JP7627000B1 - Recombinant Proteins and Anticancer Therapeutics - Google Patents
Recombinant Proteins and Anticancer Therapeutics Download PDFInfo
- Publication number
- JP7627000B1 JP7627000B1 JP2023212079A JP2023212079A JP7627000B1 JP 7627000 B1 JP7627000 B1 JP 7627000B1 JP 2023212079 A JP2023212079 A JP 2023212079A JP 2023212079 A JP2023212079 A JP 2023212079A JP 7627000 B1 JP7627000 B1 JP 7627000B1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lectin
- site
- bitter melon
- recombinant
- rip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 25
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims abstract description 140
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims abstract description 140
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims abstract description 140
- 244000302512 Momordica charantia Species 0.000 claims abstract description 97
- 235000009811 Momordica charantia Nutrition 0.000 claims abstract description 97
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 11
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 11
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 12
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 abstract description 11
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 abstract description 5
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 11
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 235000008322 Trichosanthes cucumerina Nutrition 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 5
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002946 anti-pancreatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
【課題】癌治療に用いることができる組換えタンパク質及び抗癌治療薬を提供すること。
【解決手段】組換えタンパク質は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える。前記細胞障害活性部位は、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）である。（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位のアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）前記（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞障害活性を有するタンパク質。
【選択図】図１
The present invention provides a recombinant protein and an anti-cancer therapeutic agent that can be used in cancer treatment.
[Solution] The recombinant protein comprises a lectin site and a cytotoxic activity site. The cytotoxic activity site is, for example, the following (a) or (b): (a) a protein consisting of an amino acid sequence in which the 111th phenylalanine is replaced with tyrosine and the 163rd lysine is replaced with arginine in the amino acid sequence of the RIP site contained in bitter melon lectin. (b) a protein consisting of the amino acid sequence of (a) in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having cytotoxic activity.
[Selected Figure] Figure 1
Description
本開示は組換えタンパク質及び抗癌治療薬に関する。 The present disclosure relates to recombinant proteins and anti-cancer therapeutic agents.
ゴーヤレクチンは、レクチン部位と、ＲＩＰ（Ribosome inactivating protein）部位とを備える。レクチン部位と、ＲＩＰ部位とは、ジスルフィド結合により連結されている。レクチン部位は、Ｈ抗原結合特性を有し、特定の細胞に結合する。特許文献１に記載されているように、ゴーヤレクチンは様々な用途に用いられる。 Bitter melon lectin has a lectin site and a RIP (ribosome inactivating protein) site. The lectin site and the RIP site are linked by a disulfide bond. The lectin site has H antigen binding properties and binds to specific cells. As described in Patent Document 1, bitter melon lectin is used for various purposes.
癌細胞に特有の糖鎖を認識し、癌細胞に結合するレクチン部位と、癌細胞に対する細胞障害活性を有する細胞障害活性部位とを備えるタンパク質は、癌治療に用いることができる。しかしながら、ゴーヤレクチンが備えるＲＩＰ部位は細胞障害活性を有さないので、ゴーヤレクチンは、そのままでは、癌治療に用いることができない。 Proteins that have a lectin site that recognizes glycans specific to cancer cells and binds to cancer cells, and a cytotoxic activity site that has cytotoxic activity against cancer cells, can be used in cancer treatment. However, the RIP site in bitter melon lectin does not have cytotoxic activity, so bitter melon lectin cannot be used as it is in cancer treatment.
本開示の１つの局面では、癌治療に用いることができる組換えタンパク質及び抗癌治療薬を提供することが好ましい。 In one aspect of the present disclosure, it is preferable to provide a recombinant protein and an anti-cancer therapeutic agent that can be used in cancer treatment.
本開示の１つの局面は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える組換えタンパク質である。本開示の１つの局面である組換えタンパク質は、癌治療に用いることができる。 One aspect of the present disclosure is a recombinant protein having a lectin site and a cytotoxic activity site. The recombinant protein of one aspect of the present disclosure can be used in cancer treatment.
本開示の別の局面は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える組換えタンパク質を含む抗癌治療薬である。本開示の別の局面である抗癌治療薬は、癌治療に用いることができる。 Another aspect of the present disclosure is an anti-cancer therapeutic agent comprising a recombinant protein having a lectin site and a cytotoxic activity site. The anti-cancer therapeutic agent, which is another aspect of the present disclosure, can be used in cancer treatment.
本開示の例示的な実施形態について図面を参照しながら説明する。
１．組換えタンパク質の構成
本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位と、細胞障害活性部位と、を備える。 レクチン部位と、細胞障害活性部位とは、例えば、ジスルフィド結合により連結されている。
Exemplary embodiments of the present disclosure will now be described with reference to the drawings.
1. Structure of the Recombinant Protein The recombinant protein of the present disclosure comprises a lectin site and a cytotoxic activity site. The lectin site and the cytotoxic activity site are linked by, for example, a disulfide bond.
細胞障害活性部位は、例えば、以下の（ａ）又は（ｂ）である。
（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位のアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質。
The cytotoxic activity site is, for example, the following (a) or (b):
(a) A protein consisting of an amino acid sequence in which the 111th phenylalanine is replaced with tyrosine and the 163rd lysine is replaced with arginine in the amino acid sequence of the RIP site contained in bitter melon lectin.
（ｂ）前記（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞障害活性を有するタンパク質。
レクチン部位は、例えば、ゴーヤレクチンに含まれるレクチン部位である。レクチン部位は、Ｈ抗原を認識し、癌細胞と特異的に結合する。レクチン部位は、例えば、ヒト膵癌細胞株Ｃａｐａｎ－１（以下ではＣａｐａｎ－１細胞とする）と特異的に結合する。レクチン部位は、例えば、Ｃａｐａｎ－１細胞の特異的糖鎖に結合する。
(b) A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids in (a) have been deleted, substituted or added, and which has cytotoxic activity.
The lectin site is, for example, a lectin site contained in bitter melon lectin. The lectin site recognizes H antigen and specifically binds to cancer cells. The lectin site specifically binds, for example, to human pancreatic cancer cell line Capan-1 (hereinafter referred to as Capan-1 cells). The lectin site binds, for example, to a specific sugar chain of Capan-1 cells.
２．組換えタンパク質が奏する効果
本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位を備える。レクチン部位はＨ抗原を認識し、癌細胞に特異的に結合する。本開示の組換えタンパク質は、細胞障害活性部位を備える。そのため、本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位が結合する癌細胞に対し、細胞障害活性を有する。本開示の組換えタンパク質は、レクチン部位が結合しない細胞に対しては、細胞障害活性が低い。
2. Effects of the Recombinant Protein The recombinant protein of the present disclosure has a lectin site. The lectin site recognizes the H antigen and specifically binds to cancer cells. The recombinant protein of the present disclosure has a cytotoxic activity site. Therefore, the recombinant protein of the present disclosure has cytotoxic activity against cancer cells to which the lectin site binds. The recombinant protein of the present disclosure has low cytotoxic activity against cells to which the lectin site does not bind.
レクチン部位が特異的に結合する癌細胞は、例えば、Ｃａｐａｎ－１細胞である。その場合、本開示の組換えタンパク質は、Ｃａｐａｎ－１細胞に対し、細胞障害活性を有する。 The cancer cells to which the lectin site specifically binds are, for example, Capan-1 cells. In this case, the recombinant protein of the present disclosure has cytotoxic activity against Capan-1 cells.
本開示の組換えタンパク質は、例えば、癌治療に用いることができる。本開示の抗癌治療薬は、本開示の組換えタンパク質を含む。本開示の組換えタンパク質は、例えば、膵癌治療に用いることができる。本開示の抗癌治療薬は、例えば、抗膵癌治療薬である。 The recombinant protein of the present disclosure can be used, for example, in cancer treatment. The anti-cancer therapeutic agent of the present disclosure includes the recombinant protein of the present disclosure. The recombinant protein of the present disclosure can be used, for example, in pancreatic cancer treatment. The anti-cancer therapeutic agent of the present disclosure is, for example, an anti-pancreatic cancer therapeutic agent.
３．実施例
（１）ゴーヤレクチンｃＤＮＡの単離
（１ａ）市販のゴーヤ種子を、水を含ませた不織布の上で発芽させた。次に、発芽した芽を採取した。次に、採取した芽を液体窒素で凍らせた。次に、凍らせた芽を乳鉢ですりつぶした。
3. Examples (1) Isolation of bitter melon lectin cDNA (1a) Commercially available bitter melon seeds were germinated on a nonwoven cloth soaked in water. The germinated sprouts were then harvested. The harvested sprouts were then frozen in liquid nitrogen. The frozen sprouts were then crushed in a mortar.
（１ｂ）前記（１ａ）ですりつぶした芽から、RNeasy mini kit（Qiagen）を用い、そのプロトコルに従ってＲＮＡを抽出した。
（１ｃ）前記（１ｂ）で抽出したＲＮＡから、RT kit（Takara）を用い、そのプロトコルに従って、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、配列番号１のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号２のリバースプライマー（Reverse primer）とを用い、ＰＣＲ法により増幅した。なお、図５に配列番号１～２の塩基配列を示す。
(1b) RNA was extracted from the sprouts ground in (1a) above using an RNeasy mini kit (Qiagen) according to the protocol.
(1c) cDNA was synthesized from the RNA extracted in (1b) above using an RT kit (Takara) according to the protocol. The synthesized cDNA was amplified by PCR using a forward primer of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer of SEQ ID NO: 2. The base sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 are shown in FIG. 5.
（１ｄ）前記（１ｃ）で増幅したｃＤＮＡに対し、アガロースゲル電気泳動を行った。次に、Gel extraction kit（Qiagen）用い、そのプロトコルに従って、５０μＬの超純水でｃＤＮＡを回収した。超純水は、超純水製造装置であるMilliQ（登録商標）により製造されたものであった。次に、回収したｃＤＮＡを、制限酵素XhoI及びBamHIで消化した。消化は、３７℃の下で１５時間行った。次に、ｃＤＮＡに対し、再度、アガロース電気泳動を行った。次に、Gel extraction kit（Qiagen）用い、そのプロトコルに従って、５０μＬの超純水でｃＤＮＡを回収した。超純水はMilliQにより製造されたものであった。その結果、ｃＤＮＡを含む産物５０μＬを得た。 (1d) The cDNA amplified in (1c) was subjected to agarose gel electrophoresis. Next, cDNA was recovered with 50 μL of ultrapure water using a Gel extraction kit (Qiagen) according to the protocol. The ultrapure water was produced by MilliQ (registered trademark), an ultrapure water production device. Next, the recovered cDNA was digested with restriction enzymes XhoI and BamHI. Digestion was performed at 37°C for 15 hours. Next, the cDNA was subjected to agarose gel electrophoresis again. Next, cDNA was recovered with 50 μL of ultrapure water using a Gel extraction kit (Qiagen) according to the protocol. The ultrapure water was produced by MilliQ. As a result, 50 μL of product containing cDNA was obtained.
（１ｅ）前記（１ｄ）で得られた産物を、pCAG－Hyg vector（富士フイルム和光純薬）のXhoI／BamHIサイトに挿入してライゲーション反応を生じさせた。
（２）大腸菌への形質転換
（２ａ）１０μＬの大腸菌DH5α株に、前記（１ｅ）におけるライゲーション反応後の溶液０．５μＬを加えた。次に、氷上で２０分間静置した。次に、４２℃のウォーターバスで９０秒間ヒートショックを加えることで、形質転換を行った。
(1e) The product obtained in (1d) above was inserted into the XhoI/BamHI site of pCAG-Hyg vector (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to cause a ligation reaction.
(2) Transformation into E. coli (2a) 0.5 μL of the solution obtained after the ligation reaction in (1e) was added to 10 μL of E. coli DH5α strain. The mixture was then left to stand on ice for 20 minutes. The mixture was then subjected to a heat shock in a water bath at 42° C. for 90 seconds to perform transformation.
（２ｂ）前記（２ａ）の形質転換の後、大腸菌に２００μＬのＳＯＢ培地を添加した。次に、大腸菌を、３７℃にて１０分間培養した。次に、大腸菌を含む培地のうちの２０μＬをＬＢ寒天培地に塗布した。ＬＢ寒天培地は、５０μg／Ｌのハイグロマイシン（Hygromycin）を含んでいた。次に、大腸菌を、３７℃にて一晩培養した。 (2b) After the transformation in (2a), 200 μL of SOB medium was added to the E. coli. The E. coli was then cultured at 37° C. for 10 minutes. 20 μL of the medium containing the E. coli was then spread onto an LB agar medium. The LB agar medium contained 50 μg/L of hygromycin. The E. coli was then cultured overnight at 37° C.
（３）プラスミド抽出
（３ａ）５０μg／ｍＬのハイグロマイシンを含むＬＢ培地３ｍLに、前記（２ｂ）で培養した大腸菌のコロニーを植菌した。次に、３７℃、３００ｒｐｍの条件下で、８時間振盪培養を行った。
(3) Extraction of Plasmid (3a) The colony of E. coli cultured in (2b) above was inoculated into 3 mL of LB medium containing 50 μg/mL hygromycin, and then cultured with shaking at 37° C. and 300 rpm for 8 hours.
（３ｂ）前記（３ａ）の振盪培養の後、Fast Gene plasmid mini kit（日本ジェネティクス）を用い、そのプロトコルに従って、大腸菌からプラスミドを抽出した。その結果、５０μＬのプラスミド溶液を得た。 (3b) After the shaking culture of (3a), plasmids were extracted from E. coli using a Fast Gene plasmid mini kit (Nihon Genetics) according to the protocol. As a result, 50 μL of plasmid solution was obtained.
（４）トランスフェクション
（４ａ）前記（３ｂ）で得たプラスミド溶液のうちの７μＬと、２４７μＬのOpti－MEM（Gibco）とを混合し、室温で５分間放置することで第１溶液を調製した。前記（３ｂ）で得たプラスミド溶液のうちの７μＬは、約４μｇのプラスミドを含んでいた。
(4) Transfection (4a) 7 μL of the plasmid solution obtained in (3b) was mixed with 247 μL of Opti-MEM (Gibco) and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to prepare a first solution. The 7 μL of the plasmid solution obtained in (3b) contained about 4 μg of plasmid.
（４ｂ）１０μＬのLipofectamine2000Transfection Regent（Thermo Fisher）と、２４０μＬのOpti－MEMとを混合し、室温で５分間放置することで、第２溶液を調製した。
（４ｃ）第１溶液と第２溶液とを混合し、室温で１５分間静置することで、トランスフェクション混合液を調製した。
(4b) 10 μL of Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Thermo Fisher) and 240 μL of Opti-MEM were mixed and allowed to stand at room temperature for 5 minutes to prepare a second solution.
(4c) The first solution and the second solution were mixed and allowed to stand at room temperature for 15 minutes to prepare a transfection mixture.
（４ｄ）Ｄ１０培地を用い、６ウェルプレート（Iwaki）にて、３７℃の下で、HEK293細胞を一晩培養した。次に、６ウェルプレートから、アスピレーターを用いてＤ１０培地を除去した。次に、６ウェルプレートに、新しいＤ１０培地１．５ｍLと、前記（４ｃ）で調製したトランスフェクション混合液５００μＬとを加えた。次に、３７℃の下で、５％ＣＯ２存在下にて、HEK293細胞を４８時間培養した。 (4d) HEK293 cells were cultured overnight in a 6-well plate (Iwaki) at 37°C using D10 medium. Next, the D10 medium was removed from the 6-well plate using an aspirator. Next, 1.5 mL of fresh D10 medium and 500 μL of the transfection mixture prepared in (4c) were added to the 6-well plate. Next, HEK293 cells were cultured for 48 hours at 37°C in the presence of 5% CO2 .
（４ｅ）HEK293細胞にトリプシン（tryprin）－エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を加えて５分間処理した。次に、ピペッティングにより、６ウェルプレートからHEK293細胞を剥がした。次に、HEK293細胞を含む細胞懸濁液を回収した。 (4e) Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) solution was added to the HEK293 cells and treated for 5 minutes. Next, the HEK293 cells were detached from the 6-well plate by pipetting. Next, the cell suspension containing the HEK293 cells was collected.
（４ｆ）前記（４ｅ）で回収した細胞懸濁液を、４℃、１０００ｒｐｍの条件で５分間遠心した。次に、上清を捨てた。次に、HEK293細胞のペレットを、５０μg／ｍＬのハイグロマイシンを含むＤ１０培地１０ｍＬに懸濁した。その結果、懸濁液が得られた。 (4f) The cell suspension collected in (4e) above was centrifuged at 4°C and 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was then discarded. The HEK293 cell pellet was then suspended in 10 mL of D10 medium containing 50 μg/mL hygromycin. As a result, a suspension was obtained.
（４ｇ）前記（４ｆ）で得られた懸濁液を、１０ｃｍディッシュに播種した。次に、懸濁液に含まれていたHEK293細胞を、３７℃の下で２週間培養した。培養において、継代は２回であった。 (4g) The suspension obtained in (4f) above was seeded on a 10 cm dish. Next, the HEK293 cells contained in the suspension were cultured at 37°C for two weeks. The culture was passaged twice.
（４ｈ）前記（４ｇ）の培養後、HEK293細胞を１５ｃｍディッシュ３枚に播種した。次に、播種したHEK293細胞について、１週間拡大培養を行った。次に、４℃、１３００ｒｐｍの条件で５分間遠心する工程と、培養上清を回収する工程とを交互に繰り返し、培養上清３００ｍＬを回収した。 (4h) After the culture in (4g), HEK293 cells were seeded onto three 15 cm dishes. The seeded HEK293 cells were then expanded for one week. Next, a process of centrifuging at 4°C and 1300 rpm for 5 minutes and a process of recovering the culture supernatant were alternately repeated, and 300 mL of culture supernatant was recovered.
（５）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの回収
（５ａ）前記（４ｈ）で回収した培養上清のうち１００ｍＬを、カラムに一晩吸着させた。カラムには、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化した５ｍＬのラクトース（Lactose）－セファロース（Sepharose）４Ｂが充填されていた。１０ｍＭのＰＢＳのｐＨは７．４であった。１０ｍＭのＰＢＳは０．１５ＭのＮａＣｌを含んでいた。次に、カラムを、５０ｍＬのＰＢＳで８時間かけて洗浄した。
(5) Recovery of wild-type bitter melon lectin (5a) 100 mL of the culture supernatant recovered in (4h) was adsorbed onto a column overnight. The column was filled with 5 mL of lactose-Sepharose 4B equilibrated with 10 mM phosphate buffer (PBS). The pH of the 10 mM PBS was 7.4. The 10 mM PBS contained 0.15 M NaCl. The column was then washed with 50 mL of PBS for 8 hours.
（５ｂ）前記（５ａ）におけるカラムの洗浄後、０．５Ｍのラクトース（Lactose）－ＰＢＳをカラムに注入し、素早く溶出を行った。このとき、１ｍＬずつ溶出液を回収した。その結果、１０の溶出画分を得た。１０の溶出画分の総量は１０ｍＬであった。１０の溶出画分のそれぞれに、１～１０の画分番号を付した。画分番号は、溶出する順番が早いほど小さい。例えば、最初に溶出した溶出画分の画分番号は１であり、２番目に溶出した溶出画分の画分番号は２である。 (5b) After washing the column in (5a), 0.5 M lactose-PBS was injected into the column and elution was performed quickly. At this time, 1 mL of the eluate was collected at each time. As a result, 10 elution fractions were obtained. The total volume of the 10 elution fractions was 10 mL. Each of the 10 elution fractions was assigned a fraction number from 1 to 10. The earlier the fraction was eluted, the smaller the fraction number. For example, the fraction number of the first eluted fraction was 1, and the fraction number of the second eluted fraction was 2.
溶出液には、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeが含まれる。図１Ａに示すように、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeは、ＲＩＰ部位３Ａと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ａと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ａは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ａのアミノ酸配列は、配列番号９及び図６に示すとおりである。 The eluate contains wild-type bitter melon lectin. As shown in FIG. 1A, wild-type bitter melon lectin contains RIP site 3A and lectin site 5. RIP site 3A and lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. RIP site 3A contains a signal sequence 9 and a PA tag 11. The amino acid sequence of RIP site 3A is as shown in SEQ ID NO: 9 and FIG. 6.
（６）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙの作製
（６ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙとする。組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙを、部位特異的変異導入法により、以下のように作製した。
(6) Preparation of recombinant bitter melon lectin G72Y (6a) A recombinant bitter melon lectin in which the 72nd glycine in the RIP site 3A of the wild-type bitter melon lectin was replaced with tyrosine was named recombinant bitter melon lectin G72Y. The recombinant bitter melon lectin G72Y was prepared by site-directed mutagenesis as follows.
前記（３）で抽出したプラスミドを鋳型とし、配列番号３のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号４のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いて、インバースＰＣＲ法を行った。なお、図５に配列番号３～４の塩基配列を示す。 Using the plasmid extracted in (3) above as a template, inverse PCR was performed using a forward primer of SEQ ID NO: 3 and a reverse primer of SEQ ID NO: 4. The base sequences of SEQ ID NOs: 3 to 4 are shown in Figure 5.
（６ｂ）前記（６ａ）で得られたＰＣＲ反応液２５μＬにDpnII（９U／μＬ）１μＬを添加した。次に、３７℃の下で、２時間制限酵素処理を行った。
（６ｃ）前記（６ｂ）の処理後の産物２μＬを用い、１６℃の下で、１時間セルフライゲーションを行った。
(6b) 1 μL of DpnII (9 U/μL) was added to 25 μL of the PCR reaction solution obtained in (6a) above, followed by restriction enzyme treatment at 37° C. for 2 hours.
(6c) Using 2 μL of the product after the treatment in (6b) above, self-ligation was carried out at 16° C. for 1 hour.
（６ｄ）前記（６ｃ）の処理後の産物を、前記（２）と同様の方法にて、大腸菌DH5α株に形質転換した。次に、５０μg／ｍＬのハイグロマイシン（Hygromicine）添加ＬＢ培地にて、大腸菌を一晩培養した。 (6d) The product after the treatment in (6c) was transformed into Escherichia coli DH5α strain in the same manner as in (2). Next, the Escherichia coli was cultured overnight in LB medium supplemented with 50 μg/mL hygromicine.
（６ｅ）前記（６ｄ）の培養後、培養コロニーから、前記（３）と同様の方法でプラスミドを抽出した。次に、抽出したプラスミドに対しシーケンス解析を行うことで、変異導入を確認した。次に、前記（４）～（５）と同様の方法で、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙを回収した。 (6e) After the cultivation in (6d) above, a plasmid was extracted from the cultured colony in the same manner as in (3) above. Next, the extracted plasmid was subjected to sequence analysis to confirm the introduction of the mutation. Next, the recombinant bitter melon lectin G72Y was recovered in the same manner as in (4) to (5) above.
図１Ｂに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙは、ＲＩＰ部位３Ｂと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｂと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｂは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｂは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換されている。 As shown in FIG. 1B, the recombinant bitter melon lectin G72Y has a RIP site 3B and a lectin site 5. The RIP site 3B and the lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. The RIP site 3B contains a signal sequence 9 and a PA tag 11. In the RIP site 3B, the 72nd glycine is replaced with tyrosine when compared with the RIP site 3A.
（７）組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙとした。
(7) Preparation of Recombinant Bitter Melon Lectin F111Y The recombinant bitter melon lectin, in which the 111th phenylalanine in the RIP site 3A of the wild-type bitter melon lectin was replaced with tyrosine, was named recombinant bitter melon lectin F111Y.
組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号５のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号６のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。なお、図５に配列番号５～６の塩基配列を示す。 The recombinant bitter melon lectin F111Y was basically produced in the same manner as the recombinant bitter melon lectin G72Y. However, when performing the inverse PCR method, a forward primer of SEQ ID NO:5 and a reverse primer of SEQ ID NO:6 were used. The base sequences of SEQ ID NOs:5 to 6 are shown in Figure 5.
図１Ｃに示すように、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙは、ＲＩＰ部位３Ｃと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｃと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｃは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｃは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されている。 As shown in FIG. 1C, the recombinant bitter melon lectin F111Y comprises a RIP site 3C and a lectin site 5. The RIP site 3C and the lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. The RIP site 3C contains a signal sequence 9 and a PA tag 11. In the RIP site 3C, the 111th phenylalanine is replaced with tyrosine when compared to the RIP site 3A.
（８）組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒとした。
(8) Preparation of Recombinant Bitter Melon Lectin K163R A recombinant bitter melon lectin in which the 163rd lysine in the RIP site 3A of the wild-type bitter melon lectin was replaced with arginine was named recombinant bitter melon lectin K163R.
組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号７のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号８のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。 The recombinant bitter melon lectin K163R was basically produced in the same manner as the recombinant bitter melon lectin G72Y. However, when performing the inverse PCR method, a forward primer of sequence number 7 and a reverse primer of sequence number 8 were used.
図１Ｄに示すように、組換えゴーヤレクチンＫ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｄと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｄと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｄは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｄは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。 As shown in FIG. 1D, the recombinant bitter melon lectin K163R has a RIP site 3D and a lectin site 5. The RIP site 3D and the lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. The RIP site 3D contains a signal sequence 9 and a PA tag 11. In the RIP site 3D, the 163rd lysine is replaced with arginine when compared with the RIP site 3A.
（９）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙとした。
(9) Preparation of Recombinant Bitter Melon Lectin G72Y/F111Y The recombinant bitter melon lectin G72Y/F111Y was prepared by substituting glycine at position 72 in the wild-type bitter melon lectin wild-type with tyrosine and phenylalanine at position 111 with tyrosine in the RIP site 3A.
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号５のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号６のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。 The recombinant bitter melon lectin G72Y/F111Y was basically produced in the same manner as the recombinant bitter melon lectin G72Y. However, when performing the inverse PCR method, the plasmid used in the production of the recombinant bitter melon lectin G72Y was used as a template. Furthermore, when performing the inverse PCR method, a forward primer of sequence number 5 and a reverse primer of sequence number 6 were used.
図１Ｅに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙは、ＲＩＰ部位３Ｅと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｅと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｅは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｅは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換され、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換されている。 As shown in FIG. 1E, the recombinant bitter melon lectin G72Y/F111Y has a RIP site 3E and a lectin site 5. The RIP site 3E and the lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. The RIP site 3E contains a signal sequence 9 and a PA tag 11. In the RIP site 3E, the 72nd glycine is replaced with a tyrosine, and the 111th phenylalanine is replaced with a tyrosine, when compared with the RIP site 3A.
（１０）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
(10) Preparation of Recombinant Bitter Melon Lectin G72Y/K163R The recombinant bitter melon lectin was prepared by substituting glycine at position 72 with tyrosine and lysine at position 163 with arginine in the wild-type bitter melon lectin, and named recombinant bitter melon lectin G72Y/K163R.
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号７のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号８のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。 The recombinant bitter melon lectin G72Y/K163R was basically produced in the same manner as the recombinant bitter melon lectin G72Y. However, when performing the inverse PCR method, the plasmid used in the production of the recombinant bitter melon lectin G72Y was used as a template. Furthermore, when performing the inverse PCR method, a forward primer of sequence number 7 and a reverse primer of sequence number 8 were used.
図１Ｆに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｆと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｆと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｆは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｆは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換され、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。 As shown in FIG. 1F, the recombinant bitter melon lectin G72Y/K163R comprises a RIP site 3F and a lectin site 5. The RIP site 3F and the lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. The RIP site 3F contains a signal sequence 9 and a PA tag 11. Compared to the RIP site 3A, the 72nd glycine in the RIP site 3F is replaced with a tyrosine, and the 163rd lysine is replaced with an arginine.
（１１）組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
(11) Preparation of Recombinant Bitter Melon Lectin F111Y/K163R The recombinant bitter melon lectin was prepared by substituting 111th phenylalanine with tyrosine and 163rd lysine with arginine in the wild-type bitter melon lectin wild-type, and named recombinant bitter melon lectin F111Y/K163R.
組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号７のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号８のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。 The recombinant bitter melon lectin F111Y/K163R was basically produced in the same manner as the recombinant bitter melon lectin G72Y. However, when performing the inverse PCR method, the plasmid used in the production of the recombinant bitter melon lectin F111Y was used as a template. Furthermore, when performing the inverse PCR method, a forward primer of sequence number 7 and a reverse primer of sequence number 8 were used.
図１Ｇに示すように、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｇと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｇと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｇは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｇは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換され、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。ＲＩＰ部位３Ｇは、障害活性部位に対応する。ＲＩＰ部位３Ｇのアミノ酸配列は、配列番号１０及び図７に示すとおりである。 As shown in FIG. 1G, the recombinant bitter melon lectin F111Y/K163R comprises a RIP site 3G and a lectin site 5. The RIP site 3G and the lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. The RIP site 3G comprises a signal sequence 9 and a PA tag 11. Compared to the RIP site 3A, the RIP site 3G has a phenylalanine at position 111 substituted with a tyrosine and a lysine at position 163 substituted with an arginine. The RIP site 3G corresponds to the cytotoxic activity site. The amino acid sequence of the RIP site 3G is as shown in SEQ ID NO: 10 and FIG. 7.
（１２）組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、ＲＩＰ部位３Ａでの７２番目のグリシンをチロシンに置換し、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換した組換えゴーヤレクチンを、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒとした。
(12) Preparation of recombinant bitter melon lectin G72Y/F111Y/K163R The recombinant bitter melon lectin was prepared by substituting glycine at position 72 with tyrosine, phenylalanine at position 111 with tyrosine, and lysine at position 163 with arginine in the wild-type bitter melon lectin RIP site 3A, and was named recombinant bitter melon lectin G72Y/F111Y/K163R.
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、基本的には、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙと同様の方法で作製することができた。ただし、インバースＰＣＲ法を行うとき、組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの作製で使用したプラスミドを鋳型とした。また、インバースＰＣＲ法を行うとき、配列番号３のフォワードプライマー（Forward primer）と、配列番号４のリバースプライマー（Reverse primer）とを用いた。 The recombinant bitter melon lectin G72Y/F111Y/K163R was basically produced in the same manner as the recombinant bitter melon lectin G72Y. However, when performing the inverse PCR method, the plasmid used in the production of the recombinant bitter melon lectin F111Y/K163R was used as a template. Furthermore, when performing the inverse PCR method, a forward primer of sequence number 3 and a reverse primer of sequence number 4 were used.
図１Ｈに示すように、組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒは、ＲＩＰ部位３Ｈと、レクチン部位５とを備える。ＲＩＰ部位３Ｈと、レクチン部位５とは、ジスルフィド結合７により連結されている。ＲＩＰ部位３Ｈは、シグナルシークエンス９と、ＰＡタグ１１とを含む。ＲＩＰ部位３Ｈは、ＲＩＰ部位３Ａと比べたとき、７２番目のグリシンがチロシンに置換され、１１１番目のフェニルアラニンがチロシンに置換され、１６３番目のリシンがアルギニンに置換されている。 As shown in FIG. 1H, the recombinant bitter melon lectin G72Y/F111Y/K163R comprises a RIP site 3H and a lectin site 5. The RIP site 3H and the lectin site 5 are linked by a disulfide bond 7. The RIP site 3H contains a signal sequence 9 and a PA tag 11. Compared to the RIP site 3A, the RIP site 3H has glycine at position 72 substituted with tyrosine, phenylalanine at position 111 substituted with tyrosine, and lysine at position 163 substituted with arginine.
（１３）発現確認
（１３ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの発現確認
前記（５）で回収したワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの溶出液を用いて、還元条件下にて、１０％ポリアクリルアミドゲルによるSDS－PAGEを行った。SDS－PAGEとは、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。銀染色と抗PA－tag抗体（NZ－1、Wako）染色とによるウエスタンブロッティングにて、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの溶出確認を行った。
(13) Expression Confirmation (13a) Expression Confirmation of Wild-Type Bitter Melon Lectin The eluate of the wild-type bitter melon lectin recovered in (5) above was subjected to SDS-PAGE using 10% polyacrylamide gel under reducing conditions. SDS-PAGE is sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Elution of the wild-type bitter melon lectin was confirmed by Western blotting using silver staining and anti-PA-tag antibody (NZ-1, Wako) staining.
図２Ａ及び図２ＢにSDS－PAGEの結果を示す。図２Ａは銀染色の結果を示す。図２Ｂはウエスタンブロッティングの結果を示す。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、レーンＭは分子量マーカーを示す。図２Ａ及び図２Ｂにおいて、横方向に並んだ１～１０は、溶出画分の画分番号を示す。画分番号が３～４の溶出画分にピークがあることが確認できた。 Figures 2A and 2B show the results of SDS-PAGE. Figure 2A shows the results of silver staining. Figure 2B shows the results of Western blotting. In Figures 2A and 2B, lane M shows the molecular weight marker. In Figures 2A and 2B, 1 to 10 lined up horizontally show the fraction numbers of the eluted fractions. It was confirmed that there was a peak in the eluted fractions with fraction numbers 3 to 4.
（１３ｂ）各組換えゴーヤレクチンの発現確認
組換えゴーヤレクチンＧ７２Ｙ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ、Ｇ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ（以下では各組換えゴーヤレクチンとする）のそれぞれについて、前記（１３ａ）と同様にして、発現確認を行った。また、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeについても発現確認を行った。発現確認には、画分番号が４である溶出画分を使用した。その結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
(13b) Confirmation of Expression of Each Recombinant Bitter Melon Lectin The expression of each of the recombinant bitter melon lectins G72Y, F111Y, K163R, G72Y/F111Y, G72Y/K163R, F111Y/K163R, and G72Y/F111Y/K163R (hereinafter referred to as each recombinant bitter melon lectin) was confirmed in the same manner as in (13a) above. Expression of wild-type bitter melon lectin was also confirmed. The elution fraction with fraction number 4 was used for expression confirmation. The results are shown in Figures 3A and 3B.
各組換えゴーヤレクチン、及びワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeにおいて、約８０ｋＤａ付近にバンドがあることを確認できた。
（１４）ゴーヤレクチンの濃縮
（１４ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮
前記（５）で回収した溶出画分のうち、画分番号が３～６であるものを、amicon Ultra－4 centrifugal（Merck）に移した。次に、(i)３０００ｒｐｍで３０分間遠心した。次に、(ii)ＰＢＳ溶液を２ｍＬ加えて遠心した。さらに、前記(i)と前記(ii)の処理を交互に繰り返すことにより、最終的に３００μＬの濃縮液を得た。この濃縮液は、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液である。
It was confirmed that each recombinant bitter gourd lectin and the wild-type bitter gourd lectin had a band at approximately 80 kDa.
(14) Concentration of bitter melon lectin (14a) Concentration of wild-type bitter melon lectin Among the eluted fractions collected in (5) above, fractions with fraction numbers 3 to 6 were transferred to an Amicon Ultra-4 centrifugal (Merck). Next, (i) the fractions were centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes. Next, (ii) 2 mL of PBS solution was added and centrifuged. Furthermore, the above-mentioned (i) and (ii) treatments were alternately repeated to finally obtain 300 μL of a concentrated solution. This concentrated solution is a concentrate of wild-type bitter melon lectin.
（１４ｂ）各組換えゴーヤレクチンの濃縮
各組換えゴーヤレクチンについても、前記（１４ａ）と同様にして、濃縮液を得た。
（１５）細胞障害活性の測定
（１５ａ）ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの細胞障害活性の測定
前記（１４ａ）で得たワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液を用い、ＭＴＴアッセイ法により、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する細胞障害活性を測定した。具体的には、以下の操作を行った。
(14b) Concentration of each recombinant bitter melon lectin Concentrates of each recombinant bitter melon lectin were obtained in the same manner as in (14a) above.
(15) Measurement of cytotoxic activity (15a) Measurement of cytotoxic activity of wild-type bitter melon lectin The cytotoxic activity of the wild-type bitter melon lectin obtained in (14a) above was measured by MTT assay against Capan-1 cells.
（イ）第１のコラーゲンコート９６ウェルプレート（Iwaki）に、ＰＢＳを用いて、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの希釈列を作製した。希釈列は、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの濃縮液を１／１０に希釈した溶液と、１／４０に希釈した溶液と、１／１６０に希釈した溶液とにより構成される。 (a) A dilution series of wild-type bitter melon lectin was prepared in a first collagen-coated 96-well plate (Iwaki) using PBS. The dilution series consisted of a solution obtained by diluting the concentrated solution of wild-type bitter melon lectin at 1/10, 1/40, and 1/160.
（ロ）第２のコラーゲンコート９６ウェルプレート（Iwaki）に、Ｃａｐａｎ－１細胞を含む溶液を、１ウェルあたり１００μＬ播種した。Ｃａｐａｎ－１細胞を含む溶液は、牛胎児血清(FBS)を２０％含むイスコフ改変培地で、Ｃａｐａｎ－１細胞の濃度が５．０×１０４細胞／ｍＬとなるように調製した溶液であった。次に、３７℃の下で１２時間培養することで、Ｃａｐａｎ－１細胞をウェルに接着させた。 (b) A solution containing Capan-1 cells was seeded in a second collagen-coated 96-well plate (Iwaki) at 100 μL per well. The solution containing Capan-1 cells was prepared in Iscove's modified medium containing 20% fetal bovine serum (FBS) so that the concentration of Capan-1 cells was 5.0 × 10 4 cells/mL. The plate was then cultured at 37°C for 12 hours to allow the Capan-1 cells to adhere to the wells.
（ハ）前記（ロ）の翌日、前記（ロ）で培養したＣａｐａｎ－１細胞を含む培地９０μＬと、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeの希釈列のうちの１つの溶液１０μＬとを、第３のコラーゲンコート９６ウェルプレートのウェルに添加した。次に、３７℃、５％ＣＯ２存在下で５日間培養した。次に、ウェルから、ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeを含む培地をアスピレーターにより除去した。 (c) On the day after (b), 90 μL of medium containing the Capan-1 cells cultured in (b) and 10 μL of one of the dilution series of wild-type bitter melon lectin were added to wells of a third collagen-coated 96-well plate. Then, the wells were cultured at 37° C. in the presence of 5% CO 2 for 5 days. Then, the medium containing the wild-type bitter melon lectin was removed from the wells using an aspirator.
（二）前記（ハ）において培地を除去した後、ウェルに、溶液を１００μＬ加えた。加えた溶液は、５ｍｇ／ｍＬの3-（4, 5-ジメチル-チアゾール-2-イル）-2, 5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）溶液を、イスコフ改変培地を用いて１０倍に希釈した溶液であった。次に、ＣＯ２インキュベーター内にて、３７℃、５％ＣＯ２存在下で４時間反応させた。 (ii) After removing the medium in (iii), 100 μL of a solution was added to the well. The solution added was a 5 mg/mL 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) solution diluted 10-fold with Iscove's modified medium. The wells were then incubated at 37°C in a CO2 incubator with 5% CO2 for 4 hours.
（ホ）前記（二）の反応終了後、アスピレーターにて培地をウェルから除去した。次に、２００μＬのＰＢＳ溶液にて洗浄を１回行った。次に、ウェルにジメチルスルホキシド（DMSO）溶液を５０μＬ加えてＣａｐａｎ－１細胞を溶解させ、均一な溶液になるまで１５分間、室温で振盪した。 (e) After the reaction in (ii) was completed, the medium was removed from the wells using an aspirator. Next, the wells were washed once with 200 μL of PBS solution. Next, 50 μL of dimethyl sulfoxide (DMSO) solution was added to the wells to dissolve the Capan-1 cells, and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes until a homogenous solution was obtained.
（へ）次に、マイクロプレートリーダー（サーモバイオアナリシスジャパン）を用い、Ｃａｐａｎ－１細胞を含む溶液について、５７０nmの波長吸光度を測定した。測定結果を図４に示す。
（１５ｂ）各組換えゴーヤレクチンの細胞障害活性の測定
ワイルドタイプのゴーヤレクチンwild－typeに代えて、前記（１４ｂ）で得た各組換えゴーヤレクチンの濃縮液を用い、その他の点では前記（１５ａ）と同様にして、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する細胞障害活性を測定した。測定結果を図４に示す。組換えゴーヤレクチンＦ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒの希釈列のうち、希釈倍率が１／１０である溶液を用いた場合に、吸光度が低下した。吸光度が低下することは、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する傷害活性を有することを意味する。
(f) Next, the solution containing Capan-1 cells was measured for absorbance at a wavelength of 570 nm using a microplate reader (Thermo Bioanalysis Japan). The measurement results are shown in FIG.
(15b) Measurement of cytotoxic activity of each recombinant bitter melon lectin Instead of wild-type bitter melon lectin, the concentrate of each recombinant bitter melon lectin obtained in (14b) above was used to measure the cytotoxic activity against Capan-1 cells in the same manner as in (15a) above. The measurement results are shown in FIG. 4. When a solution with a dilution ratio of 1/10 was used in the dilution series of recombinant bitter melon lectin F111Y/K163R, the absorbance decreased. A decrease in absorbance means that the product has cytotoxic activity against Capan-1 cells.
なお、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する傷害活性を有するほど、吸光度が低下する理由は以下のとおりである。Ｃａｐａｎ－１細胞は、ＭＴＴを紫色ホルマザン結晶に還元する酸化還元酵素を含んでいる。紫色ホルマザン結晶は色素である。Ｃａｐａｎ－１細胞の生存数が少ないほど、ＭＴＴは色素へ変換され難く、吸光度は低くなる。よって、Ｃａｐａｎ－１細胞に対する傷害活性を有するほど、吸光度が低下する。
４．他の実施形態
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
The reason why the greater the cytotoxicity against Capan-1 cells, the lower the absorbance is as follows. Capan-1 cells contain an oxidoreductase that reduces MTT to purple formazan crystals. Purple formazan crystals are a pigment. The fewer the viable Capan-1 cells, the less likely MTT is to be converted to a pigment, and the lower the absorbance. Therefore, the greater the cytotoxicity against Capan-1 cells, the lower the absorbance.
4. Other Embodiments Although the embodiments of the present disclosure have been described above, the present disclosure is not limited to the above-described embodiments and can be implemented in various modified forms.
（４－１）上記各実施形態における１つの構成要素が有する機能を複数の構成要素に分担させたり、複数の構成要素が有する機能を１つの構成要素に発揮させたりしてもよい。また、上記各実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記各実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加、置換等してもよい。 (4-1) The function of one component in each of the above embodiments may be shared among multiple components, or the function of multiple components may be performed by one component. Also, part of the configuration of each of the above embodiments may be omitted. Also, at least part of the configuration of each of the above embodiments may be added to or substituted for the configuration of another of the above embodiments.
（４－２）上述した組換えタンパク質の他、当該組換えタンパク質を構成要素とするシステム、組換えタンパク質の製造方法、組換えタンパク質をコードする遺伝子等、種々の形態で本開示を実現することもできる。 (4-2) In addition to the recombinant proteins described above, the present disclosure can be realized in various forms, such as a system that includes the recombinant protein as a component, a method for producing the recombinant protein, and a gene that encodes the recombinant protein.
wild－type…ワイルドタイプのゴーヤレクチン、Ｇ７２Ｙ、Ｆ１１１Ｙ、Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ、Ｇ７２Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ、Ｇ７２Ｙ／Ｆ１１１Ｙ／Ｋ１６３Ｒ…組換えゴーヤレクチン、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ、３Ｈ…ＲＩＰ部位、５…レクチン部位、７…ジスルフィド結合、９…シグナルシークエンス、１１…ＰＡタグ wild-type...wild-type bitter gourd lectin, G72Y, F111Y, K163R, G72Y/F111Y, G72Y/K163R, F111Y/K163R, G72Y/F111Y/K163R...recombinant bitter gourd lectin, 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H...RIP site, 5...lectin site, 7...disulfide bond, 9...signal sequence, 11...PA tag
Claims (2)
前記細胞障害活性部位は、以下の（ａ）又は（ｂ）である組換えタンパク質。
（ａ）ゴーヤレクチンに含まれるＲＩＰ部位の、配列番号９で表されるアミノ酸配列において、１１１番目のフェニルアラニンをチロシンに置換し、１６３番目のリシンをアルギニンに置換したアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）前記（ａ）において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ細胞障害活性を有するタンパク質 The antibody has a lectin site and a cytotoxic activity site ,
A recombinant protein , wherein the cytotoxic activity site is either (a) or (b) below :
(a) a protein having an amino acid sequence in which the 111th phenylalanine is replaced by tyrosine and the 163rd lysine is replaced by arginine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 of the RIP site contained in bitter melon lectin;
(b) a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence in (a) above, and having cytotoxic activity;
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023212079A JP7627000B1 (en) | 2023-12-15 | 2023-12-15 | Recombinant Proteins and Anticancer Therapeutics |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2023212079A JP7627000B1 (en) | 2023-12-15 | 2023-12-15 | Recombinant Proteins and Anticancer Therapeutics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP7627000B1 true JP7627000B1 (en) | 2025-02-05 |
Family
ID=94392253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023212079A Active JP7627000B1 (en) | 2023-12-15 | 2023-12-15 | Recombinant Proteins and Anticancer Therapeutics |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7627000B1 (en) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050084903A1 (en) | 2001-05-22 | 2005-04-21 | Ha-Hyung Kim | Lectin protein prepared from maackia fauriei, process for preparing the same and the use thereof |
| JP2009039006A (en) | 2007-08-07 | 2009-02-26 | Japan Science & Technology Agency | Novel lectin gene |
| JP2009057295A (en) | 2007-08-30 | 2009-03-19 | Miyazakiken Sangyo Shien Zaidan | Cell growth inhibitor, pharmaceutical and food composition, and production method |
| WO2015120058A2 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
| WO2017061449A1 (en) | 2015-10-05 | 2017-04-13 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Method for detecting cancer cells, reagent for introducing substance into cancer cells, and composition for treating cancer |
| JP2023524151A (en) | 2020-05-07 | 2023-06-08 | ユニケム ラボラトリーズ リミテッド | anticancer protein |
-
2023
- 2023-12-15 JP JP2023212079A patent/JP7627000B1/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050084903A1 (en) | 2001-05-22 | 2005-04-21 | Ha-Hyung Kim | Lectin protein prepared from maackia fauriei, process for preparing the same and the use thereof |
| JP2009039006A (en) | 2007-08-07 | 2009-02-26 | Japan Science & Technology Agency | Novel lectin gene |
| JP2009057295A (en) | 2007-08-30 | 2009-03-19 | Miyazakiken Sangyo Shien Zaidan | Cell growth inhibitor, pharmaceutical and food composition, and production method |
| WO2015120058A2 (en) | 2014-02-05 | 2015-08-13 | Molecular Templates, Inc. | Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity |
| WO2017061449A1 (en) | 2015-10-05 | 2017-04-13 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | Method for detecting cancer cells, reagent for introducing substance into cancer cells, and composition for treating cancer |
| JP2023524151A (en) | 2020-05-07 | 2023-06-08 | ユニケム ラボラトリーズ リミテッド | anticancer protein |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chandran T., Sharma A., Vijayan M.，Structural studies on a non-toxic homologue of type II RIPs from bitter gourd: Molecular basis of non-toxicity, conformational selection and glycan structure，J. Biosci.，40(5)，2015年，pp.929-941 |
| Sur S., Ray R. B.，Emerging Potential of Momordica’s Bioactive Phytochemicals in Cancer Prevention and Therapy，Biomed. Pharmacol. J.，16(4)，2023年11月15日，pp.1867-1884 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH08508162A (en) | Expression of heterologous polypeptides in halobacterium | |
| US11046975B2 (en) | Bicistronic expression vector for antibody expression and method for producing antibody using same | |
| JPH09503665A (en) | Endosomal degradation active particles | |
| JPH06505624A (en) | Purification and directional cloning of peptides | |
| JP7026906B2 (en) | Transcriptional regulatory fusion polypeptide | |
| JP7521028B2 (en) | Method for selecting cells based on CRISPR/Cas-controlled incorporation of a detectable tag into a target protein | |
| JPH0376580A (en) | Escherichia coli manifestation vector and production of antiviral protein using the same | |
| Airenne et al. | Recombinant avidin and avidin–fusion proteins | |
| JP7627000B1 (en) | Recombinant Proteins and Anticancer Therapeutics | |
| JPH07501448A (en) | Protein production using 7B2 protein | |
| EP1042467B1 (en) | Non-identical genes and their application in improved molecular adjuvants | |
| CN103360497A (en) | Novel antitumor fusion protein vaccine, and preparation method and application thereof | |
| JP5531290B2 (en) | gene | |
| CN110372780B (en) | Antitumor polypeptide and its application in the field of antitumor | |
| US20100087005A1 (en) | Auxiliary reagent for gene transfer | |
| JPH03259084A (en) | Method for producing thrombin-binding substance | |
| KR102223576B1 (en) | Method for stabilizing EC-SOD by conjugating albumin with it's N-terminal or C-terminal residue | |
| JP3499528B2 (en) | Signal sequence trap method | |
| Dracheva et al. | Expression of Soluble Human Interleukin-2 Receptor α-Chain inEscherichia coli | |
| KR20200080749A (en) | Gene Expression Cassette for Expressing a Target Protein of which Methionine at the N-terminus is Cleaved and Method for Producing the Target Protein Using the Same | |
| CN112480262B (en) | Fusion protein and preparation and application thereof | |
| JP3106188B1 (en) | Host genes and polypeptides involved in plant virus infection | |
| KR101841646B1 (en) | Method for the preparation of AIMP2-DX2 as a target for anti-cancer drug discovery | |
| CN115820618A (en) | SC1-70 antigen truncation body, preparation method and application thereof | |
| JP3752223B2 (en) | Gene encoding lectin protein derived from gorse, protein encoded by the gene, and method for producing the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231215 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20241112 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20241218 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20250107 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20250115 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7627000 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |