JP7636870B2 - Resin membrane and cell culture vessel - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養用足場材料からなる樹脂膜に関する。また、本発明は、上記樹脂膜を用いた細胞培養用容器にも関する。 The present invention relates to a resin film made of a scaffold material for cell culture. The present invention also relates to a cell culture vessel using the resin film.
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）やヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）等のヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、創薬や再生医療への応用が期待されている。このような応用を果たすには、多能性幹細胞を安全に、かつ再現性良く培養し、増殖させることが必須である。特に、再生医療の産業上利用に際しては、幹細胞を未分化状態で多量に扱う必要がある。そのため、天然高分子や合成高分子を用いた培養方法について種々検討されている。 Human pluripotent stem cells (hPSCs), such as human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), are expected to be applied to drug discovery and regenerative medicine. To achieve such applications, it is essential to safely and reproducibly culture and proliferate pluripotent stem cells. In particular, for industrial use in regenerative medicine, it is necessary to handle large quantities of stem cells in an undifferentiated state. For this reason, various culture methods using natural and synthetic polymers are being investigated.
例えば、下記の非特許文献１では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の増殖用足場材料として、フィブロネクチンを縮合反応させたポリ（ビニルアルコール－ビニルアセタール－イタコン酸）共重合体が提案されている。この足場材料は、親水性及び耐水性に優れているとされている。 For example, the following non-patent document 1 proposes a poly(vinyl alcohol-vinyl acetal-itaconic acid) copolymer obtained by a condensation reaction of fibronectin as a scaffold material for the proliferation of iPS cells and ES cells. This scaffold material is said to have excellent hydrophilicity and water resistance.
また下記の特許文献１には、カチオンとしてＤＭＡＥＭＡ、アニオンとしてアクリル酸、核酸またはヘパリンを使用した足場材料が開示されている。 Furthermore, the following Patent Document 1 discloses a scaffolding material that uses DMAEMA as a cation and acrylic acid, nucleic acid, or heparin as an anion.
また下記の特許文献２には、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の培養に用いられる足場材料として、親水かつ柔軟なポリロタキサンゲルで被覆された表面を有する培養容器が開示されている。
In addition, the following
幹細胞の未分化性や分化特性が、増殖性に関与していることが知られており、これを制御する技術が求められている。従来、天然高分子としてのラミニンやヴィトロネクチン等の接着たんぱく質や、マウス肉腫由来のマトリゲルを用いると、播種後の細胞定着性が非常に高いことが知られている。 It is known that the undifferentiated and differentiated characteristics of stem cells are involved in their proliferation, and there is a demand for technology to control this. It has been known that the use of adhesive proteins such as laminin and vitronectin, which are natural polymers, or matrigel derived from mouse sarcoma, results in very high cell adhesion after seeding.
もっとも、天然高分子やマウス肉腫由来のマトリゲル等を用いる方法では、操作が煩雑であり、コストが高くつきがちであった。また、安全性の面でも問題があった。そこで、前述した非特許文献１、特許文献１及び特許文献２に記載のような合成高分子を用いた足場材料が種々提案されている。
However, methods using natural polymers or mouse sarcoma-derived Matrigel tend to require complicated operations and are expensive. There are also safety issues. Therefore, various scaffold materials using synthetic polymers such as those described in the above-mentioned Non-Patent Document 1, Patent Document 1, and
しかしながら、非特許文献１に記載の細胞足場材料では、フィブロネクチンを含まない場合、すなわち、合成高分子だけの場合には、細胞が伸展せずに収縮し、浮遊するという問題があった。 However, the cell scaffold material described in Non-Patent Document 1 had the problem that when it did not contain fibronectin, i.e., when it contained only synthetic polymers, the cells contracted and floated without spreading.
また、特許文献１に記載の細胞足場材料では、イオン性による親水性が高く、細胞塊の収縮や細胞の凝集を引き起こすという問題があった。 In addition, the cell scaffold material described in Patent Document 1 has a problem in that it is highly hydrophilic due to its ionic nature, which causes shrinkage of cell clusters and cell aggregation.
さらに、特許文献２に記載の細胞足場材料では、親水性が高いため、膨潤しやすかった。そのため、播種した細胞が培養中に足場材料から剥離しやすく、細胞の定着性が低いという問題があった。
Furthermore, the cell scaffold material described in
本発明の目的は、細胞の培養に際しての細胞塊の収縮が生じ難く、細胞の伸展性に優れた細胞培養用足場材料からなる樹脂膜及び細胞培養用容器を提供することにある。 The object of the present invention is to provide a resin film and a cell culture vessel made of a cell culture scaffold material that is less susceptible to shrinkage of cell aggregates during cell culture and has excellent cell extensibility.
本発明に係る樹脂膜は、合成樹脂を含有する細胞培養用足場材料からなる樹脂膜であって、ｐＨ７．０におけるゼータ電位が、－４０ｍＶ以上であり、表面自由エネルギーの分散項成分が２４．５ｍＪ／ｍ２以上、４５ｍＪ／ｍ２以下である。 The resin film of the present invention is a resin film made of a scaffold material for cell culture containing a synthetic resin, and has a zeta potential of -40 mV or more at pH 7.0 and a dispersion term component of the surface free energy of 24.5 mJ/ m2 or more and 45 mJ/ m2 or less.
本発明に係る樹脂膜のある特定の局面では、前記表面自由エネルギーの極性項成分が１ｍＪ／ｍ２以上、２０ｍＪ／ｍ２以下である。 In a specific aspect of the resin film according to the present invention, the polar term component of the surface free energy is 1 mJ/ m2 or more and 20 mJ/ m2 or less.
本発明に係る樹脂膜の他の特定の局面では、ｐＨ７．０におけるゼータ電位が＋３０ｍＶ以下である。 In another specific aspect of the resin film of the present invention, the zeta potential at pH 7.0 is +30 mV or less.
本発明に係る樹脂膜のさらに他の特定の局面では、１００℃における貯蔵弾性率が１×１０４Ｐａ以上、１×１０８Ｐａ以下であり、２５℃における貯蔵弾性率と１００℃における貯蔵弾性率との比（（２５℃における貯蔵弾性率）／（１００℃における貯蔵弾性率））が１×１０以上、１×１０５以下である。 In still another specific aspect of the resin film according to the present invention, the storage modulus at 100°C is 1 x 104 Pa or more and 1 x 108 Pa or less, and the ratio of the storage modulus at 25°C to the storage modulus at 100°C ((storage modulus at 25°C)/(storage modulus at 100°C)) is 1 x 10 or more and 1 x 105 or less.
本発明に係る樹脂膜のさらに他の特定の局面では、前記合成樹脂は、構成単位中にブレンステッド塩基性基を０．２モル％以上、２０モル％以下で含む。 In yet another specific aspect of the resin film according to the present invention, the synthetic resin contains 0.2 mol % or more and 20 mol % or less of Bronsted basic groups in the structural units.
本発明に係る樹脂膜のさらに他の特定の局面では、水膨潤倍率が５０％以下である。 In yet another specific aspect of the resin film of the present invention, the water swelling ratio is 50% or less.
本発明に係る樹脂膜のさらに他の特定の局面では、前記細胞培養用足場材料が、動物由来の原料を実質的に含まない。 In yet another specific aspect of the resin film of the present invention, the scaffold material for cell culture is substantially free of animal-derived raw materials.
本発明に係る樹脂膜のさらに他の特定の局面では、前記合成樹脂がビニル重合体を含む。 In yet another specific aspect of the resin film according to the present invention, the synthetic resin includes a vinyl polymer.
本発明に係る樹脂膜のさらに他の特定の局面では、前記合成樹脂が、少なくともポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステルを含む。 In yet another specific aspect of the resin film according to the present invention, the synthetic resin contains at least a polyvinyl alcohol derivative or a poly(meth)acrylic acid ester.
本発明に係る細胞培養用容器は、細胞の培養領域の少なくとも一部に本発明に従って構成される樹脂膜を備える。 The cell culture vessel according to the present invention has a resin membrane constructed according to the present invention in at least a portion of the cell culture area.
本発明に係る樹脂膜及び細胞培養用容器によれば、細胞の培養に際し、細胞塊の収縮を抑制しつつ、細胞の伸展性を高めることができる。 The resin film and cell culture vessel according to the present invention can increase the extensibility of cells while suppressing the shrinkage of cell aggregates during cell culture.
以下、図面を参照しつつ、本発明の具体的な実施形態を説明することにより、本発明を明らかにする。 The present invention will be clarified below by explaining specific embodiments of the present invention with reference to the drawings.
本発明に係る樹脂膜は、細胞を培養するために用いられる。 The resin film of the present invention is used for culturing cells.
本発明に係る樹脂膜は、合成樹脂を含有する細胞培養用足場材料からなる樹脂膜である。本発明に係る樹脂膜のｐＨ７．０におけるゼータ電位は、－４０ｍＶ以上であり、表面自由エネルギーの分散項成分は、２４．５ｍＪ／ｍ２以上、４５ｍＪ／ｍ２以下である。 The resin film according to the present invention is a resin film made of a scaffold material for cell culture containing a synthetic resin. The resin film according to the present invention has a zeta potential of -40 mV or more at pH 7.0, and a dispersion term component of the surface free energy of 24.5 mJ/ m2 or more and 45 mJ/ m2 or less.
本発明に係る樹脂膜では、ゼータ電位及び表面自由エネルギーの分散項成分が上記特定の範囲にあるため、細胞の培養に際し、細胞塊の収縮が生じ難く、細胞の伸展性を高めることができる。以下、これを説明する。 In the resin film according to the present invention, the dispersion term components of the zeta potential and surface free energy are within the above-mentioned specific ranges, so that shrinkage of cell aggregates is unlikely to occur during cell culture, and cell extensibility can be increased. This is explained below.
（ゼータ電位）
本発明に係る樹脂膜のゼータ電位は、樹脂膜を溶液中に配置した場合、界面である樹脂膜の表面と、樹脂膜の表面から十分に離れた溶液中のバルク部分との電位差である。ゼータ電位は、測定対象物の形状に応じて、流動電位法、電気泳動法、電気浸透法等の方法を適宜選択し求めることができる。
(Zeta potential)
The zeta potential of the resin film according to the present invention is the potential difference between the surface of the resin film, which is the interface, and a bulk part in the solution sufficiently distant from the surface of the resin film when the resin film is placed in the solution. The zeta potential can be determined by appropriately selecting a method such as a streaming potential method, an electrophoresis method, or an electroosmosis method according to the shape of the object to be measured.
例えば、測定対象物が膜である場合は、流動電位法により測定することができる。また、測定対象物が繊維である場合、粒子である場合は電気浸透法により測定することができる。 For example, if the object to be measured is a membrane, it can be measured by the streaming potential method. If the object to be measured is a fiber or a particle, it can be measured by the electroosmosis method.
したがって、本発明に係る樹脂膜のゼータ電位は、流動電位法により測定されたゼータ電位であることが好ましい。流動電位法は、例えば、アントンパール社製ゼータ電位測定機器により測定することができる。具体的には、ＫＣｌ希薄溶液中にて、後述の実施例に記載された方法により測定することができる。電気泳動法としては、例えば、ゼータ電位・粒径・分子量測定システム（大塚電子社製）を用いて、水中で光散乱することにより、測定する方法が挙げられる。 Therefore, the zeta potential of the resin film according to the present invention is preferably a zeta potential measured by a streaming potential method. The streaming potential method can be performed, for example, using a zeta potential measuring device manufactured by Anton Paar. Specifically, it can be measured in a dilute KCl solution by the method described in the Examples below. An example of the electrophoretic method is a method in which the measurement is performed by light scattering in water using a zeta potential/particle size/molecular weight measuring system (manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd.).
本発明に係る樹脂膜では、ｐＨ７．０におけるゼータ電位が、－４０ｍＶ以上であるので、細胞の伸展性を高めることができる。 The resin membrane of the present invention has a zeta potential of -40 mV or more at pH 7.0, which can increase cell extensibility.
細胞の伸展性の評価は、シェイプファクター（ＳＦ）を求めることにより評価することができる。 The extensibility of cells can be evaluated by determining the shape factor (SF).
ここで、シェイプファクター（ＳＦ）とは、細胞を培養した後の細胞塊の平面視における領域の形状評価係数であり、ＳＦ＝４×π×(細胞塊の平面積)／（細胞塊の外周縁の長さ）２で求められる。 Here, the shape factor (SF) is a coefficient for evaluating the shape of an area of a cell cluster in a planar view after the cells are cultured, and is calculated as SF = 4 x π x (planar area of the cell cluster) / (length of the outer periphery of the cell cluster) 2 .
図２に示すように、上記ＳＦが１であれば、細胞塊の平面形状は円形となる。ＳＦが小さくなるほど、円から遠ざかり、細胞塊の収縮が生じ難く、かつ細胞の伸展性が高くなる。例えば、図２に示す星形形状の場合、ＳＦは０．３であり、ＳＦ＝１の円の場合よりも伸展性に優れているといえる。 As shown in Figure 2, if the SF is 1, the planar shape of the cell cluster will be circular. The smaller the SF, the further away from a circle the cell cluster will be, making it less likely for contraction of the cell cluster to occur and increasing the extensibility of the cells. For example, in the case of the star shape shown in Figure 2, the SF is 0.3, which is superior to the extensibility of a circle with SF = 1.
本発明では、上記ゼータ電位が－４０ｍＶ以上であるため、上記ＳＦ値を小さくすることができ、細胞の伸展性を高めることができる。上記樹脂膜のｐＨ７．０におけるゼータ電位は、好ましくは－３５ｍＶ以上、より好ましくは－３０ｍＶ以上、さらに好ましくは－２５ｍＶ以上、特に好ましくは－２０ｍＶ以上であり、好ましくは＋３０ｍＶ以下、より好ましくは＋３０ｍＶ未満、さらに好ましくは＋２５ｍＶ未満、特に好ましくは＋２０ｍＶ未満である。この場合には、ＳＦ値をより一層小さくすることができ、細胞の伸展性をより一層高めることができる。 In the present invention, since the zeta potential is -40 mV or more, the SF value can be reduced and the extensibility of cells can be increased. The zeta potential of the resin membrane at pH 7.0 is preferably -35 mV or more, more preferably -30 mV or more, even more preferably -25 mV or more, particularly preferably -20 mV or more, and is preferably +30 mV or less, more preferably less than +30 mV, even more preferably less than +25 mV, particularly preferably less than +20 mV. In this case, the SF value can be further reduced and the extensibility of cells can be further increased.
上記ゼータ電位は、上記合成樹脂においてアミノ基等のカチオン性官能基の含有量を増やすことにより、高めることができる。また、上記ゼータ電位は、上記合成樹脂においてカルボキシル基等のアニオン性官能基の含有量を増やすことにより、低くすることができる。 The zeta potential can be increased by increasing the content of cationic functional groups, such as amino groups, in the synthetic resin. The zeta potential can be decreased by increasing the content of anionic functional groups, such as carboxyl groups, in the synthetic resin.
（表面自由エネルギー）
細胞塊の収縮を抑え、細胞の伸展性を高める観点から、本発明に係る樹脂膜の表面自由エネルギーの分散項成分は、２４．５ｍＪ／ｍ２以上、４５ｍＪ／ｍ２以下である。上記分散項成分は、２９．０ｍＪ／ｍ２以上、４５．０ｍＪ／ｍ２未満であることが好ましく、３０．０ｍＪ／ｍ２以上、３６．０ｍＪ／ｍ２未満であることがより好ましい。この場合には、細胞塊の収縮をより一層抑え、細胞の伸展性をより一層高めることができる。
(Surface Free Energy)
From the viewpoint of suppressing the contraction of cell clusters and enhancing the extensibility of cells, the dispersion term component of the surface free energy of the resin film according to the present invention is 24.5 mJ/ m2 or more and 45 mJ/ m2 or less. The dispersion term component is preferably 29.0 mJ/ m2 or more and less than 45.0 mJ/ m2 , and more preferably 30.0 mJ/ m2 or more and less than 36.0 mJ/ m2 . In this case, the contraction of cell clusters can be further suppressed and the extensibility of cells can be further enhanced.
本発明に係る樹脂膜の表面自由エネルギーの極性項成分は、１ｍＪ／ｍ２以上、２０ｍＪ／ｍ２以下であることが好ましく、１．０ｍＪ／ｍ２以上、１０．０ｍＪ／ｍ２未満であることがより好ましく、１．５ｍＪ／ｍ２以上、６．０ｍＪ／ｍ２未満であることがさらに好ましい。この場合には、細胞塊の収縮をより一層抑え、細胞の伸展性をより一層高めることができる。 The polar term component of the surface free energy of the resin film according to the present invention is preferably 1 mJ/ m2 or more and 20 mJ/m2 or less, more preferably 1.0 mJ/ m2 or more and less than 10.0 mJ/ m2 , and even more preferably 1.5 mJ/ m2 or more and less than 6.0 mJ/ m2 . In this case, the contraction of the cell aggregate can be further suppressed and the extensibility of the cells can be further increased.
なお、上記表面自由エネルギーの分散項成分γｄ及び極性項成分である双極子成分γｐは、Ｋａｅｌｂｌｅ－Ｕｙの理論式を用いて算出される。Ｋａｅｌｂｌｅ－Ｕｙの理論式は、下記式（１）で示されるように、トータル表面自由エネルギーγが、分散項成分γｄと双極子成分γｐとの和になるとの仮定に基づく理論式である。 The dispersion term component γd and the dipole component γp , which is the polar term component, of the surface free energy are calculated using the Kaelble-Uy theoretical formula. The Kaelble-Uy theoretical formula is based on the assumption that the total surface free energy γ is the sum of the dispersion term component γd and the dipole component γp , as shown in the following formula (1).
また、Ｋａｅｌｂｌｅ－Ｕｙの理論式では、液体の表面自由エネルギーをγｌ（ｍＪ／ｍ２）とし、固体の表面自由エネルギーをγｓ（ｍＪ／ｍ２）とし、接触角をθ（°）とすると、下記式（２）が成立する。 In addition, in the Kaelble-Uy theoretical formula, if the surface free energy of the liquid is γ l (mJ/m 2 ), the surface free energy of the solid is γ s (mJ/m 2 ), and the contact angle is θ (°), the following formula (2) holds.
したがって、液体の表面自由エネルギーγｌが既知である液体を２種類用いて、上記樹脂膜に対するそれぞれの接触角θを測定し、γｓ ｄ及びγｓ ｐの連立方程式を解くことにより、上記樹脂膜の表面自由エネルギーの分散項成分γｄ及び双極子成分γｐを求めることができる。 Therefore, by using two types of liquids whose surface free energies γl are known, measuring the contact angles θ of each with respect to the resin film, and solving the simultaneous equations for γsd and γsp , the dispersion term component γd and dipole component γp of the surface free energy of the resin film can be obtained.
なお、本明細書においては、上記表面自由エネルギーγｌが既知である２種類の上記液体として、純水及びジヨードメタンが用いられている。 In this specification, pure water and diiodomethane are used as the two types of liquids whose surface free energy γ 1 is known.
上記接触角θは、接触角計（例えば、協和界面科学社製「ＤＭｏ－７０１」）を用いて、以下のようにして測定される。 The contact angle θ is measured using a contact angle meter (for example, "DMo-701" manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd.) as follows:
上記樹脂膜の表面に、純水又はジヨードメタンを１μＬ滴下する。滴下してから３０秒後の純水と、該樹脂膜とのなす角度を、純水に対する接触角θとする。また、同様に、滴下してから３０秒後のジヨードメタンと、該樹脂膜とのなす角度を、ジヨードメタンに対する接触角θとする。 1 μL of pure water or diiodomethane is dropped onto the surface of the resin film. The angle between the pure water and the resin film 30 seconds after the drop is taken as the contact angle θ with respect to the pure water. Similarly, the angle between the diiodomethane and the resin film 30 seconds after the drop is taken as the contact angle θ with respect to the diiodomethane.
合成樹脂における疎水性官能基の含有率を高くしたり、環状構造を有する官能基の含有率を高くしたり、ブチル基の含有率を少なくしたりすることにより、上記表面自由エネルギーの分散項成分γｄを小さくすることができる。また、合成樹脂における親水性官能基の含有率を高くしたり、ブチル基の含有率を高くしたりすることにより、上記表面自由エネルギーの双極子成分γｐを小さくすることができる。 The dispersion term component γd of the surface free energy can be reduced by increasing the content of hydrophobic functional groups, the content of functional groups having a cyclic structure, or the content of butyl groups in the synthetic resin, while the dipole component γp of the surface free energy can be reduced by increasing the content of hydrophilic functional groups, or the content of butyl groups in the synthetic resin.
（貯蔵弾性率）
上記樹脂膜の１００℃における貯蔵弾性率は、好ましくは０．６×１０４Ｐａ以上、より好ましくは０．８×１０４Ｐａ以上、さらに好ましくは１．０×１０４Ｐａ以上、好ましくは１．０×１０８Ｐａ以下、より好ましくは０．８×１０８Ｐａ以下、さらに好ましくは１．０×１０７Ｐａ以下である。
(Storage Modulus)
The storage modulus of the resin film at 100°C is preferably 0.6 x 10 4 Pa or more, more preferably 0.8 x 10 4 Pa or more, even more preferably 1.0 x 10 4 Pa or more, and preferably 1.0 x 10 8 Pa or less, more preferably 0.8 x 10 8 Pa or less, even more preferably 1.0 x 10 7 Pa or less.
上記樹脂膜の２５℃における貯蔵弾性率と１００℃における貯蔵弾性率との比（（２５℃における貯蔵弾性率）／（１００℃における貯蔵弾性率））は、好ましくは１．０×１０以上、より好ましくは５．０×１０１以上、さらに好ましくは８．０×１０２以上、好ましくは１．０×１０５以下、より好ましくは０．７５×１０５以下、さらに好ましくは０．５×１０５以下である。上記比を上記範囲内とすることにより、播種後の細胞の定着性をより一層高めることができる。 The ratio of the storage modulus of the resin film at 25° C. to the storage modulus at 100° C. ((storage modulus at 25° C.)/(storage modulus at 100° C.)) is preferably 1.0×10 or more, more preferably 5.0×10 1 or more, even more preferably 8.0×10 2 or more, preferably 1.0×10 5 or less, more preferably 0.75×10 5 or less, and even more preferably 0.5×10 5 or less. By setting the ratio within the above range, the fixation of cells after seeding can be further improved.
２５℃及び１００℃における貯蔵弾性率は、例えば、動的粘弾性測定装置（アイティー計測制御社製、ＤＶＡ－２００）を用いて、引張条件下、周波数１０Ｈｚ、ひずみ０．１％、温度範囲－１５０℃～１５０℃、及び昇温速度５℃／分の測定条件で測定することにより求めることができる。得られた引張貯蔵弾性率のグラフから２５℃及び１００℃における貯蔵弾性率を求め、また、比（２５℃における貯蔵弾性率／１００℃における貯蔵弾性率）を算出する。なお、測定サンプルは、長さ５０ｍｍ、幅５ｍｍ～２０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ～１．０ｍｍのサイズとする。 The storage modulus at 25°C and 100°C can be determined, for example, by using a dynamic viscoelasticity measuring device (DVA-200, manufactured by IT Measurement & Control Co., Ltd.) under tensile conditions, with a frequency of 10 Hz, a strain of 0.1%, a temperature range of -150°C to 150°C, and a heating rate of 5°C/min. The storage modulus at 25°C and 100°C is determined from the resulting tensile storage modulus graph, and the ratio (storage modulus at 25°C/storage modulus at 100°C) is calculated. The measurement sample has a length of 50 mm, a width of 5 mm to 20 mm, and a thickness of 0.1 mm to 1.0 mm.
上記２５℃及び１００℃における貯蔵弾性率は、例えば、上記合成樹脂における架橋度を高めること、上記合成樹脂を延伸すること等により、高めることができる。また、上記２５℃及び１００℃における貯蔵弾性率は、上記合成樹脂において数平均分子量を下げること、ガラス転移温度を下げること等により、低くすることができる。 The storage modulus at 25°C and 100°C can be increased, for example, by increasing the degree of crosslinking in the synthetic resin, stretching the synthetic resin, etc. The storage modulus at 25°C and 100°C can be decreased, for example, by decreasing the number average molecular weight of the synthetic resin, decreasing the glass transition temperature, etc.
（水膨潤倍率）
上記樹脂膜の水膨潤倍率は、好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、さらに好ましくは３０％以下、特に好ましくは２０％以下である。この場合には、細胞塊の収縮をより一層抑え、細胞の伸展性をより一層高めることができ、播種後の細胞の定着性をより一層高めることができる。
(Water swelling ratio)
The water swelling ratio of the resin film is preferably 50% or less, more preferably 40% or less, further preferably 30% or less, and particularly preferably 20% or less. In this case, the contraction of the cell aggregates can be further suppressed, the extensibility of the cells can be further increased, and the fixation of the cells after seeding can be further increased.
水膨潤倍率は、以下のようにして測定することができる。例えば、長さ５０ｍｍ、幅１０ｍｍ、厚み０．０５ｍｍ～０．１５ｍｍの細胞培養用足場材料からなる樹脂膜（測定サンプル）を、２５℃の水に２４時間浸漬する。浸漬前と後のサンプルの重さを測定し、水膨潤倍率＝（浸漬後のサンプル重量－浸漬前のサンプル重量）／（浸漬前のサンプル重量）×１００（％）を算出する。 The water swelling ratio can be measured as follows. For example, a resin film (measurement sample) made of a scaffold material for cell culture, 50 mm long, 10 mm wide, and 0.05 mm to 0.15 mm thick, is immersed in water at 25°C for 24 hours. The weight of the sample before and after immersion is measured, and the water swelling ratio is calculated as follows: Water swelling ratio = (sample weight after immersion - sample weight before immersion) / (sample weight before immersion) x 100 (%).
上記水膨潤倍率は、例えば、上記合成樹脂の疎水性官能基を増やすこと、数平均分子量を下げること等により、小さくできる。 The water swelling ratio can be reduced, for example, by increasing the hydrophobic functional groups of the synthetic resin or by decreasing the number average molecular weight.
［合成樹脂］
細胞培養用足場材料が含有している上記合成樹脂（以下、合成樹脂Ｘと記載することがある）としては、上記特定のゼータ電位及び上記特定の範囲の表面自由エネルギーを有する限り、特に限定されるものではない。なお、本明細書において、「構造単位」とは、合成樹脂Ｘを構成するモノマーの繰り返し単位をいう。なお、合成樹脂Ｘがグラフト鎖を有する場合は、そのグラフト鎖を構成するモノマーの繰り返し単位を含む。
[Synthetic resin]
The synthetic resin contained in the scaffold material for cell culture (hereinafter, sometimes referred to as synthetic resin X) is not particularly limited as long as it has the specific zeta potential and the specific range of surface free energy. In this specification, the term "structural unit" refers to a repeating unit of a monomer constituting synthetic resin X. In addition, when synthetic resin X has a graft chain, it includes the repeating unit of the monomer constituting the graft chain.
合成樹脂Ｘは、構成単位中にブレンステッド塩基性基を、０．２モル％以上で含むことが好ましく、２モル％以上で含むことがより好ましく、３０モル％以下で含むことが好ましく、２０モル％以下で含むことがより好ましく、１５モル％以下で含むことがさらに好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。なお、ブレンステッド塩基性基等については、後述する。 Synthetic resin X preferably contains 0.2 mol% or more of Bronsted basic groups in its structural units, more preferably 2 mol% or more, and preferably 30 mol% or less, more preferably 20 mol% or less, and even more preferably 15 mol% or less. In this case, the effects of the present invention can be more effectively achieved. Bronsted basic groups and the like will be described later.
（ビニル重合体）
合成樹脂Ｘは、ビニル重合体を含むことが好ましく、ビニル重合体であることがより好ましい。なお、ビニル重合体とは、ビニル基又はビニリデン基を有する化合物の重合体である。上記合成樹脂Ｘがビニル重合体である場合、水中における細胞培養用足場材料の膨潤をより抑制しやすくすることができる。ビニル重合体としては、例えば、ポリビニルアルコール誘導体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、エチレン・酢酸ビニル共重合体等が挙げられる。ビニル重合体は、細胞との接着性をより高める観点から、ポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステルであることが好ましい。上記合成樹脂Ｘは、少なくともポリビニルアルコール誘導体又はポリ（メタ）アクリル酸エステルを含むことが好ましい。上記合成樹脂Ｘは、ポリビニルアルコール誘導体であることが好ましく、ポリ（メタ）アクリル酸エステルであることも好ましい。
(Vinyl polymer)
The synthetic resin X preferably contains a vinyl polymer, and more preferably is a vinyl polymer. The vinyl polymer is a polymer of a compound having a vinyl group or a vinylidene group. When the synthetic resin X is a vinyl polymer, it is possible to more easily suppress the swelling of the scaffold material for cell culture in water. Examples of the vinyl polymer include polyvinyl alcohol derivatives, poly(meth)acrylic acid esters, polyvinylpyrrolidone, polystyrene, and ethylene-vinyl acetate copolymers. From the viewpoint of further increasing the adhesiveness to cells, the vinyl polymer is preferably a polyvinyl alcohol derivative or a poly(meth)acrylic acid ester. The synthetic resin X preferably contains at least a polyvinyl alcohol derivative or a poly(meth)acrylic acid ester. The synthetic resin X is preferably a polyvinyl alcohol derivative, and is also preferably a poly(meth)acrylic acid ester.
（ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘ）
細胞培養用足場材料は、ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。上記合成樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂を含むことが好ましく、ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂であることがより好ましい。
(Synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton)
The scaffold material for cell culture preferably contains a synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton. The synthetic resin X preferably contains a synthetic resin having a polyvinyl acetal skeleton, and more preferably is a synthetic resin having a polyvinyl acetal skeleton.
本明細書において、「ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘ」を、「ポリビニルアセタール樹脂Ｘ」と記載することがある。 In this specification, "synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton" may be referred to as "polyvinyl acetal resin X."
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、側鎖にアセタール基と、アセチル基と、水酸基とを有する。 Polyvinyl acetal resin X has an acetal group, an acetyl group, and a hydroxyl group in the side chain.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘを合成する際には、ポリビニルアルコールをアルデヒドによりアセタール化する工程を少なくとも備える。 The synthesis of polyvinyl acetal resin X includes at least a step of acetalizing polyvinyl alcohol with an aldehyde.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘを得るためのポリビニルアルコールのアセタール化に用いられるアルデヒドは、特に限定されない。アルデヒドとしては、例えば、炭素数が１～１０のアルデヒドが挙げられる。アルデヒドは、鎖状脂肪族基、環状脂肪族基又は芳香族基を有していてもよい。アルデヒドは、鎖状アルデヒドであってもよく、環状アルデヒドであってもよい。 The aldehyde used in the acetalization of polyvinyl alcohol to obtain polyvinyl acetal resin X is not particularly limited. Examples of the aldehyde include aldehydes having 1 to 10 carbon atoms. The aldehyde may have a chain aliphatic group, a cyclic aliphatic group, or an aromatic group. The aldehyde may be a chain aldehyde or a cyclic aldehyde.
上記アルデヒドとしては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナール、オクタナール、ノナナール、デカナール、アクロレイン、ベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、ホルミルピリジン、ホルミルイミダゾール、ホルミルピロール、ホルミルピペリジン、ホルミルトリアゾール、ホルミルテトラゾール、ホルミルインドール、ホルミルイソインドール、ホルミルプリン、ホルミルベンゾイミダゾール、ホルミルベンゾトリアゾール、ホルミルキノリン、ホルミルイソキノリン、ホルミルキノキサリン、ホルミルシンノリン、ホルミルプテリジン、ホルミルフラン、ホルミルオキソラン、ホルミルオキサン、ホルミルチオフェン、ホルミルチオラン、ホルミルチアン、ホルミルアデニン、ホルミルグアニン、ホルミルシトシン、ホルミルチミン、及びホルミルウラシル等が挙げられる。上記アルデヒドは、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。 Examples of the aldehyde include formaldehyde, acetaldehyde, propionaldehyde, butyraldehyde, pentanal, hexanal, heptanal, octanal, nonanal, decanal, acrolein, benzaldehyde, cinnamaldehyde, perillaldehyde, formylpyridine, formylimidazole, formylpyrrole, formylpiperidine, formyltriazole, formyltetrazole, formylindole, formylisoindole, formylpurine, formylbenzimidazole, formylbenzotriazole, formylquinoline, formylisoquinoline, formylquinoxaline, formylcinnoline, formylpteridine, formylfuran, formyloxolane, formyloxane, formylthiophene, formylthiolane, formylthiane, formyladenine, formylguanine, formylcytosine, formylthymine, and formyluracil. The above aldehydes may be used alone or in combination of two or more.
アルデヒドは、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、又はペンタナールであることが好ましく、ブチルアルデヒドであることがより好ましい。したがって、ポリビニルアセタール骨格は、ポリビニルブチラール骨格であることが好ましい。ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルブチラール樹脂であることが好ましい。 The aldehyde is preferably formaldehyde, acetaldehyde, propionaldehyde, butyraldehyde, or pentanal, and more preferably butyraldehyde. Therefore, the polyvinyl acetal skeleton is preferably a polyvinyl butyral skeleton. The polyvinyl acetal resin X is preferably a polyvinyl butyral resin.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘには、ビニル化合物が共重合されていてもよい。すなわち、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール樹脂の構造単位とビニル化合物との共重合体であってもよい。本発明では、ビニル化合物と共重合したポリビニルアセタール樹脂も、ポリビニルアセタール樹脂というものとする。 The polyvinyl acetal resin X may be copolymerized with a vinyl compound. That is, the polyvinyl acetal resin X may be a copolymer of the structural unit of the polyvinyl acetal resin and a vinyl compound. In the present invention, the polyvinyl acetal resin copolymerized with a vinyl compound is also referred to as the polyvinyl acetal resin.
ビニル化合物は、ビニル基（Ｈ２Ｃ＝ＣＨ－）を有する化合物である。ビニル化合物は、ビニル基を有する構造単位を有する重合体であってもよい。 The vinyl compound is a compound having a vinyl group (H 2 C═CH—) The vinyl compound may be a polymer having a structural unit having a vinyl group.
上記共重合体は、ポリビニルアセタール樹脂とビニル化合物とのブロック共重合体であってもよく、ポリビニルアセタール樹脂にビニル化合物がグラフトしたグラフト共重合体であってもよい。上記共重合体は、グラフト共重合体であることが好ましい。 The copolymer may be a block copolymer of a polyvinyl acetal resin and a vinyl compound, or a graft copolymer in which a vinyl compound is grafted onto a polyvinyl acetal resin. The copolymer is preferably a graft copolymer.
ビニル化合物としては、エチレン、アリルアミン、ビニルピロリドン、ビニルイミダゾール、無水マレイン酸、マレイミド、イタコン酸、（メタ）アクリル酸、ビニルアミン及、又は（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。これらのビニル化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。 Examples of vinyl compounds include ethylene, allylamine, vinylpyrrolidone, vinylimidazole, maleic anhydride, maleimide, itaconic acid, (meth)acrylic acid, vinylamine, and (meth)acrylic acid ester. These vinyl compounds may be used alone or in combination of two or more.
細胞の接着性をより一層高める観点からは、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ブレンステッド塩基性基又はブレンステッド酸性基を有することが好ましく、ブレンステッド塩基性基を有することがより好ましい。すなわち、ポリビニルアセタール樹脂Ｘの一部がブレンステッド塩基性基又はブレンステッド酸性基により変性されていることが好ましく、ポリビニルアセタール樹脂Ｘの一部がブレンステッド塩基性基で変性されていることがより好ましい。 From the viewpoint of further enhancing the adhesiveness of cells, it is preferable that the polyvinyl acetal resin X has a Brønsted basic group or a Brønsted acidic group, and it is more preferable that the polyvinyl acetal resin X has a Brønsted basic group. In other words, it is preferable that a part of the polyvinyl acetal resin X is modified with a Brønsted basic group or a Brønsted acidic group, and it is more preferable that a part of the polyvinyl acetal resin X is modified with a Brønsted basic group.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、ブレンステッド塩基性基又はブレンステッド酸性基を有することが好ましく、ブレンステッド塩基性基を有することがより好ましい。その場合には、細胞の伸展性をより一層高めることができる。このブレンステッド塩基性基又はブレンステッド酸性基は、ポリビニルアセタール樹脂Ｘの一部に有しておればよく、その場合、ブレンステッド塩基性基又はブレンステッド酸性基を有するモノマーが共重合されていてもよく、グラフトをされていてもよい。上記ブレンステッド塩基性基による変性度は、好ましくは０．２モル％以上、より好ましくは２モル％以上、好ましくは３０モル％以下、より好ましくは２０モル％以下、さらに好ましくは１５モル％以下である。ブレンステッド塩基性基による変性度が上記特定の範囲内であれば、細胞の伸展性より一層高めることができる。 The polyvinyl acetal resin X preferably has a Brønsted basic group or a Brønsted acidic group, and more preferably has a Brønsted basic group. In that case, the extensibility of the cells can be further increased. The Brønsted basic group or the Brønsted acidic group may be present in a part of the polyvinyl acetal resin X, and in that case, a monomer having a Brønsted basic group or a Brønsted acidic group may be copolymerized or grafted. The degree of modification by the Brønsted basic group is preferably 0.2 mol% or more, more preferably 2 mol% or more, preferably 30 mol% or less, more preferably 20 mol% or less, and even more preferably 15 mol% or less. If the degree of modification by the Brønsted basic group is within the above specific range, the extensibility of the cells can be further increased.
上記ブレンステッド塩基性基としては、イミン構造を有する置換基、イミド構造を有する置換基、アミン構造を有する置換基、及びアミド構造を有する置換基等のアミン系塩基性基が挙げられる。例えば、特に限定されないが、ヒドロキシアミノ基、ウレア基、グアニジン、ビグアニド等の共役アミン系官能基、ピペラジン、ピペリジン、ピロリジン、１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、ヘキサメチレンテトラアミン、モルホリン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピロール、アザトロピリデン、ピリドン、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾトリアゾール、ピラゾール、オキサゾール、イミダゾリン、トリアゾール、チアゾール、チアジン、テトラゾール、インドール、イソインドール、プリン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、アクリジン、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、メラミン等のヘテロ環アミノ系官能基、ポルフィリン、クロリン、コリン等の環状ピロール系官能基及びそれらの誘導体等が挙げられる。 Examples of the Bronsted basic group include amine-based basic groups such as a substituent having an imine structure, a substituent having an imide structure, a substituent having an amine structure, and a substituent having an amide structure. Examples include, but are not limited to, conjugated amine functional groups such as hydroxyamino groups, urea groups, guanidine, and biguanide; heterocyclic amino functional groups such as piperazine, piperidine, pyrrolidine, 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane, hexamethylenetetraamine, morpholine, pyridine, pyridazine, pyrimidine, pyrazine, pyrrole, azatropyridene, pyridone, imidazole, benzimidazole, benzotriazole, pyrazole, oxazole, imidazoline, triazole, thiazole, thiazine, tetrazole, indole, isoindole, purine, quinoline, isoquinoline, quinazoline, quinoxaline, cinnoline, pteridine, carbazole, acridine, adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil, and melamine; cyclic pyrrole functional groups such as porphyrin, chlorine, and choline, and derivatives thereof.
ブレンステッド酸性基としては、カルボキシル基、スルホン酸基、マレイン酸基、スルフィン酸基、スルフェン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、又はこれらの塩等が挙げられる。ブレンステッド酸性基は、カルボキシル基であることが好ましい。 Examples of the Bronsted acid group include a carboxyl group, a sulfonic acid group, a maleic acid group, a sulfinic acid group, a sulfenic acid group, a phosphoric acid group, a phosphonic acid group, or salts thereof. The Bronsted acid group is preferably a carboxyl group.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、イミン構造を有する構造単位、イミド構造を有する構造単位、アミン構造を有する構造単位、又はアミド構造を有する構造単位を有することが好ましく、イミン構造を有する構造単位、又はアミン構造を有する構造単位を有することがより好ましい。この場合、これらの構造単位のうちの１種のみを有していてもよく、２種以上を有していてもよい。 The polyvinyl acetal resin X preferably has a structural unit having an imine structure, a structural unit having an imide structure, a structural unit having an amine structure, or a structural unit having an amide structure, and more preferably has a structural unit having an imine structure or a structural unit having an amine structure. In this case, it may have only one type of these structural units, or two or more types.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、イミン構造を有する構造単位を有していてもよい。イミン構造とは、Ｃ＝Ｎ結合を有する構造をいう。特に、ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、イミン構造を側鎖に有することが好ましい。 The polyvinyl acetal resin X may have a structural unit having an imine structure. An imine structure refers to a structure having a C=N bond. In particular, it is preferable that the polyvinyl acetal resin X has an imine structure in the side chain.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、イミド構造を有する構造単位を有していてもよい。イミド構造を有する構造単位は、イミノ基（＝ＮＨ）を有する構造単位であることが好ましい。 The polyvinyl acetal resin X may have a structural unit having an imide structure. The structural unit having an imide structure is preferably a structural unit having an imino group (=NH).
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、イミノ基を側鎖に有することが好ましい。この場合、イミノ基は、ポリビニルアセタール樹脂Ｘの主鎖を構成する炭素原子に直接結合していてもよく、アルキレン基等の連結基を介して主鎖に結合していてもよい。 It is preferable that the polyvinyl acetal resin X has an imino group in the side chain. In this case, the imino group may be directly bonded to a carbon atom constituting the main chain of the polyvinyl acetal resin X, or may be bonded to the main chain via a linking group such as an alkylene group.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、アミン構造を有する構造単位を有していてもよい。上記アミン構造におけるアミン基は、第一級アミン基であってもよく、第二級アミン基であってもよく、第三級アミン基であってもよく、第四級アミン基であってもよい。 The polyvinyl acetal resin X may have a structural unit having an amine structure. The amine group in the amine structure may be a primary amine group, a secondary amine group, a tertiary amine group, or a quaternary amine group.
アミン構造を有する構造単位は、アミド構造を有する構造単位であってもよい。上記アミド構造とは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－を有する構造をいう。 The structural unit having an amine structure may be a structural unit having an amide structure. The amide structure refers to a structure having -C(=O)-NH-.
ポリビニルアセタール樹脂Ｘは、アミン構造又はイミン構造を側鎖に有することが好ましい。この場合、アミン構造又はイミン構造は、ポリビニルアセタール樹脂Ｘの主鎖を構成する炭素原子に直接結合していてもよく、アルキレン基等の連結基を介して主鎖に結合していてもよい。 It is preferable that the polyvinyl acetal resin X has an amine structure or an imine structure in the side chain. In this case, the amine structure or the imine structure may be directly bonded to a carbon atom constituting the main chain of the polyvinyl acetal resin X, or may be bonded to the main chain via a linking group such as an alkylene group.
なお、イミン構造を有する構造単位の含有率、イミド構造を有する構造単位の含有率、アミン構造を有する構造単位の含有率、アミド構造を有する構造単位の含有率は、１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定することができる。 The content of structural units having an imine structure, the content of structural units having an imide structure, the content of structural units having an amine structure, and the content of structural units having an amide structure can be measured by 1 H-NMR (nuclear magnetic resonance spectrum).
（ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘ）
細胞培養用足場材料は、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘを含むことが好ましい。上記合成樹脂Ｘは、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂を含むことが好ましく、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂であることがより好ましい。
(Synthetic resin X having a poly(meth)acrylic acid ester skeleton)
The scaffold material for cell culture preferably contains a synthetic resin X having a poly(meth)acrylic acid ester skeleton. The synthetic resin X preferably contains a synthetic resin having a poly(meth)acrylic acid ester skeleton, and more preferably is a synthetic resin having a poly(meth)acrylic acid ester skeleton.
本明細書において、「ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する合成樹脂Ｘ」を、「ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘ」と記載することがある。 In this specification, "synthetic resin X having a poly(meth)acrylic acid ester skeleton" may be referred to as "poly(meth)acrylic acid ester resin X."
従って、ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、ポリ（メタ）アクリル酸エステル骨格を有する樹脂である。 Therefore, poly(meth)acrylic acid ester resin X is a resin having a poly(meth)acrylic acid ester skeleton.
ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、（メタ）アクリル酸エステルの重合により、あるいは、（メタ）アクリル酸エステルと、他のモノマーとの共重合により得られる。 Poly(meth)acrylic acid ester resin X is obtained by polymerization of a (meth)acrylic acid ester or by copolymerization of a (meth)acrylic acid ester with another monomer.
（メタ）アクリル酸エステルとしては、（メタ）アクリル酸アルキルエステル、（メタ）アクリル酸環状アルキルエステル、（メタ）アクリル酸アリールエステル、（メタ）アクリルアミド類、（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類、（メタ）アクリル酸ホスホリルコリン等が挙げられる。 (Meth)acrylic acid esters include (meth)acrylic acid alkyl esters, (meth)acrylic acid cyclic alkyl esters, (meth)acrylic acid aryl esters, (meth)acrylamides, (meth)acrylic acid polyethylene glycols, and (meth)acrylic acid phosphorylcholine.
（メタ）アクリル酸アルキルエステルとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ－プロピル（メタ）アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ｎ－ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｔ－ブチル（メタ）アクリレート、ｎ－オクチル（メタ）アクリレート、イソオクチル（メタ）アクリレート、２－エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、イソノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、イソデシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、及びステアリル（メタ）アクリレート、イソテトラデシル（メタ）アクリレート等が挙げられる。 Examples of (meth)acrylic acid alkyl esters include methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, n-propyl (meth)acrylate, isopropyl (meth)acrylate, n-butyl (meth)acrylate, isobutyl (meth)acrylate, t-butyl (meth)acrylate, n-octyl (meth)acrylate, isooctyl (meth)acrylate, 2-ethylhexyl (meth)acrylate, nonyl (meth)acrylate, isononyl (meth)acrylate, decyl (meth)acrylate, isodecyl (meth)acrylate, lauryl (meth)acrylate, stearyl (meth)acrylate, isotetradecyl (meth)acrylate, and the like.
なお、（メタ）アクリル酸アルキルエステルは、炭素数１～３のアルコキシ基及びテトラヒドロフルフリル基等の置換基で置換されていてもよい。このような（メタ）アクリル酸アルキルエステルの例としては、メトキシエチルアクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレート等が挙げられる。 The (meth)acrylic acid alkyl ester may be substituted with a substituent such as an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms and a tetrahydrofurfuryl group. Examples of such (meth)acrylic acid alkyl esters include methoxyethyl acrylate and tetrahydrofurfuryl acrylate.
（メタ）アクリル酸環状アルキルエステルとしては、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、及びイソボルニル（メタ）アクリレート等が挙げられる。 Examples of (meth)acrylic acid cyclic alkyl esters include cyclohexyl (meth)acrylate and isobornyl (meth)acrylate.
（メタ）アクリル酸アリールエステルとしては、フェニル（メタ）アクリレート、及びベンジル（メタ）アクリレート等が挙げられる。 Examples of (meth)acrylic acid aryl esters include phenyl (meth)acrylate and benzyl (meth)acrylate.
（メタ）アクリルアミド類としては、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ジメチル（メタ）アクリルアミド、(３－（メタ）アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、４－（メタ）アクリロイルモルホリン、３－（メタ）アクリロイル－２－オキサゾリジノン、Ｎ－[３－(ジメチルアミノ)プロピル]（メタ）アクリルアミド、Ｎ－(２－ヒドロキシエチル)（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール（メタ）アクリルアミド、及び６－（メタ）アクリルアミドヘキサン酸等が挙げられる。 (Meth)acrylamides include (meth)acrylamide, N-isopropyl(meth)acrylamide, N-tert-butyl(meth)acrylamide, N,N'-dimethyl(meth)acrylamide, (3-(meth)acrylamidopropyl)trimethylammonium chloride, 4-(meth)acryloylmorpholine, 3-(meth)acryloyl-2-oxazolidinone, N-[3-(dimethylamino)propyl](meth)acrylamide, N-(2-hydroxyethyl)(meth)acrylamide, N-methylol(meth)acrylamide, and 6-(meth)acrylamidohexanoic acid.
（メタ）アクリル酸ポリエチレングリコール類としては、例えば、メトキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ－ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、ヒドロキシ－ジエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、エトキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート、及びヒドロキシ－トリエチレングルコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。 Examples of polyethylene glycol (meth)acrylates include methoxy-polyethylene glycol (meth)acrylate, ethoxy-polyethylene glycol (meth)acrylate, hydroxy-polyethylene glycol (meth)acrylate, methoxy-diethylene glycol (meth)acrylate, ethoxy-diethylene glycol (meth)acrylate, hydroxy-diethylene glycol (meth)acrylate, methoxy-triethylene glycol (meth)acrylate, ethoxy-triethylene glycol (meth)acrylate, and hydroxy-triethylene glycol (meth)acrylate.
（メタ）アクリル酸ホスホリルコリンとしては、２－（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン等が挙げられる。 Examples of (meth)acrylate phosphorylcholine include 2-(meth)acryloyloxyethyl phosphorylcholine.
（メタ）アクリル酸エステルと共重合される他のモノマーとしては、ビニル化合物が好適に用いられる。ビニル化合物としては、エチレン、アリルアミン、ビニルピロリドン、無水マレイン酸、マレイミド、イタコン酸、（メタ）アクリル酸、ビニルアミン、又は（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。ビニル化合物は、１種のみが用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。 As another monomer to be copolymerized with the (meth)acrylic acid ester, a vinyl compound is preferably used. Examples of the vinyl compound include ethylene, allylamine, vinylpyrrolidone, maleic anhydride, maleimide, itaconic acid, (meth)acrylic acid, vinylamine, and (meth)acrylic acid ester. Only one type of vinyl compound may be used, or two or more types may be used in combination.
なお、本明細書において、「（メタ）アクリル」とは、「アクリル」又は「メタクリル」を意味し、「（メタ）アクリレート」とは、「アクリレート」又は「メタクリレート」を意味する。 In this specification, "(meth)acrylic" means "acrylic" or "methacrylic", and "(meth)acrylate" means "acrylate" or "methacrylate".
上記ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘは、ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂Ｘと同様に、ブレンステッド塩基性基、またはブレンステッド酸性基を有することが好ましい。その場合には、細胞の伸展性をより一層高めることができる。このブレンステッド塩基性基は、ポリ（メタ）アクリル酸エステル樹脂Ｘの一部に有しておればよく、その場合、ブレンステッド塩基性基を有するモノマーが共重合されていてもよく、グラフトをされていてもよい。上記ブレンステッド塩基性基による変性度は、好ましくは０．２モル％以上、より好ましくは２モル％以上、好ましくは３０モル％以下、より好ましくは２０モル％以下、さらに好ましくは１５モル％以下である。ブレンステッド塩基性基による変性度が上記特定の範囲内であれば、細胞の伸展性より一層高めることができる。 The poly(meth)acrylic acid ester resin X preferably has a Brønsted basic group or a Brønsted acidic group, like the synthetic resin X having a polyvinyl acetal skeleton. In that case, the extensibility of the cells can be further improved. The Brønsted basic group may be present in a part of the poly(meth)acrylic acid ester resin X, and in that case, a monomer having a Brønsted basic group may be copolymerized or grafted. The degree of modification by the Brønsted basic group is preferably 0.2 mol% or more, more preferably 2 mol% or more, preferably 30 mol% or less, more preferably 20 mol% or less, and even more preferably 15 mol% or less. If the degree of modification by the Brønsted basic group is within the above specific range, the extensibility of the cells can be further improved.
（その他の樹脂）
細胞培養用足場材料は、上述した合成樹脂以外のポリマーを含んでいてもよい。該ポリマーとしては、ポリオレフィン樹脂、ポリエーテル樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリエステル、エポキシ樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、ポリウレタン樹脂、及びポリカーボネート樹脂等が挙げられる。
(Other resins)
The cell culture scaffold material may contain a polymer other than the above-mentioned synthetic resins, such as polyolefin resin, polyether resin, polyvinyl alcohol resin, polyester, epoxy resin, polyamide resin, polyimide resin, polyurethane resin, and polycarbonate resin.
［細胞培養用足場材料］
細胞培養用足場材料は、上記合成樹脂Ｘを含む。本発明の効果を効果的に発揮させる観点及び生産性を高める観点からは、上記細胞培養用足場材料１００重量％中、上記合成樹脂Ｘの含有量は、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、更に好ましくは９７．５重量％以上、特に好ましくは９９重量％以上、最も好ましくは１００重量％（全量）である。したがって、上記細胞培養用足場材料は、上記合成樹脂Ｘであることが最も好ましい。上記合成樹脂Ｘの含有量が上記下限以上であると、本発明の効果をより一層効果的に発揮させることができる。
[Scaffold material for cell culture]
The scaffold material for cell culture contains the synthetic resin X. From the viewpoint of effectively exerting the effects of the present invention and increasing productivity, the content of the synthetic resin X in 100% by weight of the scaffold material for cell culture is preferably 90% by weight or more, more preferably 95% by weight or more, even more preferably 97.5% by weight or more, particularly preferably 99% by weight or more, and most preferably 100% by weight (total amount). Therefore, it is most preferable that the scaffold material for cell culture is the synthetic resin X. When the content of the synthetic resin X is equal to or more than the lower limit, the effects of the present invention can be exerted even more effectively.
上記細胞培養用足場材料は、上記合成樹脂Ｘ以外の成分を含んでいてもよい。上記合成樹脂以外の成分としては、多糖類、セルロース、合成ペプチド、ポリペプチド等が挙げられる。 The above-mentioned cell culture scaffold material may contain components other than the above-mentioned synthetic resin X. Examples of the components other than the above-mentioned synthetic resin include polysaccharides, cellulose, synthetic peptides, polypeptides, etc.
本発明の効果を効果的に発揮させる観点から、上記合成樹脂Ｘ以外の成分の含有量は少ないほどよい。上記細胞培養用足場材料１００重量％中、該成分の含有量は、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは５重量％以下、更に好ましくは２．５重量％以下、特に好ましくは１重量％以下、最も好ましくは０重量％（未含有）である。したがって、細胞培養用足場材料は、合成樹脂Ｘ以外の成分を含まないことが最も好ましい。 From the viewpoint of effectively exerting the effects of the present invention, the content of components other than the synthetic resin X is preferably as low as possible. In 100% by weight of the scaffold material for cell culture, the content of the components is preferably 10% by weight or less, more preferably 5% by weight or less, even more preferably 2.5% by weight or less, particularly preferably 1% by weight or less, and most preferably 0% by weight (not contained). Therefore, it is most preferable that the scaffold material for cell culture does not contain any components other than the synthetic resin X.
上記細胞培養用足場材料は、動物由来の原料を実質的に含まないことが好ましい。動物由来の原料を含まないことにより、安全性が高く、かつ、製造時に品質のばらつきが少ない細胞培養用足場材料を提供することができる。なお、「動物由来の原料を実質的に含まない」とは、細胞培養用足場材料中における動物由来の原料が、３重量％以下であることをいう。上記細胞培養用足場材料は、細胞培養用足場材料中における動物由来の原料が、１重量％以下であることが好ましく、０重量％であることがより好ましい。すなわち、上記細胞培養用足場材料は、動物由来の原料を全く含まないことがより好ましい。 It is preferable that the above-mentioned scaffold material for cell culture is substantially free of animal-derived raw materials. By not including raw materials of animal origin, it is possible to provide a scaffold material for cell culture that is highly safe and has little variation in quality during production. Here, "substantially free of raw materials of animal origin" means that the amount of raw materials of animal origin in the scaffold material for cell culture is 3% by weight or less. It is preferable that the amount of raw materials of animal origin in the scaffold material for cell culture is 1% by weight or less, and more preferably 0% by weight. In other words, it is more preferable that the above-mentioned scaffold material for cell culture is completely free of raw materials of animal origin.
（細胞培養用足場材料を用いた細胞培養）
上記細胞培養用足場材料は、細胞を培養するために用いられる。上記細胞培養用足場材料は、細胞を培養する際の該細胞の足場として用いられる。したがって、本発明に係る樹脂膜は、細胞を培養するために用いられ、また、細胞を培養する際の該細胞の足場として用いられる。
(Cell culture using scaffold material for cell culture)
The scaffold material for cell culture is used for culturing cells. The scaffold material for cell culture is used as a scaffold for cells when culturing the cells. Therefore, the resin film according to the present invention is used for culturing cells, and is used as a scaffold for cells when culturing the cells.
上記細胞としては、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ及びサル等の動物細胞が挙げられる。また、上記細胞としては、体細胞等が挙げられ、例えば、幹細胞、前駆細胞及び成熟細胞等が挙げられる。上記体細胞は、癌細胞であってもよい。 The above cells include animal cells such as human, mouse, rat, pig, cow, and monkey cells. The above cells also include somatic cells, such as stem cells, progenitor cells, and mature cells. The above somatic cells may be cancer cells.
上記幹細胞としては、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、胚性がん細胞、胚性生殖幹細胞、及びｍＧＳ細胞等が挙げられる。 The above stem cells include mesenchymal stem cells (MSCs), iPS cells, ES cells, Muse cells, embryonic cancer cells, embryonic germ stem cells, and mGS cells.
上記成熟細胞としては、神経細胞、心筋細胞、網膜細胞及び肝細胞等が挙げられる。 The above-mentioned mature cells include nerve cells, cardiomyocytes, retinal cells, and hepatic cells.
（細胞培養用足場材料の形状）
本発明に係る樹脂膜は、細胞培養用足場材料により形成される。上記樹脂膜は、細胞培養用足場材料を用いて形成される。上記樹脂膜は、膜状の細胞培養用足場材料であることが好ましい。上記樹脂膜は、細胞培養用足場材料の膜状物であることが好ましい。上記樹脂膜の厚みは特に限定されない。
(Shape of scaffold material for cell culture)
The resin film according to the present invention is formed by a scaffold material for cell culture. The resin film is formed by using a scaffold material for cell culture. The resin film is preferably a membrane-like scaffold material for cell culture. The resin film is preferably a membrane-like product of the scaffold material for cell culture. The thickness of the resin film is not particularly limited.
本明細書では、上記細胞培養用足場材料を含む、粒子、繊維、多孔体、又はフィルムも提供する。この場合、上記細胞培養用足場材料の形状は特に限定されず、粒子であっても、繊維であっても、多孔体であっても、フィルムであってもよい。なお、上記粒子、繊維、多孔体、又はフィルムは、上記細胞培養用足場材料以外の構成要素を含んでいてもよい。 The present specification also provides particles, fibers, porous bodies, or films that contain the above-mentioned scaffold material for cell culture. In this case, the shape of the above-mentioned scaffold material for cell culture is not particularly limited, and may be a particle, a fiber, a porous body, or a film. Note that the above-mentioned particle, fiber, porous body, or film may contain components other than the above-mentioned scaffold material for cell culture.
上記細胞培養用足場材料を含むフィルムは、細胞を平面培養（二次元培養）するために用いられることが好ましい。また、上記細胞培養用足場材料を含む、粒子、繊維、又は多孔体は、細胞を三次元培養するために用いられることが好ましい。 The film containing the above-mentioned scaffold material for cell culture is preferably used for planar culture (two-dimensional culture) of cells. Also, the particles, fibers, or porous bodies containing the above-mentioned scaffold material for cell culture are preferably used for three-dimensional culture of cells.
（細胞培養用容器）
本発明は、細胞の培養領域の少なくとも一部に上記樹脂膜を備える、細胞培養用容器にも関する。図１は、本発明の一実施形態に係る細胞培養用容器を模式的に示す正面断面図である。
(Cell culture vessel)
The present invention also relates to a cell culture vessel having the above-mentioned resin film in at least a part of a cell culture region. Fig. 1 is a front cross-sectional view showing a schematic view of a cell culture vessel according to one embodiment of the present invention.
細胞培養用容器１は、容器本体２と、樹脂膜３とを備える。容器本体２の表面２ａ上に樹脂膜３が配置されている。容器本体２の底面上に樹脂膜３が配置されている。細胞培養用容器１に液体培地を添加し、また、細胞を樹脂膜３の表面に播種することで、細胞を平面培養することができる。
The cell culture vessel 1 comprises a
なお、容器本体は、第１の容器本体の底面上にカバーガラス等の第２の容器本体を備えていてもよい。第１の容器本体と第２の容器本体とは分離可能であってもよい。この場合、第２の容器本体の表面上に、該細胞培養用足場材料が配置されていてもよい。 The container body may include a second container body such as a cover glass on the bottom surface of the first container body. The first container body and the second container body may be separable. In this case, the cell culture scaffold material may be disposed on the surface of the second container body.
上記容器本体として、従来公知の容器本体（容器）を用いることができる。上記容器本体の形状及び大きさは特に限定されない。 A conventionally known container body (container) can be used as the container body. There are no particular limitations on the shape and size of the container body.
上記容器本体としては、１個又は複数個のウェル（穴）を備える細胞培養用プレート、及び細胞培養用フラスコ等が挙げられる。上記プレートのウェル数は特に限定されない。該ウェル数としては、特に限定されないが、例えば、２、４、６、１２、２４、４８、９６、３８４等が挙げられる。上記ウェルの形状としては、特に限定されないが、真円、楕円、三角形、正方形、長方形、五角形等が挙げられる。上記ウェル底面の形状としては、特に限定されないが、平底、丸底、凹凸等が挙げられる。 The container body may be a cell culture plate or a cell culture flask having one or more wells (holes). The number of wells in the plate is not particularly limited. The number of wells may be, but is not particularly limited to, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 96, 384, etc. The shape of the well may be, but is not particularly limited to, a perfect circle, an ellipse, a triangle, a square, a rectangle, a pentagon, etc. The shape of the well bottom may be, but is not particularly limited to, a flat bottom, a round bottom, an uneven bottom, etc.
上記容器本体の材質は特に限定されないが、樹脂、金属及び無機材料が挙げられる。上記樹脂としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリイソプレン、シクロオレフィンポリマー、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミドイミド、（メタ）アクリル樹脂、エポキシ樹脂、シリコーン等が挙げられる。上記金属としては、ステンレス、銅、鉄、ニッケル、アルミ、チタン、金、銀、白金等が挙げられる。上記無機材料としては、酸化ケイ素（ガラス）、酸化アルミ、酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化鉄、窒化ケイ素等が挙げられる。 The material of the container body is not particularly limited, but examples thereof include resins, metals, and inorganic materials. Examples of the resins include polystyrene, polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polyester, polyisoprene, cycloolefin polymers, polyimide, polyamide, polyamideimide, (meth)acrylic resins, epoxy resins, and silicone. Examples of the metals include stainless steel, copper, iron, nickel, aluminum, titanium, gold, silver, and platinum. Examples of the inorganic materials include silicon oxide (glass), aluminum oxide, titanium oxide, zirconium oxide, iron oxide, and silicon nitride.
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げ、より詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with examples and comparative examples. Note that the present invention is not limited to the following examples.
細胞培養用足場材料の原料として、以下の合成樹脂Ｘ１を合成した。 The following synthetic resin X1 was synthesized as a raw material for cell culture scaffold material.
撹拌装置を備えた反応機に、イオン交換水２７００ｍＬ、平均重合度１６００、アミン変性度２．０モル％、鹸化度９７．５モル％のアミン変性ポリビニルアルコールを３００重量部投入し、撹拌しながら加熱溶解し、溶液を得た。得られた溶液に、触媒として、塩酸濃度が０．２重量％となるように３５重量％塩酸を添加した。次いで、温度を１５℃に調整し、撹拌しながらｎ－ブチルアルデヒド２２重量部を添加した。次いで、ｎ－ブチルアルデヒド１４８重量部を添加し、白色粒子状のポリビニルブチラール樹脂を析出させた。析出してから１５分後に、塩酸濃度が１．８重量％となるように３５重量％塩酸を添加した後、５０℃に加熱し、５０℃で２時間保持した。次いで、溶液を冷却し、中和した後、ポリビニルブチラール樹脂を水洗し、乾燥させて、ポリビニルブチラール樹脂である合成樹脂Ｘ１を得た。 2700 mL of ion-exchanged water and 300 parts by weight of amine-modified polyvinyl alcohol with an average degree of polymerization of 1600, an amine modification degree of 2.0 mol%, and a saponification degree of 97.5 mol% were added to a reactor equipped with a stirrer, and the mixture was heated and dissolved while stirring to obtain a solution. 35% by weight hydrochloric acid was added as a catalyst to the obtained solution so that the hydrochloric acid concentration was 0.2% by weight. Next, the temperature was adjusted to 15°C, and 22 parts by weight of n-butyl aldehyde were added while stirring. Next, 148 parts by weight of n-butyl aldehyde were added to precipitate white particulate polyvinyl butyral resin. 15 minutes after the precipitation, 35% by weight hydrochloric acid was added so that the hydrochloric acid concentration was 1.8% by weight, and then the mixture was heated to 50°C and held at 50°C for 2 hours. Next, the solution was cooled and neutralized, and the polyvinyl butyral resin was washed with water and dried to obtain synthetic resin X1, which is a polyvinyl butyral resin.
得られたポリビニルブチラール樹脂（合成樹脂Ｘ１）は、平均重合度１６００、水酸基量２１モル％、アミン基量２モル％、アセチル化度１モル％、アセタール化度（ブチラール化度）７６モル％であった。 The obtained polyvinyl butyral resin (synthetic resin X1) had an average degree of polymerization of 1600, a hydroxyl group content of 21 mol%, an amine group content of 2 mol%, an acetylation degree of 1 mol%, and an acetalization degree (butyralization degree) of 76 mol%.
なお、得られた合成樹脂における構造単位の含有率は、合成樹脂をＤＭＳＯ－Ｄ６(ジメチルスルホキサイド)に溶解した後、１Ｈ－ＮＭＲ（核磁気共鳴スペクトル）により測定した。 The content of the structural units in the obtained synthetic resin was measured by dissolving the synthetic resin in DMSO-D6 (dimethyl sulfoxide) and then using 1 H-NMR (nuclear magnetic resonance spectrum).
（実施例１～６及び比較例１～４）
実施例１では上記合成樹脂Ｘ１を、実施例２～６では合成樹脂Ｘ２～Ｘ６をそれぞれ用いた。
(Examples 1 to 6 and Comparative Examples 1 to 4)
In Example 1, the synthetic resin X1 was used, and in Examples 2 to 6, the synthetic resins X2 to X6 were used, respectively.
合成樹脂Ｘ２は、ブチラール化度７１モル％、アセチル化度１モル％及び水酸基量２８モル％であるポリビニルアセタール樹脂に、モノマーとして、ジメチルアミノアクリルアミド２ｍｏｌ％が配合された樹脂であり、表１に示す構成を備える樹脂である。合成条件は、次の通りとした。すなわち、上記ポリビニルアセタール樹脂をＴＨＦに濃度２０ｗｔ％で溶解させ、ジメチルアミノアクリルアミドを２重量部添加した後、開始剤を３重量部溶解させ、ＵＶ重合試験機にて２０分間ＵＶ照射した。 Synthetic resin X2 is a resin in which 2 mol% of dimethylaminoacrylamide is blended as a monomer into polyvinyl acetal resin with a butyralization degree of 71 mol%, an acetylation degree of 1 mol%, and a hydroxyl group amount of 28 mol%, and has the composition shown in Table 1. The synthesis conditions were as follows: the polyvinyl acetal resin was dissolved in THF at a concentration of 20 wt%, 2 parts by weight of dimethylaminoacrylamide was added, and then 3 parts by weight of an initiator was dissolved and irradiated with UV for 20 minutes using a UV polymerization tester.
また、合成樹脂Ｘ３及び合成樹脂Ｘ４は、表１に示すように、合成樹脂中のジメチルアミノアクリルアミドの含有割合を、２ｍｏｌ％から５ｍｏｌ％、２１ｍｏｌ％としたことを除いては、合成樹脂Ｘ２と同様である。 Furthermore, synthetic resin X3 and synthetic resin X4 are similar to synthetic resin X2, except that the content of dimethylaminoacrylamide in the synthetic resin is changed from 2 mol% to 5 mol% and 21 mol%, as shown in Table 1.
合成樹脂Ｘ５は、モノマーとして、ジエチルアミノアクリルアミドを用いて、その含有割合を２８ｍｏｌ％としたことを除いては、合成樹脂Ｘ２と同様である。合成樹脂Ｘ６は、モノマーとして、ビニルイミダゾールを用いて、その含有割合を１６ｍｏｌ％としたことを除いて、合成樹脂Ｘ２と同様である。 Synthetic resin X5 is similar to synthetic resin X2, except that diethylaminoacrylamide is used as the monomer and its content is 28 mol%. Synthetic resin X6 is similar to synthetic resin X2, except that vinylimidazole is used as the monomer and its content is 16 mol%.
また、比較例２～４では、表２に示す組成のポリビニルアセタール樹脂を用いた。 In Comparative Examples 2 to 4, polyvinyl acetal resins with the compositions shown in Table 2 were used.
細胞培養用容器の作製；
表１及び表２に示す合成樹脂０．１重量部をブタノール・メタノール混合溶媒（９：１）１９.９重量部に溶解させた。得られた溶液２００μＬを、ポリスチレンディッシュにキャストした後、６０℃で１２０分間加熱して、表面が平滑な樹脂膜（細胞培養用足場材料からなる樹脂膜）が形成された細胞培養用容器を得た。
Fabrication of cell culture vessels;
0.1 parts by weight of the synthetic resin shown in Tables 1 and 2 was dissolved in 19.9 parts by weight of a butanol/methanol mixed solvent (9:1). 200 μL of the resulting solution was cast onto a polystyrene dish and heated at 60° C. for 120 minutes to obtain a cell culture vessel on which a resin film (a resin film made of a scaffold material for cell culture) with a smooth surface was formed.
なお、比較例１では、ポリスチレンディッシュ自体を細胞培養用容器として用いた。 In Comparative Example 1, the polystyrene dish itself was used as the cell culture vessel.
ｐＨ７．０におけるゼータ電位の測定；
ゼータ電位測定機器（アントンパール社製、型番ＳＵＲＰＡＳＳ ３）を用いて、実施例１～６及び比較例２～４で得られた樹脂膜のゼータ電位をそれぞれ求めた。まず、０．１ｍＭのＫＣｌ溶液を用意した。次に、セルに足場材料の樹脂膜をセットしたあと、ｐＨ電極及び導電率計を設定した。ＨＣｌとＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨ９～３まで滴定することで各ｐＨでのゼータ電位を測定した。
Measurement of zeta potential at pH 7.0;
The zeta potential of the resin films obtained in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 2 to 4 was measured using a zeta potential measuring device (manufactured by Anton Paar, model number SURPASS 3). First, a 0.1 mM KCl solution was prepared. Next, the resin film of the scaffold material was set in the cell, and then a pH electrode and a conductivity meter were set. The zeta potential at each pH was measured by titrating from pH 9 to 3 using HCl and NaOH solutions.
なお、比較例１では、ポリスチレンディッシュのゼータ電位を求めた。また、比較例２及び比較例３は、ゼータ電位が測定下限値未満だったため測定不能とした。 In Comparative Example 1, the zeta potential of the polystyrene dish was determined. In Comparative Examples 2 and 3, the zeta potential was below the lower measurement limit and therefore could not be measured.
表面自由エネルギーの測定；
実施例１～６及び比較例２～４で得られた樹脂膜の表面自由エネルギーについて接触角計（協和界面科学社製、ＤＭｏ－７０１）を用いて測定した。上記樹脂膜上に純水１μＬを着滴させ、３０秒後の液滴像を撮影することで純水の接触角を得た。また、上記樹脂膜上にジヨードメタン１μＬを着滴させ、３０秒後の液滴像を撮影することでジヨードメタンの接触角を得た。得られた上記接触角をＫａｅｌｂｌｅ－Ｕｙ理論を用いて表面自由エネルギーγ、分散項成分γｄ、極性項成分である双極子成分γｐを導出した。なお、比較例１では、ポリスチレンディッシュの表面自由エネルギーを求めた。
Measurement of surface free energy;
The surface free energy of the resin films obtained in Examples 1 to 6 and Comparative Examples 2 to 4 was measured using a contact angle meter (Kyowa Interface Science Co., Ltd., DMo-701). 1 μL of pure water was deposited on the resin film, and the image of the droplet was photographed after 30 seconds to obtain the contact angle of pure water. In addition, 1 μL of diiodomethane was deposited on the resin film, and the image of the droplet was photographed after 30 seconds to obtain the contact angle of diiodomethane. From the obtained contact angles, the surface free energy γ, the dispersion term component γ d , and the dipole component γ p which is the polar term component were derived using the Kaelble-Uy theory. In addition, in Comparative Example 1, the surface free energy of a polystyrene dish was obtained.
水膨潤倍率；
長さ５０ｍｍ、幅１０ｍｍ、厚み０．０５ｍｍ～０．１５ｍｍの各足場材料からなる樹脂膜（測定サンプル）を、２５℃の水に２４時間に浸漬した。浸漬前と後のサンプルの重さを測定し、水膨潤倍率＝（浸漬後のサンプル重量－浸漬前のサンプル重量）／（浸漬前のサンプル重量）×１００（％）を算出した。
Water swelling ratio;
A resin film (measurement sample) made of each scaffold material with a length of 50 mm, a width of 10 mm, and a thickness of 0.05 mm to 0.15 mm was immersed in water at 25° C. for 24 hours. The weights of the samples before and after immersion were measured, and the water swelling ratio was calculated as follows: (sample weight after immersion - sample weight before immersion) / (sample weight before immersion) x 100 (%).
貯蔵弾性率；
各樹脂膜の２５℃及び１００℃における貯蔵弾性率は、動的粘弾性測定装置（アイティー計測制御社製、ＤＶＡ－２００）により測定した。上記動的粘弾性測定装置による測定は、長さ５０ｍｍ、幅５ｍｍ～２０ｍｍ、厚み０．１ｍｍ～１ｍｍの測定サンプルを用いて、周波数１０Ｈｚ、ひずみ０．１％、温度－１５０℃～１５０℃、及び昇温速度５℃／ｍｉｎの条件で行った。なお、比較例１では、ポリスチレンディッシュの貯蔵弾性率を求めた。また、得られた２５℃及び１００℃における貯蔵弾性率から、比（（２５℃における貯蔵弾性率）／（１００℃における貯蔵弾性率））を算出した。
Storage modulus;
The storage modulus of each resin film at 25°C and 100°C was measured using a dynamic viscoelasticity measuring device (IT Measurement and Control Co., Ltd., DVA-200). The measurement using the dynamic viscoelasticity measuring device was performed using a measurement sample with a length of 50 mm, a width of 5 mm to 20 mm, and a thickness of 0.1 mm to 1 mm under the conditions of a frequency of 10 Hz, a strain of 0.1%, a temperature of -150°C to 150°C, and a heating rate of 5°C/min. In Comparative Example 1, the storage modulus of a polystyrene dish was obtained. In addition, the ratio ((storage modulus at 25°C)/(storage modulus at 100°C)) was calculated from the obtained storage modulus at 25°C and 100°C.
細胞の播種及び培養；
以下の液体培地及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）特異的阻害剤を用意した。
Cell seeding and culture;
The following liquid medium and ROCK (Rho-associated kinase) specific inhibitor were prepared.
ＴｅＳＲ Ｅ８培地（ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ社製）
ＲＯＣＫ－Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｙ２７６３２）
TeSR E8 medium (manufactured by STEM CELL)
ROCK-Inhibitor (Y27632)
得られた細胞培養用容器にリン酸緩衝生理食塩水１ｍＬを加えて３７℃のインキュベーター内で１時間静置後、細胞培養用容器からリン酸緩衝生理食塩水を除去した。 1 mL of phosphate buffered saline was added to the resulting cell culture vessel and allowed to stand in an incubator at 37°C for 1 hour, after which the phosphate buffered saline was removed from the cell culture vessel.
φ３５ｍｍのディッシュにコンフルエント状態になったｈ－ｉＰＳ細胞２５３Ｇ１のコロニーを配置し、０．５ｍＭエチレンジアミン／リン酸緩衝溶液１ｍＬを加え、室温で２分静置した。エチレンジアミン／リン酸緩衝溶液を除去した後、ＴｅＳＲ Ｅ８培地１ｍＬでピペッティングすることにより５０μｍ～２００μｍの大きさに砕かれた細胞塊を得た。得られた細胞塊（細胞数０．５×１０５ｃｅｌｌｓ）を上記の細胞培養用容器にクランプ播種した。 A colony of confluent h-iPS cells 253G1 was placed in a φ35 mm dish, 1 mL of 0.5 mM ethylenediamine/phosphate buffer solution was added, and the dish was left to stand at room temperature for 2 minutes. After removing the ethylenediamine/phosphate buffer solution, cell clumps were obtained that were crushed to sizes of 50 μm to 200 μm by pipetting with 1 mL of TeSR E8 medium. The obtained cell clumps (cell count: 0.5×10 5 cells) were clamp-seeded into the above cell culture vessel.
播種時は１．５ｍＬの液体培地と、終濃度が１０μＭとなるようにＲＯＣＫ特異的阻害剤とを細胞培養用容器に添加した、３７℃及びＣＯ２濃度５％のインキュベーター内で１日間培養を行った。 At the time of seeding, 1.5 mL of liquid medium and a ROCK-specific inhibitor were added to the cell culture vessel so as to give a final concentration of 10 μM, and the cells were cultured for one day in an incubator at 37° C. with a CO 2 concentration of 5%.
（評価）
ＳＦの評価；
１日間培養を行った後、前述したように、シェイプファクター（ＳＦ）を評価した。評価に際しては、位相差顕微鏡による倍率４倍における観察画像を得た。画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を用いて細胞塊の周囲長及びその面積を算出し、ＳＦ＝４×π×（細胞塊の平面積／細胞塊の外周縁の長さ）２でＳＦ値を求めた。図３は、ＳＦ≒０．２の場合の細胞塊の平面形状を示す写真であり、図４はＳＦ≒１である場合の細胞塊の平面形状の写真である。
(evaluation)
Evaluation of SF;
After culturing for one day, the shape factor (SF) was evaluated as described above. For the evaluation, observation images were obtained at 4x magnification using a phase contrast microscope. The perimeter and area of the cell cluster were calculated using image analysis software (Image J), and the SF value was calculated using SF = 4 x π x (plane area of cell cluster/length of outer edge of cell cluster) 2. Figure 3 is a photograph showing the planar shape of the cell cluster when SF ≈ 0.2, and Figure 4 is a photograph showing the planar shape of the cell cluster when SF ≈ 1.
また、以下の基準によりＳＦを評価した。
〇〇〇：ＳＦが０．２未満
〇〇：ＳＦが０．２以上、０．４未満
〇：ＳＦが０．４以上、０．５未満
×：ＳＦが０．５以上
In addition, SF was evaluated according to the following criteria.
〇〇〇: SF is less than 0.2 〇〇: SF is 0.2 or more and less than 0.4 〇: SF is 0.4 or more and less than 0.5 ×: SF is 0.5 or more
結果を下記の表１及び表２に示す。 The results are shown in Tables 1 and 2 below.
表１及び表２から明らかなように、比較例１ではＳＦ値が０．８２と大きく、細胞の伸展性が低いことがわかる。比較例２～４においても、ＳＦ値が０．５６以上と大きく、細胞の伸展性が低いことがわかる。これに対して、実施例１～６では、ＳＦ値が０．４１以下であり、細胞の伸展性が大幅に優れていることがわかる。特に、実施例１，２，３では、ＳＦ値が０．２５以下であり、より好ましく、実施例２，３では、ＳＦ値が０．１７以下とさらに好ましいことがわかる。また、実施例１～６では、細胞塊の収縮も見られなかった。 As is clear from Tables 1 and 2, in Comparative Example 1, the SF value is large at 0.82, indicating low cell extensibility. In Comparative Examples 2 to 4, the SF values are also large at 0.56 or more, indicating low cell extensibility. In contrast, in Examples 1 to 6, the SF values are 0.41 or less, indicating significantly better cell extensibility. In particular, in Examples 1, 2, and 3, the SF values are 0.25 or less, which is more preferable, and in Examples 2 and 3, the SF values are 0.17 or less, which is even more preferable. Furthermore, in Examples 1 to 6, no shrinkage of the cell aggregates was observed.
１…細胞培養用容器
２…容器本体
２ａ…表面
３…樹脂膜
1...
Claims (5)
ｐＨ７．０におけるゼータ電位が、－４０ｍＶ以上、＋３０ｍＶ以下であり、
表面自由エネルギーの分散項成分が３０．０ｍＪ／ｍ２以上、３６．０ｍＪ／ｍ２ 未満であり、
表面自由エネルギーの極性項成分が１．５ｍＪ／ｍ２以上、６．０ｍＪ／ｍ２ 未満であり、
前記合成樹脂が、ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂を含み、
前記ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂が、ブレンステッド塩基性基を有し、
前記ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂において、ブレンステッド塩基性基による変性度が、２モル％以上、３０モル％以下であり、
前記ポリビニルアセタール骨格を有する合成樹脂が、イミン構造を有する構造単位、イミド構造を有する構造単位、アミン構造を有する構造単位、又はアミド構造を有する構造単位を有する、樹脂膜。 A resin film made of a scaffold material for cell culture containing a synthetic resin,
The zeta potential at pH 7.0 is −40 mV or more and +30 mV or less;
The dispersion term component of the surface free energy is 30.0 mJ/ m2 or more and less than 36.0 mJ/ m2 ,
The polar term component of the surface free energy is 1.5 mJ/ m2 or more and less than 6.0 mJ/ m2 ;
the synthetic resin includes a synthetic resin having a polyvinyl acetal skeleton ,
the synthetic resin having a polyvinyl acetal skeleton has a Bronsted basic group,
the degree of modification with a Bronsted basic group in the synthetic resin having a polyvinyl acetal skeleton is 2 mol % or more and 30 mol % or less;
A resin film , wherein the synthetic resin having a polyvinyl acetal skeleton has a structural unit having an imine structure, a structural unit having an imide structure, a structural unit having an amine structure, or a structural unit having an amide structure .
２５℃における貯蔵弾性率と１００℃における貯蔵弾性率との比（（２５℃における貯蔵弾性率）／（１００℃における貯蔵弾性率））が１×１０以上、１×１０５以下である、請求項１に記載の樹脂膜。 The storage modulus at 100° C. is 1×10 4 Pa or more and 1×10 8 Pa or less,
2. The resin film according to claim 1, wherein the ratio of the storage modulus at 25° C. to the storage modulus at 100° C. ((storage modulus at 25° C.)/(storage modulus at 100° C.)) is 1×10 or more and 1 × 10 or less.
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