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JP7634082B2 - 補体因子ｄを検出するためのモノクローナル抗体、組成物、および方法 - Google Patents

補体因子ｄを検出するためのモノクローナル抗体、組成物、および方法 Download PDF

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JP7634082B2 JP2023512070A JP2023512070A JP7634082B2 JP 7634082 B2 JP7634082 B2 JP 7634082B2 JP 2023512070 A JP2023512070 A JP 2023512070A JP 2023512070 A JP2023512070 A JP 2023512070A JP 7634082 B2 JP7634082 B2 JP 7634082B2
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Description

関連出願の相互参照
本出願は、2020年8月18日に出願された米国仮出願第63/066,942号、2020年8月18日に出願された米国仮出願第63/066,948号、および2021年6月7日に出願された米国仮出願第63/197,833号の恩典を主張するものであり、これらの仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は、成熟因子Dおよびプロ因子Dの存在および量の検出において使用するためのモノクローナル抗体、およびそのような抗体を含む組成物に関する。
配列表に関する声明
本出願に関する配列表は、紙の写しに代えてテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名称は、以下である：MP_1_0316_PCT_Sequence_Listing_20210816_ST25。このテキストファイルは、139 KBであり；2021年8月16日に作成され、本明細書の提出と共にEFS-Webを介して提出されている。
背景
補体系は、病原体に対する先天性宿主防御を支援し、調節異常でかつ衰えのない補体活性は、自己免疫疾患の大きな推進力としても機能し、抑制の効かない炎症および組織破壊の伝播を引き起こし得る。しかしながら、調節異常でかつ衰えのない補体活性は、疾患の大きな推進力としても機能し、抑制の効かない炎症および組織破壊の伝播を引き起こし得る。補体の代替経路（APC）は、一般的には、補体活性の下流増幅装置として説明され、古典的経路およびレクチン経路を介する補体の活性化に続いて宿主免疫反応を高める。しかしながら、同じタイプの新たな複合体の形成を活発に駆動するプロテアーゼ複合体の正のフィードバックループを生じるAPCの能力は、補体経路の中でも独特である（Lachmann P.J, Adv Immunol 104:115-49, 2009（非特許文献1））。
補体因子D（CFD）は、APCの活性化に必須のセリンプロテアーゼである。因子Dは、C3bに結合している因子Bを切断し、代替経路C3/C5コンバターゼの活性成分であるC3b/Bb酵素を生成する。CFDは、不活性酵素前駆体（本明細書において「プロ因子D」と称される）として発現される一方で、CFDは、主に、切断された成熟セリンプロテアーゼ（本明細書において「成熟因子D」と称される）として血漿中を循環する。WO2013/180834（特許文献1）およびWO2013/192240（特許文献2）に記載されているように、近年、MASP-3が、補体因子D（CFD）の酵素前駆体型（プロ因子D）から活性化型（成熟因子D）への変換を担っており、したがって、MASP-3タンパク質が、APCにとって重要な上流の調節的立場にあることが究明された。参照により本明細書に組み入れられるWO2018/026722（特許文献3）にさらに記載されているように、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合してその触媒活性を阻害する多数の高親和性抗MASP-3阻害抗体が作製されている。
補体研究分野の現在の問題は、市販の検査キットの抗因子D抗体が、プロ因子Dと活性化型（成熟因子D）とを識別しないことである。野生型動物またはヒトの血漿では、全身のCFDの大部分は、インビボMASP-3活性によってすでに成熟型へとプロセシングされており、このことが、従来のアッセイを使用したMASP-3阻害剤によるAPC阻害のインビトロ評価を不可能にしている。それゆえ、APC状態のバイオマーカーとして使用するため、かつ、それによりMASP-3阻害剤によるAPC阻害のインビトロ評価が可能になる、生体サンプル中のプロ因子Dおよび／または成熟因子Dの存在および量を測定するための検出試薬およびアッセイの必要性が存在する。
WO2013/180834 WO2013/192240 WO2018/026722
Lachmann P.J, Adv Immunol 104:115-49, 2009
概要
本概要は、種々の概念を簡易化した形で紹介するために提供されるものであり、これらの概念は、以下の詳細な説明においてさらに説明される。本概要は、請求項に記載される主題の重要な特徴を特定することを意図するものではなく、また請求項に記載される主題の範囲を決定する際の補助として用いられることを意図するものでもない。
本発明は、生体サンプル中のプロ因子Dおよび／または成熟因子Dの存在および量を測定するための検出試薬およびアッセイの必要性に応えるものである。
一局面では、本開示は、ヒト成熟因子Dのアミノ末端領域中のエピトープであって、アミノ酸配列ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一態様では、単離された抗体またはその断片は、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に結合しない。一態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。一態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその断片の重鎖可変領域のCDRおよび／または軽鎖可変領域のCDRをコードする核酸分子を提供する。
別の局面では、本開示は、ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチド上のエピトープであって、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一態様では、抗体は、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に特異的に結合し、かつ成熟因子D（SEQ ID NO：3）に結合しない。一態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。一態様では、本開示は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその断片の重鎖可変領域のCDRおよび／または軽鎖可変領域のCDRをコードする核酸分子を提供する。
別の局面では、本開示は、試験サンプル中の成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの存在または量を検出するためのキットであって、(a)少なくとも1つの容器と(b)ヒト成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその断片とを含む、キットを提供する。
別の局面では、本開示は、ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体が、SEQ ID NO：85～88からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：89～93からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。
別の局面では、本開示は、(a)インビトロイムノアッセイにおいて試験サンプルと成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片とを接触させる工程；および(b)成熟因子Dに結合した抗体またはその断片の有無または量を検出する工程を含む、試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を判定する方法であって、結合の存在が、試料中の成熟因子Dの存在または量を示し；抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）として示される成熟因子DのN末端領域中のエピトープに結合する、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、(a)インビトロイムノアッセイにおいて試験サンプルと抗ヒトプロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片とを接触させる工程；および(b)プロ因子Dに結合した抗体またはその断片の存在または量を検出する工程を含む、試験サンプル中のプロ因子Dの存在または量を判定する方法であって、結合の存在が、試料中のプロ因子Dの存在または量を示し；抗ヒト成熟プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）として示されるヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチド中のエピトープに特異的に結合する、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、試験サンプルにおける代替経路補体（APC）活性化の程度を評価する方法であって、(a) 試験サンプルを提供する工程；(b) (i) 試験サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出することであって、成熟因子Dが、成熟因子D中に存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）中のエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dに結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその断片で捕捉もしくは検出される、成熟因子Dを捕捉および検出すること；および／または(ii) 試験サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することであって、プロ因子Dが、プロ因子D中に存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）上のエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dに結合しないプロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその断片で捕捉もしくは検出される、プロ因子Dを捕捉および検出すること、のうちの少なくとも1つを含むイムノアッセイを実施する工程；ならびに(c) (b)(i)に従って検出された成熟因子Dのレベルを所定のレベルまたは対照試料と比較する工程、および／または(b)(ii)に従って検出されたプロ因子Dのレベルを所定のレベルまたは対照試料と比較する工程を含み、試験サンプル中で検出された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルが、代替経路補体活性化の程度の指標となる、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体による処置の有効性をモニタリングするための方法であって、(a) 第1の時点においてMASP-3阻害抗体の一定用量を哺乳類対象に投与する工程；(b) 工程(a)後に対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第1の濃度を評価する工程；(c) 第2の時点において対象をMASP-3阻害抗体で処置する工程；(d) 工程(c)後に対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第2の濃度を評価する工程；ならびに(e) 工程(b)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルを、工程(d)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルと比較して、哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体の有効性を判定する工程を含む、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクのある哺乳類対象を処置する方法であって、対象が(i) 対象から採取された1つまたは複数の試料中のプロ因子Dのレベルが、所定のプロ因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照試料中のプロ因子Dレベルと比較してより低いまたは減少したと判定された場合：および／または(ii) 対象から採取された1つまたは複数の試料中の成熟因子Dのレベルが、所定の成熟因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照試料中の成熟因子Dレベルと比較してより高いまたは増加したと判定された場合に、MASP-3阻害抗体を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
別の局面では、本開示は、pH 6.0±5％、20±5％ mMのヒスチジン、100±5％ mg/mLのスクロース、および0.035％±5％のポリソルベート80を有する緩衝液系を含む水溶液中にMASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物であって、前記MASP-3阻害抗体が、110mg/mL±5％の濃度で含まれ、前記MASP-3阻害抗体が、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1；
Figure 0007634082000001
または
Figure 0007634082000002
を含むHC-CDR2；およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；SEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2；およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、薬学的組成物を提供する。
別の局面では、本開示は、MASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物を含有する製造品であって、MASP-3阻害抗体が、ヒト対象への治療的投与に適した10mg～1000mgの単位剤形である、製造品を提供する。
[本発明1001]
ヒト成熟因子Dのアミノ末端領域におけるエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該エピトープが、アミノ酸配列ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなる、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1002]
ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、本発明1001の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1003]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1001または1002の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1004]
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、本発明1001～1003のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1005]
前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、F(ab) 2 、およびF(ab') 2 からなる群より選択される、本発明1001～1004のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1006]
一本鎖分子である、本発明1001～1005のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1007]
前記抗体が、IgG1、IgG2、およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である、本発明1001～1006のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1008]
10nM未満のK D でヒト成熟因子Dに結合する、本発明1001～1007のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1009]
検出可能な部分で標識されている、本発明1001～1008のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1010]
基材上に固定化されている、本発明1001～1009のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1011]
ヒト成熟因子Dに特異的に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1001～1010のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1012]
ヒト成熟因子Dに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、IまたはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000003
を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列
Figure 0007634082000004
を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、GまたはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、IまたはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000005
を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、本発明1001～1011のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1013]
前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：50を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、本発明1001～1012のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1014]
(a) SEQ ID NO：12またはSEQ ID NO：13のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：18またはSEQ ID NO：19のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(c) SEQ ID NO：12を含むVHおよびSEQ ID NO：18を含むVL;ならびに／または
(d) SEQ ID NO：13を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：19を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1013の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1015]
前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：33を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：34を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：36を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：58を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、本発明1001～1012のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1016]
(a) SEQ ID NO：14のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：20のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：14を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：20を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1015の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1017]
前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：38を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：60を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、本発明1001～1012のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1018]
(a) SEQ ID NO：15のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：21のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：15を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：21を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1017の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1019]
前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：62を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR22、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、本発明1001～1012のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1020]
(a) SEQ ID NO：16のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：22のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：16を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：22を含むVL
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1019の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1021]
前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：47を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：63を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：64を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、本発明1001～1012のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1022]
(a) SEQ ID NO：17のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：23のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：17を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：23を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1021の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1023]
本発明1011～1022のいずれかのヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
[本発明1024]
本発明1011～1022のいずれかのヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
[本発明1025]
本発明1023および／または本発明1024のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現カセット。
[本発明1026]
本発明1023または本発明1024のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
[本発明1027]
ヒト成熟因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子の発現を可能とする条件下で本発明1026の細胞を培養する工程、および抗成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、方法。
[本発明1028]
本発明1001～1022のいずれかのヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
[本発明1029]
本発明1001～1022のいずれかのヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノアッセイにおいて使用するための基材。
[本発明1030]
(a) 少なくとも1つの容器と、(b) 本発明1001～1022のいずれかのヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片とを含む、試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を検出するためのキット。
[本発明1031]
ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該エピトープが「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなる、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1032]
ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に特異的に結合し、かつ成熟因子D（SEQ ID NO：3）には結合しない、本発明1031の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1033]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1031または1032の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1034]
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、本発明1031～1033のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1035]
前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、F(ab) 2 、およびF(ab') 2 からなる群より選択される、本発明1031～1034のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1036]
一本鎖分子である、本発明1031～1035のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1037]
前記抗体が、IgG1、IgG2、およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である、本発明1031～1036のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1038]
10nM未満のK D でヒトプロ因子Dに結合する、本発明1031～1037のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1039]
検出可能な部分で標識されている、本発明1031～1038のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1040]
基材上に固定化されている、本発明1031～1039のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1041]
前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1031～1039のいずれかのヒトプロ因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1042]
SEQ ID NO：136～139からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～145からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、本発明1031～1041のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1043]
以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XYWMS（SEQ ID NO：201）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはN、SまたはTである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000006
を含むHC-CDR2（配列中、7位のXはDまたはEであり、11位のXはTまたはAであり、12位のXはHまたはYであり、14位のXはAまたはTである）；(c) アミノ酸配列AWFAX（SEQ ID NO：203）を含むHC-CDR3（配列中、5位のXはS、YまたはNである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000007
を含むLC-CDR1（配列中、1位のXはMまたはKであり、5位のXはSまたはNであり、10位のXはKまたはRである）；(e) アミノ酸配列WASTRES（SEQ ID NO：178）を含むLC-CDR2；および(f) アミノ酸配列LQYYXYPYT（SEQ ID NO：205）を含むLC-CDR3（配列中、5位のXはTまたはSである）
を含む結合ドメインを含む、本発明1031～1042のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1044]
以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：149またはSEQ ID NO：155を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：151またはSEQ ID NO：156を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：153を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：176を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：178を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：180を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、本発明1031～1043のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1045]
(a) SEQ ID NO：136のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：137のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(c) SEQ ID NO：142のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(d) SEQ ID NO：143のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(e) SEQ ID NO：136を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：142を含むVLドメイン；ならびに／または
(f) SEQ ID NO：137を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：143を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1044の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1046]
以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：158を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：159またはSEQ ID NO：163を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：161またはSEQ ID NO：165を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：184またはSEQ ID NO：189を含むLC-CDR-1、(e) SEQ ID NO：178を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：187を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、本発明1031～1043のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1047]
(a) SEQ ID NO：138のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；(b) SEQ ID NO：139のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：144のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(c) SEQ ID NO：145のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(d) SEQ ID NO：138を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：144を含むVLドメイン；ならびに／または
(e) SEQ ID NO：139を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：145を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1046の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1048]
SEQ ID NO：140およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：146およびSEQ ID NO：147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、本発明1031～1041のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1049]
以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：167を含むCDR-H1、(b) SEQ ID NO：169またはSEQ ID NO：173を含むCDR-H2、(c) SEQ ID NO：171またはSEQ ID NO：174を含むCDR-H3、(d) SEQ ID NO：194を含むCDR-L1、(e) SEQ ID NO：196またはSEQ ID NO：199を含むCDR-L2、および(f) SEQ ID NO：198またはSEQ ID NO：200を含むCDR-L3
を含む結合ドメインを含む、本発明1031～1041のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1050]
(a) SEQ ID NO：140のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：141のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(c) SEQ ID NO：146のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(d) SEQ ID NO：147のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(e) SEQ ID NO：140を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：146を含むVLドメイン；ならびに／または
(f) SEQ ID NO：141を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：147を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1049の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1051]
本発明1031～1050のいずれかのヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
[本発明1052]
本発明1031～1050のいずれかのヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
[本発明1053]
本発明1051および／または本発明1052のヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現カセット。
[本発明1054]
本発明1051および／または本発明1052のヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
[本発明1055]
ヒトプロ因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、ヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子の発現を可能とする条件下で本発明1054の細胞を培養する工程、および抗プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、方法。
[本発明1056]
本発明1031～1050のいずれかのヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
[本発明1057]
本発明1031～1050のいずれかのヒトプロ因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノアッセイにおいて使用するための基材。
[本発明1058]
(a) 少なくとも1つの容器と、(b) 本発明1031～1050のいずれかのヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片とを含む、試験サンプル中のプロ因子Dの存在または量を検出するためのキット。
[本発明1059]
ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体が、SEQ ID NO：85～88からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：89～93からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1060]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1059の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1061]
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、本発明1059または1060の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1062]
前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される、本発明1059～1061のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1063]
前記抗体が一本鎖分子である、本発明1059～1062のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1064]
前記抗体が、IgG1、IgG2、およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である、本発明1059～1063のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1065]
10nM未満のK D でヒト因子Dに結合する、本発明1059～1064のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1066]
検出可能な部分で標識されている、本発明1059～1065のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1067]
基材上に固定化されている、本発明1059～1066のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1068]
前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1059～1067のいずれかのヒトプロ因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1069]
以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列SEQ ID NO：95を含むHC-CDR1、(b) アミノ酸配列SEQ ID NO：97を含むHC-CDR2、(c) アミノ酸配列SEQ ID NO：99を含むHC-CDR3、(d) アミノ酸配列SEQ ID NO：111を含むLC-CDR1、(e) アミノ酸配列SEQ ID NO：113を含むLC-CDR2；および(f) アミノ酸配列SEQ ID NO：115を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、本発明1059～1068のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1070]
以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列SEQ ID NO：101を含むHC-CDR1、(b) アミノ酸配列SEQ ID NO：103または107を含むHC-CDR2、(c) アミノ酸配列SEQ ID NO：105または108を含むHC-CDR3、(d) アミノ酸配列SEQ ID NO：60または123を含むLC-CDR1、(e) アミノ酸配列SEQ ID NO：119、124、または126を含むLC-CDR2、および(f) アミノ酸配列SEQ ID NO：121または125を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、本発明1059～1068のいずれかの単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1071]
(a) SEQ ID NO：85のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：86のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(c) SEQ ID NO：87のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(d) SEQ ID NO：88のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(e) SEQ ID NO：89のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(f) SEQ ID NO：90のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(g) SEQ ID NO：91のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(h) SEQ ID NO：92のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(i) SEQ ID NO：93のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(j) SEQ ID NO：85を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：89またはSEQ ID NO：90を含むVLドメイン;
(k) SEQ ID NO：86を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：91を含むVLドメイン；
(l) SEQ ID NO：87を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：92を含むVLドメイン；ならびに／または
(m) SEQ ID NO：88を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：93を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1070の単離された抗体またはその抗原結合断片。
[本発明1072]
本発明1059～1071のいずれかのヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
[本発明1073]
本発明1059～1071のいずれかのヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
[本発明1074]
本発明1072および／または本発明1073のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む、クローニングベクターまたは発現カセット。
[本発明1075]
本発明1072および／または本発明1073のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
[本発明1076]
ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、因子Dに結合する該抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子の発現を可能とする条件下で本発明1075の細胞を培養する工程、および当該抗因子D特異的抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、方法。
[本発明1077]
本発明1059～1071のいずれかのヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
[本発明1078]
本発明1059～1071のいずれかのヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノアッセイにおいて使用するための基材。
[本発明1079]
(a) 少なくとも1つの容器と、(b) 本発明1059～1071のいずれかのヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに共通のエピトープに結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片とを含む、試験サンプル中の因子Dの存在または量を検出するためのキット。
[本発明1080]
イムノアッセイにおいて、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）および／またはプロ因子D（SEQ ID NO：2）を特異的に検出または定量する少なくとも1つのモノクローナル抗体を含むキットであって、該少なくとも1つのモノクローナル抗体が、
(i) ヒト成熟因子Dのアミノ末端を包含するエピトープに特異的に結合する成熟因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片であって、該エピトープが、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかもしくはそれからなり、該抗体がヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、抗体またはその抗原結合断片；および／または
(ii) ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合するプロ因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片であって、該エピトープが、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含むかもしくはそれからなり、該抗体が成熟因子D（SEQ ID NO：3）には結合しない、抗体またはその抗原結合断片
を含む、キット。
[本発明1081]
ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）およびヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）の両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片を更に含む、本発明1080のキット。
[本発明1082]
少なくとも1つの容器を更に含む、本発明1080または1081のキット。
[本発明1083]
ヒト成熟因子Dに特異的に結合するサブパート(i)の抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1080～1082のいずれかのキット。
[本発明1084]
ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合するサブパート(ii)の抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1080～1083のいずれかのキット。
[本発明1085]
前記イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）である、本発明1080～1084のいずれかのキット。
[本発明1086]
前記サブパート(i)の成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、コーティング抗体である、本発明1080のキット。
[本発明1087]
前記サブパート(i)の成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、検出抗体である、本発明1080のキット。
[本発明1088]
前記サブパート(ii)のプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、コーティング抗体である、本発明1080のキット。
[本発明1089]
前記サブパート(ii)のプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、検出抗体である、本発明1080のキット。
[本発明1090]
前記抗因子D抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：85～88からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：89～93からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1081のキット。
[本発明1091]
試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を判定する方法であって、
(a) インビトロイムノアッセイにおいて、試験サンプルを成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程；および
(b) 成熟因子Dに結合した該抗体またはその抗原結合断片の存在もしくは不存在または量を検出する工程であって、該結合の存在が該サンプル中の成熟因子Dの存在または量を示す、工程
を含み、
該抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）として示される成熟因子DのN末端領域におけるエピトープに結合する、方法。
[本発明1092]
前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、本発明1091の方法。
[本発明1093]
前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、基材上に固定化されている、本発明1091または1092の方法。
[本発明1094]
前記イムノアッセイがELISAアッセイである、本発明1091～1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な部分で標識されており、工程(b)が、該検出可能な部分の存在または量を検出することを含む、本発明1091～1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片がネイキッドであり（すなわち、標識されておらず）、成熟因子Dに結合した該抗体またはその断片の存在または量が、該抗成熟因子D抗体に結合する標識された抗体を使用して検出される、本発明1091～1094のいずれかの方法。
[本発明1097]
前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が基材上に固定化（すなわち、捕捉／コーティング）されており、前記結合した成熟因子Dが、因子Dの異なるエピトープに結合する第2の抗体を用いて検出される、本発明1091～1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
前記試験サンプルが、哺乳類対象から得られた生体サンプルであり、例えば、該生体サンプルが、血液、血清、血漿、尿、および脳脊髄液からなる群より選択される、本発明1091～1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
前記哺乳類対象が、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する、本発明1098の方法。
[本発明1100]
前記哺乳類対象が、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片で処置されたことがある、本発明1098または1099の方法。
[本発明1101]
前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、本発明1091～1100のいずれかの方法。
[本発明1102]
前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、I、またはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000008
を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列
Figure 0007634082000009
を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、G、またはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、I、またはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000010
を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、本発明1091～1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：50を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、本発明1102の方法。
[本発明1104]
試験サンプル中のプロ因子Dの存在または量を判定する方法であって、
(a) インビトロイムノアッセイにおいて、試験サンプルを抗ヒトプロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程；および
(b) プロ因子Dに結合した該抗体またはその抗原結合断片の存在または量を検出する工程であって、該結合の存在が該サンプル中のプロ因子Dの存在または量を示す、工程
を含み、
該抗ヒト成熟プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）として示されるヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合する、方法。
[本発明1105]
前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に特異的に結合し、かつヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）には結合しない、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、基材上に固定化されている、本発明1104または1105の方法。
[本発明1107]
前記イムノアッセイがELISAアッセイである、本発明1104～1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な部分で標識されており、工程(b)が、該検出可能な部分の存在または量を検出することを含む、本発明1104～1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片がネイキッドであり（すなわち、標識されておらず）、成熟因子Dに結合した該抗体またはその断片の存在または量が、該抗プロ因子D抗体に結合する標識された抗体を使用して検出される、本発明1104～1107のいずれかの方法。
[本発明1110]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、基材上に固定化（すなわち、捕捉／コーティング）されており、前記結合したプロ因子Dが、因子Dの異なるエピトープに結合する第2の抗体を用いて検出される、本発明1104～1109のいずれかの方法。
[本発明1111]
前記試験サンプルが、哺乳類対象から得られた生体サンプルであり、例えば、該生体サンプルが、血液、血清、血漿、尿、および脳脊髄液からなる群より選択される、本発明1104～1110のいずれかの方法。
[本発明1112]
前記哺乳類対象が、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する、本発明1111の方法。
[本発明1113]
前記哺乳類対象が、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片で処置されたことがある、本発明1111または1112の方法。
[本発明1114]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1104～1113のいずれかの方法。
[本発明1115]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～139からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：142～145からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1104～1113のいずれかの方法。
[本発明1116]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：140およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：146およびSEQ ID NO：147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1104～1113のいずれかの方法。
[本発明1117]
前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：167を含むCDR-H1、(b) SEQ ID NO：169またはSEQ ID NO：173を含むCDR-H2、(c) SEQ ID NO：171またはSEQ ID NO：174を含むCDR-H3、(d) SEQ ID NO：194を含むCDR-L1、(e) SEQ ID NO：196またはSEQ ID NO：199を含むCDR-L2、および(f) SEQ ID NO：198またはSEQ ID NO：200を含むCDR-L3
を含む結合ドメインを含む、本発明1104～1113のいずれかの方法。
[本発明1118]
試験サンプルにおける代替経路補体（APC）の活性化の程度を評価する方法であって、
(a) 試験サンプルを提供する工程；
(b) 以下のうちの少なくとも1つを含むイムノアッセイを実施する工程：
(i) 該試験サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出することであって、成熟因子Dが、成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片で捕捉もしくは検出される、成熟因子Dを捕捉および検出すること；ならびに／または
(ii) 該試験サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することであって、プロ因子Dが、プロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しないプロ因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片で捕捉もしくは検出される、プロ因子Dを捕捉および検出すること；ならびに
(c) (b)(i)に従って検出された成熟因子Dのレベルを所定のレベルもしくは対照サンプルと比較するおよび／または(b)(ii)に従って検出されたプロ因子Dのレベルを所定のレベルもしくは対照サンプルと比較する工程であって、該試験サンプル中の検出された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルが、代替経路補体活性化の程度を示す、工程
を含む、方法。
[本発明1119]
工程(b)(i)が、成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で成熟因子Dを捕捉すること、ならびにヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、本発明1118の方法。
[本発明1120]
工程(b)(i)が、ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片で成熟因子Dを捕捉すること、ならびに成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、本発明1118の方法。
[本発明1121]
工程(b)(ii)が、プロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しないプロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片でプロ因子Dを捕捉すること、ならびにヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、本発明1118～1120のいずれかの方法。
[本発明1122]
工程(b)(ii)が、ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片でプロ因子Dを捕捉すること、ならびにプロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、本発明1118～1120のいずれかの方法。
[本発明1123]
成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない前記成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1118～1122のいずれかの方法。
[本発明1124]
プロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しない前記プロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、本発明1118～1123のいずれかの方法。
[本発明1125]
前記試験サンプルが、哺乳類対象から得られた生体サンプルである、本発明1118～1124のいずれかの方法。
[本発明1126]
前記生体サンプルが、全血、血清、血漿、尿、または脳脊髄液を含む、本発明1125の方法。
[本発明1127]
前記試験サンプルが、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害剤を含む、本発明1118～1126のいずれかの方法。
[本発明1128]
前記哺乳類対象が、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害剤で処置されたことがあり、前記アッセイを用いて代替経路の阻害の程度が測定される、本発明1125の方法。
[本発明1129]
前記哺乳類対象がヒト対象である、本発明1125または1128の方法。
[本発明1130]
前記ヒト対象が、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有するか、またはそれを有する疑いがある、本発明1129の方法。
[本発明1131]
前記代替経路疾患または障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される、本発明1130の方法。
[本発明1132]
前記対照サンプルが、MASP-3阻害剤による処置前に対象から採取されたサンプル、またはMASP-3阻害剤による処置の過程におけるより早い時点で採取されたサンプルである、本発明1128の方法。
[本発明1133]
前記MASP-3阻害剤が、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片である、本発明1128または1132の方法。
[本発明1134]
前記MASP-3阻害抗体が、MASP-3に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、かつ
(i) SEQ ID NO：220、222、223、225、226、および228からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：221、224、および227からなる群より選択される軽鎖可変領域のLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインであって、該CDRがKabat付番システムに従って付番される、結合ドメイン；
(ii) SEQ ID NO：229（TDDIN）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000011
を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：236（LEDTY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000012
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：242（KQSYNLYT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；
(iii) SEQ ID NO：230（SYGMS）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000013
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：237（GGEAMDY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000014
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：241（LVSKLDS）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：243（WQGTHFPWT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
(iv) SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000015
もしくは
Figure 0007634082000016
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1133の方法。
[本発明1135]
哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片による処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
(a) 第1の時点において、ある用量のMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を哺乳類対象に投与する工程；
(b) 工程(a)の後に該対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第1の濃度を評価する工程；
(c) 第2の時点において、該対象を該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片で処置する工程；
(d) 工程(c)の後に該対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第2の濃度を評価する工程；ならびに
(e) 工程(b)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルを、工程(d)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルと比較して、該哺乳類対象における該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の有効性を判定する工程
を含む、方法。
[本発明1136]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の用量を調整する工程を更に含む、本発明1135の方法。
[本発明1137]
前記成熟因子Dのレベルが対照または参照標準よりも高い場合に、前記対象に投与される前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の用量を増加させる、本発明1136の方法。
[本発明1138]
前記プロ因子Dのレベルが対照または参照標準よりも低い場合に、前記対象に投与される前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の用量を増加させる、本発明1136の方法。
[本発明1139]
増加させた用量の前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与する場合、工程(b)～(e)を繰り返して、該増加させた用量が、成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルをそれぞれの対照または参照標準と比較して所望のレベルに調整するのに十分であるかどうかを判定する、本発明1137または1138の方法。
[本発明1140]
工程(b)および(d)が、前記生体サンプルにおける成熟因子Dの濃度をイムノアッセイで評価することを含む、本発明1135の方法。
[本発明1141]
前記イムノアッセイが、(i) ヒト成熟因子DのN末端領域におけるアミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒトプロ因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記生体サンプル中に存在し得るプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）ではなく成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、本発明1140の方法。
[本発明1142]
工程(b)および(d)が、前記生体サンプルにおけるプロ因子Dの濃度をイムノアッセイで評価することを含む、本発明1135の方法。
[本発明1143]
前記イムノアッセイが、(i) ヒト因子Dのプロペプチドにおけるアミノ酸APPRGR（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒト成熟因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記生体サンプル中に存在し得る成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）ではなくプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、本発明1142の方法。
[本発明1144]
前記哺乳類対象がヒト対象である、本発明1135～1143のいずれかの方法。
[本発明1145]
前記ヒト対象が、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する、本発明1144の方法。
[本発明1146]
前記代替経路疾患または障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される、本発明1145の方法。
[本発明1147]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、本発明1135の方法。
[本発明1148]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、MASP-3に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、かつ
(i) SEQ ID NO：220、222、223、225、226、および228からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：221、224、および227からなる群より選択される軽鎖可変領域のLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインであって、該CDRがKabat付番システムに従って付番される、結合ドメイン；
(ii) SEQ ID NO：229（TDDIN）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000017
を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：236（LEDTY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000018
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：242（KQSYNLYT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；
(iii) SEQ ID NO：230（SYGMS）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000019
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：237（GGEAMDY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000020
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：241（LVSKLDS）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：243（WQGTHFPWT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
(iv) SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000021
もしくは
Figure 0007634082000022
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1147の方法。
[本発明1149]
代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する哺乳類対象を処置する方法であって、該対象が、
(i) 該対象から採取された1つもしくは複数のサンプル中のプロ因子Dのレベルが、所定のプロ因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照サンプル中のプロ因子Dレベルと比較して低いかまたは減少している；および／あるいは
(ii) 該対象から採取された1つもしくは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルが、所定の成熟因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照サンプル中の成熟因子Dレベルと比較して高いかまたは増加している
と判定された場合に、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1150]
前記対象から採取された1つまたは複数のサンプル中のプロ因子Dのレベルが、プロ因子D特異的モノクローナル抗体の使用を含むイムノアッセイを実施することによって判定される、本発明1149の方法。
[本発明1151]
前記イムノアッセイが、(i) ヒト因子Dのプロペプチドにおけるアミノ酸APPRGR（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒト成熟因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記サンプル中に存在し得る成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）ではなくプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、本発明1150の方法。
[本発明1152]
前記対象から採取された1つまたは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルが、成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用を含むイムノアッセイを実施することによって判定される、本発明1149の方法。
[本発明1153]
前記イムノアッセイが、(i) ヒト成熟因子DのN末端領域におけるアミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒトプロ因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記サンプル中に存在し得るプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）ではなく成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、本発明1152の方法
[本発明1154]
前記哺乳類対象がヒト対象である、本発明1149～1153のいずれかの方法。
[本発明1155]
前記ヒト対象が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する、本発明1154の方法。
[本発明1156]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、本発明1149の方法。
[本発明1157]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、MASP-3に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、かつ
(i) SEQ ID NO：220、222、223、225、226、および228からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：221、224、および227からなる群より選択される軽鎖可変領域のLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインであって、該CDRがKabat付番システムに従って付番される、結合ドメイン；
(ii) SEQ ID NO：229（TDDIN）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000023
を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：236（LEDTY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000024
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：242（KQSYNLYT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；
(iii) SEQ ID NO：230（SYGMS）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000025
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：237（GGEAMDY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000026
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：241（LVSKLDS）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：243（WQGTHFPWT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
(iv) SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000027
もしくは
Figure 0007634082000028
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域
のうちの少なくとも1つを含む、本発明1156の方法。
[本発明1158]
pHが6.0±5％であるバッファ系、20±5％mM ヒスチジン、100±5％mg/mL スクロース、および0.035％±5％ ポリソルベート80を含む水溶液中にMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物であって、該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が110mg/mL±5％の濃度で含まれ、該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000029
もしくは
Figure 0007634082000030
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、薬学的組成物。
[本発明1159]
無菌である、本発明1158の薬学的組成物。
[本発明1160]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：226またはSEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一を含む軽鎖可変領域とを含む、本発明1158の薬学的組成物。
[本発明1161]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、およびそれらのうちのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、本発明1158～1160のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1162]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、一本鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および全長抗体からなる群より選択される、本発明1158～1161のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1163]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、免疫グロブリン定常領域を更に含む、本発明1158～1162のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1164]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、ヒトIgG4定常領域を含む、本発明1158～1163のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1165]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、S228P変異を有するヒトIgG4定常領域を含む、本発明1164の薬学的組成物。
[本発明1166]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、低pHでのFcRn相互作用を促進する変異を含む、本発明1164または1165の薬学的組成物。
[本発明1167]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：245として示されるヒトIgG4定常領域を含む、本発明1166の薬学的組成物。
[本発明1168]
本発明1158～1167のいずれかの薬学的組成物を含有する、製造物品。
[本発明1169]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、ヒト対象への処置的投与に好適な10mg～1000mgの単位剤形である、本発明1168の製造物品。
[本発明1170]
前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、ヒト対象への処置的投与に好適な100mg～200mgの単位剤形である、本発明1169の製造物品。
[本発明1171]
容器と、該容器上または該容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む、本発明1168～1170のいずれかの製造物品。
[本発明1172]
前記容器が、ボトル、アンプル、パウチ（例えば、静脈内注入バッグ）、バイアル、シリンジ、およびカートリッジからなる群より選択される、本発明1171の製造物品。
[本発明1173]
代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する対象の処置において使用するための、本発明1158～1167のいずれかの薬学的組成物または本発明1168～1172のいずれかの製造物品。
[本発明1174]
前記代替経路疾患または障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される、本発明1173の薬学的組成物または製造物品。
本発明の前述の局面および付随する利点の多くは、以下の詳細な説明を添付図面と合わせて参照することによってそれらがより一層理解されるにつれ、より容易に認識されると考えられる。
古典的経路、レクチン経路、および副補体経路を示す略図である。 (i) シグナル配列aa 1～19（イタリック体で示す）および下線を引いた活性化（プロ）ペプチドを含む、ヒト完全長因子D（SEQ ID NO：1）；(ii) 下線を引いたプロペプチドを有するヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）；および(iii) ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）のアミノ酸配列を提供する。 様々な種由来のプロ因子Dのアミノ酸配列のアライメントを提供する。 実施例1に記載するように、成熟ヒト因子DのN末端に対応するペプチドで免疫化した後の代表マウス#2からの抗血清の力価測定をグラフで示す。 実施例1に記載するように、ポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）によって捕捉された場合のヒト成熟因子Dまたはヒトプロ因子Dへの結合についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした捕捉ELISAアッセイの結果をグラフで示す。 コーティングポリクローナルヤギ抗ヒトCFD 1824を用いて、実施例1に記載される各条件で存在するハイブリドーマ上清14A11により検出されたELISAアッセイの結果をグラフで示す。図6Aに示しているように、ハイブリドーマ上清14A11は、実施例1に記載するように、組換え成熟補体因子Dを選択的に検出可能であり、組換えプロ因子Dを検出しない。 コーティングポリクローナルヤギ抗ヒトCFD 1824を用いて、実施例1に記載される各条件で存在するハイブリドーマ上清6G6により検出されたELISAアッセイの結果をグラフで示す。図6Bに示しているように、ハイブリドーマ上清6G6は、実施例1に記載するように、組換え成熟補体因子Dを選択的に検出可能であり、組換えプロ因子Dを検出しない。 コーティングポリクローナルヤギ抗ヒトCFD 1824を用いて、実施例1に記載される各条件で存在するモノクローナル抗体mAb1824（R&D Systems）により検出されたELISAアッセイの結果をグラフで示す。図6Cに示しているように、モノクローナル抗体1824（R&D Systems）は、組換え成熟CFDと組換え活性CFDの両方を検出し、それゆえ、実施例1に記載するように、プロCFDと比べて、成熟CFDを選択的に検出できない。 実施例2に記載するように、抗ヒト成熟因子D特異的クローンについての重鎖可変領域（VH）配列のアミノ酸アライメントを示す：6G6_VH（SEQ ID NO：12）、14A11_VH（SEQ ID NO：13）、27B3_VH（SEQ ID NO：14）、58F5_VH（SEQ ID NO：15）、49G3_VH（SEQ ID NO：16）、および10G1_VH（SEQ ID NO：17）。 実施例2に記載するように、抗ヒト成熟因子D特異的クローンについての軽鎖可変領域（VL）配列のアミノ酸アライメントを示す：6G6_VK（SEQ ID NO：18）、14A11_VK：（SEQ ID NO：19）、27B3_VK：（SEQ ID NO：20）、58F5_VK：（SEQ ID NO：21）、49G3_VK：（SEQ ID NO：22）、および10G1_VK：（SEQ ID NO：23）。 多数の候補抗ヒト成熟因子D特異的抗体を用いた組換えヒトプロ因子Dまたは成熟因子Dの検出（またはその欠如）をグラフで示す。図8に示しているように、試験した精製抗体、すなわち6G6、14A11、10G1、49G3、27B3および58F5はすべて、実施例3に記載するように、因子Dの成熟型に特異的であることが判明した。 ヒト成熟因子Dで免疫化した後の代表マウス#1189の血清の、組換え成熟因子Dまたは組換えプロ因子Dの存在下での力価測定をグラフで示す。図9に示しているように、代表マウス#1189からの血清は、実施例4に記載するように、成熟因子Dとプロ因子Dの両方に結合可能な抗体を含有する。 実施例5に記載するように、抗ヒト因子Dクローンについての重鎖可変領域（VH）配列のアミノ酸アライメントを示す：3C5_VH（SEQ ID NO：85）、30H2_VH（SEQ ID NO：85）、11H1_VH（SEQ ID NO：86）、12H10_VH（SEQ ID NO：87）、および7H2_VH（SEQ ID NO：88）。 実施例5に記載するように、抗ヒト因子Dクローンについての軽鎖可変領域（VL）配列のアミノ酸アライメントを示す：3C5_VL（SEQ ID NO：89）、30H2_VL（SEQ ID NO：90）、11H1_VL（SEQ ID NO：91）、12H10_VL（SEQ ID NO：92）および7H2_VL（SEQ ID NO：93）。 図11Aは、組換えヒトプロ因子Dまたは成熟因子Dと候補抗ヒト因子D抗体3C5との結合をグラフで示しており、実施例5に記載するように、抗体3C5がヒトプロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合することを実証している。図11Bは、組換えヒトプロ因子Dまたは成熟因子Dと候補抗ヒト因子D抗体12H10との結合をグラフで示しており、実施例5に記載するように、抗体12H10がヒトプロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合することを実証している。 図12Aは、組換え抗因子D抗体3C5をELISAプレートにコーティングし、組換えヒトおよびカニクイザル成熟およびプロ因子D（huMat CFD、cy Mat CFD、huProCFDおよびcyPro CFD）を捕捉させたELISAアッセイの結果をグラフで示す。また、因子D枯渇ヒト血清（CFD Dpl血清）およびプールした正常カニクイザル血漿（NCP）の試料も捕捉した。捕捉された因子Dの検出は、実施例6に記載するように、抗ヒト成熟因子D特異的mAb 14A11のマウスIgG2a Fcバージョンを用いて行った。図12Bは、組換え抗因子D抗体12H10をELISAプレートにコーティングし、組換えヒトおよびカニクイザル成熟およびプロ因子D（huMat CFD、cy Mat CFD、huProCFDおよびcyPro CFD）を捕捉させたELISAアッセイの結果をグラフで示す。また、因子D枯渇ヒト血清（CFD Dpl血清）およびプールした正常カニクイザル血漿（NCP）の試料も捕捉した。捕捉された因子Dの検出は、実施例6に記載するように、抗ヒト成熟因子D特異的mAb 14A11のマウスIgG2a Fcバージョンを用いて行った。 実施例6に記載するように、捕捉抗体3C5（抗ヒト／カニクイザル因子D）と検出抗体14A11（抗ヒト／カニクイザル成熟因子D特異的）の組み合わせをELISAアッセイにおいて用いたヒトおよびカニクイザル成熟因子Dおよびプロ因子Dの検出をグラフで示す。 ヒト補体因子D「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）のアミノ酸残基26～32に対応する合成ペプチドで免疫化した後の代表マウス#2の血清の、組換え成熟因子Dまたは組換えプロ因子Dの存在下での力価測定をグラフで示す。図14に示しているように、代表マウス#2からの血清は、実施例7に記載するように、プロ因子Dと比べて、成熟因子Dに選択的に結合可能な抗体を含有する。 実施例7に記載するように、ポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）によって捕捉された場合のヒトプロ因子Dまたはヒト成熟因子Dへの結合についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした捕捉ELISAアッセイの結果をグラフで示す。 実施例8に記載するように、抗ヒトプロ因子D特異的クローンについての重鎖可変領域（VH）配列のアミノ酸アライメントを示す：18F5_VH（SEQ ID NO：136）、1F9_VH（SEQ ID NO：137）、2A4_VH（SEQ ID NO：138）、20A1_VH（SEQ ID NO：139）、13A10_VH（SEQ ID NO：140）および21H1_VH（SEQ ID NO：141）。 実施例8に記載するように、抗ヒトプロ因子D特異的クローンについての軽鎖可変領域（VL）配列のアミノ酸アライメントを示す：18F5_VK（SEQ ID NO :142）、1F9_VK（SEQ ID NO：143）、2A4_VK（SEQ ID NO：144）、20A1_VK（SEQ ID NO：145）、13A10_VK（SEQ ID NO：146）、および21H1_VK（SEQ ID NO：147）。 図17Aは、多数の候補抗ヒトプロ因子D特異的抗体を用いた組換えヒトプロ因子Dの検出をグラフで示す。図17Aに示しているように、試験した精製抗体、すなわち18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、および21H1はすべて、実施例9に記載するように、因子Dのプロ型を検出可能であった。図17Bは、多数の候補抗ヒトプロ因子D特異的抗体を用いた組換えヒト成熟因子Dの検出をグラフで示す。図17Bに示しているように、試験した精製抗体、すなわち、18F5、1F9、2A4、20A1、13A10および21H1のうちどれも、実施例9に記載するように、因子Dの成熟型を検出できなかった。 実施例9に記載するように、抗プロ因子D抗体21H1をコーティング抗体として、ヤギポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）を検出抗体として用いたELISAアッセイでの、プロ因子Dおよび成熟因子Dの検出をグラフで示す。 実施例9に記載するように、抗プロ因子D抗体21H1をコーティング抗体として、ヤギポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）を検出抗体として用いたELISAアッセイでの、正常ヒト血漿（NHP）、正常ヒト血清（NHS）または因子D枯渇血清（Df-Dpl血清）中のプロ因子Dおよび成熟因子Dの検出をグラフで示す。 実施例9に記載するように、抗プロ因子D抗体21H1をコーティング抗体として、ヤギポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）を検出抗体として用いたELISAアッセイで判定した場合の、正常ヒト血清（NHS）、C1q枯渇血清（C1q-Dpl）、因子D枯渇血清（Df-Dpl）および3MC症候群患者血清中に存在するプロ因子Dの量をグラフで示す。 図21Aは、実施例11に記載するように、代表的な抗MASP-3 mAb13B1による処置後912時間の期間にわたるカニクイザルにおける成熟因子Dの量をグラフで示す。図21Bは、実施例11に記載するように、カニクイザル組換え成熟因子D希釈物の4パラメーターロジスティック曲線から決定した場合の標準曲線をグラフで示す。 図22Aは、実施例12に記載するように、成熟因子D特異的抗体14A11を用いたELISAアッセイで測定した場合の、抗MASP-3 mAb13B1の皮下（SC）または静脈内（IV）投与後1344時間の期間にわたるサルにおける成熟因子Dの濃度をグラフで示す。図22Bは、実施例12に記載するように、因子Baアッセイで判定した場合の、抗MASP-3 mAb13B1の投与後1344時間の期間にわたるエクスビボ代替経路活性（ベースラインに対する％）をグラフで示す。 実施例12に記載するように、エクスビボ代替経路活性に対する抗MASP-3 mAb13B1効果とサルにおける単回静脈内ボーラスまたは皮下投与後の成熟因子D濃度とのPD-PD関係性をグラフで示す。 実施例12に記載するように、抗MASP-3 mAb13B1の投与量と成熟因子Dに対する効果（ベースラインに対する％）のPK-PD関係性をグラフで示す。 実施例13に記載するように、ELISAにより判定した場合の、mAb13B1の静脈内（IV）投与後最大84日までの期間にわたるmAb13B1の対象の血清中濃度をグラフで示す。 実施例13に記載するように、成熟因子D特異的抗体14A11を検出抗体として用いたELISAアッセイで判定した場合の、抗MASP-3 mAb 13B1の静脈内（IV）投与後84日の期間にわたる対象における成熟因子Dのレベルをグラフで示す。
配列表の説明
SEQ ID NO：1：ヒト完全長因子Dアミノ酸配列（シグナル配列を含む）
SEQ ID NO：2：ヒトプロ因子Dアミノ酸配列（シグナル配列なし）
SEQ ID NO：3：ヒト成熟因子Dアミノ酸配列
SEQ ID NO：4：ヒト完全長因子Dの残基20～25に対応するヒトプロペプチド「APPRGR」
SEQ ID NO：5：ヒト成熟因子Dの残基1～7に対応するヒト成熟因子DのN末端ペプチド（「ILGGREA」）
SEQ ID NO：6：合成ILGGREAペプチド-KLHコンジュゲート
Figure 0007634082000031
SEQ ID NO：7：ヒトMASP-3タンパク質
SEQ ID NO：8：マカク属完全長因子D
SEQ ID NO：9：イヌ属完全長因子D
SEQ ID NO：10：クマネズミ属完全長因子D
SEQ ID NO：11：ハツカネズミ属完全長因子D
抗ヒト成熟因子D特異的mAb：VH鎖
SEQ ID NO：12：mAbクローン6G6 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：13：mAbクローン14A11 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：14：mAbクローン27B3 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：15：mAbクローン58F5 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：16：mAbクローン49G3 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：17：mAbクローン10G1 VHアミノ酸配列
抗ヒト成熟因子D特異的mAb：VL鎖
SEQ ID NO：18：mAbクローン6G6 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：19：mAbクローン14A11 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：20：mAbクローン27B3 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：21：mAbクローン58F5 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：22：mAbクローン49G3 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：23：mAbクローン10G1 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：24～48：マウス抗ヒト成熟因子D特異的mAb由来の重鎖FRおよびCDR
SEQ ID NO：49～64 マウス抗ヒト成熟因子D特異的mAb由来の軽鎖FRおよびCDR
SEQ ID NO：65～69：マウス抗ヒト成熟因子D特異的mAb由来のCDRコンセンサス配列
SEQ ID NO：70：ヒトIgG4定常領域
SEQ ID NO：71：S228P変異を有するヒトIgG4定常領域
SEQ ID NO：72：ヒトIgK定常領域
SEQ ID NO：73：6G6 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：74：14A11 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：75：27B3 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：76：58F5 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：77：49G3 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：78：10G1 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：79：6G6 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：80：14A11 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：81：27B3 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：82：58F5 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：83：49G3 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：84：10G1 LC可変領域をコードする核酸
抗ヒト因子D（c末端）mAb：VH鎖
SEQ ID NO：85：mAbクローン3C5 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：86：mAbクローン11H1 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：87：mAbクローン12H10 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：88：mAbクローン7H2 VHアミノ酸配列
抗ヒト因子D（c末端）mAb：VL鎖
SEQ ID NO：89：mAbクローン3C5 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：90：mAbクローン30H2 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：91：mAbクローン11H1 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：92：mAbクローン12H10 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：93：mAbクローン7H2 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：94～109：成熟因子Dおよびプロ因子Dに共通のエピトープに結合するマウス抗ヒト因子D mAb由来の重鎖FRおよびCDR
SEQ ID NO：110～126：成熟因子Dおよびプロ因子Dに共通のエピトープに結合するマウス抗ヒト因子D mAb由来の軽鎖FRおよびCDR
SEQ ID NO：127：3C5 HCおよび30H2可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：128：11H1 VH可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：129：12H10 VH可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：130：7H2 VH可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：131：3C5 VL可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：132：30H2 VL可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：133：11H1 VL可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：134：12H10 VL可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：135：7H2 VL可変領域をコードする核酸
抗ヒトプロ因子D特異的mAb：VH鎖
SEQ ID NO：136：mAbクローン18F5 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：137：mAbクローン1F9 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：138：mAbクローン2A4 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：139：mAbクローン20A1 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：140：mAbクローン13A10 VHアミノ酸配列
SEQ ID NO：141：mAbクローン21H1 VHアミノ酸配列
抗ヒトプロ因子D特異的mAb：VL鎖
SEQ ID NO：142：mAbクローン18F5 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：143：mAbクローン1F9 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：144：mAbクローン2A4 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：145：mAbクローン20A1 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：146：mAbクローン13A10 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：147：mAbクローン21H1 VLアミノ酸配列
SEQ ID NO：148～174：マウス抗ヒトプロ因子D特異的mAb由来の重鎖FRおよびCDR
SEQ ID NO：175～200：マウス抗ヒトプロ因子D特異的mAb由来の軽鎖FRおよびCDR
SEQ ID NO：201～205：マウス抗ヒトプロ因子D特異的mAb由来のCDRコンセンサス配列
SEQ ID NO：206 18F5 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：207 1F9 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：208：2A4 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：209：20A1 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：210：13A10 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：211：21H1 HC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：212 18F5 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：213 1F9 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：214：2A4 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：215：20A1 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：216：13A10 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：217：21H1 LC可変領域をコードする核酸
SEQ ID NO：218：マウスIgG2a定常領域
SEQ ID NO：219：マウスカッパ軽鎖定常領域
抗ヒトMASP-3阻害性mAb
SEQ ID NO：220：h4D5_VH-14_VH
SEQ ID NO：221：h4D5_VL-1-NA
SEQ ID NO：222：h4D5_VH-19
SEQ ID NO：223：h10D12_VH-45
SEQ ID NO：224：h10D12_VL-21-GA
SEQ ID NO：225：h10D12_VH-49
SEQ ID NO：226：h13B1_VH-9
SEQ ID NO：227：h13B1_VL-1-NA
SEQ ID NO：228：h13B1_VH-10
SEQ ID NO：229：h4D5：14_1 NA HC-CDR1
SEQ ID NO：230：h10D12-45-21-GA HC-CDR1
SEQ ID NO：231：h13B1-9-1-NA HC-CDR1
SEQ ID NO：232：h4D5：14_1 NA HC-CDR2
SEQ ID NO：233：h10D12-45-21-GA HC-CDR2
SEQ ID NO：234：h13B1-9-1-NA HC-CDR2
SEQ ID NO：235：h13B1-10-1-NA：HC-CDR2
SEQ ID NO：236：h4D5：14_1 NA HC-CDR3
SEQ ID NO：237：h10D12-45-21-GA HC-CDR3
SEQ ID NO：238：h13B1-9-1-NA HC-CDR3
SEQ ID NO：239：h4D5：14_1 NA LC-CDR1
SEQ ID NO：240：h10D12-45-21-GA LC-CDR1
SEQ ID NO：241：h10D12-45-21-GA LC-CDR2
SEQ ID NO：242：h4D5：14_1 NA LC-CDR3
SEQ ID NO：243：h10D12-45-21-GA LC-CDR3
SEQ ID NO：244：h13B1-9-1-NA LC-CDR3
SEQ ID NO：245：S228PおよびX変異を有するヒトIgG4定常領域
SEQ ID NO：246：mAbクローン7H2 HC_FR3アミノ酸配列
SEQ ID NO：247：mAbクローン2A4 HC_FR1アミノ酸配列
詳細な説明
実施例1～3に記載するように、ヒト成熟因子DのN末端領域に特異的に結合しかつプロ因子Dに結合しない、モノクローナル抗体が作製された。実施例8～9にさらに記載するように、プロ因子Dのプロペプチドに特異的に結合しかつ成熟因子Dに結合しない、モノクローナル抗体が作製された。成熟因子D特異的モノクローナル抗体およびプロ因子D特異的抗体は、生体サンプル中の因子Dの成熟型および／またはプロ型の検出に有用であり、哺乳類対象における補体の代替経路（APC）の状態を判定するために使用してもよい。実施例10～12にさらに記載するように、成熟因子D特異的モノクローナル抗体はまた、プロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害するMASP-3阻害剤で処置した後の因子Dの状態を判定するために使用してもよい。したがって、一態様では、本発明は、ヒト成熟因子DのN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体、および生体サンプル中の成熟因子Dの存在または量を検出する方法におけるこれらの抗体の使用を対象とする。別の態様では、本発明は、プロ因子Dの活性化（プロ）ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、および生体サンプル中のプロ因子Dの存在または量を検出する方法におけるこれらの抗体の使用を対象とする。別の態様では、本発明は、高親和性MASP-3阻害抗体などのMASP-3阻害剤で処置する前および後の哺乳類対象における成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの存在または量を測定するための、成熟因子D特異的モノクローナル抗体の使用および／またはプロ因子D特異的モノクローナル抗体の使用であって、MASP-3阻害抗体が、プロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害可能であり、それによりAPCを阻害する、使用を対象とする。
I. 定義
本明細書において特に規定されない限り、本明細書において使用される用語はすべて、本発明の技術分野の熟練者によって理解される意味と同じ意味を有する。下記の定義は、本発明を説明するために本明細書および特許請求の範囲で使用される用語に関して明確さを与える目的で提供される。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、当業者によって十分に理解されており、抗原に特異的に結合する1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質のことを指す。抗体の一形態は、抗体の基本構造単位を構成する。この形態は、四量体であり、抗体鎖の2つの同一の対から構成され、それぞれの対は、1本の軽鎖および1本の重鎖を有する。それぞれの対において、軽鎖および重鎖の可変領域は一緒に、抗原への結合を担っており、定常領域は、抗体エフェクター機能を担っている。
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、任意の抗体産生哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびヒトを含む霊長類）に由来する、またはハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現もしくはトランスジェニック動物（または抗体もしくは抗体断片を産生する他の方法）に由来する、抗原、例えば、SEQ ID NO：2として示されるヒトプロ因子D（例えば、SEQ ID NO：4として示されるプロペプチド「APPRGR」中のエピトープ）、もしくはSEQ ID NO：3として示されるヒト成熟因子D（例えば、SEQ ID NO：5として示される「ILGGREA」を含むかまたはそれからなる成熟因子DのN末端のエピトープ）に特異的に結合するか、またはヒトプロ因子Dおよびヒト成熟因子Dに共通のエピトープ（例えば、因子DのC末端領域中のエピトープ（例えば、SEQ ID NO：3のアミノ酸8～228））に結合する、抗体およびその抗体断片を包含する。「抗体」という用語は、抗体の供給源またはそれが作製される手法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物、ペプチド合成などによる）に関して限定することを意図するものではない。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナルおよび組換え抗体；多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）；ヒト化抗体；完全ヒト抗体、マウス抗体；キメラ、マウス-ヒト、マウス-霊長類、霊長類-ヒトモノクローナル抗体；ならびに抗イディオタイプ抗体が含まれ、任意の無傷分子またはその断片であってもよい。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、無傷のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv）、一本鎖（ScFv）、その合成バリアント、天然に存在するバリアント、必要とされる特異性を有する抗原結合断片を有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要とされる特異性を有する抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む任意の他の修飾された立体構造の免疫グロブリン分子も包含する。
本明細書において使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、抗原、例えば、SEQ ID NO：2として示されるヒトプロ因子D（例えば、SEQ ID NO：4として示されるプロペプチド「APPRGR」中のエピトープ）、もしくはSEQ ID NO：3として示されるヒト成熟因子D（例えば、SEQ ID NO：5として示される「ILGGREA」を含むかまたはそれからなる成熟因子DのN末端のエピトープ）、またはヒトプロ因子Dおよびヒト成熟因子Dに共通のエピトープ（例えば、因子DのC末端領域中のエピトープ（例えば、SEQ ID NO：3のアミノ酸8～228））に特異的に結合する、免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の少なくとも1つのCDRを含有するポリペプチド断片のことを指す。これに関して、本明細書に記載される抗体の抗原結合断片は、VHおよびVL配列のCDRの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つすべて、例えば、本明細書に示される開示する抗ヒト因子D抗体由来のVHおよびVL配列の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのCRSを含み得る。
本明細書において使用される場合、「抗因子Dモノクローナル抗体」という用語は、モノクローナル抗体が、ヒト因子D、例えばSEQ ID NO：2として示されるヒトプロ因子D上のエピトープ（例えば、SEQ ID NO：4として示されるプロペプチド「APPRGR」中のエピトープ）の選択的結合に関与する、またはSEQ ID NO：3として示されるヒト成熟因子D（例えば、SEQ ID NO：5として示される「ILGGREA」を含むかまたはそれからなる成熟因子DのN末端のエピトープ）に特異的に結合する、またはヒトプロ因子Dおよびヒト成熟因子Dに共通のエピトープ（例えば、因子DのC末端領域中のエピトープ（例えば、SEQ ID NO：3のアミノ酸8～228））に結合するアミノ酸から構成される、同種の抗体集団のことを指す。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のモノクローナル抗体および完全長のモノクローナル抗体だけでなく、その断片（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv）、一本鎖（ScFv）、そのバリアント、抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性およびエピトープ結合能力を有する抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む任意の他の修飾された立体構造の免疫グロブリン分子も包含する。
本明細書において使用される場合、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られたものであるという抗体の性質を示し、抗体の供給源またはそれが作製される手法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）に関して限定することを意図するものではない。この用語は、上の「抗体」の定義で説明した免疫グロブリン全体もその断片なども含む。モノクローナル抗体は、連続的な細胞株培養による抗体分子の産生を提供する任意の技術、例えば、Kohler, G., et al., Nature 256:495, 1975によって記載されているハイブリドーマ法を使用して得ることができ、またはこれらを組換えDNA法（例えば、Cabillyの米国特許第4,816,567号を参照のこと）によって作製してもよい。モノクローナル抗体はまた、Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, 1991、およびMarks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。そのような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびその任意のサブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスであることができる。
認識される免疫グロブリンポリペプチドには、カッパおよびラムダ軽鎖ならびにアルファ、ガンマ（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、デルタ、イプシロンおよびミュー重鎖、または他の種における等価体が含まれる。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約25kDaまたは約214アミノ酸の）は、NH2末端に約110アミノ酸の可変領域およびCOOH末端にカッパまたはラムダ定常領域を含む。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約50kDaまたは約446アミノ酸の）も同様に、可変領域（約116アミノ酸の）および前述の重鎖定常領域の1つ、例えば、ガンマ（約330アミノ酸の）を含む。
基本的な4本鎖の抗体単位は、2本の同一の軽（L）鎖および2本の同一の重（H）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgM抗体は、J鎖と呼ばれる追加のポリペプチドを加えた5つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、それゆえ、10個の抗原結合部位を含有する。分泌されたIgA抗体は重合して、J鎖を加えた2～5つの基本的な4本鎖単位を含む多価集合体を形成し得る。各L鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によってH鎖に連結されるが、2本のH鎖は、H鎖アイソタイプに依存して、1つまたは複数のジスルフィド結合によって1本ずつ互いに連結される。各H鎖およびL鎖はまた、規則的に配置された鎖内ジスルフィド架橋も有する。VHとVLは一緒に対合して、単一の抗原結合部位を形成する。
各H鎖は、N末端に、可変ドメイン（VH）と、それに続いて、αおよびγ鎖の各々について3つの定常ドメイン（CH）と、μおよびεアイソタイプについて4つのCHドメイン（CH）とを有する。
各L鎖は、N末端に、可変ドメイン（VL）と、それに続いて、その他方の末端に定常ドメイン（CL）を有する。VLは、VHと並列しており、CLは、重鎖の第1の定常ドメイン（CH1）と並列する。任意の脊椎動物種由来のL鎖は、その定常ドメイン（CL）のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの明確に異なる型のうちの1つに割り当てることができる。
その重鎖の定常ドメイン（CH）のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、5つのクラス：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、それぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と命名される重鎖を有する。γおよびαクラスは、CHの配列および機能のわずかな相違に基づいてサブクラスへとさらに分けられ、例えば、ヒトは、以下のサブクラス：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2を発現する。
種々のクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds)；Appleton and Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71 and Chapter 6を参照されたい。
「可変」という用語は、Vドメインのある特定のセグメントが、抗体間で配列に広く違いを有することを指す。Vドメインは、抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの110アミノ酸長にわたって均等に分布しているわけではない。むしろ、V領域は、それぞれ9～12アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端に可変性であるより短い領域によって隔てられている、15～30アミノ酸のフレームワーク領域（FR）と呼ばれる比較的変化しない範囲からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、3つの超可変領域（n-シート構造を接続するループを形成し、場合によってはn-シート構造の一部を形成する）によって接続された大部分はベータシート配置をとる4つのFRを含む。各鎖における超可変領域は、FRと接近して他の鎖由来の超可変領域と共に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)を参照のこと）。定常ドメインは、抗体が抗原に結合する際に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ADCC）の関与などの様々なエフェクター機能を発揮する。
本明細書において使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基のことを指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「CDR」由来のアミノ酸残基（すなわち、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991)に記載されているようなKabat付番システムに従って付番した場合に、軽鎖可変ドメインにおける残基約24～34（L1）、50～56（L2）および89～97（L3）前後、重鎖可変ドメインにおける約31～35（H1）、50～66（H2）および95～102（H3）前後）；および／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記載されているようなChothia付番システムに従って付番した場合に、軽鎖可変ドメインにおける残基24～34（L1）、50～56（L2）および89～97（L3）、重鎖可変ドメインにおける26～32（H1）、52～56（H2）および95～101（H3））；および／または「超可変ループ」／CDR由来の残基（例えば、Lefranc, J.P., et al., Nucleic Acids Res 27:209-212；Ruiz, M., et al., Nucleic Acids Res 28:219-221 (2000)に記載されているようなIMGT付番システムに従って付番した場合に、VLにおける残基27～38（L1）、56～65（L2）および105～120（L3）、VHにおける27～38（H1）、56～65（H2）および105～120（H3））を含む。
本明細書において使用される場合、「抗体断片」という用語は、完全長抗因子D抗体に由来するかまたはそれに関係する、一般にその抗原結合または可変領域を含む、部分のことを指す。抗体断片の例示的な例としては、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2およびFv断片、scFv断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、抗体断片から形成される二重特異性および多重特異性抗体が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間に、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、1本の重鎖可変領域ドメインと1本の軽鎖可変領域ドメインが堅固な非共有会合の状態にある二量体からなる。これらの2つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗体に抗原結合特異性を付与する、6つの超可変ループ（HおよびL鎖からそれぞれ3つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なCDRを3つだけ含むFvの半分）であっても、抗原を認識して結合する能力を有するが、結合部位全体よりも親和性は低い。
本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」は、一般に組換え技術を使用して調製されるキメラ分子であって、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づいた分子の残りの免疫グロブリン構造とを有する、キメラ分子である。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合された完全な可変領域か、または可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上に移植されたCDRのみのいずれかを含み得る。エピトープ結合部位は、野生型であってもよく、1つまたは複数のアミノ酸置換によって修飾されていてもよい。別のアプローチは、ヒト由来定常領域を提供することだけでなく、可変領域を修飾してそれらをヒト型に可能な限り近くなるように再形成することにも焦点を当てている。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、すべてのCDR配列を保存する（例えば、マウス抗体由来の6つすべてのCDRを含有するヒト化マウス抗体）。他の態様では、ヒト化抗体は、元の抗体に対して変更された1つまたは複数（1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ）のCDRを有し、これらはまた、元の抗体からの1つまたは複数のCDR「に由来する」1つまたは複数のCDRとも称される。
本明細書において使用される場合、「特異的結合」という用語は、種々の分析物の均一混合物中に存在する特定の分析物に優先的に結合する抗体の能力のことを指す。ある特定の態様では、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい分析物と望ましくない分析物とを区別し、いくつかの態様では、約10～100倍超またはそれ以上（例えば、約1000倍または10,000倍超）である。ある特定の態様では、捕捉物質と分析物が捕捉物質／分析物複合体で特異的に結合している場合の親和性は、約100nM未満、または約50nM未満、または約25nM未満、または約10nM未満、または約5nM未満、または約1nM未満のKD（解離定数）によって特徴付けられる。
本明細書において使用される場合、「バリアント」抗体という用語は、親抗体配列における1つまたは複数のアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により「親」または参照抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なっている、分子のことを指す。一態様では、バリアント抗因子D抗体は、重鎖可変領域のCDR領域内における合わせて合計1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個のアミノ酸置換、および／または軽鎖可変領域の前記CDR領域内における合わせて合計1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個までのアミノ酸置換を除いて親可変ドメインと同一である可変領域を含有する分子のことを指す。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、保存的な配列改変である。
本明細書において使用される場合、「親抗体」という用語は、バリアントの調製に使用されるアミノ酸配列によってコードされる抗体のことを指す。好ましくは、親抗体は、ヒトフレームワーク領域を有し、存在するなら、ヒト抗体定常領域を有する。例えば、親抗体は、ヒト化抗体または完全ヒト抗体であり得る。
本明細書において使用される場合、「単離された抗体」という用語は、その天然環境の成分から、同定および分離され、かつ／または回収された抗体のことを指す。その天然環境の混入成分は、その抗体の診断的または治療的な使用を妨害し得る物質であり、それらには、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい態様では、抗体は、（1）ローリー法によって判定した場合に、抗体が95重量％を超えるまで、最も好ましくは99重量％を超えるまで；（2）スピニングカップ配列決定装置を用いてN末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度まで；または（3）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用した還元条件もしくは非還元条件下のSDS-PAGEによって均質となるまで、精製される。単離された抗体は、その抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので、インサイチューの組換え細胞内の抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程によって調製される。
本明細書において使用される場合、「エピトープ」という用語は、モノクローナル抗体が特異的に結合する抗原の一部分のことを指す。エピトープの決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な3次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。より具体的には、「プロ因子Dエピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、当技術分野において周知の任意の方法によって、例えばイムノアッセイによって判定された場合に、抗体が免疫特異的に結合する、対応するポリペプチド（SEQ ID NO：4）の一部分のことを指す。「成熟因子Dエピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、当技術分野において周知の任意の方法によって、例えばイムノアッセイによって判定された場合に、抗体が免疫特異的に結合する、対応するポリペプチド（SEQ ID NO：3）のアミノ末端部分を包含するエピトープ、例えば、SEQ ID NO：5として示される「ILGGREA」を含むかまたはそれからなる成熟因子DのN末端のエピトープのことを指す。「プロ因子Dおよび成熟因子Dに共通のエピトープ」という用語は、本明細書において使用される場合、当技術分野において周知の任意の方法によって、例えばイムノアッセイによって判定された場合に、抗体が免疫特異的に結合する、プロ因子Dおよび成熟因子Dに共通のC末端領域中のエピトープ（例えば、SEQ ID NO：3のアミノ酸8～228）のことを指す。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。そのようなエピトープは、本質的に直鎖状であり得るか、または不連続なエピトープであり得る。したがって、本明細書において使用される場合、「立体配座エピトープ」という用語は、連続した一連のアミノ酸以外の抗原のアミノ酸間の空間的関係によって形成される不連続なエピトープのことを指す。
本明細書において使用される場合、「哺乳類対象」には、非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ブタ、およびげっ歯動物が含まれる。
本明細書において使用される場合、「生体サンプル」という用語は、非限定的に、血液、血漿、血清、痰、羊水、脳脊髄液、細胞溶解物、腹水、尿、唾液、および組織を含む。
本明細書において使用される場合、「接触させる」という用語は、本発明の抗体と生体サンプルとを、抗体と生体サンプル中の標的タンパク質（例えば、プロ因子Dまたは成熟因子D）との間で結合相互作用が起こるように接触状態にする、組み合わせ行為のことを指す。
本明細書において使用される場合、「検出抗体（detecting antibody）」または「検出抗体（detection antibody）」という用語は、発見を可能にする抗体のことを指す。検出抗体は、検出可能な標識もしくはシグナルにまたはシグナル発生部分に直接的または間接的に（例えば、別の抗体を通じて）コンジュゲートされ得る。シグナルは、放射性シグナル（例えば、放射性ヨウ素、三重水素、炭素、硫黄など）、発色シグナル、蛍光シグナルなどであることができる。シグナル発生基質に対して作用するシグナル発生部分としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）［適した基質には、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）；OPD；2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン)-6-スルホン酸二アンモニウム塩が含まれる］；アルカリホスファターゼ［適した基質には、p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩が含まれる］；およびベータ-ガラクトシダーゼ［適した基質には、O-ニトロフェニル-ベータ-D-ガラクトピラノシドが含まれる］が挙げられるが、それらに限定されない。シグナルは、アビジン-ビオチンコンジュゲーションシステムを使用することによって増幅され得る。検出可能な標識またはシグナル発生部分は、本発明の抗因子D抗体およびその抗原結合断片に直接的および／または間接的のいずれかでカップリングされ得る。例えば、イムノコンジュゲートは、イムノアッセイでの検出を可能にする放射性同位体または酵素活性で標識されている抗因子D抗体を含み得る。
本明細書において使用される場合、「MASP-3阻害剤」という用語は、MASP-3に結合してプロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害し、それにより補体の代替経路活性化（APC）を阻害する、抗MASP-3抗体およびそのMASP-3結合断片、天然および合成ペプチド、競合基質、低分子ならびに発現阻害剤を含めた任意の作用物質のことを指す。例示的なMASP-3阻害抗体は、参照により本明細書に組み入れられるWO2018/026722に開示されている。いくつかの態様では、MASP-3阻害剤は、MASP-3阻害抗体、例えば、4D5、10D12および13B1からなる群より選択されるMASP-3阻害性モノクローナル抗体である。
本明細書において使用される場合、アミノ酸残基は、次のように略される：アラニン（Ala；A）、アスパラギン（Asn；N）、アスパラギン酸（Asp；D）、アルギニン（Arg；R）、システイン（Cys；C）、グルタミン酸（Glu；E）、グルタミン（Gln；Q）、グリシン（Gly；G）、ヒスチジン（His；H）、イソロイシン（Ile；I）、ロイシン（Leu；L）、リジン（Lys；K）、メチオニン（Met；M）、フェニルアラニン（Phe；F）、プロリン（Pro；P）、セリン（Ser；S）、トレオニン（Thr；T）、トリプトファン（Trp；W）、チロシン（Tyr；Y）、およびバリン（Val；V）。
最も広い意味で、天然に存在するアミノ酸は、それぞれのアミノ酸の側鎖の化学的特徴に基づいてグループに分けることができる。「疎水性」アミノ酸とは、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、CysまたはProのいずれかを意味する。「親水性」アミノ酸とは、Gly、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、ArgまたはHisのいずれかを意味する。アミノ酸のこのグループ分けは、次のようにさらに下位分類することができる。「非荷電親水性」アミノ酸とは、Ser、Thr、AsnまたはGlnのいずれかを意味する。「酸性」アミノ酸とは、GluまたはAspのいずれかを意味する。「塩基性」アミノ酸とは、Lys、ArgまたはHisのいずれかを意味する。
本明細書において使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、以下のグループのそれぞれの範囲内でのアミノ酸間の置換によって例示される：（1）グリジン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（2）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（3）セリンおよびトレオニン、（4）アスパラギン酸およびグルタミン酸、（5）グルタミンおよびアスパラギン、ならびに（6）リジン、アルギニンおよびヒスチジン。
本明細書において使用される場合、「単離された核酸分子」は、生物のゲノムDNAに組み込まれていない核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子は、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種由来の染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
本明細書において使用される場合、「核酸分子構築物」は、天然に存在しない配置で組み合され並べられた核酸のセグメントを含有するようにヒト介入を通じて改変された、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子である。
本明細書において使用される場合、「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような遺伝子は、そのプロモーター「に機能的に連結される」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性をモジュレートする場合、その調節エレメントとそのコアプロモーターは、機能的に連結されている。
本明細書において使用される場合、数値に関する「およそ」または「約」という用語は、別途言及のない限りまたは文脈から別途明らかでない限り、一般に、その数値のいずれかの方向で（それより大きいまたは小さい）5％の範囲内に入る数値を含むと見なされる（そのような数値が、考えられる値の100％を超え得る場合を除く）。範囲が述べられる場合、別途言及のない限りまたは文脈から別途明らかでない限り、その範囲内に終点が含まれる。
本明細書において使用される場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が別途明確に規定しない限り、複数の局面を含む。したがって、例えば、「1つの細胞」への言及は、単一の細胞だけでなく、2つ以上の細胞も含み；「1つの作用物質」への言及は、1つの作用物質だけでなく、2つ以上の作用物質も含み；「1つの抗体」への言及は、複数のそのような抗体を含み、「1つのフレームワーク領域」への言及は、1つまたは複数のフレームワーク領域および当業者に公知であるその等価物への言及を含む、等々である。
アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、最大の配列同一性パーセントを達成するように配列をアライメントし、必要ならば、ギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸と同一である候補配列中のアミノ酸の割合として定義される。配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当技術分野における技量の範囲内にある様々な方法で、例として、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。比較されている配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、アライメントを測定するための適切なパラメーターを、公知の方法によって決定することができる。
本明細書における各態様は、別途明示的に言及のない限り、必要により修正を加えて、他のすべての態様に適用されるべきである。
標準的な技術が、組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）のために使用されてよい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野において一般的に遂行されるように、または本明細書に記載のとおり、実施されてよい。これらおよび関係する技術および手順は、一般に、当技術分野において周知の従来法に従って、かつ本明細書全体を通して引用および考察される様々な一般参考文献およびより具体的な参考文献に記載のとおり実施されてよい。例えば、Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, NY)；Current Protocols in Immunology (Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober 2001 John Wiley & Sons, NY, NY)；または他の関連するCurrent Protocol刊行物および他の類似参考文献を参照されたい。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載される分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される学術用語、ならびにそれらの実験室での手順および技術は、当技術分野において周知であり、かつ一般的に使用されるものである。標準的な技術が、組換え技術、分子生物学的合成、微生物学的合成、化学的合成、化学的分析、医薬品の調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療のために使用されてよい。
本明細書において考察される任意の態様は、本発明の任意の方法、キット、試薬、または組成物に関して実行できること、および逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を実現することもできる。
II. 概説
本明細書の実施例1～3に記載するように、本発明は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合しかつプロ因子Dに結合しないモノクローナル抗因子D抗体（成熟因子D特異的抗体とも称される）を提供する。実施例8～9に記載するように、本発明はまた、プロ因子Dに特異的に結合しかつ成熟因子Dに結合しないモノクローナル抗因子D抗体（プロ因子D特異的抗体とも称される）も提供する。本明細書の実施例4～5に記載するように、本発明はまた、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合するモノクローナル抗因子D抗体も提供する。実施例6および7に記載するように、成熟因子D特異的モノクローナル抗体およびプロ因子D特異的モノクローナル抗体は、生体サンプル中の因子Dの成熟型および／またはプロ型の検出に有用であり、哺乳類対象における補体の代替経路（APC）の状態を判定するために使用してもよい。実施例10～12にさらに記載するように、成熟因子D特異的モノクローナル抗体および／またはプロ因子D特異的抗体はまた、プロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害するMASP-3阻害抗体などのMASP-3阻害剤で処置した後の因子Dの状態を判定するために使用してもよい。
したがって、一態様では、本発明は、ヒト成熟因子DのN末端領域に特異的に結合するモノクローナル抗体、および生体サンプル中の成熟因子Dの存在または量を検出する方法におけるこれらの抗体の使用を対象とする。別の態様では、本発明は、プロ因子Dの活性化（プロ）ペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、および生体サンプル中のプロ因子Dの存在または量を検出する方法におけるこれらの抗体の使用を対象とする。別の態様では、本発明は、高親和性MASP-3阻害抗体などのMASP-3阻害剤で処置する前および後の哺乳類対象における成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの存在または量を測定するための、成熟因子D特異的モノクローナル抗体の使用および／またはプロ因子D特異的モノクローナル抗体の使用であって、MASP-3阻害抗体が、プロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害可能であり、それによりAPCを阻害する、使用を対象とする。
それゆえ、主題の抗体は、診断法において、対象から得られた生体サンプル中の成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの存在または量を検出するために使用することができる。一態様では、成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの存在または量は、APCを阻害することのMASP-3阻害剤の有効性を判定するための、および／または、MASP-3阻害剤、例えばMASP-3阻害抗体（例えば、MASP-3阻害抗体4D5、10D12または13B1）による処置を受けている対象についてその対象の投薬をモニタリングするための、バイオマーカーとして有用である。
III. 補体系の概説
図1は、別個の開始イベントに応答して補体活性を駆動する3つの経路：古典的経路、レクチン経路、および代替経路を図示している（Noris M., Semin Nephrol 33 (6):479-92, 2013）。古典的経路は、免疫複合体によって誘発され、2つのプロテアーゼC1rおよびC1sの早期活性を通じて重要な免疫エフェクター機能を媒介する。レクチン経路は、微生物上または損傷を受けた宿主組織上に通常見られるが健康な宿主細胞表面上に見られない、特定の型の細胞表面糖鎖パターンによって活性化され得る。レクチン経路活性化は、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ-1および2（MASP-1およびMASP-2）として知られている酵素群によって開始される（Yongqing T. et al., Biochim Biophys Acta 1824 (1):253-62, 2012）。これらのプロテアーゼは、レクチン、例えばマンナン結合レクチン（MBL）、フィコリンならびにコレクチン10および11と複合体を形成する。レクチンは、外来細胞または損傷を受けた宿主細胞上の糖鎖パターンに結合し、それにより、MASPのタンパク分解活性を特定の表面に向ける。補体因子D（CFD）は、代替経路の活性化に必須のセリンプロテアーゼである。図1に示しているように、因子D（CFD）は、不活性酵素前駆体（本明細書において「プロ因子D」と称される）として発現され、CFDは、主に、切断された成熟セリンプロテアーゼ（本明細書において「成熟因子D」と称される）として血漿中を循環する。WO2013/180834およびWO2013/192240に記載されているように、近年、MASP-3が、補体因子D（CFD）の酵素前駆体型（プロ因子D）から成熟型（成熟因子D）への変換を担っており、したがって、MASP-3タンパク質が、代替経路にとって重要な上流の調節的立場にあることが究明された。参照により本明細書に組み入れられるWO2018/026722にさらに記載されているように、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合してその触媒活性を阻害し、それによりプロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害し、代替経路の活性化を遮断する、多数の高親和性抗MASP-3阻害抗体が作製されている。
自然免疫反応の一部である補体系の主な機能は、感染性因子から宿主を保護することである（Ricklin et al., Nat Immunol 11 (9):785-97, 2010）。タンパク質複合体アセンブリおよびタンパク分解カスケードの協調作用を通じて、この複雑な生理学的システムは、健康な宿主細胞上に通常存在しない分子パターンを示す表面に免疫および炎症反応を向ける。補体系活性化は、図1に示しているように、細胞溶解を引き起こす病原体の膜を直接破壊する膜攻撃複合体（MAC）の形成により、または食細胞による感染性因子の取り込みを容易にするオプソニン化により、最終的に標的の細胞破壊に至る。加えて、補体プロテアーゼによる基質切断は、白血球動員および免疫細胞活性化などのいくつかの重要な生物活性を誘発するアナフィラトキシンと呼ばれるサイトカイン様ペプチドを放出する。
補体の代替経路（APC）は、一般的には、補体活性の下流増幅装置として説明され、古典的経路およびレクチン経路を介する補体の活性化に続いて宿主免疫反応を高める。しかしながら、同じタイプの新たな複合体の形成を活発に駆動するプロテアーゼ複合体の正のフィードバックループを生じるAPCの能力は、補体経路の中でも独特である（Lachmann et al., Adv Immunol 104:115-49, 2009）。自己増殖複合体であるAPC C3コンバターゼは、2つのタンパク質：C3bおよびBbから構成される。新たに形成されたC3bは、チオエステル結合を介して局所表面に共有結合で付着し、強力なオプソニンとして機能して、マークした細胞の貪食および破壊を標的化することができる。加えて、C3bは、補体因子B（CFB）の結合および活性化のための足場も提供する（Lachmann et al., Adv Immunol 104:115-49, 2009；Noris et al., Semin Nephrol 33 (6):479-92, 2013）。C3bとの複合体において、CFBは、補体因子D（CFD）による切断のための適切な立体配座をとる。この切断イベントは、一本鎖ポリペプチドを非触媒断片（Ba）および触媒断片（Bb）に変換する。Ba断片は、複合体から放出されるが；Bb断片は、C3bと会合したままで、活性APC C3コンバターゼC3bBbを産生する（Lachmann et al., Adv Immunol 104:115-49, 2009；Noris et al., Semin Nephrol 33 (6):479-92, 2013）。C3bBbの能力は、さらなるC3を切断し、複数の新たなコンバターゼを産生することであり、これにより激しいシグナル増幅メカニズムがもたらされる。
補体系は、病原体に対する先天性宿主防御を支援する一方で、調節異常でかつ衰えのない補体活性は、疾患の大きな推進力としても機能し、抑制の効かない炎症および組織破壊の伝播を引き起こし得る。多くの状況において、APCおよびC3b増幅ループは、補体反応の規模およびその下流結果の決定において重要な役割を果たす。したがって、Bb活性を阻害することによるかまたはCFDによる切断を通じてCFBの活性化を遮断することによるAPCの治療的調節は、APCによって媒介される多くの自己免疫疾患および炎症性疾患を治療するための十分に特徴付けられた潜在的制御点である。
上で述べたように、MASP-3が、CFDの酵素前駆体型から成熟型への変換を担っており、したがって、MASP-3タンパク質が、代替経路にとって重要な上流の調節的立場にあることが実証された。野生型動物またはヒトの血漿では、全身のCFDの大部分は、インビボMASP-3活性によってすでに成熟型へとプロセシングされており、このことが、従来のアッセイを使用したMASP-3阻害剤によるAPC阻害のインビトロ評価を不可能にしている。それゆえ、APC状態のバイオマーカーとして使用でき、かつ、MASP-3阻害剤によるAPC阻害のインビトロおよび／またはインビボ評価にも使用できる、生体サンプル中のプロ因子Dおよび／または成熟因子Dの存在および量を測定するための検出試薬およびアッセイの必要性が存在する。
IV. 抗因子D抗体
上述したように、補体因子D（CFD）は、APCの活性化に必須のセリンプロテアーゼである。図1に示しているように、因子D（CFD）は、不活性酵素前駆体（本明細書において「プロ因子D」と称される）として発現され、CFDは、主に、切断された成熟セリンプロテアーゼ（本明細書において「成熟因子D」と称される）として血漿中を循環する。
図2は、(i) シグナル配列aa 1～19（イタリック体で示す）と下線を引いた活性化（プロ）ペプチドを含むヒト完全長因子D（SEQ ID NO：1）；(ii) 下線を引いたプロペプチドを有するヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）；および(iii) ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）のアミノ酸配列を提供する。図2に示しているように、ヒトプロ因子Dのプロペプチドは、（「APPRGR」（SEQ ID NO：4）である。
図3は、ホモサピエンス（SEQ ID NO：1）；マカク属（SEQ ID NO：8）；イヌ属（SEQ ID NO：9）；クマネズミ属（SEQ ID NO：10）；およびハツカネズミ（SEQ ID NO：11）を含む様々な種由来の補体因子D（完全長）のアミノ酸配列のアライメントを提供する。各配列のイタリックの部分は、シグナル配列を描写しており、下線を引いた部分は、活性化「プロ」ペプチド配列を描写している。
図2および3に示しているように、因子Dタンパク質は、N末端プロ領域、活性化ペプチド領域、および残りのC末端領域を含む。成熟因子Dは、各種において、プロ因子Dと比較して固有のアミノ末端を有する（例えば、N末端は、ヒト完全長因子D（SEQ ID NO：1）の残基26から始まる）。成熟因子Dおよびプロ因子Dは、それぞれのタンパク質のC末端部分に共通配列（例えば、SEQ ID NO：1のアミノ酸27～253）を有する。
A. 抗ヒト成熟因子D特異的モノクローナル抗体
本明細書の実施例1および2に記載するように、本発明者らは、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）のアミノ末端領域のアミノ酸残基1～7に対応するペプチド「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）を、本明細書に記載される検出アッセイおよび方法での使用に適した抗成熟因子D特異的抗体を作製するための抗原として使用した。図3に示しているように、N末端配列「ILLGGREA」（SEQ ID NO：5）は、ヒト（ホモサピエンス）とマカク（マカク属）の成熟因子Dタンパク質間で保存されている。
実施例2に記載するように、いくつかの代表的な抗成熟因子D特異的モノクローナル抗体の可変の重鎖断片および軽鎖断片をクローニングおよび配列決定した。
図7Aは、成熟因子DのN末端ペプチド「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）に対して高い結合親和性を有するとして特定された6つの抗成熟因子D特異的クローンの可変重鎖領域のアミノ酸配列アライメントである。
図7Bは、成熟因子DのN末端ペプチド「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）に対して高い結合親和性を有するとして特定された6つの抗成熟因子D特異的クローンの可変軽鎖領域のアミノ酸配列アライメントである。
6つの成熟因子D特異的抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにその中のCDRを下記表1および2に提供する。
（表１）抗ヒト成熟因子D特異的抗体配列：マウス親
Figure 0007634082000032
（表２）抗ヒト成熟因子D特異的抗体：CDR
Figure 0007634082000033
したがって、一局面では、本発明は、ヒト成熟因子Dのアミノ末端（N末端）領域中のエピトープであって、アミノ酸配列「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合断片を提供する。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に結合しない。一態様では、成熟因子D特異的抗体は、モノクローナル抗体である。一態様では、成熟因子D特異的抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、成熟因子D特異的抗体断片は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2およびF(ab')2からなる群より選択される。一態様では、成熟因子D特異的抗体は、一本鎖分子である。一態様では、成熟因子D特異的抗体は、IgG1、IgG2およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、10nM未満のKDでヒト成熟因子Dに結合する。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な部分、例えば、本明細書にさらに記載されるようなイムノアッセイでの使用に適した検出可能な部分で標識される。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、基材、例えば、本明細書にさらに記載されるようなイムノアッセイでの使用に適した基材上に固定化される。
一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片（すなわち、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその断片）は、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、IまたはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000034
を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列
Figure 0007634082000035
を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、GまたはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、IまたはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000036
を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3。
一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：50を含むLC-CDR-1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：12またはSEQ ID NO：13のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：18またはSEQ ID NO：19のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：12を含むVH、およびSEQ ID NO：18を含むVLを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：13を含むVH、およびSEQ ID NO：19を含むVLを含む。
一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：33を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：34を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：36を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：58を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：14のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：20のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：14を含むVH、およびSEQ ID NO：20を含むVLを含む。
一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：38を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：60を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：15のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：21のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：15を含むVH、およびSEQ ID NO：21を含むVLを含む。
一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：62を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：16のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：22のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：16を含むVH、およびSEQ ID NO：22を含むVLを含む。
一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：47を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：63を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：64を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：17のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：23のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：17を含むVH、およびSEQ ID NO：23を含むVLを含む。
ある特定の態様では、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する成熟因子D特異的抗体またはその断片は、表1に示される重鎖可変ドメイン配列のいずれかのものに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一、または少なくとも約97％同一、または少なくとも約98％同一、または少なくとも99％同一）である重鎖可変ドメインを有する。ある特定の態様では、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する成熟因子D特異的抗体またはその断片は、表1に示される軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのものに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一、または少なくとも約97％同一、または少なくとも約98％同一、または少なくとも99％同一）である軽鎖可変ドメインを有する。
別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：12～17に示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、核酸を提供する。別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：18～23に示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、核酸を提供する。
別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターであって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：12～17のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：18～23のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、ベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターを含有する細胞であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：12～17のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：18～23のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される成熟因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかの重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を含有する発現ベクターを含有する細胞を培養する工程を含む、ヒト成熟因子D特異的抗体を産生するための方法を提供する。細胞または細胞の培養物は、細胞（または細胞の培養物）により核酸によってコードされる抗体またはその抗原結合断片が発現可能となるのに十分な条件下および時間で培養される。該方法はまた、細胞（または細胞の培養物）からまたは1つもしくは複数の細胞が培養された培地から、抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含むことができる。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される成熟因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される成熟因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかの少なくとも1つまたは複数を含むイムノアッセイにおいて使用するための基材を提供する。
一態様では、本開示は、生体サンプルなどの試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を検出するためのキットであって、(a) 少なくとも1つの容器と(b) 本明細書に開示される成熟因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかの少なくとも1つまたは複数とを含む、キットを提供する。
B. 抗ヒトプロ因子D特異的モノクローナル抗体
本明細書の実施例8および9に記載するように、本発明者らは、ヒト完全長因子Dの残基20～25に対応するヒトプロペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を、本明細書に記載される検出アッセイおよび方法での使用に適した抗プロ因子D特異的抗体を作製するための抗原として使用した。
実施例9に記載するように、いくつかの代表的な抗プロ因子D特異的モノクローナル抗体の可変の重鎖断片および軽鎖断片をクローニングおよび配列決定した。
図16Aは、ヒト因子Dプロペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）に対して高い結合親和性を有するとして特定された6つの抗プロ因子Dクローンの可変重鎖領域のアミノ酸配列アライメントである。
図16Bは、ヒト因子Dプロペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）に対して高い結合親和性を有するとして特定された6つの抗プロ因子Dクローンの可変軽鎖領域のアミノ酸配列アライメントである。
6つのプロ因子D特異的モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにその中のCDRを下記表3および4に提供する。
（表３）抗ヒトプロ因子D特異的抗体配列：マウス親
Figure 0007634082000037
（表４）抗ヒトプロ因子D特異的抗体：CDR
Figure 0007634082000038
したがって、一局面では、本発明は、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）として示されるヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチド中のエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその断片であって、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に特異的に結合しかつ成熟因子D（SEQ ID NO：3）に結合しない、抗体または断片を提供する。一態様では、プロ因子D特異的抗体は、モノクローナル抗体である。一態様では、プロ因子D特異的抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、プロ因子D特異的抗体断片は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2およびF(ab')2からなる群より選択される。一態様では、プロ因子D特異的抗体は、一本鎖分子である。一態様では、プロ因子D特異的抗体は、IgG1、IgG2およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、10nM未満のKDでヒトプロ因子Dに結合する。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な部分、例えば、本明細書にさらに記載されるようなイムノアッセイでの使用に適した検出可能な部分で標識される。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、基材、例えば、本明細書にさらに記載されるようなイムノアッセイでの使用に適した基材上に固定化される。
一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片（すなわち、ヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその断片）は、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR-2およびHC-CDR-3を含み、かつ、SEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。
一態様では、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するプロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：136～139からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR-2およびHC-CDR-3を含み、かつ、SEQ ID NO：142～145からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) アミノ酸配列XYWMS（SEQ ID NO：201）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはN、SまたはTである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000039
を含むHC-CDR2（配列中、7位のXはDまたはEであり、11位のXはTまたはAであり、12位のXはHまたはYであり、14位のXはAまたはTである）；(c) アミノ酸配列AWFAX（SEQ ID NO：203）を含むHC-CDR3（配列中、5位のXはS、YまたはNである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000040
を含むLC-CDR1（配列中、1位のXはMまたはKであり、5位のXはSまたはNであり、10位のXはKまたはRである）；(e) アミノ酸配列WASTRES（SEQ ID NO：178）を含むLC-CDR2；および(f) アミノ酸配列LQYYXYPYT（SEQ ID NO：205）を含むLC-CDR3（配列中、5位のXはTまたはSである）。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：149またはSEQ ID NO：155を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：151またはSEQ ID NO：156を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：153を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：176を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：178を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：180を含むLC-CDR3。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：136のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：137のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：142のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：143のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：136を含むVH、およびSEQ ID NO：142を含むVLを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：137を含むVH、およびSEQ ID NO：143を含むVLを含む。
一態様では、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するプロ因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：158を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：159またはSEQ ID NO：163を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：161またはSEQ ID NO：165を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：184またはSEQ ID NO：189を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：178を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：187を含むLC-CDR3。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：138のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：139のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：144のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：145のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：138を含むVH、およびSEQ ID NO：144を含むVLを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：139を含むVH、およびSEQ ID NO：145を含むVLを含む。
一態様では、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するプロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：140およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：146およびSEQ ID NO：147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：167を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：169またはSEQ ID NO：173を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：171またはSEQ ID NO：174を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：194を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：196またはSEQ ID NO：199を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：198またはSEQ ID NO：200を含むLC-CDR3。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：140のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：141のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：146のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：147のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：140を含むVH、およびSEQ ID NO：146を含むVLを含む。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：141を含むVH、およびSEQ ID NO：147を含むVLを含む。
ある特定の態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、表3に示される重鎖可変ドメイン配列のいずれかのものに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一、または少なくとも約97％同一、または少なくとも約98％同一、または少なくとも99％同一）である重鎖可変ドメインを有する。ある特定の態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、表3に示される軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのものに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一、または少なくとも約97％同一、または少なくとも約98％同一、または少なくとも99％同一）である軽鎖可変ドメインを有する。
別の態様では、本開示は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：136～141に示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、核酸を提供する。別の態様では、本開示は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：142～147に示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、核酸を提供する。
別の態様では、本開示は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターであって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：136～141のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：142～147のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、ベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターを含有する細胞であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：136～141のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：142～147のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるプロ因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかの重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を含有する発現ベクターを含有する細胞を培養する工程を含む、ヒトプロ因子D特異的抗体を産生するための方法を提供する。細胞または細胞の培養物は、細胞（または細胞の培養物）により核酸によってコードされる抗体またはその抗原結合断片が発現可能となるのに十分な条件下および時間で培養される。該方法はまた、細胞（または細胞の培養物）からまたは1つもしくは複数の細胞が培養された培地から、抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含むことができる。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるプロ因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるプロ因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかの少なくとも1つまたは複数を含むイムノアッセイにおいて使用するための基材を提供する。
一態様では、本開示は、生体サンプルなどの試験サンプル中のプロ因子Dの存在または量を検出するためのキットであって、(a) 少なくとも1つの容器と(b) 本明細書に開示されるプロ因子D特異的抗体または抗原結合断片のいずれかの少なくとも1つまたは複数とを含む、キットを提供する。
C. 因子Dのプロ型と成熟型の両方に結合する抗ヒト因子Dモノクローナル抗体
本明細書の実施例4～5に記載するように、本発明はまた、ヒトプロ因子Dとヒト成熟因子Dの両方に存在するエピトープに結合する抗因子D抗体も提供する。実施例4に記載するように、本発明者らは、因子Dのプロ型と成熟型の両方を検出する能力についてスクリーニングおよび選択され、本明細書に記載される検出アッセイおよび方法において本明細書に開示される成熟因子D特異的抗体およびプロ因子D特異的抗体と組み合わせて使用するのに適した、抗因子D抗体を作製するための抗原として、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）を使用した。
実施例5に記載するように、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合するいくつかの代表的な抗因子Dモノクローナル抗体の可変の重鎖断片および軽鎖断片をクローニングおよび配列決定した。
図10Aは、成熟因子Dとプロ因子Dの両方に対して高い結合親和性を有するとして特定された5つの抗因子Dクローンの可変重鎖領域のアミノ酸配列アライメントである。
図10Bは、成熟因子Dとプロ因子Dの両方に対して高い結合親和性を有するとして特定された5つの抗因子Dクローンの可変軽鎖領域のアミノ酸配列アライメントである。
成熟因子Dとプロ因子Dの両方に結合する5つの抗因子Dモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域ならびにその中のCDRを下記表5および6に提供する。
（表５）抗ヒト因子D抗体配列：マウス親
Figure 0007634082000041
（表６）抗ヒト因子D抗体：CDR
Figure 0007634082000042
したがって、一局面では、本発明は、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）とヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）の両方に存在するエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその断片であって、その抗体はSEQ ID NO：85～88からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：89～93からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、抗体またはその断片を提供する。
一態様では、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に存在するエピトープに結合する抗因子D抗体は、モノクローナル抗体である。一態様では、抗因子D抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である。一態様では、抗因子D抗体断片は、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2およびF(ab')2からなる群より選択される。一態様では、抗因子D抗体は、一本鎖分子である。一態様では、抗因子D抗体は、IgG1、IgG2およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である。一態様では、抗因子D抗体またはその抗原結合断片は、10nM未満のKDでヒトプロ因子Dとヒト成熟因子Dの両方に結合する。一態様では、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に存在するエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片は、検出可能な部分、例えば、本明細書にさらに記載されるようなイムノアッセイでの使用に適した検出可能な部分で標識される。一態様では、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に存在するエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、基材、例えば、本明細書にさらに記載されるようなイムノアッセイでの使用に適した基材上に固定化される。
一態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。
一態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) アミノ酸配列SEQ ID NO：95を含むHC-CDR1、(b) アミノ酸配列SEQ ID NO：97を含むHC-CDR2、(c) アミノ酸配列SEQ ID NO：99を含むHC-CDR3、(d) アミノ酸配列SEQ ID NO：111を含むLC-CDR1；(e) アミノ酸配列SEQ ID NO：113を含むLC-CDR2；および(f) アミノ酸配列SEQ ID NO：115を含むLC-CDR3。
一態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) アミノ酸配列SEQ ID NO：101を含むHC-CDR1、(b) アミノ酸配列SEQ ID NO：103または107を含むHC-CDR2、(c) アミノ酸配列SEQ ID NO：105または108を含むHC-CDR3、(d) アミノ酸配列SEQ ID NO：60または123を含むLC-CDR1；(e) アミノ酸配列SEQ ID NO：119、124または126を含むLC-CDR2、および(f) アミノ酸配列SEQ ID NO：121または125を含むLC-CDR3。
一態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：85のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：89のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：90のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：85を含むVH、およびSEQ ID NO：89を含むVLを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：85を含むVH、およびSEQ ID NO：90を含むVLを含む。
一態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：86のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：87のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：88のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVHドメインを含む。
一態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：91のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：92のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：93のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性（例えば、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％の同一性）を有するVLドメインを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：86を含むVH、およびSEQ ID NO：91を含むVLを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：87を含むVH、およびSEQ ID NO：92を含むVLを含む。一態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：88を含むVH、およびSEQ ID NO：93を含むVLを含む。
ある特定の態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、表5に示される重鎖可変ドメイン配列のいずれかのものに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一、または少なくとも約97％同一、または少なくとも約98％同一、または少なくとも99％同一）である重鎖可変ドメインを有する。
ある特定の態様では、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその断片は、表5に示される軽鎖可変ドメイン配列のいずれかのものに対して実質的に同一（例えば、少なくとも約70％、少なくとも75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約96％同一、または少なくとも約97％同一、または少なくとも約98％同一、または少なくとも99％同一）である軽鎖可変ドメインを有する。
別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：85～88に示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、核酸を提供する。別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸であって、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：89～93に示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、核酸を提供する。
別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターであって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：85～88のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：89～93のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、ベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターを含有する細胞であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：85～88のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：89～93のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、細胞を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかの重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を含有する発現ベクターを含有する細胞を培養する工程を含む、ヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体を産生するための方法を提供する。細胞または細胞の培養物は、細胞（または細胞の培養物）により核酸によってコードされる抗因子D抗体またはその抗原結合断片が発現可能となるのに十分な条件下および時間で培養される。該方法はまた、細胞（または細胞の培養物）からまたは1つもしくは複数の細胞が培養された培地から、抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含むことができる。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片のいずれかを含む組成物を提供する。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片のいずれかの少なくとも1つまたは複数を含むイムノアッセイにおいて使用するための基材を提供する。
一態様では、本開示は、生体サンプルなどの試験サンプル中の因子Dの存在を検出するためのキットであって、(a) 少なくとも1つの容器と(b) 本明細書に開示されるヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片のいずれかの少なくとも1つまたは複数とを含む、キットを提供する。
一本鎖抗因子D抗体
本発明の一態様では、抗因子D抗体（すなわち、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体のいずれか）は、遺伝子融合された一本鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子として定義される、一本鎖抗体である。そのような一本鎖抗体は、「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片とも称される。一般に、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間に、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。因子Dに結合するscFv抗体は、可変軽鎖領域が、可変重鎖領域に対してアミノ末端またはそれに対してカルボキシ末端のいずれかになるように配向することができる。
ヒト化抗因子D抗体
本明細書に開示される抗因子D抗体（すなわち、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体のいずれか）は、本明細書に記載される目的に使用するためにその能力を変更することなく改変することができる。最初の問題として、本明細書に記載される抗体は、免疫したマウスから生じることに留意される。したがって、抗体は、マウス抗体のフレームワーク領域中に通常見られるアミノ酸残基を含有し、ヒト患者に投与されると免疫原性になり得る、フレームワーク領域（相補性決定領域、または「CDR」の外側の領域）を有する。ヒトにおいて使用する際にマウス抗体の免疫原性を低下させるために、マウスの抗体の特定の位置に見られる残基をより典型的にはヒト抗体の同じ位置に見られる残基に置き換えることによってフレームワーク領域を操作することが当技術分野において一般的である。これらの手法で操作された抗体は、「ヒト化抗体」と称され、副作用を誘発するリスクがより低く、典型的には循環中でより長く留まることができるので、典型的にはインビボ使用に好まれる。抗体をヒト化する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第6,180,377号；同第6,407,213号；同第5,693,762号；同第5,585,089号；および同第5,530,101号に詳述されている。
さらに、可変領域のCDRが抗体特異性を決めるので、表2、4、6～10および12～17に示される抗因子D抗体のCDRを、最適な抗体に移植または操作して、因子Dに結合するための特異性をその抗体に付与することができる。例えば、表2に示されるような成熟因子D特異的クローン6G6、14A11、27B3、58F5、49G3および10G1からのCDR、ならびに／または表4に示されるようなプロ因子D特異的クローン18F5、1F9、2A4、20A1、13A10および21H1からのCDRを、3次元構造が既知のヒト抗体フレームワーク上に移植して（例えば、WO98/45322；Jones et al., Nature 321:522 (1986)；Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988) および Winter & Milstein, Nature 349:293 (1991)を参照のこと）、ヒトに投与した際に免疫原性反応が低下または免疫原性反応がない抗成熟因子D特異的または抗プロ因子D特異的抗体を作製することができる。
抗因子D抗体を産生するための方法
別の局面では、本発明は、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片のいずれかの重鎖および軽鎖ポリペプチドの一方または両方をコードする核酸を含有する発現ベクターを含有する細胞を培養する工程を含む、ヒト因子Dを特異的に認識して結合する抗体、例えば成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を産生する方法を提供する。細胞または細胞の培養物は、細胞（または細胞の培養物）により核酸によってコードされる抗体またはその抗原結合断片が発現可能となるのに十分な条件下および時間で培養される。該方法はまた、細胞（または細胞の培養物）からまたは1つもしくは複数の細胞が培養された培地から、抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含むことができる。
一態様では、本開示は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターを含有する細胞であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：12～17のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：18～23のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含む、細胞を特徴とする。
別の態様では、本開示は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖および／または軽鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）をコードする核酸を含むクローニングまたは発現ベクターを含有する細胞であって、重鎖可変領域が、SEQ ID NO：136～141のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が、SEQ ID NO：142～147のいずれかとして示されるアミノ酸配列を含む、細胞を特徴とする。
いくつかの態様では、本発明は、本発明の抗因子D抗体またはその断片、例えば、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、表1に示されるような）、ヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、表3に示されるような）またはヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、表5に示されるような）をコードする、核酸分子を提供する。いくつかの態様では、本発明は、抗因子D抗体をコードする、例えば、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、SEQ ID NO：73～84）をコードする、またはヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、SEQ ID NO：206～217）をコードする、またはヒト成熟因子Dとヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、SEQ ID NO：127～135）をコードする核酸配列を含む、核酸分子を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、本発明の因子D特異的モノクローナル抗体（成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、および因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を含む）をコードする核酸分子を含む、細胞を提供する。
いくつかの態様では、本発明は、本発明の因子D特異的モノクローナル抗体（成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、および因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を含む）をコードする核酸分子を含む、発現カセットを提供する。
いくつかの態様では、本発明は、本発明の因子D特異的抗体（成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、および因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を含む）をコードする核酸分子を含む細胞を培養する工程を含む、因子D特異的モノクローナル抗体を産生する方法を提供する。
多くの態様において、主題のモノクローナル抗体をコードする核酸は、宿主細胞に直接導入され、該細胞は、コードされている抗体の発現を誘導するのに十分な条件下でインキュベートされる。
一態様では、因子D特異的モノクローナル抗体（成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を含む）を産生する方法は、本発明の因子D特異的抗体をコードする核酸分子を含む細胞を培養する工程を含む。
特定の関連する態様によれば、本明細書に記載されるような1つまたは複数の構築物を含む組換え宿主細胞；任意の抗因子D抗体、CDR、VHもしくはVLドメイン、またはその抗原結合断片をコードする核酸；およびコードされている産物の産生方法であって、そのためのコード核酸からの発現を含む方法が提供される。発現は、該核酸を含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することによって簡便に達成され得る。発現による産生に続いて、抗体またはその抗原結合断片は、任意の好適な技術を使用して単離および／または精製されてよく、次いで、所望のとおり使用されてよい。
例えば、発現カセットの発現に適した任意の細胞は、宿主細胞、例えば、酵母、昆虫、植物などの細胞として使用されてよい。多くの態様において、抗体を通常産生しない哺乳動物宿主細胞株が使用され、その例は以下のとおりである：サル腎細胞（COS細胞）、SV40によって形質転換されたサル腎CVI細胞（COS-7、ATCC CRL 165 1）；ヒト胚腎細胞（HEK-293、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎細胞（BHK、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4216, (1980)；マウスセルトリ細胞（TM4、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎細胞（CVI ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76、ATCC CRL-1587）；ヒト子宮頸がん細胞（HELA、ATCC CCL 2）；イヌ腎細胞（MDCK、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝細胞（BRL 3A、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（W138、ATCC CCL 75）；ヒト肝細胞（hep G2、HB 8065）；マウス乳腺腫瘍（MMT 060562、ATCC CCL 51）；TRI細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci 383:44-68 (1982)）；NIH/3T3細胞（ATCC CRL-1658）；およびマウスL細胞（ATCC CCL-1）。さらなる細胞株は、当業者に明らかになろう。多種多様な細胞株がAmerican Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209から入手可能である。
核酸を細胞に導入する方法は、当技術分野において周知である。好適な方法には、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが含まれる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類および形質転換が行われる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法の総論は、Ausubel, et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3d ed., Wiley & Sons, 1995において確認することができる。いくつかの態様では、リポフェクタミンおよびカルシウム媒介遺伝子移入技術が使用される。
主題の核酸が細胞に導入された後、細胞は、典型的には、通常37℃で、時に選択下、抗体の発現が可能となる好適な時間にわたってインキュベートされる。ほとんどの態様において、抗体は、典型的には、細胞が成長している培地の上清に分泌される。
哺乳動物宿主細胞では、主題の抗体を発現させるために数多くのウイルスベースの発現系を利用してよい。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、関心対象の抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび3部からなるリーダー配列に連結してよい。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入してよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE3）への挿入は、感染宿主において生存可能でかつ抗体分子を発現可能な組換えウイルスをもたらす（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)を参照のこと）。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの組み入れによって増強させることができる（Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)を参照のこと）。
組換え抗体の長期の高収率産生のために、安定発現を使用してよい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作してよい。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりむしろ、免疫グロブリン発現カセットおよび選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの導入に続いて、操作された細胞を富栄養培地中で1～2日間成長させてよく、次いで、選択培地に交換する。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が染色体にプラスミドを安定的に組み込みこと、および成長して巣を形成することを可能にし、次にこれがクローン化して細胞株へと増大可能である。このような操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
本発明の抗体分子が産生されたら、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインAの後の特異的抗原に対するアフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解性の違い、またはタンパク質精製のための任意の他の標準技術によって、抗体分子を精製してよい。多くの態様において、抗体は、細胞から培養培地に分泌され、培養培地から収集される。例えば、シグナルペプチドをコードする核酸配列を、抗体または断片のコード領域に隣接して組み入れてよい。そのようなシグナルペプチドは、主題の抗体の産生を容易にするために主題の抗体に対して本明細書に示されるアミノ酸配列の5'端に隣接して組み込むことができる。
検出可能な部分で標識された抗因子D抗体
別の局面では、本発明は、検出可能な部分（すなわち、検出および／または定量を可能にする部分）で標識された抗因子D抗体（成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、および因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を含む）を提供する。様々な態様では、本明細書に記載される抗体は、直接的または間接的に検出され得る検出可能な標識にコンジュゲートされる。これに関して、抗体「コンジュゲート」は、検出可能な標識に共有結合により連結された抗因子D抗体のことを指す。本発明では、モノクローナル抗体、その抗原結合断片、およびその抗体誘導体、例えば一本鎖可変断片抗体またはエピトープタグ化抗体のすべてを、検出可能な標識に共有結合により連結させてよい。「直接検出」では、たった1つの検出可能抗体、すなわち、一次検出可能抗体が使用される。したがって、直接検出は、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗体が、それ自体、2番目の抗体（二次抗体）の添加の必要なく検出され得ることを意味する。
「検出可能な標識」は、サンプル中の標識の存在および／または濃度を示す検出可能な（例えば、目視で、電子的にまたはその他の方法で）シグナルを発生させることができる分子または物質である。抗体にコンジュゲートすれば、検出可能な標識を使用して、特異的抗体が指向される標的の場所を突き止め、かつ／または定量することができる。それにより、サンプル中の標的の存在および／または濃度を、検出可能な標識によって発生されるシグナルを検出することによって検出することができる。検出可能な標識は、直接的または間接的に検出することができ、異なる特異的抗体にコンジュゲートされた数種の異なる検出可能な標識を組み合わせて使用して、1つまたは複数の標的を検出することができる。
直接検出され得る検出可能な標識の例としては、蛍光色素および放射性物質および金属粒子が挙げられる。これに対して、間接検出は、一次抗体の適用後、1つまたは複数の追加の抗体、すなわち、二次抗体の適用が必要である。したがって、その検出は、一次検出可能な抗体への二次抗体または結合物質の結合の検出によって実施される。二次結合物質または抗体の添加を必要とする一次の検出可能な結合物質または抗体の例としては、酵素的に検出可能な結合物質およびハプテン検出可能な結合物質または抗体が挙げられる。
本開示の抗体にコンジュゲートされ得る検出可能な標識の例としては、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、金属粒子、ハプテン、および色素が挙げられる。
蛍光標識の例としては、5-（および6）-カルボキシフルオレセイン、5-または6-カルボキシフルオレセイン、6-(フルオレセイン)-5-(および6)-カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、ならびにCy2、Cy3およびCy5などの色素、場合により置換されているクマリン（AMCAを含む）、PerCP、フィコビリタンパク質（R-フィコエリスリン（RPE）およびアロフィコエリスリン（APC）を含む）、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびその類似体、ならびにR-フィコエリスリンまたはアロフィコエリスリンのコンジュゲート、無機蛍光標識、例えば被覆CdSeナノ微結晶のような半導体物質に基づく粒子が挙げられる。
ポリマー粒子標識の例としては、蛍光色素を埋め込むことができる、ポリスチレン、PMMAもしくはシリカの微粒子またはラテックス粒子、あるいは、色素、酵素もしくは基質を含有するポリマーミセルまたはカプセルが挙げられる。
金属粒子標識の例としては、銀染剤によって変換され得る、金粒子および被覆金粒子が挙げられる。ハプテンの例としては、DNP、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ビオチン、およびジゴキシゲニンが挙げられる。酵素標識の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（ALPまたはAP）、β-ガラクトシダーゼ（GAL）、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、β-N-アセチルグルコサミニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、蛍ルシフェラーゼおよびグルコースオキシダーゼ（GO）が挙げられる。ホースラディッシュペルオキシダーゼに対する一般に用いられる基質の例としては、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）、ニッケルで強化されたジアミノベンジジン、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC）、ベンジジン二塩酸塩（BDHC）、Hanker-Yates試薬（HYR）、インドファンブルー（IB）、テトラメチルベンジジン（TMB）、4-クロロ-1-ナフトール（CN）、アルファ-ナフトールピロニン（アルファ-NP）、o-ジアニシジン（OD）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファート（BCIP）、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）、2-（p-ヨードフェニル）-3-p-ニトロフェニル-l-5-フェニルテトラゾリウムクロリド（INT）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（TNBT）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-ベータ-D-ガラクトシド／フェロ-フェリシアニド（BCIG/FF）が挙げられる。
アルカリホスファターゼに対する一般に用いられる基質の例としては、ナフトール-AS-B 1-ホスファート／ファストレッドTR（NABP/FR）、ナフトール-AS-MX-ホスファート／ファストレッドTR（NAMP/FR）、ナフトール-AS-B1-ホスファート／-ファストレッドTR（NABP/FR）、ナフトール-AS-MX-ホスファート／ファストレッドTR（NAMP/FR）、ナフトール-AS-B1-ホスファート／ニューフクシン（NABP/NF）、ブロモクロロインドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT）、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-b--d-ガラクトピラノシド（BCIG）が挙げられる。
発光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、1,2-ジオキセタンおよびピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光標識の例としては、ルテニウム誘導体が挙げられる。放射性標識の例としては、ヨウ化物、コバルト、セレン、三重水素、炭素、硫黄およびリンの放射性同位体が挙げられる。
検出可能な標識は、本明細書に記載される抗体（すなわち、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体のいずれか）に、または関心対象の生物学的マーカー、例えば、抗体、核酸プローブもしくはポリマーに特異的に結合する任意の他の分子に連結させてよい。さらに、当業者は、検出可能な標識が、第2の、および／または第3の、および／または第4の、および／または第5の結合物質または抗体などにもコンジュゲートできることを認識するだろう。そのうえ、当業者は、関心対象の生物学的マーカーを特徴付けるために使用されるそれぞれの追加の結合物質または抗体が、シグナル増幅工程として役立ち得ることを認識するだろう。検出可能な物質が、例えば、色素、コロイド金粒子、発光試薬である場合、生物学的マーカーは、例えば、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、電子顕微鏡法を使用して目視で検出され得る。生物学的マーカーに結合している目視で検出可能な物質はまた、分光光度計を使用して検出され得る。検出可能な物質が放射性同位体である場合、検出は、オートラジオグラフィーにより目視で、またはシンチレーションカウンターを使用して目視以外で成され得る。例えば、Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.)；Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.)を参照されたい。
別の態様では、抗因子D抗体は、標識されておらず（すなわち、ネイキッドであり）、その存在は、抗因子D抗体（すなわち、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体のいずれか）に結合する標識された抗体を使用して検出することができる。
V. 抗因子D抗体を含む組成物およびキット
組成物
別の局面では、本開示は、固定化された（またはそうでなければ堆積された）本明細書に開示されるモノクローナル抗因子D抗体（例えば、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、および因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体）を含む、基材、例えば、固体支持体（例えば、不溶性基材、例えば非水性マトリックス、例えばガラス製のプレートもしくはスライド、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、プラスチックもしくは金属、ポリマー被覆ビーズ、チューブ、またはセラミックもしくは金属チップ）を提供する。いくつかの態様では、抗因子D抗体は、別々の場所で固定化される（または堆積される）（例えば、マルチウォールプレートのウェル中、またはバイオチップ上のアレイ中に堆積される）。いくつかの態様では、抗因子D抗体を含む基材は、哺乳類対象から得られた生体サンプル中の因子D（例えば、成熟因子D、プロ因子D、または全因子D（成熟およびプロ因子D））を検出するためのキットの一部であり得る。
キット
別の局面では、本開示は、本明細書に開示される1つまたは複数のアッセイの実施において使用するためのキットを提供する。
一態様では、本開示は、生体サンプルなどの試験サンプル中の因子D（例えば、成熟因子D、プロ因子D、または全因子D（成熟およびプロ因子D））の存在を検出するための試薬および説明書を含むキット（すなわち、パッケージングされた所定の量の試薬の組み合わせ）を提供する。例示的なキットは、本明細書に記載されるような少なくとも1つの抗因子Dモノクローナル抗体またはその抗原結合断片（すなわち、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体のいずれか）を含有し得る。抗因子D抗体が、酵素などの検出可能な部分で標識されている場合、キットは、酵素に必要な基質および補因子（例えば、検出可能なクロモフォアまたはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含むだろう。加えて、安定剤、緩衝液（例えば、ブロッキングバッファーまたは細胞溶解バッファー）などの他の添加物が含まれる場合もある。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中濃度を提供するように広く変動し得る。とりわけ、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。
加えて、キットは、本発明の抗体の使用の手段（例えば、代替経路補体（APC）活性化のレベル、またはその非存在についてのバイオマーカーとして、成熟因子Dまたはプロ因子Dの検出のための）を開示している説明資料を含み得る。キットはまた、キットが設計される特定の用途を容易にするための追加の構成成分も含み得る。例えば、キットは、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出ためのフィルターセット、ヒツジ抗マウス-HRPなどの適切な二次標識など）を追加で含有し得る。キットは、当技術分野において周知であるように、特定のイムノアッセイの実施に日常的に使用される緩衝液および他の試薬を追加で含み得る。
ある特定の態様は、サンプル中の成熟因子Dの存在または量を検出するためのキットであって、本明細書に記載されるような少なくとも1つの成熟因子D特異的抗体、例えば、表2に示されるような成熟因子D特異的クローン6G6、14A11、27B3、58F5、49G3および10G1からのCDRを含む抗体または断片を含有する、キットを提供する。ある特定の態様では、キットは、緩衝液、酵素、標識、基質、ビーズ、または本発明の抗体を付着させる他の表面など、および使用説明書を含み得る。
ある特定の態様は、サンプル中のプロ因子Dの存在または量を検出するためのキットであって、本明細書に記載されるような少なくとも1つのプロ因子D特異的抗体、例えば、表4に示されるようなプロ因子D特異的クローン18F5、1F9、2A4、20A1、13A10および21H1からのCDRを含む抗体または断片を含有する、キットを提供する。主題の抗因子D抗体およびその抗原結合断片は、本明細書に記載されるような任意の適切な検出可能な部分で標識することができる。ある特定の態様では、キットは、緩衝液、酵素、標識、基質、ビーズ、または本発明の抗体を付着させる他の表面など、および使用説明書を含み得る。
キット内のアイテムは、個々の入れ物に個別に包装またはパッケージングされてよく、これらは、より大きな容器（例えば、段ボール箱または発泡スチロール箱）内に一緒に提供される。
前述の内容に従って、一態様では、本開示は、イムノアッセイにおいてヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）および／またはプロ因子D（SEQ ID NO：2）を特異的に検出または定量する少なくとも1つのモノクローナル抗体を含むキットであって、少なくとも1つのモノクローナル抗体が、(i) ヒト成熟因子Dのアミノ末端を包含するエピトープに特異的に結合する成熟因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片（エピトープは、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなり、前記抗体は、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に結合しない）；および／または(ii) ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチド上のエピトープに特異的に結合するプロ因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片（エピトープは、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなり、前記抗体は、成熟因子D（SEQ ID NO：3）に結合しない）を含む、キットを提供する。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR-1、HC-CDR-2およびHC-CDR-3を含み、かつ、SEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。
いくつかの態様では、キットは、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）とヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）の両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体、またはその断片をさらに含む。いくつかの態様では、抗因子D抗体またはその断片は、SEQ ID NO：85～88からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：89～93からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。
いくつかの態様では、キットは、少なくとも1つの容器をさらに含む。
いくつかの態様では、キットは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を行うためのものである。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、コーティング抗体である。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、検出抗体である。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、コーティング抗体である。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、検出抗体である。
本発明のキットの様々な態様では、主題の抗因子D抗体およびその抗原結合断片（すなわち、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体および／または抗因子D抗体）は、本明細書に記載されるような任意の適切な検出可能な部分で標識することができる。ある特定の態様では、キットは、緩衝液、酵素、標識、基質、ビーズ、または本発明の抗体を付着させる他の表面など、および使用説明書をさらに含む。
VI. 抗因子D抗体を使用して因子Dを検出する方法
本明細書に記載されるように、本発明者らは、哺乳類対象から得られた生体サンプルなどの試験サンプル中の因子D（例えば、成熟因子D、プロ因子Dおよび全因子D（因子Dの成熟型とプロ型の両方））の存在および／または量を検出するためのイムノアッセイでの使用に適した抗因子D抗体を作製した。
一局面では、本発明の抗因子D抗体（成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、および因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を含む）は、試験サンプル、例えば試験対象から得られた生体サンプルをプロ因子D、成熟因子Dおよび／または全因子Dの存在または量について分析するために、インビトロイムノアッセイにおいて使用される。そのようなインビトロイムノアッセイでは、抗因子D抗体またはその抗原結合断片は、ネイキッドであってもよいし、本明細書に記載されるように検出可能な部分で標識されてもよく、そして、液相で利用しても、または後述するように基材に結合させてもよい。インビトロアッセイのために、宿主免疫反応を考慮する必要がないのでマウス、キメラ、ヒト化またはヒトなどのどんな種類の抗体を利用してもよい。
本開示の抗体は、任意の公知のイムノアッセイ法、例えば、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ラテラルフローアッセイ（例えば、ディップスティック形式）および免疫沈降アッセイにおいて用いられ得る（例えば、Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press. Inc., 1987)を参照のこと）。
サンドイッチアッセイは、検出しようとするタンパク質（例えば、因子D）の異なる免疫原性部分またはエピトープにそれぞれ結合可能な2つの抗体の使用を必要とする。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル分析物が、固体支持体（例えば、基材）上に固定化された第1の抗体（例えば、抗因子D抗体、例えば成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体および／または成熟因子Dとプロ因子Dの両方に結合する抗体）に結合し、その後、第2の抗体が分析物に結合し、それにより不溶性の3部分からなる複合体が形成される。第2の抗体はそれ自体、検出可能な部分で標識されていてもよく（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されてもよい（間接サンドイッチアッセイ）。
例えば、サンドイッチアッセイの1つの好ましいタイプは、ELISAアッセイであり、その場合、検出可能な部分は、酵素である。ELISAアッセイは、用いられる検出系にかかわらず、一般に、抗原または抗体の基材（例えば、固体支持体）への固定化、ならびに適切な検出試薬の使用を含む。ELISAアッセイでは、タンパク質抗原-抗体反応が、基材（例えば、固体支持体）上で、典型的には、マイクロタイタープレート上のウェル内で起こる。抗原とこの第1の抗体（コーティングまたは捕捉抗体とも呼ばれる）が反応して、安定した複合体を生成し、これを、酵素に直接的または間接的に連結され得る第2の抗体（検出抗体と呼ばれる）の付加によって可視化することができる。その酵素に対する基質の添加によって色が生じ、これを測光法で測定することができる。
一態様では、本発明の抗因子D抗体（成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体、および因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体を含む）は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を使用して生体サンプル中の因子D抗原の成熟型またはプロ型の存在を検出するために使用される（例えば、Gold et al. J Clin Oncol. 24:252-58, 2006を参照のこと）。
直接競合ELISAでは、純粋または半純粋な抗原調製物を、試験される流体または細胞抽出物に不溶な基材に結合させ、一定量の検出可能に標識された可溶性抗体を加えて、基質に結合した抗原と標識された抗体との間で形成された二成分複合体の検出および／または定量が可能になる。
これに対して、「2部位ELISA」または「サンドイッチアッセイ」としても知られている「二重決定基」ELISAは、少量の抗原しか必要とせず、そのアッセイは、抗原の大規模精製を必要としない。したがって、二重決定基ELISAは、臨床サンプルでの抗原の検出について直接競合ELISAよりも好ましい。例えば、生検標本におけるc-mycがんタンパク質の定量のための二重決定基ELISAの使用（Field et al., Oncogene 4: 1463 (1989)；Spandidos et al., AntiCancer Res. 9: 821 (1989)）を参照されたい。二重決定基ELISAでは、一定量の未標識モノクローナル抗体または抗体断片（「捕捉抗体」）を基材（例えば、固体支持体）に結合させ、試験サンプルを捕捉抗体と接触させ、そして、一定量の検出可能に標識された可溶性抗体（または抗体断片）を加えて、捕捉抗体、抗原および標識された抗体の間で形成された三成分複合体の検出および／または定量が可能になる。
一態様では、基材（例えば、固体支持体）に結合させる捕捉抗体は、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に共通のエピトープ（すなわち、因子DのC末端部分における）に結合する本明細書に開示されるような抗因子D抗体またはその抗原結合断片である。一態様では、基材（例えば、固体支持体）に結合させる捕捉抗体は、本明細書に開示されるような成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片である。一態様では、基材（例えば、固体支持体）に結合させる捕捉抗体は、本明細書に開示されるようなプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片である。
二重決定基ELISAを実施する方法は、当業者に周知である。例えば、Field et al., Oncogene 4: 1463 (1989)；Spandidos et al., AntiCancer Res. 9: 821 (1989)；およびMoore et al., Methods in Molecular Biology Vol 10:273-281 (The Humana Press, Inc. 1992)を参照されたい。
二重決定基ELISAでは、可溶性抗体または抗体断片は、捕捉抗体によって認識されるエピトープとは別個の因子Dエピトープに結合しなければならない。二重決定基ELISAは、試験生体サンプル、例えば体液（例えば、血液、血漿または血清）または生検サンプル中に因子D抗原（すなわち、成熟因子Dまたはプロ因子D）が存在するかどうかを確かめるために実施することができる。あるいは、該アッセイは、体液の臨床サンプル中に存在する因子D抗原の量を定量するために実施することができる。定量アッセイは、精製された因子D抗原の希釈物を含めることによって実施することができる。
少なくとも1つの抗因子D抗体またはその抗原結合断片（例えば、成熟因子D特異的抗体、プロ因子D特異的抗体および／または因子Dの成熟型とプロ型の両方に結合する抗因子D抗体）を基材（例えば、固相担体）に結合させるインビトロイムノアッセイを実施することができる。例えば、ポリマー被覆ビーズ、プレート、チューブ、またはセラミックもしくは金属チップなどの不溶性基材にモノクローナル抗体を連結させるために、抗因子Dモノクローナル抗体またはその断片をアミノデキストランなどのポリマーに付着させることができる。一態様では、基材は、ELISA法での使用に適したもの（例えば、マルチウェルマイクロタイタープレート）である。したがって、サンプル中の因子D（例えば、成熟因子D、プロ因子D、または成熟因子Dとプロ因子Dの両方）のレベルの判定は、ELISAビーズアッセイ、化学的または酵素的タンパク質測定などの市販の方法によって行ってよい。
他の好適なインビトロアッセイは、当業者に容易に明らかであろう。検出可能に標識された抗抗因子D抗体の具体的な濃度、インキュベーションの温度および時間、ならびに他のアッセイ条件は、サンプル中の因子D抗原の濃度、サンプルの性質などを含む、様々な要因に応じて変動し得る。抗因子D抗体のサンプルの結合活性は、周知の方法に従って判定され得る。当業者は、日常的な実験を用いることによって各判定のための操作可能で最適なアッセイ条件を決定することができるだろう。
別の態様では、主題の抗体およびその抗原結合断片を使用して、組織標本（例えば、生検サンプル）から調製された組織切片中の因子D抗原の存在を検出することができる。そのようなインサイチュー検出は、因子D抗原の存在を判定するために、また、検査組織中の因子D抗原の分布を判定するために使用することができる。インサイチュー検出は、検出可能に標識された抗因子D抗体を組織切片に適用することによって達成することができる。インサイチュー検出の一般的な技術は、当業者に周知である。例えば、Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in Mammalian Development: A Practical Approach 113-38 Monk (ed.) (IRL Press 1987)を参照されたい。
A. 成熟因子Dを検出するためのアッセイ
前述の内容に従って、一局面では、本発明は、生体サンプルなどの試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を判定する方法であって、(a) インビトロイムノアッセイにおいて試験サンプルと成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片とを接触させる工程、および(b) 前記抗体の結合の有無を検出する工程を含み、当該結合の存在がサンプル中の成熟因子Dの存在または量を示す、方法を提供する。一態様では、成熟因子D特異的抗体またはその断片は、ヒト成熟因子Dのアミノ末端領域中のエピトープに結合し、前記エピトープは、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むか、またはそれからなり、該抗体は、プロ因子Dに結合しない。
一態様では、抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む。一態様では、抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、IまたはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000043
を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列
Figure 0007634082000044
を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、GまたはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、IまたはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000045
を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3。一態様では、抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2；(c) SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3；(d) SEQ ID NO：50を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3。
いくつかの態様では、抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその断片は、表2に示されるような成熟因子D特異的クローン6G6、14A11、27B3、58F5、49G3および10G1からのCDRを含むモノクローナル抗体である。
一態様では、前記方法は、工程(b)に従って検出された成熟因子Dの量を参照標準または対照サンプルと比較して、試験サンプル中の成熟因子Dのレベルを判定することをさらに含む。
一態様では、対照サンプルは、代替経路疾患または障害（例えば、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、C3糸球体症、または他の代替経路疾患もしくは障害）を患っている対象の個別サンプルまたはプールされたサンプルである。一態様では、対照サンプルは、正常な健常ボランティアの個別サンプルまたはプールされたサンプルである。一態様では、対照サンプルは、補体阻害剤（例えば、MASP-3阻害剤または他の補体阻害剤）で処置する前の対象のベースラインサンプルである。一態様では、参照標準は、プロ因子D対成熟因子D、または成熟因子D対全因子Dの少なくとも1つの比であり、その比は、試験サンプルまたは対照サンプル（例えば、正常な健常ボランティアの個別サンプルもしくはプールされたサンプル、または補体阻害剤で処置する前の対象のベースラインサンプル、または代替経路疾患もしくは障害を患っている対象の個別サンプルもしくはプールされたサンプル）から得られる。一態様では、抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、基材上に固定化される。一態様では、イムノアッセイは、ELISAアッセイである。
一態様では、抗ヒト成熟因子D特異的抗体は、検出可能な部分で標識されており、工程(b)は、前記検出可能な部分の存在を検出することを含む。一態様では、前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片はネイキッドであり（すなわち、標識されておらず）、成熟因子Dに結合した抗体またはその断片の存在または量は、抗成熟因子D抗体に結合する標識された抗体を使用して検出される。一態様では、前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、基材（すなわち、捕捉／コーティング）上に固定化され、結合した成熟因子Dは、因子Dの異なるエピトープに結合する第2の抗体（例えば、本明細書に記載されるような成熟因子Dおよびプロ因子Dに共通のエピトープに結合する抗因子D抗体）で検出される。
一態様では、試験サンプルは、哺乳類対象から得られた生体サンプルである。様々な態様では、生体サンプルは、全血、血清、血漿、痰、羊水、脳脊髄液、細胞溶解物、腹水、尿、唾液、および組織からなる群より選択される。一態様では、生体サンプルは、血液、血清、血漿、尿、および脳脊髄液からなる群より選択される。
一態様では、哺乳類対象（例えば、ヒト）は、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する。一態様では、哺乳類対象は、腎機能の低下により補体因子Dの除去機能が損なわれている腎疾患を患っているか、それを発症する。
一態様では、哺乳類対象（例えば、ヒト）は、本明細書にさらに記載されるような補体阻害剤、例えば代替経路補体阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体）で処置されている。
本明細書に記載されるように、本開示の様々な態様に従う成熟因子Dを検出する方法は、補体阻害剤、例えば代替経路補体阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体）の薬力学的エンドポイントまたは治療閾値を規定するために使用され得る。
イムノアッセイの詳細は、用いられる特定のフォーマットにより変動し得るが、試験サンプル中の成熟因子Dを検出する方法は、試験サンプルを、成熟因子Dに特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む。抗体を、免疫学的に反応性の条件下でサンプル中の成熟因子Dに結合させ、結合した抗体の存在は、直接的または間接的に検出される。成熟因子D特異的抗体は、例えば、ELISAの捕捉抗体として、または捕捉抗体によって捕捉される成熟因子Dに結合するための第2の抗体として使用され得る。当技術分野において公知であるように、第2の抗体の存在は、典型的にはその後に検出される。いくつかの態様では、イムノアッセイは、固体支持体上で実施される。いくつかの態様では、イムノアッセイは、ELISAアッセイである。
B. プロ因子Dアッセイ
前述の内容に従って、別の局面では、本発明は、試験サンプル中のプロ因子Dの存在または量を検出する方法であって、(a) インビトロイムノアッセイにおいて試験サンプルとプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片とを接触させる工程、および(b) 前記抗体の結合の有無を検出する工程を含み、結合の存在が、サンプル中のプロ因子Dの存在を示す、方法を提供する。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）中のエピトープに特異的に結合し、当該抗体またはその断片は、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に特異的に結合しかつヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に結合しない。
一態様では、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するプロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO：136～139からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～145からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、SEQ ID NO：140およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：146およびSEQ ID NO：147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、CDRは、Kabat付番システムに従って付番される。
一態様では、プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、以下の6つのCDRを含む結合ドメインを含む：(a) SEQ ID NO：167を含むCDR-H1、(b) SEQ ID NO：169またはSEQ ID NO：173を含むCDR-H2；(c) SEQ ID NO：171またはSEQ ID NO：174を含むCDR-H3；(d) SEQ ID NO：194を含むCDR-L1、(e) SEQ ID NO：196またはSEQ ID NO：199を含むCDR-L2、および(f) SEQ ID NO：198またはSEQ ID NO：200を含むCDR-L3。
いくつかの態様では、プロ因子D特異的抗体またはその断片は、表4に示されるようなプロ因子D特異的クローン18F5、1F9、2A4、20A1、13A10および21H1からのCDRを含むモノクローナル抗体である。
一態様では、該方法は、工程(b)に従って検出されたプロ因子Dの量を参照標準または対照サンプルと比較して、試験サンプル中のプロ因子Dのレベルを判定することをさらに含む。
一態様では、対照サンプルは、代替経路疾患または障害（例えば、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、C3糸球体症、または他の代替経路疾患もしくは障害）を患っている対象の個別サンプルまたはプールされたサンプルである。一態様では、対照サンプルは、正常な健常ボランティアの個別サンプルまたはプールされたサンプルである。一態様では、対照サンプルは、補体阻害剤（例えば、MASP-3阻害剤または他の補体阻害剤）で処置する前の対象のベースラインサンプルである。一態様では、参照標準は、プロ因子D対成熟因子D、またはプロ因子D対全因子Dの少なくとも1つの比であり、その比は、試験サンプルまたは対照サンプル（例えば、正常な健常ボランティアの個別サンプルもしくはプールされたサンプル、または補体阻害剤で処置する前の対象のベースラインサンプル、または代替経路疾患もしくは障害を患っている対象の個別サンプルもしくはプールされたサンプル）から得られる。
一態様では、抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、基材上に固定化される。一態様では、イムノアッセイは、ELISAアッセイである。
一態様では、抗ヒトプロ因子D特異的抗体は、検出可能な部分で標識されており、工程(b)は、前記検出可能な部分の存在を検出することを含む。一態様では、抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片はネイキッドであり（すなわち、標識されておらず）、プロ因子Dに結合した抗体またはその断片の存在または量は、抗ヒトプロ因子D抗体に結合する標識された抗体を使用して検出される。一態様では、前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片は、基材（すなわち、捕捉／コーティング）上に固定化され、結合したプロ因子Dは、因子Dの異なるエピトープに結合する第2の抗体（例えば、本明細書に記載されるような成熟因子Dおよびプロ因子Dに共通のエピトープに結合する抗因子D抗体）で検出される。
一態様では、試験サンプルは、哺乳類対象から得られた生体サンプルである。様々な態様では、生体サンプルは、全血、血清、血漿、痰、羊水、脳脊髄液、細胞溶解物、腹水、尿、唾液、および組織からなる群より選択される。一態様では、生体サンプルは、血液、血清、血漿、尿、および脳脊髄液からなる群より選択される。
一態様では、哺乳類対象（例えば、ヒト）は、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する。一態様では、哺乳類対象は、腎機能の低下により補体因子Dの除去機能が損なわれている腎疾患を患っているか、それを発症する。
一態様では、哺乳類対象（例えば、ヒト）は、本明細書にさらに記載されるような補体阻害剤、例えば代替経路補体阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体）で処置されている。
本明細書に記載されるように、本開示の様々な態様に従うプロ因子Dを検出する方法は、補体阻害剤、例えば代替経路補体阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体）の薬力学的エンドポイントまたは治療閾値を規定するために使用され得る。一態様では、哺乳類対象（例えば、ヒト）は、本明細書にさらに記載されるようなMASP-3阻害剤、例えばMASP-3阻害抗体で処置されている。
イムノアッセイの詳細は、用いられる特定のフォーマットにより変動し得るが、試験サンプル中のプロ因子Dを検出する方法は、試験サンプルを、プロ因子Dに特異的に結合する抗体と接触させる工程を含む。抗体を、免疫学的に反応性の条件下でサンプル中のプロ因子Dに結合させ、結合した抗体の存在は、直接的または間接的に検出される。プロ因子D特異的抗体は、例えば、ELISAの捕捉抗体として、または捕捉抗体によって捕捉されるプロ因子Dに結合するための第2の抗体として使用され得る。当技術分野において公知であるように、第2の抗体の存在は、典型的にはその後に検出される。いくつかの態様では、イムノアッセイは、固体支持体上で実施される。いくつかの態様では、イムノアッセイは、ELISAアッセイである。
VII. 代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクのある対象の診断、モニタリングおよび処置の方法
本発明の抗因子D抗体、方法、試薬およびキットは、数多くの用途に使用され得る。例えば、ある特定の態様では、本発明のアッセイを使用して、対象における成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルを評価し、かつ／または、補体経路阻害剤、例えば代替経路補体阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体）が対象から得られた生体サンプル中の成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルに与える影響の程度を評価し、それにより、前記対象におけるAPC活性化の程度を評価してよい。いくつかの態様では、本発明のアッセイを使用して、インビボまたはインビトロで補体経路阻害剤（例えば、MASP-3阻害剤）が代替補体経路活性化を減少させる程度を評価してよい。いくつかの態様では、本発明の方法は、対象から得られた生体サンプルに対して実施される。いくつかの態様では、本発明のアッセイにおいて検出された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルは、好適な参照値と比較される。参照値は、例えば、健康な患者（または健康な患者の一群）から得られたサンプルから測定された値、またはMASP-3阻害剤による処置を受けている患者から得られた（例えば、処置の前にまたは一連の処置のある時点に得られた）サンプルから測定された値であり得るか、または参照値は所定の閾値であり得る。一態様では、対照サンプルは、代替経路疾患または障害（例えば、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、C3糸球体症、または他の代替経路疾患もしくは障害）を患っている対象の個別サンプルまたはプールされたサンプルである。一態様では、対照サンプルは、正常な健常ボランティアの個別サンプルまたはプールされたサンプルである。一態様では、対照サンプルは、補体阻害剤（例えば、MASP-3阻害剤または他の補体阻害剤）で処置する前の対象のベースラインサンプルである。一態様では、参照標準は、プロ因子D対成熟因子D、成熟因子D対全因子D、またはプロ因子D対全因子Dの少なくとも1つの比であり、その比は、試験サンプルまたは対照サンプル（例えば、正常な健常ボランティアの個別サンプルもしくはプールされたサンプル、または補体阻害剤で処置する前の対象のベースラインサンプル、または代替経路疾患もしくは障害を患っている対象の個別サンプルもしくはプールされたサンプル）から得られる。
本明細書に記載されるように、本開示の様々な態様に従う成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dを検出する方法を使用して、代替経路補体活性化の程度を評価し、それにより、これを使用して、補体阻害剤、例えば代替経路補体阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体）の薬力学的エンドポイントまたは治療閾値を規定してよい。
A. 哺乳類対象における代替経路補体活性化の程度を評価する方法
一局面では、本開示は、試験サンプルにおける代替経路補体（APC）活性化の程度を評価し、試験サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出することならびに／または試験サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することを含むイムノアッセイを実施する方法であって、試験サンプル中で検出された成熟因子Dのレベルおよび／またはプロ因子Dのレベルが、試験サンプルにおける代替経路補体活性化の程度の指標となる、方法を提供する。一態様では、試験サンプルは、哺乳類対象から得られた生体サンプルであり、当該方法は、(a) 哺乳類対象から得られた生体サンプルを提供する工程；ならびに(b) 本明細書に記載される本発明の方法に従う生体サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出すること；ならびに／または生体サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することのうちの少なくとも1つを含むイムノアッセイを実施することによって、対象におけるAPC活性化の程度を評価する工程を含む。例えば、一態様では、イムノアッセイは、試験サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出することであって、成熟因子Dが、成熟因子D中に存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）中のエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dに結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその断片で捕捉もしくは検出される、成熟因子Dを捕捉および検出することを含む。一態様では、イムノアッセイは、試験サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することであって、プロ因子Dが、プロ因子D中に存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）上のエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dに結合しないプロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその断片で捕捉もしくは検出される、プロ因子Dを捕捉および検出することを含む。様々な態様では、該方法は、試験サンプル（例えば、生体サンプル）中で検出された成熟因子Dのレベルを所定のレベルまたは対照サンプルと比較する工程、および／または試験サンプル中で検出されたプロ因子Dのレベルを所定のレベルまたは対照サンプルと比較する工程を含み、試験サンプル中で検出された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルが、試験サンプル（例えば、生体サンプル）における代替経路補体活性化の程度の指標となる。いくつかの態様では、該方法は、比較分析の結果を使用して、生体サンプルが得られた哺乳類対象に関する診断、予後または処置関連情報を提供することをさらに含む。いくつかの態様では、本開示は、ヒト補体の阻害剤が代替経路補体活性化に及ぼすインビボ効果を評価する方法を提供する。ヒト補体成分のいずれかに結合するまたはそうでなければその生成および／もしくは活性を遮断する任意の化合物を、本開示に従って利用してよい。例えば、補体の阻害剤は、例えば、低分子、核酸もしくは核酸類似体、ペプチド模倣体、または核酸もしくはタンパク質ではない高分子、例えば、抗体もしくはその断片であることができる。いくつかの態様では、本開示は、ヒト補体成分に特異的な阻害剤（例えば、抗体または低分子）、例えば、C1（C1q、C1r、C1s）、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、因子D、因子B、因子P、MBL、MASP-1、MASP-2およびMASP-3からなる群より選択される補体成分の阻害剤などが代替補体経路活性化に及ぼすインビボ効果を評価する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、代替補体経路阻害剤が代替経路補体活性化に及ぼす効果を評価する方法を提供する。いくつかの態様では、本開示は、プロ因子D成熟阻害剤が代替経路補体活性化に及ぼす効果を評価する方法を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、哺乳類対象に投与されたMASP-3阻害剤が代替経路補体活性化に及ぼすインビボ効果を評価する方法を提供する。様々な態様では、MASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体）が哺乳類対象に投与され、生体サンプルがその後採取される。次いで、本明細書に記載される本発明の方法に従う生体サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出すること；ならびに／または生体サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することのうちの少なくとも1つを含むイムノアッセイを実施することによって、生体サンプルにおける代替経路補体（APC）活性化の程度が評価される。
B. 哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体の有効性をモニタリングする方法
一態様では、本開示は、哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体による処置の有効性をモニタリングするための方法であって、(a) 第1の時点において一定用量のMASP-3阻害抗体を哺乳類対象に投与する工程；(b) 工程(a) 後に対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第1の濃度を評価する工程；(c) 第2の時点において対象をMASP-3阻害抗体で処置する工程；(d) 工程(c) 後に対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第2の濃度を評価する工程；ならびに(e) 工程(b)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルを、工程(d)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルと比較して、哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体の有効性を判定する工程を含む、方法を提供する。一態様では、対象におけるAPC活性化の程度は、生体サンプル中の成熟因子Dを捕捉してそのレベルを検出することを含むイムノアッセイで評価される。任意で、生体サンプル中で検出された成熟因子Dのレベルは、好適な参照値と比較される。参照値は、例えば、MASP-3阻害抗体の投与前に対象から得られた生体サンプルから測定された成熟因子Dの値、健康な対照対象の一群から得られたサンプルから測定された平均値、所望のAPC活性化の程度を表す値（例えば、APCの90％阻害、またはAPCの80％阻害、または70％阻害、または60％阻害、または50％阻害に対応する成熟因子Dのレベル）であり得る。例えば、MASP-3阻害抗体の投与前に対象から第1の生体サンプルを得て、MASP-3阻害抗体の投与後に第2の生体サンプルを得て、サンプル中で成熟因子Dのレベルが測定される。第2の生体サンプル中の成熟因子Dのレベルが、第1の生体サンプル中の成熟因子Dのレベル未満であるかまたは対照値（例えば、APCの阻害率に対応する閾値）より低い場合、MASP-3阻害抗体がAPC活性化を所望の程度まで阻害したと結論付けることができる。あるいは、第2の生体サンプル中の成熟因子Dのレベルが第1の生体サンプル中の成熟因子Dのレベルよりも高いかまたは対照値（例えば、APCの阻害率に対応する閾値）よりも高い場合、MASP-3阻害抗体の投与量を増加させるべきと結論付けることができ、任意で、該方法は、投与量を増加させたMASP-3阻害抗体を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、用量を増加させたMASP-3阻害抗体が対象に投与される場合、工程(b)～(e)を繰り返して、用量を増加させたMASP-3阻害抗体が、それぞれの対照または参照標準と比較して成熟因子Dのレベルを所望のレベルまで調整するのに十分であるかどうかを判定する。
別の態様では、哺乳類対象におけるAPC活性化の程度は、生体サンプル中のプロ因子Dを捕捉してそのレベルを検出することを含むイムノアッセイで評価される。任意で、生体サンプル中で検出されたプロ因子Dのレベルは、好適な参照値と比較される。参照値は、例えば、MASP-3阻害抗体の投与前に対象から得られた生体サンプルから測定されたプロ因子Dの値、健康な対照対象の一群から得られたサンプルから測定された平均値、所望のAPC活性化の程度を表す値（例えば、APCの90％阻害、またはAPCの80％阻害、または70％阻害、または60％阻害、または50％阻害に対応するプロ因子Dのレベル）であり得る。例えば、MASP-3阻害抗体の投与前に対象から第1の生体サンプルを得て、MASP-3阻害抗体の投与後に第2の生体サンプルを得て、サンプル中でプロ因子Dのレベルが測定される。第2の生体サンプル中のプロ因子Dのレベルが第1の生体サンプル中のプロ因子Dのレベルよりも大きいかまたは対照値（例えば、APCの阻害率に対応する閾値）よりも高い場合、MASP-3阻害抗体がAPC活性化を所望の程度まで阻害したと結論付けることができる。あるいは、第2の生体サンプル中のプロ因子Dのレベルが第1の生体サンプル中のプロ因子Dのレベルよりも低いかまたは対照値（例えば、APCの阻害率に対応する閾値）よりも低い場合、MASP-3阻害抗体の投与量を増加させるべきと結論付けることができ、任意で、該方法は、投与量を増加させたMASP-3阻害抗体を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、用量を増加させたMASP-3阻害抗体が対象に投与される場合、工程(b)～(e)を繰り返して、用量を増加させたMASP-3阻害抗体が、それぞれの対照または参照標準と比較してプロ因子Dのレベルを所望のレベルまで調整するのに十分であるかどうかを判定する。
いくつかの態様では、該方法は、代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクのあるヒト対象に投与されるMASP-3阻害抗体の有効性をモニタリングするために使用され、例えば、代替経路疾患または障害は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症および重症筋無力症からなる群より選択される。
C. 代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクのある哺乳類対象を処置する方法
別の局面では、本開示は、代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクのある哺乳類対象を処置する方法であって、対象が、(i) 対象から採取された1つまたは複数のサンプル中のプロ因子Dのレベルが、所定のプロ因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照サンプル中のプロ因子Dレベルと比較してより低いまたは減少したと判定された場合：および／または(ii) 対象から採取された1つまたは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルが、所定の成熟因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照サンプル中の成熟因子Dレベルと比較してより高いまたは増加したと判定された場合に、MASP-3阻害抗体を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。一態様では、対象から採取された1つまたは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルは、成熟因子D特異的モノクローナル抗体の使用を含むイムノアッセイを実施することによって判定される。一態様では、対象から採取された1つまたは複数のサンプル中の成熟プロ因子Dのレベルは、プロ因子D特異的モノクローナル抗体の使用を含むイムノアッセイを実施することによって判定される。
いくつかの態様では、該方法は、代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクのあるヒト対象を処置するために使用され、例えば、代替経路疾患または障害は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症および重症筋無力症からなる群より選択される。
VIII. MASP-3阻害剤
ヒトMASP-3ポリペプチド（SEQ ID NO：7、Genbank AAK84071.1から）は、728のアミノ酸残基を有し、これは、19残基のリーダーペプチドを含む。上で述べたように、MASP-3が、補体因子Dの酵素前駆体型（すなわち、プロ因子D）から成熟型（すなわち、成熟因子D）への変換を担っており、したがって、MASP-3タンパク質が、代替経路にとって重要な上流の調節的立場にあることが実証されている。したがって、本開示の様々な局面および態様の実施において、代表的なMASP-3阻害剤は、SEQ ID NO：7として示されるMASP-3に結合するかまたはそれと直接相互作用する作用物質を含み、代替経路補体活性化を阻害する抗MASP-3抗体およびそのMASP-3結合断片、低分子ならびに発現阻害剤を含む。好ましい態様では、MASP-3阻害剤は、MASP-3に特異的であり、MASP-1またはMASP-2に結合しない。MASP-3阻害剤の一例は、MASP-3特異的阻害剤、例えば、ヒトMASP-3（SEQ ID NO：7）の一部分に、補体系の他の成分より少なくとも10倍大きい結合親和性で特異的に結合するMASP-3阻害剤である。一態様では、MASP-3阻害剤は、ヒトMASP-3（SEQ ID NO：7）のセリンプロテアーゼドメインに500pM未満の親和性で特異的に結合する高親和性MASP-3抗体である。好ましい態様では、MASP-3阻害剤、例えば抗体またはその抗原結合断片もしくは抗原結合ペプチドは、因子DのMASP-3媒介成熟を阻害する。本発明の方法において有用なMASP-3阻害剤は、MASP-3依存性の代替経路補体活性化を10％超、例えば、20％超、50％超、または90％超低下させ得る。一態様では、MASP-3阻害剤は、MASP-3依存性の代替経路補体活性化を90％超低下させる（すなわち、わずか10％またはそれより少ないMASP-3補体活性化をもたらす）。
一態様では、本発明の方法において有用なMASP-3阻害剤は、ヒトMASP-3のセリンプロテアーゼドメイン（SEQ ID NO：7のアミノ酸残基450～728）に高親和性（500pM未満のKDを有する）で特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、代替経路補体活性化を阻害する抗体またはその抗原結合断片である。例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO2018/026722に記載されているように、また本明細書の実施例10および表18～20にさらに記載するように、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合してその触媒活性を阻害する多数の高親和性抗MASP-3阻害抗体が作製されている。WO2018/026722にさらに記載されているように、数種の代表的なMASP-3阻害抗体（例えば、4D5、10D12および13B1）がヒト化された。代表的なヒト化MASP-3阻害抗体を後述する。
したがって、一態様では、請求項に記載される本発明の組成物および方法において使用するためのMASP-3阻害剤は、ヒトMASP-3（SEQ ID NO：7）からなるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を含み、該モノクローナル抗体、またはその抗原結合断片は、MASP-3に結合し、以下の少なくとも1つを含む：
(i) SEQ ID NO：229（TDDIN）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000046
を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：236（LEDTY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；
Figure 0007634082000047
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2およびSEQ ID NO：242（KQSYNLYT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；
(ii) SEQ ID NO：230（SYGMS）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000048
を含むHC-CDR2およびSEQ ID NO：237（GGEAMDY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；
Figure 0007634082000049
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：241（LVSKLDS）を含むLC-CDR2およびSEQ ID NO：243（WQGTHFPWT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
(iii) SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1；
Figure 0007634082000050
を含むHC-CDR2；およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；SEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2；およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域。
一態様では、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO：220、SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：223、SEQ ID NO：225、SEQ ID NO：226、またはSEQ ID NO：228の少なくとも1つに対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％同一を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：224またはSEQ ID NO：227の少なくとも1つに対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％同一を含む軽鎖可変領域とを含む。一態様では、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO：220またはSEQ ID NO：222に対して少なくとも95％同一を含む重鎖とSEQ ID NO：221に対して少なくとも95％同一を含む軽鎖とを含む。一態様では、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO：223またはSEQ ID NO：225に対して少なくとも95％同一を含む重鎖とSEQ ID NO：224に対して少なくとも95％同一を含む軽鎖とを含む。一態様では、MASP-3モノクローナル抗体は、SEQ ID NO：226またはSEQ ID NO：228に対して少なくとも95％同一を含む重鎖とSEQ ID NO：227に対して少なくとも95％同一を含む軽鎖とを含む。
XIV. 薬学的組成物および製造品
別の局面では、本開示は、pH 6.0±5％、20±5％ mMのヒスチジン、100±5％ mg/mLのスクロース、および0.035％±5％のポリソルベート80を有する緩衝液系を含む水溶液中にMASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物であって、前記MASP-3阻害抗体が、110mg/mL±5％の濃度で含まれ、前記MASP-3阻害抗体が、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1；
Figure 0007634082000051
または
Figure 0007634082000052
を含むHC-CDR2；およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；SEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2；およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、無菌である。一態様では、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO：226またはSEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％同一を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％同一を含む軽鎖可変領域とを含む。一態様では、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、および前述のいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される。一態様では、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、一本鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、ヒンジ領域を欠いている一価抗体、および全長抗体（whole antibody）からなる群より選択される。一態様では、MASP-3阻害抗体は、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。一態様では、MASP-3阻害抗体は、ヒトIgG4定常領域を含む。一態様では、MASP-3阻害抗体は、S228P変異を有するヒトIgG4定常領域を含む。一態様では、MASP-3阻害抗体は、低pHでのFcRn相互作用を促進する変異を含み、例えば、MASP-3阻害抗体は、SEQ ID NO：245として示されるヒトIgG4定常領域を含む。
一局面では、本開示は、ヒト対象への治療的投与に適した単位剤形のMASP-3阻害抗体、例えば、10mg～1000mg（例えば、50mg～800mg、または75mg～500、例えば100mg～300mg、例えば125～275mg、例えば150～200mg、例えば150±5％mg、155±5％mg、160±5％mg、165±5％mg、170±5％mg、175±5％mg、180±5％mg、185±5％mgまたは190±5％mg）の範囲の単位投与量のMASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物を含有する製造品であって、前記MASP-3阻害抗体が、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1；
Figure 0007634082000053
または
Figure 0007634082000054
を含むHC-CDR2；およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；SEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2；およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、製造品を提供する。
いくつかの態様では、製造品は、容器と、容器上にまたはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、アンプル、ポーチ（例えば、静脈内注入バッグ）、バイアル、シリンジ、カートリッジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されていてよい。容器は、病態を処置するために有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、皮下注射針で突き刺し可能なストッパーを有する静注液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも1つの活性物質は、本発明のMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片である。ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の病態を処置するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、抗体組成物を患者に投与するための説明書をさらに含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載される薬学的組成物および製造品は、代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクのある対象の処置において使用するためのものである。いくつかの態様では、代替経路疾患または障害は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症および重症筋無力症からなる群からのものである。
例示的な態様
A. 成熟因子D特異的mAb：
1. ヒト成熟因子DのN末端領域におけるエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該エピトープが、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなる、単離された抗体またはその抗原結合断片。
2. 前記抗体が、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、パラグラフ1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記抗体がモノクローナル抗体である、パラグラフ1または2記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、パラグラフ1～3のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
5. 前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体が一本鎖分子である、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記抗体が、IgG1、IgG2、およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
8. 10nM未満のKDでヒト成熟因子Dに結合する、パラグラフ1～7のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
9. 検出可能な部分で標識されている、パラグラフ1～8のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
10. 基材上に固定化されている、パラグラフ1～9のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
11. ヒト成熟因子Dに特異的に結合する前記単離された抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、パラグラフ1～10のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
12. ヒト成熟因子Dに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、IまたはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000055
を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列
Figure 0007634082000056
を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、GまたはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、IまたはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000057
を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～10のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
13. 前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：50を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、パラグラフ12記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
14. (a) SEQ ID NO：12またはSEQ ID NO：13のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：18またはSEQ ID NO：19のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(c) SEQ ID NO：12を含むVHおよびSEQ ID NO：18を含むVL;ならびに／または
(d) SEQ ID NO：13を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：19を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ13記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
15. 前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：33を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：34を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：36を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：58を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、パラグラフ12記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
16. (a) SEQ ID NO：14のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：20のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：14を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：20を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ15記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
17. 前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：38を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：60を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、パラグラフ12記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
18. (a) SEQ ID NO：15のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：21のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：15を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：21を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ17記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
19. 前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：62を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR22、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、パラグラフ12記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
20. (a) SEQ ID NO：16のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：22のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：16を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：22を含むVL
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ19記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
21. 前記結合ドメインが、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：47を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：63を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：64を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む、パラグラフ12記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
22. (a) SEQ ID NO：17のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：23のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；ならびに／または
(c) SEQ ID NO：17を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：23を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ21記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
23. パラグラフ11～22のいずれかに記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
24. パラグラフ23記載の本発明のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む、発現カセット。
25. パラグラフ23またはパラグラフ24記載の本発明のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
26. ヒト成熟因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、ヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子の発現を可能とする条件下でパラグラフ25記載の細胞を培養する工程、および抗成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、方法。
27. パラグラフ1～22のいずれかに記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
28. パラグラフ1～22のいずれかに記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノアッセイにおいて使用するための基材。
29. (a) 少なくとも1つの容器と、(b) パラグラフ1～22のいずれかに記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片とを含む、試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を検出するためのキット。
B. プロ因子D特異的mAb：
1. ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該エピトープが「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなる、単離された抗体またはその抗原結合断片。
2. ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に特異的に結合し、かつ成熟因子D（SEQ ID NO：3）には結合しない、パラグラフ1記載の抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記抗体がモノクローナル抗体である、パラグラフ1または2記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、パラグラフ1～3のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
5. 前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体が一本鎖分子である、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
7. 前記抗体が、IgG1、IgG2、およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
8. 10nM未満のKDでヒトプロ因子Dに結合する、パラグラフ1～7のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
9. 検出可能な部分で標識されている、パラグラフ1～8のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
10. 基材上に固定化されている、パラグラフ1～9のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
11. 前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、パラグラフ1～10のいずれかに記載のヒトプロ因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
12. SEQ ID NO：136～139からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～145からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、パラグラフ11記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
13. 以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XYWMS（SEQ ID NO：201）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはN、SまたはTである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000058
を含むHC-CDR2（配列中、7位のXはDまたはEであり、11位のXはTまたはAであり、12位のXはHまたはYであり、14位のXはAまたはTである）；(c) アミノ酸配列AWFAX（SEQ ID NO：203）を含むHC-CDR3（配列中、5位のXはS、YまたはNである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000059
を含むLC-CDR1（配列中、1位のXはMまたはKであり、5位のXはSまたはNであり、10位のXはKまたはRである）；(e) アミノ酸配列WASTRES（SEQ ID NO：178）を含むLC-CDR2；および(f) アミノ酸配列LQYYXYPYT（SEQ ID NO：205）を含むLC-CDR3（配列中、5位のXはTまたはSである）
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ12記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
14. 以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：149またはSEQ ID NO：155を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：151またはSEQ ID NO：156を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：153を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：176を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：178を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：180を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ13記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
15. (a) SEQ ID NO：136のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：137のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(c) SEQ ID NO：142のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(d) SEQ ID NO：143のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(e) SEQ ID NO：136を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：142を含むVLドメイン；ならびに／または
(f) SEQ ID NO：137を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：143を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ14記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
16. 以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：158を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：159またはSEQ ID NO：163を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：161またはSEQ ID NO：165を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：184またはSEQ ID NO：189を含むLC-CDR-1、(e) SEQ ID NO：178を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：187を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ13記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
17. (a) SEQ ID NO：138のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；(b) SEQ ID NO：139のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(c) SEQ ID NO：144のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(d) SEQ ID NO：145のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(e) SEQ ID NO：138を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：144を含むVLドメイン；ならびに／または
(f) SEQ ID NO：139を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：145を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ16記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
18. SEQ ID NO：140およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：146およびSEQ ID NO：147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、パラグラフ11記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
19. 以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：167を含むCDR-H1、(b) SEQ ID NO：169またはSEQ ID NO：173を含むCDR-H2、(c) SEQ ID NO：171またはSEQ ID NO：174を含むCDR-H3、(d) SEQ ID NO：194を含むCDR-L1、(e) SEQ ID NO：196またはSEQ ID NO：199を含むCDR-L2、および(f) SEQ ID NO：198またはSEQ ID NO：200を含むCDR-L3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ18記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
20. (a) SEQ ID NO：140のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：141のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(c) SEQ ID NO：146のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(d) SEQ ID NO：147のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(e) SEQ ID NO：140を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：146を含むVLドメイン；ならびに／または
(f) SEQ ID NO：141を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：147を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ19記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
21. パラグラフ11～20のいずれかに記載のヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
22. パラグラフ21記載のヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む、発現カセット。
23. パラグラフ21またはパラグラフ22記載のヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
24. ヒトプロ因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、ヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子の発現を可能とする条件下でパラグラフ23記載の細胞を培養する工程、および抗プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、方法。
25. パラグラフ1～20のいずれかに記載のヒトプロ因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
26. パラグラフ1～20のいずれかに記載のヒトプロ因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノアッセイにおいて使用するための基材。
27. (a) 少なくとも1つの容器と、(b) パラグラフ1～20のいずれかに記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片とを含む、試験サンプル中のプロ因子Dの存在または量を検出するためのキット。
C. （共通のエピトープへの結合によりプロおよび成熟因子Dを検出する）抗因子D mAb
1. ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO：85～88からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：89～93からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、単離された抗体またはその抗原結合断片。
2. 前記抗体がモノクローナル抗体である、パラグラフ1記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
3. 前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体、または完全ヒト抗体である、パラグラフ1または2記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
4. 前記抗原結合断片が、Fv、Fab、Fab'、F(ab)2、およびF(ab')2からなる群より選択される、パラグラフ1～3のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
5. 一本鎖分子である、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
6. 前記抗体が、IgG1、IgG2、およびIgG4からなる群より選択されるIgG分子である、パラグラフ1～4のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
7. 10nM未満のKDでヒト因子Dに結合する、パラグラフ1～7のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
8. 検出可能な部分で標識されている、パラグラフ1～7のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
9. 基材上に固定化されている、パラグラフ1～8のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
10. 前記抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、パラグラフ1～9のいずれかに記載のヒトプロ因子Dに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
11. 以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列SEQ ID NO：95を含むHC-CDR1、(b) アミノ酸配列SEQ ID NO：97を含むHC-CDR2、(c) アミノ酸配列SEQ ID NO：99を含むHC-CDR3、(d) アミノ酸配列SEQ ID NO：111を含むLC-CDR1、(e) アミノ酸配列SEQ ID NO：113を含むLC-CDR2；および(f) アミノ酸配列SEQ ID NO：115を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～10のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
12. 以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列SEQ ID NO：101を含むHC-CDR1、(b) アミノ酸配列SEQ ID NO：103または107を含むHC-CDR2、(c) アミノ酸配列SEQ ID NO：105または108を含むHC-CDR3、(d) アミノ酸配列SEQ ID NO：60または123を含むLC-CDR1、(e) アミノ酸配列SEQ ID NO：119、124、または126を含むLC-CDR2、および(f) アミノ酸配列SEQ ID NO：121または125を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～10のいずれかに記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
13. (a) SEQ ID NO：85のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(b) SEQ ID NO：86のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(c) SEQ ID NO：87のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(d) SEQ ID NO：88のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVHドメイン；
(e) SEQ ID NO：89のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(f) SEQ ID NO：90のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(g) SEQ ID NO：91のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(h) SEQ ID NO：92のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(i) SEQ ID NO：93のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有するVLドメイン；
(j) SEQ ID NO：85を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：89またはSEQ ID NO：90を含むVLドメイン;
(k) SEQ ID NO：86を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：91を含むVLドメイン；
(l) SEQ ID NO：87を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：92を含むVLドメイン；ならびに／または
(m) SEQ ID NO：88を含むVHドメインおよびSEQ ID NO：93を含むVLドメイン
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ10記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
14. パラグラフ10～13のいずれかに記載のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする、核酸分子。
15. パラグラフ14記載のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子を含む、発現カセット。
16. パラグラフ14またはパラグラフ15記載のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子のうちの少なくとも1つを含む、細胞。
17. ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を作製する方法であって、ヒト因子Dに結合する該抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸分子の発現を可能とする条件下でパラグラフ16記載の細胞を培養する工程、および当該抗因子D抗体またはその抗原結合断片を単離する工程を含む、方法。
18. パラグラフ1～13のいずれかに記載のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、組成物。
19. パラグラフ1～13のいずれかに記載のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノアッセイにおいて使用するための基材。
20. (a) 少なくとも1つの容器と、(b) パラグラフ1～13のいずれかに記載のヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片とを含む、生体サンプル中の因子Dの存在を検出するためのキット。
D. イムノアッセイにおいて成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dを検出するためのキット
1. イムノアッセイにおいて、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）および／またはプロ因子D（SEQ ID NO：2）を特異的に検出または定量する少なくとも1つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含むキットであって、該少なくとも1つのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、
(i) ヒト成熟因子Dのアミノ末端を包含するエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片であって、該エピトープが、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかもしくはそれからなり、該抗体がヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、抗体またはその抗原結合断片；または
(ii) ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片であって、該エピトープが、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含むかもしくはそれからなり、該抗体が成熟因子D（SEQ ID NO：3）には結合しない、抗体またはその抗原結合断片
を含む、キット。
2. ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）およびヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）の両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその断片を更に含む、パラグラフ1記載のキット。
3. 少なくとも1つの容器を更に含む、パラグラフ1または2記載のキット。
4. ヒト成熟因子Dに特異的に結合するパラグラフ1サブパート(i)の抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、パラグラフ1～3のいずれかに記載のキット。
5. ヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合するパラグラフ1サブパート(ii)の抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、パラグラフ1～3のいずれかに記載のキット。
6. 前記イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）である、パラグラフ1～5のいずれかに記載のキット。
7. 前記パラグラフ1サブパート(i)の抗体またはその抗原結合断片が、コーティング抗体である、パラグラフ1～6のいずれかに記載のキット。
8. 前記パラグラフ1サブパート(i)の抗体またはその抗原結合断片が、検出抗体である、パラグラフ1～6のいずれかに記載のキット。
9. 前記パラグラフ1サブパート(ii)の抗体またはその抗原結合断片が、コーティング抗体である、パラグラフ1～6のいずれかに記載のキット。
10. 前記パラグラフ1サブパート(ii)の抗体またはその抗原結合断片が、検出抗体である、パラグラフ1～6のいずれかに記載のキット。
11. ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）およびヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）の両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片を更に含む、パラグラフ1～10のいずれかに記載のキット。
12. 前記抗因子D抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：85～88からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：89～93からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、パラグラフ11記載のキット。
E. 成熟因子Dを検出するためのアッセイ
1. 試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を判定する方法であって、
(a) インビトロイムノアッセイにおいて、試験サンプルを抗ヒト成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程；および
(b) 成熟因子Dに結合した該抗体またはその抗原結合断片の存在もしくは不存在または量を検出する工程であって、該結合の存在が該サンプル中の成熟因子Dの存在または量を示す、工程
を含み、
該抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）として示される成熟因子DのN末端領域におけるエピトープに結合する、方法。
2. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、パラグラフ1記載の方法。
3. 前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、基材上に固定化されている、パラグラフ1または2記載の方法。
4. 前記イムノアッセイがELISAアッセイである、パラグラフ1～3のいずれかに記載の方法。
5. 前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な部分で標識されており、工程(b)が、該検出可能な部分の存在または量を検出することを含む、パラグラフ1～4のいずれかに記載の方法。
6. 前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片がネイキッドであり（すなわち、標識されておらず）、成熟因子Dに結合した該抗体またはその抗原結合断片の存在または量が、該抗成熟因子D抗体に結合する標識された抗体を使用して検出される、パラグラフ1～4のいずれかに記載の方法。
7. 前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が基材上に固定化（すなわち、捕捉／コーティング）されており、前記結合した成熟因子Dが、因子Dの異なるエピトープに結合する第2の抗体を用いて検出される、パラグラフ1～4のいずれかに記載の方法。
8. 前記試験サンプルが、哺乳類対象から得られた生体サンプルであり、例えば、該生体サンプルが、血液、血清、血漿、尿、および脳脊髄液からなる群より選択される、パラグラフ1～7のいずれかに記載の方法。
9. 前記サンプルが、代替経路関連疾患を患っているかまたはそれを発症するリスクを有する哺乳類対象から得られる、パラグラフ1～8のいずれかに記載の方法。
10. 前記サンプルが、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害抗体による処置後の哺乳類対象から得られる、パラグラフ1～9のいずれかに記載の方法。
11. 前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～10のいずれかに記載の方法。
12. 前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、I、またはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列
Figure 0007634082000060
を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列
Figure 0007634082000061
を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、G、またはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、I、またはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列
Figure 0007634082000062
を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～11のいずれかに記載の方法。
13. 前記抗ヒト成熟因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、(b) SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2、(c) SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3、(d) SEQ ID NO：50を含むLC-CDR1、(e) SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、および(f) SEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～11のいずれかに記載の方法。
F. プロ因子Dを検出するためのアッセイ
1. 試験サンプル中のプロ因子Dの存在または量を判定する方法であって、
(a) インビトロイムノアッセイにおいて、試験サンプルを抗ヒトプロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程；および
(b) プロ因子Dに結合した該抗体またはその抗原結合断片の存在または不存在または量を検出する工程であって、該結合の存在が該サンプル中のプロ因子Dの存在または量を示す、工程
を含み、
該抗ヒト成熟プロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）として示されるヒト因子Dの活性化（「プロ」）ペプチドにおけるエピトープに特異的に結合する、方法。
2. 前記抗体またはその抗原結合断片が、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に特異的に結合し、かつヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）には結合しない、パラグラフ1記載の方法。
3. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、基材上に固定化されている、パラグラフ1または2記載の方法。
4. 前記イムノアッセイがELISAアッセイである、パラグラフ1～3のいずれかに記載の方法。
5. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、検出可能な部分で標識されており、工程(b)が、該検出可能な部分の存在または量を検出することを含む、パラグラフ1～4のいずれかに記載の方法。
6. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片がネイキッドであり（すなわち、標識されておらず）、成熟因子Dに結合した該抗体またはその抗原結合断片の存在または量が、該抗プロ因子D抗体に結合する標識された抗体を使用して検出される、パラグラフ1～4のいずれかに記載の方法。
7. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、基材上に固定化（すなわち、捕捉／コーティング）されており、前記結合したプロ因子Dが、因子Dの異なるエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片を用いて検出される、パラグラフ1～4のいずれかに記載の方法。
8. 前記試験サンプルが、哺乳類対象から得られた生体サンプルであり、例えば、該生体サンプルが、血液、血清、血漿、尿、および脳脊髄液からなる群より選択される、パラグラフ1～7のいずれかに記載の方法。
9. 前記サンプルが、代替経路関連疾患を患っているかまたはそれを発症するリスクを有する哺乳類対象から得られる、パラグラフ1～8のいずれかに記載の方法。
10. 前記サンプルが、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害抗体による処置後の哺乳類対象から得られる、パラグラフ1～9のいずれかに記載の方法。
11. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～10のいずれかに記載の方法。
12. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～139からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：142～145からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～11のいずれかに記載の方法。
13. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：140およびSEQ ID NO：141からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR-1、HC-CDR-2、およびHC-CDR-3を含みかつSEQ ID NO：146およびSEQ ID NO：147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR-1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～11のいずれかに記載の方法。
14. 前記抗ヒトプロ因子D特異的抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) SEQ ID NO：167を含むCDR-H1、(b) SEQ ID NO：169またはSEQ ID NO：173を含むCDR-H2、(c) SEQ ID NO：171またはSEQ ID NO：174を含むCDR-H3、(d) SEQ ID NO：194を含むCDR-L1、(e) SEQ ID NO：196またはSEQ ID NO：199を含むCDR-L2、および(f) SEQ ID NO：198またはSEQ ID NO：200を含むCDR-L3
を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1～11のいずれかに記載の方法。
G. 試験サンプルにおける代替経路活性化の程度を評価する方法
1. 試験サンプルにおける代替経路補体（APC）の活性化の程度を評価する方法であって、
(a) 試験サンプルを提供する工程；
(b) 以下のうちの少なくとも1つを含むイムノアッセイを実施する工程：
(i) 該試験サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出することであって、成熟因子Dが、成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しないモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片で捕捉もしくは検出される、成熟因子Dを捕捉および検出すること；ならびに／または
(ii) 該試験サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することであって、プロ因子Dが、プロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しないモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片で捕捉もしくは検出される、プロ因子Dを捕捉および検出すること；ならびに
(c) (b)(i)に従って検出された成熟因子Dのレベルを所定のレベルもしくは対照サンプルと比較するおよび／または(b)(ii)に従って検出されたプロ因子Dのレベルを所定のレベルもしくは対照サンプルと比較する工程であって、該試験サンプル中の検出された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルが、代替経路補体活性化の程度を示す、工程
を含む、方法。
2. 工程(b)(i)が、成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で成熟因子Dを捕捉すること、ならびにヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、パラグラフ1記載の方法。
3. 工程(b)(i)が、ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片で成熟因子Dを捕捉すること、ならびに成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、パラグラフ1記載の方法。
4. 工程(b)(ii)が、プロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合断片でプロ因子Dを捕捉すること、ならびにヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、パラグラフ1記載の方法。
5. 工程(b)(ii)が、ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片でプロ因子Dを捕捉すること、ならびにプロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しないモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、パラグラフ1記載の方法。
6. 成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：12～17からなる群より選択される重鎖可変領域におけるHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：18～23からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、パラグラフ1記載の方法。
7. プロ因子Dに存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）におけるエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dには結合しない前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：136～141からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：142～147からなる群より選択される軽鎖可変領域におけるLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインを含み、該CDRが、Kabat付番システムに従って付番される、パラグラフ1記載の方法。
8. 前記試験サンプルが、哺乳類対象から得られた生体サンプルである、パラグラフ1～7のいずれかに記載の方法。
9. 前記生体サンプルが、全血、血清、血漿、尿、または脳脊髄液を含む、パラグラフ8記載の方法。
10. 前記試験サンプルが、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片）を含む、パラグラフ1～9のいずれかに記載の方法。
11. 前記哺乳類対象が、補体阻害剤、例えば代替補体経路阻害剤、例えばプロ因子D成熟阻害剤、例えばMASP-3阻害剤（例えば、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片）で処置されたことがある、パラグラフ8記載の方法。
12. 前記哺乳類対象がヒト対象である、パラグラフ8記載の方法。
13. 前記ヒト対象が、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有するか、またはそれを有する疑いがある、パラグラフ12記載の方法。
14. 前記代替経路疾患または障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される、パラグラフ13記載の方法。
15. 前記対照サンプルが、MASP-3阻害剤による処置前に対象から採取されたサンプル、またはMASP-3阻害剤による処置の過程におけるより早い時点で採取されたサンプルである、パラグラフ11～14のいずれかに記載の方法。
16. 前記MASP-3阻害剤が、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片である、パラグラフ11～15のいずれかに記載の方法。
17. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、MASP-3に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、かつ
(i) SEQ ID NO：220、222、223、225、226、および228からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：221、224、および227からなる群より選択される軽鎖可変領域のLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインであって、該CDRがKabat付番システムに従って付番される、結合ドメイン；
(ii) SEQ ID NO：229（TDDIN）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000063
を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：236（LEDTY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000064
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：242（KQSYNLYT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；
(iii) SEQ ID NO：230（SYGMS）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000065
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：237（GGEAMDY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000066
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：241（LVSKLDS）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：243（WQGTHFPWT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
(iv) SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000067
もしくは
Figure 0007634082000068
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ16記載の方法。
H. MASP-3阻害剤による処置の有効性をモニタリングする方法
1. 哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体による処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
(a) 第1の時点において、ある用量のMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を哺乳類対象に投与する工程；
(b) 工程(a)の後に該対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第1の濃度を評価する工程；
(c) 第2の時点において、該対象を該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片で処置する工程；
(d) 工程(c)の後に該対象から得られた生体サンプルにおける成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dの第2の濃度を評価する工程；ならびに
(e) 工程(b)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルを、工程(d)で評価された成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルと比較して、該哺乳類対象における該MASP-3阻害抗体の有効性を判定する工程
を含む、方法。
2. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の用量を調整する工程を更に含む、パラグラフ1記載の方法。
3. 前記成熟因子Dのレベルが対照または参照標準よりも高い場合に、前記対象に投与される前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の用量を増加させる、パラグラフ2記載の方法。
4. 前記プロ因子Dのレベルが対照または参照標準よりも低い場合に、前記対象に投与される前記MASP-3阻害抗体または抗原結合断片の用量を増加させる、パラグラフ2記載の方法。
5. 増加させた用量の前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を前記対象に投与する場合、工程(b)～(e)を繰り返して、該増加させた用量が、成熟因子Dおよび／またはプロ因子Dのレベルをそれぞれの対照または参照標準と比較して所望のレベルに調整するのに十分であるかどうかを判定する、パラグラフ3または4記載の方法。
6. 工程(b)および(d)が、前記生体サンプルにおける成熟因子Dの濃度をイムノアッセイで評価することを含む、パラグラフ1～5のいずれかに記載の方法。
7. 前記イムノアッセイが、(i) ヒト成熟因子DのN末端領域におけるアミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒトプロ因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記生体サンプル中に存在し得るプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）ではなく成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、パラグラフ6記載の方法。
8. 工程(b)および(d)が、前記生体サンプルにおけるプロ因子Dの濃度をイムノアッセイで評価することを含む、パラグラフ1～5のいずれかに記載の方法。
9. 前記イムノアッセイが、(i) ヒト因子Dのプロペプチドにおけるアミノ酸APPRGR（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒト成熟因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記生体サンプル中に存在し得る成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）ではなくプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、パラグラフ8記載の方法。
10. 前記哺乳類対象がヒト対象である、パラグラフ1～9のいずれかに記載の方法。
11. 前記ヒト対象が、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する、パラグラフ10記載の方法。
12. 前記代替経路疾患または障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される、パラグラフ11記載の方法。
13. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、パラグラフ1～12のいずれかに記載の方法。
14. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、MASP-3に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、かつ
(i) SEQ ID NO：220、222、223、225、226、および228からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：221、224、および227からなる群より選択される軽鎖可変領域のLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインであって、該CDRがKabat付番システムに従って付番される、結合ドメイン；
(ii) SEQ ID NO：229（TDDIN）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000069
を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：236（LEDTY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000070
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：242（KQSYNLYT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；
(iii) SEQ ID NO：230（SYGMS）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000071
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：237（GGEAMDY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000072
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：241（LVSKLDS）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：243（WQGTHFPWT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
(iv) SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000073
もしくは
Figure 0007634082000074
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ13記載の方法。
I. 代替経路疾患もしくは障害を患っているかまたはそれを発症するリスクを有する哺乳類対象を処置する方法
1. 代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する哺乳類対象を処置する方法であって、該対象が、
(i) 該対象から採取された1つもしくは複数のサンプル中のプロ因子Dのレベルが、所定のプロ因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照サンプル中のプロ因子Dレベルと比較して低いかまたは減少している；および／あるいは
(ii) 該対象から採取された1つもしくは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルが、所定の成熟因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照サンプル中の成熟因子Dレベルと比較して高いかまたは増加している
と判定された場合に、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を該対象に投与する工程を含む、方法。
2. 前記対象から採取された1つまたは複数のサンプル中のプロ因子Dのレベルが、プロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用を含むイムノアッセイを実施することによって判定される、パラグラフ1記載の方法。
3. 前記イムノアッセイが、(i) ヒト因子Dのプロペプチドにおけるアミノ酸APPRGR（SEQ ID NO：4）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒト成熟因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記サンプル中に存在し得る成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）ではなくプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、パラグラフ2記載の方法。
4. 前記対象から採取された1つまたは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルが、成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用を含むイムノアッセイを実施することによって判定される、パラグラフ1記載の方法。
5. 前記イムノアッセイが、(i) ヒト成熟因子DのN末端領域におけるアミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒトプロ因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記サンプル中に存在し得るプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）ではなく成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、パラグラフ4記載の方法
6. 前記哺乳類対象がヒト対象である、パラグラフ1～5のいずれかに記載の方法。
7. 前記哺乳類対象が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する、パラグラフ1～6のいずれかに記載の方法。
8. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、パラグラフ1～7のいずれかに記載の方法。
9. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、MASP-3に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、かつ
(i) SEQ ID NO：220、222、223、225、226、および228からなる群より選択される重鎖可変領域のHC-CDR1、HC-CDR2、およびHC-CDR3を含みかつSEQ ID NO：221、224、および227からなる群より選択される軽鎖可変領域のLC-CDR1、LC-CDR2、およびLC-CDR3を含む結合ドメインであって、該CDRがKabat付番システムに従って付番される、結合ドメイン；
(ii) SEQ ID NO：229（TDDIN）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000075
を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：236（LEDTY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000076
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：242（KQSYNLYT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；
(iii) SEQ ID NO：230（SYGMS）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000077
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：237（GGEAMDY）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域、ならびに
Figure 0007634082000078
を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：241（LVSKLDS）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：243（WQGTHFPWT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域；または
(iv) SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000079
もしくは
Figure 0007634082000080
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域
のうちの少なくとも1つを含む、パラグラフ8記載の方法。
J. 薬学的組成物および製造物品
1. pHが6.0±5％であるバッファ系、20±5％mM ヒスチジン、100±5％mg/mL スクロース、および0.035％±5％ ポリソルベート80を含む水溶液中にMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を含む薬学的組成物であって、該MASP-3阻害抗体が110mg/mL±5％の濃度で含まれ、該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1、
Figure 0007634082000081
もしくは
Figure 0007634082000082
を含むHC-CDR2、およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域；ならびにSEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、薬学的組成物。
2. 無菌である、パラグラフ1記載の薬学的組成物。
3. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：226またはSEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％同一を含む軽鎖可変領域とを含む、パラグラフ1または2記載の薬学的組成物。
4. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、およびそれらのうちのいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される、パラグラフ1～3のいずれかに記載の薬学的組成物。
5. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、一本鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、ヒンジ領域を欠く一価抗体、および全長抗体からなる群より選択される、パラグラフ1～3のいずれかに記載の薬学的組成物。
6. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、免疫グロブリン定常領域を更に含む、パラグラフ1～3のいずれかに記載の薬学的組成物。
7. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、ヒトIgG4定常領域を含む、パラグラフ6記載の薬学的組成物。
8. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、S228P変異を有するヒトIgG4定常領域を含む、パラグラフ7記載の薬学的組成物。
9. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、低pHでのFcRn相互作用を促進する変異を含む、パラグラフ7または8記載の薬学的組成物。
10. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、SEQ ID NO：245として示されるヒトIgG4定常領域を含む、パラグラフ7～9のいずれかに記載の薬学的組成物。
11. パラグラフ1～10のいずれかに記載の薬学的組成物を含有する、製造物品。
12. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が、ヒト対象への処置的投与に好適な10mg～1000mgの単位剤形である、パラグラフ11記載の製造物品。
13. 容器と、該容器上または該容器に付随するラベルまたは添付文書とを含む、パラグラフ10または11記載の製造物品。
14. 前記容器が、ボトル、アンプル、パウチ（例えば、静脈内注入バッグ）、バイアル、シリンジ、およびカートリッジからなる群より選択される、パラグラフ13記載の製造物品。
15. 代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する対象の処置において使用するための、パラグラフ1～10のいずれかに記載の薬学的組成物またはパラグラフ11～14のいずれかに記載の製造物品。
16. 前記代替経路疾患または障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される、パラグラフ15記載の薬学的組成物または製造物品。
以下の実施例は、単に、本発明を実施するために現在企図される最良の形態を例示するものであって、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１
この実施例は、ヒト成熟因子Dに特異的に結合するモノクローナル抗体の作製を説明する。
背景：
この実施例は、APC状態のバイオマーカーとして使用するための生体サンプル中の成熟因子Dの存在および／または量を測定するアッセイにおいて使用するための検出試薬としての使用に適した抗ヒト成熟因子D特異的抗体の作製を説明する。この実施例に記載される抗体は、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）に結合しない。
方法：
1. 合成成熟因子Dペプチド抗原の発現
ヒト完全長因子D（SEQ ID NO：1）、ヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）およびヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）のアミノ酸配列を図2に示す。図2に示しているように、ヒトプロ因子Dのプロペプチドは、「APPRGR」（SEQ ID NO：4）である。図3は、ホモサピエンス（SEQ ID NO：1）；マカク属（SEQ ID NO：8）；イヌ属（SEQ ID NO：9）；クマネズミ属（SEQ ID NO：10）；およびハツカネズミ属（SEQ ID NO：11）を含む様々な種由来の補体因子D（完全長）のアミノ酸配列のアライメントを提供する。各配列のイタリックの部分は、シグナル配列を描写しており、下線を引いた部分は、活性化「プロ」ペプチド配列を描写している。図2および3に示しているように、因子Dタンパク質は、活性化ペプチド（プロペプチド、下線を引いた）を含む。プロペプチドが切断されたら、成熟因子Dは、各種において、プロ因子Dと比較して固有のアミノ末端（例えば、ヒト完全長因子D（SEQ ID NO：1）の残基26から始まるN末端を有する）を有する。
抗ヒト成熟因子D特異的抗体を作製するために、ヒト補体因子Dのアミノ酸残基26～32「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）に対応する合成ペプチドを次のように作製した。スペーサーアミノ酸配列によってPADRE配列から離隔された「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）をコードする核酸配列、スペーサーアミノ酸配列およびC末端システイン（Sulfo-SMCC連結化学によるKLHへのコンジュゲーションが可能になる）を挿入することにより、合成成熟因子Dペプチド-KLHコンジュゲート構築物を作製した：
Figure 0007634082000083
2. 成熟因子D抗原による免疫化
上記の合成成熟因子Dペプチド-KLHコンジュゲート（SEQ ID NO：6）でC57BL6マウスを免疫化した。ペプチドコンジュゲートのアジュバントエマルジョン50μL（注射1回当たり総タンパク質50～100μg）で皮下によりマウスを3回免疫化した。
免疫したマウスからの血清サンプルを眼窩後洞放血から調製し、ELISAにより、プレートに固定化された組換えヒトプロ因子D（hPro-CFD）（SEQ ID NO：2）および組換えヒト成熟因子D（hCFD）（SEQ ID NO：3）に結合可能な抗原特異的抗体の存在について次のように試験した：
組換えヒトプロCFD-Hisまたは組換えヒト成熟CFD-Hisを、Maxisorp（商標）ELISAプレート上に、PBS中1μg／mL、100μL／ウェルで固定化し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートウェルを、0.05％ Tween 20を含有するPBS（PBST）300μLで3回洗浄し、1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有するPBS 250μLにより室温で1時間ブロッキングし、再度洗浄した。各マウスからの血清をPBST中で希釈し、室温で1時間結合させ、次いで、PBST中で3回洗浄した。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギ抗マウスIgG Fc抗体（Jackson ImmunoResearch）をアプライし（100μL／ウェル）、室温で1時間結合させ、次いで、PBSTで3回洗浄した。次いで、TMB基質（ThermoFischer）（100μL／ウェル）をアプライし、室温で5分間インキュベートした。次いで、1N H2SO4（50μL／ウェル）で反応を停止した。Biotek（商標）ELISAプレートリーダーを用いて450nMでの光学密度についてプレートを読み取った。
結果：
図4は、ヒト補体因子Dのアミノ酸残基26～32「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）に対応する合成ペプチドで免疫化した後の代表マウス#2の血清の、組換え成熟因子Dまたは組換えプロ因子Dの存在下での力価測定をグラフで示す。図4に示しているように、代表マウス#2からの血清は、プロ因子Dと比べて、成熟因子Dに選択的に結合可能な抗体を含有する。
成熟因子Dに最も好ましい結合およびプロ因子Dに最も好ましくない結合を示すマウス（すなわち、マウス#2）をハイブリドーマ融合のために選択した。融合の3日前に、PBS中50μgの抗CD40アゴニストmAb（R&D Systems, Minneapolis, MN）でマウスを皮下処置して、B細胞数を増加させた（Rycyzyn et al., Hybridoma 27:25-30, 2008を参照のこと）。マウスを屠殺し、脾臓細胞を収集し、そして、50％ポリエチレングリコールまたは50％ポリエチレングリコール＋10％ DMSOを使用して、選択したマウス骨髄腫細胞株P3/NSI/1-AG4-1（NS-1）（ATCC No. TIB18）に融合させた。融合物は、ハイブリドーマ細胞を生成し、これを、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地を含有する96ウェルのNunc組織培養処理プレートにプレーティングして、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾臓ハイブリッドの増殖を抑制した。培地の80％と置き換えることでHATサプリメントを含有する新鮮培地をハイブリドーマウェルに供給した。ハイブリドーマ選択の後、後述するように組換えヒト成熟因子Dへの結合について培養上清をアッセイした。
3. ハイブリドーマスクリーニング
最初に、ハイブリドーマ上清を、固定化された組換えヒト成熟因子D-Hisへの結合についてスクリーニングした。10個のハイブリドーマを特定し（n=10）、次いで、これを、ポリクローナルヤギ抗ヒト因子D抗体AF1824（R&D Systems）によって捕捉された場合の組換えヒト成熟因子Dまたは組換えヒトプロ因子Dの検出能力について次のように試験した。ELISAプレートを、ポリクローナル抗ヒト因子D抗体AF1824（R&D Systems）でコーティングした。ハイブリドーマ上清を、PBS、0.05％ Tween 20（PBST）中で2倍希釈した。アッセイバックグラウンドのレベルを決定するためのマトリックス対照としてNS-1骨髄腫細胞株からの上清（NS-1 sup）を含めた。
図5は、ポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）によって捕捉された場合のヒト成熟因子Dまたはヒトプロ因子Dへの結合についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした捕捉ELISAアッセイの結果をグラフで示す。図5に示しているように、試験した10個のハイブリドーマのうち、8個のハイブリドーマ（6G6、14A11、10G1、27G8、21D6、27B3、49G3、58F5）からの上清は、組換えヒトプロ因子Dと比較して組換えヒト成熟因子Dへの優先的結合を示した。ハイブリドーマ6G6、14A11、10G1、27B3、49G3および58GF5を、DNAクローニングおよび組換え抗体産生のために選択した。
ハイブリドーマ上清の特異性
ハイブリドーマ14A11および6G6の上清の特異性を、ヒト血清または血漿マトリックス中の捕捉されたまたは内因性のタンパク質の検出を次のように測定することによってさらに分析した。ELISAプレートを、4℃で一晩、ポリクローナルヤギ抗ヒトCFD AF1824（R&D Systems）でコーティングした。プレートウェルを洗浄し、ブロッキングし、再度洗浄した。正常ヒト血清プール、正常ヒト血漿プールまたは因子D枯渇ヒト血清を、2μg/mLの組換えプロ因子D（プロCFD）または成熟因子D（成熟CFD）を添加していないまたは添加したアッセイバッファー（1％ BSAおよび0.05％ Tween 20を含むPBS、PBST-BSA）中で10倍希釈した。組換えタンパク質が添加されたまたは添加されなかったバッファー対照を含むこれらのマトリックスを室温で60分間インキュベートし、次いで、洗浄した。抗ヒト因子D検出抗体を次のように希釈した後、プレートにアプライした：6G6および14A11ハイブリドーマ上清のサブクローンをPBST-BSAで半分に希釈した。精製したmAb1824マウスモノクローナル抗体をPBST-BSAバッファー中0.5μg/mLに希釈した。検出抗体を、室温で1時間インキュベートして洗浄し、次いで、マウスIgG Fcに対するホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識ヤギポリクローナル（Jackson ImmunoResearch）で発色させた。
結果：
結果を図6A～Cに示す。以下のサンプル#1～#8を図6A～Cのそれぞれに示す：
#1：因子D枯渇血清対照
#2：組換えヒト成熟CFDを添加した因子D枯渇血清
#3：組換えヒトプロCFDを添加した因子D枯渇血清
#4：正常ヒト血清対照
#5：正常ヒト血漿対照
#6：バッファー対照
#7：組換えヒト成熟CFDを添加したバッファー
#8：組換えヒトプロCFDを添加したバッファー
図6Aは、コーティングポリクローナルヤギ抗ヒトCFD 1824を用いて、各条件で存在するハイブリドーマ上清14A11により検出されたELISAアッセイでの上記サンプル#1～#8の結果をグラフで示す。図6Aに示しているように、ハイブリドーマ上清14A11は、組換え成熟補体因子Dを選択的に検出可能であり、組換えプロ因子Dを検出しない。Df-Dpl血清に組換え成熟CFDを添加した場合（#2）に得られたシグナルは、10％正常ヒト血清（#4）または正常ヒト血漿（#5）を加えた場合に得られたシグナルと同等であり、そのどちらも、正常レベルの成熟因子Dを含有するはずであることが留意される。
図6Bは、コーティングポリクローナルヤギ抗ヒトCFD 1824を用いて、各条件で存在するハイブリドーマ上清6G6により検出されたELISAアッセイでの上記サンプル#1～#8の結果をグラフで示す。図6Bに示しているように、ハイブリドーマ上清6G6は、組換え成熟補体因子Dを選択的に検出可能であり、組換えプロ因子Dを検出しない。Df-Dpl血清に組換え成熟CFDを添加した場合（#2）に得られたシグナルは、10％正常ヒト血清（#4）または正常ヒト血漿（#5）を加えた場合に得られたシグナルと同等であり、そのどちらも、正常レベルの成熟CFDを含有するはずであることが留意される。
図6Cは、コーティングポリクローナルヤギ抗ヒトCFD 1824を用いて、各条件で存在するmAb 1824により検出されたELISAアッセイでの上記サンプル#1～#8の結果をグラフで示す。図6Cに示しているように、モノクローナル抗体MAB1824（R&D Systems）は、組換え成熟CFDと組換え活性CFDの両方を検出し、それゆえ、プロCFDと比べて、成熟CFDを選択的に検出できない。
因子Dの成熟バージョンへの優先的結合を示すこれらの上清（すなわち、6G6、14A11、10G1、27B3、49G3および58GF5）を増大させ、限界希釈法によってモノクローナルまでクローン化した。
実施例２
この実施例は、抗ヒト成熟因子D特異的モノクローナル抗体のクローニングおよび配列解析を説明する。
背景／論理的根拠：
この実施例は、実施例1に記載するように作製された因子Dの成熟バージョンへの優先的結合を示すハイブリドーマ（すなわち、クローン6G6、14A11、10G1、27B3、49G3および58F5）によって産生された抗体のクローニングおよび配列解析を説明する。
方法：
組換え抗体のクローニングおよび精製：
陽性ハイブリドーマ6G6、14A11、10G1、27B3、49G3、58F5を実施例1に記載するように作製および特定した。これらのハイブリドーマを段階希釈法によってサブクローニングした。重鎖および軽鎖可変領域を、RT-PCRを使用して実施例1に記載するハイブリドーマからクローニングし、配列決定した。抗体をコードする配列を、トータルRNAから、SMARTer（商標）RACE 5'/3'キット（Takara Bio）を使用してアイソタイプ特異的リバースプライマーにより増幅させた。配列を検証した後、設計したクローニングプライマーにより可変（V）領域を再増幅させ、In-Fusion HD（商標）クローニングキット（Clontech）を使用してヒトIgG4重鎖（SEQ ID NO：71）およびカッパ軽鎖（SEQ ID NO：72）定常領域またはマウスIgG2a（SEQ ID NO：218）およびカッパ軽鎖（SEQ ID NO：219）定常領域のいずれかを担持する発現ベクターにクローニングした。発現構築物をExpi293細胞（Life Technologies）に一過性に共トランスフェクトし、5日間の培養の後、分泌された組換え抗体をプロテインAクロマトグラフィーによって上清から精製した。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列をそれぞれ図7Aおよび7Bに示し（図7Aおよび図7B中の「SIN」＝「SEQ ID NO：」）、これらを以下に記載する。それぞれの相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）を下記表7～10に提供する。
抗ヒト成熟因子D特異的抗体の重鎖可変領域（VH）配列
図7Aは、抗ヒト成熟因子D特異的クローンについての重鎖可変領域（VH）配列のアミノ酸アライメントを示す：6G6_VH（SEQ ID NO：12）、14A11_VH（SEQ ID NO：13）、27B3_VH（SEQ ID NO：14）、58F5_VH（SEQ ID NO：15）、49G3_VH（SEQ ID NO：16）、および10G1_VH（SEQ ID NO：17）。
各抗ヒト成熟因子D特異的抗体についての重鎖可変領域（VH）配列を以下に提示する。Kabat CDRに下線を引いている。
Figure 0007634082000084
（表７）抗ヒト成熟因子D特異的抗体のVH配列（CDRおよびFR領域、Kabat）
Figure 0007634082000085
Figure 0007634082000086
抗ヒト成熟因子D特異的抗体の軽鎖可変領域（VL）配列
図7Bは、抗ヒト成熟因子D特異的クローンについての軽鎖可変領域（VL）配列のアミノ酸アライメントを示す：6G6_VK（SEQ ID NO：18）、14A11_VK：（SEQ ID NO：19）、27B3_VK：（SEQ ID NO：20）、58F5_VK：（SEQ ID NO：21）、49G3_VK：（SEQ ID NO：22）、10G1_VK：（SEQ ID NO：23）。
各抗ヒト成熟因子D特異的抗体についての軽鎖可変領域（VL）配列を以下に提示する。Kabat CDRに下線を引いている。これらの領域は、Kabatシステムによって付番してもChothiaシステムによって付番しても同じである。
Figure 0007634082000087
（表８）抗ヒト成熟因子D特異的抗体のVL配列（CDRおよびFR領域、KabatおよびChothia）
Figure 0007634082000088
Figure 0007634082000089
（表９）抗ヒト成熟因子D特異的HC CDRについてのコンセンサス配列：
Figure 0007634082000090
（表１０）成熟因子D特異的LC CDRについてのコンセンサス配列：
Figure 0007634082000091
Figure 0007634082000092
マウス抗ヒト成熟因子D特異的抗体mAb重鎖および軽鎖をコードするDNA
Figure 0007634082000093
Figure 0007634082000094
Figure 0007634082000095
Figure 0007634082000096
Figure 0007634082000097
実施例３
この実施例は、いくつかのインビトロアッセイでの組換え精製抗ヒト成熟因子D特異的抗体の機能的特性評価を説明する。
背景／論理的根拠：
この実施例は、実施例1および2に記載するように作製された組換え抗ヒト成熟因子D特異的モノクローナル抗体のヒト成熟因子Dへの結合およびヒトプロ因子Dへの結合についての機能的特性評価を説明する。
方法：
サンドイッチELISAアッセイ
実施例1および2に記載するように作製された精製組換え抗ヒト成熟因子D特異的抗体6G6、14A11、10G1、49G3、27B3および58F5（ヒトIgG4 Fc）を、検出抗体としてサンドイッチELISAフォーマットにおいて試験した。「プロ」と称される組換えヒトプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）、および「成熟」と称される組換えヒト成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）を、プレート結合ヤギ抗ヒトCFDポリクローナルAF1824（R&D systems）によって捕捉した。洗浄したプレートに精製組換え抗体6G6、14A11、10G1、49G3、27B3および58F5ならびに対照ヒトIgG4を加え、インキュベートした。HRPタグ化抗マウス二次抗体、続いてTMB基質を使用してアッセイを発色させた。
結果：
図8は、多数の候補抗ヒト成熟因子D特異的抗体を用いた組換えヒトプロ因子Dまたは成熟因子Dの検出をグラフで示す。図8に示しているように、試験した精製抗体、すなわち6G6、14A11、10G1、49G3、27B3および58F5はすべて、ELISAアッセイフォーマットにおいて、プロ因子Dと比較して因子Dの成熟型に特異的であることが判明した。
親和性アッセイ
候補抗体のヒト成熟因子D対ヒトプロ因子Dへの親和性を次のように判定した。
結合定数および解離定数をOctet Fortebioによって判定した。20nMの組換えヒトIgG4候補抗体6G6、14A11、10G1、49G3、27B3および58F5を抗ヒトセンサー上に装填し、組換えヒト成熟因子D（111nM）または組換えヒトプロ因子D（111nM）と5分間にわたって結合および解離させた。結果を下記表11に示す。
（表１１）候補抗体のヒト成熟因子D対ヒトプロ因子Dへの親和性
Figure 0007634082000098
NC＝計測ソフトウェアで算出不可
この実施例に記載される結果に基づき、成熟ヒト因子D対ヒトプロ因子Dに対する優れた感受性および特異性により抗体6G6および14A11をさらなる分析および開発に選択した。
結論：
実施例1～3に記載するように、本発明者らは、成熟因子Dに特異的に結合しかつプロ因子Dに結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体を作製した。実施例10～12にさらに記載するように、成熟因子Dのレベルは、代替経路活性と相関し、それゆえ、成熟因子D特異的モノクローナル抗体は、哺乳類対象における代替経路活性化のレベルを評価するための診断アッセイの代用エンドポイントとして成熟因子Dのレベルを測定するために使用してよい。本明細書の実施例12にさらに記載するように、成熟因子D特異的モノクローナル抗体は、MASP-3阻害剤で処置された対象におけるMASP-3阻害の薬力学（PD）測定として使用してよく、これを、MASP-3阻害剤の有効な投薬を決定するために使用してよい。
実施例４：
この実施例は、成熟ヒト因子Dに対して産生され、成熟因子Dとプロ因子Dの両タンパク質を検出する能力について選択されたモノクローナル抗体（すなわち、成熟因子Dとプロ因子Dの両タンパク質に共通する因子Dのエピトープに結合する抗体）の作製を説明する。
背景／論理的根拠：
この実施例は、ヒト因子Dのプロ型と成熟型の両方に結合可能な抗ヒト因子D抗体の作製を説明する。この実施例に記載される抗体は、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合し、生体サンプル中の因子Dの状態を評価するためにELISAアッセイにおいてコーティング抗体として有用である。
方法：
成熟因子D抗原による免疫化
組換えヒト成熟因子D-Hisタグ化タンパク質でC57BL/6のMASP-1/3ノックアウトマウスを免疫化した。タンパク質のアジュバントエマルジョン50μL（注射1回当たり総タンパク質50～100μg）で皮下によりマウスを2回免疫化した。免疫したマウスからの血清サンプルを尾部放血から調製し、ELISAにより、共にstrepでタグ化されているプレートに固定化された組換えヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）および組換えヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に結合可能な抗原特異的抗体の存在について次のように試験した。
Strepタグ化組換えヒトプロCFDまたはStrepタグ化組換えヒト成熟CFDを、Maxisorp（商標）ELISAプレート上に、PBS中1μg/mL、100μL/ウェルで、4℃で一晩固定化した。プレートウェルを、0.05％ Tween 20を含有するPBS（PBST）300μLで3回洗浄し、1％ BSAを含有するPBS 250μLにより室温で1時間ブロッキングし、再度洗浄した。代表マウス#1189からの血清をPBST中で希釈し、室温で1時間結合させ、次いで、PBST中で3回洗浄した。次いで、HRP標識ヤギ抗マウスIgG Fc抗体をアプライし（100μL/ウェル）、室温で1時間結合させ、次いで、PBSTで3回洗浄した。次いで、TMB基質（ThermoFisher）（100μL/ウェル）をアプライし、室温で5分間インキュベートした。次いで、1N H2SO4（50μL/ウェル）で反応を停止した。Biotek（商標）ELISAプレートリーダーを用いて450nMでの光学密度についてプレートを読み取った。代表マウス（マウス#1189）からの血清の結果を図9に示す。
結果：
図9は、ヒト成熟因子Dで免疫化した後の代表マウス#1189の血清の、組換え成熟因子Dまたは組換えプロ因子Dの存在下での力価測定をグラフで示す。図9に示しているように、代表マウス#1189からの血清は、成熟因子Dとプロ因子Dの両方に結合可能な抗体を含有する。これらの結果に基づき、マウス#1189をハイブリドーマ融合のために選択し、ハイブリドーマ融合を次のように行った。
ハイブリドーマ融合の4日前に、50μL中総タンパク質50μgの最終注射をマウス#1189に皮下送達した。融合の3日前に、PBS中50μgの抗CD40アゴニスト抗体（R&D Systems, Minneapolis, MN）でマウス#1189を皮下処置して、B細胞数を増加させた（Rycyzyn et al., Hybridoma 27:25-30, 2008を参照のこと）。マウスを屠殺し、脾臓細胞を収集し、そして、50％ポリエチレングリコールまたは50％ポリエチレングリコール＋10％ DMSOを使用して、選択したマウス骨髄腫細胞株P3/NSI/1-AG4-1（NS-1）（ATCC No. TIB18）に融合させた。融合物は、ハイブリドーマ細胞を生成し、これを、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地を含有する96ウェルのNunc組織培養処理プレートにプレーティングして、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾臓ハイブリッドの増殖を抑制した。培地の80％と置き換えることでHATサプリメントを含有する新鮮培地をハイブリドーマウェルに供給した。
ハイブリドーマ選択の後、組換えヒトプロ因子Dおよび成熟因子Dへの結合について次のように培養上清をアッセイした。
ハイブリドーマスクリーニング
最初に、ハイブリドーマ上清を、固定化された組換えヒト成熟因子D-ストレプトアビジンへの結合についてスクリーニングした。54個のハイブリドーマを特定し、次いで、ポリクローナルヤギ抗ヒト因子D抗体AF1824（R&D Systems）によって捕捉された場合の組換えヒトプロ因子D-Strepへの結合能力について次のように試験した。ハイブリドーマ上清を、PBS、0.05％ Tween 20（PBST）中で2倍希釈した。NS-1骨髄腫細胞株からの上清（NS-1 sup）を対照として含めた。ELISAプレートを、ポリクローナル抗ヒト因子D抗体AF1824でコーティングした。試験した54個のハイブリドーマのうち、5個のハイブリドーマ（3C5、30H2、11H1、12H10および7H2）からの上清は、組換えヒトプロ因子Dおよび組換えヒト成熟因子Dへの等価な結合親和性を示し、実施例5にさらに記載するようにDNAクローニングおよび組換え抗体産生のために選択した。
実施例５:
この実施例は、プロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合する抗ヒト因子D抗体のクローニングおよび配列解析を説明する。
背景／論理的根拠：
この実施例は、実施例4に記載するように作製された成熟因子Dとプロ因子Dの両タンパク質を検出する能力について選択されたハイブリドーマ（すなわち、成熟因子Dとプロ因子Dの両タンパク質に共通する因子Dのエピトープに結合するクローン3C5、30H2、11H1、12H10および7H2）によって産生された抗体のクローニングおよび配列解析を説明する。
方法：
組換え抗体のクローニングおよび精製：
実施例4に記載するように、ハイブリドーマクローン3C5、30H2、11H1、12H10および7H2を作製し、成熟因子Dとプロ因子Dの両タンパク質を検出する能力について選択した。これらのハイブリドーマを段階希釈法によってサブクローニングした。重鎖および軽鎖可変領域をRT-PCRを使用してクローニングし、配列決定した。抗体をコードする配列を、トータルRNAから、SMARTer（商標）RACE 5'/3'キット（Takara Bio）を使用してアイソタイプ特異的リバースプライマーにより増幅させた。配列を検証した後、設計したクローニングプライマーにより可変（V）領域を再増幅させ、In-Fusion HD（商標）クローニングキット（Clontech）を使用してヒトIgG4重鎖（SEQ ID NO：71）およびカッパ軽鎖（SEQ ID NO：72）定常領域またはマウスIgG2a（SEQ ID NO：218）およびカッパ軽鎖（SEQ ID NO：219）定常領域のいずれかを担持する発現ベクターにクローニングした。発現構築物をExpi293細胞（Life Technologies）に一過性に共トランスフェクトし、5日間の培養の後、分泌された組換え抗体をプロテインAクロマトグラフィーによって上清から精製した。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列をそれぞれ図10Aおよび10Bに示し（図10Aおよび図10B中の「SIN」＝「SEQ ID NO：」）、これらを以下に記載する。それぞれの相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）を下記表12～13に提供する。
抗ヒト因子D（C末端）抗体の重鎖可変領域
図10Aは、抗ヒト因子Dクローンについての重鎖可変領域（VH）配列のアミノ酸アライメントを示す：3C5_VH（SEQ ID NO：85）、30H2_VH（SEQ ID NO：85）、11H1_VH（SEQ ID NO：86）、12H10_VH（SEQ ID NO：87）、および7H2_VH（SEQ ID NO：88）。
各抗ヒト因子D抗体についての重鎖可変領域（VH）配列を以下に提示する。Kabat CDRに下線を引いている。
Figure 0007634082000099
（表１２）抗ヒト因子D（C末端）抗体のVH配列（CDRおよびFR領域、Kabat）
Figure 0007634082000100
抗ヒト因子D抗体の軽鎖可変領域：
図10Bは、抗ヒト因子Dクローンについての軽鎖可変領域（VL）配列のアミノ酸アライメントを示す：3C5_VL（SEQ ID NO：89）、30H2_VL（SEQ ID NO：90）、11H1_VL（SEQ ID NO：91）、12H10_VL（SEQ ID NO：92）および7H2_VL（SEQ ID NO：93）。
抗ヒト因子D抗体についての軽鎖可変領域（VL）配列を以下に提示する。Kabat CDRに下線を引いている。これらの領域は、Kabatシステムによって付番してもChothiaシステムによって付番しても同じである。
Figure 0007634082000101
（表１３）抗ヒト因子D（C末端）抗体のVL配列（CDRおよびFR領域、KabatおよびChothia）
Figure 0007634082000102
Figure 0007634082000103
マウス抗ヒト因子D抗体（プロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合する）重鎖および軽鎖をコードするDNA：
Figure 0007634082000104
Figure 0007634082000105
Figure 0007634082000106
Figure 0007634082000107
抗ヒト因子D抗体の結合価
組換え精製モノクローナル抗体IgG2a Fcクローン3C5、30H2、11H1、12H10および7H2を、結合アッセイにおいて、ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dに結合する能力について次のように分析した。
候補抗体を、3μg/mLから始めて、1μg/mLのプレートに固定化された組換えヒト成熟因子D-Hisまたは組換えヒトプロ因子D-Hisタンパク質への抗体結合について力価測定した。結合した抗体を、マウスIgG Fcに特異的な標識ヤギポリクローナル抗体（Jackson ImmunoResearch）によって検出した。代表抗体3C5および12H10の結果をそれぞれ図11Aおよび11Bに示す。
図11Aは、組換えヒトプロ因子Dまたは成熟因子Dと候補抗ヒト因子D抗体3C5との結合をグラフで示しており、抗体3C5がヒトプロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合することを実証している。
図11Bは、組換えヒトプロ因子Dまたは成熟因子Dと候補抗ヒト因子D抗体12H10との結合をグラフで示しており、抗体12H10がヒトプロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合することを実証している。
実施例６：
この実施例は、ヒトおよびカニクイザル血清中の成熟因子Dの存在および量を検出可能なELISAアッセイの開発を説明する。
背景／論理的根拠：
成熟ヒト因子Dと成熟カニクイザル因子Dの両方に存在する固有のN末端エピトープ「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）に対する精製組換え抗体を、本明細書の実施例1～3に記載するように作製した。本明細書の実施例4および5に記載するように、プロ因子Dと成熟因子Dの両方を検出する（すなわち、因子Dの成熟型とプロ型に共通するエピトープに結合する）能力について選択された成熟因子Dに対する精製組換え抗体も作製し、これはイムノアッセイでの使用に適すると判断された。この実施例は、ELISAアッセイにおいて代表的な抗ヒト成熟因子D特異的抗体14A11と組み合わせた、いくつかの代表的な抗因子D抗体（3C5、12H10および他）のコーティング抗体としての分析を説明する。
方法：
1. 抗ヒト成熟因子D特異的mAb 14A11による検出を用いたELISAアッセイにおいてコーティング抗体として使用するための抗ヒト因子D抗体3C5、11H1、12H10および30H2の使用試験
ヒトIgG4 Fc組換え精製抗因子D抗体（3C5、11H1、12H10および30H2）をELISAプレート上にコーティングし、組換えヒトおよびカニクイザル成熟およびプロ因子D（huMat CFD、cy Mat CFD、huProCFDおよびcyPro CFD）を捕捉させた。また、因子D枯渇ヒト血清（CFD Dpl血清）およびプールした正常カニクイザル血漿（NCP）のサンプルも捕捉した。捕捉された因子Dを、抗ヒト成熟因子D特異的mAb 14A11のマウスIgG2a Fcバージョンで検出した。HRP標識F(ab')2断片ロバ抗マウスIgG H&L抗体（Jackson ImmunoResearch）を使用して検出抗体のシグナルを増幅させ、続いて、TMB基質（ThermoFisher）で発色させた。
代表抗体3C5および12H10を用いたELISAアッセイの結果をそれぞれ図12Aおよび12Bに示す。
結果：
図12Aは、組換え抗因子D抗体3C5をELISAプレートにコーティングし、組換えヒトおよびカニクイザル成熟およびプロ因子D（huMat CFD、cy Mat CFD、huProCFDおよびcyPro CFD）を捕捉させたELISAアッセイの結果をグラフで示す。また、因子D枯渇ヒト血清（CFD Dpl血清）およびプールした正常カニクイザル血漿（NCP）のサンプルも捕捉した。捕捉された因子Dを、抗ヒト成熟因子D特異的mAb 14A11のマウスIgG2a Fcバージョンで検出した。
図12Bは、組換え抗因子D抗体12H10をELISAプレートにコーティングし、組換えヒトおよびカニクイザル成熟およびプロ因子D（huMat CFD、cy Mat CFD、huProCFDおよびcyPro CFD）を捕捉させたELISAアッセイの結果をグラフで示す。また、因子D枯渇ヒト血清（CFD Dpl血清）およびプールした正常カニクイザル血漿（NCP）のサンプルも捕捉した。捕捉因子Dを、抗ヒト成熟因子D特異的mAb 14A11のマウスIgG2a Fcバージョンで検出した。
図12Aおよび12Bに示しているように、抗因子D抗体3C5および12H10は共に、抗ヒト成熟因子D特異的抗体14A11との組み合わせで、ヒトおよびカニクイザル血漿中の成熟因子Dを検出するためのELISAアッセイにおいてコーティング抗体として使用に適する。
2. コーティング抗体3C5（抗ヒト／カニクイザル因子D）と検出抗体14A11（抗ヒト／カニクイザル成熟因子D特異的）の組み合わせを用いた成熟因子Dを検出するためのELISAアッセイ
方法：
ヒトIgG4 Fc組換え精製抗体3C5をELISAプレート上にコーティングし、以下のサンプル（3倍段階希釈物）を用いて試験した：
#1：カニクイザル組換え成熟因子D（cy Mat CFD、1μg/mL～1.4pg/mL）
#2：ヒト組換え成熟因子D（hu Mat CFD 1μg/mL～1.4pg/mL）
#3：カニクイザル組換えプロ因子D（cy Pro CFD 1μg/mL～1.4pg/mL）
#4：ヒト組換えプロ因子D（hu Pro CFD 1μg/mL～1.4pg/mL）
#5：精製（ヒト血漿から）ヒト因子D（CFD）（1μg/mL～1.4pg/mL）
#6：ヒト因子D枯渇血清（CFD-Dpl血清、50％～0.07％）
#7：正常ヒト血清（NHS、50％～0.07％）
#8：ヒト3MC患者からの血清（3MC、25％～0.03％）
捕捉された因子Dを、抗ヒト成熟因子D特異的mAb 14A11のマウスIgG2a Fcバージョンで検出した。HRP標識F(ab')2断片ロバ抗マウスIgG H&L抗体（Jackson ImmunoResearch）を使用して検出抗体のシグナルを増幅させ、続いて、TMB基質（ThermoFisher）で発色させた。
マイクロタイターELISAプレート（Maxisorb, Nunc）に、抗体クローン3C5を、コーティングバッファー（PBS：1.06mMのリン酸二水素カリウムKH2PO4、155mMの塩化ナトリウムNaCl、8.97mMのリン酸水素二ナトリウムNa2HPO4-7H20、pH7.4）（ThermoFisher）を使用して3μg/mLの濃度でコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートした。翌日、0.05％およびTween20を含むPBSバッファー（PBST）でプレートを3回洗浄した。プレートの各ウェルに1％のPBST中ウシ血清アルブミン（BSA）（PBST-BSA）250μLを加えることによって、残っているタンパク質結合部位をブロッキングし、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSTバッファーで3回洗浄した。上に示したような濃度範囲のサンプル#1～6の3倍段階希釈物をプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、ウェルを3回洗浄した。次いで、抗体クローン14A11（PBST-BSA中で3μg/mLに希釈）100μLを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを3回洗浄した。1：30,000で希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識F(ab')2断片ロバ抗マウスIgG H&L抗体（Jackson ImmunoResearch）100μLを各ウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、ウェルを3回洗浄した。次いで、室温のTMB基質溶液（ThermoFisher）100μLを加え、室温で5分間インキュベートした。1N H2SO4 50μLを加えて反応を停止した。Biotek Synergy HT ELISAマイクロタイタープレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定した。
結果：
図13は、捕捉抗体3C5（抗ヒト／カニクイザル因子D）と検出抗体14A11（抗ヒト／カニクイザル成熟因子D特異的）の組み合わせをELISAアッセイにおいて用いたヒトおよびカニクイザル成熟因子Dおよびプロ因子Dの検出をグラフで示す。図13に示しているように、組換えヒト成熟因子D（hu Mat CFD）、正常ヒト血清（NHS）および精製ヒト補体因子D（hu purif. CFD、Complement Technologies）の結合は、組換えヒトおよびカニクイザルプロ因子D（hu pro CFD、cy Pro CFD）、ならびに3MC症候群を有する患者由来の血漿（3MC）の結合をはるかに超えていた。ヒト因子D枯渇血清（CFD-Dpl血清）は結合しない。組換えカニクイザル成熟因子D（cy Mat CFD）および正常カニクイザル血漿（NCP）は、ヒトでの結果よりもロバストでない読み出しを与える。
実施例７
この実施例は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合するモノクローナル抗体の作製を説明する。
背景／論理的根拠：
この実施例は、抗ヒトプロ因子D特異的抗体の作製を説明する。この実施例に記載される抗体は、ヒトプロ因子Dに特異的に結合し、かつヒト成熟因子Dに結合しない。
方法：
1. プロ因子D抗原の構築
図2および3に示しているように、ヒト因子Dのプロペプチドは、ヒト完全長因子Dの残基20～25に対応する「APPRGR」（SEQ ID NO：4）である。ヒト補体のアミノ酸20～25を含む合成ペプチド-KLHコンジュゲートを作製した。
Sulfo-SMCC連結化学によるKLHへのコンジュゲーションを可能にするC末端システインが付加された、因子D「APPRGR」（SEQ ID NO：4）。
1. プロ因子D抗原による免疫化
Sulfo-SMCC連結化学によるKLHへのコンジュゲーションを可能にするC末端システインが付加されたヒト補体因子Dのアミノ酸20～25「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含む合成ペプチド-KLHコンジュゲートでBALB/cマウスを免疫化した。ペプチドコンジュゲートのアジュバントエマルジョン100～200μL（注射1回当たり総タンパク質50～100μg）で皮下によりマウスを4回免疫化した。
免疫したマウスからの血清サンプルを眼窩後放血から調製し、ELISAアッセイにより、プレートに固定化された組換えヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）および組換えヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に結合可能な抗原特異的抗体の存在について次のように試験した。
組換えヒトプロCFD-Hisまたは組換えヒト成熟CFD-Hisを、Maxisorp（商標）ELISAプレート上に、PBS中1μg/mL、100μL/ウェルで固定化し、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートウェルを、0.05％ Tween 20を含有するPBS（PBST）300μLで3回洗浄し、1％ BSAを含有するPBS 250μLにより室温で1時間ブロッキングし、再度洗浄した。3回目の追加免疫後に採取したマウス#2からの血清をPBST中で希釈し、室温で1時間結合させ、次いで、PBST中で3回洗浄した。次いで、HRP標識ヤギ抗マウスIgG Fc抗体（Jackson ImmunoResearch）をアプライし（100μL/ウェル）、室温で1時間結合させ、次いで、PBSTで3回洗浄した。次いで、TMB基質（Thermo Fisher）（100μL/ウェル）をアプライし、室温で5分間インキュベートした。次いで、1N H2SO4（50μL/ウェル）で反応を停止した。Biotek（商標）ELISAプレートリーダーを用いて450nMでの光学密度についてプレートを読み取った。
図14は、ヒト補体因子Dのアミノ酸残基20～25に対応する「APPRGR」（SEQ ID NO：4）を含む合成ペプチドで免疫化した後の代表マウス#2（Ms2）の血清の、組換え成熟因子D（hu 成熟CFD）または組換えプロ因子D（hu proCFD）の存在下での力価測定をグラフで示す。図14に示しているように、代表マウス#2からの血清は、成熟因子Dと比較して、プロ因子Dに選択的に結合可能な抗体を含有する。
プロ因子Dに最も好ましい結合および成熟因子Dに最も好ましくない結合を示すマウス（すなわち、マウス#2）をハイブリドーマ融合のために選択した。融合の3日前に、PBS中の抗CD40アゴニストmAb（R&D Systems, Minneapolis, MN）50μgでマウスを皮下処置して、B細胞数を増加させた（Rycyzyn et al., Hybridoma 27:25-30, 2008を参照のこと）。マウスを屠殺し、脾臓細胞を収集し、そして、50％ポリエチレングリコールまたは50％ポリエチレングリコール＋10％ DMSOを使用して、選択したマウス骨髄腫細胞株P3/NSI/1-AG4-1（NS-1）（ATCC No. TIB18）に融合させた。融合物は、ハイブリドーマ細胞を生成し、これを、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地を含有する96ウェルのNunc組織培養処理プレートにプレーティングして、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脾臓ハイブリッドの増殖を抑制した。培地の80％と置き換えることでHATサプリメントを含有する新鮮培地をハイブリドーマウェルに供給した。ハイブリドーマ選択の後、後述するように組換えヒトプロ因子Dおよび成熟因子Dへの結合について培養上清をアッセイした。
2. ハイブリドーマスクリーニング
最初に、ハイブリドーマ上清を、固定化された組換えヒトプロ因子Dへの結合についてスクリーニングした。次いで、ELISAによる固定化された組換えヒトプロ因子D-Hisへの結合試験陽性のハイブリドーマ（n=6）（1F9、2A4、13A10、18F5、20A1、21H1）を組換えヒト成熟因子Dへの結合について試験した。
抗ヒトプロCFDハイブリドーマの特異性を次のようにさらに分析した。ハイブリドーマ上清（18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、21H1）を、ポリクローナルヤギ抗ヒト因子D抗体AF1824（R&D Systems）によって捕捉された場合の組換えプロ因子Dまたは成熟因子Dの検出能力について次のように試験した。ELISAプレートを、ポリクローナル抗ヒト因子D抗体AF1824（R&D Systems）でコーティングした。ハイブリドーマ上清を、PBS、0.05％ Tween 20（PBST）中で2倍希釈した。対照サンプルを含めた：ヒトMASP3に結合することが知られているハイブリドーマ（aM3 35C1）からの対照上清を同様に希釈した。また、対照サンプル：PBST、1μg/mlのマウスIgG（Jackson Immunoresearch 015-000-003）、および1μg/mlのマウスモノクローナル抗ヒトCFD（R&D Systems MAB1824）も含めた。ハイブリドーマ上清および対照サンプルを、捕捉されたプロ因子Dまたは成熟因子Dに室温で1時間結合させた。PBSTで3回洗浄した後、PBST中で希釈した100μL/ウェルのHRPヤギ抗マウスIgG Fcガンマ二次抗体（Jackson ImmunoResearch）を加え、室温で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、100μL/ウェルのTMB基質（ThermoFisher）を加えた。4分後、50μL/ウェルの1N H2SO4で反応を停止し、次いで、Biotek（商標）ELISAプレートリーダーにより450nmで読み取った。
図15は、ポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）によって捕捉された場合のヒトプロ因子Dまたはヒト成熟因子Dへの結合についてハイブリドーマ上清をスクリーニングした捕捉ELISAアッセイの結果をグラフで示す。
図15に示しているように、試験した6個のハイブリドーマのうち、6個すべてのハイブリドーマ（18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、21H1）からの上清が、組換えヒト成熟因子Dと比較して、組換えヒトプロ因子Dへの優先的結合を示した。
ハイブリドーマ18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、21H1をDNAクローニングおよび組換え抗体産生のために選択した。
実施例８
この実施例は、抗ヒトプロ因子D特異的モノクローナル抗体のクローニングおよび配列解析を説明する。
背景/論理的根拠：
この実施例は、実施例7に記載される因子Dのプロ型への優先的結合を示すハイブリドーマ（すなわち、18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、21H1）によって産生された抗体のクローニングおよび配列解析を説明する。
方法：
1. 組換え抗体のクローニングおよび精製
陽性ハイブリドーマ18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、21H1を実施例7に記載するように作製および特定した。これらのハイブリドーマを段階希釈法によってサブクローニングした。
重鎖および軽鎖可変領域を、RT-PCRを使用してハイブリドーマ18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、21H1からクローニングし、配列決定した。抗体をコードする配列を、トータルRNAから、SMARTer（商標）RACE 5'/3'キット（Takara Bio）を使用してアイソタイプ特異的リバースプライマーにより増幅させた。配列を検証した後、設計したクローニングプライマーにより可変（V）領域を再増幅させ、In-Fusion HD（商標）クローニングキット（Clontech）を使用してヒトIgG4重鎖（SEQ ID NO：71）およびカッパ軽鎖（SEQ ID NO：72）定常領域またはマウスIgG2a（SEQ ID NO：218）およびカッパ軽鎖（SEQ ID NO：219）定常領域のいずれかを担持する発現ベクターにクローニングした。発現構築物をExpi293細胞（Life Technologies）に一過性に共トランスフェクトし、5日間の培養の後、分泌された組換え抗体をプロテインAクロマトグラフィーによって上清から精製した。
重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列をそれぞれ図16Aおよび16Bに示し（図16Aおよび図16B中の「SIN」＝「SEQ ID NO：」）、これらを以下に記載する。それぞれの相補性領域（CDR）およびフレームワーク領域（FR）を下記表13～16に提供する。
抗ヒトプロ因子D特異的抗体の重鎖可変領域（VH）配列
図16Aは、抗ヒトプロ因子D特異的クローンについての重鎖可変領域（VH）配列のアミノ酸アライメントを示す：18F5_VH（SEQ ID NO：136）、1F9_VH（SEQ ID NO：137）、2A4_VH（SEQ ID NO：138）、20A1_VH（SEQ ID NO：139）、13A10_VH（SEQ ID NO：140）および21H1_VH（SEQ ID NO：141）。
各抗ヒトプロ因子D特異的抗体についての重鎖可変領域（VH）配列を以下に提示する。Kabat CDRに下線を引いている。
Figure 0007634082000108
Figure 0007634082000109
（表１４）抗ヒトプロ因子D特異的抗体のVH配列（CDRおよびFR領域、Kabat）
Figure 0007634082000110
Figure 0007634082000111
抗ヒトプロ因子D特異的抗体の軽鎖可変領域（VL）配列
図16Bは、抗ヒト成熟因子D特異的クローンについての軽鎖可変領域（VL）配列のアミノ酸アライメントを示す：18F5_VL（SEQ ID NO :142）、1F9_VL（SEQ ID NO：143）、2A4_VL（SEQ ID NO：144）、20A1_VL（SEQ ID NO：145）、13A10_VL（SEQ ID NO：146）、および21H1_VL（SEQ ID NO：147）。
各抗ヒトプロ因子D特異的抗体についての軽鎖可変領域（VL）配列を以下に提示する。Kabat CDRに下線を引いている。これらの領域は、Kabatシステムによって付番してもChothiaシステムによって付番しても同じである。
Figure 0007634082000112
（表１５）抗ヒトプロ因子D特異的抗体のVL配列（CDRおよびFR領域、KabatおよびChothia）
Figure 0007634082000113
Figure 0007634082000114
（表１６）抗ヒトプロ因子D特異的HC CDRについてのコンセンサス配列：
Figure 0007634082000115
（表１７）プロ因子D特異的LC CDRについてのコンセンサス配列：
Figure 0007634082000116
プロ因子D特異的モノクローナル抗体をコードする核酸配列：
Figure 0007634082000117
Figure 0007634082000118
Figure 0007634082000119
実施例９
この実施例は、いくつかのインビトロアッセイでの組換え精製抗ヒトプロ因子D特異的抗体の機能的特性評価を説明する。
背景／論理的根拠：
この実施例は、実施例7および8に記載するように作製された組換え抗ヒトプロ因子D特異的モノクローナル抗体のヒトプロ因子Dへの結合およびヒト成熟因子Dへの結合についての機能的特性評価を説明する。
方法：
1. 精製組換え抗体：固定化されたプロ因子Dおよび成熟因子Dへの結合
モノクローナル抗ヒトプロCFD抗体18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、および21H1を、実施例8に記載するようにヒトIgG4フレームワーク上で組換えにより作製した。これらの抗体は、ELISAにより、ハイブリドーマ上清として、固定化された組換えヒトプロ因子Dに対して優先的な結合を示し（実施例7に記載するように）、そして、組換え抗体として、後述するように固定化された組換えヒト成熟因子Dまたは組換えヒトプロ因子Dに結合する能力について再試験した。
精製組換え抗体18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、および21H1を、1μg/mlの組換えヒトプロ因子Dおよび成熟因子DをコーティングしたELISAプレートにおいて、PBST中で3μg/mlから3倍希釈で段階希釈し、PBS、1％ BSAでブロッキングした。対照精製抗体も同様に希釈して含めた：ラットモノクローナル抗マウスCFD（R&D Systems MAB5430）、モノクローナルマウス抗ヒトCFD（R&D MAB18241）、Rat IgG（Jackson ImmunoResearch 012-000-003）およびマウスIgG（Jackson ImmunoResearch 015-000-003）。1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、HRPタグ化抗マウス、ラットまたはヒト二次抗体（Southern Biotech 9230-05）を加え、1時間インキュベートした後、洗浄し、次いで、TMB基質（ThermoFisher）を続けた。1N H2SO4の添加によって反応を停止し、Biotek（商標）ELISAプレートリーダーにより450nmで読み取った。
結果：
図17Aは、多数の候補抗ヒトプロ因子D特異的抗体を用いた組換えヒトプロ因子Dの検出をグラフで示す。図17Aに示しているように、試験した精製抗体、すなわち、18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、および21H1はすべて、因子Dのプロ型を検出可能であった。
図17Bは、多数の候補抗ヒトプロ因子D特異的抗体を用いた組換えヒト成熟因子Dの検出をグラフで示す。図17Bに示しているように、試験した精製抗体、すなわち、18F5、1F9、2A4、20A1、13A10、または21H1はどれも、因子Dの成熟型を検出できなかった。対照サンプルは、ラットIgGおよびマウスIgGを含み、これらは、ヒトのプロ因子Dまたは成熟因子Dのいずれにも結合しない。2種類の市販の抗因子D抗体、すなわちMAB5430およびMAB18241を試験した。これらの市販の抗体は共に、プロヒト因子Dまたは成熟ヒト因子Dのいずれに対しても特異性を欠いている。
2. 精製組換え抗プロ因子D特異的抗体21H1のさらなる分析：特異性および感受性
A. 組換えヒトプロ因子Dおよび成熟因子Dの検出
方法：
精製組換え抗プロ因子D特異的抗体21H1（ヒトIgG4 Fc）を、コーティング／捕捉抗体としてサンドイッチELISAフォーマットにおいて試験した。一晩インキュベーション、ブロッキングおよび洗浄した後、組換えヒトプロ因子Dおよび成熟因子Dを、正常ヒト血漿中、その後続いてPBST-BSA中で2μg/mLに希釈した。因子Dを追加していない対照も同様に試験した。アッセイウェルを、室温で1時間インキュベートし、次いで、PBSTで3回洗浄した。捕捉された分子を、PBST-BSA中0.1μg/mLのヒト成熟因子Dに対するビオチン標識した親和性精製ヤギポリクローナル抗体（R&D BAF1824）で検出した。インキュベーションおよび洗浄後、HRPタグ化ストレプトアビジンを加え、インキュベートし、洗浄した後、TMB基質（ThermoFisher）を続けた。結果を図18に示す。
結果：
図18は、組換え抗プロ因子D抗体21H1をコーティング抗体として、ヤギポリクローナル抗因子D抗体BAF1824（R&D Systems）を検出抗体として用いたELISAアッセイでの、組換えプロ因子Dおよび成熟（活性）因子Dの検出をグラフで示す。図18に示しているように、成熟因子Dの存在下では、バッファーおよびマトリックス（因子Dなし）の場合よりも大きなシグナル伝達がある。mAb 21H1は、最低試験濃度（0.46ng/ml）までプロ因子Dの検出を継続するが、マトリックスまたは成熟因子Dのシグナル伝達は、10ng/mlのバックグラウンドレベルにある。これらの結果は、アッセイの特異性が抗プロ因子D特異的抗体21H1に起因することを実証している。
B. ヒト血清中のヒトプロ因子Dの存在についての分析
方法：
精製組換え抗プロ因子D特異的抗体21H1（ヒトIgG4 Fc）を、コーティング／捕捉抗体としてサンドイッチELISAフォーマットにおいて試験した。1μg/mlの21H1抗体の一晩インキュベーション後、プレートをブロッキングかつ洗浄し、組換えヒトプロ因子D（Pro-CFD）を、50％正常ヒト血漿（NHP）、50％正常ヒト血清（NHS）または50％因子D枯渇血清（Df-Dpl血清）中、その後続いてPBST-BSA中で1μg/mlに希釈した。血清中に因子Dを追加していない対照も同様に試験した（未添加）。アッセイウェルを、室温で1時間インキュベートし、次いで、PBSTで3回洗浄した。捕捉された分子を、PBST-BSA中0.1μg/mLのヒト成熟因子Dに対するビオチン標識した親和性精製ヤギポリクローナル抗体（R&D BAF1824）で検出した。インキュベーションおよび洗浄後、HRPタグ化ストレプトアビジンを加え、インキュベートし、洗浄した後、TMB基質を続けた。結果を図19に示す。
結果：
図19は、抗プロ因子D抗体21H1をコーティング抗体として、ヤギポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）を検出抗体として用いたELISAアッセイで判定した場合の、正常ヒト血漿（NHP）、正常ヒト血清（NHS）または因子D枯渇血清（Df-Dpl血清）中に存在するプロ因子Dの量をグラフで示す。図19に示しているように、希釈液、正常ヒト血漿、正常ヒト血清または因子D枯渇血清に組換えプロ因子Dを添加すると、陽性のシグナル伝達が得られる。未添加の正常ヒト血漿、正常ヒト血清または因子D枯渇血清では、シグナル伝達の発生が非常に低い～シグナル伝達の発生がない。
C. 試験血清サンプル中のヒトプロ因子Dの存在についての分析
方法：
精製組換え抗プロ因子D特異的抗体21H1（ヒトIgG4 Fc）を、コーティング／捕捉抗体として、正常ヒト血清（NHS、Complement Technologies）、C1q枯渇血清（C1q-Dpl、Complement Technologies A399）、因子D枯渇血清（Df-Dpl、Complement Technologies FactorD-Dpl）および3MC症候群患者血清（患者3、MASP-3活性欠損、Dr. Wilhelm Schwaebleから好意で提供）を用いたサンドイッチELISAフォーマットにおいて試験した。PBS中1μg/mLの21H1抗体の一晩インキュベーション、ブロッキングおよび洗浄後、血清をPBST-BSA中で1：10に、その後続いてPBST-BSA中で2倍希釈した。アッセイウェルを、室温で1時間インキュベートし、次いで、PBSTで3回洗浄した。捕捉された分子を、PBST-BSA中0.1μg/mLのヒト成熟因子Dに対するビオチン標識した親和性精製ヤギポリクローナル抗体（R&D BAF1824）で検出した。インキュベーションおよび洗浄後、HRPタグ化ストレプトアビジンを加え、インキュベートし、洗浄した後、TMB基質（ThermoFisher）を続けた。
結果：
図20は、抗プロ因子D抗体21H1をコーティング抗体として、ヤギポリクローナル抗因子D抗体AF1824（R&D Systems）を検出抗体として用いたELISAアッセイで判定した場合の、正常ヒト血清（NHS）、C1q枯渇血清（C1q-Dpl）、因子D枯渇血清（Df-Dpl）および3MC症候群患者血清中に存在するプロ因子Dの量をグラフで示す。正常ヒト血清および因子DまたはC1qが枯渇したヒト血清は、10倍およびそれ以上希釈した場合に非常に低いシグナル伝達を有するが、3MC症候群患者からの血清は、プロ因子Dの強い検出を生じる。
結論
実施例7～9に記載するように、本発明者らは、プロ因子Dに特異的に結合しかつ成熟因子Dに結合しないプロ因子D特異的モノクローナル抗体を作製した。実施例10～12にさらに記載するように、プロ因子Dのレベルは、代替経路活性と相関し、それゆえ、プロ因子D特異的モノクローナル抗体は、哺乳類対象における代替経路活性化のレベルを評価するための診断アッセイの代用エンドポイントとしてプロ因子Dのレベルを測定するために使用してよい。本明細書の実施例12にさらに記載するように、プロ因子D特異的モノクローナル抗体は、MASP-3阻害剤で処置された対象におけるMASP-3阻害の薬力学（PD）測定として使用してよく、これを、MASP-3阻害剤の有効な投薬を決定するために使用してよい。
実施例１０：
この実施例は、MASP-3に結合し、プロ因子Dから因子Dへの成熟を阻害し、それにより代替経路を阻害する、ヒト化抗体の作製を説明する。
背景／論理的根拠：
図1に示しかつ本明細書に記載されるように、MASP-3は、プロ因子Dから因子Dへの変換に必要であり、それゆえ、MASP-3は、補体の代替経路（APC）の重要な調節因子であることが実証されている。参照により本明細書に組み入れられるWO2018/026722に記載されているように、多数の高親和性抗MASP-3阻害性モノクローナル抗体が作製されている。WO2018/026722にさらに記載されているように、数種の代表的なMASP-3阻害抗体（例えば、4D5、10D12および13B1）がヒト化された。代表的なヒト化MASP-3阻害抗体を後述する。
代表的なヒト化MASP-3阻害抗体についての重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）配列を以下に提示する。Kabat CDRに下線を引いている。
Figure 0007634082000120
Figure 0007634082000121
（表１８）抗ヒトMASP-3特異的mAb HC CDR：
Figure 0007634082000122
（表１９）抗ヒトMASP-3特異的mAb LC CDR：
Figure 0007634082000123
（表２０）代表的なヒト化高親和性MASP-3阻害抗体：
Figure 0007634082000124
いくつかの態様では、MASP-3阻害抗体の可変軽鎖および重鎖断片を完全長IgG4フォーマットで次のように単離した：いくつかの態様では、キメラmAbをヒトIgG4定常領域（SEQ ID NO：70）に融合させた。いくつかの態様では、キメラmAbを、安定化S228Pアミノ酸置換（substation）（SEQ ID NO：71）を含有するヒトIgG4定常領域に融合させた。いくつかの態様では、キメラmAbを、S228Pアミノ酸置換を含有しかつ低pHでのFcRn相互作用を促進する変異も含有するヒトIgG4定常領域（SEQ ID NO：245）に融合させた。
WO2018/026722にさらに記載されているように、高親和性MASP-3阻害抗体13B1、10D12および4D5は、げっ歯動物および非霊長類などの哺乳類対象において、MASP-3標的の濃度よりも低いモル濃度で（例えば、約1：1～約2.5：1（MASP-3標的対mAb）のモル比で）代替経路を完全に阻害する（実施例11～21を参照のこと）。実施例11に記載するように、マウスへの高親和性MASP-3阻害抗体mAb 13B1の単一用量投与は、少なくとも14日間の全身性代替経路補体活性のほぼ完全な消失を導いた。実施例12にさらに記載するように、PNHに関連する十分に確立された動物モデルにおいて実施した研究において、mAb 13B1が、PNH様赤血球の生存を有意に改善し、C5阻害よりもPNH様赤血球を有意に良好に保護することが実証された。実施例13に記載するように、mAb 13B1が、関節炎のマウスモデルにおいて疾患の発生率および重症度を低下させることがさらに実証された。WO2018/026722にさらに記載されているように、代表的な高親和性MASP-3阻害性mAb 13B1、10D12および4D5は、霊長類における代替経路の遮断に非常に有効である。カニクイザルへのmAb 13B1、10D12または4D5の単一用量投与は、およそ16日間続く全身性代替経路活性の持続的な消失をもたらした。高親和性MASP-3阻害抗体で処置したカニクイザルにおける代替経路消失の範囲は、インビトロおよびインビボの因子D遮断によって達成されたものと同等であり、このことは、MASP-3阻害抗体による因子D変換の完全な遮断を示している。それゆえ、高親和性MASP-3阻害性mAbは、代替経路過活性に関連する疾患または障害を患っている患者の治療において治療的有用性を有し、例えば、代替経路過活性に関連する疾患または障害（代替経路疾患または障害とも称される）は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症および重症筋無力症からなる群より選択される。
実施例１１：
成熟因子D特異的抗体14A11を検出抗体として使用したイムノアッセイでの、代表的なMASP-3阻害抗体（13B1）による処置前および処置後のカニクイザルサンプル中の因子Dの分析
背景／論理的根拠：
実施例10に記載するように、定常状態（休止）プロ因子D成熟をインビボ阻害可能である多数の高親和性MASP-3阻害抗体が作製された。この実施例は、非ヒト霊長類においてAPC活性を阻害可能であることが知られている代表的な高親和性MASP-3阻害性mAb 13B1で処置した後のカニクイザルにおける因子Dの状態（すなわち、成熟因子Dの量）の分析を説明する。
方法：
この研究において、9匹のカニクイザル（1つのmAb条件当たり動物3匹）に、3つの代表的な高親和性MASP-3阻害抗体：4D5、10D12または13B1（IgG4定常領域）のうち1つを5mg/kgの静脈内単一用量で与えた。血漿（EDTA）および血清サンプルを3週間またはそれ以上の期間にわたって定期的に収集した。
カニクイザルへの13B1単一用量からの血漿サンプルを、成熟因子Dの量について次のように試験した。ELISAプレートに、ヒトプロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合する3μg/mLの抗ヒト／カニクイザル因子D mAb 3C5（ヒトIgG4）を一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ブロッキングし、研究サンプルの20倍希釈物をロードし、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、成熟因子D特異的抗体14A11の3μg/mL溶液を加え、1時間インキュベートした。洗浄後、HRP標識二次抗体（HRP標識F(ab')2断片ロバ抗マウスIgG H&L抗体（Jackson ImmunoResearch））を使用して検出抗体のシグナルを増幅させ、続いて、TMB（ThermoFisher）で発色させた。サンプルを、カニクイザル組換え成熟因子D希釈物の4パラメーターロジスティック曲線から補間した。結果を図21Aおよび図21Bに示す。
結果：
図21Aは、代表的な抗MASP-3阻害性mAb 13B1による処置後一定期間にわたるカニクイザルにおける成熟因子Dの量をグラフで示す。図21Aに示しているように、成熟因子Dのレベルは、MASP-3 mAbの投与後24時間以内に低レベルに低下し、処置後約500時間は低いままである。
図21Bは、カニクイザル組換え成熟因子D希釈物の4パラメーターロジスティック曲線から決定した場合の標準曲線をグラフで示す。サンプルの読み出しをこの標準曲線から補間し、カニクイザル成熟因子Dのug/mlとしてグラフ化した。
この実施例の結果は、成熟因子Dに特異的な抗体を利用したイムノアッセイを用いて、プロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害するMASP-3阻害抗体による処置後の成熟因子Dの血清レベルをモニタリングできることを実証している。
実施例１２
単一用量薬物動態（PK）および薬力学（PD）研究の一部としてのカニクイザルにおける代表的な抗MASP-3 mAb（13B1）の薬理学の分析
背景／論理的根拠：
実施例11において実証されたように、成熟因子Dに特異的な抗体を利用したイムノアッセイを用いて、プロ因子Dから成熟因子Dへの変換を阻害するMASP-3阻害抗体による処置後の成熟因子Dの血清レベルをモニタリングできる。この実施例は、雌のカニクイザルでの単一用量薬物動態（PK）および薬力学（PD）研究において成熟因子Dの血漿濃度を定量するための、成熟因子Dに特異的な抗体を利用したイムノアッセイの使用を説明する。
方法：
サルにおける抗MASP-3 mAb 13B1の薬理学を、雌のカニクイザルでの単一用量薬物動態（PK）および薬力学（PD）研究の一部として調査した。mAb 13B1は、0.5mg/kg、1.5mg/kgもしくは5mg/kgで皮下（SC）注射によって；または5mg/kgもしくは100mg/kgで静脈内（IV）ボーラス注入によって投与した。各研究群に3匹のサルを含めた。PKおよびPDの評価のために投薬前から投薬後1344時間（8週間）まで連続血液サンプルを収集した。
代替経路活性に対するmAb 13B1の効果は、ELISAアッセイでの成熟因子Dの定量によって、またエクスビボ因子Ba活性アッセイを用いることによって評価した。刺激によって生じた因子Baの濃度は、刺激サンプルの因子Ba濃度から未刺激サンプルの因子Ba濃度を減算して算出した。成熟（すなわち、活性）因子D血漿濃度の減少および刺激因子Ba濃度の減少は、mAb13B1 PD活性の指標となる。成熟因子D血漿濃度データおよび刺激因子Ba濃度は、平均、中央値、標準偏差および変動係数（CV％）を用いて時点および用量群によってまとめた。
血清サンプルをザイモサンで刺激して代替経路を活性化させた。ザイモサンによる代替経路活性化の程度は、因子Baの定量によって次のように判定した。液相マーカーBaの生成を判定するために、抗MASP-3 mAbで処置したカニクイザルから調製した血清（最終5％、GVB＋Mg/EGTA中で希釈）中でザイモサン（最終1mg/mL）をインキュベートすることによるエクスビボアッセイで、APCを誘導した。混合物を37℃で40分間インキュベートし、ELISAに基づく補体終点検出によってAPC活性を測定した。市販のELISAキット（Quidel）を使用して反応上清中のBaを検出した。処置前の値を100％活性と設定し、インキュベートされるがザイモサンに暴露されない処置前サンプルを0％と設定することにより、すべての試験の吸光度値を正規化した。
成熟因子DのELISAアッセイ：ELISAプレートに、ヒトプロ因子Dと成熟因子Dの両方に結合する3μg/mLの抗ヒト／カニクイザル因子D mAb 3C5（ヒトIgG4）を一晩コーティングした。プレートを洗浄し、ブロッキングし、研究サンプルの20倍希釈物をロードし、室温で1時間インキュベートした。洗浄後、成熟因子D特異的抗体14A11の3μg/mL溶液を加え、1時間インキュベートした。洗浄後、HRP標識二次抗体（Jackson ImmunoResearch）を加えてアッセイを発色させた。
結果：
図22Aは、成熟因子D特異的抗体14A11を検出抗体として利用したELISAアッセイで判定した場合の、抗MASP-3 mAb 13B1のs.c.またはi.v.投与後56日（1344時間）の期間にわたるサルにおける成熟因子Dの濃度をグラフで示す。図22Aに示しているように、サルにおけるmAb 13B1の投与は、成熟因子D濃度の用量依存的な減少と関連した。
図22Bは、因子Baアッセイで判定した場合の、抗MASP-3 mAb 13B1の投与後56日（1344時間）の期間にわたるエクスビボ代替経路活性（ベースラインに対する％）をグラフで示す。図22Bに示しているように、mAb 13B1の投与後、エクスビボ代替経路活性は、用量依存的な様式で阻害された。用量の増加と共に、エクスビボ活性の阻害の程度および持続期間が増加した。5mg/kgのmAb 13B1のs.c.またはi.v.投与後、エクスビボ活性は、およそ2週間で投薬前レベルのおよそ10％まで減少した。評価した最高用量レベルでは、サンプル採取周期の期間にわたりエクスビボ活性が阻害された。
図23は、エクスビボ代替経路活性に対する抗MASP-3 mAb 13B1効果とサルにおける単回静脈内ボーラスまたは皮下投与後の成熟因子D濃度との関係性をグラフで示す。図23に示しているように、成熟因子D濃度に対するmAb 13B1の効果は、エクスビボ代替経路活性に対するmAb 13B1の効果と線形関係にあった。
サル研究でのmAb 13B1濃度と成熟CFD濃度に対するPD効果との関係性をグラフにより検証し、シグモイド濃度-反応モデルを用いて適合させた。mAb13B1血清濃度と成熟CFD濃度の減少との間の時間差から、投薬後72時間前に収集したデータを分析から除いた。観測データおよびPDモデル適合のプロットを図24に提示する。
図24は、サルへの単回投与後の抗MASP-3 mAb13B1血清濃度と成熟因子D濃度の薬力学効果との関係性をグラフで示す。
結果のまとめ：
MASP-3阻害について予想されたように、マウスおよび非ヒト霊長類におけるAPC阻害は、全身CFDの活性化の減少に関連する。酵素前駆体型（不活性プロ酵素）または成熟型のいずれかを特異的に検出する酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）による血漿CFDの投薬後濃度の測定は、抗MASP-3 mAb13B1が、総CFDレベルの測定可能な変化なしにCFDの活性化型への成熟を遮断することを実証している。s.c.投与した5mg/kgの単一用量mAb13B1は、非ヒト霊長類においておよそ2週間にわたり≧90％の代替経路遮断を維持することができる。
サルにおける抗MASP-3 mAb13B1の投与後、エクスビボ代替経路活性は、用量依存的な様式で阻害された。用量の増加と共に、エクスビボ活性の阻害の程度および持続期間が増加した。5mg/kgのmAb13B1のs.c.またはi.v.投与後、エクスビボ活性は、およそ2週間で投薬前レベルのおよそ10％まで減少した。サルにおけるmAb13B1の投与はまた、成熟CFD濃度の用量依存的な減少にも関連した。成熟CFD濃度に対するmAb13B1の効果は、一般に、エクスビボ代替経路活性に対するmAb13B1の効果と線形関係にあった。これらのデータは、mAb13B1がサルへの単回投与後にMASP-3活性を阻害すること、そして、MASP-3の阻害が代替経路活性の減少を導くことを示している。成熟因子D血漿濃度および刺激因子Ba濃度の減少は、サルにおける代替経路のmAb13B1による用量依存的な阻害を実証した。
実施例１３
mAb13B1の安全性、忍容性、薬物動態（PK）および薬力学（PD）を評価するための第1相臨床試験
背景／論理的根拠：
本明細書に記載されるように、mAb13B1は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合してその活性を阻害する、ヒト化モノクローナル抗体である。この実施例は、mAb13B1の安全性、忍容性、薬物動態（PK）および薬力学（PD）を評価するために行われるヒト初回投与第1相研究を説明する。この研究におけるPD分析は、mAb13B1で処置された対象の代替経路補体（APC）阻害の程度を評価するために、試験サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出することであって、成熟因子Dが、成熟因子D中に存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）中のエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dに結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその断片で捕捉もしくは検出される、成熟因子Dを捕捉および検出すること；ならびに／または試験サンプル中のプロ因子Dを捕捉および検出することであって、プロ因子Dが、プロ因子D中に存在する活性化（「プロ」）ペプチド「APPRGR」（SEQ ID NO：4）上のエピトープに特異的に結合するが成熟因子Dに結合しないプロ因子D特異的モノクローナル抗体またはその断片で捕捉もしくは検出される、プロ因子Dを捕捉および検出することによる、本明細書に開示されるイムノアッセイの使用を含む。
方法：
mAb13B1のヒト初回投与第1相研究は、mAb13B1のIVおよびSC投与の単一漸増用量研究とmAb13B1のSC投与の複数漸増用量研究とからなる。本研究の両方の部で、安全性、忍容性、薬物動態（PK）、薬力学（PD）および免疫原性を評価するために健康な対象を登録する。単一漸増用量研究の目的は、十分に忍容性であり、およそ30日間にわたりMASP-3活性の≧90％阻害（本明細書に開示されるようなイムノアッセイで成熟CFD血漿濃度の低下によって測定される）を提供する、用量範囲およびスケジュールを確立することである。本研究の複数漸増用量部は、MASP-3の≧90％阻害を持続するSC投薬の用量レベルおよび頻度を決定するために設計される。mAb13B1の非臨床毒性研究は、健康な対象において推奨用量で初期ヒト試験を実施するための適切な安全域があることを示しており、第1相研究で調査された用量レベルが、APC過剰活性を特徴とする疾患において患者にとって都合良く一定期間にわたって有効性を提供すると予測される。
本明細書に記載されるように、mAb13B1は、MASP-3のセリンプロテアーゼドメインに結合してその活性を阻害する、ヒト化モノクローナル抗体（mAb）である。MASP-3を阻害することによって、mAb13B1は、CFDのタンパク分解活性化を遮断し、それにより、APCおよびその関連する補体活性の増幅を崩壊させる。mAb13B1は、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1；
Figure 0007634082000125
または
Figure 0007634082000126
を含むHC-CDR2；およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；SEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2；およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む。mAb13B1は、SEQ ID NO：245として示されるヒト起源のIgG4定常領域に融合されたマウス起源のヒト化可変領域を含む。mAb13B1は、2つの同一の219アミノ酸カッパ軽鎖と2つの同一の440アミノ酸重鎖からなるジスルフィド結合グリコシル化四量体として分泌される。
この第1相治験において使用される製剤は、110mg/mLの濃度のmAb13B1、20mMのヒスチジン、100mg/mLのスクロース、および0.035％のポリソルベート80をpH 6.0で含有する。
投与量決定
実施例12に記載するように、サルでの2つの単一用量研究においてmAb13B1濃度と成熟CFD濃度に対するPD効果との関係性をグラフにより検証し、シグモイド濃度-反応モデルを用いて適合させた。mAb 13B1血清濃度と成熟CFD濃度の減少との間の時間差から、投薬後72時間前に収集したデータを分析から除いた。観測データおよびPDモデル適合のプロットを図24に示す。
次いで、mAb13B1のPKおよびPDモデルパラメーターをスケーリングし、ヒトでの広い用量範囲にわたるmAb13B1のPKおよびPD効果を予測した。PKモデルパラメーターは、典型的にはモノクローナル抗体に対して使用されるアロメトリック係数を使用してヒトにスケーリングした（Deng R. et al., MAbs, 3 (1):61-6, 2011；Dong J. et al., Clin Pharmacokinet 50 (2): 131-42, 2011）。インビトロ効力および結合親和性データに基づき、PDモデルパラメーターは、ヒトにおいてサルと同じであると仮定した。mAb13B1曝露-反応関係モデルを使用して、成熟CFD濃度の10％、50％および90％の減少に関連するmAb13B1濃度を推定した。mAb13B1のPKモデルを使用して、mAb13B1血清濃度の経時的プロファイルを、ヒトにおいて一定範囲のIVおよびSC用量レベルにわたってシミュレーションした。ヒトでのIVおよびSC用量レベル範囲にわたる予測のmAb13B1曝露値およびPD効果を表21に提示する。
（表２１）健常ボランティアにおける単回皮下または静脈内投与後の予測のmAb13B1曝露および薬力学効果
Figure 0007634082000127
AUC（0-168h）＝投薬後0～168時間の経時的な濃度曲線下面積；Cmax＝最大観測濃度；Emax＝最大薬力学効果；IV＝静脈内；CFD＝補体因子D；SC＝皮下
a 30分間注入
予測のmAb13B1薬物動態（PK）プロファイルおよび薬力学（PD）活性は、ヒトにおける0.1mg/kgの単回IV投与が、成熟CFD血漿濃度の最大10％の減少に関連していることを示唆している。同様に、8mg/kgの単回SCまたはIV投与も、およそ4週間にわたる成熟CFDレベルの＞90％の減少に関連していると予測される。
結果のまとめ
合計80名の健康な対象に、mAb13B1を、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kgもしくは3mg/kgの投与量で静脈内（IV）に、または3mg/kgもしくは5mg/kgの投与量で皮下（SC）投与した。試験したすべての用量で、mAb13B1は、明らかな安全性シグナルはなく、十分に忍容性であった。
図25Aは、ELISAにより判定した場合の、mAb13B1のIV投与後最大84日までの期間にわたるmAb13B1の対象の血漿中濃度をグラフで示す。図25Aに示しているように、投薬量を増加させた結果、mAb13B1のレベルがより高く、血漿サンプル中でmAb13B1が検出される期間がより長くなった。
図25Bは、成熟因子D特異的抗体14A11を検出抗体として用いたELISAアッセイで判定した場合の、抗MASP-3 mAb 13B1のIV投与後84日の期間にわたる対象における成熟因子Dのレベルをグラフで示す。図25Bに示しているように、mAb 13B1の投与は、成熟因子D濃度の用量依存的な減少ならびに効果持続の用量依存的な増加と関連した。3mg/kgの投与量では、IV投与は、検出可能レベルを下回る（すなわち、およそ90％の減少またはそれ以上の）成熟CFDレベルの減少をもたらし、これは、最大4週間持続した。また、最低の単一皮下用量のmAb 13B1は、ほとんどの対象において4週間にわたり検出可能レベルを下回る（すなわち、およそ90％の減少またはそれ以上）まで成熟因子D濃度を抑制できることも判明した。
これらのデータは、試験した投与量すべてのPKおよびPDプロファイルが、有益であり、かつ、低用量で月1回（またはより低頻度）のmAb 13B1の投薬を支持することを示している。そのような投薬は、静脈内または皮下のいずれであってもよい。
単一用量のMASP-3阻害抗体13B1を受けた正常ヒトボランティアにおいて薬力学反応を測定するためのプロ因子Dおよび成熟因子Dアッセイの有用性は、進行中の第1相研究において実証された。Ab 13B1の複数の用量レベルでは、プロ因子Dおよび成熟因子Dの血漿濃度は、一貫して逆相関を示す。投薬前のベースラインレベルと比べ、Ab 13B1投与後、プロ因子Dレベルは、成熟因子Dレベルが減少するにつれて増加した。さらに、測定されたプロ因子Dの増加の程度は、一貫して、成熟因子Dの濃度の減少とほぼ等しかった。この観測は、プロ因子Dと成熟因子Dのクリアランス速度に劇的な違いがない場合、予想されたヒトにおけるMASP-3および因子D成熟の阻害の結果と合致する。まとめると、因子Dの2つの異なる型を測定する2つのアッセイの結果は、互いに支持し合い、一緒に利用した際には、治療的MASP-3阻害の特性評価に追加の診断的価値を提供し得る。
したがって、一局面では、本開示は、pH 6.0±5％、20±5％ mMのヒスチジン、100±5％ mg/mLのスクロース、および0.035％±5％のポリソルベート80を有する緩衝液系を含む水溶液中にMASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物であって、前記MASP-3阻害抗体が、110mg/mL±5％の濃度で含まれ、前記MASP-3阻害抗体が、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1；
Figure 0007634082000128
または
Figure 0007634082000129
を含むHC-CDR2；およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；SEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2；およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、薬学的組成物を提供する。一態様では、薬学的組成物は、無菌である。一態様では、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、SEQ ID NO：226またはSEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％同一を含む重鎖可変領域と、SEQ ID NO：227に対して少なくとも80％、85％、90％、95％、98％、99％または100％同一を含む軽鎖可変領域とを含む。一態様では、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、マウス抗体、および前述のいずれかの抗原結合断片からなる群より選択される。一態様では、MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片は、一本鎖抗体、ScFv、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、ヒンジ領域を欠いている一価抗体および全長抗体からなる群より選択される。一態様では、MASP-3阻害抗体は、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。一態様では、MASP-3阻害抗体は、ヒトIgG4定常領域を含む。一態様では、MASP-3阻害抗体は、S228P変異を有するヒトIgG4定常領域を含む。一態様では、MASP-3阻害抗体は、低pHでのFcRn相互作用を促進する変異を含み、例えば、MASP-3阻害抗体は、SEQ ID NO：245として示されるヒトIgG4定常領域を含む。一態様では、薬学的組成物は、それを必要とする対象に、体重1kg当たりMASP-3阻害抗体0.1～10mg（例えば、0.1mg/kg～8mg/kg、0.3mg/kg～5mg/kg、0.3mg/kg～3mg/kg、1mg/kg～3mg/kg、1mg/kg～5mg/kg、2mg/kg～5mg/kg、0.1±5％mg/kg、0.3±5％mg/kg、1.0±5％mg/kg、3.0±5％mg/kg、5.0±5％mg/kg、または8.0±5％mg/kg）の範囲の投与量で投与される。一態様では、薬学的組成物は、それを必要とする対象に、体重100kg当たり0.5～5mL（例えば、0.7mL～4.5mL、1.0mL～3.5mL、1.5mL～3.0mL、2mL～2.5mL、0.5±5％mL、0.7±5％mL、1.1±5％mL、1.4±5％mL、2.1±5％mL、2.3±5％mL、2.8±5％mL、3.4±5％mL、または4.5±5％mL）の範囲の投与量で投与される。
別の局面では、本開示は、ヒト対象への治療的投与に適した単位剤形のMASP-3阻害抗体、例えば、10mg～1000mg（例えば、50mg～800mg、または75mg～500、例えば100mg～300mg、例えば125～275mg、例えば150～200mg、例えば150±5％mg、155±5％mg、160±5％mg、165±5％mg、170±5％mg、175±5％mg、180±5％mg、185±5％mg、または190±5％mg）の範囲の単位剤形のMASP-3阻害抗体を含む薬学的組成物を含有する製造品であって、前記MASP-3阻害抗体が、SEQ ID NO：231（GKWIE）を含むHC-CDR1；
Figure 0007634082000130
または
Figure 0007634082000131
を含むHC-CDR2；およびSEQ ID NO：238（SEDV）を含むHC-CDR3を含む重鎖可変領域と；SEQ ID NO：239を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：178（WASTRES）を含むLC-CDR2；およびSEQ ID NO：244（KQSYNIPT）を含むLC-CDR3を含む軽鎖可変領域とを含む、製造品を提供する。
本発明の好ましい態様を例示かつ説明してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなくその中で様々な変更を実施できることが認識されよう。
独占的な権利または特権が主張される本発明の態様は、特許請求の範囲に記載の通りに定義される。

Claims (36)

  1. 試験サンプルにおける代替経路補体（APC）の活性化の程度の指標を提供する方法であって、
    (a) 試験サンプルを提供する工程；
    (b) 該試験サンプル中の成熟因子Dを捕捉および検出することを含む、イムノアッセイを実施する工程であって、成熟因子Dが、成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片で捕捉もしくは検出される、前記工程；ならびに
    (c) (b)に従って検出された成熟因子Dのレベルを所定のレベルもしくは対照サンプルと比較する工程であって、該試験サンプル中の検出された成熟因子Dのレベルが、代替経路補体活性化の程度の指標となる、工程
    を含む、方法。
  2. 工程(b)が、成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で成熟因子Dを捕捉すること、ならびにヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、請求項1記載の方法。
  3. 工程(b)が、ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片で成熟因子Dを捕捉すること、ならびに成熟因子Dに存在する「ILGGREA」（SEQ ID NO：5）におけるエピトープに特異的に結合するがプロ因子Dには結合しない成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片で検出することを含む、請求項1記載の方法。
  4. 前記成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、IまたはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列HIYWDDEKHYXPSLKX（SEQ ID NO：66）を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列RYYGYXXXMXY（SEQ ID NO：67）を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、GまたはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、IまたはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列RSXXSIXHSNGNTYXE（SEQ ID NO：68）を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3
    を含む結合ドメインを含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 前記結合ドメインが、以下のCDRのセット：
    (a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：50を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；
    (b) SEQ ID NO：33を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：34を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：36を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：58を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；
    (c) SEQ ID NO：38を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：60を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；
    (d) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：62を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；または
    (e) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：47を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：63を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：64を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
    のうち1つを含む、請求項4記載の方法。
  6. 前記試験サンプルが、哺乳類対象から得られた生体サンプルである、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記生体サンプルが、全血、血清、血漿、尿、または脳脊髄液を含む、請求項6記載の方法。
  8. 前記試験サンプルが、補体阻害剤を含み、
    前記補体阻害剤が、代替補体経路阻害剤、プロ因子D成熟阻害剤、またはMASP-3阻害剤から選択される、請求項1～7のいずれか一項記載の方法。
  9. 前記哺乳類対象が、補体阻害剤で処置されたことがあり、
    前記補体阻害剤は、代替補体経路阻害剤、プロ因子D成熟阻害剤、またはMASP-3阻害剤から選択される、前記イムノアッセイを用いて代替経路の阻害の程度が測定される、請求項6記載の方法。
  10. 前記哺乳類対象がヒト対象である、請求項6記載の方法。
  11. 前記ヒト対象が、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有するか、またはそれを有する疑いがある、請求項10記載の方法。
  12. 前記代替経路疾患または障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症（PNH）、加齢黄斑変性症（AMD、滲出型AMDおよび萎縮型AMDを含む）、虚血再灌流傷害、関節炎、播種性血管内凝固、血栓性微小血管症（溶血性尿毒症症候群（HUS）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、または移植関連TMAを含む）、喘息、デンスデポジット病、微量免疫型壊死性半月体形成性糸球体腎炎、外傷性脳損傷、誤嚥性肺炎、眼内炎、視神経脊髄炎、ベーチェット病、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス（SLE）、糖尿病網膜症、ぶどう膜炎、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、C3糸球体症、移植拒絶反応、移植片対宿主病（GVHD）、血液透析、敗血症、全身性炎症反応症候群（SIRS）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、ANCA血管炎、抗リン脂質症候群、アテローム動脈硬化症、IgA腎症、および重症筋無力症からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
  13. 哺乳類対象におけるMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片による処置の有効性をモニタリングするための指標を提供する方法であって、
    (a) 第1の時点において、ある用量のMASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片を投与された哺乳類対象から得られた第1の生体サンプルにおける、成熟因子Dの第1の濃度を評価する工程；
    (b) 第2の時点において、該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片で処置された該哺乳類対象から得られた第2の生体サンプルにおける、成熟因子Dの第2の濃度を評価する工程；ならびに
    (c) 工程(a)で評価された成熟因子Dのレベルを、工程(b)で評価された成熟因子Dと比較して、その結果を、該哺乳類対象における該MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の有効性をモニタリングするための指標として提供する工程
    を含む、方法。
  14. 前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の用量を調整するための指標を提供する工程を更に含む、請求項13記載の方法。
  15. 前記第2の生体サンプルにおける成熟因子Dのレベルが、対照または参照標準よりも高い場合に、そのことを前記哺乳類対象に投与される前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片の用量を増加するための指標として提供する、請求項14記載の方法。
  16. 増加された用量の前記MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片が前記哺乳類対象に投与される場合、工程(a)～(c)を繰り返して、該増加された用量が、成熟因子Dのレベルを前記対照または参照標準と比較して所望のレベルに調整するのに十分であるかどうかを判定するための指標として提供する、請求項15記載の方法。
  17. 工程(a)および(b)が、前記第１の生体サンプルおよび前記第２の生体サンプルにおける成熟因子Dの濃度をイムノアッセイで評価することを含む、請求項13記載の方法。
  18. 前記イムノアッセイが、(i) ヒト成熟因子DのN末端領域におけるアミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒトプロ因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記第１の生体サンプルおよび前記第２の生体サンプル中に存在し得るプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）ではなく成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、請求項17記載の方法。
  19. MASP-3阻害抗体またはその抗原結合断片による処置のための、代替経路疾患もしくは障害を患っているか、またはそれを発症するリスクを有する哺乳類対象を選択する指標を提供する方法であって、該対象が、
    該哺乳類対象から採取された1つもしくは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルが、所定の成熟因子Dレベルと比較してまたは1つもしくは複数の対照サンプル中の成熟因子Dレベルと比較して高いかまたは増加している
    と判定された場合に、そのことが処置のために選択される指標となる、方法。
  20. 前記哺乳類対象から採取された1つまたは複数のサンプル中の成熟因子Dのレベルが、成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片の使用を含むイムノアッセイを実施することによって判定される、請求項19記載の方法。
  21. 前記イムノアッセイが、(i) ヒト成熟因子DのN末端領域におけるアミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなるエピトープに特異的に結合し、かつヒトプロ因子Dには結合しない、第1のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と、(ii) ヒト成熟因子Dおよびヒトプロ因子Dの両方に共通のエピトープに結合する第2の抗体またはその抗原結合断片とを含み、該第1および第2の抗体またはその抗原結合断片が、該イムノアッセイにおいて共に機能して、前記サンプル中に存在し得るプロ因子Dタンパク質（SEQ ID NO：2）ではなく成熟因子Dタンパク質（SEQ ID NO：3）を特異的に検出するかまたはその量を定量する、請求項20記載の方法
  22. 試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を判定する方法であって、
    (a) インビトロイムノアッセイにおいて、試験サンプルを成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程；および
    (b) 成熟因子Dに結合した該抗体またはその抗原結合断片の存在もしくは不存在または量を検出する工程であって、該結合の存在が該サンプル中の成熟因子Dの存在または量を示す、工程
    を含み、
    該成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）として示される成熟因子DのN末端領域におけるエピトープに結合する、方法。
  23. イムノアッセイにおいて、ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）を特異的に検出または定量する少なくとも1つのモノクローナル抗体を含むキットであって、該少なくとも1つのモノクローナル抗体が、ヒト成熟因子Dのアミノ末端を包含するエピトープに特異的に結合する成熟因子D特異的モノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片であって、該エピトープが、アミノ酸ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかもしくはそれからなり、該抗体がヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、抗体またはその抗原結合断片を含む、キット。
  24. ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）およびヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）の両方に共通のエピトープに結合する抗因子D抗体またはその抗原結合断片を更に含む、請求項23記載のキット。
  25. 前記イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）である、請求項23または24記載のキット。
  26. 前記成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、コーティング抗体である、請求項23記載のキット。
  27. 前記成熟因子D特異的モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が、検出抗体である、請求項23記載のキット。
  28. ヒト成熟因子Dのアミノ末端領域におけるエピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該エピトープが、アミノ酸配列ILGGREA（SEQ ID NO：5）を含むかまたはそれからなる、単離された抗体またはその抗原結合断片。
  29. ヒト成熟因子D（SEQ ID NO：3）に特異的に結合し、かつヒトプロ因子D（SEQ ID NO：2）には結合しない、請求項28記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  30. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項28または29記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  31. ヒト成熟因子Dに特異的に結合する前記抗体またはその抗原結合断片が、以下の6つのCDR：(a) アミノ酸配列XSXMGVS（SEQ ID NO：65）を含むHC-CDR1（配列中、1位のXはT、IまたはSであり、3位のXはGまたはIである）；(b) アミノ酸配列HIYWDDEKHYXPSLKX（SEQ ID NO：66）を含むHC-CDR2（配列中、11位のXはHまたはNであり、16位のXはSまたはRである）；(c) アミノ酸配列RYYGYXXXMXY（SEQ ID NO：67）を含むHC-CDR3（配列中、6位のXはR、GまたはNであり、7位のXはSまたはYであり、8位のXはF、IまたはVであり、10位のXはDまたはHである）；(d) アミノ酸配列RSXXSIXHSNGNTYXE（SEQ ID NO：68）を含むLC-CDR1（配列中、3位のXはNまたはSであり、4位のXはQまたはEであり、7位のXはVまたはLであり、15位のXはFまたはLである）；(e) アミノ酸配列KVXNRFS（SEQ ID NO：69）を含むLC-CDR2（配列中、3位のXはSまたはYである）；および(f) アミノ酸配列FQGSHVPPT（SEQ ID NO：54）を含むLC-CDR3を含む結合ドメインを含む、請求項28～30のいずれか一項記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  32. 前記結合ドメインが、以下のCDRのセット：
    (a) SEQ ID NO：25を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：27を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：29を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：50を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；
    (b) SEQ ID NO：33を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：34を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：36を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：58を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；
    (c) SEQ ID NO：38を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：60を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；
    (d) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：41を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：62を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：52を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3；あるいは
    (e) SEQ ID NO：43を含むHC-CDR1、SEQ ID NO：39を含むHC-CDR2、SEQ ID NO：47を含むHC-CDR3、SEQ ID NO：63を含むLC-CDR1、SEQ ID NO：64を含むLC-CDR2、およびSEQ ID NO：54を含むLC-CDR3
    のうち1つを含む、請求項31記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  33. 請求項28～32のいずれか一項記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
  34. 請求項28～32のいずれか一項記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域のCDRをコードする、核酸分子。
  35. 請求項28～32のいずれか一項記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片を含む、イムノアッセイにおいて使用するための基材。
  36. (a)少なくとも1つの容器と、(b)請求項28～32のいずれか一項記載のヒト成熟因子Dに特異的に結合する少なくとも1つの抗体またはその抗原結合断片とを含む、試験サンプル中の成熟因子Dの存在または量を検出するためのキット。
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