ｍＭの最終濃度、好ましくは約５ｍＭの最終濃度でのチオ硫酸ナトリウム溶液とを含有する。
本発明に従ってワクチンにおいて使用されるＰＣＶ抗原コードＤＮＡの量は、約１０μｇ～約２０００μｇの間、好ましくは、約５０μｇ～約１０００μｇの間である。当業者には、各免疫化又はワクチン接種プロトコールに使用されるＤＮＡの有効用量を正確に定義するために必要な力量があるであろう。
用量体積は、０．５～５ｍｌの間、好ましくは、２～３ｍｌの間であり得る。
別の実施形態では、本発明は、とりわけブタサーコウイルス（ＰＣＶ）に対する、免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫若しくは免疫学的応答を惹起するための方法であって、ブタへの、シングルショット、単回投与又は単回用量（ｉ）バキュロウイルス系により発現されるＰＣＶ ＯＲＦ２組換えタンパク質の少なくとも２μｇ～約４００μｇ及び（ｉｉ）獣医学許容可能担体の、非経口又は皮下投与を含み、獣医学許容可能担体が、溶媒、分散媒、コーティング剤、安定化剤、希釈剤、保存薬、抗微生物剤、抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、細胞培養上清、安定化剤、ウイルス若しくは発現ベクター、免疫調節剤及び／又はこれらの任意の組合せを含む、方法を包含する。
有利な実施形態では、ＰＣＶワクチンは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）（例えば、ＷＯ２００６／０７２０６５を参照されたい）である。
ＷＯ２００６／０７２０６５及びＷＯ２００８／０７６９１５には、ＰＣＶワクチンの生成、その製剤及びその投与が記載されている。
有利な実施形態では、ワクチンは、ＰＣＶの抗原の約２μｇ～約４００μｇの投薬量を含む。例えば、ワクチンは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の約２μｇ～約４００μｇの投薬量を含む。
別の有利な実施形態では、ワクチンは、ＰＣＶの抗原の約４μｇ～約２００μｇの投薬量を含む。例えば、ワクチンは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の約４μｇ～約２００μｇの投薬量を含む。
さらに別の有利な実施形態では、ワクチンは、ＰＣＶの抗原の約１０μｇ～約１００μｇの投薬量を含む。例えば、ワクチンは、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２タンパク質の約１０μｇ～約１００μｇの投薬量を含む。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、ローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの１種又は複数種の抗原とを含み、ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、生菌ローソニア・イントラセルラリス、好ましくは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス又は改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスである。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、ローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含み、ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、生菌ローソニア・イントラセルラリス、好ましくは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス又は改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスである。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、約１０3～１０9細菌／Ｋｇ体重の、好ましくは約１０5～１０7細菌／Ｋｇ体重の、ローソニア・イントラセルラリスの抗原の投薬量を含み、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原を含み、ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、生菌ローソニア・イントラセルラリス、好ましくは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス又は改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスである。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス菌約１０5～約１０7のローソニア・イントラセルラリス菌の抗原の投薬量を有し、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原を含み、ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、生菌ローソニア・イントラセルラリス、好ましくは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス又は改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスである。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの１種又は複数種の抗原を含む。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの１種又は複数種の抗原とを含み、ＰＣＶは、ＰＣＶ１、ＰＣＶ２又はＰＣＶ３である。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの１種又は複数種の抗原を含み、ＰＣＶの抗原は、組換えポリペプチド、好ましくは、バキュロウイルス細胞に発現される組換えポリペプチドである。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの１種又は複数種の抗原とを含み、ＰＣＶの抗原は、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子により発現される組換えポリペプチド、好ましくは、バキュロウイルス細胞に発現されるＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子により発現される組換えポリペプチドである。
有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの１種又は複数種の抗原を含み、ＰＣＶの抗原は、ＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子により発現される組換えポリペプチド、好ましくは、バキュロウイルス細胞に発現されるＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子により発現される組換えポリペプチドである。
非常に有利な実施形態では、本発明によるワクチンは、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含む。
免疫化の又はワクチン接種の好ましい方法は、本発明による及び直ぐ上に記載のワクチンの全身投与に存する。全身投与方法は、本明細書に記載され、筋肉内及び皮内投与を含むが、これらに限定されない。
したがって、免疫化の又はワクチン接種の好ましい方法は、筋肉内経路による本発明によるワクチンの投与に存する。
一側面において、本発明のワクチンはＭ．ｈｙｏの抗原を含み得る。したがって、本発明のひとつの特徴では、Ｍ．ｈｙｏ．に対するブタの防御免疫応答を惹起するための免疫原性組成物が提供される。よりいっそう好ましくは、各用量中のＭ．ｈｙｏ．の量は、少なくとも１．２２の相対力価（ＲＰ）値を有し、１．２２の相対力価は、Ｍ．ｈｙｏ．抗原のそのような量の４０分の１（１／４０）の投与を受けるマウスの少なくとも９５％、好ましくは１００％が、処置後２１日以内に又は２１日目にＭ．ｈｙｏ．特異的抗体検出アッセイで検出可能な量の抗体を生じさせることを意味する。したがって、処置後２１日以内に又は２１日目にマウスの少なくとも９５％、好ましくは１００％において検出可能なＭ．ｈｙｏ．特異的抗体応答を誘導するために必要とされるＭ．ｈｙｏ．抗原の４０倍の量は、Ｍ．ｈｙｏ．感染に対する防御免疫応答を付与するのに、その感染の発生率を低下させるのに、及び／又はその感染に関連する臨床兆候の重症度を低下させる若しくはその臨床兆候を予防するのに十分な量である。言い換えると、上記のＭ．ｈｙｏ．抗原の量は、混合されて組合せワクチンとして投与されたときにＰＣＶ抗原へのいずれかの負の干渉を克服することができることが証明されている。一部の好ましい形態での組成物は、アジュバントをさらに含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）又は含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）。様々なアジュバントが本発明に関連して有用となり、当業者によって選択され得るが、カルボマー、よりいっそう好ましくは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（高分子量架橋ポリアクリル酸ポリマー）又はＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）が、特に好ましい。有利なことに、本発明の免疫原性組成物は、単回用量でブタに投与されたとき、Ｍ．ｈｙｏ．感染に対する防御免疫応答を付与し、その感染の発生率を低下させ、及び／又はその感染に関連する臨床兆候の重症度を低下させ、及び／又はその臨床兆候を予防する。そのような単回用量は、ブタに投与されたとき、少なくとも１００、より好ましくは少なくとも１１０、よりいっそう好ましくは少なくとも１２０、さらにいっそう好ましくは少なくとも１３０、よりいっそう好ましくは少なくとも１４０、さらにいっそう好ましくは少なくとも１５０、よりいっそう好ましくは少なくとも１６０、さらにいっそう好ましくは少なくとも１７０、よりいっそう好ましくは少なくとも１８０、及び最も好ましくは少なくとも１８４日の免疫継続期間を生じさせる。言い換えると、本発明の免疫原性組成物の１用量は、ブースター又は後続投与なしに、動物又は動物の群に、少なくとも１００日間（１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０日間など）、最も好ましくは少なくとも１８４日間、Ｍ．ｈｙｏ．による感染の発生率の低下又は感染の臨床兆候の重症度の低下をもたらす。抗体検出アッセイに関して、当業者は、適切な製品を特定すること及び利用することができるであろう。ＥＬＩＳＡアッセイ及び特にＩＤＥＸＸ Ｈｅｒｄｃｈｅｋ Ｍ．ｈｙｏ．Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ（商標）（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｍｅ．）が好ましい。特に、ＩＤＥＸＸ Ｈｅｒｄｃｈｅｋ Ｍ．ｈｙｏ．Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ（商標）（ＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、Ｍｅ．）は、本発明に感染して参照アッセイとして使用され得る。
本明細書で使用される場合、「防御免疫応答」は、Ｍ．ｈｙｏ．感染の発生率の低下又はその感染の臨床的、病理学的若しくは病理組織学的兆候の重症度の低下を指す。「防御免疫応答」は、抗原又はワクチンの免疫学的有効量により誘発され得る。
用語「Ｍ．ｈｙｏ．抗原」は、任意の組成物であって、動物、好ましくはブタ、に投与されたときにＭ．ｈｙｏ．感染に対する免疫応答を誘導、刺激又は増強することができる少なくとも１種の抗原を含む組成物を指す。好ましくは、前記Ｍ．ｈｙｏ．抗原は、全Ｍ．ｈｙｏ．バクテリン、好ましくは不活性化形態の全Ｍ．ｈｙｏ．バクテリン、生きている改変された若しくは弱毒化されたＭ．ｈｙｏ．菌、Ｍ．ｈｙｏ．の免疫原性アミノ酸配列を少なくとも含むキメラウイルス、又はＭ．ｈｙｏ．の免疫原性アミノ酸配列を少なくとも含む任意の他のポリペプチド若しくは成分である。好ましくは、Ｍ．ｈｙｏ．抗原は、不活性化Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンである。より好ましくは、Ｍ．ｈｙｏ．抗原は、Ｍ．ｈｙｏ．Ｊ株に由来する。最も好ましくは、Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンは、ＩＮＧＥＬＶＡＣ（登録商標）ＭＹＣＯＦＬＥＸワクチン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ Ｉｎｃ、Ｓｔ Ｊｏｓｅｐｈ、Ｍｏ．、ＵＳＡ）に含まれている又はＩＮＧＥＬＶＡＣ（登録商標）ＭＹＣＯＦＬＥＸである、不活性化Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンである。しかし、本発明に従って使用することができるＭ．ｈｙｏ．抗原を、以下のワクチン組成物に含まれているいずれかのものから選択することもできる：ＰＯＲＣＩＬＩＳ Ｍ．ＨＹＯ、ＭＹＣＯ ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ＢＰＭ、ＭＹＣＯ ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ＢＰＭＥ、ＭＹＣＯ ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ＭＥ、ＭＹＣＯ ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）Ｍ、ＭＹＣＯ ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ＯＮＣＥ、ＭＹＣＯ ＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ＭＥＨ（全て、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．、Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ、Ｄｅｌ．、ＵＳＡ）、ＳＴＥＬＬＡＭＵＮＥ ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ）、ＳＵＶＡＸＹＮ ＭＹＣＯＰＬＡＳＭＡ（商標）、ＳＵＶＡＸＹＮ Ｍ．ＨＹＯ（商標）、ＳＵＶＡＸＹＮ ＭＨ－ＯＮＥ（商標）（全て、Ｆｏｒｔ Ｄｏｄｇｅ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒｋ、Ｋａｎｓ．、ＵＳＡ（Ｗｙｅｔｈ）からのもの）。有利には、Ｍ．ｈｙｏ．上清及び／又はバクテリンの２ｍｌの用量が企図される。
利用可能なＭ．ｈｙｏ．ワクチンは、死滅した全細胞マイコプラズマ調製物（バクテリン）から作製される。したがって、「バクテリン」は、本明細書で使用される場合、好ましくは、死滅した全細胞の調製物である、細菌の全細胞調製物、特に、Ｍ．ｈｙｏ．の全細胞調製物を指す。ワクチン又は抗原が、「上清」であると本明細書に記載される場合、前記上清は、（死滅した）全細胞調製物の可溶性画分／部分であり得る。本発明は、Ｍ．ｈｙｏ．全細胞調製物の可溶性部分の使用を企図しているが、前記Ｍ．ｈｙｏ．調製物可溶性部分は（ｉ）ＩｇＧも（ｉｉ）免疫グロブリンに結合した抗原を含む免疫複合体も実質的に含まない（例えば、米国特許第１０，２０６，９９１号を参照されたい）。一部の実施形態では、Ｍ．ｈｙｏ．調製物の可溶性部分は、少なくとも１種のＭ．ｈｙｏ．タンパク質抗原を含む。他の実施形態では、Ｍ．ｈｙｏ．調製物の可溶性部分は、２種又は複数種のＭ．ｈｙｏ．タンパク質抗原を含む。一実施形態では、Ｍ．ｈｙｏ．上清画分は、以下のＭ．ｈｙｏ．特異的タンパク質抗原のうちの１つ又は複数を含む：分子量おおよそ４６ｋＤのＭ．ｈｙｏ．タンパク質（ｐ４６）、おおよそ６４ｋＤのＭ．ｈｙｏ．タンパク質（ｐ６４）及びおおよそ９７ｋＤのＭ．ｈｙｏ．タンパク質（ｐ９７）。別の実施形態では、上清画分は、少なくとも、ｐ４６、ｐ６４及びｐ９７ Ｍ．ｈｙｏ．タンパク質抗原を含む。或いは、おおよそ６４ｋＤのＭ．ｈｙｏ．タンパク質（ｐ６４）は本明細書では、Ｋｉｍら（Infect. Immun. 58(8):2637-2643 (1990)）により及び米国特許第５，７８８，９６２号に記載されている、Ｍ．ｈｙｏ．からのｐ６５表面抗原と称されることもある。任意のＭ．ｈｙｏ．株を、Ｍ．ｈｙｏ．調製物の可溶性部分を生産するための出発抗原として使用することができる。Ｍ．ｈｙｏ．の好適な株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）及びＮＲＲＬ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国農務省農業研究局、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌ．）などの寄託機関を含む、商業的又は学術的供給元から得ることができる。ＡＴＣＣは、単独で、次の６種の株を販売用リストに載せている：Ｍ．ｈｙｏ．ＡＴＣＣ ２５０９５、Ｍ．ｈｙｏ．ＡＴＣＣ ２５６１７、Ｍ．ｈｙｏ．ＡＴＣＣ ２５９３４、Ｍ．ｈｙｏ．ＡＴＣＣ ２７７１４、Ｍ．ｈｙｏ．ＡＴＣＣ ２７７１５、及びＭ．ｈｙｏ．ＡＴＣＣ ２５９３４Ｄ。本発明の実施形態における使用に好ましいＭ．ｈｙｏ．株は、米国特許商標庁により要求されるアクセシビリティールールに則って１９９０年５月３０日に寄託されたＰ－５７２２－３株、ＡＴＣＣ ＃５５０５２として特定される。疾患が広範囲に及ぶことを勘案して、豚においてマイコプラズマ肺炎を引き起こす既知の株に感染した豚からの肺分泌物又は組織からＭ．ｈｙｏを回収することによっても株を得ることができる。
注射のタイミングは自由度が高い。本明細書に記載の組成物を、３週齢という早期から、ブタがＭ．ｈｙｏ．への曝露の少なくとも２種間前にワクチン接種のために育成農家を離れるときまで、使用することができる。本発明によるワクチンは、皮内適用、気管内適用又は膣内適用をはじめとする任意の従来の手法で適用され得る。本発明によるワクチンはまた、全身投与によっても適用され得る。組成物は、好ましくは筋肉内又は皮内投与され得る。
ＷＯ２００９／１２６３５６、米国特許第８４４４９８９号、同第８８５２６１３号及び同第８９４０３０９号には、Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンの生成、その製剤及びその投与が記載されている。
有利な実施形態では、各用量中のＭ．ｈｙｏ．抗原の量は、少なくとも１．２２の相対力価（ＲＰ）値を有する。
別の有利な実施形態では、Ｍ．ｈｙｏ．バクテリンは、不活性化前に５ｌｏｇ10～８ｌｏｇ10の間の抗原量を有する。
有利な実施形態では、Ｍ．ｈｙｏ．ワクチンは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）である。したがって、有利な実施形態では、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＭ．ｈｙｏ．の抗原である。
免疫化の又はワクチン接種の好ましい方法は、筋肉内経路などの全身投与による、本発明によるワクチンの投与に存する。
一態様では、本発明のワクチンは、ＰＲＲＳＶの抗原を含む。したがって、本発明の一態様では、ＰＲＲＳＶに対するブタの防御免疫応答を惹起するための免疫原性組成物が提供される。ＰＲＲＳＶのウイルスエンベロープタンパク質は、一般に、ビリオン内のタンパク質の存在量に基づいて主要及び微量タンパク質にカテゴリー分けされる。主要ウイルスエンベロープタンパク質は、ｇｐ５（ＯＲＦ ５）及びＭ（ＯＲＦ ６）であり、二量体を形成する。微量エンベロープタンパク質は、ｇｐ２（ＯＲＦ２）、ｇｐ３（ＯＲＦ３）、ｇｐ４（ＯＲＦ４）及びＥ（ＯＲＦ２ｂ）並びに恐らく新たに同定されるウイルスタンパク質ｇｐ５ａ（ＯＲＦ ５ａ）である。活性抗原成分は、ＰＲＲＳＶウイルスからのＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６又はＯＲＦ７を含み得る。
組換えＰＲＲＳＶ抗原をベクター化ＰＲＲＳＶワクチンとして発現させる又は組成物中で発現させることができ、前記ベクター化ＰＲＲＳＶワクチン又は組成物は、ある特定のＰＲＲＳＶ抗原を保持及び発現する１種又は複数種の組換えアデノウイルスベクターを含み、薬学的に又は獣医学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤又はビヒクルを含んでいてもよい。有利には、ベクターはアデノウイルスベクターであるが、バキュロウイルスなどの他のベクターも企図される。
ＰＲＲＳＶは、いずれの株であってもよい。本明細書で開示される新規の本発明の組成物及び方法は、全ての公知の及びまだ発見されていないＰＲＲＳＶ株に普遍的に適用可能であるからである。ＰＲＲＳＶウイルスは、約５０％の配列相同性を共有する、「ＵＳ」及び「ＥＵ」型と呼ばれる２つの遺伝子型として存在する（Dea S et al. (2000). Arch Virol 145:659-88）。これら２つの遺伝子型をそれらの免疫学的特性により区別することもできる。様々な分離株に関する殆どの配列決定情報は、構造タンパク質、すなわち、ウイルスゲノムのわずか約４％に相当するエンベロープタンパク質ＧＰ５、に基づくものであり、その上、非構造タンパク質（ｎｓｐ）に関しては極わずかなことしか分かっていない。ＰＲＲＳＶの単離及びワクチンの製造は、多数の公表文献（ＷＯ９２／２１３７５、ＷＯ９３／０６２１１、ＷＯ９３／０３７６０、ＷＯ９３／０７８９８、ＷＯ９６／３６３５６、欧州特許第０ ６７６ ４６７号、欧州特許第０ ７３２ ３４０号、欧州特許第０ ８３５ ９３０号、米国特許第１０，０３９，８２１号）に記載されている。ＰＲＲＳＶ抗原は、ＰＲＲＳＶ微量タンパク質（例えば、ｇｐ２、ｇｐ３、ｇｐ４、ｇｐ５ａ、ｇｐ５又はＥ）を任意の組合せで含み、追加のＰＲＲＳＶ主要タンパク質（例えば、ｇｐ５又はＭ）を含んでいてもよい。例えば、ＰＲＳＳＶ抗原をウイルス様粒子（ＶＬＰ）の表面に提示させることができよう。他の実施形態では、抗原の可溶性バージョンを宿主動物に投与することができよう［この場合、タンパク質の互いとの、又は加えて、ＶＳＶ－Ｇの成分、若しくは他のウイルスタンパク質との、オリゴマー化（三量体化を含む）、或いは任意のオリゴマー化（三量体化モチーフを含む）（例えば、細菌ＧＣＮ４のモチーフなど）］。さらに、Ｉ型ウイルス表面糖タンパク質のＴＭ／ＣＴドメインは、ＶＳＶ－Ｇの対応するドメインと同じ目的を達成すること、したがって、それと交換可能であることが、想定される。
一部の実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンは組換えワクチンである。この事例では、１種又は複数種のベクターは、ＰＲＲＳＶ Ｅ抗原、ポリペプチド、細胞外ドメイン若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列；又はｇｐ２、ｇｐ３、ｇｐ４、ｇｐ５ａ、ｇｐ５又はＭ抗原の既存の細胞局在配列が異種遺伝子の細胞表面発現決定配列で置き換えられている、改変ＰＲＲＳＶ ｇｐ２、ｇｐ３、ｇｐ４、ｇｐ５ａ、ｇｐ５若しくはＭ抗原、ポリペプチド、細胞外ドメイン若しくはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列、どちらかを含む。一部の実施形態では、１種又は複数種のベクターは、再標的化されたＰＲＲＳＶ微量タンパク質を発現する第１のベクター、及び再標的化されたＰＲＲＳＶ主要タンパク質を発現する第２のベクターという、２種のベクターの混合物を含む。
本発明に関連して、方法は、ワクチン及び他の組成物の生産における使用のための生ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の生産に使用され得る。典型的な生産方法では、ＰＲＲＳＶ感染に対して許容する細胞株を用いてウイルスを増殖させる。しかし、そのような一般的な方法では、細胞株をＰＲＲＳＶによる感染前に集密又はほぼ集密に増殖させる。
有利な方法では、細胞株をＰＲＲＳＶによる感染前に植えて増殖させる必要がなく、むしろＰＲＲＳＶ及び細胞株を並行して細胞培養プロセスに添加することができる。したがって、前記方法は、ウイルスが商業規模で大量生産されることになる場合、時間、コスト及び材料の節約の大きな利益をもたらす。商業規模という用語は、１０Ｌを超える細胞培養物体積を指す。例えば、商業規模は、生ＰＲＲＳＶの１０Ｌ～３０００Ｌの範囲の生産規模を指す。より特異的な実施形態では、体積は、３０Ｌ～３００Ｌである。
本明細書に記載される方法は、ＡＴＣＣ ＶＲ ２３３２、ＶＲ ２３８５、ＶＲ ２３８６、ＶＲ ２４２９、ＶＲ ２４７４及びＶＲ ２４０２；ＣＮＣＭ Ｉ－１１０２、ＣＮＣＭ Ｉ－１１４０、ＣＮＣＭ Ｉ－１３８７、ＣＮＣＭ Ｉ－１３８８、又はＥＣＡＣＣ Ｖ９３０７０１０８として寄託されたＰＲＲＳＶ株を含むがこれらに限定されない、任意のＰＲＲＳＶ株の生産に使用され得る。特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、ブタペスト条約の条項に従って寄託番号ＥＣＡＣＣ １１０１２５０１（親株）及びＥＣＡＣＣ １１０１２５０２（高継代弱毒化ＭＳＶ）でＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に各々２０１１年１月２５日に寄託されたＰＲＲＳＶ ９４８８１株、又は前述の株の一方の任意の子孫若しくは後代を、生産するために使用される。増殖させるウイルスは、それらの弱毒化形態の上述のウイルスのいずれかであり得る。或いは、ウイルスは、１種又は複数の豚疾患のさらなる抗原決定基をコードする１種又は複数種の核酸を含むように、遺伝的に改変され得る。
ＰＲＲＳＶによる感染に対して許容する多数の細胞株があることは、当業者には理解されるであろう。例示的な細胞は、ＭＡＲＣ－１４５細胞に由来するものなどのブタ肺胞マクロファージ細胞である。ＰＲＲＳＶに感染し得る他の細胞としては、ＭＡ－１０４細胞；ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＭＡ－１０４細胞又はＭＡＲＣ－１４５細胞以外のアフリカミドリザル腎細胞、例えば、ＶＥＲＯ細胞が挙げられ、これらにトランスフェクトされる。加えて、細胞は、培養での長期増殖に適応させた、豚動物からの初代細胞であり得る。特に好適な宿主動物は、シミアン細胞株ＭＡ－１０４、Ｖｅｒｏ細胞、又はブタ肺胞マクロファージである。ＰＲＲＳＶは、肺胞の肺マクロファージにおいて優先的に増殖する（Wensvoort et al., 1991）。サル腎細胞株ＭＡ－１０４からクローニングされたＣＬ２６２１及び他の細胞株（Benfield et al., 1992；Collins et al., 1992；Kim et al., 1993）などの少数の細胞株も、ウイルスに感染しやすく、本明細書に記載される大規模生産方法において使用され得る。
米国特許第９，９４４，９０２号の実施例１に示されている例示的な方法の中に、ＰＲＲＳＶ ９４８８１ ＭＬＶの生産のための現行プロセスが提供されている。この手順は、ＰＲＲＳＶ ９４８８１ ＭＬＶについて示されているが、この手順を、大規模生産が必要とされる任意のＰＲＲＳＶに容易に使用することができることは、当業者には理解されるであろう。
記載されている生産方法により生産されるウイルスは、本発明のワクチンにおける使用のためのＰＲＲＳＶ抗原、特にＭＬＶ ＰＲＲＳＶ、の生産に使用され得る。
前記方法に従って増殖させるウイルス株は、毒性ＰＲＲＳウイルス、弱毒化ＰＲＲＳウイルス、又は実際には、望ましい特性をそれらにさらに付与するように改変されたＰＲＲＳウイルスであり得る。これは、弱毒化表現型を拡大するための好適な宿主細胞における連続的増殖のような、古典的な増殖及び選択技法により達成され得る。或いは、これらの株は、好適な遺伝子操作技法によるこれらの株のゲノムの核酸配列の定方向変異により遺伝子改変され得る。ＰＲＲＳＶのゲノムは、完全に又は部分的に配列決定されており（Conzelmann et al., 1993；Meulenberg et al., 1993a, Murthaugh et al, 1995）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＯＲＦ １ａ及び１ｂ）に加えて、次の６種の構造タンパク質をコードする：ＧＰ２（ＯＲＦ２）、ＧＰ３（ＯＲＦ３）、ＧＰ４（ＯＲＦ４）及びＧＰ５（ＯＲＦ５）と称する４種のエンベロープ糖タンパク質、非グリコシル化膜タンパク質Ｍ（ＯＲＦ６）、並びにヌクレオカプシドタンパク質Ｎ（ＯＲＦ７）（Meulenberg et al. 1995, 1996；van Nieuwstadt et al., 1996）。ＰＲＲＳＶの欧州及び米国株の免疫学的特徴付け及びヌクレオチド配列決定によって、構造ウイルスタンパク質内に位置する、ＰＲＲＳＶ株内のわずかな抗原の違いが同定されている（Nelson et al., 1993；Wensvoort et al., 1992；Murtaugh et al., 1995）。
実際に、例示的なウイルスはＰＲＲＳＶ ９４８８１ウイルスである。弱毒化株は、本明細書に記載される方法を使用して増殖されるが、容易には、ウイルスは、キメラウイルスにされるＰＲＲＳＶ ９４８８１ウイルスであり、キメラウイルスにされる際、ＥＣＡＣＣ受託番号１１０１２５０２で寄託されたＰＲＲＳＶ ９４８８８１ウイルスの骨格又は実際にはＥＣＡＣＣ受託番号１１０１２５０１で寄託された親株が、ＯＲＦ １ａ、ＯＲＦ １ｂ、ＯＲＦ ２、ＯＲＦ ３、ＯＲＦ ４、ＯＲＦ ５、ＯＲＦ ６若しくはＯＲＦ ７のうちの１つ若しくは複数についての内在性配列を異なるＰＲＲＳウイルス株の対応するＯＲＦで置き換えるように改変される。例えば、異なるＰＲＲＳウイルス株は、異なる欧州型株、例えば、レリスタットウイルス株（Ｌｅｌｙｓｔａｄ Ａｇｅｎｔ（ＣＤＩ－ＮＬ－２．９１）、又は他の株、例えば、受託番号ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０４、ＣＮＣＭ受託番号Ｉ－１１４０、ＣＮＣＭ受託番号Ｉ－１３８７、ＣＮＣＭ受託番号Ｉ－１３８８、ＡＴＣＣ ＶＲ ２３３２、ＶＲ ２３８５、ＶＲ ２３８６、ＶＲ ２４２９、ＶＲ ２４７４、及びＶＲ ２４０２；ＣＮＣＭ Ｉ－１１０２、ＣＮＣＭ Ｉ－１１４０、ＣＮＣＭ Ｉ－１３８７、ＣＮＣＭ Ｉ－１３８８、若しくはＥＣＡＣＣ Ｖ９３０７０１０８で寄託されたものであり得、或いは実際には、米国型株、例えば、北米型ＰＲＲＳウイルス、ｐＴ７Ｐ１２９Ａ；ＡＴＣＣ寄託ＶＲ－２３３２、ＡＴＣＣ寄託ＶＲ－２３６８；ＡＴＣＣ ＶＲ－２４９５；ＡＴＣＣ ＶＲ ２３８５、ＡＴＣＣ ＶＲ ２３８６、ＡＴＣＣ ＶＲ ２４２９、ＡＴＣＣ ＶＲ ２４７４、及びＡＴＣＣ ＶＲ ２４０２であり得る。
改変された配列を調製するための組換え技法は当業者に周知であり、通常は、ウイルスゲノムの全長相補的ＤＮＡコピー（感染性クローン）の構築を利用し、そのとき、このコピーは、ＤＮＡ組換え及び操作方法（部位特異的変異誘発などのような）により改変され得る。このように、例えば、ウイルスタンパク質の抗原部位又は酵素的特性が改変され得る。欧州及び北米遺伝子型のＰＲＲＳウイルスの感染性クローンは、文献で報告されており、本発明の方法を使用してそれらを増殖させることができる。
好ましくは本発明によるワクチンは、好適な担体中で生きているこれらの株の１種又は複数種を含む、改変された生ＰＲＲＳＶを含むが、不活性化されたウイルスを使用して死菌ワクチン（ＫＶ）を調製することもできる。ＭＬＶは、通常は、１用量あたり１０1～１０7ウイルス粒子、好ましくは、１用量あたり１０3～１０5粒子、より好ましくは、１用量あたり１０4～１０5粒子（４．０～５．０ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50）の投与を可能にするように製剤化される。本発明のワクチンは、１用量あたり約１０4～約１０7ウイルス粒子のＰＲＲＳＶの抗原の投薬量を有し得る。ＫＶは、１用量あたり約１０3～約１０10ウイルス粒子の不活性化前力価に基づいて製剤化され得る。ワクチンは、薬学的に許容される担体、例えば、生理食塩液を含み得る。ワクチンは、アジュバントを含むこともあり、又は含まないこともある。好適なアジュバントの例は、商標名Ｄｉｌｕｖａｃ Ｆｏｒｔｅ（登録商標）で入手することができるアルファ－トコフェロール酢酸エステルである。或いは、例えば、アルミニウムベースのアジュバントが使用され得る。
ブタを口鼻腔経路によってＰＲＲＳＶに感染させることができる。肺内のウイルスは、肺の肺胞マクロファージに取り込まれ、これらの細胞のＰＲＲＳＶウイルス複製は、９時間以内に完了する。ＰＲＲＳＶは、肺から１２時間以内に肺リンパ節へ、そして３日以内に末梢リンパ節、骨髄及び脾臓へと移動する。これらの部位では、少数の細胞しかウイルス抗原について陽性染色されない。ウイルスは、少なくとも２１日の間、多くの場合、それより長く血液中に存在する。７日後、ＰＲＲＳＶに対する抗体が血液中に見られる。ＰＲＲＳ感染ブタにおけるウイルスと抗体の組み合わせられた存在は、抗体の存在にもかかわらず、ウイルス感染が低レベルではあるが長期間持続し得ることを示す。少なくとも７週間の間、肺内の肺胞細胞集団は、正常なＳＰＦ肺とは異なる。
ワクチンは、注射用の溶液を得るために溶媒で再構成されることになる、生ウイルスの凍結乾燥調製物の形態で提供され得る。したがって、記載される方法の回収ステップの後、ウイルスは、併せられ、凍結乾燥され得る。溶媒は、例えば、水、生理食塩水、若しくは緩衝液、又はアジュバント添加溶媒であり得る。溶媒は、アジュバント、例えば、アルファ－トコフェロール酢酸エステルを含有し得る。次いで、再構成されたワクチンがブタに、例えば、首に筋肉内又は皮内注射として注射され得る。筋肉内注射の場合、体積２ｍｌが適用され得、筋肉内注射の場合、典型的には０．２ｍｌである。したがって、さらなる態様では、本発明は、ウイルスの凍結乾燥組成物と再構成用の溶媒とを別々の容器に含むワクチン製品であって、使用説明書を含むパンフレット又はラベルをさらに有していてもよい、ワクチン製品に関する。
上記の方法により生産されるウイルスから調製されるワクチンは、上述の株の１種又は複数種を含み得るばかりでなく、ＰＲＲＳに対して又はローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ及び／若しくはＭ．ｈｙｏ．などの他のブタウイルス性若しくは細菌性疾患に対して有効である成分もさらに含み得る。したがって、本発明は、記載のワクチンであって、ＰＲＲＳではないブタ疾患に対する少なくとも１種のさらなる抗原活性を有することを特徴するワクチンに、さらに関する。加えて、ワクチンは、ある特定の薬学的許容されるにアジュバント又は獣医学許容可能アジュバントを含み得る。１つのそのようなアジュバントは、アルファ－トコフェロールである。したがって、新たなワクチン組成物、特に、ＰＲＲＳＶ ９４８８１を含むＰＲＲＳウイルスワクチンは、アジュバントの添加によってさらに改善され得る。そのような改善は、アジュバントとワクチンの組合せの投与によって単独でのワクチンの投与と比較して良好な臨床応答／アウトカムが見られるように、ワクチンの有効性を増強するアジュバントと組み合わせてワクチンを調製することを含む。例えば、本発明のワクチン組成物は、ＰＲＲＳＶ ９４８８１ウイルスワクチンと、ＭＣＰ－１、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｎｍｕｓ）画分、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）及びこれらの組合せから選択されるアジュバントとを含み得る。一部の実施形態では、組換えサブユニットワクチンであり得るか又は代替的に弱毒化生ウイルスワクチンであり得るＰＲＲＳＶ ９４８８１ウイルスワクチンを含む、ウイルスワクチン。存在する例示的な生ワクチンは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶであり、ＰＲＲＳＶ ９４８８１は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶと同様の方法で製剤化され得る。
上記のものに加えて、ワクチン組成物は、他の構成要素がＭＣＰ－１、ヘモフィルス・ソムナス画分、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）又は基礎ウイルスワクチンのアジュバント特性に干渉しないのであれば、他の構成要素を含有してもよい。そのような他の構成要素としては、例えば、結合剤、着色剤、乾燥剤、防腐剤、湿潤剤、安定剤、賦形剤、接着剤、可塑剤、粘着付与剤、増粘剤、パッチ材料、軟膏基剤、ケラチン除去剤、塩基性物質、吸収促進剤、脂肪酸、脂肪酸エステル、高級アルコール、界面活性剤、水、及び緩衝剤が挙げられる。好ましい他の構成要素としては、緩衝剤、軟膏基剤、脂肪酸、防腐剤、塩基性物質又は界面活性剤が挙げられる。
本発明において使用されるアジュバントの内容又は量は様々であり得、例えば、使用されるＰＲＲＳウイルスワクチンの特性、及び剤形を考慮することにより決定され得る。
本発明のワクチン組成物を、製剤化の分野において公知の任意の方法によって、例えば、液体調製物、懸濁液、軟膏、粉末、ローション、Ｗ／Ｏエマルジョン、Ｏ／Ｗエマルジョン、エマルジョン、クリーム、パップ、パッチ及びゲルに製剤化することができ、好ましくは、本発明のワクチン組成物は、薬剤として使用される。したがって、本発明の別の態様によると、上記ワクチン組成物を含む医薬組成物が提供される。本発明によるワクチン組成物は、経皮投与されたとき、抗体産生を有意に誘導することができる。したがって、別の好ましい実施態様では、本発明のワクチン組成物は経皮調製物として提供され得る。
アジュバント及びＰＲＲＳウイルスワクチンが生物に投与されると、動物の臨床アウトカムが向上される。当業者は、アジュバントの有効量及びＰＲＲＳウイルスワクチンの免疫学的有効量を、例えば、抗原性物質の種類及び特性、生物の種、年齢、体重、疾患の重症度、疾患の種類、投与回数並びに投与方法を考慮することにより、そしてさらに生物体内で抗原性物質に対して産生される抗体の量を指標として使用して、適切に決定することができる。
ＰＲＲＳウイルスワクチン、アジュバント又はそれらの組合せは、生物に、例えば、患者の状態及び疾患の特性に依存して選択される任意の好適な方法により投与され得る。そのような方法の例としては、腹腔内投与、経皮投与（例えば、皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、及びパッチ適用）、鼻腔内投与、経口投与、粘膜投与（例えば、直腸投与、膣内投与、及び角膜投与）が挙げられる。これらの中で、筋肉内投与が好ましい。
ＰＲＲＳＶ ＭＬＶの例示的な治療用量は、約２ミリリットル（２ｍＬ）である。投薬量が、個々の対象の品種、サイズ及び他の物理的因子、並びに具体的なＰＲＲＳＶ ＭＬＶ製剤及び投与経路に基づいて変わり得ることは、当業者には分かるであろう。好ましくは、ＰＲＲＳＶ ＭＬＶは単回用量で投与されるが、追加の用量が有用であることもある。この場合もやはり、投薬量及び投与回数が、対象ブタの年齢及び健康状態、並びに業界に共通の他の考慮事項、及びＰＲＲＳＶ ＭＬＶが投与される具体的な条件による影響を受けることは、本発明を通じて当業者には分かるであろう。
ある特定の他の実施態様では、ワクチンは、２種又はそれより多くのＰＲＲＳウイルスを含む多価ワクチンであって、ＰＲＲＳウイルスの少なくとも１種がＥＣＡＣＣ受託番号１１０１２５０２で寄託された弱毒化９４８８１ウイルスである、多価ワクチンであり得る。他のＰＲＲＳウイルスは、受託番号で寄託されたＰＲＲＳＶ株レリスタットウイルス株（Ｌｅｌｙｓｔａｄ Ａｇｅｎｔ（ＣＤＩ－ＮＬ－２．９１）、又は他の株、例えば、受託番号ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０４、ＣＮＣＭ受託番号Ｉ－１１４０、ＣＮＣＭ受託番号Ｉ－１３８７、ＣＮＣＭ受託番号Ｉ－１３８８、ＡＴＣＣ ＶＲ ２３３２、ＶＲ ２３８５、ＶＲ ２３８６、ＶＲ ２４２９、ＶＲ ２４７４、及びＶＲ ２４０２；ＣＮＣＭ Ｉ－１１０２、ＣＮＣＭ Ｉ－１１４０、ＣＮＣＭ Ｉ－１３８７、ＣＮＣＭ Ｉ－１３８８、若しくはＥＣＡＣＣ Ｖ９３０７０１０８で寄託されたものからなる群から選択される１種又は複数種であり得、或いは実際には、米国型株、例えば、北米型ＰＲＲＳウイルス、ｐＴ７Ｐ１２９Ａ；ＡＴＣＣ寄託ＶＲ－２３３２、ＡＴＣＣ寄託ＶＲ－２３６８；ＡＴＣＣ ＶＲ－２４９５； ＡＴＣＣ ＶＲ ２３８５、ＡＴＣＣ ＶＲ ２３８６、ＡＴＣＣ ＶＲ ２４２９、ＡＴＣＣ ＶＲ ２４７４、及びＡＴＣＣ ＶＲ ２４０２であり得る。
ＰＲＲＳウイルスに基づくワクチンは、仔ブタと雌ブタの両方にワクチン接種するために使用され得る。本発明の一態様では、特定の用量投与レジメンは、ブタの年齢、及び投与に選択される抗原に基づいて選択される。これにより、ＰＲＲＳＶ感染（野生型曝露及びワクチン接種の両方から）は高齢動物におけるほうがはるかに速やかに除去されるという本発明者らの発見に基づいて、あらゆる年齢のブタに最も効果の高い用量を施すことが可能になることになる。したがって、いくつかの点で、高齢動物のワクチン接種は好ましいが、３週齢及びそれより若年のブタを含む若年のブタのワクチン接種は能動免疫を誘導するのに役立ち、さらに非常に有益である。動物の年齢は、ＰＲＲＳを制御する上で重要な因子であり得、ワクチン接種及び有効な免疫反応の発生に影響を与える因子であり得る。それ故、年齢、疾患管理、動物飼育管理、自然及び能動免疫は重要であり、制御戦略の中でこれらを考慮する必要がある。
ＰＲＲＳＶワクチンを任意の従来のやり方で投与することができ、一部の好ましい方法では、投与は経鼻投与である。投与されたＰＲＲＳＶワクチンは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＰＲＲＳ（登録商標）と同様に、単回投与後にＰＲＲＳＶ感染を処置するその利点又は感染の重症度若しくは発生率を低下させるその利点を提供することが好ましい。しかし、他の抗原又は混合若しくは多価ワクチンが選択された場合には、それらが、初回投与後の１又は複数回のブースター接種を含み得るその従来のやり方で投与され得ることは、理解されるはずである。当業者は、選択されるＰＲＲＳＶワクチン、及び抗原が投与されることになる動物の年齢範囲に基づいて、適切な投薬レベルを決定することができるであろう。
有利な実施形態では、ＰＲＲＳＶワクチンは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＰＲＲＳ（登録商標）ＭＬＶである。したがって、有利な実施形態では、ＰＲＲＳＶの抗原は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＭＬＶに含まれているＰＲＲＳＶの抗原である。免疫化の又はワクチン接種の好ましい方法は、筋肉内経路などの全身投与による、本発明によるワクチンの投与に存する。
特に有利な実施形態では、ＰＣＶの抗原、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原、及びＰＲＲＳＶの抗原は、３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原、Ｍ．ｈｙｏ．の抗原、及びＰＲＲＳＶの抗原である。
特に有利な実施形態では、ローソニア・イントラセルラリスの抗原は、凍結乾燥され、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンに溶解されている。別の特に有利な実施形態では、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原は、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンに溶解されている。さらにいっそう特に有利な実施形態では、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）に溶解されている。ワクチンの体積は２ｍｌであり得る。
本発明は、１種又は複数種の抗微生物剤をさらに含み得るワクチンをさらに企図している。抗微生物剤としては、チアムリン及び／又はクロルテトラサイクリンが挙げられるが、これらに限定されない。この事例では、チアムリンの投薬量は、約３５ｇ／トン又は約３５ｐｐｍであり得、クロルテトラサイクリンの投薬量は、約４００ｇ／トン又は約４００ｐｐｍであり得る。
本発明の組合せワクチンは、有利には筋肉内投与されるが、経口投与も企図される。
本発明は、豚において疾患を引き起こす別の微生物との組合せも包含する。好ましくは、豚において疾患を引き起こす他の微生物は、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）；アデノウイルス；アルファウイルス、例えば、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス；気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）；ブラキスピラ属種（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、好ましくは、Ｂ．ヒオディセンテリア（Ｂ．ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）；Ｂ．ピロシコリ（Ｂ．ｐｉｏｓｉｃｏｌｉ）、ブタ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ）、好ましくは、次亜種１、２及び３；豚コレラウイルス（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）；クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、好ましくは、Ｃｌ．ディフィシル（Ｃｌ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）Ａ、Ｂ及びＣ型、ノビイ菌（Ｃｌ．ｎｏｖｙｉ）、Ｃｌ．セプティカム（Ｃｌ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ）、破傷風菌（Ｃｌ．ｔｅｔａｎｉ）；コロナウイルス、好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス；エペリスロゾーノシス・スイス（Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎｏｓｉｓ ｓｕｉｓ）；ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；ヘモフィラス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、好ましくは亜型１、７及び１４；血球凝集性脳脊髄炎ウイルス；日本脳炎ウイルス；レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、好ましくは、レプトスピラ・オーストラリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、レプトスピラ・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリッポチフォーサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、黄疸出血性レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａｅ）、及びレプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・タラソビ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｔａｒａｓｓｏｖｉ）；マイコバクテリウム属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．）、好ましくは、Ｍ．アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）及びＭ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）；パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）；ブタサイトメガロウイルス；ブタパルボウイルス；仮性狂犬病ウイルス；ロタウイルス；サルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）、好ましくは、Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及びブタコレラ菌（Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）；スタフィロコッカス・フィカス（Ｓｔａｐｈ．ｈｙｉｃｕｓ）；ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）、好ましくは、連鎖球菌属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、好ましくは、ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐ．ｓｕｉｓ）；豚ヘルペスウイルス；豚インフルエンザウイルス；豚ポックスウイルス；水疱性口内炎ウイルス；豚水疱疹ウイルス；レプトスピラ・ハージョ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｈａｒｄｊｏ）並びに／又はマイコプラズマ・ハイオシノビアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ）からなる群から選択される。
本発明の免疫原性調製物はまた、異なる又は同一である少なくとも１種のブタ病原体に対する少なくとも１種の従来のワクチン（弱毒化生、不活性化、若しくはサブユニット）又は組換えワクチン（ウイルスベクター）と、組み合わせることができる。本発明は、特に、アジュバントを含有する従来のワクチン（弱毒化生、不活性化、他はサブユニット）との組合せを提供する。不活性化又はサブユニットワクチンについては、特に、単独でのアルミナゲル若しくはアジュバントとしてのサポニンと混合されたアルミナゲルを含有するもの、又は水中油型エマルジョンの形態の製剤化されたものが挙げられる。
加えて、組成物は、１種又は複数種の獣医学許容可能担体を含み得る。本明細書で使用される、「獣医学許容可能担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存薬、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸着遅延剤などを含む。好ましい実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバント、好ましくはＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）、及び生理食塩水と混合される、これにより提供されるような、好ましくは上記の濃度で提供される、ＰＣＶ３ ＯＲＦ２タンパク質又はＰＣＶ２ ＯＲＦ２を含む。
本明細書で使用される組成物が、注射用の生理的に許容される無菌溶液を含み得ることは、当業者には理解されるであろう。非経口注射又は注入にすぐに使用可能な溶液を調製するための、例えば、食塩水又は対応する血漿タンパク質溶液などの、等張性水溶液は、容易に入手可能である。加えて、本開示の免疫原性及びワクチン組成物は、希釈剤、等張剤、安定剤、又はアジュバントを含み得る。希釈剤としては、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを挙げることができる。等張剤としては、数ある中でも特に、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを挙げることができる。安定剤としては、数ある中でも特に、アルブミン、及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
「アジュバント」は、本明細書で使用される場合、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ－２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）、ＧＰＩ－０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａ．）、油中水型エマルション、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィン油（欧州薬局方型）；イソプレン系の油、例えば、アルケンの、特にイソブテン又はデセンの、オリゴマー化の結果として生じるスクアラン又はスクアレン油；酸の又は直鎖アルキル基を含有するアルコールの又はアルコールのエステル、より詳細には、植物油、オレイン酸エチル、ジ（カプリル酸／カプリン酸）プロピレングリコール、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル又はジオレイン酸プロピレングリコール；分岐脂肪酸又はアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づき得る。油は、エマルジョンを形成するために乳化剤と組み合わせて使用される。乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤、特に、ソルビタンのエステル、マンニットのエステル（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、及びオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステルであって、エトキシ化されていてもよいエステル、並びにポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特に、プルロニック（Pluronic)製品、特に、Ｌ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, pp 51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997) を参照されたい。
例えば、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、及びこの同じ本の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９を使用することが可能である。
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、並びに無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、架橋されている、特に、糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されている、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語によって知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、米国特許第２，９０９，４６２号も参照することができ、この参考特許文献には、少なくとも３個の、好ましくは多くとも８個のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物で架橋されている、そのようなアクリルポリマーであって、少なくとも３個の前記ヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって置き換えられている、アクリルポリマーが、記載されている。好ましい基は、２～４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル、アリル及び他のエチレン性不飽和基である。前記不飽和基は、これら自体が他の置換基、例えばメチル、を含有し得る。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の名で販売されている製品（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が、特に適切である。それらは、アリルスクロースで又はアリルペンタエリトリトールで架橋されている。それらの中でも特に、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７４Ｐ、９４１Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを挙げることができる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の使用、特に、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用が最も好ましく、この使用は、好ましくは、１用量あたり５００μｇ～約５ｍｇでの使用であり、１用量あたり約７５０μｇ～約２．５ｍｇの量での使用は、よりいっそう好ましく、１用量あたり約１ｍｇの量での使用が、最も好ましい。特に、最終組成物の用量はＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）又はＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１を、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）約７５０μｇ～約２．５ｍｇの範囲で含み得る。例えば、一部の実施形態では、最終組成物の用量は１ｍｇのＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１を含み得る。
さらなる好適なアジュバントとしては、数ある中でも特に、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ、Ｇａ．）、ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）、モノホスホリルリピッドＡ、アブリジン脂質－アミンアジュバント、大腸菌からの易熱性エンテロトキシン（組換え又は非組換え）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、又はムラミルジペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
言い換えると、本発明のワクチンは、１種又は複数種のアジュバントを含み得る。アジュバントの非限定的な例は本明細書の至る所で提供される。
さらに、本発明のワクチンは、次のうちの１種又は複数種をアジュバントとして含み得る：アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー；架橋されているアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されているアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；カルボマー；少なくとも３個、多くとも８個のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物で架橋さているアクリルポリマーであって、少なくとも３個の前記ヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって置き換えられていてもよく、又は置き換えられており、前記基が、２～４個の炭素原子を含有し、例えば、ビニル、アリル及び他のエチレン性不飽和基であり、前記不飽和基自体が他の置換基、例えばメチル、を含有し得る、アクリルポリマー；カルボポール（登録商標）；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９７４Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９３４Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９７１Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９８０；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）９４１Ｐ；ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；サポニン；Ｑｕｉｌ Ａ；ＱＳ－２１；ＧＰＩ－０１００；油中水型エマルジョン；水中油型エマルジョン；水中油中水型エマルジョン；軽質流動パラフィン油に基づくエマルジョン又は欧州薬局方型アジュバント；イソプレン系の油；スクアラン；アルケン又はイソブテン又はデセンのオリゴマー化の結果として生じるスクアレン油；酸の又は直鎖アルキル基を含有するアルコールのエステル；植物油；オレイン酸エチル；ジ（カプリル酸／カプリン酸）プロピレングリコール；トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル；ジオレイン酸プロピレングリコール；分岐脂肪酸又はアルコールのエステル：イソステアリン酸エステル；非イオン性界面活性剤；ソルビタンの又はマンニットの又はグリコールの又はポリグリセロールの又はプロピレングリコールの又はオレイン酸若しくはイソステアリン酸の又はリシノール酸の又はヒドロキシステアリン酸のエステルであって、エトキシ化されていてもよいエステル、無水マンニトールオレイン酸エステル；ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、プルロニック（Pluronic)製品、ＲＩＢＩアジュバント系；ブロックコポリマー；ＳＡＦ－Ｍ；モノホスホリルリピッドＡ；アブリジン脂質－アミンアジュバント；大腸菌からの易熱性エンテロトキシン（組換え又は非組換え）；コレラ毒素；ＩＭＳ １３１４、又はムラミルジペプチド。
好ましい且つ有利な実施形態では、本発明のワクチンは１種又は複数種のカルボマーを含む。
好ましい且つ有利な実施形態では、本発明のワクチンは、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）及び／又はＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）を含む。カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標）の具体的な例は、本明細書中で提供される。さらなる実施形態では、本発明のワクチンは薬学的に又は獣医学的に許容される担体を含み得る。
好ましくは、アジュバントは１用量当たり約１００μｇ～１０ｍｇの量で添加される。よりいっそう好ましくは、アジュバントは１用量当たり約１００μｇ～１０ｍｇの量で添加される。よりいっそう好ましくは、アジュバントは１用量当たり約５００μｇ～５ｍｇの量で添加される。よりいっそう好ましくは、アジュバントは１用量当たり約７５０μｇ～２．５ｍｇの量で添加される。最も好ましくは、アジュバントは１用量当たり約１ｍｇの量で添加される。
加えて、本組成物は、１種又は複数種の薬学的許容可能担体を含み得る。本明細書で使用される場合、「薬学的許容可能担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、安定化剤、希釈剤、保存薬、抗菌及び抗真菌剤、等張剤、並びに吸着遅延剤などを含む。
さらなる態様によると、この免疫原性組成物は、さらに、薬学的許容可能塩、好ましくはリン酸塩を、生理的に許容される濃度で含む。好ましくは前記免疫原性組成物のｐＨは、生理的ｐＨに調整され、生理的ｐＨは、約６．５～７．５の間を意味する。
投与レジメンは、豚飼育管理の経済性を改善するために使用され得る。例えば、ワクチンなどの免疫原性組成物は、雌ブタ、仔ブタ、又は両方を保護するための努力の一環として、雌ブタ及び／又は仔ブタに投与され得る。
本発明のワクチンは、受精した未経産ブタ及び雌ブタを１１４日の妊娠期間中の全又は２又は少なくとも１三半期にローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．又はＰＲＲＳＶによるチャレンジを実施したときに保護することができることを、さらに主張する。
本発明のワクチンは、１１４日の妊娠期間中の全又は２又は少なくとも１三半期にローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．又はＰＲＲＳＶによるチャレンジを実施したときのワクチン接種を施したワクチン接種済みの未経産ブタ及び雌ブタにおけるミイラ化、死産及び胎仔の発生率を有意に低下させることができることも、さらに主張する。
投薬レジメンは、若い雌ブタ（すなわち、５月齢以下）に、繁殖の前に、本明細書に記載の免疫原性組成物の少なくとも１用量をワクチンとして接種することを含み得る。本明細書に記載の免疫原性組成物の用量は、１ｍＬ用量として繁殖の前に筋肉内投与され得る。一部の実施形態では、ワクチンの１又は複数用量が雌ブタに施され得る。例えば、初回ワクチンが施され、続いてブースターワクチンが２１日後且つ繁殖の前に施され得る。一部の実施形態では、雌ブタは、ブースターワクチン接種後１４日～２１日の範囲内に繁殖され得る。この時間枠が雌ブタに免疫応答を開始させる。このような投薬レジメンの利用は、分娩時のミイラ化の数を低減及び／又は抑制し得る。
さらに、ローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．又はＰＲＲＳＶを含む免疫原性組成物を投与することを含む投薬レジメンの使用は、ローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．又はＰＲＲＳＶに感染したブタにおけるリンパ節腫大、リンパ球枯渇及び／又は多核／巨大組織球を、軽減、減少及び／又抑制し得る。有利には、用量は、約２ｍｌである。サーコウイルスへのブタの免疫応答を誘導することを可能にする免疫化の方法も記載される。特に、ブタにおいて有効であるワクチン接種の方法が記載される。これらの免疫化及びワクチン接種方法は、上記の調製物のうちの１種又は一価若しくは多価ワクチンのうちの１種の投与を含む。免疫化及びワクチン接種のこれらの方法は、これらの調製物又はワクチンの１又は複数の連続用量の投与を含む。調製物及びワクチンは、この免疫化方法又はワクチン接種方法に関連して、先行技術においてポリヌクレオチドワクチン接種のために提案された様々な投与経路により、特に、筋肉内及び皮内経路で、並びに公知の投与技法、特に、針を有する注射器での注射によって、液体ジェット（Furth et al. Analytical Bioch., 1992, 205: 365-368）により、又はＤＮＡで被覆された金粒子の投射（Tang et al. Nature, 1992, 356: 152-154）により、投与され得る。
この方法は、成体のブタへの投与を可能にするばかりでなく、若年のブタへの、及び妊娠中の雌のブタへの投与も可能にし、後者の妊娠中の雌のブタへの投与場合、特に、新生仔への能動免疫（母由来抗体）の付与を可能にする。好ましくは、雌のブタに、繁殖の前に、及び／又は受胎の前、及び／又は妊娠中に接種が施される。有利には、少なくとも１回の接種が受胎の前に行われ、続いて、接種が、妊娠中に、例えば、ほぼ妊娠中期に（妊娠約６～８週に）及び／又は妊娠末期に（妊娠約１１～１３週に）行われることが好ましい。したがって、有利なレジメンは、受胎前の接種、及び妊娠中のブースター接種である。その後、各受胎前に、並びに／又は妊娠中のほぼ妊娠中期及び／若しくは妊娠末期に、再接種があり得る。好ましくは、再接種は、妊娠中である。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明のワクチンの使用に関する。さらに、本発明は、本明細書に記載される本発明のワクチンの使用を含む方法に関する。
したがって、一実施形態では、本発明のワクチンは、前記ワクチンを動物に投与するステップを含む動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
したがって、一実施形態では、本発明のワクチンは、前記ワクチンをブタに投与するステップを含むブタの防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。有利な実施形態では、本発明のワクチンは動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであり、前記方法においてワクチンは全身投与、好ましくは、筋肉内又は皮内投与される。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであり、前記方法においてワクチンは１回分用量又は少なくとも１回分用量で投与される。
本発明は、動物のローソニア・イントラセルラリス及び／又はＰＣＶ及び／又はＭ．ｈｙｏ．及び／又はＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＭ．ｈｙｏ．に対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＲＲＳに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＭ．ｈｙｏ．に対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＰＲＲＳに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＲＲＳ及びＭ．ｈｙｏ．に対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＭ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、生菌ローソニア・イントラセルラリス、好ましくは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス又は改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの抗原とを含むワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、生菌ローソニア・イントラセルラリス、好ましくは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス又は改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＣＶの組換えポリペプチドとを含むワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、生菌ローソニア・イントラセルラリス、好ましくは、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス又は改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスと、ＰＶＣ ＯＲＦ２遺伝子により発現されるＰＣＶの組換えポリペプチドとを含むワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの抗原とを含むワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含むワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスの抗原と、ＰＣＶの抗原とを含み、全身投与、好ましくは、筋肉内又は皮内投与されるワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含み、全身投与、好ましくは、筋肉内又は皮内投与されるワクチンである。
一実施形態では、本発明のワクチンは、動物において少なくとも１種の病原体により引き起こされる臨床疾患に対して動物を免疫化するための方法における使用のためワクチンであって、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記少なくとも１種の病原体の病原型に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導できるワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、動物においてローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶより引き起こされる臨床疾患に対して動物を免疫化するための方法における使用のためのワクチンであって、感染の臨床兆候を引き起こさないが、病原体の病原型に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導できるワクチンである。
一実施形態では、本発明のワクチンは、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物における腸の病変を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して軽減させるための防御免疫応答である、ワクチンである。
したがって、有利な実施形態では、本発明のワクチンは、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物における腸の病変を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して軽減するための防御免疫応答であり、前記ワクチンが、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含む、ワクチンである。
腸の病変は回腸の病変であり得る。腸の病変及び／又は回腸の病変は巨視的病変及び／又は微視的病変であり得る。
一実施形態では、本発明のワクチンは、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物における糞便排出を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して低減させるための防御免疫応答である、前記ワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物における糞便排出を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して低減させるための防御免疫応答であり、前記ワクチンが、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含む、ワクチンである。
一実施形態では、本発明のワクチンは、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物の１日あたりの平均体重増加を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して増加させるための防御免疫応答である、前記ワクチンである。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物の１日あたりの平均体重増加を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して増加させるための防御免疫応答であり、前記ワクチンが、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原と、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原とを含む、前記ワクチンである。
本発明は、動物のローソニア・イントラセルラリス及び／又はＰＣＶ及び／又はＭ．ｈｙｏ．及び／又はＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法であって、本発明のワクチンを動物に投与するステップを含む方法をさらに包含する。
本発明は、動物のローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法であって、本発明のワクチンを動物に投与するステップを含む方法も包含する。
本発明は、ブタのローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法であって、本発明のワクチンをブタに投与するステップを含む方法も包含する。
本発明は、動物において少なくとも１種の病原体により引き起こされる臨床疾患に対して動物を免疫化する方法であって、本発明のワクチンを動物に投与するステップを含み、前記ワクチンが、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記少なくとも１種の病原体の病原型に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導できる、前記方法も包含する。
本発明は、動物においてローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶにより引き起こされる臨床疾患に対して動物を免疫化する方法であって、本発明のワクチンを動物に投与するステップを含み、前記ワクチンが、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記病原体の病原型に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導できる、前記方法も包含する。
本発明は、ブタにおいてローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶにより引き起こされる臨床疾患に対してブタを免疫化する方法であって、本発明のワクチンを動物に投与するステップを含み、前記ワクチンが、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記病原体の病原型に対してブタを免疫化する免疫応答を誘導できる、前記方法も包含する。
本発明は、ローソニア・イントラセルラリス及び／又はＰＣＶ及び／又はＭ．ｈｙｏ．及び／又はＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を誘導するための組成物の調製における本発明のワクチンの使用をさらに包含する。
有利な実施形態では、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を誘導するための組成物の調製における本発明のワクチンの使用である。
有利な実施形態では、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＭ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳに対する防御免疫応答を誘導するための組成物の調製における本発明のワクチンの使用である。
本発明は、ローソニア・イントラセルラリス及び／又はＰＣＶ及び／又はＭ．ｈｙｏ．及び／又はＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を誘導するための方法のための本発明のワクチンの使用をさらに包含する。
有利な実施形態では、本発明のワクチンの使用は、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶに対する防御免疫応答を誘導する方法のための使用である。
有利な実施形態では、本発明のワクチンの使用は、ローソニア・イントラセルラリス及びＰＣＶ及びＭ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳに対する防御免疫応答を誘導する方法のための使用である。
本発明のワクチンは、単回用量、すなわち、ワンショット投与として投与され得る。
したがって、一実施形態では、本発明のワクチンは単回用量又はワンショット投与用に製剤化及び／又は包装され得る。
一実施形態では、本発明のワクチンは、複数回用量レジメン、好ましくは２用量レジメン用に製剤化及び／又は包装され得る。
一実施形態において、本発明のワクチンは、投薬剤形として存在し、前記剤形は、より多量の前記ワクチンを収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬量は、前記容器から供給可能である。前記容器は、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００又は少なくとも２５０用量の前記ワクチンを収容し得る。
通常は、ローソニア・イントラセルラリスにより引き起こされる疾患であるブタ増殖性腸炎（ＰＰＥ）は、水薬により又は飲用水に入れて経口投与される市販の生ワクチン（Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ）を使用して制御され得る。ワクチン接種の３日前、当日及びワクチン接種の３日後に、ローソニア・イントラセルラリスに対して有効ないずれの抗生物質もＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓによるワクチン接種を施した動物に投与しないことが求められる。
本発明者らは、驚くべきことに、且つ意外にも、ローソニア・イントラセルラリス生ワクチンは筋肉内投与した場合、動物の抗生物質の同時／併用処置にもかかわらず有効であることを見いだした。
したがって、動物の抗生物質の同時／併用処置にもかかわらず本発明のワクチンを動物に投与することができると予想される。本発明のワクチンが、動物の抗生物質の同時／併用処置であるにもかかわらず投与される場合、投与経路は好ましくは全身投与である。
したがって、本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が、動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置されるワクチンも包含する。
さらに、本発明は、ブタの防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が、ブタに前記ワクチンを投与するステップを含み、ブタが１種又は複数種の抗生物質で同時に／併用処置される、ワクチンも包含する。句「１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置」は、本明細書で使用される場合、動物／ブタが、ワクチン接種の３日前、ワクチン接種の２日前、及び／又はワクチン接種の１日前に、抗生物質処置を受けた（すなわち、１種又は複数種の抗生物質が動物／ブタに投与された）ことを意味する。前記の句は、動物／ブタが抗生物質処置とワクチン接種を同じ日に受けたことも意味し得る。前記の句は、動物／ブタがワクチン接種の１日、２日及び／又は３日後に抗生物質処置を受けることになることも意味し得る。
用語「抗生物質」は、当技術分野において周知であり、本明細書ではその最も広い意味で使用される。用語「抗生物質」は、本明細書で使用される場合、細菌に有害な作用を与える化合物を指し得る。抗生物質の非限定的な例としては、ベータ－ラクタマーゼ（例えば、ペニシリンＶＫ、ペニシリンＧ、アモキシリン三水和物）、ニトロイミダゾール、マクロライド（例えば、酒石酸タイロシン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、及びクラリスロマイシン）、テトラサイクリン、グリコペプチド（例えば、バンコマイシン）、プレウロムチリン及びフルオロキノロンが挙げられる。
好ましくは、抗生物質Ｄｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）若しくはＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）又はこれらの組合せが抗生物質に使用される。
好ましくは、抗生物質は、全部で２週間、３５ｇ／トンのＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）及び４００ｇ／トンのＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）の投薬量を投与される。
したがって、本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のための本発明のワクチンであって、前記方法が、動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンがローソニア・イントラセルラリスの抗原とＰＣＶの抗原とを含む、ワクチンを包含する。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が、動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンは生菌ローソニア・イントラセルラリスとＰＣＶの抗原とを含み、全身投与、好ましくは筋肉内投与される、ワクチンである。
さらに、本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物が１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンがＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原、及びＩｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原を含む、前記ワクチンを包含する。さらに、本発明は、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物がＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）及び／又はＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンがＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原、及びＩｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原を含む、前記ワクチンを包含する。
有利な実施形態では、本発明のワクチンは、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法が動物に前記ワクチンを投与するステップを含み、前記動物がＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）及び／又はＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）で同時に処置／併用処置され、前記ワクチンがＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓに含まれているローソニア・イントラセルラリスの抗原、及びＩｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）又は３ＦＬＥＸ（登録商標）に含まれているＰＣＶの抗原を含み、全身投与、好ましくは筋肉内投与される、前記ワクチンを包含する。
本発明及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲で定義される通りの本発明の趣旨及び精神から逸脱することなく、様々な変化、置換及び変更をここに加えることができることは、理解されるはずである。
本発明のいくつかの特徴を次に番号付きの項目によって説明することとする。
１．ブタワクチンとしての使用に好適なワクチンであって、免疫原性ローソニア・イントラセルラリス成分、免疫原性ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）成分、免疫原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ．）成分、及び免疫原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）成分を含むワクチン。
２．１種又は複数種のアジュバントを含む、項目１のワクチン。
３．１種又は複数種のアジュバントが、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のコポリマー；架橋されているアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋されているアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー；カルボマー；少なくとも３個且つ多くとも８個のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化化合物で架橋されているアクリルポリマーであって、少なくとも３個の前記ヒドロキシル基の水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族基によって置き換えられていてもよく、又は置き換えられており、前記基が２～４個の炭素原子を含有し、例えば、ビニル、アリル及び他のエチレン性不飽和基であり、これらの不飽和基自体が他の置換基、例えばメチル、を含有し得る、アクリルポリマー；カルボポール；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ） ９７４Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ） ９３４Ｐ；カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ） ９７１Ｐ；水酸化アルミニウム；リン酸アルミニウム；サポニン；Ｑｕｉｌ Ａ；ＱＳ－２１；ＧＰＩ－０１００；油中水型エマルジョン；水中油型エマルジョン；水中油中水型エマルジョン；軽質流動パラフィン油に基づくエマルジョン又は欧州薬局方型アジュバント；イソプレン系の油；スクアラン；アルケン又はイソブテン又はデセンのオリゴマー化の結果として生じるスクアレン油；酸の又は直鎖アルキル基を含有するアルコールのエステル；植物油；オレイン酸エチル；ジ（カプリル酸／カプリン酸）プロピレングリコール；トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル；ジオレイン酸プロピレングリコール；分岐脂肪酸又はアルコールのエステル：イソステアリン酸エステル；非イオン性界面活性剤；ソルビタンの又はマンニットの又はグリコールの又はポリグリセロールの又はプロピレングリコールの又はオレイン酸若しくはイソステアリン酸の又はリシノール酸の又はヒドロキシステアリン酸のエステルであって、エトキシ化されていてもよいエステル、無水マンニトールオレイン酸エステル；ポリオキシプロピレン－ポリオキシエチレンコポリマーブロック、プルロニック（Pluronic)製品、ＲＩＢＩアジュバント系；ブロックコポリマー；ＳＡＦ－Ｍ；モノホスホリルリピッドＡ；アブリジン脂質－アミンアジュバント；大腸菌からの易熱性エンテロトキシン（組換え又は非組換え）；コレラ毒素；ＩＭＳ １３１４、又はムラミルジペプチドのうちの１種又は複数種を含む、項目２のワクチン。
４．免疫原性ローソニア・イントラセルラリス成分がローソニア・イントラセルラリスワクチンである、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
５．免疫原性ローソニア・イントラセルラリス成分が生ワクチンである、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
６．ローソニア・イントラセルラリス成分が弱毒化ワクチンである、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
７．ローソニア・イントラセルラリス成分が約１０3～１０9細菌／Ｋｇ体重又は約１０5～１０7細菌／Ｋｇ体重の用量を含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
８．ローソニア・イントラセルラリス成分がローソニア・イントラセルラリス菌の１×１０5～１×１０7の用量を含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
９．ローソニア・イントラセルラリス成分が凍結乾燥されている、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１０．ローソニア・イントラセルラリスワクチンがアジュバントをさらに含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１１．アジュバントが、ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）である、前記項目のワクチン。
１２．ローソニア・イントラセルラリス成分が、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓワクチンである、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１３．免疫原性ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）成分がブタサーコウイルス（ＰＣＶ）ワクチンである、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
１４．ＰＣＶがＰＣＶ１である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１５．ＰＣＶがＰＣＶ２である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１６．ＰＣＶがＰＣＶ３である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１７．ＰＣＶが、ＰＣＶ２及びＰＣＶ３である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１８．ＰＣＶ成分が組換えＰＣＶ成分である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
１９．組換えＰＣＶ成分が、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子であるか、前記遺伝子を含むか、又は前記遺伝子により発現される、例えば、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子により発現されるタンパク質である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２０．組換えＰＣＶ成分が、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子であるか、前記遺伝子を含むか、又は前記遺伝子により発現される、例えば、ＰＣＶＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子により発現されるタンパク質であり、前記ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子がＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子をコードする、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２１．組換えＰＣＶ成分が、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子であるか、前記遺伝子を含むか、又は前記前記遺伝子により発現される、例えば、ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子により発現されるタンパク質であり、前記ＰＣＶ ＯＲＦ遺伝子がＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子をコードし、前記ＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子がＰＣＶ２ ＯＲＦ２遺伝子である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２２．ＰＣＶ成分が組換えＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質である、又は前記タンパク質を含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２３．ＰＣＶ成分が組換えＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質であるか、又は前記タンパク質を含み、ワクチンが組換えＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質の約２μｇ～約４００μｇの投薬量を含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２４．ＰＣＶ成分が、ＤＮＡであるか又はＤＮＡを含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２５．ＰＣＶ成分がＤＮＡであるか又はＤＮＡを含み、前記ＤＮＡが、約１０μｇ～約２０００μｇの間、好ましくは、約５０μｇ～約１０００μｇの間の量で存在する、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２６．ＰＣＶ成分が、バキュロウイルス細胞で発現される又はされた、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２７．ＰＣＶ成分がアジュバントをさらに含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２８．ワクチン又はワクチン成分のうちの１つがアジュバントを含み、前記アジュバントがＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
２９．ＰＣＶ成分が、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
３０．免疫原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）成分がマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチンである、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
３１．Ｍ．ｈｙｏ．成分が上清及び／又はバクテリンである、前記項目のいずれか１つのワクチン。
３２．Ｍ．ｈｙｏ．成分がバクテリンである、前記項目のワクチン。
３３．Ｍ．ｈｙｏ．成分の用量が、上清及び／又はバクテリン約２ｍｌである、前記項目のいずれか１つのワクチン。
３４．Ｍ．ｈｙｏ．成分がＩｎｇｅｌｖａｃ ＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
３５．免疫原性ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）成分がブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）ワクチンである、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
３６．ＰＲＲＳＶ成分が生ワクチンである、前記項目のいずれか１つのワクチン。
３７．ＰＲＲＳＶ成分が弱毒化ワクチンである、前記項目のワクチン。
３８．ＰＲＲＳＶ成分が改変生ワクチンである、前記２項目のワクチン。
３９．ＰＲＲＳＶ成分が、１用量あたり約１０1～約１０7ウイルス粒子、好ましくは、１用量あたり約１０3～約１０5粒子、より好ましくは、１用量あたり約１０4～約１０5粒子の用量を含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４０．ＰＲＲＳＶ成分が凍結乾燥されている、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４１．凍結乾燥ＰＲＲＳＶ成分が、投与のために２ｍｌの溶媒で再構成される又はされた、前記項目のワクチン。
４２．ＰＲＲＳＶ成分が、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶである、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４３．ＰＣＶ成分、Ｍ．ｈｙｏ．成分及びＰＲＲＳＶ成分が、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンである、又は前記ワクチンに由来する、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４４．ＰＣＶ成分、Ｍ．ｈｙｏ．成分及びＰＲＲＳＶ成分が、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンであり、又は前記ワクチンに由来し、ローソニア・イントラセルラリス成分が、凍結乾燥され、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンに溶解されている、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４５．ローソニア・イントラセルラリス成分が、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓである、前記２項目のワクチン。
４６．ワクチンの体積が、約０．５ｍｌ～約４ｍｌである、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４７．ワクチンの体積が、約２ｍｌである、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４８．薬学的に又は獣医学的に許容される担体をさらに含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
４９．アジュバントをさらに含む、前記項目のいずれか１つのワクチン。
５０．アジュバントが、ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）である、前記項目のワクチン。
５１．経口投与用の形態である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
５２．飲用水又は経口水薬による経口投与用の形態である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
５３．筋肉内投与用の形態である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
５４．単回用量又はワンショット投与用に製剤化及び／又は包装されている、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
５５．マルチウェルプレートレジメン用に製剤化及び／又は包装されている、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
５６．２用量レジメン用に製剤化及び／又は包装されている、前記項目のいずれか１つに記載のワクチン。
５７．投薬剤形として存在し、前記投薬剤形が、より多量のワクチンを収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬剤形が前記容器から供給可能である、前記項目のいずれか１つのワクチン。
５８．投薬剤形として存在し、前記投薬剤形が、より多量の前記ワクチン含有を収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬剤形が前記容器から供給可能であり、前記容器が、前記組成物の少なくとも１０用量を収容している、前記項目のいずれか１つのワクチン。
５９．投薬剤形として存在し、前記投薬剤形が、より多量の前記ワクチン含有を収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬剤形が、前記容器から供給可能であり、前記容器が前記組成物の少なくとも５０用量を収容している、前記項目のいずれか１つのワクチン。
６０．投薬剤形として存在し、前記投薬剤形が、より多量の前記ワクチン含有を収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬剤形が、前記容器から供給可能であり、前記容器が前記組成物の少なくとも１００用量を収容している、前記項目のいずれか１つのワクチン。
６１．投薬剤形として存在し、前記投薬剤形が、より多量の前記ワクチン含有を収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬剤形が、前記容器から供給可能であり、前記容器が前記組成物の少なくとも１５０用量を収容している、前記項目のいずれか１つのワクチン。
６２．投薬剤形として存在し、前記投薬剤形が、より多量の前記ワクチン含有を収容している容器から供給され、前記ワクチンの剤形が、前記容器から供給可能であり、前記容器が前記組成物の少なくとも２００用量を収容している、前記項目のいずれか１つのワクチン。
６３．投薬剤形として存在し、前記投薬剤形が、より多量の前記ワクチン含有を収容している容器から供給され、前記ワクチンの投薬剤形が、前記容器から供給可能であり、前記容器が前記組成物の少なくとも２５０用量を収容している、前記項目のいずれか１つのワクチン。
６４．動物の免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫応答又は防御的免疫学的応答の惹起における使用のための前記項目のいずれか１つのワクチン。
６５．動物がブタ動物である、動物の免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫応答又は防御的免疫学的応答の惹起における使用のための前記項目のいずれか１つのワクチン。
６６．使用が、動物のローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫応答又は防御的免疫学的応答を惹起するための使用である、先行する２項目のいずれか１つに記載の使用のための前記項目のいずれか１つのワクチン。
６７．経口投与される、先行する３項目のいずれか１つに記載の使用のための前記項目のいずれか１つのワクチン。
６８．飲用水又は経口水薬によって経口投与される、先行する４項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
６９．筋肉内投与される、先行する５項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
７０．１用量として投与される、先行する６項目のいずれか１つに記載の使用のための前記項目のいずれか１つのワクチン。
７１．１用量として投与され、前記１用量が、動物のローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫応答又は防御的免疫学的応答を惹起する、先行する７項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
７２．少なくとも１用量として投与される、先行する８項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
７３．少なくとも１用量として投与され、前記１用量が、動物のローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫応答又は防御的免疫学的応答を惹起する、先行する９項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
７４．ブタ動物に１用量が投与される、先行する１０項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
７５．ブタ動物に１用量のみが投与される、先行する１１項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
７６．ブタ動物に少なくとも１用量が投与される、先行する１２項目のいずれか１つに記載の使用のための先行する項目のいずれか１つのワクチン。
７７．動物のローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する免疫応答又は免疫学的応答又は防御免疫応答又は防御的免疫学的応答を惹起するための方法であって、先行する項目のいずれか１つのワクチンを動物に投与するステップを含む方法。
７８．動物において少なくとも１種の病原体により引き起こされる臨床疾患に対して前記動物を免疫化する方法であって、先行する項目のいずれか１つのワクチンを動物に投与するステップを含み、免疫学的組成物が、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記少なくとも１種の病原体の病原型に対して動物を免疫化する免疫応答を誘導できる、方法。
７９．ローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する免疫学的若しくは免疫応答若しくは防御免疫若しくは防御的免疫学的応答を惹起するための組成物の調製における使用のための、又はローソニア・イントラセルラリス、ＰＣＶ、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する免疫学的若しくは免疫応答若しくは防御免疫若しくは防御的免疫学的応答を誘導するための方法における使用のための、先行する項目のいずれか１つのワクチンの使用。
＊ ＊ ＊
本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、上記項目により定義される本発明は、本発明の趣旨又は範囲を逸脱することなくそれらの多くの明らかな変形形態が可能であるので、上記の説明で示した特定の詳細に限定されないことを理解されたい。
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、以下の実施例は説明を目的として与えるものであり、いかなる点においても本発明を制限することを目的とするものではない。
（実施例１）
筋肉内投与されるＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）の有効性および抗微生物剤の存在を伴う有効性研究設計
目的：
本実施例の主目的は、ＰＰＥの原因物質である毒性ローソニア・イントラセルラリスを含有する消化管ホモジネートによるチャレンジを実施するブタに筋肉内注射したときの、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンと組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの有効性を評価することである。副次的目的は、抗微生物剤併用処置を施したブタに投与したときのこのワクチンの組合せの有効性を評価することである。
根拠：
ＰＰＥは、水薬により又は飲用水に入れて経口投与する市販の生ワクチン（Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ）を使用して制御することができる。ワクチン接種の３日前、当日及びワクチン接種の３日後に、ローソニアに対して有効ないずれの抗生物質もＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓによるワクチン接種を施した動物に投与しないことが求められる。抗生物質の使用を低減させる傾向があるが、これは、今もなお、多くの農場において乗り越えるべき大きなハードルである。異なる適用経路の使用は、抗生物質処置の存在下でワクチンの有効性をもたらす可能性があり、これはワクチン使用を助長するであろう。同時に、業界には、ブタが受ける注射数を低減させたいという願いがあり、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンと組み合わせて注射したときのＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの有効性をよりよく理解することが、ローソニア、ＰＣＶ２、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶに対する組合せワクチンの開発の実現可能性を理解する上での手掛かりとなるだろう。本研究では、毒性ローソニア・イントラセルラリスを含有する消化管ホモジネートによる３週間後のチャレンジを伴う、３ＦＬＥＸ（登録商標）と組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）筋肉内経路によるブタのワクチン接種について、研究することにする。
全般的な設計の説明：
１１２匹の離乳した日齢２１日（＋／－２日）のブタを、回腸炎の病歴が無いことが分かっている供給源から得た。加えて、この試験に使用するブタは、ローソニア・イントラセルラリスに対して血清抗体陰性であるばかりでなく、糞便ｑＰＣＲ陰性でもあるものとする。ブタを４群（１群に動物２４匹を有する３群、１６匹を有する１群）に無作為に割り当て、体重、同腹仔及び性別でブロック分けする。処置群は、陽性チャレンジ対照（ＰＣ）；３（登録商標）ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与する群（ＥＩＩＭ）、及び抗微生物剤との併用投与で３（登録商標）ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与する群（ＥＩＩＭＡＴＢ）である。ブタ１６匹の陰性対照群にはチャレンジを実施せず、この陰性対照群をＰＣ群と比較して単独でのローソニアによるチャレンジを評価する。この陰性対照群を研究終了時に他の処置群と一緒に安楽死させる。処置群ＥＩＩＭＡＴＢは、抗微生物剤を施す唯一の群であり、この群に、全部で２週間、３５ｇ／トンのＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）及び４００ｇ／トンＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）の表示投薬量を与える。抗微生物剤処置は、離乳に起因する飼料摂取不足からブタを回復させるための５日の適応期間の後に（Ｄ－７）に始める。飼料での１週間のＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）ＣＴＣの後、ＥＩＩＭＡＴＢ群に、３ＦＬＥＸワクチンと組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの２ｍｌ用量によるＩＭワクチン接種を施す。凍結乾燥形態のＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓを、３ＦＬＥＸワクチンを使用して３ＦＬＥＸの用量２ｍｌごとにＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの１用量２ｍｌが得られるように再水和する。これは、結果として得られる実験的「４ＦＬＥＸ」ワクチンの２ｍｌ用量が、４種全ての抗原の適切な量を含有することを意味する。全ての処置群に同時に（ＤＯ）ワクチン接種する。ワクチン接種の後に残ったワクチンの保管試料は、－８０℃で保存することとする。ワクチン接種後、動物を注射部位の病変及びあらゆる他の有害反応について観察する。観察結果を記録する。陽性及び陰性チャレンジ対照群には３ＦＬＥＸによるワクチン接種のみを施し、ローソニア抗原を与えない。免疫を生じさせるための２８日（４週間）の期間の後、ブタ１匹あたり微生物１０8~9の目標量を含有する、ローソニア・イントラセルラリスを含有する粘膜ホモジネートによる経口チャレンジを、全ての動物に実施する。この粘膜ホモジネートを、その全内容を調査するために、及びローソニア・イントラセルラリスを定量するための定量的ＰＣＲのために、次世代シークエンシングにより配列決定することとする。消化管ホモジネート材料は、サルモネラ属、ＰＲＲＳＶ及びブラキスピラ属種をはじめとする他の病原体が無い状態でなければならない。チャレンジ前後に体重の増加の判断を可能にするために、チャレンジ時に全てのブタを計量する。チャレンジ後、全ての動物を、糞便の変化、身体状態の変化及び変容行動について、研究終了まで毎日評価する。
研究をチャレンジ後２１日目に終了し、終了時に全ての動物を安楽死させ、再び計量する。剖検時に、腸管の全ての部分における巨視的病変を測定し、評価し、回腸終端部試料はもちろん任意の追加の罹患組織もホルマリンに採取して微視的病変を測定することとする。
微視的病変を、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）により並びにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により推定して、増殖性の病変を測定する。血液及び糞便試料を、ローソニア・イントラセルラリスの血清検査及びｑＰＣＲのために、ワクチン接種時に、チャレンジ時に、そしてその後、剖検まで毎週、全ての動物から採取する。糞便試料を、動物間で手袋を変えて指挿入により、又は糞便ループにより採取する。糞便試料を糞便ループで採取する場合、これらを再使用してはならず、異なる糞便ループを動物ごとに使用しなければならない。全ての血液及び糞便試料を小分けして、小分けしたものを１つだけ、ローソニアについての血清検査及び糞便ＰＣＲに供するべきである。試料が入っている全ての管に、採取日、研究日及びブタＩＤナンバーを書いたラベルを貼る。
実験単位：個々のブタ各々。
反復実験数の根拠：
検出力計算：チャレンジ対照群における発症率を少なくとも７５％と仮定すると、１処置群あたり動物２１匹によって、ａ＝０．０５を使用する両側検定についての処置と対照の間の４０パーセンテージポイントの差を検出するための検出力おおよそ８０％が得られると予想される。可能性のある副次的影響を許容し、８０％よりわずかに高い検出力レベルの容認を可能にするために、１処置群あたり動物２４匹の総数を使用する。
無作為化のための方法：
動物を体重、性別及び同腹仔ごとにブロック分けし、乱数発生器を使用してブタを処置ごとに割り当てる。
盲検化のレベル及び説明：
病変、糞便排出及び血清検査の評価のための処理を盲検化する。盲検化を統計解析についても行う。
診断の詳細及び要件：
ワクチン接種時点及びチャレンジ時点の後に、全ての研究動物の血液及び糞便試料を毎週採取する。これは、おおよそ５６０の血液及び糞便試料（動物１１２匹×試料採取５回）に等しい。全ての試料を診断に供する。小分けした各試料の少なくとも１つを研究終了まで－８０℃で保存する。
生産段階：生産の保育段階。
動物の性別：去勢ブタ及び未経産ブタを処置群間に可能な限り等しく分配する。
組入れ／除外及び組入れ後除去基準：
研究開始時の組入れ基準：Ｄ（－７）に正常な健康状態のブタの商用生産群。研究開始時の除外基準：Ｄ（－７）に臨床的に病気又は発育不全であるブタ。
研究中の除外除去基準：
福祉上の又は病気の懸念が生じた場合、主任研究者及び現場の獣医及び／又は設計者が、安楽死を含み得る最良の行動方針を評価し、決定する。
（実施例２）
筋肉内投与されるＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）の有効性、および、抗微生物剤の存在を伴う有効性、最終研究報告書
本研究は、ブタ増殖性腸炎（ＰＰＥ）の原因物質であるローソニア・イントラセルラリスに対する防御の点に関するＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの筋肉内投与経路の有効性及びＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸワクチンと組み合わせたときの有効性を評価した。ワクチンの有効性への抗微生物剤の潜在的干渉も評価した。
ＰＰＥは、特徴的な巨視的病変、微視的病変、Ｌ．イントラセルラリスの糞便排出、Ｌ．イントラセルラリスへのセロコンバージョン、臨床兆候、及び生産性能に対する影響の測定によれば、この研究で首尾良く再現された。Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと３ＦＬＥＸ（登録商標）の筋肉内投与用の組合せである「４ＦＬＥＸ」は、巨視的病変の重症度、微視的病変の重症度、臨床的下痢スコア、及びＬ．イントラセルラリスの糞便排出の有意義且つ有意な低減をもたらした。１日あたりの平均体重増加に関しても、この処置群においてワクチン非接種の対照と比較して増加が観察された。これらの結果は、筋肉内経路及びＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンの組合せが、ＰＰＥの予防の好適で効果のある選択肢であることを示す。このワクチンの組合せが安全であることも観察され、有害事象も注射部位反応も観察されなかった。
抗微生物剤をワクチン接種中に投与したとき、この研究で評価した一部のパラメーターに変化が認められた。抗微生物剤を施した群（ＥＩＩＭＡＴＢ）ではワクチン非接種チャレンジ実施対照と比べて巨視的及び微視的病変の低減が観察されたが、これらのレベルは、統計的有意性に達せず、数値的には抗微生物剤なしの同じ処置（ＥＩＩＭ）と比較して上昇した。しかし、ワクチン接種し、さらに抗微生物剤を施した群（ＥＩＩＭＡＴＢ）は、ワクチン非接種対照と比較して有意に増加する最大の体重増加がチャレンジ後にあった、ワクチン接種群であった。臨床的下痢スコアの変化の発生率の有意な低下も観察された。これらの結果は、抗微生物剤が、ワクチンの有効性に干渉する可能性があり得るが、試験した抗微生物剤の存在下でワクチン接種したときにはかなりの防御レベルがやはり付与されたことを示す。
本研究の主目的は、ブタ増殖性腸炎（ＰＰＥ）の原因物質であるローソニア・イントラセルラリスからブタを防御する点での、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンと組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの筋肉内投与経路の有効性を、評価することであった。第２の目的は、抗微生物剤併用処置を施したブタに投与したときのこのワクチンの組合せの有効性を評価することであった。
ワクチンの有効性を、腸の病変の肉眼的及び微視的病変の軽減により決定した。増殖能力、臨床兆候及び糞便排出をはじめとする興味を引く他の変数も評価した。
ＰＰＥは、水薬により又は飲用水に入れて経口投与する市販の生ワクチン（Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ）を使用して制御することができる。ワクチン接種の３日前、当日及びワクチン接種の３日後に、ローソニアに対して有効ないずれの抗生物質もＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓによるワクチン接種を施した動物に投与しないことが求められる。抗生物質の使用を低減させる傾向があるが、これは、今もなお、多くの農場において乗り越えるべき大きなハードルである。異なる適用経路の使用は、抗生物質処置の存在下でワクチンの有効性をもたらす可能性があり、ワクチン使用を助長するであろう。同時に、業界には、ブタが受ける注射数を低減させたいという願いがあり、３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンと組み合わせて注射したときのＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの有効性をよりよく理解することが、ローソニア、ＰＣＶ２、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ及びＰＲＲＳＶに対する組合せワクチンの開発の実現可能性を理解する上での手掛かりとなるだろう。本研究では、筋肉内経路によるブタのワクチン接種を、３ＦＬＥＸ（登録商標）と組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）について、続いて毒性ローソニア・イントラセルラリスを含有する消化管ホモジネートによる４週間後のチャレンジについて研究した。
設計考察：
日齢２１日（＋／－２日）のブタを、回腸炎の病歴が無いことが分かっている供給源から得た。ブタを４群（１群に動物２４匹を有する３群、１６匹を有する１群）に無作為に割り当てた。処置群は、陽性チャレンジ対照（ＰＣ）；３（登録商標）ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与する群（ＥＩＩＭ）、及び抗微生物剤との併用投与で３（登録商標）ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与する群（ＥＩＩＭＡＴＢ）であった。ブタ１６匹の陰性対照（ＮＣ）群にはチャレンジを実施せず、この群は、ＰＣ群におけるチャレンジの重症度を評価する目的に役立った。処置群ＥＩＩＭＡＴＢは、抗微生物剤を施した唯一の群であり、この群に、全部で２週間、３５ｇ／トンのＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）及び４００ｇ／トンのＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）の表示投薬量を与えた。抗微生物剤処置は、離乳に起因する飼料摂取不足からブタを回復させるための１３日の適応期間の後に（Ｄ－７）に始めた。飼料での１週間のＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）ＣＴＣの後、ＥＩＩＭＡＴＢ群に、３（登録商標）ＦＬＥＸワクチンと組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの２ｍｌ用量によるＩＭワクチン接種を施した。全ての処置群に同時に（Ｄ０）ワクチン接種した。免疫を生じさせるための２８日（４週間）の期間の後、ローソニア・イントラセルラリスを含有する粘膜ホモジネートによる経口チャレンジを、全ての動物に実施した。研究をチャレンジ後２１日目に終了し、終了時に全ての動物を安楽死させ、病変をスコアリングし、試料を採取した。さらなる設計の詳細が下の表にある。
Figure 0007657287000001
Figure 0007657287000002
群ごとの処置：
処置群は、陽性チャレンジ対照（ＰＣ）；Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与した群（ＥＩＩＭ）、及び抗微生物剤との併用投与でＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与した群（ＥＩＩＭＡＴＢ）であった。ブタ１６匹の陰性対照（ＮＣ）群にはチャレンジを実施せず、この群は、ＰＣ群におけるチャレンジの重症度を評価する目的に役立った。処置群ＥＩＩＭＡＴＢは、抗微生物剤を施した唯一の群であり、この群に、全部で２週間、３５ｇ／トンのＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）（チアムリン）及び４００ｇ／トンのＣＴＣ（クロルテトラサイクリン）の表示投薬量を与えた。飼料での１週間のＤｅｎａｇａｒｄ（登録商標）ＣＴＣの後、ＥＩＩＭＡＴＢ群に、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸワクチンと組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの２ｍｌ用量によるＩＭワクチン接種を施した。凍結乾燥形態のＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓを、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸワクチンを使用してＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸの用量２ｍＬごとにＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの１用量２ｍＬが得られるように再水和した。これは、結果として得られる実験的「４ＦＬＥＸ」ワクチンの２ｍＬ用量が、４種全ての抗原の適切な量を含有したことを意味する。
処置投薬：
ワクチンをＤ０に下の表に示されている経路によって第１～５群に投与した。ＩＭ注射の投与は、適切なサイズの消毒針及び注射器を使用して、首の右側の、耳の付け根と肩端との中間に行った。
Figure 0007657287000003
Figure 0007657287000004
 動物の組入れ／除外基準：
研究の開始前に、各動物の健康を評価し、動物の健康診断用紙の全ての項目に記入した。ローソニアについてｑＰＣＲ及び血清反応陰性であった正常な健康状態の動物のみをこの試験に含めた。福祉上の又は病気の懸念が研究中に生じた場合、主任研究者及び現場の獣医及び／又は設計者が、安楽死を含み得る最良の行動方針を決定し、これらの事象を記録した。
実験単位：ブタを実験単位とした。
無作為化：
飼養及び処置へのブタの無作為化は、ＳＡＳ統計ソフトウェアを使用してＧＢＩにより提供された統計サービスにより行った。研究の開始前に、利用可能なブタ、同腹仔情報、性別、年齢、体重、及び収容施設の仕組みをＧＢＩ統計学者に提供した。動物を体重、性別及び同腹仔ごとにブロック分けし、乱数発生器を使用してブタを処置ごとに割り当てた。
盲検化基準：
病変のスコアリング及び研究所アッセイの実施に携わった職員を、本研究を通して群へのブタの割り振りについて盲検化した。本研究についてのデータの収集に携わった全ての研究施設職員は、文書化を目的とした署名記録へ記入した。
獣医医療及び併用処置：
研究施設に到着後、監視者又は設計者からの同意前には、いかなる医薬品も投与しなかった。動物は、施設に到着すると研究終了時まで獣医的管理下にあった。チャレンジ投与とは無関係の外傷又は病気を呈するいずれの動物にも適切な獣医医療を施すこととした。研究者により提供される証拠書類は、観察された臨床兆候、あらゆる診断検査のアウトカム、及び投与したあらゆる処置のアウトカムについての記載を含むものとした。全ての処置をＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｒｄに文書で記録することとし、これらは、ＥＩＩＭＡＴＢ群に施された抗微生物剤を含んだ。安楽死させた又は息を引き取った動物を剖検し、診断を確立するために必要に応じて試料を採取し、この場合、獣医学報告記録に記入することとした。あらゆる予期せぬ病気又は瀕死の動物を、現場の研究者、現場の獣医が監視者及びＰＩと協力して適切に取り扱って、処置又は安楽死のどちらかによる疼痛／苦痛を緩和するための最良の策を決定することとした。
一般的観察：
到着時に開始し、Ｄ２８まで継続して、全ての動物を毎日、全体的な健康について観察し、観察結果をＧｅｎｅｒａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｒｄに記録した。
注射反応：
ブタを、ワクチン接種後４～８時間、注射部位を観察することにより注射部位での反応について、及びあらゆる有害事象について監視した。ブタをワクチン接種後１、２及び３日目に再評価した。注射部位に異常が認められたあらゆる動物を毎日、病変が解消されるまで監視することとした。異常を判定してサイズ（ｃｍ）、発赤、腫脹、発熱及び疼痛に関して指摘し、記載した。注射部位の観察結果をＩｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｒｄに記録した。
臨床観察：
全てのブタを、Ｄ２８からＤ４９まで毎日、ローソニア・イントラセルラリスチャレンジに関連する臨床兆候について観察した。下の表に示す観察評価を使用して、所見をＣｌｉｎｉｃａｌ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ Ｒｅｃｏｒｄに記録した。
Figure 0007657287000005
 体重：
各ブタを、事象の日程で示す通りに計量（ｌｂ）し、結果をＢｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ Ｒｅｃｏｒｄに記録した。全ての試験動物について１日あたりの平均体重増加を、群比較のために算出した。
剖検：
Ｄ４９に、残存する全てのブタを現場の手順に従って安楽死させた。回腸、空腸、盲腸、及び結腸を肉眼的病変について検査し、下の表にあるスコアリングスキームに従ってＯｆｆ Ｔｅｓｔ Ｎｅｃｒｏｐｓｙ Ｒｅｃｏｒｄにスコアを記録した。
Figure 0007657287000006
Figure 0007657287000007
血液試料採取：
採血をＳａｍｐｌｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｒｄに記録した。静脈全血を、事象の日程に従って血清分離剤入り採血管（ＳＳＴ）に採取した。研究者又は設計者が無菌１８～２０ｇ×１～１．５”Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）針、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）針ホルダー、及び９又は１３ｍｌ ＳＳＴ管を使用して、各ブタから前大静脈経由で静脈全血を採取した。各試料に、動物のＩＤ番号、研究番号、採取日、研究日及び試料タイプを書いたラベルを貼った。ＳＳＴを室温で放置して凝固させた後、おおよそ２０００×ｇで５～１０分間、遠心分離を行った。遠心分離が完了し次第、試験及び－８０℃での長期保存のための部分試料を作製した。－８０℃で保存した血清の部分試料を、全ての試料の取り扱いを標準化すべくドライアイスを用いてローソニアＥＬＩＳＡ試験のために診断研究所（ＩＳＵ－ＶＤＬ）に送った。
糞便試料採取：
ｑＰＣＲによりローソニア排出についてＩＳＵ－ＶＤＬで試験するため、事象の日程に従って直腸への指挿入により糞便試料を採取した。糞便採取をＳａｍｐｌｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｒｄに記録した。糞便試料を、研究番号、採取日、研究日及びブタＩＤナンバーを書いたラベルを貼った管に採取した。全ての試料を小分けして２本の管に入れ、－８０℃で保存した。小分けした１つを、輸送中に試料を凍結状態で維持するために、及び、全ての試料がＩＳＵ－ＶＤＬで確実に同等に処理されることになるように、ドライアイスと共に断熱容器に入れて発送した。採取した試料をＳａｍｐｌｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｒｄに記録した。微視的病変の評価を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びにローソニア免疫細胞化学検査（ＩＨＣ）により行った。試験手順及び結果を最終報告書に含める。生データを、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｃｏｒｄを使用して記録した。Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅｃｏｒｄを使用する既に確立した方法によるスコアリングと共に行う微視的組織学的検査のために、回腸の試料を採取してホルマリン固定した。
統計解析：
統計検定は、同様のデータを有する同業者による査読を受けた公表文献に使用されたものであって一対比較を可能にするものに従った。定量的データをカイ２乗検定で評価した。有意性をｐ＜０．０５の場合に決定し、傾向を０．０５≦ｐ＜０．１０の場合に決定した。
一般的観察／有害事象：
３つの有害事象が研究中に起こった。ワクチン接種が関与した有害事象はなかったが、１つの事象はローソニア・イントラセルラリスチャレンジに関係していた。これらの事象を下の表に記載する。
Figure 0007657287000008
 注射反応：
ワクチン接種したいずれの動物も、ワクチン接種後にそれらを評価した３日間にいかなる発赤も、腫脹も、発熱も、疼痛も発症しなかった。単独でのＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸワクチンＩＭを施した群においても、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと混合し組み合わせて注射したときにも、注射部位反応の差は認められなかった。
臨床観察：
臨床的下痢スコアは、全ての動物においてチャレンジの時点でゼロのスコアであり、感染後６日目（ｄｐｉ）に種々の群で変わり始めた。下痢スコアの変化の発生率は、ＰＣ群においてＮＣ群と比較して有意に（ｐ＜０．０００１）高く（下の表を参照されたい）、これは、Ｌ．イントラセルラリスチャレンジが特徴的な臨床兆候をもたらしたことを示していた。Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓを施した全ての群に、ワクチン非接種ＰＣ群と比較して、臨床的下痢スコアの変化の発生率の有意な低下がなかった（下の表を参照されたい）。行動は、チャレンジ後にあまり変容せず、１つの変容行動事象しかＰＣ群における５０１の評価の中で認められなかった。身体状態スコアは、チャレンジに起因して変化することが判明した。全ての処置群に身体状態変化が陰性対照群と比較して有意に多く起こった（下の表を参照されたい）。ＥＩＩＭ処置群は、身体状態の変化の発症率が最も低くかった群であり、ワクチン非接種ＰＣ群と比較して身体状態が軽減される傾向（ｐ＝０．０５４）があった。
Figure 0007657287000009
 肉眼的病変スコア：
Ｌ．イントラセルラリスの優先的定着部位である回腸における肉眼的病変スコアは、ＰＣ群が最も高く、平均スコアは１．５５であった（図１）。このスコアは、チャレンジ非実施対照群（ＮＣ）より有意に高く、このことからこのチャレンジモデルの妥当性が実証された（図１、ｐ＜０．０５）。ワクチン接種群の中で、ＥＩＩＭ群は、最も低い病変スコアを有し、平均スコアが０．６７であり、これは、ワクチン非接種ＰＣ群より有意（ｐ＜０．０５）に低かった（図１）。ＥＩＩＭＡＴＢ群は、ＰＣ群より重症度が低いが統計的有意性に達しない、同様のレベルの病変を発症した。肉眼的病変の長さも測定し、この長さも病変スコアと同様のパターンに従った。ＥＩＩＭ群は、ＰＣ群の長さのおよそ半分の平均回腸病変長を有した（ｐ＝０．０９７）（図２）。病変スコアを掛けることによって重症度スコアを病変長に割り当てた。平均病変重症度スコアは、図３で見つけることができる。重症度スコアは、病変スコア及び病変長のものと同様の傾向に従った。ＥＩＩＭ群は、１５．６３の平均重症度スコアを有したが、ＰＣ群は、４０．６８の平均スコアを有した（ｐ＝０．０５３；図３）。ワクチン接種群は、腸管の他の部分においても病変の軽減に至った。ＰＣ群とＮＣ群の間に病変に有意な差が無かったのでこのことは更に調査はしなかった。このことは回腸の外側に病変がある動物のより少ない数に起因する可能性が高かった。
体重：
１日あたりの平均体重増加（ＡＤＧ）は、チャレンジ前の試験期間では処置群間で非常に類似しており、群間に有意差は見いだされなかった。チャレンジ後の期間では、チャレンジを実施した全ての群には、チャレンジを実施しなかったＮＣ群と比較してＡＤＧの有意な低減があった（図４）。ＥＩＩＭＡＴＢ群は、チャレンジ後の期間に最高の成績を上げたワクチン接種群であり、１．７１ｌｂ／日のＡＤＧを有し、これは、１．４３のＡＤＧを有したワクチン非接種チャレンジ実施ＰＣ群より有意に大きかった（Ｐ＜０．０５）。ＥＩＩＭ群は、２番目に大きいチャレンジ後ＡＤＧを有した群であり、この群のＡＤＧは１．６５であり、この値もまた、ＰＣ群より有意に高かった（ｐ＜０．０５）；（図４）。
ローソニア血清ＥＬＩＳＡ：
ＩＳＵ－ＶＤＬでＥＬＩＳＡにより測定されたローソニアに対する血清抗体を有する動物の数を図５に示す。全ての動物は、試験０日目（チャレンジの２８日前、－２８ｄｐｉ）のワクチン接種時に血清反応陰性であった。動物２匹だけはチャレンジ時（研究２８日目）に血清反応陽性であり、１匹は、ＥＩＩＭ群の動物であり、もう１匹は、ＥＩＩＭＡＴＢ群の動物であった。これは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）３ＦＬＥＸワクチンとの組合せでのＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓのＩＭワクチン接種が非常に大幅なセロコンバージョンをもたらすことを示す。予想通り、殆どの動物がセロコンバージョンし、２１ｄｐｉに陽性であり、これらのことによっても、このチャレンジモデルの期待値に従うローソニアチャレンジの妥当性が確認された。ＰＣ群は、２１ｐｄｉに抗ローソニア抗体を有した動物の数が最も多く、９５％のブタが陽性であった。１４ｄｐｉに、ＥＩＩＭ及びＰＣ群は、それぞれ、６７％及び６５％の血清反応陽性ブタを有した。
ローソニア糞便ｑＰＣＲ：
全ての動物は、研究０日目（チャレンジの２８日前、－２８ｄｐｉ）のワクチン接種時にローソニアについて糞便ｑＰＣＲ陰性であった。チャレンジ時に、ＥＩＩＭＡＴＢ群の動物２匹は、ｑＰＣＲによりそれらの糞便中の検出可能なローソニアレベルを有した。ＰＣ群の動物のうちの１匹は、チャレンジ時に糞便１グラムあたり３４．１又は２５２／微生物のＣｔ値を有した。ローソニアの排出は、１４ｄｐｉにピークに達し、ピークに達した時点で、ＰＣ群は、糞便１グラムあたり平均６．８８ ｌｏｇ10微生物を排出した。この時点で、ＥＩＩＭ群は、それぞれ、糞便１グラムあたりｌｏｇ10微生物数５．９６の排出レベルを有するＰＣ群と比較して糞便排出の有意な（ｐ＜０．０５）低減をもたらした。２１ｄｐｉに、ＥＩＩＭ群は、チャレンジ実施動物の中で最も少ないローソニアを排出した群であり、糞便１グラムあたりのｌｏｇ10微生物数は平均３．２０であった。これは、糞便１グラムあたり平均４．６４ ｌｏｇ10微生物を排出したワクチン非接種ＰＣ群より有意に少なかった（図６）。ＥＩＩＭＡＴＢ群もまた、比較的程度は低いがＰＣと比較して排出を減少させ、糞便１グラムあたりのｌｏｇ10微生物数は平均４．０５であった（図６）。
微視的病変及びローソニアＩＨＣ：
微視的病変を、剖検時に採取した回腸終端部のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により測定した。最も重症度の高い病変を発症した群は、２．０５の平均病変スコアを有したＰＣ群であり、ＮＣ群の動物は病変を発症せず、このことにより、かさねてこの感染モデルの妥当性が実証された（図７）。重症度が最も低い病変を発症したワクチン接種群はＥＩＩＭ群であり、その平均スコアは、ＰＣ群から有意に低減された１．２９であった（図７、ｐ＜０．０５）。ＥＩＩＭＡＴＢ群は、ＥＩＩＭ群と比較して高いが同様の平均病変スコアを有し、その平均スコアは１．５７であった。
剖検時に採取してホルマリで固定した回腸終端部組織も、Ｌ．イントラセルラリス抗原についての免疫組織化学（ＩＨＣ）染色に供した。ＨＥ染色と同様に、最も高いスコアを有した群はＰＣ群であり、平均スコアはＮＣ群と比較して有意に（ｐ＜０．０５）増加した２．２３であり、このことにより、かさねてこの研究における疾患の感染及び再現の妥当性が実証された（図８）。かさねてＨＥスコアと同様に、ＥＩＩＭ群は、最も低い感度スコアを有したワクチン接種群であり、そのスコアは、ＰＣ群と比較して有意に低減された１．６３であった（ｐ＜０．０５）。
考察：
本研究は、筋肉内経路により投与した１用量２ｍｌの３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンと組み合わせたときの凍結乾燥された体裁のＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの有効性を調査した。加えて、ワクチン接種中に飼料中に提供したときのチアムリン及びクロルテトラサイクリンの干渉を評価した。
Ｌ．イントラセルラリスにより引き起こされるブタ増殖性腸炎（ＰＰＥ）は、特徴的な巨視的病変、微視的病変、Ｌ．イントラセルラリスの糞便排出、Ｌ．イントラセルラリスへのセロコンバージョン、臨床兆候、及び生産性能に対する影響の測定によれば、この研究で首尾よく再現された。Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと３ＦＬＥＸ（登録商標）の筋肉内投与用の組合せである「４ＦＬＥＸ」は、巨視的病変の重症度、微視的病変の重症度、臨床的下痢スコア、及びＬ．イントラセルラリスの糞便排出の有意義且つ有意な低減をもたらした。１日あたりの平均体重増加に関する、有意でないが数的な増加も、この処置群（ＥＩＩＭ）においてワクチン非接種の対照（ＰＣ）と比較して観察された。これらの結果は、筋肉内経路及びＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンの組合せが、ＰＰＥの予防の好適で効果のある選択肢であることを示す。このワクチンの組合せが安全であることも観察され、有害事象も注射部位反応も観察されなかった。
抗微生物剤をワクチン接種中に投与したとき、この研究で評価したパラメーターに変化が認められた。ＥＩＩＭＡＴＢ群ではワクチン非接種チャレンジ実施対照と比べて巨視的及び微視的病変の低減が観察されたが、これらのレベルは統計的有意性に達せず、数値的には抗微生物剤なしの同じ処置（ＥＩＩＭ）と比較して上昇された。しかし、ＥＩＩＭＡＴＢ群は、チャレンジ後に体重増加の数値が最も大きかったワクチン接種群であり（図４）、下痢の臨床スコアの変化の発生率の有意な低下があった（処置群間の臨床スコアの評価の表）。これらの結果は、抗微生物剤はワクチンの有効性に干渉し得るが、ローソニアに対して有効である試験した抗微生物剤の存在下でワクチン接種したときにも依然としてある程度の防御レベルが付与されたことを示す。
Ｎｏｇｕｅｉｒａ Ｍ．Ｇ．ら（Immunological responses to vaccination following experimental Lawsonia intracellularis virulent challenge in pigs. Vet Microbiol. 2013）もまた、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの筋肉内投与が、ワクチン非接種且つチャレンジ実施動物と比較して微視的病変の軽減及びＬ．イントラセルラリスの糞便排出の低減につながることを見いだした。その研究では、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ中に存在する生菌Ｌ．イントラセルラリス抗原が、いずれのアジュバントも用いずに単独で投与された。Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと３ＦＬＥＸ（登録商標）の組合せは、恐らく、ＩｍｐｒａｎＦＬＥＸ（登録商標）アジュバントを含むことに起因してワクチンに対する免疫応答を改善することができた。
本研究は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ３ＦＬＥＸ（登録商標）と組み合わせたＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓの筋肉内投与がＬ．イントラセルラリスに対する有意な防御をもたらすことを証明する。ワクチン接種中に投与した抗微生物剤の潜在的影響は不明であり、さらなる調査の正当な理由となる。しかし、抗微生物剤投与と併用の筋肉内ワクチン接種は、疾患のいくつかの関連パラメーターにおいて有意義な防御レベルを提供した。
（実施例３）
筋肉内投与されるＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）の有効性、および飼料グレードの抗微生物剤の存在を伴う有効性研究
序論：
Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓワクチンは、飲用水によって又は経口水薬によって投与される、ローソニア・イントラセルラリスに起因するブタ増殖性腸炎の予防のための、健康な離乳後のブタにおける使用が認可されている非常に有効な、成功を収めた商品である。筋肉内注射によって投与されるこの製品の、３ＦＬＥＸ（登録商標）と組み合わせられたときの及び併用抗微生物療法と共に投与されたときの有効性に関するデータは存在しない。
本実施例の目的は、１．３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチン接種と組み合わせて筋肉内注射によって投与したときのＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓワクチンの有効性を評価すること、及び２．飼料中の抗微生物剤併用処置を施したブタに投与したときのこのワクチンの組合せの有効性を評価することである。
図９は、ワクチンの配合を示す。
図１０は、研究のアウトラインを提供する。
主測定パラメーターは、巨視的病変スコア、微視的病変スコア及び糞便排出を含む。副次的測定パラメーターは、１日あたりの平均増加、臨床スコア及びセロコンバージョンを含む。
材料及び方法：
日齢１７～２１日の離乳後のブタを得、各々動物２４匹を有する３つの処置群に無作為に分けた。処置群は、ワクチン非接種の陽性チャレンジ対照（ＰＣ）；３（登録商標）ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与する群（ＥＩＩＭ）；抗微生物剤との併用投与で３（登録商標）ＦＬＥＸワクチンと共にＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）ＩｌｅｉｔｉｓをＩＭ投与する群（ＥＩＩＭＡＴＢ）であった。ワクチン調製は、凍結乾燥形態のＥｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓを３ＦＬＥＸ（登録商標）ワクチンで再構成することにより行った。この結果、改変された生菌ローソニア・イントラセルラリス抗原をＰＣＶ２、Ｍ．ｈｙｏ．及びＰＲＲＳＶ ＭＬＶワクチン画分と一緒に含有する最終２ｍｌ用量を得た。飼料中の抗微生物剤での処置が、生の改変Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓワクチンによるワクチン接種の有効性を阻害するかどうかを調査するために、ＥＩＩＭＡＴＢ群に、飼料中のチアムリン（３５ｐｐｍ）及びクロルテトラサイクリン（４００ｐｐｍ）を施し、これをワクチン接種の１週間前に開始してワクチン接種の１週間後まで続けた。ワクチン接種の２８目後に毒性ローソニア・イントラセルラリスを含有する消化管ホモジネートによるチャレンジを全ての動物に対して実施し、２１日後に剖検を行った。臨床兆候、１日あたりの平均体重増加（ＡＤＧ）、糞便排出、並びに巨視的及び微視的病変を剖検時に評価した。
結果:
どちらのワクチン接種処置群も、下痢の臨床スコアの有意な低減に至った（Ｐ＜０．０５）。両方のワクチン接種群は、チャレンジ後にＡＤＧの増加にも至った。チャレンジ対照群は、１．４３ｌｂのチャレンジ後ＡＤＧを有したが、ＥＩＩＭ及びＥＩＩＭＡＴＢ群は、それぞれ、１．６５及び１．７１ｌｂのＡＤＧを有した（Ｐ＜０．０５）。巨視的病変スコアは、両方のワクチン接種群において値が０．６７及び１．０４であり、１．５５の平均スコアを有したワクチン非接種群と比較して減少された。同様に、微視的病変も、ＥＩＩＭ及びＥＩＩＭＡＴＢ群でのそれぞれ１．２９及び１．５７の平均値と比較してＰＣ群での平均スコアが２．０５であり、ワクチン接種によって減少された。このＩＭワクチン組合せが安全であると判明したので、有害反応なしと記述した。
結論：
ローソニアチャレンジ後のワクチン非接種群と比較して２つの注射ワクチン群は、ＡＤＧを改善し、巨視的及び微視的病変スコアの低減をもたらし、ローソニアの排出を低減させ、臨床兆候を低減させた。Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓと３ＦＬＥＸ（登録商標）筋肉内ワクチンの組合せで、抗微生物剤干渉の証拠は、観察されなかった。この研究は、さらなる調査の正当な理由となる、豚生産者用の新しいツールを明らかにした。
（実施例４）
筋肉内投与されるローソニアＡＬＣワクチンと組合せたブタサーコウイルス２ａ型（ＰＣＶ２ａ）ＯＲＦ２ ＶＬＰワクチンの有効性
本研究の目的は、３週齢のブタにおいて筋肉内投与したローソニアＡＬＣ（無毒の生きた培養物）ワクチン（Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ、凍結乾燥状態）との組合せでのブタサーコウイルス２ａ型（ＰＣＶ２ａ）ＯＲＦ２ ＶＬＰワクチンの、４週間後のブタサーコウイルス２ａ型チャレンジに対する有効性を実証することである。
ブタを本研究への登録時に無作為化する。ワクチン接種段階の間は、ブタを同腹仔と共に畜舎に入れる。下の表を参照して、０日目のブタは、ワクチン接種時に２１±３日である。ＰＣＶ２ａ ＯＲＦ２ ＶＬＰワクチン（Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標））をＬ．イントラセルラリスＡＬＣ（無毒の生きた培養物；Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ、凍結乾燥状態）と併せ、Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ Ｉｌｅｉｔｉｓ凍結乾燥物を、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸで再構成する（第１群）。第２群（ローソニアの無毒の生きた培養物、一価）は、無毒のローソニア、並びに食塩水及びアジュバントカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）を含み、食塩水及びアジュバントカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）を含むのは、カルボポール及び食塩水がＩｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標）中に存在するからであり、したがって、カルボポール及び食塩水は、第１及び３群にも存在する。第３群（ＰＣＶ２ ＶＬＰ、一価）は、ＰＣＶ２ａ ＯＲＦ２ ＶＬＰを含む。ＮＴＸ群は、非処置対照として役立つブタ６匹からなる。注射部位反応及びアナフィラキシーを含む接種に対するあらゆる有害反応について、ブタを観察する。
ローソニアＡＬＣ（無毒の生きた培養物；Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ、凍結乾燥状態）及びＰＣＶ２ａ ＯＲＦ２ ＶＬＰ（Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ（登録商標））は、商標登録されている周知の家畜ワクチンである。しかし、ＷＯ２００６／０７２０６５及びＷＯ２００８／０７６９１５には、ＰＣＶワクチンの生成、その製剤及びその投与が記載されている。ＷＯ９６／３９６２９及びＷＯ０５／０１１７３１には、ローソニア・イントラセルラリスの培養、弱毒化ローソニア・イントラセルラリス及びその投与が記載されている。
チャレンジの前（Ｄ２７）にブタを混ぜる。ＮＴＸ群をＤ２０に剖検して、ブタがワクチン接種段階の間に野生型ＰＣＶ２に曝露されていないことを確証する。２８日目に、筋肉内注射及び鼻腔内投与によって毒性ＰＣＶ２ａ（４．７７ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／２ｍＬ用量）によるチャレンジをブタに実施する。２７日目に開始して研究の残りの間ずっと糞便の硬さ、身体状態及び行動に基づいて臨床スコアを割り当てる。
剖検
チャレンジの２２日後に第１～３群の動物を安楽死させ剖検する。リンパ節及び回腸を評価し、スコアリングし、病理組織診断及び免疫組織化学検査のために採取する。
Figure 0007657287000010
 全ての臓器及び注射部位領域の異常についての一般検査を剖検中に完了する。扁桃腺、気管支リンパ節（ＴＢＬＮ）、腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）、外腸骨リンパ節（ＩＬＮ）、及び回腸の試料を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定する。標準的な手順に従って試料を処理し、病理組織診断のためにヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）により、及びＰＣＶ２抗原について免疫組織化学検査（ＩＨＣ）により評価する。組織のスコアリングは、下記のスコアリングシステムに従って行う。
Figure 0007657287000011
リンパ球枯渇
４種のリンパ系組織試料（扁桃腺、ＴＢＬＮ、ＭＬＮ、ＩＬＮ）又は回腸のうちの１種又は複数種が、リンパ節枯渇について組織学的に陽性（スコア＞０）であった場合、ブタを陽性と見なす。
リンパ球定着
４種のリンパ系組織試料（扁桃腺、ＴＢＬＮ、ＭＬＮ、ＩＬＮ）又は回腸のうちの１種又は複数種が、ＩＨＣによりＰＣＶ２リンパ球定着について陽性（スコア＞０）であった場合、ブタを陽性と見なす。
組織結果（病理組織診断及び免疫組織化学検査）
下の表に提示する結果は、組織スコライング表に記載の陽性スコア（１、２、３のスコア）を有したあらゆる組織を表す。パーセンテージは、群内のブタの総数のうちの陽性スコアを有するブタの数を示す。
Figure 0007657287000012
第２群における結果は、無毒の生きたローソニアワクチンによるワクチン接種のみを施した動物がＰＣＶ２による感染の高い発生率を示すため、チャレンジが成功したことを示す。さらに、結果は、第１群がＰＣＶ２感染の臨床兆候を一切示さないので、ＰＣＶ２ワクチンが、無毒の生きたローソニアワクチンとの組合せで効果があることを示す。第１群（ローソニアの無毒の生きた培養物＋ＰＣＶ２ ＶＬＰ；二価ワクチン）は、ＰＣＶ２ワクチンによるワクチン接種のみを施した第３群（ＰＣＶ２ ＶＬＰ、一価ワクチン）と同様に行動する。このように、ＰＣＶ２ワクチンを無毒の生きたローソニアワクチンと組み合わせたとき、いかなる干渉も観察されない。

Claims (18)

  1. ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）の抗原と、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）の１種又は複数種の抗原、および１種又は複数種のアジュバントを含む、動物の防御免疫応答を惹起するための方法における使用のためのワクチンであって、前記方法は前記ワクチンを動物に投与することを含み、前記ワクチンは筋肉内投与または皮内投与され、前記ローソニア・イントラセルラリスの抗原が生菌ローソニア・イントラセルラリスであり、前記PCVの抗原が組換えポリペプチドである、前記ワクチン。
  2. さらに、
    Ｍ．ｈｙｏ、または、
    ＰＲＲＳＶ、または、
    ＰＲＲＳＶ及びＭ．ｈｙｏ．、
    の１以上を病原体の抗原を含む、請求項１に記載のワクチン。
  3. 組換えポリペプチドがＰＣＶ ＯＲＦ２タンパク質である、請求項１または２に記載のワクチン。
  4. Ｍ．ｈｙｏ．の抗原がバクテリンである、請求項２または３に記載のワクチン。
  5. ＰＲＲＳＶの抗原が生ＰＲＲＳＶウイルスである、または、前記生ＰＲＲＳＶウイルスが弱毒化ウイルスである、請求項２～４のいずれか１項に記載のワクチン。
  6. 生菌ローソニア・イントラセルラリスが、改変された生菌ローソニア・イントラセルラリスである、または、前記生菌ローソニア・イントラセルラリスが、弱毒化ローソニア・イントラセルラリスである、請求項１～５のいずれか１項に記載のワクチン。
  7. アジュバントがカルボマーである、請求項６に記載のワクチン。
  8. 生菌ローソニア・イントラセルラリスが弱毒化ローソニア・イントラセルラリスであり、及び／又は前記ＰＣＶの抗原がＰＣＶ ＯＲＦ２遺伝子により発現される組換えポリペプチドである、請求項１～７のいずれか１項に記載のワクチン。
  9. Ｍ．ｈｙｏ．の抗原がバクテリンであり、及び／又はＰＲＲＳＶの抗原が弱毒化ＰＲＲＳＶウイルスである、請求項２～７のいずれか１項に記載のワクチン。
  10. 動物がブタである、請求項１～９のいずれか１項に記載のワクチン。
  11. 方法が、動物のローソニア・イントラセルラリス及び／又はＰＣＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のワクチン。
  12. 方法が、動物のＭ．ｈｙｏ．及び／又はＰＲＲＳＶに対する防御免疫応答を惹起するための方法である、請求項２～１１のいずれか１項記載のワクチン。
  13. 筋肉内投与される、及び／又は1用量として投与される、請求項１～１２のいずれか１項に記載のワクチン。
  14. 動物が、１種又は複数種の抗生物質で同時に処置／併用処置される、請求項１～１３のいずれか１項に記載のワクチン。
  15. 方法が、動物において少なくとも１種の病原体により引き起こされる臨床疾患に対して前記動物を免疫化するための方法であり、ワクチンが、感染の臨床兆候を引き起こさないが、前記少なくとも１種の病原体の病原型に対して前記動物を免疫化する免疫応答を誘導できる、請求項１～１４のいずれか１項に記載のワクチン。
  16. ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物における腸の病変を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して軽減するための防御免疫応答である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の使用のワクチン。
  17. 腸の病変が回腸の病変である、または、腸の病変が巨視的病変及び／又は微視的病変である、請求項１６に記載のワクチン。
  18. ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物の糞便排出を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して低減させるための防御免疫応答である、または、ローソニア・イントラセルラリスに対する防御免疫応答が、動物の１日あたりの平均体重増加を同じ種の非免疫化対照群の動物と比較して増加させるための防御免疫応答である、請求項１～１７のいずれか１項に記載のワクチン。
JP2023504581A 2020-07-24 2021-07-22 組合せブタワクチン Active JP7657287B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024193753A JP2025026461A (ja) 2020-07-24 2024-11-05 組合せブタワクチン

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063055947P 2020-07-24 2020-07-24
US63/055,947 2020-07-24
EP20196349 2020-09-16
EP20196349.3 2020-09-16
PCT/US2021/042778 WO2022020593A2 (en) 2020-07-24 2021-07-22 Combination porcine vaccine

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024193753A Division JP2025026461A (ja) 2020-07-24 2024-11-05 組合せブタワクチン

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023535066A JP2023535066A (ja) 2023-08-15
JP7657287B2 true JP7657287B2 (ja) 2025-04-04

Family

ID=77274829

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023504581A Active JP7657287B2 (ja) 2020-07-24 2021-07-22 組合せブタワクチン
JP2024193753A Pending JP2025026461A (ja) 2020-07-24 2024-11-05 組合せブタワクチン

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2024193753A Pending JP2025026461A (ja) 2020-07-24 2024-11-05 組合せブタワクチン

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20230241198A1 (ja)
EP (1) EP4185321A2 (ja)
JP (2) JP7657287B2 (ja)
KR (1) KR20230044474A (ja)
CN (1) CN116157147A (ja)
AU (1) AU2021311726A1 (ja)
BR (1) BR112023001324A2 (ja)
CA (1) CA3185751A1 (ja)
CL (1) CL2023000118A1 (ja)
CO (1) CO2023000299A2 (ja)
MX (1) MX2023001024A (ja)
WO (1) WO2022020593A2 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116036260A (zh) * 2022-12-30 2023-05-02 哈药集团生物疫苗有限公司 猪圆环病毒、猪肺炎支原体、猪塞内卡病毒三联灭活疫苗及其制备方法和应用
WO2024260953A1 (en) * 2023-06-23 2024-12-26 Intervet International B.V. A method of culturing lawsonia intracellularis bacteria
CN118894910A (zh) * 2024-07-24 2024-11-05 华南农业大学 一种PRRSV-GP3-GP5-M+PCV2-TBCap重组蛋白、疫苗及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008545618A (ja) 2005-03-14 2008-12-18 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド ローソニア・イントラセルラリスを含む免疫原性組成物
JP2016531859A (ja) 2013-09-27 2016-10-13 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 室温安定であるワクチンの乾燥製剤

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
DE3584341D1 (de) 1984-08-24 1991-11-14 Upjohn Co Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa.
EP0587780B2 (en) 1991-06-06 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits
EP0601062B2 (en) 1991-08-26 2000-12-13 Regents Of The University Of Minnesota Sirs vaccine and diagnosis method
US6042830A (en) 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
AU2696792A (en) 1991-09-16 1993-04-27 David A Benfield Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
CA2121241C (en) 1991-10-14 2007-12-04 Nicolaas Visser Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
EP0676467B1 (en) 1994-04-11 2001-10-04 Akzo Nobel N.V. European vaccine strains of the porcine reproductive respiratory syndrome virus (PRRSV)
US5788962A (en) 1995-01-17 1998-08-04 The Curators Of The University Of Missouri DNA sequences coding for mycoplasma hyopneumoniae surface antigens, corresponding proteins and use in vaccines and diagnostic procedures
DE69632658T2 (de) 1995-03-14 2005-06-09 Akzo Nobel N.V. Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom
US5885823A (en) 1995-06-05 1999-03-23 Nobl Laboratories, Inc. Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents
ATE199022T1 (de) 1996-10-09 2001-02-15 Akzo Nobel Nv Europäische vakzinstämme des fortplanzungs- atmungs-syndromsvirus des sweins (prrsv)
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
UA78180C2 (uk) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US7312065B2 (en) * 2003-07-25 2007-12-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Lawsonia intracellularis of European origin and vaccines, diagnostic agents and methods of use thereof
US7833707B2 (en) 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
DK1968630T5 (en) * 2005-12-29 2018-08-13 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc MULTIVALENT PCV2 IMMUNOGENIC COMPOSITIONS.
SG170792A1 (en) 2005-12-29 2011-05-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Use of a pcv2 immunogenic composition for lessening clinical symptoms in pigs
WO2008076915A2 (en) 2006-12-15 2008-06-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Treatment of pigs with pcv2 antigen
CN101980720A (zh) 2008-01-23 2011-02-23 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法
US8444989B1 (en) 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
DK2675475T3 (en) 2011-02-17 2015-09-14 Boehringer Ingelheim Vetmed NEW EUROPEAN PRRSV TRIAL
MY183980A (en) 2011-02-17 2021-03-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Commercial scale process for production of prrsv
US9120859B2 (en) * 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
TWI670085B (zh) * 2014-02-19 2019-09-01 荷蘭商英特威國際公司 液體穩定之豬病毒疫苗

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008545618A (ja) 2005-03-14 2008-12-18 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド ローソニア・イントラセルラリスを含む免疫原性組成物
JP2016531859A (ja) 2013-09-27 2016-10-13 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 室温安定であるワクチンの乾燥製剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Schweizer Archiv fur Tierheikunde ，2012年，Vol. 154, No. 10, pp. 445-450

Also Published As

Publication number Publication date
CL2023000118A1 (es) 2023-09-08
WO2022020593A2 (en) 2022-01-27
KR20230044474A (ko) 2023-04-04
MX2023001024A (es) 2023-02-15
US20230241198A1 (en) 2023-08-03
BR112023001324A2 (pt) 2023-02-14
WO2022020593A3 (en) 2022-02-24
CN116157147A (zh) 2023-05-23
EP4185321A2 (en) 2023-05-31
JP2023535066A (ja) 2023-08-15
AU2021311726A1 (en) 2023-02-09
CA3185751A1 (en) 2022-01-27
CO2023000299A2 (es) 2023-01-26
JP2025026461A (ja) 2025-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10780156B2 (en) Treatment of pigs with PCV2 antigen
CN102698263B (zh) 多价pcv2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法
JP5701191B2 (ja) Ｐｃｖ２免疫原性組成物および組成物を製造する方法
RU2522849C2 (ru) Лечение prdc у молодых свиней
AU2017353380B2 (en) Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof
US12433942B2 (en) Porcine circovirus type 3 (PCV3) vaccines, and production and uses thereof
US20090317423A1 (en) Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
JP2025026461A (ja) 組合せブタワクチン
CN102660578B (zh) Pcv2免疫原性组合物和产生这种组合物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230131

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230131

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20231226

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231227

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240313

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20240702

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20241105

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20241112

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20250225

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20250325

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7657287

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150