JP7612827B2 - 細胞培養物から精製されたラブドウイルスを製造するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、上流及び下流の処理の分野に関し、細胞培養物からラブドウイルス、好ましくは、腫瘍溶解性ラブドウイルス、特に、水疱性口内炎ウイルスを調製し、製造しかつ／又は精製するための方法及びプロセスを提供し、ラブドウイルスを含む医薬組成物を含む。

発明の背景
腫瘍溶解性ウイルスのための製造プロセス設計は、最終原薬及び製剤の幾つかの重要な品質属性を考慮する必要がある。これらの中には、体積当たりに感染性ウイルスの含量が高いこと及び生成物及びプロセスに関連する不純物の許容レベルが低いことがある。製剤中の体積当たりのウイルス含量は、用量当たりに１０^９～１０^１２感染性単位又はゲノム単位の範囲であることができ、下流の精製の間に、少なくとも１桁の活性ウイルスの濃縮が必要である。典型的な生物学的製剤の許容可能な不純物閾値は、例えば、１０ng/用量のホスト細胞ＤＮＡ（ＷＨＯ限界）として依然として適用さる場合があり、必要とされる高い生成物含量と組み合わされた場合、別の重大な課題を提起する。両方の制限は、典型的には、医薬用途のための他の活性ウイルス製品、例えば、ウイルスワクチンに見られるものより数桁厳しい。したがって、商業規模の製造手法は、この所定の目的のために最適化され、新たに開発される必要がある。特に、細胞培養物からラブドウイルスを調製し、製造し又は精製するための改善された方法が必要とされている。

例えば、ＷＯ第２００７／１２３９６１号には、細胞培養物から精製された水疱性口内炎ウイルスを単離するための精製プロセスが開示されている。このプロセスにおいて、細胞培養物は、清澄化及びろ過後に、アニオン交換膜吸着材上にローディングされ、ついで、ウイルスが溶出され、続けて、さらに精製され、ろ過工程が行われる。

発明の概要
本発明は、細胞培養物から精製されたラブドウイルス、例えば、水疱性口内炎ウイルスを得るための方法及びプロセスを提供することにより、上記必要性に対処する。

また、特定の態様に関する任意の実施態様をその特定の態様に関する別の実施態様と組み合わせることもでき、複数の層においても、その特定の態様に対する幾つかの実施態様を含む組み合わせであることができると理解されたい。

第１の態様では、本発明は、細胞培養物においてラブドウイルスを製造する方法であって、
（ｉ）ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、続けて、好ましくは、深層ろ過、接線流ろ過もしくは遠心分離により細胞培養物を清澄化し、上清中のラブドウイルス収集物を回収することにより又は
ｂ．細胞培養物をろ過工程、好ましくは、深層ろ過に供し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、上清中のラブドウイルス収集物を回収することにより、細胞培養物からラブドウイルス収集物を得る工程を含む、方法に関する。

第１の態様に関する一実施態様では、ラブドウイルスは、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルスである。さらに関連する実施態様では、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇは、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、工程（ｉａ）におけるウイルス放出剤は、固体塩又は塩水溶液であり、工程（ｉｂ）におけるウイルス放出剤は、塩水溶液である。さらに関連する実施態様では、工程（ｉａ）において、細胞培養物中の塩濃度を少なくとも約０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５M上昇させ、工程（ｉｂ）における塩水溶液は、少なくとも約０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５Mの濃度を有する。さらに関連する実施態様では、工程（ｉａ）における細胞培養物中の塩濃度の上昇及び工程（ｉｂ）における塩水溶液の濃度は、約０．０１M～約５M、約０．０５M～約５M、約０．１M～約５M、約０．１５M～約５M、約０．２M～約５M、約０．２５M～約５M、約０．３M～約５M、約０．３５M～約５M、約０．４M～約５M、約０．４５M～約５M又は約０．５M～約５Mである。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＮＨ_４Ｃｌ、硫酸ＮＨ_４、酢酸ＮＨ_４又は重炭酸ＮＨ_４である。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ウイルス放出剤は、アミノ酸、好ましくは、極性、酸性又は塩基性アミノ酸、より好ましくは、アルギニンである。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ウイルス放出剤は、硫酸化多糖類、好ましくは、硫酸デキストランである。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、工程（ｉａ）において、ウイルス放出剤を細胞培養物に加えることにより、細胞培養物のイオン強度を好ましくは、少なくとも約０．０１Mもしくは少なくとも約０．０５Mもしくは少なくとも約０．１Mもしくは少なくとも約０．１５Mもしくは少なくとも約０．２Mもしくは少なくとも約０．２５Mもしくは少なくとも約０．３Mもしくは少なくとも約０．３５Mもしくは少なくとも約０．４Mもしくは少なくとも約０．４５Mもしくは少なくとも約０．５M又は約０．０１M～約５Mもしくは約０．０５M～約５Mもしくは約０．１M～約５Mもしくは約０．１５M～約５Mもしくは約０．２M～約５M上昇させ、工程（ｉｂ）において、少なくとも約０．０１Mもしくは少なくとも約０．０５Mもしくは少なくとも約０．１Mもしくは少なくとも約０．１５Mもしくは少なくとも約０．２Mもしくは少なくとも約０．２５Mもしくは少なくとも約０．３Mもしくは少なくとも約０．３５Mもしくは少なくとも約０．４Mもしくは少なくとも約０．４５Mもしくは少なくとも約０．５M又は約０．０１M～約５Mもしくは約０．０５M～約５Mもしくは約０．１M～約５Mもしくは約０．１５M～約５Mもしくは約０．２M～約５Mのイオン強度を有するウイルス放出剤含有水溶液でフィルターをすすぐ。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ラブドウイルスをほ乳類ホスト細胞、好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞中で産生する。さらに関連する実施態様では、ほ乳類ホスト細胞を懸濁液中で培養する。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、細胞培養物においてラブドウイルスを製造する方法は、
（ｉｉ）（場合により）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）（場合により）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）（場合により）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含む。

関連する実施態様では、カチオン交換体は、モノリス、樹脂又は膜である。さらに関連する実施態様では、カチオン交換体は、モノリス吸着材である。

第１の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ラブドウイルスを医薬組成物に製剤化する。

第２の態様では、本発明は、ラブドウイルスに感染させた細胞培養物からラブドウイルスを精製するための方法であって、
（ｉ）ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、続けて、好ましくは、深層ろ過、接線流ろ過もしくは遠心分離により細胞培養物を清澄化し、上清中のラブドウイルス収集物を回収することにより又は
ｂ．細胞培養物をろ過工程、好ましくは、深層ろ過に供し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、上清中のラブドウイルス収集物を回収することにより、細胞培養物からラブドウイルス収集物を得る工程を含む、方法に関する。

第２の態様に関する一実施態様では、ラブドウイルスは、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルスである。さらに関連する実施態様では、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇは、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、工程（ｉａ）におけるウイルス放出剤は、固体塩又は塩水溶液であり、工程（ｉｂ）におけるウイルス放出剤は、塩水溶液である。さらに関連する実施態様では、工程（ｉａ）において、細胞培養物中の塩濃度を少なくとも約０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５M上昇させ、工程（ｉｂ）における塩水溶液は、少なくとも約０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５Mの濃度を有する。さらに関連する実施態様では、工程（ｉａ）における細胞培養物中の塩濃度の上昇及び工程（ｉｂ）における塩水溶液の濃度は、約０．０１M～約５M、約０．０５M～約５M、約０．１M～約５M、約０．１５M～約５M、約０．２M～約５M、約０．２５M～約５M、約０．３M～約５M、約０．３５M～約５M、約０．４M～約５M、約０．４５M～約５M又は約０．５M～約５Mである。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＮＨ_４Ｃｌ、硫酸ＮＨ_４、酢酸ＮＨ_４又は重炭酸ＮＨ_４である。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ウイルス放出剤は、アミノ酸、好ましくは、極性、酸性又は塩基性アミノ酸、より好ましくは、アルギニンである。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ウイルス放出剤は、硫酸化多糖類、好ましくは、硫酸デキストランである。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、工程（ｉａ）において、ウイルス放出剤を細胞培養物に加えることにより、細胞培養物のイオン強度を好ましくは、少なくとも約０．０１Mもしくは少なくとも約０．０５Mもしくは少なくとも約０．１Mもしくは少なくとも約０．１５Mもしくは少なくとも約０．２Mもしくは少なくとも約０．２５Mもしくは少なくとも約０．３Mもしくは少なくとも約０．３５Mもしくは少なくとも約０．４Mもしくは少なくとも約０．４５Mもしくは少なくとも約０．５M又は約０．０１M～約５Mもしくは約０．０５M～約５Mもしくは約０．１M～約５Mもしくは約０．１５M～約５Mもしくは約０．２M～約５M上昇させ、工程（ｉｂ）において、少なくとも約０．０１Mもしくは少なくとも約０．０５Mもしくは少なくとも約０．１Mもしくは少なくとも約０．１５Mもしくは少なくとも約０．２Mもしくは少なくとも約０．２５Mもしくは少なくとも約０．３Mもしくは少なくとも約０．３５Mもしくは少なくとも約０．４Mもしくは少なくとも約０．４５Mもしくは少なくとも約０．５M又は約０．０１M～約５Mもしくは約０．０５M～約５Mもしくは約０．１M～約５Mもしくは約０．１５M～約５Mもしくは約０．２M～約５Mのイオン強度を有するウイルス放出剤含有水溶液でフィルターをすすぐ。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ラブドウイルスをほ乳類ホスト細胞、好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞中で産生する。さらに関連する実施態様では、ほ乳類ホスト細胞を懸濁液中で培養する。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ラブドウイルスに感染させた細胞培養物からラブドウイルスを精製するための方法は、
（ｉｉ）（場合により）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）（場合により）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）（場合により）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含む。

関連する実施態様では、カチオン交換体は、モノリス、樹脂又は膜である。さらに関連する実施態様では、カチオン交換体は、モノリス吸着材である。

第２の態様に関する一実施態様又はその実施態様のいずれかでは、ラブドウイルスを医薬組成物に製剤化する。

第３の態様では、本発明は、水疱性口内炎ウイルスであって、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇがリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられており、前述の態様もしくは実施態様のいずれかの方法に従って製造され又は前述の態様もしくは実施態様のいずれかの方法に従って精製された、水疱性口内炎ウイルスに関する。第３の態様に関する実施態様では、前述の態様もしくは実施態様のいずれかの方法に従って製造され又は前述の態様もしくは実施態様のいずれかの方法に従って精製された水疱性口内炎ウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号：１２と少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のコード配列からなる。第３の態様にさらに関連する実施態様又はその実施態様のいずれかでは、感染性粒子の量は、ＴＣＩＤ_５０/mLにより測定された場合、少なくとも約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９又は少なくとも約１×１０^１０である。

図１：ＬＣＭＶのＧＰでシュードタイプ化された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－ＧＰ）の精製／産生のために行われる上流及び下流プロセス工程を示す例示的なフローチャート。 図２：大規模製造での１×１０^１１ＴＣＩＤ_５０のＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）の用量当たりのプロセス中間体について経時的に選別されたホスト細胞ＤＮＡ純度のバーチャート。上流の清澄化サンプル（ＵＳＰ）を細胞培養物の粗収集物のサンプルを取得し、この粗収集サンプルにＮａＣｌを加え、ついで、遠心分離により粗収集サンプルを清澄化し、ＵＳＰをもたらすことにより得た。続けて、ホスト細胞ＤＮＡ純度をＵＳＰで測定し、ついで、ホスト細胞ＤＮＡ純度を全細胞培養収集物について計算した。プロセスの終わりに得られた無菌ろ過材料は、原薬レベルでのホスト細胞ＤＮＡ純度を示す。 図３：大規模製造での１×１０^１１ＴＣＩＤ_５０のＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）の用量当たりのプロセス中間体について経時的に選別されたホスト細胞タンパク質純度のバーチャート。上流の清澄化サンプル（ＵＳＰ）を細胞培養物の粗収集物のサンプルを取得し、この粗収集サンプルにＮａＣｌを加え、ついで、遠心分離により粗収集サンプルを清澄化し、ＵＳＰをもたらすことにより得た。続けて、ホスト細胞タンパク質純度をＵＳＰで測定し、ついで、ホスト細胞タンパク質純度を全細胞培養収集物について計算した。プロセスの終わりに得られた無菌ろ過材料は、原薬レベルでのホスト細胞タンパク質純度を示す。 図４：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の感染後（ｐ．ｉ．）の示された時点でのＶＳＶ－ＧＰのＴＣＩＤ_５０//mLレベルを示すバーチャート。ＴＣＩＤ_５０/mLレベルを未処理の粗収集物（黒色のバー）又は処理された粗収集物の遠心分離されたサンプルの上清（灰色のバー）のいずれかにおいて決定した。この目的で、粗収集物のサンプルを異なる範囲の添加剤で処理し、ついで、遠心分離により清澄化した。その後、ＴＣＩＤ_５０/mLレベルを遠心分離後の処理された粗収集サンプルの上清中で決定した。粗収集物のＴＣＩＤ_５０レベルを対照３０時間及び４８時間のｐ．ｉ．及び硫酸デキストラン処理についてのみ測定した。 図５：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の感染後のＶＳＶ－ＧＰのゲノム力価/mLレベル（黒色のバー）及びＴＣＩＤ_５０/mL（灰色のバー）を示すバーチャート。ゲノム力価/mLレベル又はＴＣＩＤ_５０/mLレベルを未処理の粗収集物（添加剤なし、遠心分離なし）及び処理された粗収集物サンプルの遠心分離されたサンプルの上清中で決定した。この目的で、粗収集物のサンプルを異なる範囲の添加剤で処理し、ついで、遠心分離により清澄化した。その後、ゲノム力価/mL又はＴＣＩＤ_５０/mLレベルを遠心分離後の処理された粗収集サンプルの上清中で決定した。 図６：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の感染後のＶＳＶ－ＧＰのゲノム力価/mLレベル（黒色のバー）及びＴＣＩＤ_５０/mL（灰色のバー）により測定された場合のＶＳＶ－ＧＰの回収率を示すバーチャート。ゲノム力価/mLレベル又はＴＣＩＤ_５０/mLレベルを未処理の粗収集物（添加剤なし）中で決定し、１００％に設定した。異なる濃度の塩での処理後のＶＳＶ－ＧＰの％ 回収を処理された粗収集サンプルの遠心分離されたサンプルの上清中で測定した。この目的で、粗収集物のサンプルを異なる範囲の塩で処理し、ついで、遠心分離により清澄化した。その後、ゲノム力価/mL又はＴＣＩＤ_５０/mLレベルを遠心分離後の処理された粗収集サンプルの上清中で決定した。 図７Ａ～図７Ｂ：（Ａ）５０Ｌスケールでのプロセス制御データに拡張可能なＶＳＶ－ＧＰ、（Ｂ）４Ｌのプロセス制御データに拡張可能なＶＳＶ－ＧＰの代表的な性能データ。ＴＣＩＤ_５０/mL及びゲノム力価/mLレベルを塩類処理された収集物から出発し、原薬（ＤＳ）で終わる種々のユニット操作工程で測定した。 図８：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の感染後のＶＳＶ－ＧＰのゲノム力価/mLレベル（黒色のバー）及びＴＣＩＤ_５０/mL（灰色のバー）を示すバーチャート。ゲノム力価/mLレベル又はＴＣＩＤ_５０/mLレベルを処理された粗収集サンプルの遠心分離されたサンプルの上清中で決定した。この目的で、粗収集物のサンプルを異なる範囲のＭｇＣｌ_２又はＮａＣｌ_２で処理し、ついで、遠心分離により清澄化した。その後、ゲノム力価/mL又はＴＣＩＤ_５０/mLレベルを遠心分離後の処理された粗収集サンプルの上清中で決定した。 図９：ＨＥＫ２９３Ｆ感染細胞の収集物におけるＶＳＶ－ＧＰの総ＴＣＩＤ_５０を示すバーチャート。全ＴＣＩＤ_５０レベルを（ｉ）粗収集物、（ｉｉ）ヌクレアーゼ処理された粗収集物、（ｉｉｉ）深層ろ過後のヌクレアーゼ処理された粗収集物（清澄化された収集物）、（ｉｖ）０．２５M 塩化ナトリウムを含有するトリスバッファーを使用した第１のフィルターフラッシュ（溶出物）及び（ｖ）０．５M 塩化ナトリウムを含有するトリスバッファーを使用した第２のフィルターフラッシュ（溶出物）と同じランで決定した。

発明の詳細な説明
下記詳細な説明では、本発明の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載される。ただし、主題の技術をこれらの具体的な詳細のうちの幾つかがなくても実施することができることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を不明瞭にしないように、周知の構造及び技術は詳細に示されていない。見出しは、読解を助けるために単に便宜上含まれており、本発明を特定の態様又は実施態様に限定すると理解されるべきではない。

本発明者らは、驚くべきことに、本発明の方法又はプロセスに従うことにより、細胞培養物からのラブドウイルスの回収及び／又は精製が当業者に公知の方法及びプロセスと比較して顕著に改善されることを見出した。本発明者らは、ウイルス放出剤、特に、塩又は硫酸デキストランを収集手順が開始される前に、ラブドウイルスに感染した細胞培養物に直接加えることにより、後続の工程において、細胞培養物から回収可能なラブドウイルスの量が大幅に改善されることを見出した。さらに、ラブドウイルスの回収及び／又は精製は、カチオン交換体上でラブドウイルスを捕捉することによりさらに改善される。回収されたラブドウイルスは、例えば、全ＴＣＩＤ_５０当たり又はＴＣＩＤ_５０/mLでの感染性ウイルス濃度を決定することにより、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法を使用することにより又はｑＰＣＲにより決定された粗上清中のゲノムコピー数/mLに基づいて定量化することができる。

最も広い意味において、本発明は、ラブドウイルス、特に、水疱性口内炎ウイルスを製造するための方法を提供する。一態様では、本発明の方法又はプロセスの実施により、好ましくは、ｃＧＭＰ条件下でのラブドウイルスの調製、産生及び／又は精製が可能となり、体積当たりの総感染性ウイルス又は感染性ウイルスの高い含量がもたらされる。関連する態様では、本発明の方法又はプロセスの実施により、商業目的に十分な、すなわち、商業規模での要求を満たすためのラブドウイルスの調製、産生及び／又は精製が可能となる。この態様に関連して、本発明の方法／プロセスは、好ましくは、少なくとも２Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、６０Ｌ、７０Ｌ、８０Ｌ、９０Ｌ、１００Ｌ、１１０Ｌ、１２０Ｌ、１３０Ｌ、１４０Ｌ、１５０Ｌ、１６０Ｌ、１７０Ｌ、１８０Ｌ、１９０Ｌ又は少なくとも２００Ｌの細胞培養体積を有する細胞培養物で実施される。さらに、この態様に関連して、回収されるラブドウイルスの総量は、ＴＣＩＤ_５０により測定された場合、少なくとも約１０^８～１０^１４の範囲の感染性粒子であることができる。特に、少なくとも約１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３又は１０^１４ＴＣＩＤ_５０により測定された感染性粒子。好ましくは、感染性粒子の量は、ＴＣＩＤ_５０により測定された場合、少なくとも約１０^１３である。さらに、この態様に関連して、回収されるラブドウイルスの量は、ＴＣＩＤ_５０/mLにより測定された場合、少なくとも約１０^８～１０^１１の範囲の感染性粒子であることができる。特に、少なくとも約１０^８、１０^９、１０^１０又は１０^１１ＴＣＩＤ_５０/mLにより測定された感染性粒子。好ましくは、感染性粒子の量は、ＴＣＩＤ_５０/mLで測定された場合、少なくとも約１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９又は少なくとも約９×１０^９である。より好ましくは、感染性粒子の量は、ＴＣＩＤ_５０/mLで測定された場合、少なくとも約１０^１０である。

別の態様では、本発明の方法又はプロセスの実施により、用量当たりに１０ng未満、用量当たりに９ng未満、用量当たりに８ng未満、用量当たりに７ng未満、用量当たりに６ng未満、用量当たりに５ng未満、用量当たりに４ng未満、用量当たりに３ng未満、用量当たりに２ng未満又は用量当たりに１ng未満のホスト細胞ＤＮＡのホスト細胞ＤＮＡレベルがもたらされるであろう。ここで、用量は、１×１０^１１ 総ＴＣＩＤ_５０ウイルスである。好ましくは、用量当たりのホスト細胞ＤＮＡレベルは、用量当たりに１ng未満である。ここで、用量は、１×１０^１１総ＴＣＩＤ_５０ウイルスである。

さらに別の態様では、本発明の方法又はプロセスの実施により、用量当たりに１０μg未満、用量当たりに９μg未満、用量当たりに８μg未満、用量当たりに７μg未満、用量当たりに６μg未満、用量当たりに５μg未満、用量当たりに４μg未満、用量当たりに３μg未満、用量当たりに２μg未満又は用量当たりに１μg未満のホスト細胞タンパク質のホスト細胞タンパク質レベルがもたらされるであろう。ここで、用量は、１×１０^１１総ＴＣＩＤ_５０ウイルスである。好ましくは、用量当たりのホスト細胞タンパク質レベルは、用量当たりに１μg未満である。ここで、用量は、１×１０^１１総ＴＣＩＤ_５０ウイルスである。

別の態様では、本発明の方法又はプロセスの実施により、総ＴＣＩＤ_５０当たりで測定された場合、少なくとも１×１０^１２ＴＣＩＤ_５０、２×１０^１２ ＴＣＩＤ_５０、３×１０^１２ ＴＣＩＤ_５０、４×１０^１２ＴＣＩＤ_５０、５×１０^１２ ＴＣＩＤ_５０、６×１０^１２ ＴＣＩＤ_５０、７×１０^１２ＴＣＩＤ_５０、８×１０^１２ ＴＣＩＤ_５０、９×１０^１２ ＴＣＩＤ_５０、１×１０^１３ＴＣＩＤ_５０、１．５×１０^１３ ＴＣＩＤ_５０、２×１０^１３ ＴＣＩＤ_５０、２．５×１０^１３ＴＣＩＤ_５０、３×１０^１３ ＴＣＩＤ_５０又は３．５×１０^１３ ＴＣＩＤ_５０の感染力価の原薬収量がもたらされるであろう。好ましくは、２００Ｌの上流スケールでの本発明の方法又はプロセスの実施により、ＴＣＩＤ_５０当たりで測定された場合、少なくとも１×１０^１３ＴＣＩＤ_５０の感染力価の原薬収量がもたらされるであろう。

第１の工程において、ホスト細胞をラブドウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルスに感染させる。ホスト細胞の感染は、当業者に日常的に利用可能な技術により行われ、通常、特定の感染多重度でのラブドウイルスシードによる細胞培養物への接種を含む。好ましくは、感染を１．０～２．０×１０^６個 細胞/mLの範囲の生細胞密度で行う。ついで、細胞培養物を十分なラブドウイルス複製を可能にする期間、すなわち、ラブドウイルスの複製を可能にする条件下で培養する。ラブドウイルスの複製を可能にする正確な条件は、特定のホスト細胞系統に従って、当業者により選択される。好ましくは、細胞を例えば、０．０００５（又は１０，０００個の細胞当たりに５個の感染性粒子）の低い感染多重度で、マスターシードウイルスを使用して感染させる。このため、当業者であれば、第１の工程において、本発明の方法は、ラブドウイルスに適したホスト細胞の感染及びラブドウイルスの複製を可能にする条件下での感染ホスト細胞の培養を含むであろうことを理解するであろう。

ホスト細胞は、任意の起源のものであることができ、単離された細胞として又は細胞集団に含まれる細胞として存在することができる。ラブドウイルスを産生するホスト細胞は、ほ乳類細胞であるのが好ましい。代替的には、ホスト細胞は、ヒト細胞、サル細胞、マウス細胞又はハムスター細胞であることができる。当業者であれば、所定の細胞がウイルスを産生するかどうか、このため、特定のホスト細胞を本発明の範囲内で使用することができるかどうかを試験する際に使用するのに適した方法を知っている。この点において、ホスト細胞により産生されるウイルスの量は、特に限定されない。好ましいウイルス力価は、さらに下流の処理を行うことなく、感染後の所定の培養細胞物の粗上清中に、１×１０^７以上 ＴＣＩＤ_５０/mL又は１×１０^８以上 ゲノムコピー数/mLである。

一実施態様では、ほ乳類細胞は、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ細胞、任意のＨＥＫ２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞もしくはベロ細胞又は骨髄由来腫瘍浸潤細胞（ＢＭ－ＴＩＣ）である。例えば、懸濁液中で既に自然に増殖しなくなっている場合、ホスト細胞を懸濁液中で増殖に適合させることにより、懸濁液中のホスト細胞を培養するのが好ましい。好ましい実施態様では、ホスト細胞は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞系統由来のＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞のいずれかである。好ましくは、ＨＥＫ２９３Ｆ又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、動物成分を含まずかつ化学的に規定された条件下での撹拌タンク又はウェーブバイオリアクタシステム内において、懸濁液バッチモードで培養される。

本発明の意味におけるホスト細胞は、複製不能なベクターからのラブドウイルスの産生のための古典的なパッケージング細胞及び複製可能なベクターからのラブドウイルスの産生のための産生細胞を含む。パッケージング細胞は、通常、パッケージングされる各ベクターに欠けておりかつ／又はウイルスの産生に必要な必須遺伝子の発現のための１種以上のプラスミドを含む。このような細胞は、所望の目的に適した適切な細胞系統を選択することができる当業者に公知である。

一実施態様では、ホスト細胞系統は、ＨＥＫ２９３細胞である。本明細書で使用する場合、「ＨＥＫ２９３細胞又はＨＥＫ２９３細胞系統」という用語は、ヒト胚性腎に由来し、１９７３年に、第１９染色体におけるＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子を含む４kbpのアデノウイルス５（ａｄ５）ゲノムフラグメントのインテグレーションにより最初に不死化された接着性ヒト細胞系統を指す（Graham et al., J. Gen. Virol. (1977) 36: 59-72；Malm et al., Nature research, Scientific Reports (220) 10:18996）。この細胞系統は、例えば、ＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから得ることができる（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－１５７３；ＤＳＭＺ Ｎｏ：ＡＣＣ３０５；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿００４５）。特に、バイオリアクター中での治療用タンパク質又はウイルスの大規模培養及びバイオ生産を可能にするために、親ＨＥＫ２９３細胞系統は、無血清培地中での高密度懸濁増殖にも適合されている。これらは、工業的に関連する懸濁細胞系統ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ及びFreeStyle ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞を含むが、これらに限定されない。FreeStyle ＨＥＫ２９３－Ｆ細胞は、FreeStyle（商標）２９３発現培地中の懸濁培養に適合されており、例えば、ThermoFisherから入手可能である（Ｒ７９００７；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｄ６０３）。ＨＥＫ２９３－Ｆ及びＨＥＫ２９３－Ｈ細胞は、無血清培地（ＳＦＭ）中での急速な増殖、優れたトランスフェクション効率及び高レベルのタンパク質発現のために、ＨＥＫ２９３細胞からのクローン選択から調製され、例えば、ThermoFisherから入手可能である（ＨＥＫ２９３－Ｆ：１１６２５０１９、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿６６４２；ＨＥＫ２９３－Ｈ：１１６３１０１７、ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿６６４３）。ＨＥＫ２９３－Ｈ系統は、変異体であり、血清補充培地中で増殖させた場合、単層培養においてより良好な接着性を示し、プラークアッセイ及び他の足場依存性用途での使用の容易さを示す。ＨＥＫ２９３－Ｆ及びＨＥＫ－２９３－Ｈは、Gibco（登録商標）CD 293培地に適合するように提供されている。他のＨＥＫ２９３細胞系統は、例えば、ＨＥＫ２９３．２ｓｕｓ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３．３）、ＨＥＫ２９３－ＳＦ－３Ｆ６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１２５８５；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿４Ｖ９４）、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（Thermofischer Ａ１４５２７／Ａ１４５２８／１０００４４２０２（cGMP banked）；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ｄ６１５）及びＨＥＫ２９３－Ｓ（Ximbio １５４１５５；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿Ａ７８４）であるが、それらに限定されない。懸濁増殖に適応させたＨＥＫ２９３細胞系統を「２９３細胞、ＳＦＭ適応」と呼ぶこともできる。

ＨＥＫ２９３細胞培養のために、細胞は、例えば、撹拌タンクリアクターに接種するのに十分な細胞が得られるまで、連続バッチモード接種段階において、化学的に規定された培地中で継代される。数回のバッチ継代を、溶解酸素、ｐＨ及び温度を撹拌タンク接種からウイルス収集まで制御しながら、シードウイルスを接種する前に撹拌タンク中で行う。細胞塊の蓄積中の温度は、シードウイルス接種後に使用される温度とは異なる場合があり、通常、３７℃付近である。好ましい実施態様では、温度を感染後に、３７℃から３２℃～３６℃の範囲、より好ましくは、３４℃に変化させる。

一般的には、本発明の方法又はプロセスは、任意のラブドウイルスを調製し、産生し又は精製するのに有用である。好ましい実施態様では、本発明の方法又はプロセスは、ベシクロウイルスを調製し、産生し又は精製するのに使用される。水疱性口内炎ウイルスの調製、産生又は精製が特に好ましい。

ラブドウイルス科は、約１０～１６kbのネガティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する１８属及び１３４種を含む（Walke et al., ICTV Virus Taxonomy Profile: Rhabdoviridae, Journal of General Virology, 99:447-448 (2018)）。

ラブドウイルス科のメンバーの特徴的な特徴は、下記の１つ以上を含む。マトリックス層及び脂質エンベロープにより取り囲まれた螺旋ヌクレオカプシドから構成される、長さ１００～４３０nm及び直径４５～１００nmの弾丸形状又は桿状粒子である。ここで、一部のラブドウイルスは、非エンベロープ繊維状ウイルスを有する。１０．８～１６．１kbのネガティブセンスの一本鎖ＲＮＡは、ほとんどがセグメント化されていない。構造タンパク質である核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び糖タンパク質（Ｇ）をコードする少なくとも５つの遺伝子をコードするゲノム。

本明細書で使用する場合、ラブドウイルスは、アルメンドラウイルス（ａｌｍｅｎｄｒａｖｉｒｕｓ）、キュリオウイルス（ｃｕｒｉｏｖｉｒｕｓ）、サイトラブドウイルス、ジコールハウイルス（ｄｉｃｈｏｒｈａｖｉｒｕｓ）、エフェメロウイルス、ハパウイルス（Ｈａｐａｖｉｒｕｓ）、レダンテウイルス（ｌｅｄａｎｔｅｖｉｒｕｓ）、リッサウイルス、ノビラドウイルス、ヌクレオラブドウイルス、ペラブドウイルス（ｐｅｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、シグマウイルス、スプリビウイルス、スリプウイルス（ｓｒｉｐｕｖｉｒｕｓ）、チブロウイルス、ツパウイルス（ｔｕｐａｖｉｒｕｓ）、バリコサウイルス又はベシクロウイルスの属に属する場合がある。

本明細書で言及された属の中で、ラブドウイルスは、列記された種のいずれかに属する場合がある。アルメンドラウイルスの属は、アルボレタムアルメンドラウイルス、バルサアルメンドラウイルス、クーツベイ（Ｃｏｏｔ Ｂａｙ）アルメンドラウイルス、プエルトアルメンドラスアルメンドラウイルス、リオチコアルメンドラウイルスを含む。キュリオウイルスの属は、クイリノポリスキュリオウイルス、イリリキュリオウイルス、イタカイウナスキュリオウイルス、ロシャンボーキュリオウイルスを含む。サイトラブドウイルスの属は、アルファルファ萎縮サイトラブドウイルス、オオムギ黄変萎縮モザイクサイトラブドウイルス、ブロッコリー壊死性黄変サイトラブドウイルス、コロカシアボボーン病（ｂｏｂｏｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ）関連サイトラブドウイルス、Ｆｅｓｔｕｃａ葉条斑サイトラブドウイルス、レタス壊死性黄変サイトラブドウイルス、レタス黄変斑サイトラブドウイルス、北地ムギモザイクサイトラブドウイルス、ノゲシサイトラブドウイルス１、イチゴクリンクルサイトラブドウイルス、アメリカコムギ縞モザイクサイトラブドウイルスを含む。ジコールハウイルスの属は、コーヒーリングスポットジコールハウイルス、ラン壊疽斑紋ジコールハウイルスを含む。エフェメロウイルスの属は、アドレードリバーエフェメロウイルス、ベリーマエフェメロウイルス、ウシ流行熱エフェメロウイルス、キンベリーエフェメロウイルス、クールピニャエフェメロウイルス、コトンカンエフェメロウイルス、オボジアンエフェメロウイルス、ヤタエフェメロウイルスを含む。ハパウイルスの属は、フランダースハパウイルス、グレイロッジハパウイルス、ハートパークハパウイルス、ジョインジャカカハパウイルス、カメセハパウイルス、ラジョヤハパウイルス、ランドジアハパウイルス、マニトバハパウイルス、マルコハパウイルス、モスケイロハパウイルス、モスリルハパウイルス、Ｎｇａｉｎｇａｎハパウイルス、オルドリバーハパウイルス、パリークリークハパウイルス、ウォンガベルハパウイルスを含む。レダンテウイルスの属は、バウアーダンテウイルス、フィキリニレダンテウイルス、フクオカレダンテウイルス、Ｋａｎｙａｗａｒａレダンテウイルス、カーンキャニオンレダンテウイルス、Ｋｅｕｒａｌｉｂａレダンテウイルス、コレンテレダンテウイルス、クマシレダンテウイルス、ルダンテクレダンテウイルス、マウントエルゴンバットレダンテウイルス、ニシムロレダンテウイルス、Ｎｋｏｌｂｉｓｓｏｎレダンテウイルス、オイタレダンテウイルス、ウハンレダンテウイルス、ヨンジアレダンテウイルスを含む。リッサウイルスの属は、アラバンリッサウイルス、オーストラリアバットリッサウイルス、Ｂｏｋｅｌｏｈバットリッサウイルス、Ｄｕｖｅｎｈａｇｅリッサウイルス、ヨーロッパバット１リッサウイルス、ヨーロッパバット２リッサウイルス、ガンノルワバットリッサウイルス、イコマリッサウイルス、イルクートリッサウイルス、ホジェンドリッサウイルス、ラゴスバットリッサウイルス、リエイダバットリッサウイルス、モコラリッサウイルス、狂犬病リッサウイルス、シモニバットリッサウイルス、ウエストカフカスバットリッサウイルスを含む。ノビラブドウイルスの属は、ヒラメノビラブドウイルス、魚ノビラブドウイルス、サケノビラブドウイルス、ライギョノビラブドウイルスを含む。ヌクレオラブドウイルスの属は、ダツラ葉脈黄変ヌクレオラブドウイルス、ナス斑萎縮ヌクレオラブドウイルス、トウモロコシ条斑ヌクレオラブドウイルス、イラントウモロコシモザイクヌクレオラブドウイルス、トウモロコシモザイクヌクレオラブドウイルス、ジャガイモ黄変萎縮ヌクレオラブドウイルス、コメ黄変萎縮ヌクレオラブドウイルス、ノゲシ網状黄変ヌクレオラブドウイルス、ケシアザミ葉脈黄変ヌクレオラブドウイルス、タロイモ葉脈白化ヌクレオラブドウイルスを含む。ペラブドウイルスの属は、ウナギペラブドウイルス、パーチペラブドウイルス、マスペラブドウイルスを含む。シグマウイルスの属は、Drosophila affinisシグマウイルス、Drosophila ananassaeシグマウイルス、Drosophila immigransシグマウイルス、Drosophila melanogasterシグマウイルス、Drosophila obscuraシグマウイルス、Drosophila tristisシグマウイルス、Muscina stabulansシグマウイルスを含む。スプリビウイルスの属は、コイスプリビウイルス、パイク幼魚スプリビウイルスを含む。スリプウイルスの属は、アルンピバースリプウイルス、チャコスリプウイルス、Ｎｉａｋｈａスリプウイルス、セナマドレイラスリプウイルス、Ｓｒｉｐｕｒスリプウイルスを含む。チブロウイルスの属は、中央コンゴチブロウイルス、ベアトリスヒルチブロウイルス、沿岸平地チブロウイルス、Ｅｋｐｏｍａ１チブロウイルス、Ｅｋｐｏｍａ２チブロウイルス、スウィートウォーターブランチチブロウイルス、チブローガーガンチブロウイルスを含む。ツパウイルスの属は、ダラムツパウイルス、クラマスツパウイルス、ツパイツパウイルスを含む。バリコサウイルスの属は、レタスビッグべイン関連バリコサウイルスを含む。ベシクロウイルスの属は、アラゴアスベシクロウイルス、アメリカバットベシクロウイルス、カラジャスベシクロウイルス、カンディプーラベシクロウイルス、球菌ベシクロウイルス、インディアナベシクロウイルス、イスファハンベシクロウイルス、Ｊｕｒｏｎａベシクロウイルス、マルパイススプリングベシクロウイルス、マラバベシクロウイルス、モートンベシクロウイルス、ニュージャージーベシクロウイルス、ペリネットベシクロウイルス、ピリベシクロウイルス、ラーディベシクロウイルス、Ｙｕｇ Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃベシクロウイルス又はムサウイルスを含む。

好ましくは、本発明の方法又はプロセスに従って調製され、産生され又は精製されたラブドウイルスは、腫瘍溶解性ラブドウイルスである。この点において、腫瘍溶解性は、当技術分野において公知のその通常の意味を有し、ガン細胞に感染し、ガン細胞を溶解する（分解する）が、正常細胞には感染しない（何ら著しく広がらない）ラブドウイルスの能力を指す。好ましくは、腫瘍溶解性ラブドウイルスは、ガン細胞内で複製可能である。腫瘍溶解活性を当業者に公知の種々のアッセイ系において試験することができる（例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014に記載されている）。腫瘍溶解性ラブドウイルスは、特定のタイプのガン細胞のみに感染し、これを溶解することができると理解されたい。また、腫瘍溶解性作用は、ガン細胞のタイプに応じて変化する場合もある。

好ましい実施態様では、ラブドウイルスは、ベシクロウイルスの属に属する。ベシクロウイルス種は、主に、ゲノムの系統発生分析と組み合わせた血清学的手段により定義されている。生物学的特徴、例えば、ホストの範囲及び伝播のメカニズムも、この属内のウイルス種を区別するのに使用される。このように、ベシクロウイルスの属は、完全なＬ配列から推測される最尤樹により十分に支持される、別個の単系統群を形成する。

ベシクロウイルス属内の異なる種に割り当てられたウイルスは、下記特徴のうちの１つ以上を有する場合がある。Ａ）Ｌにおける２０％の最小アミノ酸配列多様性；Ｂ）Ｎにおける１０％の最小アミノ酸配列多様性；Ｃ）Ｇにおける１５％の最小アミノ酸配列多様性；Ｄ）血清学的試験において区別することができること及びＥ）ホスト及び／又は節足動物ベクターにおける差異により証明されるように、異なる生態学的ニッチを占めること。

水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が好ましい。最も好ましい実施態様では、本発明の方法又はプロセスは、水疱性口内炎ウイルスを調製し、産生し又は精製するのに使用され、ここで、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、好ましくは、ＷＥ－ＨＰＩ系統の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。このようなＶＳＶ（ＬＣＭＶのＧＰを有するリコンビナント）は、例えば、ＷＯ第２０１０／０４０５２６号に記載されており、ＶＳＶ－ＧＰと命名されている。

リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰは、ＧＰ１又はＧＰ２であることができる。また、異なるＬＣＭＶ系統由来の糖タンパク質も含まれる。特に、ＬＣＭＶ－ＧＰは、野生型ＬＣＭＶ又はＬＣＭＶ系統ＬＣＭＶ－ＷＥ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰＩ、ＬＣＭＶ－ＷＥ－ＨＰｌｏｐｔに由来することができる。好ましい実施態様では、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子は、配列番号：１に示されるアミノ酸配列又は配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするが、配列番号：１に示されるアミノ酸配列をコードする糖タンパク質ＧＰを含むリコンビナントラブドウイルスの機能的特性は維持される。

水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で通常、少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び糖タンパク質（Ｇ）をコードする。

好ましい実施態様では、水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の機能的変異体を含む水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、配列番号：３に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の機能的変異体を含むリンタンパク質（Ｐ）、配列番号：４に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の機能的変異体を含む大型タンパク質（Ｌ）及び配列番号：５に記載されたアミノ酸配列又は配列番号：５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の機能的変異体を含むマトリックスタンパク質（Ｍ）をコードする。

水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）又は糖タンパク質（Ｇ）の配列に対する修飾を、これらのタンパク質の基本的な機能を失うことなく行うことができることが当業者により理解される。本明細書で使用する場合、このような機能的変異体は、それらの基本的な機能又は活性の全部又は一部を保持する。タンパク質Ｌは、例えば、ポリメラーゼであり、ウイルスの転写及び複製中に必須の機能を有する。その機能的変異体は、この能力の少なくとも一部を保持しなければならない。基本的な機能性又は活性の保持についての良好な指標は、依然として複製可能でありかつ腫瘍細胞に感染可能であるこれらの機能的変異体を含むウイルスの産生の成功である。ウイルスの産生並びに腫瘍細胞への感染及び腫瘍細胞における複製についての試験を当業者に公知の種々のアッセイ系において試験することができる（例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、Muik et al., Cancer Res., 74(13), 3567-78, 2014に記載されている）。

好ましい実施態様では、水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び糖タンパク質（Ｇ）をコードし、ここで、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：４の８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

好ましい実施態様では、水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び糖タンパク質（Ｇ）をコードし、ここで、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：２の９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

さらに好ましい実施態様では、水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で少なくとも水疱性口内炎ウイルスの核タンパク質（Ｎ）、大型タンパク質（Ｌ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）及び糖タンパク質（Ｇ）をコードし、ここで、大型タンパク質（Ｌ）は、配列番号：４の８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、核タンパク質（Ｎ）は、配列番号：２の９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

別の実施態様では、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇは、ダンデノングウイルス（ＤＡＮＤＶ）又はモペラ（ＭＯＰＶ）ウイルスの糖タンパク質により置き換えられている。ダンデノングウイルス（ＤＡＮＤＶ）は、旧世界のアレナウイルスである。今日では、糖タンパク質を含み、利用することができる、当業者に公知の単一の系統のみが存在する。水疱性口内炎ウイルスに含まれるＤＡＮＤＶの糖タンパク質は、７つ以上のグリコシル化部位、特に、７つのグリコシル化部位を有する。例示的な好ましい糖タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＥＵ１３６０３８でアクセス可能なＤＡＮＤＶに含まれるものである。一実施態様では、ＤＡＮＤＶの糖タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号：６に示されるアミノ酸配列又は配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列をコードし、一方、配列番号：６に示されるアミノ酸配列をコードする糖タンパク質を含む水疱性口内炎ウイルスの機能的特性は維持される。モペラウイルス（ＭＯＰＶ）は、旧世界のアレナウイルスである。糖タンパク質を含み、水疱性口内炎ウイルスに含まれる糖タンパク質のドナーとして利用することができる、当業者に公知の複数の系統が存在する。水疱性口内炎ウイルスに含まれるＭＯＰＶの糖タンパク質は、７つ以上のグリコシル化部位、特に、７つのグリコシル化部位を有する。例示的な好ましい糖タンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＹ７７２１７０でアクセス可能なモペラウイルスに含まれるものである。一実施態様では、ＭＯＰＶの糖タンパク質をコードする遺伝子は、配列番号：７に示されるアミノ酸配列又は配列番号：７のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列をコードし、一方、配列番号：７に示されるアミノ酸配列をコードする糖タンパク質を含む水疱性口内炎ウイルスの機能的特性は維持される。

本発明の方法又はプロセスに従って調製され、産生され又は精製されるラブドウイルス、特に、水疱性口内炎ウイルスは、そのゲノム中で更なる遺伝子（リコンビナントラブドウイルス）をコードすることができると理解されたい。これらの遺伝子は、多くの場合、カーゴと呼ばれ、例えば、腫瘍抗原、ケモカイン、サイトカイン又は他の免疫モデュラトリーエレメントを含む。ラブドウイルスにより追加で発現されるカーゴのタイプとは無関係に、このようなカーゴ発現ラブドウイルスを、本発明の方法又はプロセスに従って、調製し、産生し又は精製することができる。このため、最も好ましい実施態様では、水疱性口内炎ウイルスは、本発明の方法又はプロセスに従って調製され、産生され又は精製され、ここで、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている。さらに好ましい実施態様では、水疱性口内炎ウイルスは、本発明の方法又はプロセスに従って調製され、産生され又は精製され、ここで、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられており、ゲノムは、更なるカーゴ、例えば、腫瘍抗原、ケモカイン、サイトカイン又は他の免疫モデュラトリーエレメントをコードする。好ましくは、カーゴは、ＣＣＬ２１又はＣＣＬ２１タンパク質の延長されたｃ末端におけるアミノ酸の欠失及び／もしくは突然変異を特徴とするＣ末端切断型ＣＣＬ２１タンパク質（完全長ＣＣＬ２１のアミノ酸１～７９を有する）である。それにより、グリコサミノグリカン、例えば、ヘパリンへの延長されたｃ末端結合におけるアミノ酸を欠失させかつ／又は変異させることを減らせる。さらに好ましい実施態様では、カーゴは、ＩｇＧ１のＦｃ末端に融合したＣＤ８０の細胞外ドメインを含む融合タンパク質であり、ＣＤ８０Ｆｃ融合タンパク質がもたらされる。最も好ましい実施態様では、カーゴは、配列番号：８又は配列番号：９を含むか又はこれからなるＣＤ８０細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質である。さらに好ましい実施態様では、カーゴは、配列番号：１０又は配列番号：１１を含むか又はこれからなるＣＣＬ２１タンパク質である。ただし、本発明の方法又はプロセスの目的で、本発明者らは、追加のカーゴが方法又はプロセスの実施に影響を及ぼさないことを見出した。したがって、カーゴの性質は、本発明の適用性を限定するものと解釈されるべきではない。

更なる遺伝子をコードするラブドウイルスを当業者に公知の方法に従って産生することができ、（１）細胞にトランスフェクションされたｃＤＮＡ又は（２）ヘルパー細胞にトランスフェクションされたｃＤＮＡの組み合わせ又は（３）感染性もしくは非感染性のリコンビナントラブドウイルスのいずれかを産生するのに必要な残りの成分又は活性をトランスに提供するヘルパー／ミニウイルスにさらに感染させた細胞にトランスフェクションされたｃＤＮＡの使用を含むが、これらに限定されない。これらの方法のいずれか（例えば、ヘルパー／ミニウイルス、ヘルパー細胞系統又はｃＤＮＡトランスフェクションのみ）を使用するのに必要とされる最小成分は、（１）ラブドウイルスのＮタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質によるゲノム（又はアンチゲノム）ＲＮＡのカプシド形成並びに（２）ゲノム又はアンチゲノム（複製中間体）ＲＮＡ等価物の複製のためのシス作用シグナルを含有するＤＮＡ分子である。

複製エレメント又はレプリコンは、ラブドウイルスのリーダー配列及びトレーラー配列を５’端及び３’端に最小限に含むＲＮＡの鎖である。ゲノムの意味では、リーダーは、３’端にあり、トレーラーは、５’端にある。これらの２つの複製シグナル間に配置された任意のＲＮＡが、次に複製されるであろう。リーダー領域及びトレーラー領域は、Ｎタンパク質によるカプシド形成の目的でかつ転写及び複製を開始するのに必要なポリメラーゼ結合のために、最小のシス作用エレメントをさらに含有する必要がある。リコンビナントラブドウイルスを調製するために、Ｇ遺伝子を含有するミニウイルスは、リーダー領域、トレーラー領域及びＧタンパク質のｍＲＮＡを産生するのに適した開始及び終止シグナルを有するＧ遺伝子も含有するであろう。ミニウイルスが、Ｍ遺伝子をさらに含む場合、Ｍタンパク質のｍＲＮＡを産生するのに適した開始及び終止シグナルも存在する必要がある。

リコンビナントラブドウイルスゲノム内に含まれる任意の遺伝子について、その遺伝子は、それらの遺伝子の発現及びタンパク質産物の産生を可能にするであろう適切な転写開始及び終止シグナルに隣接するであろう（Schnell et al., Journal of Virology, p.2318-2323, 1996）。「非感染性」リコンビナントラブドウイルスを産生するために、リコンビナントラブドウイルスは、最小レプリコンエレメント並びにＮ、Ｐ及びＬタンパク質を有する必要があり、Ｍ遺伝子を含有する必要がある。これにより、細胞から発芽するが、非感染性粒子であるウイルス粒子が産生される。「感染性」粒子を産生するために、ウイルス粒子は、例えば、付着タンパク質又はレセプターリガンドの使用により、ウイルス粒子の結合及び融合を媒介することができるタンパク質をさらに含む必要がある。ラブドウイルスのネイティブなレセプターリガンドは、Ｇタンパク質である。

リコンビナントラブドウイルスのアセンブリを可能にするであろう任意の細胞を使用することができる。感染性ウイルス粒子を調製するための１つの方法は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ又は他の適切なバクテリオファージポリメラーゼ、例えば、Ｔ３もしくはＳＰ６ポリメラーゼをコードするプラスミドに適切な細胞系統を感染させることを含む。ついで、細胞をＧ、Ｎ、Ｐ、Ｌ及びＭラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含有する個々のｃＤＮＡでトランスフェクションすることができる。これらのｃＤＮＡにより、リコンビナントラブドウイルス粒子を構築するためのタンパク質が提供されるであろう。細胞を当技術分野において公知の任意の方法によりトランスフェクションすることができる。

また、ラブドウイルスゲノムＲＮＡ等価物を含有する「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」も細胞系統にトランスフェクションされる。感染性リコンビナントラブドウイルス粒子が、感染細胞において溶解性であることが意図される場合には、Ｎ、Ｐ、Ｍ及びＬタンパク質をコードする遺伝子は、任意の異種核酸セグメントと同様に存在する必要がある。感染性のリコンビナントラブドウイルス粒子が、溶解性であることが意図されない場合には、Ｍタンパク質をコードする遺伝子は、ポリシストロン性ＤＮＡに含まれない。「ポリシストロン性ｃＤＮＡ」は、Ｎ、Ｐ及びＬタンパク質をコードする遺伝子を含有する少なくとも転写単位を含むｃＤＮＡを意味する。また、リコンビナントラブドウイルスのポリシストロン性ＤＮＡは、タンパク質変異体もしくはそのポリペプチドフラグメント又は治療用核酸もしくはタンパク質をコードする遺伝子を含有することもできる。代替的には、最初に産生されたウイルス粒子と最初に会合する任意のタンパク質又はそのフラグメントをトランスで供給することができる。

企図されるポリシストロン性ｃＤＮＡは、タンパク質変異体をコードする遺伝子、レポーターをコードする遺伝子、治療用核酸及び／又はＮ－Ｐ－Ｌ遺伝子もしくはＮ－Ｐ－Ｌ－Ｍ遺伝子のいずれかを含有することができる。リコンビナントラブドウイルスを生成する第１の工程は、ｃＤＮＡからのゲノム又はアンチゲノム等価物であるＲＮＡの発現である。ついで、そのＲＮＡは、Ｎタンパク質によりパッケージングされ、ついで、Ｐ／Ｌタンパク質により複製される。このようにして産生されたリコンビナントウイルスを回収することができる。Ｇタンパク質が、リコンビナントＲＮＡゲノムに存在しない場合には、それは、典型的には、トランスで供給される。Ｇ及びＭタンパク質の両方が存在しない場合には、両方ともトランスで供給される。「非感染性ラブドウイルス」粒子を調製するために、細胞にトランスフェクションされたポリシストロン性ｃＤＮＡがラブドウイルスのＮ、Ｐ及びＬ遺伝子のみを含有するであろうことを除いて、手順は、上記と同じであることができる。非感染性ラブドウイルス粒子のポリシストロン性ｃＤＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子をさらに含有することができる。

細胞培養物のトランスフェクション後、全細胞培養物を通常、感染後１～３日で収集する。有利には、本発明の方法／プロセスにより、後続の収集工程のために、全細胞培養物の処理が可能となる。

本発明の方法又はプロセスの第１の代替法では、ラブドウイルス収集物を細胞培養物にウイルス放出剤、例えば、塩又は硫酸デキストランを直接加えることにより、細胞培養物から得る。収集物の粗上清中のＴＣＩＤ_５０又はゲノムコピー数当たりに測定されたウイルス濃度は、要求を満たすのに充分な収量を示唆したが、収集後、説明することができないウイルス濃度の相当な低下が観察されている。これは、ウイルスと細胞、デブリ及び／又は他の細胞培養成分のいずれかとの相互作用によるものである場合があり、ついで、これらのウイルスは、清澄化工程、例えば、深層ろ過、遠心分離又はＴＦＦ後に失われると仮定された。理論に拘束されるものではないが、既にホスト細胞から発芽したウイルス粒子は、細胞表面に静電的に制限される場合があるとさらに考えられる。このため、例えば、ウイルス放出剤により細胞培養物のイオン強度を上昇させることにより、ウイルス粒子を細胞表面から放出させることができる。この仮説を、種々のウイルス放出剤を細胞培養物に加えることにより試験した。

この点において、「ウイルス放出（ｒｅｌｅａｓｅ）剤」又は「ウイルス放出（ｒｅｌｅａｓｉｎｇ）剤」という用語は、収集前に細胞培養物に適用され、それにより、後続の収集工程について、上清中に放出されるウイルスの量（ＴＣＩＤ_５０により測定される）を増大させる－好ましくは、溶液に配合された－作用剤を指す。ウイルス放出剤の作用及び適合性を例えば、収集前の細胞培養物からのサンプルを取得し、サンプルをウイルス放出剤で処理し、続けて、処理されたサンプルを遠心分離し、処理されたサンプルの上清中のウイルスの量（ＴＣＩＤ_５０により測定される）を決定し、それを未処理のサンプルと比較することにより容易に測定することができる。好ましくは、本発明のウイルス放出剤は、ウイルスを（永続的に）不活性化せずもしくは損傷させず、後続の方法／プロセス工程を妨げずかつ／又は後続の方法／プロセス工程中に容易に除去することができる。別の態様は、商品のコストであり、好ましいウイルス放出剤は、費用効率が高く、容易に調達される。一態様では、未処理の細胞培養物と比較して、ウイルス放出剤で処理された細胞培養物から得られたウイルス収集物（ＴＣＩＤ_５０により測定される）は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００倍増加する。好ましくは、未処理の収集物と比較して、ウイルス放出剤で処理された収集物から回収されたウイルスの量（ＴＣＩＤ_５０により測定される）は、少なくとも約１０倍、好ましくは、少なくとも約２５倍、好ましくは、少なくとも約５０倍、好ましくは、少なくとも約７５倍、より好ましくは、少なくとも約１００倍増大する。

本発明の目的で、所望の効果を達成するために必要なウイルス放出剤の量及び／又は適合性を（ｉ）ウイルス放出剤を細胞培養物に加えた後の細胞培養物中のイオン強度の上昇により表現することができるか又は代替的には、（ｉｉ）細胞培養物中のウイルス放出剤の濃度の上昇により表現することができるかのいずれかである。代替法（ｉ）について、本発明の目的で、ついで、細胞培養物に加えられるウイルス放出剤により、細胞培養物中のイオン強度の適切な上昇がもたらされるであろうと理解されるであろう。この文脈において、「イオン強度の上昇」という用語は、ウイルス放出剤の添加後の細胞培養物のイオン強度の上昇を指す。代替法（ｉｉ）について、「ウイルス放出剤濃度の上昇」は、細胞培養物に加えられる特定のウイルス放出剤のみに基づいて計算され、以下の用語「塩濃度の上昇」を準用する。この用語は、ウイルス放出剤としての塩についてより詳細に説明する。

したがって、一態様では、ウイルス放出剤は、好ましくは、溶液中の作用剤である。この作用剤、例えば、本明細書に記載された塩、アミノ酸又は硫酸化多糖類は、それが採用培養物に加えられた後に、細胞培養物のイオン強度を上昇させることが可能であり、それにより、ウイルス粒子の放出を促進する。細胞培養物中のイオン強度の上昇は、少なくとも約０．０１M又は少なくとも約０．０５Mであるべきである。別の実施態様では、細胞培養物中のイオン強度の上昇は、約０．０１M～約１．５M又は約０．０５M～約１．５M、約０．１M～約１．５M、約０．１５M～約１．５M又は約０．２M～約１．５Mである。別の実施態様では、細胞培養物中のイオン強度の上昇は、約０．０１M～約５M又は０．０５M～約５M、約０．１M～約５M、約０．１５M～約５M又は約０．２M～約１．５Mである。好ましい実施態様では、細胞培養物中のイオン強度の上昇は、少なくとも約０．１M又はより好ましくは、少なくとも約０．２Mである。ラブドウイルスのタイプに応じて、ラブドウイルスが永続的に不活化され又は損傷されない限り、イオン強度のさらに高い上昇を達成することができる。このため、約２M、２．５M、３M、３．５M、４M、４．５M又は５Mまでのイオン強度の上昇を細胞培養物中で達成することができる。

溶液のイオン強度は、溶液中のイオンの濃度の尺度であることが公知である。イオン性化合物は、水に溶解し、イオンに解離し、存在する全てのイオンの濃度の関数である溶液のイオン強度をもたらす。

この式において、ｃは、イオンｉのモル濃度（M、mol/L）であり、ｚは、そのイオンの電荷数であり、合計は、溶液中の全てのイオンｎに対して取られる。塩化ナトリウムについて、イオン強度は、濃度に等しいが、ＭｇＳＯ_４等の塩については、イオン強度は、４倍高く、このように、多価イオンは、イオン強度に強く寄与する。さらに、（塩）溶液、例えば、バッファーの所望のイオン強度をどのように調整することができるかも公知であり、（塩）溶液のイオン強度の設定を存在する作用剤、例えば、塩の濃度及びイオン効力に応じて行うことができる。さらに、膨大な数の刊行物及び特許文献が先行技術に存在し、その結果、イオン強度の特定の値又は範囲をハンドブック、モノグラフ等において調べることができる。したがって、当業者であれば、細胞培養物中のイオン強度の必要な上昇をもたらすのに必要なイオン強度を有する（塩）溶液を提供可能である。

好ましくは、ウイルス放出剤を細胞培養物に加えることにより、細胞培養物のイオン強度は、少なくとも約０．０１Mもしくは少なくとも約０．０５M、少なくとも約０．１Mもしくは少なくとも約０．２Mもしくは少なくとも約０．２５Mもしくは少なくとも約０．３Mもしくは少なくとも約０．３５Mもしくは少なくとも約０．４Mもしくは少なくとも約０．４５Mもしくは少なくとも約０．５M又は約０．０１M～約１．５Mもしくは約０．０５M～約１．５Mもしくは約０．１M～約１．５Mもしくは約０．１５M～約１．５Mもしくは約０．２M～約１．５M上昇する。一部の例では、約２M、２．５M、３M、３．５M、４M、４．５M又は５Mまでのイオン強度の上昇を細胞培養中で達成することができる。前述の下限及び範囲のいずれかを上限又は範囲のいずれかと組み合わせることができると理解されるであろう。

「細胞培養物」という用語は、ホスト細胞、ラブドウイルス及び細胞培養培地を含むと理解されたい。ウイルス放出剤、特に、塩又は硫酸デキストランの体積及び／又は濃度は、主に、細胞培養物の体積及び細胞培養物中で達成される最終濃度又はイオン強度により決まる。塩は、固体塩として又は塩水溶液として細胞培養物に加えることができる。塩溶液について、一部の例では、少量の高濃度塩溶液を加えるのが適切である場合があり、一方、他の例では、より低い塩濃度を有するより多量の塩溶液を加えるのが望ましい場合がある。塩溶液を経時的に連続して加えることができ又は細胞培養物に一度に全てを加えることができる。一実施態様では、塩溶液は、１：２０の希釈で、４M ストック溶液で培養物に加えられ、これにより、収集の直前に追加の０．２M ＮａＣｌの濃度上昇がもたらされる。硫酸デキストランについて、少量の高濃度硫酸デキストラン溶液を加えることも適切である場合があり、一方、他の例では、より低濃度のより多量の硫酸デキストラン溶液を加えるのが望ましい場合がある。硫酸デキストラン溶液を経時的に連続して加えることができ又は細胞培養物に一度に全てを加えることができる。一実施態様では、硫酸デキストラン溶液は、収集の直前に培養物に加えられ、これにより、細胞培養物中の１００μg/mlの濃度がもたらされる。ただし、場合によっては、より低い又はより高い濃度の硫酸デキストランを細胞培養物に加える必要がある場合がある。

ウイルス放出剤の効果及び適合性並びに必要とされる濃度を先に説明されているように、当業者により容易に決定することができる。

明らかに、細胞培養物中のウイルス放出剤、特に、塩又は硫酸デキストランは、培養中に形成されている場合があるラブドウイルスの凝集体を溶解するのに役立ち、また、ホスト細胞又はホスト細胞膜からのラブドウイルスの放出を支援する。このため、ウイルス放出剤、特に、塩又は硫酸デキストランを加えることにより、より多量の回収可能なラブドウイルスが上清中に放出される又は後続の工程において捕捉しかつ回収することができる細胞から放出される。

他の硫酸化多糖類、ついで、硫酸デキストランも好ましいことが理解される。より高い硫酸化度を有する硫酸化多糖類が好ましい場合がある。硫酸化多糖類は、硫酸デキストラン、ペントサンポリスルファート、フコイダン及びカラギーナン並びにそれらの各塩を含むことができるが、これらに限定されない。

また、ウイルス放出剤としてアルギニンを使用することにより、上清中に放出されるラブドウイルスの量を改善することができたことが観察された。このため、一実施態様では、ウイルス放出剤は、アルギニンを含有する溶液である。好ましくは、細胞培養物中のアルギニン濃度又は細胞培養物中のイオン強度は、溶液の添加により、少なくとも約０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は少なくとも約０．５M上昇する。他のアミノ酸及びそれらの各塩の使用も企図され、一態様では、アミノ酸及びそれらの各塩、好ましくは、極性アミノ酸、より好ましくは、塩基性又は酸性アミノ酸は、ウイルス放出剤として有用である。最も好ましいアミノ酸は、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン又はチロシンを含むが、これらに限定されない。好ましくは、細胞培養物中のアミノ酸濃度又は細胞培養物中のイオン強度は、アミノ酸の添加により、少なくとも約０．０１M、０．０５Ｍ、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は少なくとも約０．５M上昇する。

本発明の目的で、塩を細胞培養物に加えることにより、塩濃度の上昇が達成されることが重要である。

この文脈において、「塩濃度の上昇」という用語は、常に、細胞培養物に加えられる特定の塩及びこの特定の塩の濃度が上昇するかどうかを指す。

細胞培養物は、培地中に特定のレベルの塩濃度を予め含むことができると理解されたい。細胞培養物中に予め含まれている場合がある塩及び収集のために細胞培養物に加えられる塩は、同じ塩であってもよいし又は異なる塩であってもよい。細胞培養物中の塩及び細胞培養物に加えられる塩が同じである場合、当業者であれば、培地中の存在する塩を考慮に入れて、塩濃度を上昇させるように、十分に濃縮された塩又は塩溶液を調製しなければならないことを理解するであろう。例として、０．１M ＮａＣｌ濃度を予め含む細胞培養物中で０．２Ｍ ＮａＣｌ上昇させる（細胞培養物中の０．３M ＮａＣｌの最終濃度をもたらす）ために、十分に濃縮されたＮａＣｌ塩溶液を、培地中の既存のＮａＣｌ濃度を考慮して調製しなければならない。

一方、細胞培養物が、任意の塩を含まないか又は細胞培養物に加えられる塩とは異なる塩を含む場合には、塩濃度の上昇は、細胞培養物に加えられるであろう塩のみに基づくであろう。したがって、このような場合（塩を含まない又は異なる塩）の両方において、塩濃度の上昇は、細胞培養物に加えられる特定の塩のみに基づく。すなわち、塩濃度の上昇は、細胞培養物に加えられる特定の塩のみに基づいて計算されるであろう。

細胞培養物中の塩濃度の上昇は、少なくとも約０．０１M又は少なくとも約０．０５Mであるべきである。別の実施態様では、細胞培養物中の塩濃度の上昇は、約０．０１M～約１．５M、約０．０５M～約１．５M、約０．１M～約１．５M、約０．１５M～約１．５M、約０．２M～約１．５Mである。

好ましい実施態様では、細胞培養物中の塩濃度の上昇は、少なくとも約０．１M又はより好ましくは、少なくとも約０．２Mである。本発明者らは、ラブドウイルスに何ら悪影響を及ぼすことなく、１．５Mまでの濃度上昇を試験した。ラブドウイルスのタイプに応じて、ラブドウイルスが塩濃度により永続的に不活化されず又は損傷されない限り、さらに高い塩濃度を達成することができる。このため、約２M、２．５M、３M、３．５M、４M、４．５M又は５Mまでの塩濃度の上昇を細胞培養物中で達成することができる。

適切な塩は、有機塩及び無機塩を含む。無機塩は、本発明によれば限定されず、水溶液に可溶性であり、細胞培養物及び／又はウイルスを永続的に損傷しない任意の無機塩を利用することができる。無機塩は、例えば、サルファート、ニトラート、ホスファート、カーボナート、ハロゲン化物、ボラート、シリカート等のアルカリ塩又はアルカリ土類塩からなる群より選択される。薬学的に許容され得る製品が提供されるであろう場合、無機塩及び有機塩は、それ自体公知の薬学的に許容され得る塩の群から選択されるであろう。例えば、薬学的に許容され得る無機塩は、ナトリウム塩、例えば、ハロゲン化ナトリウム、好ましくは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム；カルシウム塩、例えば、ハロゲン化カルシウム、好ましくは、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、ホウ酸カルシウム；マグネシウム塩、例えば、ハロゲン化マグネシウム、好ましくは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、ホウ酸マグネシウム及びこれらの組み合わせ並びに他の薬学的に許容され得る無機塩から選択される。

薬学的に許容され得る塩の更なる例は、塩基性残基、例えば、アミンの鉱物又は有機酸塩；酸性残基、例えば、カルボン酸のアルカリ又は有機塩等を含むが、これらに限定されない。例えば、このような塩には、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、ゲンチシン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、４－メチル－ベンゼンスルホン酸、リン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸及び酒石酸からの塩を含む。更なる薬学的に許容され得る塩をアンモニア、Ｌ－アルギニン、カルシウム、２，２’－イミノビスエタノール、Ｌ－リシン、マグネシウム、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、カリウム、ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタンからのカチオンと形成することができる。

好ましい塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＮＨ_４Ｃｌ、硫酸ＮＨ_４、酢酸ＮＨ_４又は重炭酸ＮＨ_４を含むが、これらに限定されない。最も好ましい実施態様では、ＮａＣｌ塩溶液が使用される。塩溶液は、バッファー、好ましくは、約５～約９、望ましくは、約６．５～約８．５のｐＨを有するバッファーを含むことができる。

ウイルス放出剤の添加後の細胞培養物のｐＨは、細胞及び／又はより重要には、ウイルスの完全性を保存する範囲、例えば、約ｐＨ５～９又はより好ましくは、約６．５～８．５の範囲に維持されると理解されるであろう。また、場合によっては、ウイルス放出剤の性質に応じて、ウイルス放出剤の電荷に影響を及ぼし、それにより、ウイルス放出剤としてのその特性を促進するために、ｐＨを特定の範囲に調整することが望ましい場合がある。

ウイルス放出剤、特に、塩又は硫酸デキストランを細胞培養物に加えて、細胞培養物中での所望の濃度又はイオン強度を達成した後、特定の保持又はインキュベーション時間は予見されない。このため、細胞培養物中での所望の濃度又はイオン強度を達成した後、全細胞培養物が、次の工程でさらに処理されるであろう。細胞培養物中のウイルス放出剤の均一な分布を達成するために、細胞培養物を撹拌し又は動かすことが望ましい場合がある。ウイルス放出剤、特に、塩又は硫酸デキストランを加え、細胞培養物を調製し又は次のプロセス工程に移動させる技術的必要性により、ウイルス放出剤との特定のインキュベーション時間が本質的に達成される。場合によっては、ウイルス放出剤を加えた後に、細胞培養物を一定期間インキュベーションすることが望ましい場合がある。このインキュベーション時間は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間又は２４時間であることができる。

本発明の方法又はプロセスによれば、ついで、細胞培養物を清澄化工程に供する。ラブドウイルスが上清中に分泌される場合、この清澄化工程は、ラブドウイルスを含有する上清から、粒子状物質、すなわち、細胞及び細胞デブリの大部分を分離するのに役立つ。細胞培養上清から細胞を除去するための種々の方法が当業者に利用可能であり、好ましくは、清澄化は、下記方法：深層ろ過、接線流ろ過及び／又は遠心分離のうちの１つ以上を含む。これらの清澄化方法それぞれにおいて、上清を細胞及び細胞デブリから分離し、ラブドウイルスを含む上清を更なる処理のために収集する。上清から粒子状物質を分離するための当業者に公知の他の方法をこの清澄化工程において等しく適用することができる。好ましい実施態様では、細胞培養物をクロスフローによる精密ろ過により、より好ましくは、０．６５μmのカットオフ中空繊維を使用することにより清澄化する。別の好ましい実施態様では、細胞培養物を、デプスフィルターを介して清澄化する。場合によっては、潜在的なバイオバーデン汚染を防止するために、０．４５μm／０．２μmろ過をデプスフィルターに直列に接続する。

本発明の方法又はプロセスの第２の代替法では、ラブドウイルス収集物は、細胞培養物から、まず、ろ過工程、好ましくは、深層ろ過を介して細胞培養物を清澄化し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤、特に、塩水溶液又は硫酸デキストランですすぐことにより得られる。塩水溶液が使用される場合、この塩溶液は、少なくとも約０．０１Mもしくは０．０５Mの濃度もしくはイオン強度又は約０．０１M～約１．５Mもしくは約０．０５M～約１．５Mの濃度もしくはイオン強度を有する。ついで、上清（又はこの代替法では、ろ液）及びすすぎ溶液－両方ともラブドウイルス収集物を含有する－を回収する。

このため、この代替法では、ウイルス放出剤、特に、塩溶液又は硫酸デキストランを細胞培養物に直接加えないが、細胞培養物をまず、ろ過工程、好ましくは、深層ろ過により清澄化し、フィルター、好ましくは、深層フィルターをウイルス放出剤（好ましくは、塩溶液又は硫酸デキストラン）ですすぐ。細胞及び細胞デブリは、フィルター、好ましくは、デプスフィルターにより保持され、ウイルス放出剤は、主に、フィルター、好ましくは、デプスフィルターにより保持される細胞又は細胞膜からのラブドウイルスの放出を支援する。このため、この代替法では、ウイルス放出剤を加えることの効果は、第１の代替法と同じである。すなわち、より多量の回収可能なラブドウイルスが放出され、回収され、これを後続の工程で捕捉し、回収することができる。当業者であれば、細胞及び細胞デブリの除去を可能にするであろう種々のフィルターの範囲から選択することができると理解されるであろうし、適切なフィルターを選択するであろう。

また、ここでは、ラブドウイルスのタイプに応じて、ラブドウイルスが塩濃度により永続的に不活化されない又は損傷されない限り、さらに高い、例えば、塩濃度を適用することができる。適切な塩は、有機塩及び無機塩を含む。無機塩は、本発明によれば限定されず、水溶液に可溶性であり、細胞培養物及び／又はウイルスを妨害しない任意の無機塩を利用することができる。無機塩は、例えば、サルファート、ニトラート、ホスファート、カーボナート、ハロゲン化物、ボラート、シリカート等のアルカリ塩又はアルカリ土類塩からなる群より選択される。薬学的に許容され得る製品が提供されるであろう場合、無機塩及び有機塩は、それ自体公知の薬学的に許容され得る塩の群から選択されるであろう。例えば、薬学的に許容され得る無機塩は、ナトリウム塩、例えば、ハロゲン化ナトリウム、好ましくは、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム；カルシウム塩、例えば、ハロゲン化カルシウム、好ましくは、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、ホウ酸カルシウム；マグネシウム塩、例えば、ハロゲン化マグネシウム、好ましくは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、ホウ酸マグネシウム及びこれらの組み合わせ並びに他の薬学的に許容され得る無機塩から選択される。

好ましい塩は、再度、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２、ＮＨ_４Ｃｌ、硫酸ＮＨ_４、酢酸ＮＨ_４又は重炭酸ＮＨ_４を含むが、これらに限定されない。最も好ましい実施態様では、ＮａＣｌ塩溶液が使用される。塩溶液は、バッファー、好ましくは、約５～約９、望ましくは、約６．５～約８．５のｐＨを有するバッファーを含むことができる。硫酸デキストランについて、少量の高濃度硫酸デキストラン溶液を加えることも適切である場合があり、一方、他の例では、より低濃度のより多量の硫酸デキストラン溶液を加えるのが望ましい場合がある。必要とされる濃度を先に説明されているように、当業者により容易に決定することができる。

同様に、第２の代替法において、アルギニンをウイルス放出剤として使用することができる。このため、一実施態様では、ウイルス放出剤は、アルギニンを含有する溶液である。好ましくは、溶液のアルギニン濃度又は溶液のイオン強度は、少なくとも約０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は少なくとも約０．５Mである。他のアミノ酸及びそれらの各塩の使用も企図され、一態様では、アミノ酸、好ましくは、極性アミノ酸、より好ましくは、塩基性又は酸性アミノ酸は、ウイルス放出剤として有用である。最も好ましいアミノ酸は、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン又はチロシンを含むが、これらに限定されない。好ましくは、溶液のアミノ酸濃度又は溶液のイオン強度は、少なくとも約０．０１M、０．０５Ｍ、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は少なくとも約０．５Mである。

別の実施態様では、第１及び第２の代替法の両方を組み合わせることができる。すなわち、ラブドウイルス収集物は、ウイルス放出剤、特に、塩又は硫酸デキストランを細胞培養物に直接加え、続けて、細胞培養物を深層ろ過し、その後、デプスフィルターをウイルス放出剤（好ましくは、塩溶液又は硫酸デキストラン）ですすぐことにより、細胞培養物から得られる。

任意選択的に、場合によっては、後続の方法／プロセス工程又は原薬を妨害しないように、得られたラブドウイルス収集物からウイルス放出剤を低減し又は除去する必要がある場合がある。例えば、塩濃度により、後続の捕捉工程、ＤＮＡ分解工程を妨害される場合があり又は塩濃度により、より長期間インキュベーションされた場合に、ラブドウイルスが損傷され又は不活性化される場合がある。塩濃度の低減を好ましくは、希釈、透析ろ過及び／又は透析により達成することができる。いずれにしても、これらの方法のそれぞれにおいて、塩濃度を低減し、ついで、低減された塩濃度を有するラブドウイルス収集物を本発明の方法又はプロセスに従ってさらに処理する。ラブドウイルス収集物中の塩濃度を低減させるのに適した当業者に公知の他の方法を等しく適用することができる。

さらに任意選択的に、場合によっては、ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、例えば、ベンゾナーゼで処理することが望ましい場合がある。好ましい実施態様では、ＤＮＡ分解ヌクレアーゼは、塩活性ヌクレアーゼ、例えば、ＳＡＮ－ＨＱである。

ついで、清澄化工程後に回収されたラブドウイルス収集物を、この収集物をカチオン交換体上にローディングすることにより、更なる精製工程に供する。収集物を清澄化工程の直後に、カチオン交換体上にローディングすることができる。場合によっては、回収された収集物をある期間、例えば、一晩保存し、ついで、翌日にカチオン交換体に適用する。一実施態様では、カチオン交換体の材料は、モノリス、樹脂、繊維又は膜である。好ましい実施態様では、カチオン交換体は、モノリス吸着材である。ラブドウイルスのカチオン交換体捕捉を使用することにより、例えば、アニオン交換と比較してはるかに効率的であったことが見出された。好ましくは、この捕捉及び精製工程を結合／溶出モードでのモノリシックカチオン交換クロマトグラフィーにより行う。

一態様では、前述の精製工程は、ラブドウイルス収集物を濃縮する目的も果たす。この点において、（清澄化された）ウイルス収集物（ＴＣＩＤ_５０/mLにより測定される）は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００倍濃縮される。好ましくは、ウイルスは、（ＴＣＩＤ_５０/mLで測定される）少なくとも約１０倍、好ましくは、少なくとも約２５倍、好ましくは、少なくとも約５０倍、好ましくは、少なくとも約７５倍、より好ましくは、少なくとも約１００倍濃縮される。例えば、１×１０^９ＴＣＩＤ_５０/mLの濃度を有するウイルス溶液 １０Ｌを１０倍に濃縮すると、１×１０^１０ＴＣＩＤ_５０/mLのウイルス濃度を有するウイルス溶液 １Ｌが得られるであろう。

カチオン交換体上にラブドウイルス収集物を適用するために選択されるバッファーは、一般的には、当業者に周知である。カチオン交換体へのラブドウイルスの最大結合をもたらすであろう条件が選択される。好ましくは、収集物を、それをカチオン交換体に適用する前に、コンディショニングバッファーで希釈する。一実施態様では、コンディショニングバッファーは、トリスバッファーを含み、より好ましくは、コンディショニングバッファーは、ＨＣｌでｐＨを７．５に調整された１００mM トリスバッファーを含む。好ましくは、収集物及びコンディショニングバッファーをカチオン交換体への適用前に、少なくとも１：１又は少なくとも１：２の比で希釈する。

ついで、捕捉されたラブドウイルスをカチオン交換体から溶出する。溶出を典型的には、直線的に上昇する塩濃度でカチオン交換体に溶出バッファーを適用することにより又は単一工程溶出プロセスを使用することにより行う。好ましい実施態様では、溶出バッファーは、アルギニンをさらに含む。

ついで、そのように精製された溶出液を回収し、プールする。このラブドウイルス溶出液は既に高度に精製されているが、ラブドウイルス溶出液の意図される更なる使用に応じて、下記任意の処理工程のうちの１つ以上をラブドウイルス溶出液について行うことができる。

（ｉ）好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により、不純物をさらに除去するように、ラブドウイルス溶出液を洗練する工程。

好ましい実施態様では、洗練工程は、フロースルーモード、例えば、約７００kDの排除限界を有する、混合モードビーズベースのサイズ排除及びアニオン交換クロマトグラフィー（Capto（商標）Core）に基づく。

（ｉｉ）好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により、ラブドウイルス溶出液又は洗練されたラブドウイルスのバッファーを変更する工程。

好ましい実施態様では、バッファー交換を限外ろ過／透析ろ過、続けて、バイオバーデンろ過を使用して行い、原薬がもたらされる。

（ｉｉｉ）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程。

医薬組成物
治療に使用するために、本発明の方法又はプロセスに従って調製され、産生されかつ／又は精製されたラブドウイルスは、動物又はヒトへの投与を容易にするのに適した医薬組成物に製剤化される。典型的な製剤を水溶液又は水性もしくは非水性懸濁液の形態で、リラブドウイルスを生理学的に許容され得る担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより調製することができる。担体、賦形剤、修飾剤又は安定剤は、利用される用量及び濃度で無毒である。それらは、バッファー系、例えば、ホスファート、シトラート、アセタート並びに他の無機酸又は有機酸及びそれらの塩；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤、例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール及びｍ－クレゾール；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリンもしくはデキストランを含む単糖類、二糖類、オリゴ糖類もしくは多糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はイオン性もしくは非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）もしくは脂肪酸エステル、脂肪酸エーテルもしくは糖エステルを含む。また、賦形剤は、放出修飾又は吸収修飾機能も有することができる。

一実施態様では、ラブドウイルスは、トリス、アルギニン及び場合により、シトラートを含む医薬組成物に製剤化される。トリスは、好ましくは、約１mM～約１００mMの濃度で使用される。アルギニンは、好ましくは、約１mM～約１００mMの濃度で使用される。シトラートは、最大１００mMの濃度で存在することができる。好ましい製剤は、約５０mM トリス及び５０mM アルギニンを含む。

医薬組成物を液体、凍結液体又は凍結乾燥形態として提供することができる。凍結液体を－７０℃～－８５℃及び約－１５℃、－１６℃、－１７℃、－１８℃、－１９℃、－２０℃、－２１℃、－２２℃、－２３℃、－２４℃又は約－２５℃の温度を含む約０℃～約－８５℃の温度で保存することができる。

ラブドウイルス又は医薬組成物は、必要ではないが、場合により、目的の障害を予防し又は治療するのに現在使用されている１種以上の薬剤と共に製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するリコンビナント抗体の量、障害又は処置の種類及び上記検討された他の要因により決まる。これらは、一般的には、本明細書に記載されたのと同じ投与量及び投与経路で又は本明細書に記載された投与量の約１～９９％で又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投与量及び任意の経路で使用される。

疾患の予防又は治療のために、ラブドウイルス又は医薬組成物の適切な投与量（単独で又は１種以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、処置される疾患の種類、ラブドウイルスのタイプ、疾患の重症度及び経過、ラブドウイルスが予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴及びラブドウイルスに対する応答並びに主治医の裁量により決まるであろう。本発明のラブドウイルス又は医薬組成物は、１回又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。

疾患の種類及び重症度に応じて、ラブドウイルスのＴＣＩＤ_５０により測定された約１０^８～１０^１３個の感染性粒子が、例えば、１回以上の別々の投与によるか又は持続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための最初の候補投与量であることができる。状態に応じて、数日又はそれ以上にわたる反復投与の場合、処置は、一般的には、疾患症状の所望のサプレッションが生じるまで持続されるであろう。ラブドウイルスの１つの例示的な投与量は、ＴＣＩＤ_５０により測定された約１０^８～１０^１３個の範囲の感染性粒子であろう。このため、ＴＣＩＤ_５０により測定される約１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２又は１０^１３個の感染性粒子（又はその任意の組み合わせ）の１回以上の用量を患者に投与することができる。このような用量を断続的に、例えば、毎週又は３週間毎に（例えば、患者が、約２～約２０回又は例えば、約６回の用量のリコンビナントラブドウイルスを受けるように）投与することができる。初回のより高い負荷用量、続けて、１回以上のより低い用量又はその逆を投与することができる。ただし、他の投与計画が有用である場合がある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。

ラブドウイルス及びそれを含む組成物の有効性を関与する特定の疾患に応じて、それ自体公知の任意の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／もしくは動物モデル又はそれらの任意の組み合わせを使用して試験することができる。適切なアッセイ及び動物モデルは、当業者には明らかであろうし、例えば、以下の実施例で使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。

実際の薬学的有効量又は治療用量は、当然、当業者に公知の要因、例えば、患者の年齢及び体重、投与経路及び疾患の重症度により決まる。いずれの場合も、ラブドウイルスは、患者の固有の状態に基づいて薬学的有効量を送達することが可能となる投与量及び様式で投与されるであろう。

代替的には、本発明のラブドウイルス又は医薬組成物を処置される領域のサイズ、使用されるウイルス力価、投与経路及び方法の所望の効果に応じて、範囲内の全ての数を含む約５０μL～約１００mLの容量で送達することができる。

腫瘍内投与では、容量は、好ましくは、約１００μL、２００μL、３００μL、４００μL、５００μL、６００μL、７００μL、８００μL、９００μL、１０００μL、１１００μL、１２００μL、１３００μL、１４００μL、１５００μL、１６００μL、１７００μL、１８００μL、１９００μL、２０００μL、２５００μL、３０００μL、３５００μL、４０００μL又は約４５００μLの容量を含む約５０μL～約５mLである。好ましい実施態様では、容量は、約１０００μLである。

例えば、ラブドウイルスの注入による全身投与では、容量は、当然、より多くてもよい。代替的には、ラブドウイルスの濃縮溶液を注入の直前に、より大量の注入溶液で希釈することができる。

特に、静脈内投与では、容量は、好ましくは、約２mL、３mL、４mL、５mL、６mL、７mL、８mL、９mL、１０mL、１１mL、１２mL、１３mL、１４mL、１５mL、１６mL、１７mL、１８mL、１９mL、２０mL、２５mL、３０mL、３５mL、４０mL、４５mL、５０mL、５５mL、６０mL、７０mL、７５mL、８０mL、８５mL、９０mL、９５mL又は約１００mLの容量を含む１mL～１００mLである。好ましい実施態様では、容量は、約５mL～１５mLであり、より好ましくは、容量は、約６mL、７mL、８mL、９mL、１０mL、１１mL、１２mL、１３mL又は約１４mLである。

好ましくは、同じ製剤が、腫瘍内投与及び静脈内投与に使用される。腫瘍内投与と静脈内投与との間の用量及び／又は容量比は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９又は約１：２０であることができる。例えば、１：１の用量及び／又は容量比は、同じ用量及び／又は容量が腫瘍内及び静脈内に投与されることを意味し、一方、例えば、約１：２０の用量及び／又は容量比は、腫瘍内投与の用量及び／又は容量より２０倍高い静脈内投与の用量及び／又は容量を意味する。好ましくは、腫瘍内投与と静脈内投与との間の用量及び／又は容量比は、約１：９である。

ラブドウイルスの有効濃度は、望ましくは、１ミリリットル当たりに約１０^８～１０^１４ベクターゲノム（vg/mL）の範囲である。感染単位をMcLaughlin et al., J Virol.;62(6):1963-73 (1988)に記載されているように測定することができる。好ましくは、濃度は、約１．５×１０^９～約１．５×１０^１３であり、より好ましくは、約１．５×１０^９～約１．５×１０^１１である。一実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０^９である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０^１０である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０^１１である。さらに別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０^１２である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０^１３である。別の実施態様では、有効濃度は、約１．５×１０^１４である。望ましくない影響のリスクを低減するために、最も低い有効濃度を使用するのが望ましい場合がある。これらの範囲におけるさらに他の投与量を主治医により、処置される対象、好ましくは、ヒトの身体状態、対象の年齢、特定の種類のガン及びガンが進行性である場合、そのガンが進行している程度を考慮して選択することができる。

ラブドウイルスの有効ターゲット濃度をＴＣＩＤ_５０により表現することができる。ＴＣＩＤ_５０は、例えば、Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法を使用することにより決定することができる。望ましくは、範囲は、１×１０^８/mL～１×１０^１４/mL ＴＣＩＤ_５０の有効ターゲット濃度を含む。好ましくは、有効ターゲット濃度は、約１×１０^９～１×１０^１２/mL、より好ましくは、約１×１０^９～１×１０^１１/mLである。一実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１×１０^１０/mLである。好ましい実施態様では、ターゲット濃度は、約５×１０^１０/mLである。別の実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１．５×１０^１１/mLである。一実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１×１０^１２/mLである。別の実施態様では、有効ターゲット濃度は、約１．５×１０^１３/mLである。

ラブドウイルスの有効ターゲット用量もＴＣＩＤ_５０により表現することができる。望ましくは、範囲は、１×１０^８～１×１０^１４ＴＣＩＤ_５０のターゲット用量を含む。好ましくは、ターゲット用量は、約１×１０^９～１×１０^１３、より好ましくは、約１×１０^９～１×１０^１２である。一実施態様では、有効濃度は、約１×１０^１０である。好ましい実施態様では、有効濃度は、約１×１０^１１である。一実施態様では、有効濃度は、約１×１０^１２である。別の実施態様では、有効濃度は、約１×１０^１３である。

実際の薬学的有効量又は治療用量は、当然、当業者に公知の要因、例えば、患者の年齢及び体重、投与経路並びに疾患の重症度により決まる。いずれの場合も、ラブドウイルスは、患者の固有の状態に基づいて、薬学的有効量を送達することが可能となる投与量及び様式で投与されるであろう。

一般的には、本明細書で言及された疾患、障害及び状態の治療及び／又は緩和のために、処置される特定の疾患、障害又は状態、特定のラブドウイルスの有効性、特定の投与経路及び特定の医薬製剤又は組成物に応じて、ラブドウイルスは、一般的には、例えば、週２回、週１回又は月１回の用量で投与されるであろうが、特に、前述のパラメータに応じて相当変動させることができる。このため、場合によっては、上記与えられた最小用量より少なく使用することで十分である場合があり、一方、他の場合では、上限を超えなければならない場合がある。大量に投与する場合、それらを１日にわたって分散される多数のより少ない用量に分割することが推奨される場合がある。

当業者であれば、過度の負担なしに、本発明の方法又はプロセス内の種々の代替法を選択し、組み合わせることが可能であると理解されるであろう。例えば、当業者であれば、必要に応じて任意のプロセス工程を自由に行い、それらを種々のセットアップ、例えば、異なるホスト細胞、特定のラブドウイルス又は細胞培養物を清澄化する特定の方法で組み合わせることができる。以下に、一部の好ましい実施態様を説明するが、本発明の方法及びプロセスは、これらの実施態様により限定されると解釈されるべきではない。

一実施態様では、本発明の方法又はプロセスにより、細胞培養物中／細胞培養物からの、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス、より好ましくは、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇがリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている水疱性口内炎ウイルスの調製、産生及び／又は精製が可能となり、本発明の方法又はプロセスは、下記：
（ｉ）
ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、続けて、好ましくは、深層ろ過、接線流ろ過もしくは遠心分離により細胞培養物を清澄化し、上清中のウイルス収集物を回収することにより
又は
ｂ．細胞培養物をろ過工程、好ましくは、深層ろ過に供し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、上清中のウイルス収集物を回収することにより、
細胞培養物からウイルス収集物を得る工程を含む。

別の実施態様では、本発明の方法又はプロセスにより、細胞培養物中／細胞培養物からの、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス、より好ましくは、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇがリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている水疱性口内炎ウイルスの調製、産生及び／又は精製が可能となり、本発明の方法又はプロセスは、下記：
（ｉ）
ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、ここで、ウイルス放出剤が固体塩又は塩水溶液であり、続けて、好ましくは、深層ろ過、接線流ろ過もしくは遠心分離により細胞培養物を清澄化し、上清中のウイルス収集物を回収することにより
又は
ｂ．細胞培養物をろ過工程、好ましくは、深層ろ過に供し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、ここで、ウイルス放出剤が塩水溶液であり、上清中のウイルス収集物を回収することにより、
細胞培養物からウイルス収集物を得る工程を含む。

別の実施態様では、本発明の方法又はプロセスにより、細胞培養物中／細胞培養物からの、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス、より好ましくは、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇがリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている水疱性口内炎ウイルスの調製、産生及び／又は精製が可能となり、本発明の方法又はプロセスは、下記：
（ｉ）
ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、ここで、ウイルス放出剤が固体塩又は塩水溶液であり、細胞培養物中の塩濃度を上昇させ、続けて、好ましくは、深層ろ過、接線流ろ過もしくは遠心分離により細胞培養物を清澄化し、上清中のウイルス収集物を回収することにより
又は
ｂ．細胞培養物をろ過工程、好ましくは、深層ろ過に供し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、ここで、ウイルス放出剤が塩水溶液であり、上清中のウイルス収集物を回収することにより、
細胞培養物からウイルス収集物を得る工程を含む。

別の実施態様では、本発明の方法又はプロセスにより、細胞培養物中／細胞培養物からの、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス、より好ましくは、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇがリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている水疱性口内炎ウイルスの調製、産生及び／又は精製が可能となり、本発明の方法又はプロセスは、下記：
（ｉ）
ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、ここで、ウイルス放出剤が固体塩又は塩水溶液であり、細胞培養物中の塩濃度を少なくとも約０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５M上昇させ、続けて、好ましくは、深層ろ過、接線流ろ過もしくは遠心分離により細胞培養物を清澄化し、上清中のウイルス収集物を回収することにより
又は
ｂ．細胞培養物をろ過工程、好ましくは、深層ろ過に供し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、ここで、ウイルス放出剤が少なくとも約０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５Mの濃度を有する塩水溶液であり、上清中のウイルス収集物を回収することにより、
細胞培養物からウイルス収集物を得る工程を含む。

別の実施態様では、本発明の方法又はプロセスにより、細胞培養物中／細胞培養物からの、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス、より好ましくは、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇがリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている水疱性口内炎ウイルスの調製、産生及び／又は精製が可能となり、本発明の方法又はプロセスは、下記：
（ｉ）
ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、ここで、ウイルス放出剤が固体塩又は塩水溶液であり、細胞培養物中の塩濃度を約０．０１M～約５M、約０．０５M～約５M、約０．１M～約５M、約０．１５M～約５M、約０．２M～約５M、約０．２５M～約５M、約０．３M～約５M、約０．３５M～約５M、約０．４M～約５M、約０．４５M～約５M又は約０．５M～約５M上昇させ、続けて、好ましくは、深層ろ過、接線流ろ過もしくは遠心分離により細胞培養物を清澄化し、上清中のウイルス収集物を回収することにより
又は
ｂ．細胞培養物をろ過工程、好ましくは、深層ろ過に供し、続けて、フィルター、好ましくは、デプスフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、ここで、ウイルス放出剤が約０．０１M～約５M、約０．０５M～約５M、約０．１M～約５M、約０．１５M～約５M、約０．２M～約５M、約０．２５M～約５M、約０．３M～約５M、約０．３５M～約５M、約０．４M～約５M、約０．４５M～約５M又は約０．５M～約５Mの濃度を有する塩水溶液であり、上清中のウイルス収集物を回収することにより、
細胞培養物からウイルス収集物を得る工程を含む。

さらに好ましい実施態様では、前述の実施態様のいずれかは、
（ｉｉ）（場合により）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体、好ましくは、モノリス、樹脂又は膜、より好ましくは、モノリス吸着材上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）（場合により）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）（場合により）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含むことができる。

さらに関連する実施態様では、前述の実施態様のいずれかは、
（ｉｉ）（場合により）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体、好ましくは、モノリス、樹脂又は膜、より好ましくは、モノリス吸着材上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）（場合により）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）（場合により）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含むことができる。

さらに関連する実施態様では、前述の実施態様のいずれかは、
（ｉｉ）（場合により）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体、好ましくは、モノリス、樹脂又は膜、より好ましくは、モノリス吸着材上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）（場合により）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含むことができる。

さらに関連する実施態様では、前述の実施態様のいずれかは、
（ｉｉ）（場合により）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体、好ましくは、モノリス、樹脂又は膜、より好ましくは、モノリス吸着材上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）（場合により）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含むことができる。

さらに関連する実施態様では、前述の実施態様のいずれかは、
（ｉｉ）（場合により）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体、好ましくは、モノリス、樹脂又は膜、より好ましくは、モノリス吸着材上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含むことができる。

さらに関連する実施態様では、前述の実施態様のいずれかは、
（ｉｉ）工程（ｉａ）又は（ｉｂ）後に得られた収集物の塩濃度を好ましくは、希釈、透析ろ過又は透析により低下させる工程と、
（ｉｉｉ）ラブドウイルス収集物をＤＮＡ分解ヌクレアーゼ、好ましくは、ベンゾナーゼ又は塩活性ヌクレアーゼで処理する工程と、
（ｉｖ）ラブドウイルスを、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの後に得られた溶液をカチオン交換体、好ましくは、モノリス、樹脂又は膜、より好ましくは、モノリス吸着材上にローディングすることにより捕捉する工程と、
（ｖ）ラブドウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程と、
（ｖｉ）工程（ｖ）のラブドウイルス溶出液を好ましくは、サイズ排除、多峰性サイズ排除、イオン交換及び／又は接線流ろ過により洗練する工程と、
（ｖｉｉ）洗練されたラブドウイルス溶出液のバッファーを好ましくは、限外ろ過及び透析ろ過又は透析により交換する工程と、
（ｖｉｉｉ）ラブドウイルスを無菌ろ過する工程とをさらに含むことができる。

前述の具体的な実施態様のいずれかにさらに関連して、ほ乳類ホスト細胞、好ましくは、懸濁液中で培養されたほ乳類ホスト細胞、より好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞を含む細胞培養物中／細胞培養物から、ベシクロウイルス、好ましくは、水疱性口内炎ウイルス、より好ましくは、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇがリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている水疱性口内炎ウイルスを調製し、産生しかつ／又は精製するのが好ましい。

前述の具体的な実施態様のいずれかに関する好ましい実施態様では、水疱性口内炎ウイルスのＲＮＡゲノムは、配列番号：１２と少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一のコード配列からなる。

実施例
実施例１：原薬上流製造プロセス
概要及びバッチ定義
１つの融解したＨＥＫ２９３細胞バイアル（ＵＰＳ０１）に基づいて、細胞を増殖させ、より大きな振とうフラスコ容量で培養した（ＵＰＳ０２～ＵＰＳ０６）。続けて、ＵＰＳ０６を第１のバイオリアクターに播種し（ＵＰＳ０７）、続けて、細胞を第２のシードバイオリアクター内で培養し、増殖させ（ＵＰＳ０８）、最後に、生産バイオリアクターで増殖させた（ＵＰＳ０９）。原薬を含有する粗収集物の１つのバッチを、生産バイオリアクターへの播種後４８時間又は５６時間での細胞に感染させることにより、バッチモードで生産した（ＵＰＳ１０）。感染時、培養温度を一定に保つか（プロセス変形形態１、４８時間）又は３７．０℃～３４．０℃で変動させた（プロセス変形形態２、５６時間）。感染をＶＳＶ－ＧＰ（ここで、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている）又はＶＳＶ－ＧＰ－カーゴ、すなわち、更なる導入遺伝子、特に、切断型ＣＣＬ２１（１～７９）タンパク質もしくはＣＤ８０－Ｆｃ融合タンパク質をコードするＶＳＧ－ＧＰにより行った。以下では、すべてのプロセスをＶＳＶ－ＧＰ及び種々のＶＳＶ－ＧＰ－カーゴ変異体（ＣＣＬ２１（１～７９）及びＣＤ８０－Ｆｃ融合体）により行い、読みやすくするために、単語ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）と呼ぶものとする。収集を感染後３４±２時間で行った（ＵＰＳ１１）。その後、約２００Ｌの全作業容量を下流処理に供した。

ＵＰＳ０１－細胞融解
１つのマスターセルバンク（ＭＣＢ）又はワーキングセルバンク（ＷＣＢ）バイアルからのＨＥＫ２９３細胞をヒートブロック中で融解し、培養培地に調整した。遠心分離工程後、得られた細胞ペレットを培地で再懸濁させ、１２５mLの振とうフラスコ中でインキュベーションした。

ＵＰＳ０２～ＵＰＳ０６－振とうフラスコ中での細胞増殖
ＨＥＫ２９３細胞を、振とうフラスコ中で５回の継代培養段階にわたって増殖させた。接種基準に達した時点で、次の段階を開始した。ここでは、次のより大きな振とうフラスコ容量をそれぞれの新たな継代培養段階に使用した。最大培養容量を超えた場合、残りの細胞を廃棄した。ＵＰＳ０７について、２０００mLもの振とうフラスコを、ウェーブミクスドバイオリアクターの接種基準をカバーするのに必要に応じて使用した。

ＵＰＳ０７－（第１のシード）バイオリアクターにおける細胞増殖（任意）
最後の振とうフラスコ継代培養（ＵＰＳ０６）を、バッチモードでの更なる細胞増殖のための第１のシードバイオリアクターに接種するのに使用した。ウェーブバイオリアクター又は撹拌タンクリアクターは、細胞増殖に適している。接種前及び接種中に、ｐＨ値を、ヘッドスペースを介してＣＯ_２をバイオリアクターに加えることにより制御した。全培養期間中、空気によるヘッドスペースエアレーションが存在した。溶存酸素値を、カスケードレギュレーションモードの高度なコントローラを使用して、ガス化空気及び酸素により制御した。接種用量及びＵＰＳ０６の終了時での生存細胞濃度に応じて加えるべき培地容量を計算した。バイオリアクターに計算された培地容量を充填した。培地をエアレーション及びｐＨ制御なしで、バイオリアクター内で少なくとも２時間コンディショニングした。接種の直前に、エアレーションを開始し、培地をアクティブなｐＨ制御下でバイオリアクター内に保持した。総コンディショニング時間は、２４時間を超えないものとする。バイオリアクターの接種に必要な条件が満たされると、細胞懸濁液をポンピングによりバイオリアクターに移した。細胞懸濁液が、接種中に完全に使用されない場合、残りの細胞を廃棄する。

ＵＰＳ０８－シードバイオリアクターにおける細胞増殖
５０Ｌの使い捨て撹拌タンクバイオリアクターを培養に使用した。接種前及び接種中に、ｐＨ値を、スパージャー及びヘッドスペースを介してＣＯ_２をバイオリアクターに加えることにより制御した。接種後、塩基添加による低側ｐＨ制御をアクティブにした。

代替法として、ガラスバイオリアクターを培養に使用した。接種前及び接種中に、ｐＨ値を、スパージャー及びヘッドスペースを介してＣＯ_２をバイオリアクターに加えることにより制御した。接種後、塩基添加による低側ｐＨ制御をアクティブにした。全培養期間中、空気によるヘッドスペースエアレーションが存在した。％ ＤＯを水中酸素入力により制御し、高度なコントローラによりレギュレーションする。

播種のために、ウェーブミクスドバイオリアクターに含まれる細胞懸濁液の生存細胞濃度を決定した。バイオリアクター中の必要とされる細胞濃度に応じて、接種容量及び加えなければならなかった培地容量を計算した。バイオリアクターに、計算された培地容量を充填した。培地をエアレーション及びｐＨ制御なしで、シードバイオリアクター内で少なくとも２時間コンディショニングした。接種時に、エアレーションを開始し、培地をアクティブなｐＨ制御下でシードバイオリアクター内に保持した。総コンディショニング時間は、２４時間を超えないものとする。バイオリアクターの接種に必要な条件が満たされると、細胞懸濁液をポンピングによりバイオリアクターに移した。細胞懸濁液が、接種中に完全に使用されない場合、残りの細胞を廃棄する。

消泡戦略（任意）：培養中の泡の形成を防止するために、消泡剤を、接種直後に開始される時間依存性ポンププロファイルを使用して、培養物に加えることができる。したがって、消泡剤を６時間毎に細胞懸濁液に直接投与するものとし、ポンプを毎回１秒間運転させる。消泡剤の添加容量をプロセス制御システムにより記録する。

ＵＰＳ０９－生産バイオリアクターにおける細胞増殖
２００Ｌの使い捨て撹拌タンクバイオリアクターを生産に使用した。接種前及び接種中に、ｐＨ値を、スパージャー及びヘッドスペースを介してＣＯ_２を加えることにより制御した。接種後、塩基添加による低側ｐＨ制御をアクティブにした。全培養期間中、空気によるヘッドスペースエアレーションが存在した。％ 溶存酸素を水中酸素入力により制御するものとし、高度なコントローラを使用した４ガス混合モジュールによりレギュレーションする。

播種のために、シードバイオリアクターに含まれる細胞懸濁液の生存細胞濃度を決定した。バイオリアクター中の必要とされる細胞濃度に応じて、接種容量及び加えなければならなかった培地容量を計算した。バイオリアクターに、計算された培地容量を充填した。培地をエアレーション及びｐＨ制御なしで、生産バイオリアクター内で少なくとも２時間コンディショニングした。接種直前に、エアレーションを開始し、培地をアクティブなｐＨ制御下でシードバイオリアクター内に保持した。総コンディショニング時間は、２４時間を超えないものとする。バイオリアクターの接種に必要な条件が満たされると、細胞懸濁液をポンピングによりバイオリアクターに移した。細胞懸濁液が、接種中に完全に使用されない場合、残りの細胞を廃棄する。培養中の泡の形成を防止するために、消泡剤を、接種直後に開始される時間依存性ポンププロファイルを使用して、培養物に加えることができる。したがって、消泡剤を６時間毎に細胞懸濁液に直接投与するものとし、ポンプを毎回１秒間運転させる。消泡剤の添加容量をプロセス制御システムにより記録した。

ＵＰＳ１０－ウイルス感染の変形形態Ｉ
ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）による感染を生産バイオリアクター段階の細胞接種後４８時間で行った。これにより、感染時に、１．０×１０^６～２．０×１０^６個 細胞/mLの生存細胞濃度がもたらされた。ウイルスをコンディショニングされた細胞培養培地中で予め希釈した。生産バイオリアクターに感染させるための基準を満たした後、対照細胞を２つの２５０mLの振とうフラスコに播種し、細胞懸濁液を生産バイオリアクターから取り出した。生産バイオリアクターを収集するまで、振とうフラスコをインキュベーションし、対照細胞を生産細胞と同じ方法で操作した。感染時、生産バイオリアクターの培養温度は、３６．０～３９．０℃の範囲で一定であろう。

ＵＰＳ１０－ウイルス感染の変形形態ＩＩ
ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）による感染を最終バイオリアクター段階の細胞接種後５６時間で行った。これにより、感染時に、１．０×１０^６～２．０×１０^６個 細胞/mLの生存細胞濃度がもたらされた。ウイルスをコンディショニングされた細胞培養培地中で予め希釈した。生産バイオリアクターに感染させるための基準を満たした後、対照細胞を２つの２５０mLの振とうフラスコに播種し、細胞懸濁液を生産バイオリアクターから取り出した。生産バイオリアクターを収集するまで、振とうフラスコをインキュベーションし、対照細胞を生産細胞と同じ方法で操作した。感染時、生産バイオリアクターの培養温度を３７．０～３４．０℃で変動させた。感染中の過剰な泡形成の場合、例えば、エアレーションチューブの目詰まりを防ぐために、消泡剤をバイオリアクターに直接加えることができる。消泡剤の添加容量をプロセス制御システムにより記録した。

ＵＰＳ１１－収集
収集を感染後３４±２時間で行った。収集手順を、４M～５M ＮａＣｌストック溶液を感染細胞ブロスに加えることにより開始した。これにより、約０．２M ＮａＣｌの濃度上昇がもたらされ、その後、少なくとも１０分～３０分の期間インキュベーションし、その後、移動及び細胞分離を開始した。特に断らない限り、全てのパラメータを培養中と同様に制御した。規定時間のインキュベーション後、温度、ＤＯ及びｐＨ制御を非アクティブにした。その後、感染細胞ブロスを下流処理に移した。

プロセス性能データ
記載されたプロセスで製造されたＶＳＶ－ＧＰ－ＣＣＬ２１（１～７９）収集物のプロセスモニタリング及びプロセス内分析制御からの例示的な結果を以下にまとめる。異なるＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）変異体（カーゴなし、ＣＣＬ２１（１～７９）又はＣＤ８０－Ｆｃ融合体）間のプロセス性能は同等であった。
・生産バイオリアクターにおけるμ＝０．７ｄ^－１の最高細胞特異的増殖速度；
・生存率が９０％超の収集物では、１ミリリットル当たりに２～３×１０^６個 細胞の総細胞数濃度；
・最終細胞培養上清中の感染性ウイルス含量は、約２×１０^９ＴＣＩＤ_５０/mLであり、細胞培養上清中のウイルスゲノム含量は、約３～３．５×１０^１０ＴＣＩＤ_５０/mLである。

実施例２：原薬下流製造プロセス
概要及びバッチ定義
ＶＳＶ－ＧＰ－（カーゴ）の製造は、１つバッチ製造に基づいた。全ての下流ユニット操作を何ら分割及びプール工程も伴わずに、１サイクルで行った。塩処理された収集物（ＵＰＳ１１）を、深層ろ過又は接線流精密ろ過、続けて、ヌクレアーゼ消化工程により清澄化した。清澄化された収集物をさらに希釈し、その後、結合－溶出モードでのモノリシックカチオン交換クロマトグラフィーにより精製した（ＤＰＳ０３）。この時点で、保持工程を行った。この場合、中間体を一晩保存した。第２の下流プロセス日に、中間体をフロースルーモードでの多峰性クロマトグラフィーにより精製した（ＤＰＳ０４）。フロースルーを集め、限外ろ過／透析ろ過工程により処理した（ＤＰＳ０５）。最終的なろ過及び製剤化工程（ＤＰＳ０６）により、単一バッチがもたらされ、このバッチを細胞培養ボトルに分注し、包装し、－８０℃（－８６℃～－７０℃）で凍結させた。

収集変形形態Ｉ－深層ろ過
深層ろ過工程を、バルク収集物を清澄化するのに行った。したがって、ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）含有粗収集物を、STR（登録商標）２００バイオリアクターから、3M（商標）Zeta Plus（商標）Encapsulated System深層ろ過カプセルを通して、使い捨てバッグにポンプ注入した。最大圧力は、０．９barとした。清澄化を室温で行った。3M（商標）Zeta Plus（商標）Encapsulated System深層ろ過カプセルを、廃棄のために、０．５M ＮａＯＨで消毒した。

収集変異形態ＩＩ－接線流精密ろ過
接線流精密ろ過工程を、バルク収集物を清澄化するのに行った。したがって、使い捨てバイオリアクターを、４１．５cmの有効長さ及び０．７５mmの繊維内径を有する０．６５μmのｍＰＥＳ中空繊維膜を取り付けた精密ろ過モジュールに接続した。ろ過を２１００秒^－１のせん断速度及び０．７bar以下の最大膜通過圧で、一定の保持液流速において行った。入口圧力が０．７bar以上に上昇するまで、精密ろ過を行った。２～５リットルの濃縮細胞懸濁液が、バイオリアクター容器中に残存すると予想された。透過液を５００Ｌの使い捨てバッグに集めた。プローブがもはや収集物に接触しなくなるまで、温度及びｐＨを３７℃、ｐＨ７．１に制御した。

ＤＰＳ０２－酵素消化
プロセス工程ＤＰＳ０２は、ＳＡＮ－ＨＱ（ArcticZymes（登録商標））エンドヌクレアーゼにより行われる、ＤＰＳ０１からのろ液の酵素消化である。ＵＳＰ区画での層流の内部で、ＳＡＮ－ＨＱエンドヌクレアーゼストック溶液を室温に平衡化し、別の使い捨てバッグ中において、バッファー（５０mM トリス、ｐＨ７．５）で希釈した。塩化マグネシウムを酵素の補因子として加えた。消化バッファーを中間物（清澄化された収集物）に連続的に加えた。得られた中間物を１０分超混合し、室温で２０分超インキュベーションした。ヌクレアーゼ処理後、中間物を０．１M トリスバッファーで１：２に希釈し、規定のｐＨ値及び導電率値にした。酵素消化工程の目的は、懸濁液中に存在する核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の除去である。

清澄化された収集レベルでのバイオバーデン低減戦略－変形形態Ｉ
収集プロセス中での推定バイオバーデン汚染の低減のために、０．４５μm/０．２μmのSartopore（登録商標）2MaxiCaps（登録商標）Size 1（フィルターを直列に接続した）を使用するバイオバーデン低減ろ過を行った。フィルターをデプスフィルター又は精密ろ過システムの透過液ポートに直列に接続することができる。膜通過圧力が０．９bar以上になった場合、フィルターを交換した。ろ過後、０．４５μm/０．２μmのSartopore（登録商標）2MaxiCaps（登録商標）Size 1フィルターをアセンブリから取り外し、完全性について試験した。

清澄化された収集レベルでのバイオバーデン低減戦略－変形形態ＩＩ
収集プロセス中の推定バイオバーデン汚染の低減のために、５μmのポリプロピレンフィルターKleenpak Nova 10’’ Profile II ０．５μm又は０．４５μm/０．２μmのSartopore（登録商標）2MaxiCaps（登録商標）Size 1を使用するバイオバーデン低減ろ過を行った。ろ過をヌクレアーゼ処理後及び希釈後に行った。膜通過圧力が０．９bar以上になった場合、フィルターを交換した。ろ過後、フィルターをアセンブリから取り外し、完全性について試験した。

ＤＰＳ０３－カチオン交換クロマトグラフィー
プロセス工程ＤＰＳ０３を、CIMmultusTM ＳＯ_３－モノリス上でのカチオン交換クロマトグラフィーにより行った捕捉工程とした。結合バッファーは、５０mM トリス、ｐＨ７．５を含有し、場合により、アルギニンを種々の濃度で補充した。クロマトグラフィーをステップ溶出による結合／溶出モードで行った。ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）精製を室温で行った。溶出液を１つのバッグに集めた。ローディングを５又は１０CV/hの流量で行った。モノリスを１０CV又は５０CV及び５CV/h又は１０CV/hの容量流量で洗浄した。溶出を１２０CV/h又は１０CV/hの流量で行った。回収された溶出液を２～８℃で一晩保存した。この工程の目的は、ウイルスの濃縮及び不純物（具体的には、残留ホスト細胞ＤＮＡ及びホスト細胞タンパク質）の除去とした。

ＤＰＳ０４－多峰性サイズ排除クロマトグラフィー
プロセス工程ＤＰＳ０４を、２０ｃｍのベッド高及び２．５Ｌのベッド容量を有するReadyToProcess（商標）Capto（登録商標）Core 700を使用するAkta（商標）準備勾配で行った多峰性クロマトグラフィープロセス工程とした。クロマトグラフィーをフロースルーモードで行った。樹脂を、カチオン交換クロマトグラフィーの溶出バッファーを使用してコンディショニングした。洗練工程前に、捕捉溶出液を室温で少なくとも３０分間インキュベーションした。ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）洗練を室温及び４２cm/hの一定速度で行った。フロースルーを１つのバッグに集めた。この工程の目的は、微量不純物（具体的には、ヌクレアーゼ残留物、ＨＣＰ）の最終的な除去とした。

ＤＰＳ０５－限外ろ過／透析ろ過
バッファー交換工程を２工程の透析ろ過により行った。ここでは、７５０kDのカットオフを有する限外ろ過モジュールMiniKros（登録商標）中空繊維モジュール（Repligen）を使用した。第１の工程において、一定容量での透析ろ過を行い、それにより、中間物の初期容量を、一定のクロスフロー速度で透析ろ過バッファーに対して６×透析ろ過した。これにより、３０００秒^－１の最大せん断応力がもたらされた。工程２において、透析ろ過された保持液を一定のクロスフロー速度で規定された保持液容量まで濃縮した。これにより、３０００秒^－１の最大せん断応力がもたらされた。濃縮された中間物を５Ｌの使い捨てバッグに排出した。この工程の目的は、透析ろ過バッファーに対するマトリックス交換とした。

ＤＰＳ０６－充填及び凍結
透析ろ過保持液を、０．４５μm／０．２μmのフィルター（Sartopore（登録商標）MidiCaps（登録商標））を通してろ過し、懸濁液としてバッグ又はボトルに集めた。最終的な一次包装材料をポンピングにより充填されたバッグ／ボトルに無菌的に接続した。ついで、ボトルを真空密封し、プラスチックホイル中に包装した。その後、懸濁液を凍結させ、－８０℃で保存した。０．２μmのフィルターの目的は、最終的なバイオバーデン低減とした。凍結法により、更なる処理まで原薬懸濁液の保存条件が可能となった。

プロセス性能データ
任意のプロセス工程において変形形態Ｉを使用して記載されたプロセスで製造された原薬に対する、ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）収集のプロセスモニタリング及びプロセス内分析制御からの例示的な結果を表１及び図２～図３にまとめる。不純物の低減は、腫瘍崩壊性ウイルス製剤の高い要求及び基準に適合する。上流から最終原薬への不純物低減の性能は、ホスト細胞タンパク質について約３．５（０．４μg/mL未満）及びホスト細胞ＤＮＡについて約５．４（最終濃度 ３ng/mL未満）の対数低減値に相当する。これは、生物製剤開発における一般的な不純物制限の典型的な限界（例えば、Ｗ．Ｈ．Ｏ．ガイドラインに従った用量当たりに１０ng ｈｃＤＮＡ）をはるかに下回っている。全体的な収量から、最も高い要求に対してさえ、十分な高度に濃縮されたウイルス用量が可能となる。

表１：製造ユニット操作における感染性ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）含量の例、（遠心分離され、塩処理された）初期培養上清のＴＣＩＤ_５０に基づいて計算された回収率

実施例３：収集前での種々の添加剤の試験
図４
非遠心分離収集材料と比較して、ＶＳＶ－ＧＰの低い収集力価が、遠心分離による清澄化後の上清において観察された。ＶＳＶ－ＧＰは、ホスト細胞膜断片と相互作用し、結合していたと仮定された。ついで、結合したＶＳＶ－ＧＰを有するこれらの断片はペレット化したであろう。膜断片のペレット化を可能にし、上清中に「遊離」のままであったＶＳＶ－ＧＰを十分に清澄化する膜断片間の相互作用を破壊するための添加剤が提案された。清澄化された収集材料を感染後３０時間の時点で、画分 １５mLに分注し、添加剤を図４に示された最終濃度で加えた。ＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、Tween、Pluronicを含有するサンプルを室温で１０分間インキュベーションし、３５５ｇで３分間遠心分離した。ベンゾナーゼ及びトリプシンを含有するサンプルを３７℃で３０分間インキュベーションし、３５５ｇで３分間遠心分離した。硫酸デキストランを含有するサンプルを培養条件下で１８時間インキュベーションし、３５５ｇで３分間遠心分離した。ついで、上清を、ＴＣＩＤ_５０を使用して試験した。最も高い回収率が、２つの濃度のＮａＣｌ（０．２M及び１M）及び１００μg/mL 硫酸デキストランについて観察された。これは、これらの添加剤が上清中に遊離ウイルス粒子をうまく放出したことを示している。他の添加剤は、遠心分離後の力価の顕著な改善を示さなかった。

実施例４：種々の添加剤及び濃度の更なる試験
図５
収集時のＶＳＶ－ＧＰの力価を代替添加剤により改善することができるかどうかを調査するために、更なる添加剤試験を行った。添加剤をそれらがウイルスとどのように相互作用するかに基づいて選択した。塩化カリウムは、別の一価のイオンを試験するために、グリシンは、溶解度を上昇させ、排除圧力を生じさせることができ、Ｌ－アルギニンは、疎水性相互作用を緩和し、中性ｐＨで２＋／１－電荷を有する。清澄化された収集材料を感染後３０時間の時点で、画分 １５mLに分注し、添加剤を示された最終濃度で加え、室温で１０分間インキュベーションし、３５５ｇで３分間遠心分離した。ついで、上清をＴＣＩＤ_５０及びｑＰＣＲを使用して試験した。遠心分離されていない未処理の粗収集物は、感染性ＶＳＶ－ＧＰの高力価を示し、ＶＳＶ－ＧＰとホスト細胞デブリとの相互作用により、ＶＳＶ－ＧＰの新たな細胞に感染する能力は阻害されなかったが、大量のデブリは、後続の下流処理工程のプロセス性能に悪影響を及ぼすことが広く観察されている不純物である。図５で試験された全ての添加剤のうち、ＫＣｌのみが、ＮａＣｌより改善された感染回収を示した。また、ＫＣｌの濃度を上昇させると、ＶＳＶ－ＧＰ放出が改善されることも観察された。ただし、ＮａＣｌは、ＶＳＶ－ＧＰの良好な放出を示し、カチオン交換捕捉における溶出に使用され、他のプロセス工程に使用されるであろうため、ＮａＣｌは、ＶＳＶ－ＧＰ収集のための添加剤として使用されるであろうことが決定された。

実施例５：最少ＮａＣｌ濃度の試験
図６
ＮａＣｌを収集時にＶＳＶ－ＧＰを放出するための添加剤として選択した。ＮａＣｌは、高い感染回収を示し、プロセス全体を通して種々の濃度で存在するであろうためである。０．２M未満の低濃度のＮａＣｌが、同等のウイルス放出効果を有することができるかどうかを研究した。これは、塩感受性プロセス工程であるカチオン交換クロマトグラフィーを使用したＶＳＶ－Ｇの捕捉前に、フィードの導電率を低下させるのに必要な希釈バッファーの量を減少させるであろうためである。感染後３０時間の時点で、清澄化された収集材料を画分 １５mLに分注し、ＮａＣｌを図６に示された最終濃度で加え、室温で１０分間インキュベーションし、３５５ｇで３分間遠心分離した。ついで、上清を、ＴＣＩＤ_５０を使用して試験した。０．２M ＮａＣｌを使用した感染回収が最も高かったことが示されたが、より低濃度でもある程度の効果が示された。このため、この濃度は、収集時のＶＳＶ－ＧＰの高い回収率に対して最も有望であると考えられた。一方、後続のカチオン交換工程において、ＶＳＶ－ＧＰの捕捉を達成するのに必要とされる希釈係数を最小限にする。

実施例６：例示的なプロセス性能データ
図７Ａ＋図７Ｂ
ここで、実施例１及び２に詳細に記載されたプロセスについての、ＶＳＶ－ＧＰによる細胞の感染及び５０Ｌ（図７Ａ）又は４Ｌ（図７Ｂ）の培養容量における更なる例示的な性能データを示す。簡潔に、細胞を懸濁液中で４８時間培養し、ＶＳＶ－ＧＰを０．０００５のＭＯＩで加え、ウイルスを収集し、３６時間のＴＯＨで、最終濃度０．２M ＮａＣＬを加えることによりホスト細胞デブリから解離させた。ＶＳＶ－ＧＰを、０．６５μmの中空繊維精密ろ過を使用して、ホスト細胞デブリを除去するために清澄化し、ｈｃＤＮＡを低減するために、ＳＡＮ－ＨＱヌクレアーゼで処理した。フィードを、０．５μmの深層ろ過及び結合バッファー（最終濃度５０mM トリス、ｐＨ７．５）中での１：２希釈により、クロマトグラフィー捕捉前に調製した。ウイルス懸濁液を捕捉し、カチオン交換モノリスを使用して濃縮し、溶出を、塩工程を使用して達成した。捕捉材料を一晩保持した。その後、多峰性サイズ排除ＣＣ７００樹脂を使用したクロマトグラフィー洗練を行った。この工程により、捕捉中に除去されなかったＨＣＰ及びｈｃＤＮＡから、ＶＳＶ－ＧＰをさらに精製した。最後に、洗練された溶出液を製剤バッファーに透析ろ過し、０．２μmのフィルターを使用して無菌ろ過した。

実施例７：収集中の代替添加剤としてのＭｇＣｌ_２の試験
図８
以前に試験した賦形剤に加えて、塩化マグネシウムを感染細胞からのＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）の放出のために、収集時に加えた。二価のカチオンとしての塩化マグネシウムの効果を調査した。塩化マグネシウムは、水に高度に可溶性であり、より低い濃度で塩化ナトリウムと比較して同様のイオン強度を示すためである。さらに、マグネシウムカチオン（Ｍｇ^２＋）は、遊離ＤＮＡ／ＲＮＡの除去のための核酸の酵素的消化中の補因子として重要な役割を果たす。収集時に、ウイルス懸濁液を５mL又は４０mLのアリコートに分け、図８に示されたように、種々の量の塩化マグネシウム（０．０４M～０．０７M添加）と共にインキュベーションし（３４℃で１０分）、１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を、ＴＣＩＤ_５０及びＧＣ ｑＰＣＲを使用して分析した。ＮａＣｌ処理されたサンプル（０．２M添加）を対照サンプル（０．０７M ＭｇＣｌ_２と比較して同様のイオン強度）と同様に行った。

ＮａＣｌ処理された粗収集物（対照、０．２M添加）は、ＭｇＣｌ_２処理された粗収集物（０．０７M添加）と比較して、同様のウイルス力価（ＴＣＩＤ_５０及びＧＣ ｑＰＣＲ）を示した。ＭｇＣｌ_２のより低い濃度では、ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）の放出は減少した。塩化マグネシウムは、収集中のＨＥＫ２９３細胞からのウイルス放出のための可能性のある代替手段を表わす。また、塩処理されたウイルス懸濁液中のより低い導電率によっても、後続のカチオン交換クロマトグラフィー工程（捕捉）のための導電率を調整するのに必要な希釈バッファーの量を減少させる。

実施例８：ＮａＣｌを使用したウイルス放出のための深層ろ過後のフィルターフラッシュ
図９

収集時のＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）放出のための塩化ナトリウムの添加とは別に、深層ろ過後のフィルターフラッシュを使用したウイルス溶出を試験した。この研究では、ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）がフィルター材料中に保持された後にＨＥＫ２９３細胞から放出されるかどうかを調べた。

収集時に、ＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）を、振とうインキュベーター中において、ベンゾナーゼと共に３７℃で３０分間インキュベーションした。バルク収集物の清澄化のための深層ろ過（3M（商標）Zeta Plus（商標））を規定の容量フィルターロード（２００L/m²）、一定の容量フラックス（２００ＬＭＨ）及び１．５barの最大圧力（プレフィルター）で行った。深層ろ過後、ろ過容量の５分の１（２０％）でのフィルターフラッシュを、塩化ナトリウム（０．２５M及び０．５M ＮａＣｌ）を含有するトリスバッファーを使用して行った。図９は、収集時に添加物を加えなかった場合のＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）とＨＥＫ２９３細胞との相互作用の優れた例である。清澄化された収集物中の感染性ウイルス力価が、極めて低いためである。０．２５M ＮａＣｌでの第１のフィルターフラッシュを使用したウイルス放出は、総感染性ウイルス回収に既に十分であった。０．５M ＮａＣｌによる第２のフィルターフラッシュは、幾らかの更なるウイルスを放出したが、第１のフィルターフラッシュにより、ほとんどのウイルスが既に「溶出されていた」。フィルターフラッシュを使用したウイルス放出に必要なＮａＣｌの量は、収集時に加えたＮａＣｌの量（０．２M添加）に匹敵する。深層ろ過後にフィルターフラッシュをしたＶＳＶ－ＧＰ（－カーゴ）の良好な回収にもかかわらず、収集時のＮａＣｌの添加は、手法が単純であることを確信する。

実施例９：ＴＣＩＤ_５０を決定するための例示的な方法
細胞及びウイルス
ＢＨＫ－２１細胞（＃６０３１２６（Ｃ１３）、ＣＬＳ）を５％ ＣＯ_２及び３７℃で培養する。培地（ＧＭＥＭ ＃２１７１００８２、Thermo）に、８．７％ ＦＣＳ及び４．３％ トリプトースホスファートブロスを補充する。ＢＨＫ－２１細胞をＰＢＳで洗浄し、TrypLETM Select Enzymeと共に３７℃で６～８分間インキュベーションすることにより、細胞培養フラスコから剥離する。細胞を培地中で取り、Flex2（nova biomedical）を使用して計数し、９６ウェルプレートに播種する。

ＴＣＩＤ_５０アッセイ
９６ウェルプレートにおいて、ＧＭＥＭを補充した１００μl中の１０^４個 ＢＨＫ－２１細胞をウェル当たりに播種する。２４時間後、接着細胞をウイルスの１１個の０．５ｌｏｇ_１０の連続希釈液又は希釈液単独（陰性対照）に感染させ、その後、３７℃、５％ ＣＯ_２で３日間インキュベーションする。細胞培養ウェルの明視野画像を、４×対物レンズを使用するCytation5 Multi-Mode Imaging Reader（BioTek）を使用して撮影する。撮像されたウェルが、ＣＰＥ陽性であるか又は陰性であるかどうかは、眼により（すなわち、視覚的に）評価される。最終力価［ＴＣＩＤ_５０/mL］をＳｐｅａｒｍａｎ及びＫａｒｂｅｒの式により計算する。各ウイルスサンプルについて、連続希釈液による感染を同じ日に合計８つのプレートで行う。これらの８回の反復に基づいて、ＴＣＩＤ_５０/mLを上記されたように（単一の測定）計算する。

Claims (29)

1. 細胞培養物においてベシクロウイルスを製造する方法であって、
   （ｉ）
   ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、続けて細胞培養物を清澄化し、上清中のベシクロウイルス収集物を回収することにより
   又は
   ｂ．細胞培養物をろ過工程に供し、続けて、フィルターをウイルス放出剤ですすぎ、上清中のベシクロウイルス収集物を回収することにより、
   細胞培養物からベシクロウイルス収集物を得る工程を含み、
   ここで、未処理の細胞培養物に比べて、ウイルス放出剤で処理した細胞培養物から得られるウイルス収集物（ＴＣＩＤ_５０による測定）は、少なくとも５倍増加し、
   ここで、工程（ｉａ）におけるウイルス放出剤が、固体塩又は塩水溶液であり、工程（ｉｂ）におけるウイルス放出剤が、塩水溶液である、
   方法。
2. 工程ａ．において、細胞培養物が、深層ろ過、接線流ろ過又は遠心分離により清澄化されるか、又は工程ｂ．において、ろ過工程が、深層ろ過により行われ、そしてフィルターは、デプスフィルターである、請求項１記載の方法。
3. ベシクロウイルスが、水疱性口内炎ウイルスである、請求項１又は２記載の方法。
4. 水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇが、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている、請求項３記載の方法。
5. 工程（ｉａ）において、細胞培養物中の塩濃度を少なくとも０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５M上昇させ、工程（ｉｂ）における塩水溶液が、少なくとも０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５Mの濃度を有する、請求項１記載の方法。
6. 工程（ｉａ）における細胞培養物中の塩濃度の上昇及び工程（ｉｂ）における塩水溶液の濃度が、０．０１M～５M、０．０５M～５M、０．１M～５M、０．１５M～５M、０．２M～５M、０．２５M～５M、０．３M～５M、０．３５M～５M、０．４M～５M、０．４５M～５M又は０．５M～５Mである、請求項１記載の方法。
7. 塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２ 、ＮＨ_４Ｃｌ、硫酸ＮＨ_４、酢酸ＮＨ_４又は重炭酸ＮＨ_４である、請求項５～６のいずれか一項記載の方法。
8. 工程（ｉａ）において、ウイルス放出剤を細胞培養物に加えることにより、細胞培養物のイオン強度を、少なくとも０．０１Mもしくは少なくとも０．０５Mもしくは少なくとも０．１Mもしくは少なくとも０．１５Mもしくは少なくとも０．２Mもしくは少なくとも０．２５Mもしくは少なくとも０．３Mもしくは少なくとも０．３５Mもしくは少なくとも０．４Mもしくは少なくとも０．４５Mもしくは少なくとも０．５M又は０．０１M～５Mもしくは０．０５M～５Mもしくは０．１M～５Mもしくは０．１５M～５Mもしくは０．２M～５M上昇させ、工程（ｉｂ）において、少なくとも０．０１Mもしくは少なくとも０．０５Mもしくは少なくとも０．１Mもしくは少なくとも０．１５Mもしくは少なくとも０．２Mもしくは少なくとも０．２５Mもしくは少なくとも０．３Mもしくは少なくとも０．３５Mもしくは少なくとも０．４Mもしくは少なくとも０．４５Mもしくは少なくとも０．５M又は０．０１M～５Mもしくは０．０５M～５Mもしくは０．１M～５Mもしくは０．１５M～５Mもしくは０．２M～５Mのイオン強度を有するウイルス放出剤含有水溶液でフィルターをすすぐ、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
9. ベシクロウイルスをほ乳類ホスト細胞中で産生する、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
10. ほ乳類ホスト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であるか、又は懸濁液中で培養されるＨＥＫ２９３細胞である、請求項９記載の方法。
11. （ｉｉ）ベシクロウイルスを、溶液をカチオン交換体上にローディングすることにより捕捉する工程と、
    （ｉｉｉ）ベシクロウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程とをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項記載の細胞培養物においてベシクロウイルスを製造する方法。
12. カチオン交換体が、モノリス、樹脂又は膜である、請求項１１記載の方法。
13. カチオン交換体が、モノリス吸着材である、請求項１２記載の方法。
14. ベシクロウイルスを医薬組成物に製剤化する、請求項１～１３のいずれか一項記載の方法。
15. ベシクロウイルスに感染させた細胞培養物からベシクロウイルスを精製するための方法であって、
    （ｉ）
    ａ．細胞培養物にウイルス放出剤を直接加え、続けて細胞培養物を清澄化し、上清中のベシクロウイルス収集物を回収することにより
    又は
    ｂ．細胞培養物をろ過工程に供し、続けてフィルターをウイルス放出剤ですすぎ、上清中のベシクロウイルス収集物を回収することにより、
    細胞培養物からベシクロウイルス収集物を得る工程を含み、
    ここで、未処理の細胞培養物に比べて、ウイルス放出剤で処理した細胞培養物から得られるウイルス収集物（ＴＣＩＤ_５０による測定）は、少なくとも５倍増加し、
    ここで、工程（ｉａ）におけるウイルス放出剤が、固体塩又は塩水溶液であり、工程（ｉｂ）におけるウイルス放出剤が、塩水溶液である、
    方法。
16. 工程ａ．において、細胞培養物が、深層ろ過、接線流ろ過又は遠心分離により清澄化されるか、又は工程ｂ．において、ろ過工程が、深層ろ過により行われ、そしてフィルターは、デプスフィルターである、請求項１５記載の方法。
17. ベシクロウイルスが、水疱性口内炎ウイルスである、請求項１５記載の方法。
18. 水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇが、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰにより置き換えられている、請求項１７記載の方法。
19. 工程（ｉａ）において、細胞培養物中の塩濃度を少なくとも０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５Mまで上昇させ、工程（ｉｂ）における塩水溶液が、少なくとも０．０１M、０．０５M、０．１M、０．１５M、０．２M、０．２５M、０．３M、０．３５M、０．４M、０．４５M又は０．５Mの濃度を有する、請求項１５記載の方法。
20. 工程（ｉａ）における細胞培養物中の塩濃度の上昇及び工程（ｉｂ）における塩水溶液の濃度が、０．０１M～５M、０．０５M～５M、０．１M～５M、０．１５M～５M、０．２M～５M、０．２５M～５M、０．３M～５M、０．３５M～５M、０．４M～５M、０．４５M～５M又は０．５M～５Mである、請求項１９記載の方法。
21. 塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２ 、ＮＨ_４Ｃｌ、硫酸ＮＨ_４、酢酸ＮＨ_４又は重炭酸ＮＨ_４である、請求項１９～２０のいずれか一項記載の方法。
22. 工程（ｉａ）において、ウイルス放出剤を細胞培養物に加えることにより、細胞培養物のイオン強度を、少なくとも０．０１Mもしくは少なくとも０．０５Mもしくは少なくとも０．１Mもしくは少なくとも０．１５Mもしくは少なくとも０．２Mもしくは少なくとも０．２５Mもしくは少なくとも０．３Mもしくは少なくとも０．３５Mもしくは少なくとも０．４Mもしくは少なくとも０．４５Mもしくは少なくとも０．５M又は０．０１M～５Mもしくは０．０５M～５Mもしくは０．１M～５Mもしくは０．１５M～５Mもしくは０．２M～５M上昇させ、工程（ｉｂ）において、少なくとも０．０１Mもしくは少なくとも０．０５Mもしくは少なくとも０．１Mもしくは少なくとも０．１５Mもしくは少なくとも０．２Mもしくは少なくとも０．２５Mもしくは少なくとも０．３Mもしくは少なくとも０．３５Mもしくは少なくとも０．４Mもしくは少なくとも０．４５Mもしくは少なくとも０．５M又は０．０１M～５Mもしくは０．０５M～５Mもしくは０．１M～５Mもしくは０．１５M～５Mもしくは０．２M～５Mのイオン強度を有するウイルス放出剤含有水溶液でフィルターをすすぐ、請求項１５～１８のいずれか一項記載の方法。
23. ベシクロウイルスをほ乳類ホスト細胞から精製する、請求項１５～２２のいずれか一項記載の方法。
24. ほ乳類ホスト細胞は、ＨＥＫ２９３細胞であるか、又は懸濁液中で培養されるＨＥＫ２９３細胞である、請求項２３記載の方法。
25. （ｉｉ）ベシクロウイルスを、溶液をカチオン交換体上にローディングすることにより捕捉する工程と、
    （ｉｉｉ）ベシクロウイルスを溶出し、溶出液を回収する工程
    とをさらに含む、請求項１５～２４のいずれか一項記載のベシクロウイルスを精製するための方法。
26. カチオン交換体が、モノリス、樹脂又は膜である、請求項２５記載の方法。
27. カチオン交換体が、モノリス吸着材である、請求項２６記載の方法。
28. ベシクロウイルスを医薬組成物に製剤化する、請求項１５～２７のいずれか一項記載の方法。
29. 感染性粒子の量が、ＴＣＩＤ_５０/mLにより測定された場合、少なくとも１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９又は少なくとも１×１０^１０である、請求項１～２８のいずれか一項記載の方法によって製造され又は精製された水疱性口内炎ウイルスを含む、組成物。