JP7610845B2 - タンジェントフローろ過によるｍＲＮＡ精製 - Google Patents

Description

本発明は、（Ｉａ） 沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から沈殿したｍＲＮＡ分子を精製するステップと、（Ｉｂ） 精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子を洗浄し、溶解させるステップと、（ＩＩａ） キレート化剤を含む溶液を使用して、ｍＲＮＡ分子を精製するステップと、続いて、（ＩＩｂ） 精製済みのｍＲＮＡ分子を洗浄するステップとを含む、ｍＲＮＡ分子を精製する方法であって、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）が、タンジェントフローろ過を用いて実施される、方法に関する。

遺伝情報は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）として細胞内に保管されており、必要なときには、リボ核酸（ＲＮＡ）内に転写することができる。ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子は両方とも、窒素塩基、五炭糖及び少なくとも１個のリン酸基からなるヌクレオチドの集合体である。タンパク質合成のための遺伝情報を保有するｍＲＮＡ分子を含む、様々な種類のＲＮＡ分子が存在する。真核生物では、これらのｍＲＮＡ分子は、ＤＮＡから未成熟のｍＲＮＡ分子として転写され、続いて、例えば５’キャップ及び３’ポリアデノシン（ポリ（Ａ））テールの付加によって修飾される。次いで、成熟ｍＲＮＡ分子が細胞核から細胞質内に転移され、タンパク質に翻訳される。したがって、ＤＮＡ配列及び成熟ｍＲＮＡ分子の量、安定性及び翻訳効率は、主に、細胞内のタンパク質合成を左右する。

例えば治療との関連で細胞内における所望のタンパク質の合成を最適化するという目的では、ｍＲＮＡベースの手法は、有望なツールの代表である。ｍＲＮＡ分子の使用には、タンパク質翻訳のためにはｍＲＮＡ分子を細胞の細胞質内にのみ導入しなければならないという利点がある（Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら、２０１１、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１５０（３）：２３８～２４７； Ｙａｍａｍｏｔｏら、２００９、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ、７１（３）：４８４～４８９）。さらに、プラスミド等の適切なキャリアに含まれる各ＤＮＡ配列の使用に比較すると、ｍＲＮＡ分子の使用は、難度がより低く、より効率的なものであり、プラスミド又はプラスミドの一部がゲノムに組み込まれると染色体ＤＮＡが改変されてしまうという、かなり高いリスクもなくなっている。ｍＲＮＡ分子は、例えば治療用途においては、主にインビトロ転写によって生成される。このような手法は、プラスミドＤＮＡ自体の直線化又はプラスミドＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される、ＤＮＡ鋳型をベースとする。これらの手法は両方とも十分に確立されており、容易にスケールアップすることができる。しかしながら、いずれの場合においても、ｍＲＮＡ分子は、下流工程での用途に使用できるようにする前に、精製されなければならない。

汚染物質は、大部分の下流工程での用途、特定すると、治療に関する大部分の下流工程での用途に悪影響するため、合成されたｍＲＮＡ分子の精製は重要である。様々な副生成物が、ｍＲＮＡ合成等の上流プロセスで使用及び／又は生成される成分等の所望のｍＲＮＡ分子を汚染する可能性がある。インビボ手法とインビトロ手法のいずれの場合であっても、短いｍＲＮＡ分子フラグメントは例えば、加水分解及びアボーティブ転写（ａｂｏｒｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって生じ得る。ｍＲＮＡ分子の加水分解は、触媒又は酵素の存在下で起き得るが、自然に起きることもあり、この加水分解の結果として、各ｍＲＮＡ分子が分解されることにより、長さが可変のｍＲＮＡ分子フラグメントが形成される。アボーティブ転写（例えば、Ｒｅｖｙａｋｉｎら、２００６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４（５８０２）：１１３９～１１４３を参照）の場合、ＲＮＡポリメラーゼは、転写のためにＤＮＡ分子内にある各プロモーターエレメントに結合し、転写開始部位の周囲のＤＮＡ二本鎖を巻き戻し、ｍＲＮＡ分子の合成を開始させる。しかしながら、場合によっては、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡのプロモーター領域を脱出せず、ＤＮＡ分子の一部を翻訳しながら動かない状態にとどまることもある。巻き戻されたＤＮＡは酵素中に蓄積していくため、ＲＮＡポリメラーゼは、転写のための遺伝情報が保管されたＤＮＡの部分を排出し、長さ１～１５ヌクレオチドの合成ＲＮＡ分子を放出する（例えば、Ｇｏｌｄｍａｎら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４（５９２９）：９２７～９２８を参照）。例えば、このような短いｍＲＮＡ分子フラグメントを含む医薬組成物を投与したときの望ましくない免疫反応を回避するという目的では、さらなる下流工程での用途、特定すると、治療に関するさらなる下流工程での用途のための、フラグメント化されていない精製済みのｍＲＮＡ分子を得ることは、非常に望ましい。

沈殿及びろ過並びにこれらの組合せを含む、ｍＲＮＡ分子を精製するための様々な手法が存在する。望ましくない塩、ヌクレオチド及びタンパク質を除去するという目的では、例えば、ＲＮＡ沈殿ベースの手法は、精製されたＲＮＡ分子を、好適なバッファーに再懸濁可能なペレットとして得るための、費用効果が高い簡便な方法の代表である。沈殿のためには、例えばグアニジンチオシアネート（ＧＳＣＮ）、酢酸アンモニウム（ＮＨ_４ＯＡｃ）、エタノール、塩化リチウム及び酢酸ナトリウムを含む、多様な溶液を使用することができる（例えば、Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｒｓｃｈ、２０１３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、５３０：３３７～３４３によってレビューされている）。一方、ろ過法は、ｍＲＮＡ分子等のターゲット分子を精製するための機械的コンセプトをベースとする。ろ過の場合、フィード、すなわち、ｍＲＮＡ分子等のターゲット分子を含む溶液又は懸濁液は、フィルターメンブレンを通り抜け、又はフィルターメンブレンを端から端まで横断するが、後者の場合は、タンジェントフローろ過（ＴＦＦ）と呼ばれる。

例えば、ＷＯ２０１４／１５２９６６Ａ１及びＷＯ２０１５／１６４７７３Ａ１は、溶液及び／又は懸濁液の体積を変更しながらＴＦＦを使用して、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法を開示している。ｍＲＮＡ分子は、例えば尿素、ＧＳＣＮ及び／又は塩化カリウムを使用してｍＲＮＡ分子を沈殿させることによって精製され、沈殿物は、複数回洗浄される。しかしながら、いずれの場合においても、これらの方法が、失敗作のｍＲＮＡ分子及び／又は加水分解生成物等の短いｍＲＮＡフラグメントを考慮に入れたターゲットｍＲＮＡ分子の精製を可能にしているかは示されていない。

ＷＯ２０１６／１９３２０６Ａ１は、ＲＮＡを製造及び精製するための方法であって、ＲＮＡ精製が、少なくとも１つのＴＦＦステップを含み、好ましくは、フェノール／クロロホルム抽出並びに／又はＤＮＡ及び／若しくはＲＮＡ沈殿を含むステップを含まない、方法を開示している。さらに、ＲＮＡ分子は好ましくは、例えばカチオン交換及び／若しくはイオン交換クロマトグラフィー、並びに／又は逆相クロマトグラフィーを用いるさらなる精製ステップの適用によって精製される。上記のように、上記文献は、失敗作のｍＲＮＡ分子及び／又はｍＲＮＡ分子の加水分解生成物を考慮に入れたターゲットＲＮＡ分子の精製を開示していない。

ＷＯ２０１８／１５７１３３Ａ１は、ｍＲＮＡ分子の大規模な精製のための方法を開示している。この発明は特に、清浄で均一なｍＲＮＡ分子組成物を調製するための、撹拌された細胞又は撹拌型Ｎｕｔｓｃｈｅろ過装置に関する。実施例において示されているように、ＧＳＣＮを使用してｍＲＮＡ分子を沈殿させ、沈殿物は、ＧＳＣＮ及びエタノールを含む溶液を使用して洗浄する。興味深いことに、特許請求された方法によって得られたｍＲＮＡ分子組成物が、ＴＦＦを使用して精製されたｍＲＮＡ分子を含む組成物と比較されており、ＴＦＦベースの精製のみでは、ターゲットｍＲＮＡ分子の他に残留酵素も含む溶液が生じたことが示されている。

ＷＯ２０１４／１５２９６６Ａ１ ＷＯ２０１５／１６４７７３Ａ１ ＷＯ２０１６／１９３２０６Ａ１ ＷＯ２０１８／１５７１３３Ａ１

Ｔａｖｅｒｎｉｅｒら、２０１１、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１５０（３）：２３８～２４７； Ｙａｍａｍｏｔｏら、２００９、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ、７１（３）：４８４～４８９ Ｒｅｖｙａｋｉｎら、２００６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１４（５８０２）：１１３９～１１４３ Ｇｏｌｄｍａｎら、２００９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２４（５９２９）：９２７～９２８ Ｗａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｒｓｃｈ、２０１３、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、５３０：３３７～３４３

したがって、特に失敗作のｍＲＮＡ分子及びｍＲＮＡ分子の加水分解生成物を考慮に入れて、ｍＲＮＡ分子を大規模に効率的に精製することができ、これにより、ＧＳＣＮ等の下流工程での用途で問題となり得る塩を確実に低いレベルに抑えることと、容易に自動化できるシステムを使用することとを可能にする、いつでも使える代替ソリューションを入手することが、依然として必要とされている。

本出願は、特許請求の範囲に記載の実施形態を提供することにより、精製済みのｍＲＮＡ分子をハイスループットで得るという必要性に対処する。

特に、本発明は、（Ｉａ） 第１の溶液を使用して、沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から沈殿したｍＲＮＡ分子を精製するステップと、（Ｉｂ） 第２の溶液を使用して、ステップ（Ｉａ）において得られた精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子を洗浄し、溶解させるステップと、（ＩＩａ） キレート化剤を含む第３の溶液を使用して、ステップ（Ｉｂ）において得られた溶解したｍＲＮＡ分子からｍＲＮＡ分子を精製するステップと、続いて、（ＩＩｂ） 第４の溶液を使用して、ステップ（ＩＩａ）において得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を洗浄するステップとを含む、ｍＲＮＡ分子を精製する方法であって、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）が、タンジェントフローろ過を用いて実施される、方法に関する。

驚くべきことに、本発明による方法は、高度のｍＲＮＡ分子精製をもたらし、この結果として、精製済みのｍＲＮＡ分子を含むが、ｍＲＮＡ分子の加水分解生成物及び失敗作のｍＲＮＡ分子を全く又はほとんど含まない溶液をもたらすことがわかった。特に、前記方法の適用により、下流工程での用途で問題となり得るｍＲＮＡ分子の加水分解生成物、失敗作のｍＲＮＡ分子、タンパク質及び塩が効率的に除去されることがわかった。したがって、本発明による方法を適用することにより、医薬用途等の下流工程での用途に適する、精製済みのｍＲＮＡ分子を含む溶液を得ることができる。

本発明との関連において、「精製するための方法」という用語は、精製すべき前記ターゲット分子及びターゲット分子以外の成分を含む混合物、例えば溶液又は懸濁液から、ターゲット分子を得るための方法であって、前記方法の実施後に得られた溶液中におけるターゲット分子の濃度が、前記方法の実施前における混合物中のターゲット分子の濃度との比較で高められ、又は上昇している、方法を指す。ターゲット分子の精製は、前記ターゲット分子以外の成分を除去又は少なくとも実質的に除去することによる、前記ターゲット分子の濃縮と言うこともできる。

本発明との関連において、ターゲット分子は、ｍＲＮＡ分子である。本明細書において、「ｍＲＮＡ」及び「ｍＲＮＡ分子」という用語は、相互に置きかえ可能に使用されているが、例えばＡ、Ｃ、Ｇ及び／又はＵヌクレオチド、すなわち、それぞれの窒素塩基としてアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルを含むヌクレオチドからなる一本鎖ＲＮＡ分子集合体を指す。さらに、ｍＲＮＡ分子は、翻訳中にアミノ酸配列を合成しているときに鋳型として使用され得る、１個以上のコード配列を含む。したがって、精製すべきｍＲＮＡ分子は好ましくは、コード配列、すなわち、タンパク質等のアミノ酸配列に翻訳することが可能であり、開始コドン及び終始コドンを含む、配列を含む。コード配列は、天然の配列であってもよいし、使用すべき天然の配列に由来する部分的に若しくは完全にコドン最適化された配列であってもよいし、又は人工の配列であってもよい。コドン最適化は、いくつかの種によって所与のアミノ酸のために優先的に使用されるコドンが存在することもあるという理由で、タンパク質の発現を、そのタンパク質に対応するｍＲＮＡ分子の翻訳効率を高めることによって最大化するために用いられる技法を指す。さらに、前記ｍＲＮＡ分子は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び／若しくは３’非翻訳領域、１個以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、翻訳を促進するための１個以上のさらなる配列、並びに／又は、作用の持続期間を調節及び／若しくは延長するための１個以上の修飾を含んでもよい。ｍＲＮＡ分子のさらなる特徴は、後でさらに詳細に説明されている。
したがって、「ｍＲＮＡ」という用語は、アミノ酸配列の発現に適し、又は、タンパク質等のアミノ酸配列に翻訳することができる、任意のＲＮＡ分子を意味するように解されるべきである。したがって、「ｍＲＮＡ分子」は、そのｍＲＮＡ分子を特徴付ける特性及び／又は活性を示し、したがって、タンパク質等のアミノ酸配列に翻訳することが可能である、ｍＲＮＡ分子と解されるように意図されているが、前記アミノ酸配列は、そのアミノ酸配列を特徴付ける活性及び／又は特性を示す。

本明細書において、「アミノ酸配列」という用語は、任意の種類のアミノ酸配列、すなわち、各アミノ酸がペプチド結合を介して連結されている、２個以上のアミノ酸からなる鎖を包含し、着目する任意のアミノ酸配列を指す。好ましくは、コード化アミノ酸配列は、少なくともアミノ酸５個分の長さであり、より好ましくは、少なくともアミノ酸１０個分の長さであり、さらにより好ましくは、少なくともアミノ酸５０個分、１００個分、２００個分又は５００個分の長さである。したがって、「アミノ酸配列」という用語は、短鎖ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、タンパク質並びに公知のタンパク質の部分、好ましくは機能的部分等のこれらのフラグメントを包含する。前述のものは例えば、タンパク質の生体活性部分であってもよいし、又は、抗体の産生に効果的なものであり得るエピトープ等の抗原性部分であってもよい。アミノ酸配列の機能に関して限定はなく、可能なアミノ酸配列は、後でさらに詳述されている。

対照的に、前記ｍＲＮＡ分子の精製中に除去すべき成分、したがって、ターゲット分子以外の成分には例えば、加水分解によって部分的に又は完全に分解されるｍＲＮＡ分子が挙げられる。加水分解による分解は、ランダム過程であり、得られた分解生成物は、本明細書において「加水分解生成物」又は「ｍＲＮＡ分子の加水分解生成物」と呼ぶものであり、加水分解したｍＲＮＡ分子より少なくとも１ヌクレオチド短い。したがって、加水分解したｍＲＮＡ分子の長さに応じて、得られた加水分解生成物は、例えば１０，０００ヌクレオチド未満、好ましくは５，０００ヌクレオチド未満、より好ましくは５００ヌクレオチド未満、さらにより好ましくは２５０ヌクレオチド未満、さらにより好ましくは１７０ヌクレオチド未満、最も好ましくは１２０ヌクレオチド未満の長さを有し得る。除去すべき成分の別の例は、例えば５０ヌクレオチド未満、好ましくは２５ヌクレオチド未満、より好ましくは１５ヌクレオチド未満の長さを有し得る失敗作のｍＲＮＡ分子である。

さらに、ｍＲＮＡ分子の精製中に除去すべき成分には例えば、ｍＲＮＡ分子のインビトロ転写等のターゲット分子のインビトロ合成中に使用される成分、並びに／又は、ターゲット分子の合成及び／若しくはｍＲＮＡ分子の転写のための鋳型の増幅を目的として使用される細胞に含まれる成分が挙げられる。ｍＲＮＡ分子のインビトロ転写の場合、このような成分は例えば、インビトロ転写のために使用される酵素等のタンパク質；塩；マグネシウムイオン等のイオン；三リン酸ヌクレオシド；５’キャップ及び／又は５’キャップアナログを含むモノホスフェート、ジホスフェート、及び／若しくはトリホスフェート；アボーティブ転写産物；加水分解生成物；３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等のバッファー；並びに／又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化剤を含む。

本発明による方法は、タンジェントフローろ過（ＴＦＦ）によって実施される。ＴＦＦは、精製すべきｍＲＮＡ分子を含む懸濁液又は溶液が、フィルターメンブレンの表面を端から端まで横断するように接線方向に流れ、このとき、ｍＲＮＡ分子が、好ましくは保持液中に保持されることを特徴とする。したがって、ｍＲＮＡ分子を精製するためにＴＦＦを実施することにより、そのときまでには、フィルターメンブレンを閉塞させる可能性があるろ過ケーキが存在しなくなり、この結果として、フィルターメンブレンの使用可能時間を長くすることができる。
したがって、本発明によるターゲット分子を精製するためのシステムは、ＴＦＦシステムである。ＴＦＦシステムは一般的に、カプセル、カセット及びホルダー又は中空繊維モジュール等のフィルター装置と、ポンプと、管と、バルブ又はクランプと、流体貯蔵器と、任意選択により圧力計とを備える（図１を参照）。このようなＴＦＦシステムは、高いｍＲＮＡ分子の濃度が高い場合であっても、フィルターメンブレンの細孔を閉塞させることなく、連続的に使用することができる。ＴＦＦシステムの使用は、精製すべきｍＲＮＡ分子のハイスループット精製を可能にするため、有利である。

注意点として、「溶液」という用語は一般的に、２種以上物質の均一な混合物を指し、特に、物質の液体状態に適用されるが、気体及び固体の溶液も同様に可能である。本明細書において、「溶液」という用語は、特に本発明による「第１の溶液」、「第２の溶液」、「第３の溶液」及び「第４の溶液」に関する場合、水、均一であることが好ましい液体の混合物及び例えば液体と、好ましくは溶解した塩との混合物等の液体を包含する。

本発明によれば、沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から前記沈殿したｍＲＮＡ分子を精製するステップ（Ｉａ）を含む、ｍＲＮＡ分子を精製する方法が提供される。前記精製は、第１の溶液を使用して達成される。沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液は例えば、細胞溶解又はインビトロ転写によって得ることができる。したがって、沈殿したｍＲＮＡ分子は、タンパク質及び酵素を含むアミノ酸配列、ヌクレオシド三リン酸、バッファー成分、並びに、任意選択により５’キャップ及び５’キャップアナログ等、細胞の構成要素又はインビトロ転写混合物の成分から精製されなければならない。５’キャップ及び５’キャップアナログは、例えばｍＲＮＡ分子がインビトロで転写され、同時転写５’キャッピングされた場合においては、ステップ（Ｉａ）を実施するために使用された懸濁液に含まれてもよい。したがって、ステップ（Ｉａ）は、沈殿したｍＲＮＡ分子に由来する細胞の構成要素又はインビトロ転写混合物の成分を除去するために有利である。

本発明の一部の実施形態では、第１の溶液は、酢酸アンモニウム（ＮＨ_４ＯＡｃ）を含有する。したがって、沈殿したｍＲＮＡ分子は、ＮＨ_４ＯＡｃを含む第１の溶液を使用して、懸濁液から精製される。さらに、第１の溶液は、好ましくは１～１２の範囲、より好ましくは１～１０の範囲、さらにより好ましくは３～９の範囲、最も好ましくは６～８の範囲のｐＨを有する。したがって、沈殿したｍＲＮＡ分子は、ＮＨ_４ＯＡｃを含む第１の溶液を使用して、沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から精製され、１～１２の範囲、好ましくは１～１０の範囲、より好ましくは３～９の範囲、さらにより好ましくは６～８の範囲のｐＨを有する。

本発明によるｍＲＮＡ分子を精製する方法は、第２の溶液を使用して、上記ステップ（Ｉａ）において得られた精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子を洗浄し、溶解させるステップ（Ｉｂ）をさらに含む。前記第２の溶液は、ｍＲＮＡ分子を再懸濁させることが可能であり、ｍＲＮＡ分子が安定な状態に留まり、すなわち、加水分解しない、任意の溶液、例えば水であってよい。ステップ（Ｉｂ）を実施することは、特に第１の溶液の成分を除去するため、及び溶解したｍＲＮＡ分子を得るために有利である。本発明の一部の実施形態では、第２の溶液は、水である。

本発明によるｍＲＮＡ分子を精製する方法は、キレート化剤を含む第３の溶液を使用して、ステップ（Ｉｂ）において得られた溶解したｍＲＮＡ分子からｍＲＮＡ分子を精製するステップ（ＩＩａ）をさらに含む。これは、溶解したｍＲＮＡ分子を含む溶液から失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物を除去するために特に有利である。

「キレート化剤」という用語は、カチオンをキレート化する分子を指し、特には、ｐＨ及び／若しくは温度、キレート化剤の濃度並びに／又はキレート化すべきカチオンの種類等のいくつかの因子に応じて、配位化合物内の中心原子に結合することができる供与基を有する、分子を指す。キレート化剤は例えば、分子１個当たりの座（ｄｅｎｔａｔｅ）の数、すなわち、供与基の数、及び／又は、キレート化すべきカチオンにある配位座の数によって特徴付けることができる。例えば、キレート化剤ＥＤＴＡは、６つの座を有し、キレート化剤と二価カチオンとが１：１の錯体になるように二価カチオンをキレート化する。
好ましくは、本発明との関連において、「キレート化剤」という用語は、例えば二価マグネシウムイオン及び二価カルシウムイオン並びに／又は三価鉄イオン等の二価並びに／又は三価カチオンを錯化することができる、キレート化剤を指す。一般に、カチオンにある配位座が４つ未満のキレート化剤は、特に二価及び／又は三価カチオンを効率的に錯化するという観点においては、カチオンにある配位座が４つ以上のキレート化剤より低いキレート化活性を有する。

本発明によるキレート化剤は、キレート化すべきカチオンにある配位座が少なくとも４つのキレート化剤であり、より好ましくは、キレート化すべきカチオンにある配位座が４つより多いキレート化剤であり、さらにより好ましくは、「強力キレート化剤」とも呼ばれる、分子１個当たり少なくとも４つの座を有するキレート化剤であり、より好ましくは、医薬組成物及び／又は配合物中に使用される、キレート化すべきカチオンにある配位座が４つより多いキレート化剤であり、さらにより好ましくは、ＥＤＴＡである。医薬組成物中に使用される、キレート化すべきカチオンにある配位座が４つより多いキレート化剤は例えば、Ｎａ２ＥＤＴＡ溶液を含むアンチドット（ａｎｔｉｄｏｔ）（例えば、２ｇ／１０ｍｌ；例えば、ＧＰＵＰｈａｒｍａ ＧｍｂＨを参照）及び／若しくはＥＤＴＡカルシウム二ナトリウムを含むアンチドット（例えば、５０ｍｇ／ｍｌ、Ａｍｐ．１０ｍｌ；例えば、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ ＳＥＲＢを参照）中に使用され、又は例えば、賦形剤として使用される（例えば、Ｐｈｅｎｈｙｄａｎ，Ｄｅｓｉｔｉｎ Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ ＧｍｂＨ；又はＳｏｌｕｖｉｔ Ｎ，Ｂａｘｔｅｒ；又はＦｌｕｉｍｕｃｉｌ，Ｚａｍｂｏｎ ＧｍｂＨを参照）。

したがって、本発明の一部の実施形態では、キレート化剤は、ＥＤＴＡである。好ましいキレート化剤の例は、表１に列記されており、ＥＤＴＡが最も好ましいキレート化剤である。

ＥＤＴＡ等の強力キレート化剤は特に、マグネシウムカチオン等の二価カチオンを効率的に除去することができる。マグネシウムカチオンは、例えばｍＲＮＡ分子の転写に関与する酵素によって必要とされるため、細胞及びインビトロ転写混合物中に高いレベルで存在する。本発明者らは、ステップ（ＩＩａ）においてＥＤＴＡ等の強力キレート化剤を使用することにより、加水分解生成物及び失敗作のｍＲＮＡ分子の効率的な除去を達成することが可能であり、これにより、高度のｍＲＮＡ分子精製ができるようになることを発見した。理論に縛られるわけではないが、上記で言及した前記カチオンは、ｍＲＮＡ分子の二次構造及び三次構造の形成を促進することが可能であり、特にマグネシウムカチオン等の二価カチオンの除去は、失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物が、前記カチオンの存在下においては、精製すべきｍＲＮＡ分子に結合しやすいことがあるため、ｍＲＮＡ分子の精製との特段の関連性を有し得ると仮定されている。したがって、ステップ（ＩＩａ）においてＥＤＴＡ等の強力キレート化剤を使用して二価カチオンを除去することにより、融点が低下し、ｍＲＮＡ分子の二次構造及び／又は三次構造が影響を受けると考えられている。

したがって、失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物は、透過物として除去することができる。したがって、ステップ（ＩＩａ）は、失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物を除去するために特に有利である。

本発明によれば、第３の溶液は、キレート化剤、好ましくは、上記に規定の強力キレート化剤、最も好ましくはＥＤＴＡを含む。上記のように、所与のキレート化剤の錯体形成定数（ｃｏｍｐｌｅｘ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ）がｐＨによって影響されるため、キレート化剤の錯化能力は、ｐＨによって影響され得る。例えばＥＤＴＡは、マグネシウムイオンのキレート化という観点においては、８～１０のｐＨ等のより高いｐＨ値では特に強力である。しかしながら、所与のキレート化剤の錯化能力と、精製すべきｍＲＮＡ分子の安定性との最適なトレードオフを考慮すると、ｐＨを調節することが望ましい。この点について、ＥＤＴＡ等の強力キレート化剤は、１～１０のｐＨ、好ましくは６～８のｐＨにおいて、特に二価カチオンを効率的に除去することができることが観察されている。したがって、理論に縛られるわけではないが、これにより、特にｍＲＮＡ分子に結合した失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物の融点を、ＥＤＴＡ等の強力キレート化剤によって低下させることができ、この結果として、失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物を除去しながら、同時にｐＨを、精製すべきｍＲＮＡ分子の安定性を保つ値に調整することができると仮定されている。
したがって、好ましい一実施形態では、キレート化剤を含有する第３の溶液中におけるｐＨ値は、各キレート化剤が最適なキレート化能を有するｐＨ値に調節される。
したがって、例えば１～１０のｐＨ、好ましくは６～８のｐＨでＥＤＴＡ等の強力キレート化剤を使用することは、二価カチオンの効率的な除去のため、したがって、ひいては、失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物の効率的な除去のために有利である。上記代替的なキレート化剤のうちの１つが使用される場合、ｐＨは、前記代替的なキレート化剤がイオン、好ましくは、二価マグネシウムカチオンの除去に効果的であるｐＨ値に調節されることが必要になることもある。対応するｐＨ範囲は、好ましいキレート化剤に関する上記表の中で示されている。

一部の実施形態第３の溶液は、１～１０の範囲、好ましくは３～９の範囲、より好ましくは６～８の範囲のｐＨを有する。

第３の溶液のｐＨは、バッファーを使用して得ることができる。好ましいバッファー（これらのバッファーの各ｐＨ範囲は、カッコ内に与えられている。）は、２－［ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ］－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－ジオール（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ；ｐＨ範囲５．８～７．２）、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ；ｐＨ範囲６．０～７．２）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ；ｐＨ範囲６．１～７．５）、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ；ｐＨ範囲６．１～７．５）、２－ヒドロキシ－３－モルホリン－４－イルプロパン－１－スルホン酸（ＭＯＰＳＯ；ｐＨ範囲６．２～７．６）、１，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（ビストリスプロパン；ｐＨ範囲６．３～９．５）、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ；ｐＨ範囲６．４～７．８）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ；ｐＨ範囲６．５～７．９）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ；ｐＨ範囲６．８～８．２）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ；ｐＨ範囲６．８～８．２）、３－（Ｎ，Ｎ－ビス［２－ヒドロキシエチル］アミノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ；ｐＨ範囲７．０～８．２）、４－（Ｎ－モルホリノ）ブタンスルホン酸（ＭＯＢＳ；ｐＨ範囲６．９～８．３）及び３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸（ＴＡＰＳＯ；ｐＨ範囲７．０～８．２）を含む。特に好ましいバッファーは、６～８の好ましいｐＨ、より好ましくは６．５～７．５のｐＨを有するＭＯＰＳである。

一部の実施形態第３の溶液は、１～１０の範囲、好ましくは３～９の範囲、より好ましくは６～８の範囲のｐＨを有し、バッファー、好ましくはＭＯＰＳを含む。

本発明の一部の実施形態では、第３の溶液は、ＭＯＰＳバッファーを含み、好ましくは、キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡの添加前にＭＯＰＳバッファーのｐＨを調節することによって得られる。
したがって、本発明の一部の実施形態では、特にマグネシウムカチオン等の二価カチオンを除去するためのキレート化剤として好ましくはＥＤＴＡを含む第３の溶液は、ＭＯＰＳバッファーをさらに含み、６～８のｐＨを有する。本発明の一部の実施形態では、ＭＯＰＳバッファーを調製し、前記ＭＯＰＳバッファーを１～１０のｐＨ、好ましくは６～８のｐＨに調節した後、好ましいキレート化剤としてＥＤＴＡを加えることによって、第３の溶液を得ることができる。
本発明の一部の実施形態では、第３の溶液は、４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含み、６～８のｐＨ、好ましくは６．５～７．５のｐＨを有する。

本発明によるｍＲＮＡ分子を精製する方法は、第４の溶液を使用して、ステップ（ＩＩａ）において得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を洗浄するステップ（ＩＩｂ）をさらに含む。第４の溶液は、ｍＲＮＡ分子が安定な状態のままである、すなわち、加水分解しない、任意の溶液であってよい。ステップ（ＩＩｂ）は、前記第４の溶液が例えば塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを含み、又は水である場合においては、第３の溶液の成分を除去するために有利である。

上記のように、第２及び第４の溶液は、ｍＲＮＡ分子が安定な状態のままである、すなわち、加水分解しない、任意の溶液であってよい。このような流体は、例えば水、好ましくは、注射用水（ＷＦＩ水）等のヌクレアーゼ不含水又はＲＮアーゼ不含水であってよい。さらに、第４の溶液の場合は、このような流体は、例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝グルコース、塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムであってもよい。

したがって、本発明の一部の実施形態では、第４の溶液は、水である。本発明の一部の実施形態では、第２及び第４の溶液は、水である。
本発明の一部の実施形態では、第４の溶液は、塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを含む。

本発明の一部の実施形態では、第２の溶液は、水であり、及び／又は第４の溶液は、水であり、若しくは、塩化ナトリウム及び／若しくはクエン酸ナトリウムを含む。これは、ステップ（ＩＩｂ）の後に、さらなる下流工程での処理又は用途の前にさらなるステップにおいて除去しなければならない成分を導入するｃことなく、精製済みのｍＲＮＡ分子を含む溶液を得るために有利である。

本発明の好ましい実施形態では、第２の溶液は、水であり、第４の溶液は、好ましくは４～５のｐＨの塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを含む。これは、塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムが好ましくは、精製済みのｍＲＮＡ分子を含む医薬組成物に含まれるため、特に治療との関連においては、非常に有利である。したがって、これは、塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムが高頻度で使用される医薬組成物成分であるため、得られたｍＲＮＡ分子を後で医薬組成物中に配合するという観点においては、有利である。したがって、医薬組成物の好ましい成分である塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを含む第４の溶液を使用することにより、前記ｍＲＮＡ分子を精製するために必要なステップと、前記ｍＲＮＡ分子を医薬組成物中に配合するために必要なステップとの、時間効率及び費用対効果が高い統合を可能にする。

第４の溶液が塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを含む場合、第４の溶液のｐＨは、好ましくは３～６、より好ましくは３．５～５．５、さらにより好ましくは４～５である。

本発明による方法の好ましい実施形態では、エタノールは、前記方法において使用された第１、第２、第３及び／又は第４の溶液のいずれにも含まれない。

上記のように、驚くべきことに、本発明による方法の適用により、高度のｍＲＮＡ分子精製を達成することができることがわかった。好ましくは、前記方法の実施によって得られた溶液は、精製済みのｍＲＮＡ分子を含むが、加水分解生成物及び失敗作のｍＲＮＡ分子を含まず、又は非常に低いレベルしか含まない。より好ましくは、ｍＲＮＡ分子の百分率は、ステップ（ＩＩｂ）後の得られた溶液中において、すべてのＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ分子、加水分解生成物及び失敗作のｍＲＮＡ分子）のうちの少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％である。これは、例えばゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析等の当業者に周知の方法によって測定することもできるし、又は、キャピラリーゲル電気泳動若しくはＦｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ分析等のキャピラリー電気泳動によって得られた電気泳動図を調査することによって測定することもできる。後に挙げた手法は、下記の実施例において、例示としてより詳細に説明されている。

本発明の一部の実施形態では、少なくともステップ（ＩＩａ）、好ましくはステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）は、０℃～２５℃の温度、好ましくは２℃～８℃の温度で実施される。したがって、本発明による方法は、少なくともステップ（ＩＩａ）の場合においては、すなわち、強力キレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを含む第３の溶液を使用して、ステップ（Ｉｂ）において得られた溶解したｍＲＮＡ分子からｍＲＮＡ分子を精製する場合においては、好ましくは０℃～２５℃で実施される。この結果、失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物は、０℃～２５℃の温度、好ましくは２℃～８℃の温度でステップ（ＩＩａ）を実施することによって除去される。２℃～８℃の温度等の特段により低い温度は、加水分解によるｍＲＮＡ分子の分解量が、特に２５℃超の温度等のより高い温度でステップ（ＩＩａ）を実施したときに観察される分解の量との比較で減少するため、有利である。したがって、多量の精製済みのｍＲＮＡ分子を得るためには、少なくとも本発明による方法のステップ（ＩＩａ）、好ましくは、少なくともステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を、０℃～２５℃の温度、好ましくは２℃～８℃の温度で実施することが有利である。

本発明の一部の実施形態では、懸濁液に含まれる沈殿したｍＲＮＡ分子は、好ましくはＤＮＡ鋳型を用いるインビトロ転写によって得られる。したがって、本発明による精製すべきｍＲＮＡ分子は、当技術分野において知られた任意の方法によって製造することができる。好ましくは、ｍＲＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型を用いてインビトロで転写される。

インビトロ転写は、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸、緩衝系及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等の適切なＲＮＡポリメラーゼを含有する、精製済みの線形の又は直線化されたＤＮＡ鋳型を必要とする。例えば、このような精製された線形ＤＮＡ鋳型は、インビトロで化学合成することが可能であり、任意選択により続いて、例えばＰＣＲベースの方法を用いる鋳型増幅を行ってもよい。代替的には、転写のためのＤＮＡ鋳型は、一般に細胞溶解によって得られ、精製され、例えば部位特異的な制限酵素を使用して直線化された、ＤＮＡプラスミドから得ることも可能である。いずれの場合においても、得られた線形ＤＮＡ鋳型配列は、標準的な実験プロトコルを採用した、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵヌクレオチドの存在下におけるｍＲＮＡ分子のインビトロ転写のために使用することができる。

本発明の一部の実施形態では、精製すべきｍＲＮＡ分子は、無修飾及び／又は修飾ヌクレオチドの存在下におけるインビトロ転写によって生成される。したがって、精製すべきｍＲＮＡ分子は、無修飾及び／又は修飾ヌクレオチドの使用により、線形の又は直線化されたＤＮＡ鋳型をベースとするインビトロ転写によって合成することができる。本明細書において使用されている「無修飾ヌクレオチド」という用語は、上記Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵヌクレオチドを指す。特に、ｍＲＮＡ分子のインビトロ転写の場合においては、前記用語は、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵヌクレオチドを指す。本明細書において使用されている「修飾ヌクレオチド」という用語は、任意の天然の又は化学合成されたＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵヌクレオチドの異性体と、任意の天然の又は化学合成されたアナログ、代替的若しくは修飾ヌクレオチド、又は、例えば化学修飾又は置換残基を有するこれらの異性体とを指す。修飾ヌクレオチドは、塩基修飾及び／又は糖修飾を有することができる。修飾ヌクレオチドは、例えばｍＲＮＡ分子の５’キャップを対象とする、リン酸基修飾を有することもできる。修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドの共有結合修飾によって転写後合成されたヌクレオチドも含む。さらに、無修飾ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの任意の適切な混合物も可能である。非限定的な数の修飾ヌクレオチドの例は、文献（例えば、Ｃａｎｔａｒａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２０１１、３９（Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ１９５～Ｄ２０１；Ｈｅｌｍ及びＡｌｆｏｎｚｏ、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ、２０１４、２１（２）：１７４～１８５；Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ、２０１２、５１（２９）：７１１０～３１）で確認することが可能であり、いくつかの好ましい修飾ヌクレオチドは、それぞれのヌクレオシド残基をベースにして、以下に例示として言及されている：
１－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルリン酸アデノシン、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－アセチルアデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、７－メチルアデノシン、２－メチルチオアデノシン、２－メトキシアデノシン、２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシアデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザアデノシン、７－デアザ－８－アザアデノシン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン；２－チオシチジン、３－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、リシジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、２－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、イソシチジン、プソイドシチジン、プソイドイソシチジン、２－チオシチジン、２’－メチル－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－ブロモシチジン、２’－アジド－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－アザシチジン、３－メチルシチジン、１－メチルプソイドイソシチジン、ピロロシチジン、ピロロプソイドイソシチジン、２－チオ－５－メチルシチジン、４－チオプソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチルプソイドイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザプソイドイソシチジン、１－メチル－１－デアザプソイドイソシチジン、２－メトキシシチジン、２－メトキシ－５－メチルシチジン、４－メトキシプソイドイソシチジン、４－メトキシ－１－メチルプソイドイソシチジン、ゼブラリン、５－アザゼブラリン、５－メチルゼブラリン、５－アザ－２－チオゼブラリン、２－チオゼブラリン；１－メチルグアノシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシルリン酸グアノシン、７－メチルグアノシン、ヒドロキシワイブトシン、７－アミノメチル－７－デアザグアノシン、７－シアノ－７－デアザグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２Ｊ－トリメチルグアノシン、イソグアノシン、４－デメチルワイオシン、エポキシクエオシン、不完全修飾型（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシワイブトシン、メチル化不完全修飾型ヒドロキシワイブトシン、イソワイオシン、ペルオキシワイブトシン、ガラクトシルクエオシン、マンノシルクエオシン、クエオシン、アルカエオシン、ワイブトシン、メチルワイオシン、ワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルデメチルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシン、７－アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、７－デアザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアノシン、６－チオグアノシン、６－チオ－７－デアザグアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザグアノシン、７－メチルグアノシン、６－チオ－７－メチルグアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシグアノシン、１－メチルグアノシン、８－オキソグアノシン、７－メチル－８－オキソグアノシン、１－メチル－６－チオグアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオグアノシン、Ｎ１－メチルグアノシン、２’－アミノ－３’－デオキシグアノシン、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン、２－チオウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン、３－メチルウリジン、４－チオウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－タウリノメチルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル、ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウリジン、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチル－２－チオルジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン、ウリジン５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メトキシウリジン、５－アミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、プソイドウリジン、１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン、１－メチルプソイドウリジン、３－メチルプソイドウリジン、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、５－ホルミルウリジン、５－アミノメチル－２－ゲラニルウリジン、５－タウリノメチルウリジン、５－ヨードウリジン、５－ブロモウリジン、２’－メチル－２’－デオキシウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２’－アジド－２’－デオキシウリジン、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン、イノシン、１－メチルイノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、５－アザウリジン、２－チオ－５－アザウリジン、４－チオプソイドウリジン、２－チオプソイドウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、１－カルボキシメチルプソイドウリジン、５－プロピニルウリジン、１－プロピニルプソイドウリジン、１－タウリノメチルプソイドウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、１－タウリノメチル－４－チオウリジン、５－メチルウリジン、１－メチルプソイドウリジン、４－チオ－１－メチルプソイドウリジン、２－チオ－１－メチルプソイドウリジン、１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザプソイドウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２－チオジヒドロウリジン、２－チオジヒドロプソイドウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオウリジン、４－メトキシプソイドウリジン、４－メトキシ－２－チオプソイドウリジン、１，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２，８－ジメチルアデノシン、２－メチルチオメチレンチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、２－ゲラニルチオウリジン、２－リシジン、２－メチルチオ環状Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、２－セレノウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、２’－Ｏ－リボシルアデノシンホスフェート、２’－Ｏ－リボシルグアノシンホスフェート、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）プソイドウリジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－メチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピルデメチルワイオシン、７－メチルグアノシン、８－メチルアデノシン、Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、２－メチルチオ環状Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミルクエオシン、任意のヌクレオチドに付加されたグアノシン、グアニリル化された５’末端、ヒドロキシ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン；最も好ましくは、プソイドウリジン、Ｎ１－メチルプソイドウリジン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－メチルシチジン、２－チオウリジン、５－ヨードウリジン及び／又は５－メチルウリジン。

さらに、「修飾ヌクレオチド」という用語は、重水素等の同位体を含有するヌクレオチドを含む。「同位体」という用語は、同じ数のプロトンを有するが、異なる数の中性子を有し、この結果として質量数が異なる、元素を指す。したがって、例えば水素の同位体は重水素に限定されず、トリチウムも含む。さらに、ｍＲＮＡ分子は、例えば炭素、酸素、窒素及びリンを含む、他の元素の同位体を含有してもよい。修飾ヌクレオチドは重水素化されていてもよいし、又は、別の水素の同位体若しくは別の酸素、炭素、窒素若しくはリンの同位体を含有してもよい。

したがって、精製すべきｍＲＮＡ分子が、４種のヌクレオチド型、すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＵヌクレオチドの存在下におけるインビトロ転写によって生成される場合、修飾ヌクレオチド型の総数は、０、１、２、３又は４であってよい。したがって、一部の実施形態では、１種のヌクレオチド型に属する少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１個のＵヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、合計２種のヌクレオチド型に属する少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１個のＵヌクレオチド及び少なくとも１個のＣヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、合計３種のヌクレオチド型に属する少なくとも１個のヌクレオチド、例えば、少なくとも１個のＧヌクレオチド、少なくとも１個のＵヌクレオチド及び少なくとも１個のＣヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、４種すべてのヌクレオチド型に属する少なくとも１個のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであってもよい。これらすべての実施形態では、ヌクレオチド型１種当たり１個以上のヌクレオチドが修飾されていてもよいが、前記ヌクレオチド型１種当たりの修飾ヌクレオチドの百分率は、０％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％である。
一部の実施形態では、精製すべきｍＲＮＡ分子に含まれる修飾ヌクレオチドの合計百分率は、０％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は１００％である。

精製すべきｍＲＮＡ分子は例えば、Ｕヌクレオチドの０．５～５０％、好ましくは５～５０％及びＣヌクレオチドの５～５０％が修飾されていることを特徴としてもよい。前記修飾Ｕヌクレオチドは、好ましくは、５－ヨードウリジンであり、前記修飾Ｃヌクレオチドは、好ましくは、５－ヨードシチジンである。
一部の実施形態では、精製すべきｍＲＮＡ分子は、Ｕヌクレオチドの１５～２５％及びＣヌクレオチドの５～１５％が修飾されており、前記修飾Ｕヌクレオチドが、好ましくは、５－メチルウリジンであり、前記修飾Ｃヌクレオチドが、好ましくは、５－ヨードシチジンであることを特徴としてもよい。
一部の実施形態では、精製すべきｍＲＮＡ分子は、Ｕヌクレオチドの３０～５０％及びＣヌクレオチドの１０～２０％が修飾されており、前記修飾Ｕヌクレオチドが、好ましくは、５－ヨードウリジンであり、前記修飾Ｃヌクレオチドが、好ましくは、５－ヨードシチジンであることを特徴としてもよい。
一部の実施形態では、精製すべきｍＲＮＡ分子は、Ｕヌクレオチドの３０～５０％及びＣヌクレオチドの５～１５％が修飾されており、前記修飾Ｕヌクレオチドが、好ましくは、５－ヨードウリジンであり、前記修飾Ｃヌクレオチドが、好ましくは、５－ヨードシチジンであることを特徴としてもよい。
一部の実施形態では、精製すべきｍＲＮＡ分子は、Ｕヌクレオチドの０．５～５％及びＣヌクレオチドの２５～３５％が、修飾されており、前記修飾Ｕヌクレオチドが、好ましくは、２－チオウリジンであり、前記修飾Ｃヌクレオチドが、好ましくは、５－メチルシチジンであることを特徴としてもよい。
精製すべきｍＲＮＡ分子は例えば、Ｕヌクレオチドの５０～１００％、好ましくは１００％が、修飾されていることを特徴としてもよい。前記修飾Ｕヌクレオチドは、好ましくは、Ｎ１－メチルプソイドウリジンである。

本発明の一部の実施形態では、本方法は、ステップ（Ｉａ）の前に、酢酸アンモニウムを使用して、沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液を得るステップを含む。ｍＲＮＡ分子の沈殿は、ｍＲＮＡ沈殿が費用効果の高い簡便なものであるという特段の理由により、塩、ヌクレオチド及びタンパク質を除去するために有利である。例えばＧＳＣＮ、ＮＨ_４ＯＡｃ、エタノール、塩化リチウム、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む沈殿用の様々な溶液が、当業者に公知である。しかしながら、特に治療用途に関しては、ＧＳＣＮ及びＬＤＳのような塩をなくすことは、非常に有利である。したがって、本発明の一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、ＮＨ_４ＯＡｃを使用して沈殿させる。したがって、ステップ（Ｉａ）において使用される懸濁液は好ましくは、ｍＲＮＡ分子を沈殿させるためにＮＨ_４ＯＡｃを使用して得られる。

上記のように、本発明の一部の実施形態では、第１の溶液は、酢酸アンモニウムを含有する。好ましくは、懸濁液及び第１の溶液中におけるＮＨ_４ＯＡｃの総量は、０．１ｍｏｌ／ｌ～５ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１ｍｏｌ／ｌ～４ｍｏｌ／ｌ、より好ましくは２ｍｏｌ／ｌ～３ｍｏｌ／ｌであり、したがって、５ｍｏｌ／ｌ未満、好ましくは４ｍｏｌ／ｌ未満、より好ましくは３ｍｏｌ／ｌ未満である。酢酸アンモニウムの量が少量であることは、時間効率及び費用対効果が高い下流工程での処理という観点において、非常に有利である。第１の溶液は、１～１２の範囲のｐＨ、好ましくは６．５～７．５の範囲のｐＨをさらに有することができる。
本発明の一部の実施形態では、第１の溶液は、酢酸アンモニウムを含有し、懸濁液及び第１の溶液中におけるＮＨ_４ＯＡｃの総量は、１ｍｏｌ／ｌ～４ｍｏｌ／ｌ、好ましくは２ｍｏｌ／ｌ～３ｍｏｌ／ｌである。
本発明の一部の実施形態では、第１の溶液は、１～１２の範囲のｐＨ、好ましくは６．５～７．５の範囲のｐＨを有し、酢酸アンモニウムを含有し、懸濁液及び第１の溶液中におけるＮＨ_４ＯＡｃの総量は、１ｍｏｌ／ｌ～４ｍｏｌ／ｌ、好ましくは２ｍｏｌ／ｌ～３ｍｏｌ／ｌである。

本発明の一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、ステップ（ＩＩａ）によってキレート化剤を含む第３の溶液を使用して、ｍＲＮＡ分子を精製する前に、ステップ（Ｉｂ）において得られた溶解したｍＲＮＡ分子に、第５の溶液を加えることをさらに含む。第５の溶液は好ましくは、第３の溶液と同じキレート化剤を含む。したがって、第５の溶液は好ましくは、特にマグネシウムカチオン等の二価カチオンを除去するためのキレート化剤としてのＥＤＴＡと、任意選択により、ＭＯＰＳバッファーとを含む。しかしながら、第５の溶液に含まれるキレート化剤の濃度は好ましくは、第３の溶液に含まれるキレート化剤の濃度より高い。ステップ（Ｉｂ）において得られた溶解したｍＲＮＡ分子に第５の溶液を加えた後でステップ（ＩＩａ）を実施することにより、ステップ（Ｉｂ）において得られたｍＲＮＡ分子が懸濁された溶液の組成を、ステップ（ＩＩａ）において使用された第３の溶液の組成に調節することができる。これには、潜在的な希釈効果を減じることができ、この結果、本明細書に開示の方法によるｍＲＮＡ分子精製の処理能力及び／又は再現性を高めることができるという利点がある。

本発明の一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、ｍＲＮＡ分子を脱リン酸化及び／又はポリアデニル化及び／又はポストキャッピング（ｐｏｓｔ－ｃａｐｐｉｎｇ）することをさらに含む。したがって、ｍＲＮＡ分子は、本発明の方法を用いて精製することが可能なだけでなく、さらには、ｍＲＮＡ分子をタンパク質等の機能的アミノ酸配列に確実に翻訳できるように修飾されることも可能である。このような修飾は、例えばｍＲＮＡ分子のインビトロ合成若しくは転写中及び／又は同時転写５’キャッピング中に付加される５’－一リン酸、５’－二リン酸及び／又は５’－三リン酸を除去するためのｍＲＮＡ分子の脱リン酸化；ポリ（Ａ）テールが大抵の場合においてｍＲＮＡ分子の寿命の主要な決定因子であることを理由とする、ｍＲＮＡ分子のポリアデニル化；並びに、同時転写５’キャッピングが実施されない場合における、ｍＲＮＡ分子のポストキャッピングを含む。特に、５’キャップ及び３’ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡ効率の主要な決定因子であると考えられているため、このような特徴をｍＲＮＡ分子精製法に組み込むことは、ｍＲＮＡ分子の処理の時間効率及び費用効果の最大化、及び精製済みのｍＲＮＡ分子の作用の持続期間の最大化という観点において、有利である。

５’キャップの存在は、ｍＲＮＡ分子の安定性を向上させ、この結果として、ｍＲＮＡ分子の作用の持続期間を延長するために有利である。したがって、沈殿した精製すべきｍＲＮＡ分子が５’キャップ又は５’キャップアナログを含まない場合、ｍＲＮＡ分子は好ましくは、例えばＣ１－ｍ７Ｇキャップ又はｍ７ＧｐｐｐＧキャップの酵素的付加によって、転写後５’キャッピングされる。しかしながら、より好ましくはｍＲＮＡ分子は、例えばＡＲＣＡキャップアナログを使用して、又はＴｒｉｌｉｎｋ技術（ＣｌｅａｎＣａｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ＵＳ２０１８／２７３５７６Ａ１を参照）の適用によって、同時転写５’キャッピングされる。この場合、本発明によるＴＦＦ法を使用することは、クリーンキャップアナログ（ｃｌｅａｎ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｕｅ）を除去するために有利である。

さらに、沈殿した精製すべきｍＲＮＡ分子が３’ポリ（Ａ）テールを含まない場合、ｍＲＮＡ分子は好ましくは、少なくとも１００個のＡヌクレオチド、好ましくは少なくとも１２０個のＡヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２４０個のＡヌクレオチドからなるポリ（Ａ）テールによって酵素的にポリアデニル化される。任意選択により、付加すべきポリ（Ａ）テールは、ポリ（Ａ）テール配列内及び／又はポリ（Ａ）テールの一方の末端に、Ａ以外のヌクレオチド、好ましくはＧヌクレオチドを含んでもよいが、前記末端は、精製すべきｍＲＮＡ分子の３’末端に付加されるべきでない。ｍＲＮＡ分子へのポリ（Ａ）テールの付加は、前記ｍＲＮＡ分子の作用の持続期間を延長するため、したがって、所望の翻訳レベルを達成するために有利であることがわかっている。

したがって、本発明の一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、ｍＲＮＡ分子を脱リン酸化することをさらに含む。
本発明の他の実施形態では、本方法は、ｍＲＮＡ分子をポリアデニル化することをさらに含む。
本発明のさらなる他の実施形態では、本方法は、ｍＲＮＡ分子をポストキャッピングすることをさらに含む。

一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ分子を精製するための方法は少なくとも、ｍＲＮＡ分子を脱リン酸化及びポリアデニル化することを含む。

一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡ分子を精製するための方法は少なくとも、ｍＲＮＡ分子を脱リン酸化及びポストキャッピングすることを含み、ｍＲＮＡ分子を脱リン酸化することは、ｍＲＮＡ分子をポストキャッピングした後に実施される。

本発明の一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、ステップ（Ｉｂ）において得られたｍＲＮＡ分子を脱リン酸化することと、続いて、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を実施することと、続いて、得られたｍＲＮＡ分子をポリアデニル化することと、続いて、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を再び実施することとを含み、後に挙げたステップ（Ｉａ）は好ましくは、２０℃～３０℃の温度、好ましくは２３℃～２７℃の温度、より好ましくは２５℃で実施され、任意選択により、続いて、得られたｍＲＮＡ分子を含む保持液がろ過される。したがって、ｍＲＮＡ分子処理の費用効果及び時間効率を最大化するために、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、ｍＲＮＡ分子を脱リン酸化及びポリアデニル化するステップをさらに含む。特に、後に挙げた２つのステップと、脱リン酸化及びポリアデニル化中に導入された成分も除去するようにｍＲＮＡ分子を精製するためのさらなるステップとを一緒に導入することは、有利であることがわかっている。

したがって、特に精製すべきｍＲＮＡ分子が同時転写付加された５’キャップ又は５’キャップアナログを含む場合、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、次のステップを含んでもよい。最初に、ステップ（Ｉａ）において、酢酸アンモニウムを含むことが好ましい第１の溶液を使用して、沈殿したｍＲＮＡ分子が、前記沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から精製される。次いで、ステップ（Ｉｂ）において、精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子は、例えばタンパク質、塩及びヌクレオシド三リン酸を除去するために、第２の溶液、好ましくは水を使用して洗浄し、溶解される。次いで、溶解したｍＲＮＡ分子は、キャッピングされなかった可能性があるＲＮＡ分子から５’一リン酸、５’二リン酸及び５’三リン酸を除去するための当業者に公知の方法によって、脱ホスホリル化される。脱ホスホリル化されたｍＲＮＡ分子は、さらなるステップ（Ｉａ）において、酢酸アンモニウムを含むことが好ましい第１の溶液を使用して精製され、続いて、さらなるステップ（Ｉｂ）において、水であることが好ましい第２の溶液を使用して洗浄される。このようにして得られたｍＲＮＡ分子はステップ（ＩＩａ）において、失敗作のｍＲＮＡ分子及び加水分解生成物を除去するために、キレート化剤を含む第３の溶液、好ましくはＥＤＴＡ、好ましくはＭＯＰＳを使用して、０～８のｐＨ、より好ましくは６．５～７．５のｐＨでさらに精製される。次いで、第３の溶液は、第４の溶液を使用してステップ（ＩＩｂ）の洗浄ステップを実施することによって、除去される。例えば、ポリ（Ａ）テールをコードする配列を含むＤＮＡ鋳型がインビトロ転写のために使用されたという理由で、ポリアデニル化ステップが必要とされない場合、得られた精製済みのｍＲＮＡ分子はステップ（ＩＩｂ）において、シトレート及び／又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい第４の溶液を使用して洗浄されるが、任意選択により、前記ステップ（ＩＩｂ）の後に続いて、例えば細孔径が０．３μｍ未満のフィルターメンブレンを使用するさらなるろ過ステップを行ってもよい。例えば、ポリ（Ａ）テールをコードする配列を含まないＤＮＡ鋳型がインビトロ転写のために使用されたという理由で、ポリアデニル化ステップが有利である場合、得られた精製済みのｍＲＮＡ分子はステップ（ＩＩｂ）において、第４の溶液、好ましくは水を用いて洗浄され、その後、例えばポリ（Ａ）ポリメラーゼを加えることにより、ｍＲＮＡ分子の作用を確実に延長するための通例の実験プロトコルを採用して、３’ポリ（Ａ）テールを酵素的付加することによって伸長されることも可能である。次いで、ｍＲＮＡ分子は、ステップ（Ｉａ）が好ましくは、例えば加えられたポリ（Ａ）ポリメラーゼを除去するために、２０℃～３０℃の温度、好ましくは２３℃～２７℃の温度、より好ましくは２５℃で実施されることと、ステップ（ＩＩｂ）において使用された第４の溶液が好ましくは、５’キャップ又は５’キャップアナログ及び３’ポリ（Ａ）テールを含む精製済みのｍＲＮＡ分子を得るための、シトレート及び／又は塩化ナトリウムを含むこととを除いて前述のようにして、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を施される。任意選択により、得られた精製済みのｍＲＮＡ分子には、例えば０．３μｍ未満の細孔径を有するフィルターメンブレンを使用する、さらなるろ過ステップを施すこともできる。

精製すべきｍＲＮＡ分子が同時転写付加された５’キャップ又は５’キャップアナログを含まない場合、本発明によるｍＲＮＡ分子を精製するための方法は上記手順との比較で、５’キャップ又は５’キャップアナログを転写後付加する、好ましくは酵素的に転写後付加するさらなるステップを含んでもよい。したがって、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、次のステップを含んでもよい。最初に、ステップ（Ｉａ）において、酢酸アンモニウムを含むことが好ましい第１の溶液を使用して、沈殿したｍＲＮＡ分子が、前記沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から精製される。次いで、ステップ（Ｉｂ）において、精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子は、例えばタンパク質、塩及びヌクレオシド三リン酸を除去するために、第２の溶液、好ましくは水を使用して洗浄し、溶解される。この後には、上記本方法は、ステップ（Ｉｂ）において得られたｍＲＮＡ分子をキャッピングすることと、続いて、ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）を実施することと、得られたｍＲＮＡ分子を脱リン酸化することと、続いて、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を実施することとをさらに含む。例えば、ポリ（Ａ）テールをコードする配列を含むＤＮＡ鋳型がインビトロ転写のために使用されたという理由で、ポリアデニル化ステップが必要とされない場合、得られた精製済みのｍＲＮＡ分子はステップ（ＩＩｂ）において、シトレート及び／又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい第４の溶液を使用して洗浄されるが、任意選択により、前記ステップ（ＩＩｂ）の後に続いて、例えば細孔径が０．３μｍ未満のフィルターメンブレンを使用するさらなるろ過ステップを行ってもよい。例えば、ポリ（Ａ）テールをコードする配列を含まないＤＮＡ鋳型がインビトロ転写のために使用されたという理由で、ポリアデニル化ステップが有利である場合、得られた精製済みのｍＲＮＡ分子はステップ（ＩＩｂ）において、第４の溶液、好ましくは水を使用して洗浄され、その後、例えばポリ（Ａ）ポリメラーゼを加えることにより、ｍＲＮＡ分子の作用を確実に延長するための通例の実験プロトコルを採用して、３’ポリ（Ａ）テールを酵素的付加することによって伸長されることも可能である。次いで、ｍＲＮＡ分子は、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を施されるが、ステップ（Ｉａ）は好ましくは、例えば加えられたポリ（Ａ）ポリメラーゼを除去するために、２０℃～３０℃の温度、好ましくは２３℃～２７℃の温度、より好ましくは２５℃で実施され、ステップ（ＩＩｂ）は好ましくは、シトレート及び／又は塩化ナトリウムを第４の溶液を使用して実施され、任意選択により、続いて、得られたｍＲＮＡ分子を含む保持液がろ過される。

したがって、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）は好ましくは、３’ポリアデニル化及び任意選択により５’キャッピング等のｍＲＮＡ分子の何らかの伸長の実施前に実施される。特に、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）は好ましくは、ｍＲＮＡ分子の３’ポリアデニル化の前に実施され、ステップ（Ｉａ）～（Ｉｂ）は好ましくは、５’キャッピングの前に実施される。これは、上記４つすべての実施形態において当てはまり、すなわち、同時転写キャッピングされたｍＲＮＡ分子及び転写後５’キャッピングされｍＲＮＡ分子のそれぞれを精製する場合に当てはまる。

さらに、上記４つすべての実施形態では、ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の実施前にｍＲＮＡ分子を脱リン酸化するステップは、任意選択によるものであってよい。したがって、一部の実施形態は、ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の実施前にｍＲＮＡ分子を脱リン酸化するステップを除けば、上記４つの実施形態に対応する。

ＴＦＦは、フィルター装置としてカプセル、カセット及びカセットホルダー又は中空繊維モジュールを使用して、実施することができる。特に、中空繊維モジュールは、無菌処理を可能にする、完成品として事前に組み立てられたあらかじめ滅菌済みの使い捨て型流路をもたらすものであり、フィルターメンブレンをパッケージ化するための費用効果が高い方法を提供する。

ｍＲＮＡ分子精製のための使用されたフィルターメンブレンは、ｍＲＮＡ分子精製に適する、したがって、精製すべきｍＲＮＡ分子と相互作用しない、任意の種類の材料製のものであってよい。フィルターメンブレンの材料の例には、無修飾ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）、ｍＰＥＳ中空繊維メンブレン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、セルロースアセテート、ニトロセルロース、混合セルロースエステル（ＭＥ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリフルオロテトラエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリビニルクロリド、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）及びこれらの組合せが挙げられる。

フィルターメンブレンは、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値によって特徴付けられ、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値は、それらの粒子の９０％がメンブレンによって保持される、ダルトンを単位とする最も低い粒子の分子量を指す。好ましくは、フィルターメンブレンは、ＭＷＣＯより小さいサイズ、したがって、その細孔径より小さいサイズの成分が、透過物としてフィルターメンブレンを通り抜けることを可能にしながら、ｍＲＮＡ分子を保持するのに適する、細孔径を有する。様々なサイズの様々な成分を除去しなければならないため、フィルターメンブレンの細孔径を、本発明による方法の各ステップにおいて除去すべき成分のサイズに調節することが有利である。

本発明の一部の実施形態では、ステップ（Ｉａ）の場合は、３００ｋＤａ～０．６５μｍの分子量カットオフ、好ましくは５００ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンが、ＴＦＦのために使用され、及び／又はステップ（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）の場合は、１ｋＤａ～０．６５μｍの分子量カットオフ、好ましくは１ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量カットオフ、より好ましくは１ｋＤａ～５０ｋＤａの分子量カットオフ、さらにより好ましくは５０ｋＤａ、７０ｋＤａ及び／若しくは１００ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンが使用され、及び／又はステップ（ＩＩａ）の場合は、少なくとも５０ｋＤａの分子量カットオフ、好ましくは少なくとも７０ｋＤａの分子量カットオフ、より好ましくは７０ｋＤａ又は１００ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンが使用される。ＴＦＦで使用されるフィルターメンブレンは、フィルターメンブレンの細孔径が、フィルターメンブレンを通過することができ、この結果として、透過物に含まれる、ｍＲＮＡ分子及び成分等の粒子のサイズを左右するため、重要である。

したがって、フィルターメンブレンのＭＷＣＯは、ステップ（Ｉａ）の場合、好ましくは少なくとも３００ｋＤａ又は０．０６５μｍである。好ましくは、ＭＷＣＯは、３００ｋＤａ、５００ｋＤａ、７５０ｋＤａ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．４５μｍ、０．５μｍ、０．６５μｍからなる群より選択され、５００ｋＤａのＭＷＣＯが特に好ましい。これは、例えば、精製すべきｍＲＮＡ分子を得るために溶解させた細胞に含まれる酵素及びタンパク質を除去しながら、又はインビトロ転写されたｍＲＮＡ分子の場合においては、インビトロ転写反応混合物に含まれる酵素、修飾された三リン酸ヌクレオシド及び無修飾三リン酸ヌクレオシド、５’キャップ、５’キャップアナログ並びにバッファー成分を除去しながら、沈殿したｍＲＮＡ分子を保持するために有利である。したがって、適切なＭＷＣＯ値は、例えば、精製すべきｍＲＮＡ分子のインビトロ転写等の前処理ステップで使用された、ステップ（Ｉａ）においてＴＦＦによって除去すべき酵素のサイズを考慮することによって、選択することができる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、１００ｋＤａ未満のＭＷＣＯを有するフィルターメンブレンを使用した場合には効率的に除去されない、当技術分野において周知の酵素である。ステップ（Ｉａ）において１ｋＤａ～７５０ｋＤａの範囲のＭＷＣＯを採用した場合は、ＴＦＦが限外ろ過と呼ばれることもあり、一方、０．０５μｍ～０．６５μｍの範囲のＭＷＣＯを採用した場合は、ＴＦＦが精密ろ過と呼ばれることもある。

ステップ（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）の場合、ＭＷＣＯは、好ましくは少なくとも１ｋＤａ、好ましくは１ｋＤａ～５０ｋＤａ、より好ましくは少なくとも５０ｋＤａ、さらにより好ましくは少なくとも７０ｋＤａである。好ましくは、ＭＷＣＯは、１ｋＤａ、３ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、７０ｋＤａ、１００ｋＤａ、３００ｋＤａ、０．０５μｍ、０．１μｍ、０．２μｍ、０．４５μｍ、０．５μｍ及び０．６５μｍからなる群より選択され、５０ｋＤａ、７０ｋＤａ又は１００ｋＤａのＭＷＣＯが特に好ましい。これは、酢酸アンモニウム、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、ＭＯＰＳ等のバッファー、失敗作のｍＲＮＡ分子及び／又は加水分解生成物等、各溶液に含まれる塩及び他の成分を効率的に除去しながら、ｍＲＮＡ分子を精製するために有利である。比較的大きいｍＲＮＡ分子の場合、３００ｋＤａ超のＭＷＣＯも検討され得る。

ステップ（ＩＩａ）の場合、ＭＷＣＯは、好ましくは少なくとも５０ｋＤａ、より好ましくは少なくとも７０ｋＤａ、さらにより好ましくは７０ｋＤａ又は１００ｋＤａである。例えば上記ＭＯＰＳ－ＥＤＴＡバッファーを使用する場合、１００ｋＤａのＭＷＣＯが特に好ましい。他の強力キレート化剤又は他の強力キレート化剤とバッファーとの組合せが採用される場合、１００ｋＤａ以上のＭＷＣＯでさえも、比較的大きいｍＲＮＡ分子の精製のために検討され得る。

さらに、ＴＦＦを用いるプロセスは、様々な変数の観点から特徴付けることも可能であるが、最も重要な２つの変数は、膜間差圧及び流量である。

「膜間差圧」（ＴＭＰ）は、成分にフィルターメンブレンを通り抜けさせる、駆動力を指す。一部の実施形態では、膜間差圧は、ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の場合においては、例えば、典型的な事例における５００ｍｇのｍＲＮＡという実験室スケールでは、１００ｍｂａｒ～５００ｍｂａｒ、好ましくは２００ｍｂａｒ～４００ｍｂａｒであり、ステップ（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）の場合においては、２ｍｂａｒ～２０ｍｂａｒ、好ましくは５ｍｂａｒ～１５ｍｂａｒである。

「フロー」という用語は、ＴＦＦシステムの中を通って流れる、特には、フィルターメンブレン領域内を流れる溶液の体積を指し、「流量」は、所与の時間の間に前記システム内を流れる溶液の体積を指す。したがって、流量又はクロスフロー速度は、溶液がフィルターメンブレンの端から端までを横断して流れる速度を指す。一部の実施形態では、ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の場合の流量は、例えば典型的な事例における５００ｍｇのｍＲＮＡという実験室スケールでは、１．５Ｌ／ｍｉｎ～２．５Ｌ／ｍｉｎ、好ましくは１．６Ｌ／ｍｉｎ～１．９Ｌ／ｍｉｎであり、ステップ（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）の場合は、０．２Ｌ／ｍｉｎ～０．６Ｌ／ｍｉｎ、好ましくは０．３５Ｌ／ｍｉｎ～０．４５Ｌ／ｍｉｎである。

本発明の特に好ましい実施形態では、ｍＲＮＡ分子を精製するための方法は、連続式ＴＦＦを用いて実施される。連続式ＴＦＦは、保持液が、別の周回のＴＦＦ用のフィードとして使用される、ＴＦＦシステムを指す。本明細書において、「フィード」という用語は、精製すべきｍＲＮＡ分子を含む溶液又は懸濁液を指す。したがって、ｍＲＮＡ分子を含む初期フィードは、ＴＦＦを用いるろ過の１回目の周回に供され、得られたｍＲＮＡ分子を含む保持液は、少なくともｍＲＮＡ分子を循環させることによって、別の周回のＴＦＦ用のフィードとして再び使用される。これは、システム間の移送を原因とするｍＲＮＡ分子喪失のリスクを低下させながら自動で精製ステップが繰り返されるため、精製のレベルの向上に有利である。

したがって、本発明の一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、タンジェントフローろ過後の保持液に含まれ、好ましくは、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩａ）によって得られた保持液には少なくとも含まれる。ステップ（ＩＩｂ）の場合、ｍＲＮＡ分子は、保持液又は透過物に含まれ得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は、ステップ（Ｉａ）～ステップ（ＩＩｂ）によって得られた保持液に含まれる。

本発明の一部の実施形態では、ステップ（Ｉａ）において得られた保持液は、ステップ（Ｉｂ）において、タンジェントフローろ過のためのフィード溶液として使用され、ステップ（Ｉｂ）において得られた保持液は、ステップ（ＩＩａ）において、フィード溶液として使用され、ステップ（ＩＩａ）において得られた保持液は、ステップ（ＩＩｂ）において、フィード溶液として使用される。したがって、本発明は好ましくは、少なくともステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を実施するために連続式ＴＦＦを使用して、実施される。より厳密には、ｍＲＮＡ分子は好ましくは、本発明による精製のための連続式ＴＦＦシステムの中を循環している。したがって、本発明の一実施形態では、少なくともステップ（Ｉａ）～（ＩＩａ）、好ましくはステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）は、連続式ＴＦＦを用いて実施される。

ＴＦＦシステムのさらなる利点は、ＴＦＦシステムがダイアフィルトレーション、特に連続式ダイアフィルトレーションのために容易に使用され得るという点である。ダイアフィルトレーションにより、溶液又は懸濁液の一部を、別の溶液又は懸濁液と交換することができる。例えば非連続式ダイアフィルトレーションにおいては、溶液は、最初に希釈され、次いで、最初の体積に戻るまで濃縮される。しかしながら、これは、精製すべきｍＲＮＡ分子の機能性に悪影響する可能性がある。

したがって、本発明の好ましい実施形態では、精製すべきｍＲＮＡ分子は、少なくともステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）の間は、定体積式ダイアフィルトレーションを用いた上記方法による精製のために、連続式ＴＦＦシステム内で循環している。定体積式又は連続式ダイアフィルトレーションは、一定の体積がろ過システム内で保たれる、ろ過プロセスを指す。したがって、透過物としてフィルターメンブレンを通過する溶液又は懸濁液の体積と同じ量の溶液又は懸濁液が加えられる。したがって、保持液の体積は、最初にＴＦＦシステムに供給された体積、すなわち、フィード体積と同じであり、洗浄量（ｗａｓｈｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）、すなわち、ダイアフィルトレーション量（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）は、透過物の体積と同じ体積である。連続式ＴＦＦと連続式ダイアフィルトレーションとの組合せは、ＴＦＦシステムの循環処理部分の中で精製すべきｍＲＮＡ分子を、これらのｍＲＮＡ分子の機能を保持するために一定の体積に保ちながら、透過物として汚染物質を除去するために有利である。

したがって、本発明の一部の実施形態では、少なくともステップ（Ｉａ）～（ＩＩａ）、好ましくはステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）は、ダイアフィルトレーション、好ましくは連続式ダイアフィルトレーションを用いて実施される。

本発明の一部の実施形態では、第１、第２、第３及び／又は第４の溶液のいずれかのダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積に対して少なくとも１倍、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、好ましくは少なくとも１０倍である。前記ダイアフィルトレーション量の判定は、時間及び費用効果と、達成すべき生成レベルとの最適なトレードオフという観点においては、特別に興味深いものである。第１、第２、第３及び／又は第４の溶液のいずれかのダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積に対して少なくとも１倍、好ましくは少なくとも１０倍であることがわかった。これは、ハイスループット処理、したがって、大規模なｍＲＮＡ分子精製を可能にしながら、成分の実質的な除去を確実に行うために有利である。

一部の実施形態では、ダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積、したがって、最初にステップ（Ｉａ）においてＴＦＦシステムに供給された沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液の体積に対して１倍である。
一部の実施形態では、ダイアフィルトレーション量は、懸濁液の体積に対して２倍である。
一部の実施形態では、ダイアフィルトレーション量は、懸濁液の体積に対して３倍である。
一部の実施形態では、ダイアフィルトレーション量は、懸濁液の体積に対して４倍である。
一部の実施形態では、ダイアフィルトレーション量は、懸濁液の体積に対して５倍である。
さらなる一部の実施形態では、ダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積に対して少なくとも５倍である。

一部の実施形態では、ダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積、したがって、最初にステップ（Ｉａ）においてＴＦＦシステムに供給された沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液の体積に対して少なくとも１０倍である。ＴＦＦシステムに供給された体積の少なくとも１０倍のダイアフィルトレーション量を用いることは、上記各ステップにおいて対象される成分を実質的に除去するために有利であることがわかった。

したがって、第１、第２、第３及び／又は第４の溶液のいずれかのダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積に対して少なくとも１０倍であることが好ましい。少なくとも、第３及び第４の溶液のダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積に対して少なくとも１０倍であることがさらにより好ましい。

一部の実施形態では、第１、第２、第３及び第４の溶液のダイアフィルトレーション量は、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積に対して少なくとも１０倍である。

本発明の方法によって精製済みのｍＲＮＡ分子を得るための完全に自動化可能なクローズドシステムが、図２に例示として示されている。上記システムは、ｍＲＮＡ製造システムと流体連通している、好ましくは第１のバルブを介して流体連通している、図１に示された連続式ＴＦＦシステムを備える。注意点として、本明細書において使用されている「バルブ」という用語は、バルブ、（例えば、二方及び／又は三方）コック、クランプ及びＭＰＣコネクタを包含し；バルブ及び／又はＭＰＣコネクタが好ましい。さらに、ＭＰＣコネクタは、クランプと組み合わせて使用されることが好ましい。したがって、２つの要素、例えば２つの管は、使い捨てを可能にし、並びに／又は、様々なシステムとの適合性、例えば管のうちの１つにおける高圧及び／若しくは圧力の変化に対する安定性、並びに／若しくは低コストを確保するような態様で接続されることが可能である。

ｍＲＮＡ製造システムは、反応容器及び少なくとも１個のさらなる容器を含んでもよい。反応容器及び少なくとも１個のさらなる容器は好ましくは、連結管を介して、互いに流体連通しており、ＴＦＦシステムとも流体連通している。第１のバルブは、ｍＲＮＡ製造システムの連結管と、ＴＦＦシステムの管、好ましくは、フィード貯蔵器からフィルター装置まで循環する管との間に配置されている。代替的には、ｍＲＮＡ製造システムは、フィルター装置から貯蔵器まで循環する管と流体連通していてもよいし、又は貯蔵器と流体連通していてもよい。注意点として、本明細書において使用されている「管」という用語は、管、チューブ、配管又はこれらの組合せを指し得る。さらに、ｍＲＮＡ製造システムの連結管は、補助ポンプを備えてもよい。補助ポンプは、連結管の中を通って移送される流体の速度を自動的に調節するために有利である。

本発明の方法による精製すべきｍＲＮＡ分子は、例えば細胞ｍＲＮＡ分子増幅のために細胞を培養することによって得ることもできるし、又は好ましくは、インビトロ転写（ＩＶＴ）によって得ることもできる。ｍＲＮＡ分子が細胞から得られる場合、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等の細胞は、ｍＲＮＡ分子製造に適した細胞特異的な培養条件下において、発酵槽内で培養されてもよい。前記培養条件のパラメータは好ましくは、例えばそれぞれの量の培地、ガス及び／又はバッファーを供給することによって、自動的に調整される。したがって、ｍＲＮＡ製造システムは、反応容器及び少なくとも１個のさらなる容器を備えてもよく、反応容器は、発酵槽であり、少なくとも１個のさらなる容器は、例えば各培地、ガス及び／又はバッファー溶液を含む。

代替的には、精製すべきｍＲＮＡ分子がＩＶＴによって得られる場合、ＩＶＴ鋳型、例えば、ターゲット精製すべきｍＲＮＡ分子のＩＶＴのための各ＤＮＡ鋳型と、ＩＶＴ用の酵素、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ及びＮＴＰの混合物等のＩＶＴ試薬とが、必要とされる。

したがって、ｍＲＮＡ製造システムは、反応容器及び少なくとも１個のさらなる容器を備えてもよく、少なくとも１個のさらなる容器は、前記ＩＶＴ試薬のうちの少なくとも１つを含む。

したがって、反応容器は好ましくは、少なくとも１つのさらなる容器、好ましくは少なくとも第１のさらなる容器及び第２のさらなる容器と流体連通している。

第１のさらなる容器は、前記ＩＶＴ試薬のうちの少なくとも１つを含んでもよく、好ましくは、連結管並びに第２及び第３のバルブを介して反応容器と流体連通している。好ましくは、第２のバルブは、反応容器と連結管との間に配置されており、第３のバルブは、連結管と第１のさらなる容器との間に配置されている。第１のバルブを閉じ、第２及び第３のバルブを開くことにより、ｍＲＮＡ分子を、例えばＩＶＴによって、好ましくは反応容器内で製造することができる。第３のバルブを閉じ、第１及び第２のバルブを開くことにより、製造されたｍＲＮＡ分子を、ｍＲＮＡ製造システムからＴＦＦシステムに移送することができる。

第２のさらなる容器は、ｍＲＮＡ分子を沈殿させるための溶液を含んでもよく、前記溶液は、好ましくは酢酸アンモニウム（ＮＨ_４ＯＡｃ）、例えば５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃを含む。好ましくは、第２のさらなる容器は、第４のバルブを介して連結管と流体連通している。第２及び第４のバルブを開き、第１及び第３のバルブを閉じることにより、ターゲット分子を、反応容器内で沈殿させることができ、又は反応容器が発酵槽である場合は、第２のさらなる容器内で沈殿させることができる。次いで第１のバルブを開くと、懸濁液中の沈殿したｍＲＮＡ分子を、ｍＲＮＡ製造システムから本発明の方法によるｍＲＮＡ分子精製のためのＴＦＦシステムに移送することができる。

したがって、図２に示されたシステムは、貯蔵器を有するＴＦＦシステム、好ましくは連続式ダイアフィルトレーションシステムを備える。好ましくは、貯蔵器は、それぞれ少なくとも第５、第６、及び第７のバルブを介して、少なくとも３個のさらなる容器、すなわち、少なくとも第３のさらなる容器、第４のさらなる容器及び第５のさらなる容器と流体連通している。第３のさらなる容器は、本発明による第１の溶液を含んでもよく、第４のさらなる容器は、本発明による第２の溶液を含んでもよく、第５のさらなる容器は、本発明による第３の溶液を含んでもよい。第２の溶液と第４の溶液とが異なる場合、貯蔵器は好ましくは、例えば第８のバルブを介して、第４の溶液を含む第６のさらなる容器と流体連通している。したがって、第３のさらなる容器は、第１の溶液を含み、第１の溶液は、沈殿したｍＲＮＡ分子を精製するためのＮＨ_４ＯＡｃ、例えば２．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃを含み、第４のさらなる容器は、第２の溶液としての水、例えば、注射用水（ＷＦＩ）を含み、第５のさらなる容器は、第３の溶液を含み、第３の溶液は、キレート化剤としてのＥＤＴＡ及び任意選択によりＭＯＰＳを含むことが好ましい。第４の溶液が水ではない場合、第６のさらなる容器は好ましくは、塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを含む。さらに、補助ポンプが、前記少なくとも３個のさらなる容器のいずれかから貯蔵器に移送される流体の速度を自動的に調節するために存在してもよい。

したがって、貯蔵器は好ましくは、所定の長さの時間にわたって第１のバルブを開いておくことにより第１のバルブを介してｍＲＮＡ製造システムから移送された、懸濁液中の沈殿したｍＲＮＡ分子を含む。所定の長さの時間にわたって第５のバルブを開いておくことにより、第１の溶液を、懸濁液中の沈殿したｍＲＮＡ分子に加えることが可能であり、その後、この混合物は、少なくとも１回の周回の連続式ＴＦＦのためにフィルター装置に移送されることが可能であり、フィルターメンブレンは好ましくは、３００ｋＤａ～０．６５μｍの分子量カットオフを有する。したがって、沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液は、本明細書に開示の方法のステップ（Ｉａ）により、例えばタンパク質、塩及び／又はＮＴＰ等のＩＶＴ混合物の成分から精製することができる。精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液は好ましくは、保持液として貯蔵器に戻される。ステップ（Ｉｂ）を実施するため、したがって、ステップ（Ｉａ）において得られた精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子を洗浄し、溶解させるためには、第６のバルブは、所定の長さの時間にわたって開かれている。この結果、第２の溶液を、貯蔵器内の沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液に加えることができる。１ｋＤａ～０．６５μｍの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンを有することが好ましいフィルター装置を使用して、少なくとも１回の周回の連続式ＴＦＦを実施することにより、例えば、第１の溶液に含まれるＮＨ_４ＯＡｃを除去することができる。次いで、所定の長さの時間にわたって第７のバルブを開いておくことにより、第３の溶液を、貯蔵器内の洗浄及び溶解済みのｍＲＮＡ分子に加えることができる。フィルターメンブレンが好ましくは５０ｋＤａ、より好ましくは１００ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルター装置を使用して、少なくとも１回の周回の連続式ＴＦＦを実施することにより、失敗作のｍＲＮＡ分子及びｍＲＮＡ分子の加水分解生成物を、本明細書に開示の方法のステップ（ＩＩａ）によって効率的に除去することができる。例えば第３の溶液の成分を除去することによって、ステップ（ＩＩａ）において得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を洗浄するために、次いでステップ（ＩＩｂ）が実施されてもよい。したがって、第６又は第８のバルブは、５０ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンを備えるフィルター装置を使用して少なくとも１回の周回の連続式ＴＦＦを行うという目的で、水又は塩化ナトリウム及び／若しくはクエン酸ナトリウムを含む第４の溶液を精製済みのｍＲＮＡ分子に加えるために、所定の長さの時間にわたって開かれている。

任意選択により、さらなるステップが、ステップ（Ｉｂ）とステップ（ＩＩａ）との間に実施される。したがって、ＴＦＦシステムは、好ましくは第９のバルブを介して例えば貯蔵器と流体連通している、第７のさらなる容器をさらに備えてもよい。前記第７のさらなる容器は、第５の溶液を含んでもよく、第５の溶液は好ましくは少なくとも、第３の溶液のキレート化剤、好ましくはＥＤＴＡを、前記第３の溶液の場合より高い濃度で含む。ステップ（Ｉｂ）の実施後に所定の長さの時間にわたって第９のバルブを開いておくことにより、第５の溶液を第２の溶液に溶解したｍＲＮＡ分子に加えることができる。これには、ＴＦＦシステム内における少なくともキレート化剤の濃度を、本明細書において第３の溶液との関連で指定された各濃度に調節するために必要な時間を短くすることによって、本発明の方法の処理能力及び再現性を高めることができるという利点がある。さらに、補助ポンプが、第７のさらなる容器から貯蔵器（図示なし）に移送される流体の速度を自動的に調節するために存在してもよい。

任意選択により、ｍＲＮＡ分子製造システムは、好ましくは仮置き用バルブを介してｍＲＮＡ分子製造システムの連結管と流体連通していることが好ましい、仮置き容器をさらに含んでもよい。仮置き容器は、無菌であることが好ましい袋であってもよい。所定の長さの時間にわたって第１のバルブ及び仮置き用バルブを開いておくことにより、ｍＲＮＡ分子を含む懸濁液又は溶液の少なくとも一部分を、ＴＦＦシステムからｍＲＮＡ分子製造システムに移送し、及び／又はｍＲＮＡ分子製造システムからＴＦＦシステムに移送することができる。これは、好ましくは所定の長さの時間にわたって、前記懸濁液又は溶液の少なくとも一部分を貯蔵するために有利であり得る。したがって、前記懸濁液又は溶液の前記少なくとも一部分は、さらなる周回の精製、例えば、ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）、ステップ（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）及び／又はこれらの組合せに供されなくてもよい。さらに、懸濁液又は溶液の少なくとも一部分を仮置き容器内に貯蔵している間には、ＴＦＦシステム及び／又はｍＲＮＡ分子製造システムをクリーニングし、水及び／若しくはバッファーで洗浄し、及び／又は滅菌することができる。任意選択により又は代替的には、仮置き容器は、容器に含まれる溶液又は懸濁液、好ましくは、精製済みのｍＲＮＡ分子を含む溶液又は懸濁液の少なくとも一部分を得るために使用することができる。任意選択により、上記システムは、さらなるろ過ステップのためのフィルター（図示なし）をさらに含んでもよい。前記フィルターは、最終ろ過ステップのための０．３μｍ未満、例えば０．２２μｍの細孔径のフィルターメンブレンを備えてもよく、したがって、仮置き容器から得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を含む懸濁液の最終ろ過のために有用であり得る。

精製すべきｍＲＮＡ分子を、例えば脱リン酸化し、５’キャップ及び／又は３’ポリ（Ａ）テールを付加することによって修飾することが有利なこともあり得る。特に、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）は好ましくは、ｍＲＮＡ分子の３’ポリアデニル化の前に少なくとも１回実施され、ステップ（Ｉａ）～（Ｉｂ）は好ましくは、５’キャッピングの前に少なくとも１回実施される。任意選択により、得られたｍＲＮＡ分子は、少なくとも１回目のステップ（Ｉａ）及び少なくとも１回目のステップ（Ｉｂ）の後に脱ホスホリル化され、続いて、少なくとも２回目のステップ（Ｉａ）及び少なくとも２回目のステップ（Ｉｂ）を行うこともできる。したがって、上記システムは、次のもの（図示なし）のうちの１つ以上をさらに備えてもよい：好ましくはキャッピングのために必要な試薬を含み、好ましくは第４’のバルブを介してｍＲＮＡ製造システムの連結管と流体連通している、第２’のさらなる容器と、好ましくは脱リン酸化のために必要な試薬を含み、好ましくは第４’’のバルブを介してｍＲＮＡ製造システムの連結管と流体連通している、第２’’のさらなる容器と、好ましくはポリ（Ａ）テールを酵素的付加するために必要な試薬、例えば、少なくともポリ（Ａ）ポリメラーゼを含み、好ましくは第４’’’のバルブを介してｍＲＮＡ製造システムの連結管と流体連通している、第２’’’のさらなる容器。所定の長さの時間にわたって第１のバルブ及び仮置き用バルブを開いておくことにより、精製すべきｍＲＮＡ分子を含む各懸濁液の少なくとも一部分を、ＴＦＦシステムからｍＲＮＡ製造システムの仮置き容器内に移送することができる。第１のバルブを閉じ、第４’、第４’’及び／又は第４’’’のバルブを開くことにより、ｍＲＮＡ分子のキャッピング、脱リン酸化及び／又はポリアデニル化を、好ましくは仮置き容器内で実施することができる。代替的には又はさらには、反応容器が発酵槽ではない場合、反応容器を仮置き容器の代わりとして使用すること可能であり、したがって、仮置き用バルブの代わりの第２のバルブは、開かれている。第４’、第４’’及び／又は第４’’’のバルブを閉じ、第１のバルブを開くことにより、修飾されたｍＲＮＡ分子を含む懸濁液を、ｍＲＮＡ分子製造システムからＴＦＦシステムに移送することができる。

注意点として、フィルター装置は、自動的に交換され得る１個より多いフィルターメンブレンを備えてもよい。好ましくは、フィルター装置は、例えばそれぞれがフィルターカラムを備える１個より多いフィルター装置ユニットを備え、ｍＲＮＡ分子は連続式ＴＦＦのために、上記において各方法ステップとの関連で指定された分子量カットオフを有するフィルターメンブレンを備えるフィルター装置ユニットのうちの少なくとも１つに移送される。

さらに、図２に図示されているように、上記システムは、例えば第１０のバルブを介して貯蔵器と流体連通している出口、例えば出口容器を備えてもよい。好ましくは、前記出口容器は、精製済みのｍＲＮＡ分子を含む溶液又は懸濁液の少なくとも一部分を貯蔵するための、使い捨て型であることが好ましい無菌の袋を指し、又はこの袋と流体連通している。第１０のバルブを開くことにより、精製済みのｍＲＮＡ分子を得ることができる。代替的には、（最後に実施される）ステップ（ＩＩｂ）においては、精製済みのｍＲＮＡ分子は、保持液ではなく透過物に含まれてもよい。任意選択により、上記システムは、さらなるろ過ステップのためのフィルター（図示なし）をさらに含んでもよい。前記フィルターは、最終ろ過ステップのための０．３μｍ未満、例えば０．２２μｍの細孔径を有するフィルターメンブレンを備えてもよく、したがって、精製済みのｍＲＮＡ分子を含む懸濁液、例えば透過物、又は出口容器から得られた懸濁液の最終ろ過のために有用であり得る。さらに、補助ポンプが、貯蔵器から出口（図示なし）に移送される流体の即速度を自動的に調節するために存在してもよい。

上記システムは、自動的に制御されることが好ましい冷却要素及び／又は加熱要素（図示なし）をさらに備えてもよい。前記冷却要素及び／又は加熱要素は、管、容器（例えば、反応容器、仮置き容器、さらなる容器及び／又は貯蔵器）及び／又はフィルター装置のうちの１つ以上を少なくとも部分的に取り巻くように配置されいてもよい。好ましくは、冷却要素は、貯蔵器及び／又はフィルター装置を少なくとも部分的に取り巻くように配置されている。したがって、本発明による方法は、各冷却要素及び／又は加熱要素の制御によって、０℃～２５℃の温度で実施することが可能であり、好ましくは、大部分のステップに関しては、２℃～８℃で実施することが可能である。この結果、多量の精製済みのｍＲＮＡ分子を得ることができる。

好ましくは、上記システムは、自動的に制御されることが好ましいｐＨ調整のための要素（図示なし）をさらに備えてもよい。前記要素は、ｐＨ計等の溶液及び／又は懸濁液のｐＨを測定するための装置及び任意選択によりｐＨ調整容器を備えてもよく、後に挙げたｐＨ調整容器は好ましくは、容器（例えば、反応容器、仮置き容器、さらなる容器及び／又は貯蔵器）のうちの少なくとも１つと流体連通している。したがって、各容器内の溶液又は懸濁液のｐＨは、測定及び／又は制御することができる。追加事項として又は代替的には、透過物のｐＨは、測定することが可能であり、好ましくは、連続的に測定することが可能である。したがって、ｍＲＮＡ精製プロセスは、モニタリング及び品質検査することができる。

さらに、核酸の濃度及び／又は純度は、好ましくは透過物を使用して、測定することができる。このような測定は、例えばｍＲＮＡ分子を含む分子の吸光度をＵＶ域の約２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで測定することにより、測光法によって実施することができる。例えば、約２６０ｎｍで得られた値の、約２８０ｎｍで得られた値に対する商は、溶液又は懸濁液中における各拡散の純度を指し示し得る。例えば約１．８～約２．０の比は、高い純度のＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指し示し得るが、例えば１．８未満の比は、例えばタンパク質による不純物を指し示し得る。したがって、例えば透過物の組成に関する情報は、ｍＲＮＡ分子濃度も含めて得ることができる。任意選択により又は代替的には、ｍＲＮＡ分子濃度は、導電性の測定、好ましくは連続的な導電性の測定によって判定することができる。したがって、上記システムは、分光計及び／若しくは分光光度計、例えばｎａｎｏｄｒｏｐ、並びに／又は導電性の測定を実施するための手段等、自動的に制御されることが好ましい核酸定量化（図示なし）のための要素をさらに備えてもよい。

容器（例えば、反応容器、仮置き容器、さらなる容器及び／又は貯蔵器）のいずれか１つ又はすべての容器を、各はかりに配置することができる。したがって、各容器の重量は、精製すべき又は各容器内で精製されるｍＲＮＡ分子を含む溶液又は懸濁液の重量は、測定することが可能であり、例えば第１、第２、第３、第４及び／若しくは第５の溶液の各溶液若しくは各添加成分、並びに／又はＩＶＴ試薬の適切な量。したがって、ｍＲＮＡ製造及び／又は精製プロセスは、最適化及び自動化することができる。

ｍＲＮＡ製造及び／又は精製プロセスを確実に自動制御するために、上記システムは好ましくは、上記手段を制御するようになされた制御手段、例えば、バルブ、（補助）ポンプ、加熱要素及び／又は冷却要素、ｐＨ調整のための要素、核酸の定量化のための要素、導電性測定を実施するための手段及び／又ははかりを備える。本明細書において、「システム」という用語は、装置として解されることを意味し、装置と相互に置きかえ可能に使用され得る。

ｍＲＮＡ分子製造システムの連結管に関しては、前記連結管は、例えば反応容器とさらなる容器とを直接に流体連通させる、図２に図示された連結管であってもよい。代替的には、連結管は、それぞれの容器を連結する２つ以上の管を指し得る。したがって、連結管は例えば少なくとも、反応容器と第１のさらなる容器とを流体連通させる第１の管、及び、反応容器と第２のさらなる容器とを流体連通させる第２の管を指し得る。好ましくは、前記２つ以上の管のうちの１つ以上は、各容器間にあるバルブと、任意選択により補助ポンプとを備えてもよい。

上記システムの構成要素のいずれか１つは、使い捨て型構成要素であってもよい。好ましくは、容器（例えば、仮置き容器、反応容器及び／又はさらなる容器）のうちの１つ以上及び／又は（仮置き用）バルブのうちの１つ以上はそれぞれ、各使い捨て型容器及びバルブであってもよい。好ましくは、仮置き容器及び／又は反応容器は、各使い捨て型容器である。任意選択により、システム全体が、例えば特定のｍＲＮＡ分子の製造及び精製を目的とする、使い捨て用のシステムであってもよい。これには、通常ならば汚染のリスクを低下させるために必要とされる時間とコストがかかる洗浄、クリーニング及び／又は滅菌ステップを省略しながら、各ｍＲＮＡ分子を無菌条件下で製造及び精製することができるという利点がある。したがって、好ましくは、上記システムに属する１つ以上の構成要素は、各使い捨て型構成要素である。

図２に例示として示されたシステムには、いくつかの利点がある。このようなクローズドシステムにおいては、例えばＲＮアーゼによる汚染のリスクが最小化され、同時に、連続式ＴＦＦを用いることによりフィルターメンブレンの閉塞が回避されるため、処理能力を高めることができる。さらに、このようなシステムは、例えばポンプによって制御される流体の移送により、容易に取り扱うことができるものであり、例えば（補助）ポンプ及び／又はバルブを自動的に制御することにより、完全に自動化することさえも可能である。さらに、このようなシステムは、容易にスケーリングすることが可能であり、顧客に特有の要件に応じてうまく調節することができる。したがって、ｍＲＮＡ分子のハイスループット精製は、図２に提示のシステムを使用して、本開示の方法による非常に効率的で自動化された様式で実施することができる。

本発明は、（ａ） 上記ｍＲＮＡ分子を精製する方法によってｍＲＮＡ分子を精製することと、（ｂ） このようにして得られたｍＲＮＡ分子を医薬組成物中に配合することとを含む、医薬組成物を製造するための方法にさらに関する。これは、そのタンパク質の欠損若しくは欠陥が疾患と関連付けらており、及び／又は、そのタンパク質の存在が細胞内で必要とされる若しくは有益である、タンパク質の合成を可能にするためのｍＲＮＡ分子の投与等、薬学的な観点における精製済みのｍＲＮＡ分子の用途との関連で、特別に興味深いことである。

好ましくは、本発明によって精製されたｍＲＮＡ分子から翻訳され得るアミノ酸配列の機能が、細胞内又は細胞の近傍において必要とされ、又は有益であり、例えば、細胞内又は細胞の近傍においては、そのアミノ酸配列が欠乏若しくは欠損した形態が疾患若しくは病気の誘因であり、そのアミノ酸配列の提供が疾患若しくは病気を軽減若しくは予防することができる、アミノ酸配列、又は、身体にとって有益なプロセスを促進することができる、アミノ酸配列が、細胞内又は細胞の近傍において必要とされ、又は有益である。コード化アミノ酸配列は、完全なアミノ酸配列又はその機能的バリアントであってよい。さらに、コード化アミノ酸配列は、因子、インデューサー、制御因子、スティミュレーター若しくは酵素又はこれらの機能フラグメントとして作用することが可能であり、このアミノ酸配列は、その機能が障害、特に代謝障害を治療するため、又は新たな血管、組織等の形成等のインビボプロセスを開始するために必要である、アミノ酸配列である。ここで、機能的バリアントは、そのアミノ酸配列の機能が細胞内で必要とされ、又は、そのアミノ酸配列を欠乏若しくは欠損した形態が病原性のものである、アミノ酸配列の機能を細胞内で担う、フラグメントを意味するように理解されている。

好ましくは、このようなアミノ酸配列は、準最適なアミノ酸配列の生合成によって生じる生理学的な機能を発生又は再生させるため、したがって、疾患の経過に直接又は間接的に好ましい影響を与えるための、サプリメント目的又は医療目的での用途において、有利である。公知の遺伝的基礎を伴う障害は、例えば嚢胞性線維症、血友病、高血圧、コレステロールレベルの上昇、がん、神経変性障害及び精神疾患等である。現在２２，９９３件のヒト遺伝子及び遺伝子障害のエントリーがそれぞれの遺伝子及び表現型に関する説明と一緒に収載されたオンラインカタログを、ＯＮＩＭ（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ）ウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｏｎｉｍ．ｏｒｇ）で入手可能であり；それぞれの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から入手可能である。非限定的な例として、次の表２では、いくつかの先天性疾患及び対応する遺伝子が列記されている。細胞シグナリング経路どうしは高度に相互作用するため、特定の遺伝子の変異は、種々の病的症状を引き起こすが、これらの病的症状のうちの特徴的なもののみが表２に列記されている。

タンパク質は、免疫原性反応を誘導し、例えば抗原として作用するポテンシャルも有し得る。このようなタンパク質は、サプリメント用途又は予防接種を含む医療目的での用途に資するものである。

ｍＲＮＡ分子を精製するステップに関しては、上記に記載したものと同じことが、（Ｉａ） 第１の溶液を使用して、沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から沈殿したｍＲＮＡ分子を精製するステップと、（Ｉｂ） 第２の溶液を使用して、ステップ（Ｉａ）において得られた精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子を洗浄し、溶解させるステップと、（ＩＩａ） ＥＤＴＡ等のキレート化剤を含む第３の溶液を使用して、ステップ（Ｉｂ）において得られた溶解したｍＲＮＡ分子からｍＲＮＡ分子を精製するステップと、続いて、（ＩＩｂ） 第４の溶液を使用して、ステップ（ＩＩａ）において得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を洗浄するステップとを含む、本発明によるｍＲＮＡ分子を精製する方法であって、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）が、タンジェントフローろ過を用いて実施される、方法にもあてはまる。

このようにして得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を医薬組成物中に配合するステップに関しては、前記ステップは、水を用いて精製されたｍＲＮＡ分子が、ステップ（ＩＩｂ）において使用される第４の溶液として使用される場合、及び、ステップ（ＩＩｂ）が１回より多い場合における最後のステップ（ＩＩｂ）において使用される第４の溶液として使用される場合のそれぞれにおいて、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを加えることを含んでもよい。これは、精製済みのｍＲＮＡ分子が、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムをすでに含む溶液中では得られない場合、又は、精製済みのｍＲＮＡ分子が、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムをすでに含有するが、投与用として望まれる濃度とは別の濃度で含有する溶液中で得られる場合においては、有利である。後者の場合、本方法は、各濃度を測定し、必要に応じて調節するステップをさらに含んでもよい。好ましくは、精製済みのｍＲＮＡ分子は、それぞれの濃度の前記塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムを含むｐＨ３～６、好ましくはｐＨ４～５の第４の溶液を、上記ｍＲＮＡ分子を精製するための方法の（最後の）ステップ（ＩＩｂ）において使用することよる投与のために有利な濃度の塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウムをさらに含む、溶液に含まれる。

得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を医薬組成物に配合することは、薬学的に許容されるキャリアを加えるステップを含んでもよい。精製済みのｍＲＮＡ分子は好ましくは、有効量、すなわち、医薬組成物を投与すべき対象において検出可能な治療反応を誘導するのに十分な量で含まれる。精製済みのｍＲＮＡ分子及び／又は医薬組成物は、無菌の水溶液又は非水溶液、懸濁液及びエマルション並びにクリーム及び座薬であり得るが、粉末、錠剤又はエアロゾルの形態を有することも可能である。

本明細書において使用されている「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、健全な医学的判断の範囲では、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴うことなく、人間及び動物の組織と接触させて使用するのに適し、ベネフィット／リスク比に見合う、化合物、資材、原材料及び／又は組成物を指す。したがって、薬学的に許容されるキャリアは、投与、吸着、溶解度又は薬物動態学的な検討事項の観点から取り扱いを容易にするために薬学的に活性な物質と一緒に配合された、不活性物質である。

適切な薬学的に許容されるキャリアの例は、当技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、バッファー、水、オイル／水型エマルション等のエマルション、様々な種類の湿潤剤及び無菌溶液が挙げられる。特に、水性キャリアには、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルション又は懸濁液が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物油及びエチルオレエート等の有機エステルである。薬学的に許容されるキャリアのさらなる例には、限定されるわけではないが、生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液、シトレート、ホスフェート及び他の有機酸；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウムイオン及びカリウムイオン；低分子量（１０個超のアミノ酸残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン若しくはゼラチン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；ヒスチジン、グルタミン、リシン、アスパラギン、アルギニン若しくはグリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含む淡水化物；単糖；二糖；他の糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトール；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；非イオン性界面活性剤、例えば、商品名Ｔｗｅｅｎで市販されているポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、プロピレングリコール、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ若しくはポリエチレングリコール；メチオニン、アスコルビン酸及びトコフェロールを含む抗酸化剤；並びに／又は、保存料、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノールアルコール、ブチルアルコール若しくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベン若しくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾール）が挙げられる。適切な薬学的に許容されるキャリア及びこれらのキャリアの配合は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．でさらに詳細に説明されている。さらに、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤及び不活性ガス、ナノシステム（ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍ）又はリポソーム等の保存料、安定剤及び他の添加剤が存在してもよい。

本発明は、前述の方法によって製造され、本明細書に開示の各方法のいずれかによって精製された、ｍＲＮＡ分子を含む医薬組成物にさらに関する。医薬組成物は、医薬組成物が投与された対象の細胞内におけるタンパク質等のアミノ酸配列の翻訳を調節及び／又は向上させるために有利であり、前記タンパク質等のアミノ酸配列の存在は、例えば疾患との関連において、対象にとって有益であり、及び／又は必要とされる。

医薬組成物、ｍＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子の精製及び医薬組成物の配合に関しては、上記各実施形態との関連で言及された特徴及び利点を含めて、上記に記載したことと同じことが当てはまる。

本発明の医薬組成物は、針注射、吸入器の使用、ネブライザー、クリーム、フォーム、ゲル、ローション及び軟膏等、多種多様な当業者に公知の投与形態及び投与経路によって投与することができる。用量及び作用の持続期間は、前記精製済みのｍＲＮＡ分子が果たすべき機能に依存するが、いずれの場合においても、計画的に調節されなければならない。作用の持続期間は、例えば前記精製済みのｍＲＮＡ分子が、欠損遺伝子に起因する疾患の長期治療のために使用される場合、可能な限り長いものにするが、他の適応症もある場合、作用の持続期間は、特定の時間枠に調節することもできる。さらに、適切な医薬組成物に配合された前記精製済みのｍＲＮＡ分子の全身投与も可能である。

本開示の方法によってｍＲＮＡ分子を循環させている、連続式タンジェントフローろ過（ＴＦＦ）システムの概要の図である。ｍＲＮＡ分子は、ステップ（Ｉａ）においては懸濁液中であり、ステップ（Ｉｂ）においては溶解しており、ステップ（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）のそれぞれの場合においては溶液中である。 本開示の方法によってｍＲＮＡ分子を精製するための例示的なシステムの概要の図である（バルブ、（補助）ポンプ及び／又は（さらなる）容器の位置が例示として図示されている。）。 ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）によってＲＴで各インビトロ転写（ＩＶＴ）混合物を精製した後で、無修飾のｔｄＴｏｍａｔｏをコードするｍＲＮＡを含むＴＦＦ保持液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、続いてコロイダルクマシー染色を施した図である。レーン１：コントロールとしての酢酸アンモニウム（ＮＨ_４ＯＡｃ）中の酵素混合物；レーン２：ＴＦＦシステムをプライミングした後の酵素混合物；レーン３：ヌクレアーゼ不含水水中のＴＦＦ後の酵素混合物；レーン４：ＩＶＴ混合物；レーン５：ＴＦＦシステムのプライミング後のＩＶＴ混合物；レーン６：ヌクレアーゼ不含水水中のＴＦＦ後のＩＶＴ混合物；レーン７：コントロールとしてのヌクレアーゼ不含水水中の酵素混合物。酵素混合物は、ＲＮアーゼ阻害剤、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼ及びＤＮアーゼＩからなっていた。 ステップ（Ｉａ）及び（ｂ）によってＲＴで各インビトロ転写（ＩＶＴ）混合物を精製した後で、無修飾のｔｄＴｏｍａｔｏをコードするｍＲＮＡを含むＴＦＦ保持液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、続いてコロイダルクマシー染色を施した図である。レーン１：コントロールとしてのヌクレアーゼ不含水中の酵素混合物；レーン２：ＴＦＦ前のＩＶＴ混合物；レーン３：ＴＦＦシステムのプライミング後のＩＶＴ混合物；レーン４：ヌクレアーゼ不含水水中のＴＦＦ後のＩＶＴ混合物；レーン５：ヌクレアーゼ不含水水中のＴＦＦ後のＩＶＴ混合物（２．５Ｍ酢酸アンモニウム及びヌクレアーゼ不含水によるダイアフィルトレーション後、各混合物を２．５倍に濃縮して、タンパク質の除去を効率的に検出した。）。酵素混合物は、ＲＮアーゼ阻害剤、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼ及びＤＮアーゼＩからなっていた。 ステップ（Ｉａ）及び（ｂ）によって４℃で各インビトロ転写（ＩＶＴ）混合物を精製した後で、無修飾のｔｄＴｏｍａｔｏをコードするｍＲＮＡを含むＴＦＦ保持液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、続いてコロイダルクマシー染色を施した図である。レーン１：コントロールとしてのヌクレアーゼ不含水中の酵素混合物；レーン２：ＴＦＦ前のＩＶＴ混合物；レーン３：１洗浄量（初期フィード体積に等しい）後のＩＶＴ混合物；レーン４：ヌクレアーゼ不含水水中のＴＦＦ後のＩＶＴ混合物；レーン５：ヌクレアーゼ不含水水中のＴＦＦ後のＩＶＴ混合物（２．５Ｍ酢酸アンモニウム及びヌクレアーゼ不含水によるダイアフィルトレーション後、各混合物を２．５倍に濃縮して、タンパク質の除去を効率的に検出した。）。酵素混合物は、ＲＮアーゼ阻害剤、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼ及びＤＮアーゼＩからなっていた。 Ａ） ＴＦＦによって精製されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡと、酢酸アンモニウムによる沈殿によって精製され、続いて７０％エタノールによって洗浄されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのトランスフェクションとを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを使用して実施した、ＨＥＫ２９３細胞内で翻訳されたｈＣＦＴＲタンパク質のウェスタンブロットの図である。ハウスキーピング要素（ｈｏｕｓｅ ｋｅｅｐｅｒ）として、Ｈｓｐ９０タンパク質のバンドが示されている。トランスフェクションなしの細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。Ｂ） 発現したｈＣＦＴＲは、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用したデンシトメトリー分析によって定量化し、ＨＳＰ９０タンパク質に対して正規化した。トランスフェクションなし（ＵＴ）の細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。 百分率を単位とする異なる洗浄量の後の、ｈＣＦＴＲターゲットｍＲＮＡ分子の量に対する、ｈＣＦＴＲではない様々なスパイクインｍＲＮＡ分子の残存量の図である。タンジェントフローろ過をＲＴで実施した。 百分率を単位とする異なる洗浄量の後の、ｈＣＦＴＲターゲットｍＲＮＡ分子の量に対する、ｈＣＦＴＲではない様々なスパイクインｍＲＮＡ分子の残存量の図である。タンジェントフローろ過を４℃で実施した。 ４℃におけるＴＦＦ精製の前（Ａ）及び後（Ｂ）に、２５ｎｔのアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド（１５ｎｔ、２５ｎｔ及び１２０ｎｔ）をスパイクしたｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動を、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して実施した図である。下限マーカー（ｌｏｗｅｒ ｍａｒｋｅｒ）は、各キャピラリーのランにおけるピークの保持時間を正規化するためにＦｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒの試薬キットに用意された、内部標準（長さ１５ｎｔのＲＮＡオリゴヌクレオチド）である。 代表として、異なる膜間差圧セットポイントで透過流束を測定した、図である。 ＲＴにおける手法１による精製前（Ａ）、ステップ（Ｉｂ）の後（Ｂ）、ステップ（ＩＩａ）の後（Ｃ）及びステップ（ＩＩｂ）の後（Ｄ）に、長さ２５ｎｔ及び長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、並びに長さ２５６ｎｔのＧＬＰ－１ ｍＲＮＡ分子をスパイクしたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動を、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して実施した図である。下限マーカーは、各キャピラリーのランにおけるピークの保持時間を正規化するためにＦｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒの試薬キットに用意された、内部標準（長さ１５ｎｔのＲＮＡオリゴヌクレオチド）である。 ＲＴにおける手法２による精製の前（Ａ）及び後（Ｂ）に、長さ２５ｎｔ及び長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、並びに長さ２５６ｎｔのＧＬＰ－１ ｍＲＮＡ分子をスパイクしたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡのキャピラリーゲル電気泳動を、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して実施した図である。下限マーカーは、各キャピラリーのランにおけるピークの保持時間を正規化するためにＦｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒの試薬キットに用意された、内部標準（長さ１５ｎｔのＲＮＡオリゴヌクレオチド）である。

次の例においては、本発明の他の態様及び利点を説明するが、これらは、例示を目的として与えられており、限定として与えられているわけではない。本明細書において引用された各刊行物、特許、特許出願は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

方法及び資材は、本明細書においては、本開示における使用のために記載されており；当技術分野において知られた他の適切な方法及び資材が使用されてもよい。資材、方法及び例は、説明用のものにすぎず、限定を加えるものとして意図されていない。

本明細書において使用されている略語及び各略語に関する説明は、表３に列記されている。

資材及び方法
使用された材料、装置、ソフトウェア及び試験系
資材は、表４に列記されている。

装置は、表５に列記されている。

ソフトウェアは、表６に列記されている。

試験系は、表７に列記されている。

ＴＦＦによるＩＶＴ混合物の精製 － ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）
下記においては、無修飾で長さ１６４４ヌクレオチド（ｎｔ）のインビトロ転写無修飾ｔｄＴｏｍａｔｏターゲットｍＲＮＡ分子を含むインビトロ転写（ＩＶＴ）混合物を使用した。さらに、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼ、ＲＮアーゼ阻害剤及びＤＮアーゼＩを含む酵素混合物を使用した。

ＲＮＡ沈殿
ＩＶＴ混合物及び酵素混合物のそれぞれを、２．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃの最終濃度になるまで、よく冷えた等量の５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ ｐＨ７によって沈殿させ、氷の上で少なくとも３０分間インキュベートした。ＴＦＦの前には、混合物中における最終濃度が約０．５ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡになるまで、２．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ ｐＨ７によって各混合物を１：１に希釈した。ＩＶＴ又は酵素混合物をＴＦＦシステムにつなげたら、最初にＴＦＦシステムを、透過物用クランプを閉じた状態で５０ｍｌ／ｍｉｎでＩＶＴ混合物を循環させることによって１０分間プライミングした。

ステップ（Ｉａ）：タンパク質、ヌクレオチド及び塩の除去
ＭＷＣＯが５００ｋＤａのｍＰＥＳフィルターカラムを使用して、約２００～３００ｍｂａｒの一定のＴＭＰにおいて、５０ｍｌ／ｍｉｎで各混合物のダイアフィルトレーションを実施した。各混合物を、１０洗浄量の２．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ ｐＨ７によってダイアフィルトレーションした。このステップにより、インビトロ転写に由来の酵素、ヌクレオチド及びバッファー成分が効率的に除去された。ステップ（Ｉａ）を用いて、他の任意の中間製造ステップ（例えば、脱リン酸化、ポストキャッピング、ポリアデニル化、．．．）に由来の他の任意のタンパク質及び／又は酵素を除去することができる。一部の酵素（例えば、着目するｍＲＮＡ分子に高いアフィニティで結合するポリ（Ａ）ポリメラーゼ）の場合、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、ＬＤＳ、．．．）を酢酸アンモニウムバッファー ｐＨ７に加えてもよい。ポリ（Ａ）ポリメラーゼがポリアデニル化のために使用される場合、後続するステップ（Ｉａ）は好ましくは、２０℃～３０℃の温度、好ましくは２３℃～２７℃の温度、より好ましくは２５℃で実施される。このような温度は、効率的なポリ（Ａ）ポリメラーゼ除去のために有利である。

ステップ（Ｉｂ）：ステップ（Ｉａ）に由来のＮＨ_４ＯＡｃの除去
ＮＨ_４ＯＡｃを除去し、ｍＲＮＡ分子を分割するという目的で、５０ｍｌ／ｍｉｎの流量及び約２００～３００ｍｂａｒのＴＭＰにおけるヌクレアーゼ不含水を使用した１０洗浄量によるダイアフィルトレーションのために、ＭＷＣＯが１００ｋＤＡのｍＰＥＳフィルターカラムを使用した。代替的には、ＭＷＣＯが５０ｋＤａのｍＰＥＳフィルターカラムを、ｍＲＮＡ分子のサイズに応じて使用してもよい。

ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）の精製効率を調査するために、ｍＲＮＡ分子を含むＴＦＦ保持液は、ＴＦＦ（すなわち、ステップ（Ｉｂ））の前後でサンプリングし、例えばＵＶ測定、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて分析し、続いて、例えばコロイダルクマシー染色を施すことが可能である。

図３～図５に示されているように、酵素は、上記ステップ（Ｉａ）及び（Ｉｂ）を施すことによって、ｍＲＮＡ分子から効率的に除去され得る。これにより、ｍＲＮＡ分子は、ＴＦＦカラムによって保持されたが、酵素及び／又はタンパク質は、効率的に除去された。スメアピーク分析により、スメアプレピークは、ＴＦＦ精製の前では４．７％であり、４℃におけるＴＦＦ精製に関しては＋１．３％の偏差があり、ＲＴでＴＦＦ精製を実施した後では＋１．８％の偏差があることが明らかになった。したがって、ｍＲＮＡの分解を観察することはできなかった。

ＴＦＦによる沈殿及び溶解したｍＲＮＡの精製 － ステップ（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）の発展
下記においては、沈殿及び溶解したｍＲＮＡをさらなる精製のために使用した。

様々なろ過メンブレン及びｍＲＮＡの透過に及ぼされるＥＤＴＡの効果の試験
異なる細孔径を有する様々なフィルターメンブレンを、ヌクレアーゼ不含水を単独で使用した場合、又はヌクレアーゼ不含水をさらなる１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と一緒に使用した場合におけるｍＲＮＡ分子の透過について試験した。それぞれ５００ｋＤａ、３００ｋＤａ、１００ｋＤａ及び５０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する４個のｍＰＥＳカラムを試験した。膜間差圧（ＴＭＰ）は、ＴＦＦシステムの保持液用クランプを使用して調節され、それぞれＭＷＣＯが５００ｋＤａ及び５０ｋＤａのカラムに関しては４０ｍｂａｒに保たれ、それぞれＭＷＣＯが１００ｋＤａ及び３００ｋＤａのカラムに関しては１００ｍｂａｒに保たれた。メインポンプを１５ｍｌ／ｍｉｎの流量に設定し、ＴＦＦをＲＴで実施した。フィード中における初期ｍＲＮＡ分子濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌであり、保持液及び透過物中におけるｍＲＮＡ分子濃度は、ＵＶ測定を用いて測定された。各カラムは、元々のサンプル体積に対して１０ｘ洗浄量によって試験された。

ＥＤＴＡがない場合、ｍＲＮＡ分子は、５００ｋＤａのＭＷＣＯを有する供試カラムによって保持された。より小さい細孔径（すなわち、３００ｋＤａ、１００ｋＤａ及び５０ｋＤａ）は、いずれのｍＲＮＡ分子の通過を許さないと仮定され、したがって、ＥＤＴＡが存在しない状態ではさらに試験されなかった。

ＥＤＴＡがある場合、驚くべきことに、ｍＲＮＡ分子は、ＭＷＣＯが５００ｋＤａのフィルターメンブレンの細孔を通過し、ＭＷＣＯが３００ｋＤａのフィルターメンブレンを使用したときにも部分的に失われた。しかしながら、ｍＲＮＡ分子は、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下においては、ＭＷＣＯが１００ｋＤａ及び５０ｋＤａのフィルターメンブレンを使用してうまく保持することができた。したがって、以下に提示の実験では、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのカラムが、ｍＲＮＡ分子のろ過のために選択された。

１０ｍＭ ＥＤＴＡによるろ過後には、ｍＲＮＡ分子の散発的な沈殿が観察されることもあったことに留意しなければならない。しかしながら、４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むバッファーの使用によって、上記沈殿を効率的に防止することができた。

４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡダイアフィルトレーションバッファーの調製
ＭＯＰＳをヌクレアーゼ不含水に溶解させ、１Ｍ ３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）バッファーを調製した。次いで、３２％ＮａＯＨを使用して、１Ｍ ＭＯＰＳバッファーのｐＨをｐＨ７に調節した。得られたｐＨ７の１Ｍ ＭＯＰＳバッファーを、０．５Ｍ ＥＤＴＡ及びヌクレアーゼ不含水と混合すると、最終的には、４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むダイアフィルトレーションバッファーが得られた。

核酸オリゴヌクレオチドを除去するための洗浄バッファー量の判定
ＴＦＦプロセスの効率、すなわち、アボーティブ転写産物及び／又は加水分解生成物を代表とする核酸オリゴヌクレオチド等の不純物の完全な除去に必要な洗浄サイクルの最小回数は、メンブレンフィルター及びメンブレンフィルターの細孔径による分子の排除に強く依存する。したがって、洗浄バッファー量のそれぞれの効果を調査して、着目するｍＲＮＡ分子を含む沈殿及び溶解したｍＲＮＡからスパイク済みの核酸オリゴヌクレオチドを除去するために必要な洗浄サイクルの数を決定した。

この実験に関しては、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのｍＰＥＳフィルターカラムを使用した上で、ＴＦＦ流量は、１５ｍｌ／ｍｉｎに設定され、ＴＭＰは、約４０ｍｂａｒに一定に保たれた。５ｍｌのフィード総体積として、５００μＬのｍＲＮＡ分子に、ターゲットｍＲＮＡ分子の２．５％（ｍ／ｍ）に相当する長さ１０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、ターゲットｍＲＮＡ分子の２．５％（ｍ／ｍ）に相当する長さ５０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、及び、ターゲットｍＲＮＡ分子の５％（ｍ／ｍ）に相当する長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドをスパイクした。４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むダイアフィルトレーションバッファーを用いた場合の元々のフィード体積に対して５ｘ、１０ｘ、１５ｘ及び２０ｘ洗浄量の後に、逆相ＨＰＬＣ分析用のサンプルを抜き出した。サンプルを抜き出す前には、透過物用クランプを閉じ、保持液の循環のために５０ｍｌ／ｍｉｎで５分間保持液用バルブを開いた。各洗浄サイクルにおいては、無菌シリンジを使用して１００μＬのサンプルを抜き出し、これらのサンプルは、分析まで氷の上に置いておいた。ＴＦＦを室温で実施した。逆相ＨＰＬＣ分析を用いてサンプルを調査したが、２６０ｎｍで検出された面積は、サンプル中におけるＤＮＡオリゴヌクレオチドの相対量を表していた。ＴＦＦ（コントロール）前の対応する面積は、１００％オリゴヌクレオチドに対して設定された。

すべての場合において、それぞれフィード体積に対して５ｘ、１０ｘ、１５ｘ及び２０ｘ洗浄量を適用した後には、核酸オリゴヌクレオチドを検出することができなかった。したがって、この結果により、洗浄用バッファーを用いた場合の５ｘ洗浄量後にはすでに、核酸オリゴヌクレオチドを保持液中で検出することができないことが示された。洗浄用バッファーを用いた場合の１０ｘ洗浄量という最低量は、ｍＲＮＡ分子から核酸オリゴヌクレオチドを除去するのに十分であると判定された。

ＥＤＴＡの除去のためのヌクレアーゼ不含水を用いた場合の洗浄量の判定
ＴＦＦによるＤＮＡオリゴヌクレオチドの除去は、洗浄用バッファー、すなわち、４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むダイアフィルトレーションバッファーを使用して実施されるため、後続するろ過ステップは、洗浄用バッファーをヌクレアーゼ不含水によって交換するために有利である。したがって、実験は、ｍＲＮＡ分子から洗浄用バッファーを除去するために必要な洗浄サイクルの量を決定するために実施された。前述の実験からは、２０ｘ洗浄量のダイアフィルトレーションバッファーによってあらかじめろ過されたｍＲＮＡ分子を含む総体積が約５ｍｌのフィード溶液が、ＭＷＣＯが１００ｋＤＡのｍＰＥＳフィルターカラムを使用して、１５ｍｌ／ｍｉｎの流量及び４０ｍｂａｒの一定のＴＭＰにおいて、ヌクレアーゼ不含水によってダイアフィルトレーションされた。ヌクレアーゼ不含水を用いた場合の元々のフィード体積に対して５ｘ、１０ｘ、１５ｘ及び２０ｘ洗浄量の後に、逆相ＨＰＬＣ分析のためのサンプルを採取した。ヌクレアーゼ不含水による各洗浄サイクル後の残留ＥＤＴＡの量を定量化するために、４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むダイアフィルトレーションバッファーを滴定し、検量線を記録した（表６を参照；ＭＯＰＳ－ＥＤＴＡ検量線：ｌｏｇ（ｙ）＝０．６４６７ ｌｏｇ（ｘ）＋１．９１２８；ｒ＝０，９９４６２；ｒ²＝０．９９８７７；曲線モデル：ｌｏｇ／ｌｏｇ）。単独のＭＯＰＳバッファーは２６０ｎｍで吸収シグナルを示さないため、表８及び表９に記載の濃度は、ＥＤＴＡの濃度に対応する。実験は、２２℃のＲＴで実施された。表９では、各洗浄サイクルが終わってからＥＤＴＡを除去した後のデータが示されている。

表９に示されているように、洗浄量を増大させた後に、逆相ＨＰＬＣによって２６０ｎｍで検出されたピーク面積に応じたＥＤＴＡの量が減少することにより、ヌクレアーゼ不含水を用いた場合の１０ｘ洗浄量という最低量が、残留ＥＤＴＡの部分的な除去のためには必要であることが明らかになった。

測定されたパラメータの試験
ＲＴで実施された前述の実験においては、ステップ（ＩＩａ）においてＤＮＡオリゴヌクレオチドを除去するために必要なダイアフィルトレーションバッファーを使用する洗浄サイクルの最小数と、ステップ（ＩＩｂ）において残留ＥＤＴＡを除去するために必要なヌクレアーゼ不含水を使用する洗浄サイクルの最小数とを判定した。測定されたパラメータを試験するために、５ｍｌのフィード総体積として、５００μｇのｍＲＮＡに、ターゲットｍＲＮＡ分子の体積の２．５％に相当する長さ１０ｎｔの核酸オリゴヌクレオチド、ターゲットｍＲＮＡ分子の体積の２．５％に相当する長さ５０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、及び、ターゲットｍＲＮＡ分子の体積の５％に相当する長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドをスパイクした（表８及び表９では、「ＴＦＦ前」と呼んでいる。）。

後述する実験においては、そうではないとの記載がない場合、次の構成を使用した。ＭＷＣＯが１００ｋＤａのｍＰＥＳフィルターカラムを使用して、１５ｍｌ／ｍｉｎの流量及び約４０ｍｂａｒのＴＭＰにおいて、０．１ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ分子を含むフィード溶液をダイアフィルトレーションした。いずれの場合においても、適用された洗浄量は、１０倍の洗浄量、すなわち、４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むダイアフィルトレーションバッファーを用いた場合の１０ｘ洗浄量であり、続いて、ヌクレアーゼ不含水を用いた場合の１０ｘ洗浄量だった（表８及び表９では、「ＴＦＦ後」と呼んでいる。）。ｍＲＮＡ分子は、特に高温での加水分解によって分解しやすいため、実験は、ｍＲＮＡ分子の加水分解を最小限に保つために４℃で実施され、つまりは、氷水を使用して実施された。

逆相ＨＰＬＣを用いて測定したとき、上記構成により、試験された３種すべての長さのＤＮＡオリゴヌクレオチド（表１０）及び残留ダイアフィルトレーションバッファー（表１１）が効率的に除去された。さらに、精製の前後にＦｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、キャピラリーゲル電気泳動後にスメアピーク分析を実施した（表１２）。スメアピーク分析により、ｍＲＮＡの完全性は、ＴＦＦ精製によって変化せず、したがって、本方法によって影響されないことが示された。

精製済みのｍＲＮＡ分子の翻訳効率の測定
さらに、得られた精製済みのｍＲＮＡ分子の翻訳効率を測定することは、大変興味深いことだった。したがって、１．４×１０^６ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに播種し、上記のように精製された３．７５μｇのｍＲＮＡ分子と、標準的な手順によって精製された３．７５μｇのｍＲＮＡ分子とをそれぞれトランスフェクションした。トランスフェクションを、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（１：１５）を使用して実施した。２４時間後、細胞を溶解させたら、ＳＤＳ－Ｐａｇｅ及びウェスタンブロットのそれぞれを用いて、５０μｇの細胞溶解物のそれぞれを使って調査した。

図６からわかるように、ウェスタンブロット（Ａ）を用いると、同等の量のｍＲＮＡ分子が検出され、定量化された（Ｂ）。

長さが異なる長さｍＲＮＡを除去するためのしきい値の測定
合計３００μｇのｍＲＮＡターゲットｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡを、５ｍｌの総体積を採用した長さが異なる様々なｍＲＮＡ分子でスパイクした。特に、相異なる６種類のｍＲＮＡ分子をスパイクのために使用したが、各種類は、ターゲットｍＲＮＡ分子の体積の１６．７％に相当した。３種類のｍＲＮＡ分子は、キャップ及びポリ（Ａ）テールを示し、それぞれ３，６３２ｎｔ、１，８６４ｎｔ及び１，１１１ｎｔの全長を有していた。２種類のｍＲＮＡ分子は、キャップもポリ（Ａ）テールも有さず、それぞれ４９４ｎｔ及び２５６ｎｔの全長を示した。最後の種類のｍＲＮＡ分子は、ポジティブコントロールとして働くＤＮＡの長さが１２０ｎｔのオリゴヌクレオチドに当てはまった。

スパイク済みのｍＲＮＡ分子を含む溶液を、上記のようにしてＲＴ（図７）及び４℃（図８）のそれぞれでろ過した。ＴＦＦ前（サンプル調製の直後）、上記ダイアフィルトレーションバッファーを使用した元々のサンプル体積に対して５ｘ、１０ｘ、１５ｘ及び２０ｘ洗浄量の後、及び、１０ｘ洗浄量のヌクレアーゼ不含水水を使用したさらなる洗浄後に、サンプルを抜き出した。各洗浄サイクルにおいては、無菌シリンジを使用して１００μｌのサンプルを抜き出し、分析まで氷の上に置いておいた。分子によるフィルター細孔の透過を、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用したキャピラリーゲル電気泳動によって評価した。

図７及び図８に示されているように、９５１ｎｔの長さを有するｍＲＮＡ分子のカットオフを、１００ｋＤａのｍＰＥＳカラムを使用して観察することができた。９５１ｎｔ未満の長さを有するｍＲＮＡ分子の場合、例えば５０ｋＤａ又は７０ｋＤａのｍＰＥＳカラム等、より低いＭＷＣＯを有するカラムが有利なこともあり得る。

０．１ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌへのｍＲＮＡ分子濃度の上昇
下記最終の組の実験（図９）においては、下記に記載のろ過手順を、ターゲットｍＲＮＡ分子として無修飾で長さ１６４４ｎｔの無修飾ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡを含む溶液に適用した。特には、合計５ｍｇのｍＲＮＡ分子に相当する１ｍｇ／ｍｌのｍＲＮＡ分子と、ターゲットｍＲＮＡ分子の２．５％（ｍ／ｍ）に相当する１５ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド及び長さ２５ｎｔのアンチセンスオリゴヌクレオチド（着目するｍＲＮＡ分子に相補的に結合する）と、ターゲットｍＲＮＡ分子の５％（ｍ／ｍ）に相当する長さ１２０ｎｔのオリゴヌクレオチドを含む、合計５ｍｌのフィード溶液を分析した。このスパイク済みのフィード溶液を、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのｍＰＥＳフィルターカラムを使用して１５ｍｌ／ｍｉｎの流量及び約４０ｍｂａｒのＴＭＰにおいて４℃でダイアフィルトレーションした。適用された洗浄量は、ｉ） ヌクレアーゼ不含水を用いた場合の１０ｘ洗浄量と、続いて、ｉｉ） ４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むダイアフィルトレーションバッファーを用いた場合の１０ｘ洗浄量と、続いて、ｉｉｉ） ヌクレアーゼ不含水を用いた場合の１０ｘ洗浄量だった。

ｍＲＮＡの完全性の指標として、スメア値を調査した。特に、次のスメア値が得られた：ＴＦＦ前における６．４％のスメアプレピーク及びＴＦＦ後の５．９％のスメアプレピーク。スメアプレピーク面積は、ｍＲＮＡに関係する加水分解生成物の比率を反映している。したがって、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ分析によって加水分解生成物を測定することはできず、ＴＦＦ精製がｍＲＮＡの完全性に影響しないことを示すことができた。

通例の手段を用いた最適なＴＦＦパラメータの判定の例示的な概要
下記は、どのようにして当業者が通例の手段の適用によって上記ＴＦＦ法を最適することができるのかについての簡単な説明である。

ステップ（Ｉａ）
ＴＦＦ流量は、ＴＦＦシステム内で沈殿したｍＲＮＡ分子を再循環させ、フィルター表面から沈殿したｍＲＮＡ分子を押し流すのに十分なせん断速度をもたらすように調節することができる。透過物用クランプを開くことにより、十分な透過流束を得ることができる。酵素の除去は例えば、ＳＤＳ－Ｐａｇｅ分析によって測定することができ、必要な洗浄量は、通例の手段によって調節することができる（好ましくは１～２０倍の洗浄量；より好ましくは５～１５倍；最も好ましくは９～１１倍）。１洗浄量は、初期フィード体積に等しいダイアフィルトレーション媒体、例えば、ｐＨ７の酢酸アンモニウムバッファーの体積として規定されている。

ステップ（Ｉｂ）
ステップ（Ｉａ）に記載のものと同じパラメータを適用した。これにより、バッファーは例えば、ｍＲＮＡ分子を分解し、バッファー（例えば、酢酸アンモニウム）を除去するために、ヌクレアーゼ不含水によって交換することができる。バッファーの除去は例えば、導電性、ＵＶ測定によって測定することができ、必要な洗浄量は、通例の手段によって調節することができる（好ましくは１～２０倍の洗浄量；より好ましくは５～１５倍；最も好ましくは９～１１倍）。１洗浄量は、初期フィード体積に等しいダイアフィルトレーション媒体、例えば、ヌクレアーゼ不含水の体積として規定されている。

ステップ（ＩＩａ）
ＴＦＦ流量は、ＴＦＦシステム内でｍＲＮＡ分子を再循環させ、フィルター表面からｍＲＮＡ分子を押し流すのに十分なせん断速度をもたらすように調節することができる。透過物用クランプを開くことにより、十分な透過流束を得ることができる。着目するｍＲＮＡの損失は例えば、透過物ラインにおけるＵＶ測定（例えば、オンライン式／オフライン式の測定）によってモニタリングすることができる。着目するｍＲＮＡの損失が観察される場合、流量及び／又はＴＭＰは、着目するｍＲＮＡのさらなる損失が観察されなくなるまで、通例の手段によって調節することができる。必要な洗浄量は、不純物（例えば、アボーティブ転写産物及び／又は加水分解生成物）の量に応じた通例の手段によって調節することができる（好ましくは１～２０倍の洗浄量；より好ましくは５～１５倍；最も好ましくは９～１１倍）。１洗浄量は、初期フィード体積に等しいダイアフィルトレーション媒体、例えば、ｐＨ７のＭＯＰＳ－ＥＤＴＡの体積として規定されている。

ステップ（ＩＩｂ）
ステップ（ＩＩａ）に記載のものと同じパラメータを適用した。これにより、バッファーは例えば、バッファー、例えばＭＯＰＳ－ＥＤＴＡを除去するために、ヌクレアーゼ不含水によって交換することができる。バッファーの除去は例えば、導電性、ＵＶ測定によって測定することができ、必要な洗浄量は、通例の手段によって調節することができる（好ましくは１～２０倍の洗浄量；より好ましくは５～１５倍；最も好ましくは９～１１倍）。１洗浄量は、初期フィード体積に等しいダイアフィルトレーション媒体、例えば、ヌクレアーゼ不含水の体積として規定されている。

ＴＭＰ上昇実験（ＴＭＰ ｅｘｃｕｒｓｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）は、ｍＲＮＡ分子精製に最適な条件を決定するのに役立ち得る。例示として、上記ステップ（ＩＩａ）において使用されたダイアフィルトレーションバッファー中における１．０ｍｇ／ｍｌの濃度のターゲットｍＲＮＡ分子を含む合計５ｍｌのフィード溶液を、ＭＷＣＯが１００ｋＤａのｍＰＥＳフィルターカラム及び１５ｍｌ／ｍｉｎの流量を用いてダイアフィルトレーションした。透過流束は、約５０ｍｂａｒ～約１５０ｍｂａｒの範囲の６つの異なるＴＭＰ値において、ｍｌ／ｍｉｎを単位として測定された。図１０のｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡを見ればわかるように、最適なＴＭＰは、１５ｍｌ／ｍｉｎの流量では約５０ｍｂａｒであると決定されたが、この最適なＴＭＰは、実験設定に依存し得る。

比較例
下記には、本明細書に開示の方法（手法１）によって得られた結果と、ＷＯ２０１５／１６４７７３Ａ１に開示の方法（手法２）によって得られた結果とを比較するために実施された、一例が記載されている。

手法１
インビトロ転写無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（ＵＳ９７１３６２６Ｂ２を参照；５ｍｇのペレット）に、長さ２５ヌクレオチド（ｎｔ）及び長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、並びに長さ２５６ｎｔのグルカゴン様ペプチド１分子（ＧＬＰ－１ ｍＲＮＡ分子（配列番号：１）をスパイクした。長さ２５ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、μｇを単位とするｍＲＮＡの総量に対して２．５％の比になるようにｍＲＮＡにスパイクした。長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、μｇを単位とするｍＲＮＡの総量に対して５．０％の比になるようにｍＲＮＡにスパイクした。加えて、長さ２５６ｎｔのＧＬＰ－１ ｍＲＮＡ分子を、μｇを単位とするｍＲＮＡ総量に対して１６％の比になるようにｍＲＮＡにスパイクした。
２．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ７）を使用して、スパイク済みのｍＲＮＡ分子を沈殿させた。
タンパク質、塩及びアボーティブ転写産物を除去するために、５０ｍＬ／ｍｉｎの流量及び約２００～３００ｍｂａｒのＴＭＰ（ｍＲＮＡ濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）でＭＷＣＯが５００ｋＤａのｍＰＥＳを使用して、１０ｘ洗浄量の２．５Ｍ ＮＨ_４ＯＡｃによってステップ（Ｉａ）を実施した。
ＮＨ_４ＯＡｃを除去し、ｍＲＮＡ分子を分解するために、５０ｍＬ／ｍｉｎの流量及び約２００～３００ｍｂａｒのＴＭＰでＭＷＣＯの５０ｋＤａのｍＰＥＳを使用して、１０ｘ洗浄量のヌクレアーゼ不含水によってステップ（Ｉｂ）を実施した（ｍＲＮＡ濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）。
二価カチオン、アボーティブ転写産物、及び／又は加水分解生成物を除去するために、１５ｍＬ／ｍｉｎの流量及び約２０ｍｂａｒのＴＭＰでＭＷＣＯが１００ｋＤａのｍＰＥＳを使用して、１０ｘ洗浄量の４０ｍＭ ＭＯＰＳ及び１０ｍＭ ＥＤＴＡによってステップ（ＩＩａ）を実施した（ｍＲＮＡ濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）。
ＭＯＰＳ－ＥＤＴＡダイアフィルトレーションバッファーを除去するために、１５ｍＬ／ｍｉｎの流量及び約２０ｍｂａｒのＴＭＰでＭＷＣＯが１００ｋＤａのｍＰＥＳを使用して、１０ｘ洗浄量のヌクレアーゼ不含水を用いてステップ（ＩＩｂ）を実施した（ｍＲＮＡ濃度：１．０ｍｇ／ｍＬ）。
得られたｍＲＮＡ分子は、スパイク済みのオリゴヌクレオチドの除去に関しては、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ／逆相ＨＰＬＣを用いて調査し、ｍＲＮＡ分子の回収の測定に関しては、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて調査した。

手法２（ＷＯ２０１５／１６４７７３Ａ１に記載のもの）
インビトロ転写無修飾ｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡ（ＵＳ９７１３６２６Ｂ２を参照；１０．２６ｍｇのペレット）に、長さ２５ヌクレオチド（ｎｔ）及び長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、並びに長さ２５６ｎｔのＧＬＰ－１ ｍＲＮＡ分子（配列番号：１）をスパイクした。長さ２５ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、μｇを単位とするｍＲＮＡの総量に対して２．５％の比になるようにｍＲＮＡにスパイクした。長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドを、μｇを単位とするｍＲＮＡの総量に対して５．０％の比になるようにｍＲＮＡにスパイクした。加えて、長さ２５６ｎｔのＧＬＰ－１ ｍＲＮＡ分子を、μｇを単位とするｍＲＮＡ総量に対して１６％の比になるようにｍＲＮＡにスパイクした。
スパイク済みのｍＲＮＡ分子を、ｉ） ２．０９Ｍ グアニジニウムチオシアネート、０．２６％ラウリルサルコシルナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｙｌ ｓａｒｃｏｓｙｌ）及び１３．０ｍＭ クエン酸ナトリウムの最終濃度になるようにグアニジニウムチオシアネート、ラウリルサルコシルナトリウム及びクエン酸ナトリウムを使用し、ｉｉ） 約３８％ＥｔＯＨの最終濃度になるように無水エタノールを使用して沈殿させ、ＲＴで５分間インキュベートした。
約６ｍＬ／ｍｉｎの流量でＭＷＣＯが５００ｋＤａのｍＰＥＳを使用して、約２２ｍＬの沈殿したｍＲＮＡを用いてローディングを実施した（ｍＲＮＡ濃度：０．５２ｍｇ／ｍＬ）。
約６ｍＬ／ｍｉｎの流量でＭＷＣＯが５００ｋＤａのｍＰＥＳを使用して、次の２つのステップを５回より多く繰り返すことによって洗浄を実施した（ｍＲＮＡ濃度：０．５２ｍｇ／ｍＬ）。ステップａ） ５ｍＬの２．０９Ｍグアニジニウムチオシアネートと、０．２６％ラウリルサルコシルナトリウムと、１３．０ｍＭ クエン酸ナトリウムと、約３８％ＥｔＯＨとを使用して洗浄すること、及びステップｂ） ５ｍＬの８０％エタノールを使用して洗浄すること。
得られた固体状ｍＲＮＡを５ｍＬのヌクレアーゼ不含水で処理し、５～１０分間（透過物は閉じた状態で）再循環させて、確実に溶解させることによって、溶出（ステップＣ）を実施した。ｍＲＮＡ分子が回収されなくなるまで、約６ｍＬ／ｍｉｎの流量及びＭＷＣＯが５００ｋＤａのｍＰＥＳを用いて、この手順を繰り返した（ｍＲＮＡ濃度：０．５２ｍｇ／ｍＬ）。
１ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）を用いた場合の約５洗浄量、約６ｍＬ／ｍｉｎの流量及びＭＷＣＯが１００ｋＤａのｍＰＥＳ（ｍＲＮＡ濃度：０．５２ｍｇ／ｍＬ）を用いて、透析（ステップＤ）を実施した。
得られたｍＲＮＡ分子は、スパイク済みのオリゴヌクレオチドの除去に関しては、Ｆｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ／逆相ＨＰＬＣを用いて調査し、ｍＲＮＡ分子の回収の測定に関しては、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて調査した。

注意点として、上記２手法の場合、ＷＯ２０１５／１６４７７３Ａ１に記載の方法に比べて、次の変更がなされた。フィルターカラムにおけるせん断速度を一定に保つための線形のダウンスケーリング後、最初に計画された流量は、６ｍＬ／ｍｉｎだった。しかしながら、この流量は、非常に低いＴＭＰをもたらしており、つまりは、効果的な透過物流量が０ｍＬ／ｍｉｎであり、ダイアフィルトレーションは可能ではなかった。そのため、かなりの透過流束をもたらすのに十分なＴＭＰが観察されるまで、流量を段階的に増大させた。したがって、ステップａ）～ｄ）のために使用される最終的な流量は、２０～２４ｍＬ／ｍｉｎの範囲だった（１．１～１．２５ｍＬ／ｍｉｎの透過物流量）。

無精製のｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡサンプル及び精製されたｈＣＦＴＲ ｍＲＮＡサンプルを対象にして実施されたＦｌａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ分析により、表１３に示された結果が得られた。各電気泳動図は、それぞれ、手法１に関しては図１１に示されており、手法２に関しては図１２に示されている。

手法１の場合、スパイク済みのＤＮＡオリゴヌクレオチド（２５ｎｔ及び１２０ｎｔ）の除去は、主に、ステップ（Ｉａ）／（Ｉｂ）によって達成された。ステップ（ＩＩａ）は、より長い加水分解生成物に相当する２５６ｎｔのｍＲＮＡを除去するために必要とされた。ステップ（ＩＩｂ）は、２５６ｎｔのｍＲＮＡをさらに除去せず、これにより、加水分解生成物及び失敗作の配列（ａｂｏｒｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を除去するためには、ＥＤＴＡ等の強力キレート化剤を使用したステップ（ＩＩａ）が必須であることが示された。

手法２の場合、スパイク済みのＤＮＡオリゴヌクレオチド（２５ｎｔ及び１２０ｎｔ）の除去は、ステップＡ～Ｃによって、部分的にのみ達成された。ステップＤは、１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチドを完全には除去しなかった。より長い加水分解生成物に相当する２５６ｎｔのｍＲＮＡは、ＴＦＦ精製後のサンブル中にほぼ完全に残留していた。したがって、１ｍＭクエン酸ナトリウム（ステップＤ）を用いてダイアリシスを実施することは、失敗作のｍＲＮＡ分子に相当する長さ１２０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド、特に、より長い加水分解生成物に相当する長さ２５６ｎｔのｍＲＮＡのさらなる除去に強い影響を与えなかった。

下記では、本明細書において使用された長さ２５６ｎｔのｍＲＮＡ配列が、さらに詳細に記載されている。
配列番号：１
コドン最適化されたＧＬＰ－１配列
_{ＧＧＧＡＧＡ}ＣＵＧＣＣＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＵＣＡＵＣＣＵＧＵＧＧＣＵＧＵＧＣＧＵＧＵＵＣＧＧＣＣＵＧＵＵＣＣＵＧＧＣＣＡＣＣＣＵＧＵＵＣＣＣＣＡＵＣＡＧＣＵＧＧＣＡＧＡＵＧＣＣＵＧＵＧＧＡＡＡＧＣＧＧＣＣＵＧＡＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＵＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＵＵＣＧＣＣＡＡＧＣＧＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＵＵＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＵＧＵＣＣＡＧＣＵＡＣＣＵＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＡＧＡＧＵＵＵＡＵＣＧＣＣＵＧＧＣＵＣＧＵＧＡＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＣＵＧＡ^{ＧＡＡＵＵ}
_{Ｔ７プロモーターの部分}、Ｃ：Ｅｔｈｒｉｓ ｍｉｎｉｍａｌ ５’ＵＴＲ、後続するさらなるＵヌクレオチド、ＴＩＳＵ ５’ＵＴＲ、開始コドン、コドン最適化されたＧＬＰ－１ ｍＲＮＡ配列、終始コドン、^{ＥｃｏＲＩ制限部位の部分}
ポリアデニル化されていないｍＲＮＡを、スパイク実験のために使用した。

Claims (14)

1. （Ｉａ） 第１の溶液を使用して、沈殿したｍＲＮＡ分子を含む懸濁液から沈殿したｍＲＮＡ分子を精製するステップと、
   （Ｉｂ） 第２の溶液を使用して、ステップ（Ｉａ）において得られた精製済みの沈殿したｍＲＮＡ分子を洗浄し、溶解させるステップと、
   （ＩＩａ） キレート化剤を含む第３の溶液を使用して、ステップ（Ｉｂ）において得られた溶解したｍＲＮＡ分子からｍＲＮＡ分子を精製するステップであって、
   前記キレート化剤は、ＥＤＴＡである、ステップと、続いて、
   （ＩＩｂ） 第４の溶液を使用して、ステップ（ＩＩａ）において得られた精製済みのｍＲＮＡ分子を洗浄するステップと
   を含む、ｍＲＮＡ分子を精製する方法であって、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）が、タンジェントフローろ過を用いて実施される、方法。
2. 第３の溶液が、１～１０のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
3. 第３の溶液が、ＭＯＰＳバッファーを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）が、０℃～２５℃の温度で実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ステップ（Ｉａ）の前に、前記懸濁液が、ｍＲＮＡ分子を沈殿させるために酢酸アンモニウムを使用して得られ、第１の溶液が、酢酸アンモニウムを含有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 第２の溶液が、水であり、及び／又は、第４の溶液が、水であり、若しくは塩化ナトリウム及び／若しくはクエン酸ナトリウムを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. ｍＲＮＡ分子が、タンジェントフローろ過後の保持液に含まれる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. ステップ（Ｉａ）において得られた保持液が、ステップ（Ｉｂ）において、タンジェントフローろ過のためのフィード溶液として使用され、ステップ（Ｉｂ）において得られた保持液が、ステップ（ＩＩａ）において、フィード溶液として使用され、ステップ（ＩＩａ）において得られた保持液が、ステップ（ＩＩｂ）において、フィード溶液として使用される、請求項７に記載の方法。
9. 懸濁液に含まれるｍＲＮＡ分子が、インビトロ転写によって得られる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. ｍＲＮＡ分子を脱リン酸化及び／又はポリアデニル化及び／又はポストキャッピングすることをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. ステップ（Ｉｂ）において得られたｍＲＮＡ分子を脱リン酸化することと、続いて、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を実施することと、続いて、得られたｍＲＮＡ分子をポリアデニル化することと、続いて、ステップ（Ｉａ）～（ＩＩｂ）を実施することとを含む、請求項１０に記載の方法。
12. ステップ（Ｉａ）の場合は、３００ｋＤａ～０．６５μｍの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンが、タンジェントフローろ過のために使用され、及び／又はステップ（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）の場合は、１ｋＤａ～０．６５μｍの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンが、使用され、及び／又はステップ（ＩＩａ）の場合は、少なくとも７０ｋＤａの分子量カットオフを有するフィルターメンブレンが、使用される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 第１、第２、第３及び／又は第４の溶液のいずれかのダイアフィルトレーション量が、ステップ（Ｉａ）の懸濁液の体積に対して少なくとも１倍である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. （ａ） 請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法によってｍＲＮＡ分子を精製することと、
    （ｂ） このようにして得られたｍＲＮＡ分子を医薬組成物中に配合することと
    を含む、医薬組成物を製造するための方法。

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