JP7603600B2 - 細胞増殖又は細胞分化に関与する受容体を標的にする内在化結合分子 - Google Patents

Description

本発明は、筋線維芽細胞及び／又は肝星細胞（ＨＳＣ）上に存在する受容体を標的としている、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含む結合分子の分野に関する。本発明はまた、それぞれがＨＳＣ上及び／又は筋線維芽細胞上の受容体をターゲティングする、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含む結合分子に関する。本発明はさらに、かかる結合分子をコードする核酸、かかる結合分子の発現のための宿主細胞及びかかる結合分子を調製する方法に関する。本発明はさらに、かかる結合分子を含む医薬組成物、ならびにとくに予防目的、治療目的もしくは診断目的でのかかる結合分子及び／又は組成物の使用に関する。

発明の背景
慢性肝疾患
臨床状況での慢性肝疾患（ＣＬＤ）は、線維化瘢痕、肝実質の結節性再生及び門脈血圧の上昇を特徴とする状態である肝線維症（ＬＦ）及び肝硬変（ＬＣ）を招く肝実質の進行性破壊及び再生のプロセスを含む肝臓の疾患プロセスである。ＣＬＤは、ウイルス感染（例えば、ＨＣＶ）、メタボリック症候群（例えば、ＮＡＳＨ）、又はアルコール中毒によって引き起こされ得る。ＬＦは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の蓄積、組織収縮、結果として血流の変更を特徴とする。これらの症状は、ディッセ腔（類洞と、肝細胞との間の小さな領域）に見られる周皮細胞であるＨＳＣの活性化によって引き起こされる。一般的に述べると、周皮細胞は、身体全体にわたって毛細血管及び細静脈を覆う内皮細胞の周りを包む収縮性細胞である。活性化すると、ＨＳＣは、筋線維芽細胞に分化転換して（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）、大量のＥＣＭタンパク質及び線維形成促進性（ｐｒｏｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ）サイトカインを分泌し始める。未処置のままの場合、ＥＣＭタンパクの蓄積により、ＬＦは、世界での１２番目の主要な死因としてランク付けられているＬＣに進行する。

ＣＬＤにおける治療法
肝疾患の主要な原因に狙いを定めた治癒法は、現在、最も有効な戦略をとなっているが、少数の病因に関して存在するに過ぎない。概して、肝移植が、末期の慢性肝疾患を患う患者に利用可能な唯一の処置である。高レベルの罹患率及び死亡率を考慮すると、現在の処置方法を補うか、又は潜在的に置き換える（さらなる）治療アプローチの開発が明らかに必要とされる。この数十年にわたってＣＬＤに対して行われた研究により、疾患の病態生理学の理解が改善されており、基礎疾患プロセスを標的とする新規作用物質の開発を可能にしてきた。これまで、ＣＬＤに関して認可された特定の薬物療法は存在せず、現在評価を受けているより新しい治療法は存在するが、これらの処置の研究は、比較的初期段階にある。

現在の治療法に対する代替手段は、肝臓における門脈圧亢進症及び／又は線維化瘢痕組織の低減ならびに最終的な消失である。理論上、マトリックス沈着及びコラーゲン合成の阻害ならびに新たに生成される線維化組織の崩壊を含め、抗線維化療法は、線維形成の様々な態様を標的とし得る。新たに合成されたコラーゲンは、古いコラーゲンよりも分解を受けやすいと考えられるが、動物における研究により、進行した硬変ですら可逆的であることが示されており、ヒトのデータも同じことを示唆している。肝線維症の発病機序の理解における最近の進展は、現在、肝線維症の新規治療アプローチにつながっている。「抗線維化活性」を有する薬物は、臨床試験で研究されているが、とくにそれらの全身毒性に起因して、無効であることが判明している。Ｒｈｏ－キナーゼ阻害剤及びＪＡＫ－２キナーゼ阻害剤等のこれらの（多くの場合、小さな）分子の治療的応用は、それらの扱いにくい薬力学的及び動力学的プロファイルによって阻まれている。したがって、ＣＬＤ向けの、とくに肝線維症向けの改善された治療法及び診断が必要とされている。

発明の概要
本発明は、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインと、少なくとも１つの診断用及び／又は治療用の分子とを含む結合分子の形態により、かかる代替的な改善された治療法又は診断を提供する。ここで、前記少なくとも１つの単一可変抗体ドメインは、肝星細胞（ＨＳＣ）上及び／又は筋線維芽細胞上で発現される膜貫通受容体に特異的に結合することができる。

かかる結合分子は、好ましくは、血小板由来増殖因子受容体－ベータ（ＰＤＧＦＲＢ）又はインスリン様増殖因子２受容体（ＩＧＦ２Ｒ）への結合を通じて、活性化された肝星細胞又は筋線維芽細胞のターゲティングを可能にする。血小板由来増殖因子受容体－ベータ（ＰＤＧＦＲＢ）又はインスリン様増殖因子２受容体（ＩＧＦ２Ｒ）はともに、かかる細胞上で高度に発現される。前記結合分子は、例えば、Ｐｔ（ＩＩ）遷移金属錯体を含むリンカーを介して、好ましくは毒素又は薬物に結合される。とくに、薬物が、ＲＨＯ－キナーゼ、ＪＡＫ－２阻害剤、又はネプリライシン阻害剤等のキナーゼ阻害剤である場合、本発明の結合分子は、好ましくは、活性化されたＨＳＣ又は筋線維芽細胞の弛緩（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）を与え、該弛緩により、例えば、肝線維症が減衰される。前記リンカーの使用により、これらのキナーゼ阻害剤を用いた場合に一般的に観察される（オフターゲットの）毒性が低減される。

肝疾患において、硬変の発病、維持及び増悪において重大な役割を果たす（活性化された）細胞、例えば、肝星細胞（ＨＳＣ）、への、薬物の選択的な送達は、追求に関心がもたれる到達点（venue）である。活性化されたＨＳＣでアップレギュレートされるＰＤＧＦＲＢ及びＩＧＦ２Ｒ等の受容体のターゲティングを使用して、肝疾患の有効な薬物処置を達成することができる可能性がある。本発明において、ＰＤＧＦＲＢ又はＩＧＦ２Ｒのターゲティングは、上記ターゲティングにより、例えば、ｒｈｏ－キナーゼ阻害剤、ＪＡＫ－２キナーゼ阻害剤、又はネプリライシン阻害剤を含む、タンパク質性分子の内在化（internalisation）が誘導されるため、重要な手段であるとみなされる。

本発明はさらに、本発明の結合分子の少なくとも一部をコードする核酸及び本発明の核酸を含む、本発明の結合分子の少なくとも一部の発現のための宿主細胞を提供する。また、本発明の結合分子を産生する方法も提供される。該方法は、本発明の宿主細胞を培養するステップと、前記結合分子の少なくとも一部の発現を可能にするステップと、前記結合分子を収集するステップと、上記治療用又は診断用の分子を、任意に上記で定義されるリンカーにより、前記結合分子の前記一部にカップリングするステップとを含む方法である。

治療用の分子を含む本発明の結合分子は、例えば、線維症又は癌の治療法にとくに適していることにより、本発明はさらに、本発明の少なくとも１つの結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、慢性肝疾患の処置において有用な少なくとも１つの他の化合物をさらに含み得る。本発明の医薬組成物は、門脈圧亢進症の存在下での静脈瘤出血の補助的処置として、又は肝疾患の処置における使用のためにとくに有用である。

診断用の分子を含む本発明の結合分子は、例えば肝硬変の診断に、とくに適していることにより、本発明は、診断用の分子、好ましくは造影剤、を含む、本発明の少なくとも１つの結合分子と、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む診断用組成物を提供する。

（Ａ）免疫化したラマの血液試料から、ＶＨＨライブラリーを創出することから、（Ｂ）ファージディスプレイ選択を実施すること及び（Ｃ）スクリーニング用のクローンを選択することに至る研究プロセスの概要（図の出典Ｓｃｈｏｏｎｏｏｇｈｅ Ｓ． ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，２１７：１２６６－１２７２）。 ＩＧＦ２Ｒ選択したＶＨＨの、ヒトＩＧＦ２Ｒエクトドメインへの結合。 ヒトＰＤＧＦＲＢエクトドメイン（ライブラリー１５２及び１５３）及びラットＰＤＧＦＲＢエクトドメイン（ライブラリー１５４及び１５５）に関するＰＤＧＦＲＢライブラリーの第１の選択回からのファージアウトプット。 ヒトＰＤＧＦＲＢ（ライブラリー１５２及び１５３）又はラットＰＤＧＦＲＢ（ライブラリー１５４及び１５５）のいずれかをトランスフェクトしたＳＣＣ ＶＩＩ細胞に関するＰＤＧＦＲＢライブラリーの第２の選択回からのファージアウトプット。 ヒトＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨのアミノ酸配列（ＣＤＲに下線）。親和性は、ヒトＰＤＧＦＲＢエクトドメイン（ＥＣＤ）、ヒトＰＤＧＦＲＢ受容体をトランスフェクトしたＳＣＣ ＶＩＩ細胞（ＳＣＣ－ｈＰＤＧＦＲＢ）及びヒト肝星細胞系（ＬＸ－２）に関して測定する。競合アッセイのデータは、種々のエピトープ基においてＶＨＨを分類するように包含される。 ラットＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨのアミノ酸配列（ＣＤＲに下線）。親和性は、ラットＰＤＧＦＲＢエクトドメイン（ＥＣＤ）及びラットＰＤＧＦＲＢ受容体をトランスフェクトした扁平上皮癌細胞（ＳＣＣ－ｒＰＤＧＦＲＢ）に関して測定する。競合アッセイのデータは、種々のエピトープ基においてＶＨＨを分類するように包含される。 ペプチドテイル及び精製タグを有するＶＨＨ挿入片を有する模式的に表示した発現ベクター。 ヒトＩＧＦ２Ｒに対して誘導される二価及びビパラトピックＶＨＨ構築物の構築ならびに特性決定。Ａ．一価、二価及びビパラトピックＶＨＨフォーマットの模式図。二価及びビパラトピックフォーマットでは、２つのＶＨＨは、可撓性（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）_３リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号３６９）と融合される。フォーマットは全て、チオール反応性プローブへの部位特異的なコンジュゲーションのためのＣ末端システイン及びアフィニティクロマトグラフィ精製用のヘキサヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号３７０）又はＥＰＥＡタグ（ＥＰＥＡ；配列番号３７１）を含有する。Ｂ．抗ヒトＩＧＦ２Ｒ ＶＨＨ構築物の、組換えヒトＩＧＦ２Ｒエクトドメインへの結合。Ｃ．選択したＶＨＨに関するＢ_ｍａｘ及びＫ_Ｄ＋９５％信頼区間。 ＧＦＰに融合したヒト又はラットＰＤＧＦＲＢ受容体（ＳＣＣ－ｈＰ又はＳＣＣ－ｒＰ）のいずれかをトランスフェクトしたＳＣＣ ＶＩＩ細胞上の選択したＶＨＨの結合。ＶＨＨは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷで標識した抗ＶＨＨウサギ血清及びロバ抗ウサギ二次抗体を使用して検出される。 ヒトＩＧＦ２Ｒに対して誘導されるＶＨＨを用いた競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。 ＰＤＧＦＲＢ ＥＣＤに関するＳＰ０２Ｐ及びＳＰ２６Ｐを用いた競合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイ。 ヒト又はラットＩＧＦ２Ｒ発現ＳＣＣ細胞への１３Ｆ１１－１３Ｅ８（Ｆ１１Ｅ８）結合。 １３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ（Ｆ１１Ｅ８－ＡＢＤ）の、ＩＧＦ２Ｒ及び血清アルブミンへの結合。Ａ）組換えヒトＩＧＦ２Ｒ ＥＣＤに関する結合アッセイ。Ｂ）種々の種由来の血清アルブミンに関する結合アッセイ。Ｃ）静脈内注射後のラットにおけるＦ１１Ｅ８－ＡＢＤ及びＦ１１Ｅ８の血清レベル。ＥＬＩＳＡによって評価した場合の血清濃度を示す。ＬＯＤ：およそ２０ｎＭ。 Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートされた１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ（ＦＥ－Ａ－Ａ４８８）の、活性化された初代ラット肝星細胞への結合。 ＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨを使用した結合アッセイ。Ａ）ヒトＰＤＧＦＲＢ ＥＣＤに関するヒトＰＤＧＦＲＢ特異的なＶＨＨを使用した結合アッセイ。Ｂ）ヒトＰＤＧＦＲＢ、ラットＰＤＧＦＲＢ及びヒトＩＧＦ２Ｒ発現標的細胞に関する、ビパラトピックＳＰ２８－ＳＰ２６Ｐ（ＳＰ２８－２６Ｐ）を使用した結合アッセイ。Ｃ）ヒトＰＤＧＦＲＢ、ラットＰＤＧＦＲＢ及びヒトＩＧＦ２Ｒ発現標的細胞に関する、ビパラトピックＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐを使用した結合アッセイ。 ＩＧＦ２Ｒ発現標的細胞における１３Ｆ１１及び１３Ｆ１１－１３Ｅ８の内在化、倍率６３倍。スケールバーは、３０μｍである。Ａ．Ａ５４９（ＩＧＦ２Ｒ陽性）。Ｂ．ヒトＩＧＦ２Ｒを一過的にトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２。Ｃ．偽トランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２。Ｄ．Ａ５４９細胞に関する酸性洗浄対照。 ヒト又はラットＩＧＦ２Ｒ発現ＳＣＣ細胞に関する１３Ｆ１１－１３Ｅ８（Ｆ１１Ｅ８）及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１（Ｅ８Ｆ１１）の内在化の速度。 ｐＨ感受性ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ色素にコンジュゲートされた一価（１３Ｆ１１）及びビパラトピック（１３Ｆ１１－１３Ｅ８及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１）ＶＨＨのＬＸ－２細胞における内在化。 ヒトＰＤＧＦＲＢ発現ＳＣＣ細胞及びＬＸ－２細胞に関するＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐの内在化の速度。 活性化された肝星細胞（ＨＳＣ）に関する収縮アッセイ。ＮＤＣとのインキュベーションの６日後のゲルの測定面積を表す。いかなる阻害剤も含まないＬＸ－２細胞の収縮を、弛緩０％と設定した一方で、１μＭ ＢＤＭを、１００％弛緩と設定した。注記：培地に関しては、収縮阻害は観察されなかった。 １３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ（Ｆ１１Ｅ８－ＡＢＤ）の、硬変（ＢＤＬ）ラット肝臓切片及び健常な（ＳＨＡＭ）ラット肝臓切片への免疫蛍光結合。 硬変（ＢＤＬ）ラット及び健常（ＳＨＡＭ）ラットに由来する各種組織におけるＩＧＦ２Ｒの発現。 Ａ）１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ－Ｙ２７６３２（検査コンジュゲート）及びＢ）１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ－エチル（偽コンジュゲート）に関する投薬後の時間（分）の関数としての、ＢＤＬラットにおける門脈圧（ＰＰ）及び平均動脈圧（ＭＡＰ）の変化。 ＢＬＤラット及びＳＨＡＭラットにおける１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ－Ｙ２７６３２（検査コンジュゲート）によるＩＧＦ２Ｒのｉｎ ｖｉｖｏターゲティング。Ａ）注入した検査コンジュゲートのｉｎ ｓｉｔｕ検出。ＶＨＨ特異的な検出抗体（緑色）により、検査コンジュゲートの存在に関してプローブされたＢＤＬラット（上部）及びＳＨＡＭラット（下部）の肝臓凍結切片。検査コンジュゲートは、ＢＤＬラットの硬変肝臓における、閉塞した類洞を覆う細胞層において明らかに検出されて、ＳＨＡＭラットの健常肝臓では検出されない。Ｂ）検査コンジュゲートの分布対ＩＧＦ２Ｒの（組織）分布。同じ凍結切片をまた、フルオロフォアコンジュゲートＦ１１Ｅ８（赤色）を使用してＩＧＦ２Ｒに関して染色した。検査コンジュゲートは、ＩＧＦ２Ｒとの同時局在化を示す（赤色を伴う緑色：黄色）。注目すべきことには、より深くに位置する領域は、検査コンジュゲートの非存在下でＩＧＦ２Ｒ発現（赤色）を示し、組織浸透が、生存中の研究の単一時間の最後に、依然として進行中であり、完了していないことを示唆している。より初期の観察と一致して、ＩＧＦ２Ｒは、ＳＨＡＭラットの肝臓では検出されなかった。

発明の詳細な説明
まず、具体的に詳述されていないステップ、方法、及び技法は全て、別記しない限り、当業者に明らかであるように、本質的に自体公知の様式で実施され得ることに留意されるべきである。免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体（ＩＳＶＤ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖のみの抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、又は単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）等の本発明の結合分子中に存在する結合部分の特異性及び他の所望の特性を改善するための親和性成熟及び他の技法等の、タンパク質工学に関する技法について記載する、本明細書中で言及される標準的なハンドブック及び共通の一般知識を参照する。本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の状況を示さない限り、複数形の内容を包含することに留意しなくてはならない。当業者は、日常的にすぎない実験を使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の態様に対する多くの等価体を認識するか、又は確かめることが可能である。かかる等価体は、本発明によって包含されると意図される。「及び／又は」の語は、本明細書中で使用される場合はいつでも、「及び」、「又は」及び「上記用語につながっている要素の全て又はあらゆる他の組合せ」を包含する。「約」又は「およそ」の語は、本明細書中で使用する場合、所与の値又は範囲の２５％以内、好ましくは２０％以内、より好ましくは１５％以内、最も好ましくは１０％以内を意味する。本明細書及び併記の特許請求の範囲全体にわたって、文脈が他の状況を求めない限りは、「含む」という単語ならびに「含む（三人称単数現在形）」及び「含んでいる」等の変化形は、表示した特色の包含の意味を含むが、あらゆる他の特色の排除の意味を含まないと理解される。本明細書中で使用される場合、「含んでいる」の語は、「含有している」又は「包含している」又は「有している」の語で置換することができる。対比して、特色（単数又は複数）と組み合わせた「からなっている」という単語は、言及される特色（単数又は複数）の包含を意味するが、あらゆる他の特色（単数又は複数）の排除も意味する。

第１の態様では、本発明は、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインと、少なくとも１つの診断用又は治療用の分子とを含む結合分子を提供し、ここで、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインは、好ましくは増加された増殖、収縮性、走化性、及び高められた細胞マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質産生（例えば、コラーゲン）を特徴とする活性化されたＨＳＣ上及び／又は筋線維芽細胞上で発現される膜貫通受容体に特異的に結合することが可能である。ＨＳＣが活性されているか、又は活性されていないかどうかを好ましくは決定する方法の完全な説明に関して、Ｔｓｃｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ（肝星細胞活性化のメカニズム（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１７）を参照されたい。

本発明の結合分子内に含まれる治療用の分子は好ましくは、ＨＳＣ弛緩を誘導し、ＨＳＣ弛緩は、ＨＳＣ活性化の減少の徴候であり、それにより、原発性肝疾患によって始まる線維形成プロセスを減少させる。かかる治療用の分子の一例は、本発明の実施例においてＨＳＣ弛緩を誘導することがわかっている小分子キナーゼ阻害剤であるＹ２７６３２である。とくに、本発明の結合分子はとくに、活性化されたＨＳＣ上の受容体と相互作用することが示された。研究により、本発明の結合分子を使用して、肝線維症患者を処置することができるという概念実証が示されている。また、研究により、本発明の結合分子は、血小板活性を妨げないことが証明されている。

本発明の結合分子は、肝星細胞、とくに、活性化された肝星細胞、及び／又は筋線維芽細胞上で発現される膜貫通受容体に特異的に結合可能でなくてはならない。活性化されたＨＳＣ及び／又は筋線維芽細胞上で十分量で発現される受容体の例は、例えば、ＰＤＧＦＲＢ及びＩＧＦ２Ｒである。したがって、好ましい態様では、膜貫通受容体がＰＤＧＦＲＢ又はＩＧＦ２Ｒである本発明の結合分子が提供される。

ＰＤＧＦは、細胞成長及び分裂を調節する多数の増殖因子の１つである。とくに、ＰＤＧＦは、血管形成、既存の血管組織からの血管の成長、線維芽細胞、骨芽細胞、腱細胞、血管平滑筋細胞及び間葉系幹細胞等の間葉系細胞の有糸分裂誘発、すなわち増殖、ならびに間葉系細胞の直接的な遊走である走化性において、重要な役割を果たす。ＰＤＧＦは、２つのＡサブユニット（ＰＤＧＦ－ＡＡ）、２つのＢサブユニット（ＰＤＧＦ－ＢＢ）、又はそれぞれの１つ（ＰＤＧＦ－ＡＢ）で構成され得る二量体糖タンパク質である。ＰＤＧＦは、線維芽細胞、平滑筋細胞及びグリア細胞を包含する間質系起源の細胞にとっての強力な有糸分裂促進因子（細胞に、細胞分裂を開始するように促して、有糸分裂を誘発するタンパク質）である。マウス及びヒトの両方において、ＰＤＧＦシグナル伝達ネットワークは、５つのリガンド、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦ－ＡＢ、ＰＤＧＦ－ＣＣ及びＰＤＧＦ－ＤＤ、ならびに２つの受容体、ＰＤＧＦＲ－アルファ（ＰＤＧＦＲＡ）及びＰＤＧＦＲ－ベータ（ＰＤＧＦＲＢ）からなる。ＰＤＧＦは全て、分泌されるジスルフィド連結ホモ二量体として機能するが、ＰＤＧＦＡ及びＰＤＧＦＢのみが、機能性ヘテロ二量体を生成し得る。ＰＤＧＦはＨＳＣの活性化時に過度に合成され、アルコール中毒又は肝炎の状態においてそうである可能性がある。したがって、線維芽細胞の活性化及び細胞分裂が起こり、とくに創傷治癒で蔓延している結合組織に至る。ＰＤＧＦは、このプロセスにおいて必要とされる要素である。本質的に、ＰＤＧＦは、分裂するように、細胞にＧ１チェックポイントをスキップさせることが可能である。単球－マクロファージ及び線維芽細胞において、外因的に投与されたＰＤＧＦは、走化性、増殖、及び遺伝子発現を刺激して、炎症性細胞及び線維芽細胞の流入を著しく増して、細胞外マトリックス及びコラーゲン生成を促進して、したがって、治癒プロセスが起きる時間を低減する。静止状態のＨＳＣが、ＰＤＧＦＲＡを発現するのに対して、ＨＳＣは、活性化すると、ＰＤＧＦＲＢ発現に切り替わる。ＨＳＣは、肝細胞傷害及び肝細胞死によって活性化されるようになり、線維形成をもたらす。マンノース６－リン酸／インスリン様増殖因子－２受容体（Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ２Ｒ）は、肝瘢痕を生じる活性化されたＨＳＣにおけるマトリックスタンパク質の強力な誘導因子である潜在型トランスフォーミングＰＤＧＦＢの活性化に関与することによって、初期線維形成において重要な役割を果たす。ＩＧＦ２Ｒは、細胞外リガンド（ＩＧＦ－ＩＩ）の浄化、細胞外リガンドの活性化（ＴＧＦβ）に、またトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）からリソソームまでの新たに合成されたＭ６Ｐでタグ付けされたリソソーム酵素の選別に関与される膜貫通糖タンパク質である。この機能のため、ＩＧＦ２Ｒは、ソーティングエンドソーム、エンドサイトーシスリサイクリング区画、ＴＧＮ、後期エンドソーム及び原形質膜間を循環する（Ｍａｘｆｉｅｌｄ ＆ ＭｃＧｒａｗ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｆｅｂ；５（２）：１２１－３２）。

本発明の結合分子は、例えば、肝線維症、肺線維症、又は腎線維症等の、上述される膜貫通受容体の１つを発現する筋線維芽細胞が、役割を果たす様々な繊維化疾患に使用することができる。実施例において、本発明は、（活性化された）ＨＳＣにおける原理証明を提供する。しかしながら、肝線維形成では、活性化された肝星細胞（ＨＳＣ）は、ＰＤＧＦＲＢ及びＩＧＦ２Ｒを大量に発現する筋線維芽細胞へ分化転換すると考えられる（Ｙｕｃｈａｎｇ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．肝臓における中皮－間葉系の移行（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ）．ＰＮＡＳ（２０１３），１１０：２３２４－２３２９）。肝線維症の実験モデル及び肝疾患を患う患者の両方における線維化肝臓における肝筋線維芽細胞の別の主要な供給源は、門脈線維芽細胞である（Ｊｕｎ Ｘｕ，ｅｔ ａｌ．種々の病因論の肝線維症に寄与する肝筋線維芽細胞のタイプ（Ｔｈｅ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｔｏ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｔｉｏｌｏｇｉｅｓ）．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （２０１４），５：１６７）。したがって、好ましい態様では、筋線維芽細胞が、肝筋線維芽細胞である本発明の結合分子が提供される。好ましくは、線維芽細胞は、ＨＳＣ又は門脈線維芽細胞に、より好ましくはＨＳＣに由来する。「に由来する」は、本文脈では、オリジネーター細胞（ＨＳＣ又は門脈線維芽細胞）の、筋線維芽細胞への分化を指す。「筋線維芽細胞」の語は、好ましくは、ＨＳＣ又は門脈線維芽細胞から、筋線維芽細胞への移行中であり、オリジネーター細胞と、筋線維芽細胞との間の中間表現型を有し得る筋線維芽細胞様細胞を包含する。静止状態のＨＳＣは概して、グリア線維性関連タンパク質（ＧＦＡＰ）、シナプトフィジン（ｓｙｎａｐｔｏｐｈｉｓｉｎ）、シネミン、及び神経増殖因子受容体ｐ７５等の神経マーカーであるデスミンを発現する（Ｇｅｅｒｔｓ Ａ．（２００１）．静止状態の肝星細胞の歴史、不均一性、発生生物学、及び機能（Ｈｉｓｔｏｒｙ，ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ，ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ）．Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２１ ３１１－３３５ １０．１０５５／ｓ－２００１－１７５５０；Ｂａｔａｌｌｅｒ Ｒ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｄ． Ａ．（２００５）．肝臓線維症（Ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５，２０９－２１８）。さらに、Ｎｒ１ｄ２、Ａｄｉｐｏｒ１、Ａｄｐｆ、Ｄｂｐ、Ｐｒｅｉ４、及びＦｏｘｊ１は、ＨＳＣ静止状態表現型と関連付けられる特有のマーカーとして同定された（Ｌｉｕ Ｘ．，Ｘｕ Ｊ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｄ．Ａ．，Ｋｉｓｓｅｌｅｖａ Ｔ．（２０１３）．肝線維症の可逆性及び線維形成筋線維芽細胞の不活性化（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）．Ｃｕｒｒ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１，２０９－２１４）。線維形成肝障害及びＴＧＦβ１の放出に応答して、静止状態のＨＳＣは、迅速に活性化を受ける。静止状態のＨＳＣは、ビタミンＡ含有脂質液滴及び神経マーカーをダウンレギュレートして、Ｉ型コラーゲン及びα－ＳＭＡ発現する活性化されたＨＳＣ／筋線維芽細胞へと分化する（Ｂａｔａｌｌｅｒ ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，２００５；Ｆｏｒｂｅｓ Ｓ．Ｊ．，Ｐａｒｏｌａ Ｍ．（２０１１）．肝線維形成細胞（Ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ）．Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２５，２０７－２１７）。静止状態のＨＳＣはまた、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ、とくにＭＭＰ１３及びそれらの阻害剤ＴＩＭＰの産生をアップレギュレートする（Ｕｃｈｉｎａｍｉ Ｈ．，Ｓｅｋｉ Ｅ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｄ． Ａ．，Ｄ’Ａｒｍｉｅｎｔｏ Ｊ．（２００６）．ＭＭＰ １３の損失は、胆汁鬱滞中にマウス肝傷害及び線維症を減衰させる（Ｌｏｓｓ ｏｆ ＭＭＰ １３ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｍｕｒｉｎｅ ｈｅｐａｔｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４４，４２０－４２９）。さらに、活性化されたＨＳＣは、活性化されたＨＳＣ／筋線維芽細胞表現型と一意的に関連付けられる遺伝子であるＣｒｌｆ１、Ｓｐｐ１、Ｌｏｘ、ＬｏｘＬ２、ＩＬ－１７Ｒａ、Ｆｏｓｌ１、及びＦｏｌｒ１をアップレギュレートする（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，肝線維症の可逆性及び線維形成筋線維芽細胞の不活性化（Ｒｅｖｅｒｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｇｅｎｉｃ Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）．Ｃｕｒｒ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．２０１３，１：２０９－２１４）。

とくに、結合分子が、細胞内部で作用する治療用の分子を含む場合、結合分子は、例えば、リガンド又は抗体内在化を通じて、細胞によって吸収されることが好ましい。リガンド内在化は、細胞外分子が細胞の表面上のその特異的な受容体タンパク質に結合する場合にのみ、細胞が細胞外分子（例えば、（天然）リガンド又は抗体）を取り込む、受容体媒介性エンドサイトーシスプロセスとして定義される。エンドサイトーシスは、細胞が、タンパク質又は多糖等の非粒子状材料を、それらを貪食することによって内在化するプロセスである。したがって、好ましい態様では、結合分子の、受容体への結合により、リガンド又は抗体内在化の誘導が可能となる本発明の結合分子が提供される。

好ましい態様では、結合分子が、ＨＳＣ及び／又は筋線維芽細胞上で発現される膜貫通受容体に特異的に結合することが可能であるさらなる単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子が提供される。かかる結合分子は、２つの異なる抗原、例えば、同じ抗原上のエピトープ、すなわち、１つの受容体上の２つの異なるエピトープに結合することが可能である２つの単一可変抗体ドメインを含み得る。後者はまた、ビパラトピック結合分子とも呼ばれる。本発明の結合分子はまた、ともに同じエピトープに特異的である、２つの単一可変抗体ドメインを含む。二価結合分子としても知られるかかる結合分子は、単一受容体上の２つのエピトープに結合することはできず（一般に、１つの受容体の配列中に存在するエピトープ配列の２つは存在しない（それが、二量体でない限り）ため）、同じタイプの２つの受容体、例えば、互いの近傍に存在する２つのＰＤＧＦ受容体上の同じエピトープ配列に結合することが可能である。その効果は、二価結合分子が２つの受容体を架橋して、それにより、受容体及びそれらが結合した結合分子の内在化を誘導することである。ビパラトピック結合分子の場合、結合は、受容体オリゴマー形成をもたらし、オリゴマー形成は、受容体内在化をさらに高める。したがって、好ましい態様では、結合分子が、マルチパラトピック、好ましくはビパラトピック結合分子である、本発明の結合分子が提供される。あるいは、又はマルチパラトピック特異性と併せて、結合分子は、多価、好ましくは二価結合分子であることが好ましい。あるいは、又はマルチパラトピック特異性、二価特異性、又はその両方と併せて、結合分子は、多特異的、好ましくは二特異的結合分子であることが好ましい。したがって、本発明の結合分子は、多重単一可変抗体ドメインを組み合わせることができ、ここで、例えば、２つが、互いに対して二価であり、さらに、第３の、第４の、第５の、又はさらには第６の単一可変抗体ドメインに関して、ビパラトピック及び／又は二特異的である。本発明の結合分子は、６つよりも多い単一可変抗体ドメインを含み得るが、本発明の結合分子は、すでに定義され、また以下で定義されるように、２つ～６つ、好ましくは２つ～４つ、より好ましくは２つの単一可変抗体ドメインを含むことが好ましい。この方が産生しやすいためであり、また動物モデルにおいて優れた結果が示されている。

本発明の結合分子中に存在する単一可変抗体ドメインは、あらゆる種類の単一可変抗体ドメインであり得る。古典的な単一可変抗体ドメインは、（単一）ドメイン抗体又は免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体等の、抗体（の一部）の可変ドメインである。好ましくは、少なくとも１つの単一可変抗体ドメイン及び／又はさらなる単一可変抗体ドメインは、互いに独立して、免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体（ＩＳＶＤ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖のみの抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される。より好ましくは、少なくとも１つの単一可変抗体ドメイン及びさらなる単一可変抗体ドメインはともに、単一可変ドメイン抗体、好ましくは重鎖のみの抗体の可変ドメインである。これらのより小さな抗体（の一部）は、とくに、タンデムフォーマット（例えば、二価又はビパラトピック）で、抗体が、それらのより小さなサイズのため高い内在化能力及び最適な組織浸透を示すため、好ましい。

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶＤ」）の語は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、抗原結合部位は、単一免疫グロブリンドメイン上に存在して、また単一免疫グロブリンドメインによって生成される分子を定義する。これは、「従来の」免疫グロブリン又はそれらの断片とは切り離して、免疫グロブリン単一可変ドメインを設定し、ここで、２つの免疫グロブリンドメイン、とくに２つの可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を生成する。通常、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して、抗原結合部位を生成する。この場合、ＶＨ及びＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、抗原結合部位に寄与し、すなわち、総計６つのＣＤＲが、抗原結合部位生成に関与する。対比して、免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一ＶＨ又はＶＬドメインによって生成される。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって生成される。したがって、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」の語は、抗原結合部位の生成用の少なくとも２つの可変ドメインの相互作用を必要とする従来の免疫グロブリン又はそれらの断片を含まない。このことはまた、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む」か、又は「含有する」本発明の態様に関する事例である。したがって、免疫グロブリン単一可変ドメインを「含む」か、又は「含有する」結合分子又は組成物は、例えば１つよりも多い免疫グロブリン単一可変ドメインを含む構築物に関し得る。あるいは、免疫グロブリン単一可変ドメイン以外のさらなる成分、例えば、様々な種類の助剤、タンパク質タグ、着色剤、色素等が存在し得る。しかしながら、これらの用語は、抗原結合部位が単一可変ドメインによって生成される従来の免疫グロブリンの断片を含まない。概して、単一可変ドメインは、本質的に４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１～ＦＲ４）及び３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３）からなるアミノ酸配列である。かかる単一可変ドメイン及び断片は、最も好ましくは、免疫グロブリンフォールドを含むか、又は適切な条件下で、免疫グロブリンフォールドを生成することが可能である。したがって、単一可変ドメインは、例えば、それが単一抗原結合単位（すなわち、単一抗原結合ドメインが、例えばＶＨ／ＶＬ相互作用を通じて、例えば、別の可変ドメインと相互作用して、機能性抗原結合ドメインを生成する必要がある、例えば従来の抗体及びｓｃＦｖ断片中に存在する可変ドメインに関する事例である場合、別の可変ドメインと相互作用して、機能性抗原結合単位を生成する必要がないような、本質的に単一可変ドメインからなる機能性抗原結合単位）を生成することが可能である限りは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ－配列）もしくはその適切な断片；又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ－配列又はＶＨＨ配列）もしくはその適切な断片を含み得る。本発明の一態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ－配列）又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ－配列）であり、より具体的には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列又は重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨＨ）であり得る。重鎖抗体及びそれらの可変ドメインの一般的説明に関して、とくに本明細書中で引用される従来技術、ならびに国際公開第０８／０２００７９号の５９頁で言及される従来技術及び国際出願公開第０６／０４０１５３号の４１頁～４３頁で言及される参考文献のリストを参照されたい。これらの従来技術及び参考文献は、参照により本明細書で援用される。これらの参考文献に記載されるように、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化したＶＨＨ配列は、とくに、フレームワーク配列の１つ又は２つ以上における１つ又は２つ以上の「特徴残基」の存在を特徴とし得る。

ＶＨＨのヒト化、ならびに他の修飾、一部もしくは断片、誘導体又は「ＶＨＨ融合体」、多価構築物（リンカー配列の幾つかの非限定的な例を包含する）、ならびにＶＨＨ及びそれらの調製物の血清半減期を増加させる種々の修飾を包含する、ＶＨＨのさらなる説明は、例えば、国際公開第０８／１０１９８５号及び国際公開第０８／１４２１６４号に見出すことができる。一例は、例えば、ヒト血清アルブミンに対して親和性を有する結合ドメインの存在である。

したがって、本発明の結合分子の半減期を増加させるためには、上記結合分子は、好ましくは、１つ又は２つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を伴わない結合分子と比較して上記半減期を増加させるかかる１つ又は２つ以上の他の基、残基、部分又は結合単位を含む。これらの基、残基、部分又は結合単位はまた、半減期延長剤とも称される。

本発明の結合分子において使用されるべき半減期延長剤は、ヒトにおける結合分子の血清半減期を、少なくとも１時間、好ましくは少なくとも２時間又は２時間超、増加させる。半減期延長剤は、６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらには２４時間、４８時間もしくは７２時間を超えて半減期を増加し得る。本発明の結合分子において使用されるべきとくに好ましい結合単位は、アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ＶＨＨもしくは抗体Ｆｃテイル又はそれらの断片である。

「ｄＡｂ」又は「ｓｄＡｂ」に関して、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８９（Ｎａｔｕｒｅ ３４１（６２４２）：５４４－６）、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．２００３（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（１１）：４８４－４９０）ならびに国際公開第０４／０６８８２０号、同第０６／０３０２２０号、同第０６／００３３８８号を参照されたい。

また、哺乳動物起源ではないことから本発明における好適さを他に譲る単一可変ドメインとして、ある特定の種のサメ（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、国際公開第０５／１８６２９号を参照）ならびにマウス（例えば、いわゆるＣｒｅｓｃｅｎｄｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社のｈｕｍａｂｏｄｉｅｓ）に由来するものを、本発明において挙げることができる。免疫グロブリン配列、とくに免疫グロブリン単一可変ドメインのアミノ酸配列及び構造は、本技術において、また本明細書中で、それぞれ、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」と、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」と、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」と、また「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と称される４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」とを含むとみなされ得るが、それらに限定されない。これらのフレームワーク領域に、本技術において、それぞれ、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」と、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」と、「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と称される３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」が割り込んでいる。免疫グロブリン単一可変ドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、１１０～１２０の領域に存在してもよく、好ましくは１１２～１１５であり、最も好ましくは１１３である。しかしながら、免疫グロブリン単一可変ドメインの一部、断片、類似体又は誘導体は、かかる一部、断片、類似体又は誘導体が、本明細書中で概要するさらなる要件を満たして、また好ましくは本明細書中に記載する目的に適している限りは、それらの長さ及び／又はサイズに関してとくに限定されないことに留意すべきである。したがって、本発明の意味において、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変抗体ドメイン」の語は、非ヒト供給源に、好ましくはラクダ科に由来される、好ましくはラクダ重鎖抗体としてのペプチドを含む。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変抗体ドメイン」は、国際公開第０８／１０１９８５号及び同第０８／１４２１６４号に、すでに記載されるように、ヒト化されてよい。さらに、この用語は、国際公開第０８／１０１９８５号及び同第０８／１４２１６４号に、すでに記載されるように、「ラクダ化されて（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）」いる非ラクダ科供給源、例えば、マウス又はヒトに由来する結合分子を含む。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」の語は、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヒト、及びラクダ科免疫グロブリン配列を含む、種々の起源の免疫グロブリン配列を包含する。この用語はまた、完全ヒト免疫グロブリン配列、ヒト化免疫グロブリン配列又はキメラ免疫グロブリン配列を包含する。例えば、この用語は、ラクダ科免疫グロブリン配列及びヒト化ラクダ科免疫グロブリン配列又はラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（国際公開第９４／０４６７８号ならびにＤａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ １９９４，Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．３３９：２８５及び１９９６，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：５３１を参照）に記載されるようなラクダ化ｄＡｂを含む。すでに上述するように、少なくとも１つの結合分子は、ＨＳＣ及び／又は筋線維芽細胞上で発現される受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することが可能である。好ましくは、第２の単一可変抗体ドメインもまた、存在する場合、ＨＳＣ及び／又は筋線維芽細胞上で発現される膜貫通受容体に特異的に結合することが可能である。ＰＤＧＦＲＢに特異的に結合することが可能な少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含むか、又はＩＧＦ２Ｒに特異的に結合することが可能な少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子がとくに好ましい。

ＰＤＧＦＲＢに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの単一可変抗体ドメイン及びＩＧＦ２Ｒに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子は、あまり好ましくない。

１つの好ましい態様では、単一可変抗体ドメインの１つの、その抗原への結合が、他の単一可変抗体ドメインの、その抗原への結合を調節し、好ましくは、クラスター誘導型エンドサイトーシス及び迅速な受容体内在化をもたらす、本発明の結合分子が提供される。

本発明は、実施例において、ＰＤＧＦＲＢへの優れた結合及びＰＤＧＦＲＢの内在化を示す幾つかのＶＨＨを提供する。好ましい態様では、ＰＤＧＦＲＢへの特異的な結合において、それぞれ、配列番号９、配列番号２５、配列番号８１、及び配列番号６５として表１に示される、ＳＰ０２Ｐ又はＳＰ０５Ｐ又はＳＰ１４Ｐ又はＳＰ１２Ｐの配列のいずれか１つから選択される配列を有する単一ドメイン抗体と競合することが可能である少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子が提供される。より好ましい態様では、結合分子は、ＳＰ０２Ｐ又はＳＰ０５Ｐ又はＳＰ１４Ｐ又はＳＰ１２Ｐの配列の１つを有する単一ドメイン抗体と競合することが可能である少なくとも第２の単一可変抗体ドメインを含み、ここで、好ましくは、第１の単一可変抗体ドメイン及び第２の単一可変抗体ドメインはともに、ＳＰ０２Ｐ又はＳＰ０５Ｐ又はＳＰ１４Ｐ又はＳＰ１２Ｐの配列の１つを有する同じ単一ドメイン抗体と競合しない。あるいは、また好ましくは、結合分子は、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含み、ここで、好ましくは、第１の単一可変抗体ドメイン及び第２の単一可変抗体ドメインはともに、ＳＰ０２Ｐ又はＳＰ０５Ｐ又はＳＰ１４Ｐ又はＳＰ１２Ｐの配列の１つを有する同じ単一ドメイン抗体と競合する。

「競合する」の語は、例えば、本発明の例５及び例８に記載されるような競合アッセイにおいて、結合分子の添加により、所与のＶＨＨ、すなわち、競合が決定されるＶＨＨの結合の著しい減少が誘導されることを意味する。これらに関する「著しい」は、好ましくは、２５０ｎＭの結合分子が、ＥＬＩＳＡにおいて、１０ｎＭの蛍光標識したＶＨＨに添加される場合に、５％を上回る、好ましくは１０％を上回る減少である。例８は、例えば、１０ｎＭの標識１３Ｆ１１及び２５０ｎＭの非標識１３Ｅ８を、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＩＧＦ２Ｒエクトドメインに結合させた場合、５％未満のより小さな蛍光強度を示す一方で、１０ｎＭの標識１３Ｆ１１及び２５０ｎＭの非標識１３Ａ８、１３Ｃ１１、１３Ｇ１０、又は１３Ａ１２が、同じか、又は重複するエピトープに関して競合する場合に、蛍光強度の実質的により大きな減少が観察される。これらのデータから、１３Ｆ１１及び１３Ｅ８は、互いに競合しないのに対して、１３Ａ８、１３Ｃ１１、１３Ｇ１０及び１３Ａ１２は、ＩＧＦ２Ｒへの結合に関して、１３Ｆ１１と競合すると結論付けられる。結合分子が所与のＶＨＨと競合するかどうかを決定する場合、同じ検査条件及び閾値が、ＰＤＧＦＲＢに対して誘導される結合分子に当てはまる。

本発明はさらに、実施例において、ＩＧＦ２Ｒへの優れた結合及びＩＧＦ２Ｒの内在化を示す幾つかのＶＨＨを提供する。好ましい態様では、ＩＧＦ２Ｒへの特異的な結合において、それぞれ、配列番号２４９及び配列番号２７３として表２に示される、１３Ｅ８又は１３Ｆ１１の配列を有する単一ドメイン抗体と競合することが可能である少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子が提供される。より好ましい態様では、結合分子は、１３Ｅ８又は１３Ｆ１１の配列を有する単一ドメイン抗体と競合することが可能である少なくとも第２の単一可変抗体ドメインを含み、ここで、好ましくは、第１の抗体及び第２の抗体はともに、１３Ｅ８又は１３Ｆ１１の配列を有する同じ単一ドメイン抗体と競合しない。あるいは、また好ましくは、結合分子は、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含み、ここで、好ましくは、第１の単一可変抗体ドメイン及び第２の単一可変抗体ドメインはともに、１３Ｅ８又は１３Ｆ１１の配列の１つを有する同じ単一ドメイン抗体と競合する。

好ましい態様では、結合分子が、ＰＤＧＦＲＢに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子が提供され、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号８３によるＣＤＲ１配列、配列番号８５によるＣＤＲ２配列及び配列番号８７によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号３によるＣＤＲ１配列、配列番号５によるＣＤＲ２配列及び配列番号７によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号１１によるＣＤＲ１配列、配列番号１３によるＣＤＲ２配列及び配列番号１５によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号３５によるＣＤＲ１配列、配列番号３７によるＣＤＲ２配列及び配列番号３９によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号７５によるＣＤＲ１配列、配列番号７７によるＣＤＲ２配列及び配列番号７９によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号２７によるＣＤＲ１配列、配列番号２９によるＣＤＲ２配列及び配列番号３１によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号４３によるＣＤＲ１配列、配列番号４５によるＣＤＲ２配列及び配列番号４７によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号５１によるＣＤＲ１配列、配列番号５３によるＣＤＲ２配列及び配列番号５５によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号１１５によるＣＤＲ１配列、配列番号１１７によるＣＤＲ２配列及び配列番号１１９によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号６７によるＣＤＲ１配列、配列番号６９によるＣＤＲ２配列及び配列番号７１によるＣＤＲ３配列、又はＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組合せのいずれかを含み、ここで、独立して、多くても４つ、より好ましくは多くても３つ、より好ましくは多くても２つ、最も好ましくは多くても１つのアミノ酸が、保存的に置換されており、好ましくは独立して、下記のアミノ酸置換から選択される：ＡｌａをＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎ又はＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａ又はＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕ又はＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅ又はＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｒｙをＴｒｐ又はＰｈｅへ；及びＶａｌをＩｌｅ又はＬｅｕへ。

好ましくは、本発明の結合分子は、ＩＧＦ２Ｒに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含み、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号２５１によるＣＤＲ１配列、配列番号２５３によるＣＤＲ２配列及び配列番号２５５によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号２７５によるＣＤＲ１配列、配列番号２７７によるＣＤＲ２配列及び配列番号２７９によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号２５９によるＣＤＲ１配列、配列番号２６１によるＣＤＲ２配列及び配列番号２６３によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号２９１によるＣＤＲ１配列、配列番号２９３によるＣＤＲ２配列及び配列番号２９５によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号２９９によるＣＤＲ１配列、配列番号３０１によるＣＤＲ２配列及び配列番号３０２によるＣＤＲ３配列；もしくは配列番号３０７によるＣＤＲ１配列、配列番号３０９によるＣＤＲ２配列及び配列番号３１１によるＣＤＲ３配列、又はＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列及びＣＤＲ３配列の組合せのいずれかを含み、ここで、独立して、多くても４つ、より好ましくは多くても３つ、より好ましくは多くても２つ、最も好ましくは多くても１つのアミノ酸が、保存的に置換されており、好ましくは独立して、下記のアミノ酸置換から選択される：ＡｌａをＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎ又はＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａ又はＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕ又はＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅ又はＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｒｙをＴｒｐ又はＰｈｅへ；及びＶａｌをＩｌｅ又はＬｅｕへ。

好ましくは、本発明の結合分子は、ＰＤＧＦＲＢに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含み、ここで、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号８１、配列番号１、配列番号９、配列番号３３、配列番号７３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つを含むか、又は配列番号８１、配列番号１、配列番号９、配列番号３３、配列番号７３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つからなる。

好ましくは、本発明の結合分子は、ＩＧＦ２Ｒに特異的に結合することが可能な少なくとも１つの単一可変抗体ドメインを含み、ここで、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号２４９、配列番号２７３、配列番号２５７、配列番号２８９、配列番号２９７、もしくは配列番号３０５のいずれか１つを含むか、又は配列番号２４９、配列番号２７３、配列番号２５７、配列番号２８９、配列番号２９７、もしくは配列番号３０５のいずれか１つからなる。

１つの好ましい態様では、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子が提供され、ここで、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号８１を含むか、又は配列番号８１からなり、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号１、配列番号９、配列番号３３、配列番号７３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つを含むか、又は配列番号１、配列番号９、配列番号３３、配列番号７３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つからなるか、あるいは少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号１、配列番号９、配列番号３３、もしくは配列番号７３のいずれか１つを含むか、又は配列番号１、配列番号９、配列番号３３、もしくは配列番号７３のいずれか１つからなり、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つを含むか、又は配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つからなるか、あるいは少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９のいずれか１つを含むか、又は配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９のいずれか１つからなり、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号６５もしくは配列番号１１３のいずれか１つを含むか、又は配列番号６５もしくは配列番号１１３のいずれか１つからなる。かかる分子は、ビパラトピック抗ＰＤＧＦＲＢ結合分子を包含する。

好ましくは、本発明の結合分子は、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含み、ここで、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号２４９を含むか、又は配列番号２４９からなり、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号２７３、配列番号２５７、配列番号２８９、配列番号２９７、もしくは配列番号３０５のいずれか１つを含むか、又は配列番号２７３、配列番号２５７、配列番号２８９、配列番号２９７、もしくは配列番号３０５のいずれか１つからなる。かかる分子は、ビパラトピック抗ＩＧＦ２Ｒ結合分子を包含する。

好ましくは、本発明の結合分子は、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含み、ここで、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号８１、配列番号１、配列番号９、配列番号３３、配列番号７３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つを含むか、又は配列番号８１、配列番号１、配列番号９、配列番号３３、配列番号７３、配列番号２５、配列番号４１、配列番号４９、配列番号６５、もしくは配列番号１１３のいずれか１つからなり、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、配列番号２４９、配列番号２７３、配列番号２５７、配列番号２８９、配列番号２９７、もしくは配列番号３０５のいずれか１つを含むか、又は配列番号２４９、配列番号２７３、配列番号２５７、配列番号２８９、配列番号２９７、もしくは配列番号３０５のいずれか１つからなる。かかる結合分子は、ＰＤＧＦＲＢ上の１つのエピトープ及びＩＧＦ２Ｒ上の１つのエピトープに結合することが可能な二特異的結合分子を包含する。

２つ又は３つ以上のアミノ酸配列を比較する目的で、［第２のアミノ酸配列における相当する位置にあるアミノ酸残基に同一の第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を、［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の総数］で除算することと、［１００％］を乗じることとによって、第１のアミノ酸配列と、第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」又は「配列類似性」（本明細書中では、「アミノ酸同一性」とも称される）のパーセントが算出されてもよく、ここで、第１のアミノ酸配列と比較して、第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換又は付加は、単一アミノ酸残基（位置）での差として、すなわち、本明細書中で定義される「アミノ酸の差」としてみなされる。あるいは、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の度合いは、ヌクレオチド配列に関する配列同一性の度合いの決定に関して上述するような公知のコンピュータアルゴリズムを使用して、同様に標準的な設定を使用して、算出され得る。通常、上記で概要する算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定する目的で、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列は、「第１の」アミノ酸配列と解釈され、他のアミノ酸配列は、「第２の」アミノ酸配列と解釈される。また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の度合いを決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れてもよく、このことは概して、アミノ酸残基が、類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置き換えられ、また結合分子の機能、活性又は他の生物学的特性に対してほとんど又は本質的に影響しないアミノ酸置換として記載され得る。かかる保存的アミノ酸置換は、例えば、国際公開第０４／０３７９９９号、英国特許第Ａ－３ ３５７ ７６８号、国際公開第９８／４９１８５号、同第００／４６３８３号及び同第０１／０９３００号から、当業者に周知であり、かかる置換の（好ましい）タイプ及び／及び組合せは、国際公開第０４／０３７９９９号ならびに国際公開第９８／４９１８５号から、またそこで引用されるさらなる参考文献からの適切な教示に基づいて選択され得る。かかる保存的置換は好ましくは、下記群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基で置換される置換である：（ａ）小さな脂肪族の無極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ及びＧｌｙ；（ｂ）極性の負に帯電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ；（ｃ）極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族の無極性残基：Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｃ及びＣｙｓ；及び（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。とくに好ましい保存的置換は下記の通りである：ＡｌａをＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎ又はＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａ又はＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕ又はＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅ又はＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｒｙをＴｒｐ又はＰｈｅへ；及びＶａｌをＩｌｅ又はＬｅｕへ。

本明細書中に記載される結合分子に適用されるあらゆるアミノ酸置換はまた、Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，タンパク質構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９７８によって開発された、種々の種の相同タンパク質間のアミノ酸変動の頻度の分析、Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｆａｓｍａｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２１１，１９７４及びＡｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４７：４５－１４９，１９７８によって開発された構造生成能の分析、ならびにＥｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４０－１４４，１９８４；Ｋｙｔｅ ＆ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ；Ｊ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２，１９８１、及びＧｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：３２１－３５３，１９８６によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの分析に基づき得る。全て、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

本発明はまた、これらのアミノ酸配列の最適化された変異体を包含する。概して、本発明のアミノ酸配列の「最適化された変異体」は、ｉ）「ヒト化」の度合い、ｉｉ）化学的安定性、及び／又はｉｉｉ）発現のレベルを高める置換等の１つ又は２つ以上の有益な置換を含む変異体である。

１つの好ましい態様では、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインを含む、本発明の結合分子が提供され、ここで、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインは、リンカーアミノ酸配列によって分離されている。多くの場合、４個～１５個のアミノ酸の簡素なＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーで十分であり得るが、アミノ酸鎖のより大きな可撓性が望ましい場合には、より長いか、又はより複雑なリンカーが使用されてよい。好ましいリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（ＧＳＴＳＧＳ）ｎ又はタンパク質フォールディングのために可撓性を提供するあらゆる他のリンカーである。結合ドメインは、リンカーによってのみ分離されてよいが、他の有用なアミノ酸配列が、結合ドメイン間に、あるいはそれぞれ、第１の結合ドメイン配列もしくは最終結合ドメイン配列のＮ末端又はＣ末端に導入されてよい。したがって、一態様では、リンカーをコードするアミノ酸配列をさらに含む、本発明の結合分子が提供される。かかるリンカー配列は、好ましくは、分子内に可撓性を提供して、２つのエピトープ間を連結（架橋）するように結合分子によって架橋され得る距離を高める。さらに、かかるリンカーは、単一可変抗体ドメインの１つが、その第１の標的に結合されており、第２の単一可変抗体ドメインが、第２の標的を見つけて、結合しなくてはならない場合に、生じ得る立体障害を減させ得る。

本発明の結合分子は、分子内の単一可変抗体ドメインが、十分な親和性でその標的に結合すると内在化されることが観察された。したがって、好ましい態様では、少なくとも１つの単一可変抗体ドメイン、及び存在する場合、さらなる単一可変抗体ドメインが、互いに独立して、それら各々の受容体に、解離定数（Ｋ_Ｄ）１０Ｅ－５～１０Ｅ－１２モル／リットル又はそれ未満、好ましくは１０Ｅ－７～１０Ｅ－１２モル／リットル又はそれ未満、より好ましくは１０Ｅ－９～１０Ｅ－１２モル／リットルで、特異的に結合することが可能である、本発明の結合分子が提供される。

本発明の文脈では、ある特定の抗原「・・・に結合する、及び／又は・・・に対して親和性を有する」は、例えば、抗体及びそれらの各々の抗原の状況において理解されるように、本技術で有用な意味を有する。本発明の特定の態様では、「・・・に結合する、及び／又は・・・に対して親和性を有する」の語は、少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、抗原と特異的に相互作用することを意味する。「特異性」の語は、特定の免疫グロブリン配列、抗原結合性部分又は抗原結合性分子（例えば、本発明の結合分子）が結合し得る種々のタイプの抗原又は抗原決定基の数を指す。抗原結合性分子の特異性は、非標的分子に関する親和性及び／又はアビディティに対する、標的分子（単数又は複数）に関する親和性及び／又はアビディティに基づいて決定され得る。抗原と、抗原結合性タンパク質との解離に関する平衡定数（Ｋ_Ｄ）によって表される親和性は、抗原決定基と、抗原結合性タンパク質上の抗原結合性部位との間の結合強度に関する尺度であり、Ｋ_Ｄの値が小さいほど、抗原決定基と、抗原結合性分子との間の結合強度は強力である（あるいは、親和性はまた、１／Ｋ_Ｄである親和性定数（Ｋ_Ａ）と表すことができる）。Ｋ_Ｄを決定する方法は、当業者に明らかであり、例えば、本明細書中で言及される技法を包含する。親和性は、分子相互作用の強度又は安定性を表す。親和性は、ｍｏｌ／リットル（又はＭ）の単位を有するＫ_Ｄ、又は平衡解離定数によって、一般的に付与される。親和性はまた、１／Ｋ_Ｄに等しく、またリットル／ｍｏｌの単位を有する、結合定数Ｋ_Ａとして表すことができる。本明細書中では、２つの分子（例えば、本発明のアミノ酸配列、免疫グロブリン配列、又は結合分子と、その対象とされる標的との）間の相互作用の安定性は、主にそれらの相互作用のＫ_Ｄ値に関して表され、Ｋ_Ａ＝１／Ｋ_Ｄの関係を考慮して、分子相互作用の強度を、そのＫ_Ｄ値によって指定することを、相当するＫ_Ａ値を算出するのに使用することができることは、当業者に明らかである。

Ｋ_Ｄ値は、それが結合の自由エネルギーに関連するため、同様に熱力学的意義において分子相互作用の強度を特性決定する。当業者に明らかであるように（例えば、本明細書中のさらなる開示に基づいて）、親和性は、それ自体公知の様式で、目的の特異的な抗原に応じて、決定することができる。アビディティは、抗体－抗原複合体の強度全体の尺度を付与する。アビディティは、３つの主要なパラメーターに依存する：エピトープに対する抗体の親和性（上記を参照）、抗体及び抗原の両方の結合価、及び相互作用する部分の構造配列。アビディティは、抗原決定基と、抗原結合性分子上のその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合性分子上に存在する適切な結合部位の数の両方に関する。通常、本発明の免疫グロブリン配列（例えば、本発明のアミノ酸配列、ＩＳＶＤ及び／又は結合分子）は、それらの抗原に、１０Ｅ－５～１０Ｅ－１２モル／リットル又はそれ未満、好ましくは１０Ｅ－７～１０Ｅ－１２モル／リットル又はそれ未満、より好ましくは１０Ｅ－９～１０Ｅ－１２モル／リットルで結合する。１０Ｅ－５Ｍよりも大きいあらゆるＫ_Ｄ値は、一般に、非特異的な結合を示すとみなされる。好ましくは、本発明の一価免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは５００ｐＭ未満の親和性で、所望の抗原に結合する。抗原結合タンパク質又は抗原結合性タンパク質の、抗原又は抗原決定基に対する結合特異性及び結合親和性は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ等のスッキャッチャード分析及び／又は競合結合アッセイ、及び本技術において自体公知のそれらの異なる変形、ならびに本明細書中で言及される他の技法を包含する、自体公知のあらゆる適切な様式で決定され得る。意義のある（例えば、特異的である）とみなされる、本発明の結合分子の、本明細書中で規定されるような細胞関連抗原への結合等の生物学的相互作用に関するＫ_Ｄは、通常、１０Ｅ－１０Ｍ（０．１ｎＭ）～１０Ｅ－６Ｍ（１μＭ）の範囲に存在する。

Ｋ_Ｄはまた、ｋ_ｏｆｆと表される複合体の解離速度定数の、ｋ_ｏｎと表されるその解離の速度に対する比として表される（つまり、Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ、及びＫ_Ａ＝ｋ_ｏｎ／ｋ_ｏｆｆ）。２つの分子間の分子相互作用の親和性は、一方の分子がバイオセンサチップ上に固定化され、他方の分子が、流動条件下で、固定化された分子上を通過する、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えば、Ｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３，１５５１－１５５９，２００１を参照）等の、自体公知の種々の技法により測定することができ、ｋ_ｏｎ測定値、ｋ_ｏｆｆ測定値、したがってＫ_Ｄ（又はＫ_Ａ）値をもたらす。これは、例えば、周知のＢｉｏｃｏｒｅ機器を使用して実施され得る。細胞によって発現される膜貫通受容体に関する親和性測定は、ＬＩＳＡによって実施されることが好ましい。

また、測定したＫ_Ｄは、測定プロセスが何らかの形で、例えば、１つの分子のバイオセンサ上のコーティングに関連した人工産物によって、含意される分子の固有の結合親和性に影響を与える場合、見かけのＫ_Ｄに相当し得る。また、見かけのＫ_Ｄは、１つの分子が、他の分子に関して１つよりも多い認識部位を含有する場合に測定され得る。かかる状況では、測定される親和性は、２つの分子による相互作用のアビディティによって影響され得る。親和性を評価するのに使用され得る別のアプローチは、Ｆｒｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７７，３０５－１９，１９８５）の２工程ＥＬＩＳＡ手順である。この方法は、溶液相結合平衡測定を確立して、プラスチック等の支持体上の分子の１つの吸着に関連する考え得る人工産物を回避する。しかしながら、Ｋ_Ｄの正確な測定は、非常に労働集約的である可能性があり、したがって、多くの場合、見かけのＫ_Ｄ値は、２つの分子の結合強度を評価するために決定される。測定が全て、一貫した方法で（例えば、アッセイ条件を変更しないまま保って）行われる限りは、見かけのＫ_Ｄ測定は、真のＫ_Ｄの近似値として使用することができ、したがって、本文書では、Ｋ_Ｄ及び見かけのＫ_Ｄは、同等の重要性又は関連性で取り扱われるべきであることに留意すべきである。

また、治療用又は診断用の分子は、存在する場合、リンカー及び／又はスペーサーによって、結合分子の残部に結合されることが好ましい。リンカーは、薬物のランダム／異種又は部位特異的なコンジュゲーションのいずれかに関する戦略を使用して、例えば、本発明の結合分子等のターゲティング部分に結合される。前者の戦略は、それぞれリシン又は（ヒンジ領域）システイン残基への薬物コンジュゲーションに関する従来の活性エステル又はマレイミド化学反応に主に基づいているのに対して、後者は、遺伝的に、酵素的に、又は他の手段によって操作された「修飾ターゲティング部位」の特異的な部位で導入されている化学残基を利用する。単一可変抗体ドメインは、Ｃ末端もしくはＮ末端部分上でシステイン又はヒスチジン残基を含み得る。ターゲティング部分への部位特異的なコンジュゲーションは、最小のバッチ間変動性で、同種混合物を生じる。リンカーは、切断可能であり得るか、又は切断不可能であり得る。両方のタイプのリンカーが、循環中で安定であると仮定されるが、血中での完全性の詳細な分析に、またある特定のＡＤＣの毒性プロファイルに基づいて、安定性は、現在認可されているＡＤＣにとって懸念事項である。切断可能なリンカーを有するＡＤＣの場合、標的細胞による内在化後、切断可能なリンカーならびに抗体は、リソソーム中で分解されるようになり、毒性活性を発揮するのに、薬物を自由に利用可能にさせる。切断不可能なリンカーを有するＡＤＣの場合、抗体のみが、リソソーム中で分解されるようになり、薬物－リンカー複合体が放出される。上述の洞察により、例えば、ＡＤＣ産生プロセスをより簡素且つ安価にすることによって、及び／又は治療域を広げることによって、有益な方法で、リンカーに、ＡＤＣならびに薬物の特性を変更させることができる調節可能な物理化学的機能を与える道が開かれる。次に、薬物と、ｍＡｂとの間に安定な接着剤が存在すると、理想的なリンカーは、（１）薬物及びＡＤＣの溶解度を改善して、薬物の、ｍＡｂへのコンジュゲーションを、より効率的にし、（２）細胞輸送、及び薬物と、その細胞標的との間の相互作用を改善し、（３）多剤耐性タンパク質を介して腫瘍細胞による薬物の流出を減少させ、（４）健常な細胞による薬物－リンカー複合体の取込みを防止する。従来の有機リンカーのほとんどが、準最適なＡＤＣを提供するため、ここ数年で、新たなコンジュゲーション技術に関して幅広い研究が開始されている。

本発明は、例えば、国際特許出願公開第２０１３１０３３０１号に記載されるようもの等であるが、これらに限定されない２つの反応性基を有する機能性白金（ＩＩ）錯体を含む、さらに「Ｌｘ」と称される特定のリンカーを提供する。Ｌｘの第１の反応性基は、キナーゼ阻害剤によって、第２の反応性基は、本発明の結合分子等のターゲティング部分によって置き換えられることが可能である。Ｌｘを使用することによって、コンジュゲートされた結合分子の免疫反応性は、結合されていない天然の結合分子と、実質的に同じままである。これは、結合分子の免疫反応性が、十分に高いままである場合のみにとくに重要であり、身体において適所で、コンジュゲートされた薬物を、治療用化合物として送達することが可能である。さらに、結合分子を、ＬＸに結合するのにあまり時間がかからず、このカップリングを行うための反応条件が穏やかであり、使用される機能性部分とは非常に独立しているため、使用されるターゲティング部分は、患者特有のニーズにカスタマイズされ得る。穏やかな反応条件に起因して、結合分子は、優れた条件のままであり、その元の（コンジュゲートされていない）免疫反応性を保持する。本発明は、小さな治療用又は診断用の分子の、結合分子への迅速で効率的で安定な部位特異的な結合を可能にする技術を提供する。Ｌｘを通じてコンジュゲートされたビパラトピックポリペプチドは、細胞モデルにおいて、優れた弛緩活性を示した。Ｌｘリンカーは、血中での分解に耐性である一方で、依然として標的でペイロードの放出を可能にしている。さらに、Ｌｘは、他の系と異なり、種々の化学種の薬物の結合を可能にする。上述するように、薬物の、結合分子を介したＨＳＣへのターゲティングは、特異性を高めるのに、全身毒性を減少させるのに、また例えばそれらの毒性プロファイルに関して、原則上は全身薬物としてあまり適していないか、又は不適切である化合物の治療用途を可能にするのに、概念上、魅力的である。これは、活性化されたＨＳＣの外側膜上に露出された、アップレギュレートされた受容体を標的とするには、薬物の、本発明の結合分子への安定な部位特異的なカップリングを要する。したがって、リンカー及び／又はスペーサーは好ましくは、遷移金属錯体を含むか、又は遷移金属錯体からなる。好ましい態様では、遷移金属錯体は、Ｐｔ（ＩＩ）を含む。さらなる好ましい態様では、上記リンカーは、シス－白金（ＩＩ）錯体、より好ましくは、不活性な二座部分を含むシス－白金（ＩＩ）錯体を含み、ここで、上記二座部分は、好ましくはエタン－１，２－ジアミンである。

上述したように、活性化されたＨＳＣ又は筋線維芽細胞の細胞骨格の収縮を阻害することによって、線維症が減弱する。したがって、好ましい態様では、治療用の分子が、活性化されたＨＳＣの細胞骨格の収縮を阻害することが可能である、本発明の結合分子が提供される。
例えば、キナーゼ阻害剤は、活性化されたＨＳＣの細胞骨格の収縮を阻害することが可能である。標的とされるキナーゼは、肝線維症及び門脈圧亢進症において役割を果たすレニン－アンジオテンシン系（ＲＡＳ）と呼ばれるシグナル伝達経路に関与する。ＲＡＳは、血管平滑筋緊張を調節することによって、血圧の調節において中心的な枠割を果たす。ＲＡＳに関与する２つのキナーゼは、チロシンキナーゼヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）及びＰｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）である。これらのタンパク質キナーゼの発現は、ヒト硬変における門脈圧亢進症と関連付けられている。

門脈圧亢進症は、肝線維症及び肝硬変の全ての段階に存在する。肝硬変では、活性化されたＨＳＣは、それらが存在する類洞周辺で収縮する。これにより、門脈圧亢進症を引き起こし、ここでは、肝臓における門脈系を通じて、血流が閉塞される。ＲＡＳ内では、ＪＡＫ２は、リン酸化されるようになり、小ＧＴＰアーゼＲｈｏＡの活性化を担うヌクレオチド交換因子であるＡｒｈｇｅｆ１を活性化し、続いて、Ａｒｈｇｅｆ１は、その下流のエフェクターＲＯＣＫを活性化する。ＲＯＣＫは、収縮力発生を促進するアクトミオシン細胞骨格の制御因子である。ＲＯＣＫは、ミオシン軽鎖ホスファターゼ（ＭＬＣＰ）をリン酸化して、それによりミオシン軽鎖ホスファターゼ（ＭＬＣＰ）を不活性化して、ミオシン軽鎖リン酸化及び収縮の増加を招く。したがって、ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２の使用は、ＲＡＳによって誘導されるＨＳＣ収縮の減少を引き起こす。続いて、ＪＡＫ２は、ＲＯＣＫを活性化するのに役割を果たすので、ＳＢ１５１８（パクリチニブとも呼ばれる、これはＪＡＫ２阻害剤である）によるその阻害は、ＨＳＣを弛緩するのを助長し得る。これらの小分子は、非常に毒性があり、非特異的であり、したがって、それらは、それ自体を全身投与に不適切にさせる用量制限毒性に悩まされている。効果的な量のコンジュゲートされた小分子薬物を保有する本発明の結合分子は、それ自体が小分子の全身投与の制限を克服するように設計されている。好ましくは、治療用の分子は、好ましくは、Ｒｈｏ－キナーゼ阻害剤、ＪＡＫ－２阻害剤及びネプリライシン阻害剤からなる群から選択される、より好ましくは、Ｙ２７６３２、ＳＢ１５１８及びＬＢＱ６５７からなる群から選択されるキナーゼ阻害剤である。別の好ましい態様では、治療用の分子は、タキサン、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、カリケアマイシン、マイタンシノイド、アウリスタチン、好ましくは、アウリスタチンＦ及びＣＣ １００６５類似体等の毒素である。

通常、膜貫通受容体への結合は、細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する。例えば、ＰＤＧＦの、ＰＤＧＦＲＢへの結合は、受容体自体及び他のタンパク質のリン酸化を誘導し、それにより、遊走及び増殖等の細胞応答を誘発する細胞内シグナル伝達経路を関与させる。本発明の結合分子の目的は、そのペイロードの、標的細胞の細胞質への輸送であり、輸送に使用される受容体の活性化ではないため、結合分子の、膜貫通受容体の細胞外ドメインへの結合が、受容体の細胞内シグナル伝達カスケードを誘導しないことが好ましい。結合分子の、膜貫通受容体への結合が、受容体媒介性内在化、エンドサイトーシス及びエンドリソソーム区画内の薬物又は毒素の放出を引き起こすことは、さらに好ましい。

１つの好ましい態様では、結合分子が、リンカー分子へのコンジュゲーションの目的を果たすＮ末端もしくはＣ末端のシステイン又はヒスチジン残基、好ましくはＮ末端又はＣ末端システインを含む、本発明の結合分子が提供される。ある態様では、本発明は、本発明の少なくとも２つの結合分子を含むビパラトピック結合分子を提供する。

上述するように、治療用の分子を含む、本発明の結合分子は、治療分子を、標的細胞、例えば、線維化肝細胞の細胞質に送達するのに役立ち、それにより、肝線維症の処置を可能にする。したがって、本発明は、医薬としての使用のための本発明の内在化用結合分子を提供する。「処置する」、「処置すること」、又は「処置」の語は、疾患と関連付けられる状態、症状、もしくはパラメーターを改善するのに、又は疾患の進行を防ぐのに有効な量、様式及び／又は形式で、統計学的に有意な度合いで、又は当業者にとって検出可能な度合いで、治療法を施すことを指す。治療用途の場合、処置は、対象における疾患もしくは状態を改善し得るか、治癒し得るか、維持し得るか、又はその持続期間を減少させ得る。治療用途では、対象は、症状の部分的又は完全な所見を有し得る。典型的な場合、処置は、医師によって検出可能な程度に、対象の疾患もしくは状態を改善するか、又は疾患もしくは状態の悪化を防止する。本明細書中で使用する場合、「防止する」又は「防止すること」の語は、言及される障害の症状を和らげることを意味する。とくに、上記用語は、ＣＬＤ関連障害、例えば食道静脈瘤出血、及びそれらの症状の低減、それらの緩和又はそれらからの軽減を包含する、本発明の結合分子を、対象に投与することの治療上プラスの効果の完全範囲を包含する。「防止」の語は、疾患の発症の防止もしくは先延ばし、症状の発症の防止もしくは先延ばし、及び／又は発症するか、もしくはもしくは発症すると予想されるかかる症状の重篤性の低減を包含する。これらは、現存する症状を改善すること、さらなる症状を防止すること、及び症状の根底にある原因を改善又は防止することをさらに包含する。本明細書中で使用する場合、「対象」及び「患者」の語は、相互に置換可能に使用される。本明細書中で使用する場合、「対象（単数）」及び「対象（複数）」の語は、動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ、ラクダ、ネコ、イヌ、モルモット、ラット、マウス、ヒツジ）及び霊長類（例えば、サル、例えばカニクイザル、テナガザル、オランウータン、ゴリラ、チンパンジー、及びヒト）を包含する哺乳動物を指す。「患者」は、好ましくは、ヒトを指す。上記患者は、あらゆる年齢の高齢者、成人、青年及び子供、例えば２歳から１２歳未満の範囲の子供、１２歳から１８歳未満の範囲の青年、１８歳から６５歳未満の範囲の成人、及び８５歳及びそれ以上の高齢者を包含し得る。

好ましくは、かかる医薬は、ＰＤＧＦＲＢ及び／又はＩＧＦ２Ｒの発現の増加と関連付けられるか、もしくはそれを特徴とする疾患もしくは障害の防止及び／又は処置に関する方法における使用のためのものである。

好ましくは、かかる医薬は、肝硬変、肝線維症及び／又は門脈圧亢進症の防止及び／又は処置に関する方法における使用のためのものである。例えば、門脈圧亢進症（ＰＨ）は、肝線維症に、また肝硬変の全ての段階に存在する。肝硬変では、活性化されたＨＳＣは、それらが存在する類洞周辺で収縮する。これにより、ＰＨを引き起こし、ここでは、肝臓における門脈系を通じて、血流が閉塞される。門脈系は、胃、腸、脾臓、及び膵臓からの大量の血液を混合する門脈で構成され、大量の血液を、より小さな血管を通じて分岐させて、肝臓全体にわたって移動させる。肝臓における血管が、肝臓損傷に起因して遮断されると、血液は、肝臓を通って適切に流れることができず、高血圧をもたらす。ＰＨが悪化して、血流が、門脈を通じて閉塞されると、血液は、かかる大量の血液を運搬するように設計されていない食道における血管等のより小さな血管を通って再誘導される。これが、遠位の食道及び近位の胃で拡張された静脈（静脈瘤）を引き起こし、それらにより、破裂（静脈瘤出血）の危険性が増加し、重篤な内出血から致命的な内出血を引き起こす。本発明の結合分子は、肝硬変、肝線維症及び／又は門脈圧亢進症を引き起こすか、又は増悪させる細胞を標的とするのにとくに有用である。

好ましくは、かかる医薬は、食道静脈瘤及び／又は痔と関連付けられる疾患又は障害の防止及び／又は処置に関する方法における使用のためのものである。好ましくは、かかる医薬は、静脈瘤内出血及び外出血を特徴とする疾患又は障害の防止及び／又は処置に関する方法における使用のためのものである。

一態様では、本発明は、本発明の結合分子の少なくとも一部をコードする核酸を提供する。本発明の利点の１つは、本発明の分子の産生の容易さ及び本発明の分子の簡素さであるが、本質的に全ての必須機能をコードする単一核酸に関する選択により、得られた結合分子において他の機能性の比較的容易な付加（選択される発現ベクターにおいて余地が存在する限りは）が可能となる。かかる核酸は、適切な宿主細胞においてトランスフェクトされると、本発明の結合分子の産生を可能にする。したがって、本発明は、本発明の核酸を含む、本発明の結合分子の少なくとも一部の発現のための宿主細胞を提供する。一態様では、本発明は、本発明の結合分子を産生する方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップと、前記結合分子の少なくとも一部の発現を可能にするステップと、前記結合分子を収集するステップと、任意にこれまでに定義されたリンカーにより、上記治療用又は診断用の分子を、前記結合分子の前記一部にカップリングするステップとを含む上記方法を提供する。

本発明の結合分子は、あらゆる一般的に使用される方法によって産生することができる。典型的な例として、適切な宿主系、例えば、細菌、酵母又は哺乳動物細胞における組換え発現が挙げられる。本発明の結合分子は、本発明に従って配合される前に、適切な精製レジメンを受ける。概して、本発明の結合分子は、結合分子を産生するように遺伝子操作された生存宿主細胞によって産生される。タンパク質を産生するように細胞を遺伝子操作する方法は、本技術で周知されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９０），分子生物学における現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照のこと。かかる方法は、結合分子をコードして、結合分子の発現を可能にする核酸を、生存宿主細胞に導入することを包含する。これらの宿主細胞は、培養液中で成長させた細菌細胞、真菌細胞、又は動物細胞であり得る。細菌宿主細胞として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞が挙げられるが、これに限定されない。適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の例として、ＢＬ２１（Ｄ３）、ＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＧＭ２９２９、ＪＭ１０９、ＫＷ２５１、ＮＭ５３８、ＩＭＭ５３９、及び外来ＤＮＡを切断することができないあらゆる大腸菌株が挙げられる。大腸菌株ＢＬ２１（Ｄ３）が好ましい。使用することができる真菌宿細胞として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる動物細胞系の数少ない例は、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、３Ｔ３及びＷＩ３８である。新たな動物細胞系は、当業者に周知されている方法を使用して（例えば、形質転換、ウイルス感染、及び／又は選択によって）確立することができる。任意に、結合分子は、宿主細胞によって、培地に分泌され得る。幾つかの態様では、結合分子は、細菌細胞において、例えば大腸菌細胞において産生することができる。

一態様では、結合分子は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、Ｐｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５１：１２３－３５（２００１）を参照）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、又はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）等の酵母細胞において発現される。クローン抗体又はそれらの抗原結合性断片を発現するための典型的な哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を包含する、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０（１９８０）に記載されている、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１（１９８２）に記載されるようにＤＨＦ選択可能マーカーとともに使用される）、リンパ球細胞系、例えば、ＮＳ０骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、及びトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、細胞は、乳腺上皮細胞である。結合分子をコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子等のさらなる配列を保有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、及び同第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、通常、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞で、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサート等の薬物に対して耐性を付与する。標準的な分子生物学技法を使用して、組換え発現ベクターを調製して、宿主細胞をトランスフェクトして、形質転換体に関して選択して、宿主細胞を培養して、抗体分子を培養培地から回収することができる。例えば、本発明の結合分子は、アフィニティクロマトグラフィによって単離することができる。一態様では、本発明の結合分子は、国際公開第１０／０５８５５０号に記載されるように精製される。例示的な態様では、結合分子は、結合分子を支持体に結合又は吸着させることを可能にする条件下で、結合分子と混入物（単数又は複数）との混合物を、プロテインＡベースの支持体及び／又はイオン交換支持体と接触させることと、結合分子が支持体に結合した状態のままである条件下で、結合を受けている支持体を洗浄することにより１つ又は２つ以上の混入物を除去することと、吸着された結合分子を、溶出緩衝液で溶出させることにより結合分子を支持体から選択的に溶出させることとによって、１つ又は２つ以上の混入物から精製される。本発明の結合分子はまた、トランスジェニック動物によって産生され得る。例えば、米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現する方法について記載している。乳特異的プロモーター及び抗体分子をコードする核酸及び分泌用のシグナル配列を包含する導入遺伝子が構築される。かかるトランスジェニック哺乳動物の雌によって産生される乳は、その中に分泌された形で目的のシグナルドメインを包含する。抗体分子は、乳から精製され得るか、又は用途によっては、直接使用され得る。本発明は、本明細書中で規定されるような配合物を産生する方法を包含する。

本発明は、本発明の少なくとも１つの結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。

本発明の結合分子は、液体溶液（例えば、注射可能溶液及び注入可能溶液）の形態で投与され得るか、又は投与に使用され得る。かかる組成物は、非経口形式（例えば、皮下、腹腔内又は筋内注射）によって、又は吸入によって投与され得る。「非経口投与」及び「非経口投与される」という語句は、本明細書中で使用する場合、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与の形式を意味し、皮下（ｓ．ｃ．）又は筋内投与ならびに静脈内（ｉ．ｖ．）、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管内、表皮下、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内の注射ならびに注入を包含する。好ましくは、本明細書中に記載する本発明の結合分子の第２の用量又はさらなる用量は、徐放、したがって持続効果のために、皮下的に又は経口に投与される。好ましくは、とくに急性状況では、結合分子は、胃における取込み後に罹患した肝臓に対して直接、臓器循環を介して輸送されるため、本発明の結合分子を経口投与することが好ましい。本発明はまた、安定であり、好ましくは薬剤の調製を包含する医薬用途に適している、ＰＤＧＦ又はＩＧＦに対する少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む結合分子の配合物（「本発明の医薬組成物」とも呼ばれる）を提供する。「医薬組成物」の語は、有効成分（本発明の結合分子）の生物活性を有効にさせるような形態で存在し、また配合物が投与される対象にとって受け入れがたいほど毒性があるさらなる構成成分を含有しない調製物を指す。かかる配合物は、好ましくは滅菌である。「薬学的に許容可能な」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、用いられる有効成分の有効な用量を提供するように、対象哺乳動物に合理的に投与され得るものである。

「賦形剤」の語は、本明細書中で使用する場合、配合物に有益な物理特性を付与する化合物用の希釈剤、ビヒクル、防腐剤、リオプロテクタント（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、界面活性剤、結合剤、担体又は安定化剤として一般に使用される不活性物質を指す。当業者は、リオプロテクション（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）、安定化、防腐剤等の、配合物において特定の機能を有し得る、医薬目的に適した賦形剤に精通している。

本発明の結合分子とともに同時配合され得る作用物質の非限定的な例として、例えば、補助的な処置（例えば、（メチル）プレドニゾロン又は（メチル）プレドニゾン等の副腎皮質ステロイド、利尿薬、アルブミン、ビタミンＫ、抗生物質及び栄養療法及びベータ遮断薬等の全身降圧剤）及び赤血球輸血による支持療法が挙げられる。かかる併用療法は、有利には、より低投与量の投与される治療剤を利用してもよく、したがって、各種単独療法と関連付けられる考え得る毒性又は合併症を回避する。ある態様では、本発明は、全身降圧処置とともに本発明の結合分子の併用療法に関する。好ましくは、複合療法は、門脈圧が正常化されるまで提供される。門脈圧測定は、診断を確認して、疾患の経過及びさらなる処置の考え得る必要性をモニタリングするのに役立つ。本発明のあらゆる特定のタンパク質性分子の有効性又は投薬レジメンは、当業者に利用可能な方法によって決定され得る。簡潔に述べると、臨床試験の間、患者は、医療従事者によって観察される場合があり、疾患の状態は、判断基準のあらゆる組合せによって評価される。患者の疾患状態の改善は、多数の時点でこれらの判断基準に基づいて決定され、患者集団に関するこれらの決定の組合せをプロットして、処置の有効性を評価する。例示的な態様では、有効性の評価は、以下に記載される判断基準のいずれか又は全てによって測定され得る：
・時間に対する処置の応答
・完全な寛解を伴う対象の数
・ＥＶＨの増悪（を伴う対象）の数及びＥＶＨの第１の増悪までの時間
・臓器機能不全の改善ならびにＣＬＤ関連の兆候及び症状の改善
・研究薬物処置期間（テーパリングを包含する）内の総死亡率
・ＣＬＤのバイオマーカーの決定。

本発明の結合分子の投与量は、いわゆる上昇用量実験における動物研究及び臨床研究により確立されるべきである。通常、用量は、今日の抗体投与量に匹敵する（モルレベルで、本発明の分子の重量は、抗体の重量と異なり得る）。通常、かかる投与量は、３ｍｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（体重）又は用量１回当たり２５ｍｇ～１０００ｍｇである。

とくに、肝疾患のより慢性の段階では、本発明の結合分子の第１の適用は、（少なくとも初期では）、他の処置（標準的なケア）と組み合わせて行われる蓋然性が高い。したがって、本発明はまた、本発明の結合分子と、通常療法、例えばプロプラノロール等の降圧薬又は例えば食道における静脈瘤からの出血を停止させる外科的手段とを含む、医薬組成物を提供する。さらに、本発明はまた、例えば肝疾患における、補助的処置における使用のための、本発明の結合分子を含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明はまた、肝疾患の複合内科的処置における使用のための、本発明の結合分子を含む医薬組成物を提供する。

したがって、理想的な治療用化合物は、プロプラノロール等の現在使用されている分子よりもはるかに強力であり、且つ他の状況では遊離薬物としてそれらの使用を可能にするには狭すぎる治療域を有するエフェクター化合物の送達を可能にすべきである。好ましくは、薬物の、ターゲティング部分への安定なコンジュゲーションは、循環における（他の状況では、毒性がある）化合物の放出によって、全身毒性を回避する。分子がＨＳＣによって内在化されると、薬物が放出されて、ＨＳＣを不活性化することが可能となるはずである。

好ましくは、医薬組成物は、慢性肝疾患の処置に有用な少なくとも１つの他の化合物をさらに含む。本発明の医薬組成物は、好ましくは、門脈圧亢進症の存在下での静脈瘤出血の補助的処置としての使用のため、及び／又は肝疾患の治療における使用のためのものである。診断用の分子を含む、本発明の結合分子は、例えば肝線維症の診断にとくに有用である。したがって、好ましい態様では、診断用の分子を含む、本発明の結合分子が提供され、ここでは、診断用の分子は、造影剤である。診断用の分子を含む、本発明の少なくとも１つの結合分子と、希釈剤及び／賦形剤とを含む診断用組成物がさらに提供される。

本発明のとくに好ましい態様では、本発明の結合分子は、互いに独立して、肝星細胞及び／又は筋線維芽細胞のＰＤＧＦＲＢ又はＩＧＦ２Ｒ受容体に特異的に結合することが可能である、少なくとも２つの単一可変ドメインを含み、それらのドメインは、シス－白金（ＩＩ）錯体を含むリンカーを介して、Ｒｈｏ－キナーゼ阻害剤、Ｊａｋ－２キナーゼ阻害剤、ネプリライシン阻害剤又はアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト等のキナーゼ阻害剤から選択される治療用の分子に連結される。好ましくは、リンカーのシス－白金（ＩＩ）錯体は、不活性な二座部分、最も好ましくは、エタン－１，２－ジアミンを含む。さらに、ＩＧＦ２Ｒ受容体に特異的に結合する、好ましい単一可変ドメインは、配列番号２７５によるＣＤＲ１配列、配列番号２７７によるＣＤＲ２配列及び配列番号２７９によるＣＤＲ３配列を含むか、又は配列番号２５１によるＣＤＲ１配列、配列番号２５３によるＣＤＲ２配列及び配列番号２５５によるＣＤＲ３配列を含み（すなわち、それぞれ、１３Ｆ１１及び１３Ｅ８による）、ＰＤＧＦＲＢ受容体に特異的に結合する、好ましい単一可変ドメインは、配列番号１１によるＣＤＲ１配列、配列番号１３によるＣＤＲ２配列及び配列番号１５によるＣＤＲ３配列、又は配列番号１５５によるＣＤＲ１配列、配列番号１５７によるＣＤＲ２配列及び配列番号１５９によるＣＤＲ３配列を含む（すなわち、それぞれ、ＳＰ０２Ｐ及びＳＰ２６Ｐによる）。さらに、上記結合分子はまた、好ましくは、いわゆる半減期延長剤を含み、半減期延長剤は、アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ＶＨＨもしくは抗体Ｆｃテイル又はそれらの断片から選択されることが好ましい。以下の例では、とりわけ、これらの好ましい態様の特定の種が、より詳細に記載されている。

例
（例１）：ＩＧＦ２Ｒ又はＰＤＧＦＲＢに特異的なヒト抗体断片の選択。ラマ免疫化、細胞収集、ファージＶＨＨ選択及びライブラリーの構築。標的親和性及びＨＳＣ内在化に基づくＶＨＨ選択：ＩＧＦ２Ｒ（ラット及びヒト）。
抗原特異的なＶＨＨを生成及び特性決定するための一般的な手順を、図１に表す。

１．１ ＩＧＦ２Ｒ
本発明者等の目的は、ヒト及びラット肝星細胞（ＨＳＣ）上の受容体ＩＧＦ２Ｒに、特異的に且つ高い親和性で結合するＶＨＨを同定することであった。研究用の出発材料は、予め生成したラマＶＨＨ ｃＤＮＡライブラリーであった。ライブラリーは、ヒトＩＧＦ２Ｒ（ｈＩＧＦ２Ｒ）発現Ａ５４９細胞で免疫化したラマの末梢血単核細胞から抽出したＶＨＨ配列の大規模プールからなっていた。ライブラリーサイズは、ＤＮＡ形質転換時にコロニー滴定を用いて評価した場合、およそ１０^８個のコロニー形成単位（ｃｆｕ）であった。

ファージは、Ａ５４９ＶＨＨライブラリーから調製され、ＩＧＦ２Ｒの組換えヒト細胞外ドメイン（ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤ）に対して、２回の選択を行った。各回において、およそ１０^１１個のコロニー形成単位（ｃｆｕ）のファージを、種々の濃度の標的上でインキュベートして、溶出して、増幅させて、続いて、次の回の選択に使用した。第２の選択回後のファージアウトプットは、第１の回よりも明らかに高く（それぞれ、１．２×１０^９個及び３．３×１０^７個）、ＶＨＨ結合剤が増幅されていることを実証した。

最終選択回後、９４個のファージクローンを、無作為に選択して、ファージＥＬＩＳＡにおいて、ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤへの結合に関して検査した。続いて、高い結合親和性を有するクローンを、ＨｉｎｆＩ消化を使用して、それらの制限パターンによってさらに特性決定して、それらの制限パターンに従って分類した。各カテゴリーから、多数のクローンを選択して、これらの結合剤のアミノ酸配列を同定した（表２）。この選択は、Ａ５４９ライブラリーに由来される１５個の特有のｈＩＧＦ２Ｒ結合剤全てのパネルをもたらした（図２）。

１．２ ＰＤＧＦＲＢ
受容体ＰＤＧＦＲＢ（ラット及びヒト）に、特異的に且つ高い親和性で結合するＶＨＨの選択を、ラマの免疫化によって開始した。各受容体に関して、表３の免疫化スケジュールに従って、２匹のラマに５回、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を４回及びＰＤＧＦＲＢをトランスフェクトしたＳＣＣ ＶＩＩ細胞を１回注射した。ｒＰＤＧＦＲＢで免疫化した２匹のラマはまた、ｒＩＧＦ２Ｒに特異的に且つ高い親和性で結合するＶＨＨの生成のためにｒＩＧＦ２ＲをトランスフェクトしたＳＣＣ ＶＩＩ細胞でも免疫化されたことに留意しなくてはならない。最終免疫化の８日後に、血液を収集して、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を精製して、それらのＲＮＡを抽出した。

ＰＤＧＦＲＢライブラリー（ヒト及びラットＰＤＧＦＲＢの両方に関する）を、下記の手順に従って創出した。ともに製造業者のプロトコールに従って、抽出したＲＮＡ（４０μｇ、それぞれ１０μｇの反応を４回）を、逆転写酵素キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してｃＤＮＡに転写して、ｃＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて浄化した。ＩＧ Ｈ断片（従来の重鎖）を、リーダー配列領域及びＣＨ２領域でアニーリングするプライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上に載せて、その後、７００ｂｐ断片をゲルから切り出して、製造業者のプロトコールに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した。続いて、精製したＤＮＡ ８０ｎｇを、ネステッドＰＣＲ用の鋳型として使用して、制限部位を導入した（最終容量８００μＬ）。増幅した断片を、製造業者のプロトコールに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて浄化して、溶出緩衝液１２０μＬ中に溶出した。溶出したＤＮＡを、ＢｓｔＥＩＩ及びＳｆｉＩで消化し、その後、試料を、１．５％ ＴＡＥ－アガロースゲル上に流して、４００ｂｐ断片をゲルから単離した。ＤＮＡ断片を、製造業者のプロトコールに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて単離して、溶出緩衝液１００μＬ中に溶出した。次に、ＤＮＡ断片（３３０ｎｇ）を、ファージミドベクター（ｐＨＥＮ１誘導体、１μｇ）にライゲーションして、ＴＧ１細菌細胞に形質転換した。ライゲーション前に、ファージミドベクターを、ＳｆｉＩ及びＢｓｔＥＩＩによる消化、続くＦａｓｔＡＰによる脱リン酸化によって調製した。

形質転換体の数を、プレートアウトしたＴＧ１細胞（８ｍＬ）の希釈から算出した。ライブラリーの力価（表４）は、最も高い希釈においてコロニーを計数することと、以下の式を使用することとによって算出した：
ライブラリーサイズ＝（コロニーの量）×（希釈）×８ｍＬ／０．００５ｍＬ（スポットした容量）。インサート頻度は、ライブラリー形質転換それぞれから、２４個の異なるクローンを採取することと、コロニーＰＣＲを実行することとによって決定された。インサート頻度は、ライブラリー１、ライブラリー２及びライブラリー４に関しては１００％、またライブラリー３に関しては９６％であった。

ファージを、ライブラリーから調製して、２回の選択を行った。第１の選択回は、細胞外ドメイン（ｈＰＤＧＦＲＢ－ＥＣＤ又はｒＰＤＧＦＲＢ－ＥＣＤ）に関して実行した。ファージを、種々の濃度の標的上でインキュベートして、溶出して、増幅して、続いて、次の回の選択に使用した。第１の選択回のファージアウトプットを、図３に表示する。第２の選択回は、結合及び内在化するファージの選択のため、ｈＰＤＧＦＲＢ又はｒＰＤＧＦＲＢのいずれかをトランスフェクトしたＳＣＣ ＶＩＩ細胞に関して実行した。酸洗浄を使用して、ＰＤＧＦＲＢにのみ結合するファージを、結合後にＰＤＧＦＲＢを介して内在化するファージと分離した。最小のＥＣＤ密度を有するウェル由来の第１の回からのアウトプットを用いて、この選択回を実行した。第２の選択回のファージアウトプットを、図４に表示する。

第２の選択回後、９４個の内在化するファージクローンを、無作為に選択して、ファージＥＬＩＳＡにおいて、ＰＤＧＦＲＢ－ＥＣＤへの結合に関して検査した。続いて、高い結合親和性を有するクローンを、ＨｉｎｆＩ消化を使用して、制限パターン分析によって、さらに特性決定した。クローンを、それらの制限パターンに従って分類して、各カテゴリー由来の唯一のクローンを選択して、これらの結合剤のアミノ酸配列を同定して、１８個の特有のｈＰＤＧＦＲＢ結合ＶＨＨ及び１１個の特有のｒＰＤＧＦＲＢ結合ＶＨＨを生じた（表１、図５～図６）。

（例２）：ＶＨＨを含む結合分子の産生のための遺伝子の設計
ＶＨＨを産生するために、選択したＶＨＨの遺伝子を、発現ベクターのインサートにおいて下記の配列を含有するｐＥＴ－２１又はｐＥＴ－２８ベクターにクローニングした（図７）。細菌細胞における産生されたタンパク質の、ペリプラズムへの輸送を誘導するＰｅｌＢ配列。ＩＰＴＧによる添加時にＶＨＨタンパク質の誘導を可能にするＴ７プロモーター及びターミネーター、ならびにその間にあるｌａｃオペロン。それぞれ、抗生物質アンピシリン又はカナマイシンに対する耐性のためのアンピシリン又はカナマイシン耐性遺伝子。色素又はキナーゼ阻害剤等のペイロードを含む、準最終部分又はマレイミド修飾部分の部位選択的なコンジュゲーションに利用可能な１つの遊離Ｃ末端システインは、その１つである。ヒスチジン、ＥＰＥＡ又は他の親和性精製タグ及びトロンビン切断部位を使用して、必要に応じて精製タグを除去する。

（例３）：ＶＨＨドメインを含む単量体、二量体及び多量体結合分子の産生
大腸菌ＢＬ２１－ＤＥ３ Ｃｏｄｏｎｐｌｕｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を、ＶＨＨコードプラスミドＤＮＡ（例２）でヒートショック形質転換して、適切な抗生物質の存在下で成長させた。単一コロニーを採取及び使用して、２×ＹＴ（２％（ｗ／ｖ）グルコース、３５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した）１０ｍＬを接種して、接種した培地を、３７℃及び１８０ｒｐｍで一晩インキュベートした。次に、一晩の培養液を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＫＰＯ緩衝液１００ｍＬ、０．１％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリン又は３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを補充した）９００ｍＬ中で１／１００に希釈して、ＯＤ_６００が、０．５～０．８の値に達するまで、培養液を３７℃及び１８０ｒｐｍでインキュベートして、その後、１Ｍ ＩＰＴＧ １ｍＬを培養液に添加して、タンパク質産生を誘導して、インキュベーションを、２５℃及び１８０ｒｐｍで一晩続けた。培養液を、４℃にて４７００ｒｐｍで１５分間、遠心沈殿させることによって、細菌細胞を収集した後、ＰＢＳ中に細菌細胞を再懸濁した（細菌培養液８００ｍＬ当たりＰＢＳ ３０ｍＬ）。懸濁液を２回凍結融解することによって、ＶＨＨを含有するペリプラズム内容物を細胞から放出させて、その後、懸濁液を、４℃及び４７００ｒｐｍで遠心沈殿させた。Ｔａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（細菌培養液１Ｌ当たり０．７５ｍＬ）上での固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）精製を用いて、ＶＨＨを精製した。樹脂は、ＰＢＳで３回、予め洗浄し、その後、樹脂をペリプラズムに添加して、４℃及び１５ｒｐｍで３０分間インキュベートした。懸濁液を４℃及び９００ｒｐｍで３分間、遠心沈殿させることによって、樹脂をペリプラズムと分離させて、ＰＢＳ中の０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ２０で洗浄した後、ＰＢＳで２回の洗浄ステップを行った。続いて、樹脂を、Ｐｏｌｙ－Ｐｒｅｐクロマトグラフィカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）に添加して、続いて、非特異的に結合したタンパク質を、ＰＢＳ中の１５ｍＭイミダゾール溶液１ｍＬで予め溶出させ、その後、目的のタンパク質を、ＰＢＳ中の１５０ｍＭイミダゾール溶液で溶出させた。収集した画分のタンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００分光光度計（ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で２８０ｎｍ（１Ａｂ＝１ｍｇ／ｍＬで設定）にて測定し、ＶＨＨを含有する画分をプールして、３．５ｋＤａ ＭＷＣＯ ＳｎａｋｅＳｋｉｎ Ｄｉａｌｙｓｉｓチューブ（ＴｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、４℃で一晩、ＰＢＳ中の１ｍＭ ＴＣＥＰ－ＨＣｌの溶液に対して透析した。精製したタンパク質を分注して、－２０℃で保存した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで、およそ１５ＫＤａのはっきりした唯一のバンドによって明らかであるように、クローンは全て、首尾よく精製された。

（例４）：単量体ＶＨＨドメインの特性決定。
４．１ ＩＧＦ２Ｒ
１５個の特有のｈＩＧＦ２Ｒ結合剤（例１．１、図２）を、例２及び例３に記載されるように産生及び精製した。ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤに関する結合アッセイにより、見かけの親和性を決定した。簡潔に述べると、１μＭから始まって、３倍段階ＶＨＨ希釈物を、ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤでコーティングしたプレート上に添加した。２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄して、ＶＨＨ特異的ＩｇＧ抗体、続くＩＲＤ８００ＣＷコンジュゲートＩｇＧ特異的抗体を使用して、結合したＶＨＨを検出した。結合アッセイの結果を、図２に表示する。ＶＨＨ １３Ｆ１１もまた、Ｃ末端遊離システインを用いて産生し、マレイミド化学反応を使用して、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートした（図８Ａの１３Ｆ１１－Ａ６４７、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）。この構築物を用いた滴定ＥＬＩＳＡ（６４７ｎｍでの直接的な読取り）を、ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤに関して実行して、部位特異的コンジュゲーション後に、親和性が影響されるかどうかを決定した（図８Ｂ）。一部位特異的結合分析を使用して、Ｋ_Ｄ及びＢ_ｍａｘをＧｒａｐｈｐａｄ（バージョン８．３）において算出した（図８Ｃ）。１３Ｆ１１－Ａ６４７の算出した親和性は、１．００±０．６１ｎＭ（Ｋ_Ｄ±ＳＥＭ、ｎ＝２）であった。それは、コンジュゲートされてない１３Ｆ１１に関して算出された親和性（０．２３±０．０５ｎＭ（Ｋ_Ｄ±ＳＥＭ、ｎ＝２））よりもわずかに低い。これにより、Ｃ末端遊離末端への部位特異的コンジュゲーションは、親和性において、わずかな、しかし許容可能な減少を引き起こすことが示唆される。

４．１ ＰＤＧＦＲＢ
１８個の特有のｈＰＤＧＦＲＢ結合剤及び１１個の特有のｒＰＤＧＦＲＢ結合剤（例１．２、図５及び図６）を、例２及び例３に記載されるように産生及び精製して、それぞれ、ｈＰＤＧＦＲＢ－ＥＣＤ及びｒＰＤＧＦＲＢ－ＥＣＤに関する結合アッセイにより、見かけの親和性を決定した。結果は、それぞれ、ｈＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨ及びｒＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨに関して、図５及び図６に概要する。続いて、ＥＣＤに関して高い結合親和性を有するｈＰＤＧＦＲＢ及びｒＰＤＧＦＲＢ結合ＶＨＨを、それぞれ、図９Ａ及び図９ＢにおけるｈＰＤＧＦＲＢ及びｒＰＤＧＦＲＢをトランスフェクトしたＳＣＣ ＶＩＩ細胞に関する結合に関して検査した。さらに、ｈＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨヒトの結合親和性もまた、ヒト肝星細胞（ＨＳＣ）系ＬＸ－２で決定した（図５）。

（例５）：ビパラトピック結合分子の構築を可能にするための、非重複受容体エピトープへのＶＨＨ結合の決定
５．１ ＩＧＦ２Ｒ ＶＨＨ
１５個のｈＩＧＦ２Ｒ特異的結合剤のパネル（図２）から、ＶＨＨ １３Ａ８、１３Ａ１２、１３Ｃ１１、１３Ｅ８、１３Ｆ１１及び１３Ｇ１０を、さらなる特性決定用に選択した。競合アッセイを実施して、選択したＶＨＨが、ｈＩＧＦ２Ｒ上の別個のエピトープを認識するかどうかを決定した。このために、不飽和量（１０ｎＭ）の、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされた１３Ｆ１１（１３Ｆ１１－Ａ６４７、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）を、コンジュゲートされていない競合体（２５０ｎＭ）の存在下で、固定化ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤとともにインキュベートした（図１０）。１３Ｆ１１－Ａ６４７＋１３Ｆ１１とのｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤのインキュベーションを陽性対照として使用し、１３Ｆ１１－Ａ６４７のみとのｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤのインキュベーションを使用して、最大蛍光強度を定めた。ＶＨＨ １３Ａ８は、ＶＨＨ １３Ｆ１１との完全な競合を示し、これらの２つのＶＨＨが、重複エピトープを（少なくとも部分的に）認識することが実証された。他のＶＨＨのうち、１３Ｅ８のみが、１３Ｆ１１と競合せず、１３Ｆ１１及び１３Ｅ８は、非重複エピトープを認識することが実証された。したがって、２つのＶＨＨは、ビパラトピックＶＨＨ構築物に関する構成要素として適格である。

５．２ ＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨ
競合ＥＬＩＳＡを実行して、ｈＰＤＧＦＲＢ特異的結合剤（図５）及びｒＰＤＧＦＲＢ特異的結合剤（図６）が、それぞれ、ｈＰＤＧＦＲＢ又はｒＰＤＧＦＲＢ上の別個のエピトープを認識するかどうかを決定した。ｈＰＤＧＦＲＢ結合ＶＨＨ ＳＰ０２Ｐ、ＳＰ０５Ｐ、ＳＰ１２Ｐ及びＳＰ１４ＰならびにｒＰＤＧＦＲＢ結合剤ＳＰ２６Ｐを、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷにコンジュゲートして（ＶＨＨ－ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）、コンジュゲートされたＶＨＨをそれぞれ、３倍段階希釈で、コンジュゲートされてない競合体と混合して、固定化ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤに関してインキュベートした。コンジュゲートされていないＶＨＨの濃度が増加すると、ＶＨＨ－ＩＲＤｙｅ８００ＣＷの蛍光シグナルが減少する場合、２つのＶＨＨは、同じエピトープ（の一部）を共有している。ｈＰＤＧＦＲＢ結合ＶＨＨ及びｒＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨに関する競合アッセイによって決定されるエピトープを、それぞれ、図５及び図６に概要する。さらに、セクション５．１に記載されるのと類似した方法を使用して、ｈＰＤＧＦＲＢ結合ＶＨＨ ＳＰ０２Ｐと、ｒＰＤＧＦＲＢ結合ＶＨＨ ＳＰ２６Ｐとの間の結合エピトープ競合を実施した。２つのＶＨＨ間で、競合は観察されず、それらを、ビパラトピック結合分子用の構成要素として認定した。

（例６）：ビパラトピックＶＨＨの構築及び特性決定
６．１ ＩＧＦ２Ｒ
ＶＨＨ １３Ｆ１１及び１３Ｅ８は、非重複受容体エピトープに対するそれらの高い親和性及び結合に基づいて、ビパラトピック及び二価ＶＨＨ構築物の設計用に選択された。２つのＶＨＨを、３つのＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ反復からなる可撓性リンカーと融合させた（図８Ａ）。配列は、大腸菌における発現に関してコドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔからの合成ＤＮＡ断片として得られた。ＶＨＨをコードするＤＮＡ断片を、部位特異的コンジュゲーション用のＣ末端遊離システイン及びＩＭＡＣ精製用のＨｉｓ６タグを導入しているベクターｐＥＴ２８ベースのベクターにクローニングした（図８Ａ）。構築物を、例３に記載されるように、産生及び精製した。構築物を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートして（例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）、組換えｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤに関する滴定ＥＬＩＳＡ（例４．１に記載されるように）を実施して、Ｋ_Ｄ及びＢ_ｍａｘを決定した（一部位特異的結合分析を使用して、Ｇｒａｐｈｐａｄ（バージョン８．３）において算出した）（図８Ｃ）。１３Ｆ１１、１３Ｆ１１－１３Ｆ１１、１３Ｆ１１－１３Ｅ８及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１に関する、算出した親和性は、それぞれ、１．００±０．６１ｎＭ（Ｋ_Ｄ±ＳＥＭ、ｎ＝２）、３．１０±０．８７ｎＭ、２．５±１．８７ｎＭ及び２．５±１．５６ｎＭ（Ｋ_Ｄ±ＳＥＭ、ｎ＝２）である（図８Ｃ）。

１３Ｆ１１－１３Ｅ８が、ｒＩＧＦ２Ｒに対して交差反応性であるかどうかを決定するために、構築物を、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷにコンジュゲートして（１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）、ヒト又はラットＩＧＦ２Ｒのいずれかを過剰発現するＳＣＣ ＶＩＩ細胞に関する結合アッセイを使用して、結合親和性を決定した（図１２）。１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＩＲＤｙｅ８００ＣＷは、図１２に示されるように、匹敵する親和性（１０ｎＭ未満）で、ヒト及びラットＩＧＦ２Ｒの両方に結合し、これにより交差反応が確認される。

次に、１３Ｆ１１－１３Ｅ８を、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ（細菌アルブミン結合モジュールに関する構造、特異性、及び相互作用の機序（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ ｍｏｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｌｂｕｍｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅｓ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２（２７７）：８１１４－８１２０）に記載されるように、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）の形態で、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期延長剤を包含するように、遺伝的に再度操作し、続いて、例３に記載されるように、産生及び精製した。次に、１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤを、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷにコンジュゲートして（Ｆ１１Ｅ８－ＡＢＤ－ＩＲＤ８００、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）、ビパラトピックＶＨＨならびにＡＢＤ単位の結合親和性を決定した。Ｆ１１－Ｅ８－ＡＢＤ－ＩＲＤ８００に関して、ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤへの低ナノモル結合親和性が見られ、ＡＢＤドメインの付加が、ビパラトピックＦ１１－Ｅ８の、ｈＩＧＦ２Ｒへの結合に対して効果がないことを示した（図１３Ａ）。Ｆ１１－Ｅ８－ＡＢＤ－ＩＲＤ８００の、ラット血清アルブミン（ＲＳＡ）に対する結合親和性（Ｋ_Ｄ）は、３０ｎＭであり、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対して、結合親和性は、およそ２００ｎＭであった。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対して、結合は観察されなかった（図１３Ｂ）。

構築物を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８にコンジュゲートすること（ＦＥ－Ａ－Ａ４８８、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）によって、初代活性化ラット肝星細胞（ＨＳＣ）への結合実験において、Ｆ１１－Ｅ８－ＡＢＤの交差反応性をさらに評価した。活性化ＨＳＣは、硬変胆管結紮（ＢＤＬ）ラットの灌流肝臓から得られ、ＨＳＣは、密度勾配遠心分離を使用して単離した。細胞を培養液中に６日間保持して、完全な活性化を可能にし、続いて、５０ｎＭ ＦＥ－Ａ－Ａ４８８で染色した。アルファ－平滑筋アクチン（ａ－ＳＭＡ）を用いたさらなる染色によって、活性化を決定した。ＦＥ－Ａ－Ａ４８８は、図１４において見られるように、ラットＨＳＣに結合し、長アクチンポリマー、又はいわゆるストレスファイバーの存在によって、活性化が確認された（図１４）。

６．２ ＰＤＧＦＲＢ
ＶＨＨ ＳＰ０２Ｐ、ＳＰ１２Ｐ、ＳＰ１４Ｐ及びＳＰ２６Ｐは、非重複ｈＰＤＧＲＢエピトープに対するそれらの高い親和性及び結合に基づいて、ビパラトピックＶＨＨ構築物の設計用に選択され、例６．１に記載されるのと類似した方法で産生された（図１５Ａ）。ビパラトピック構築物の結合親和性を、ペリプラズムを用いたＥＬＩＳＡアッセイで決定した（図１５Ａ）。ＶＨＨ ＳＰ２６Ｐ及びＳＰ２８Ｐは、非重複ｒＰＤＧＲＢエピトープに対するそれらの高い親和性及び結合に基づいて、ビパラトピックＶＨＨ構築物の設計用に選択され、例６．１に記載されるのと類似した方法で産生された。生成されたビパラトピックＳＰ２８Ｐ－ＳＰ２６Ｐを、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷにコンジュゲートして（ＳＰ２８Ｐ－ＳＰ２６Ｐ－ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）、ｈＰＤＧＦＲＢ、ｒＰＤＧＦＲＢ又はｈＩＧＦ２ＲをトランスフェクトしたＳＳＣ ＶＩＩ細胞に関する結合アッセイに供した（図１５Ｂ）。構築物は、ｒＰＤＧＦＲＢに対して非常に高い親和性を示した（１ｎＭ未満のＫ_Ｄ）一方で、ｈＰＤＧＦＲＢに対する結合親和性は、数桁低い。ｈＰＤＧＦＲＢ及びｒＰＤＧＦＲＢに関して交差反応性であるビパラトピックＶＨＨ構築物を創出するために、ｈＰＤＧＦＲＢへのＶＨＨ ＳＰ０２Ｐ結合及びｒＰＤＧＦＲＢへのＶＨＨ ＳＰ０２６Ｐ結合を選択して、ビパラトピック構築物ＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐを、例６．１に記載されるのと類似した方法で産生した（図１５Ｃ）。構築物ＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐを、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷにコンジュゲートして（ＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐ－ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）、ｈＰＤＧＦＲＢ、ｒＰＤＧＦＲＢ又はｈＩＧＦ２ＲをトランスフェクトしたＳＳＣ ＶＩＩ細胞に関する結合アッセイに供した（図１５Ｃ）。ｈＰＤＧＦＲＢ及びｒＰＤＧＦＲＢの両方に対する結合親和性は、５ｎＭ未満であり、本発明の結合分子における使用にとくに有望であるビパラトピックＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐを作製する。

（例７）：アルブミン結合ドメインの付加による１３Ｆ１１－１３Ｅ８の、ラットにおけるｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態の改善
１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤのｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態特性を、健常なスプラーグドーリーラットにおいて、ＡＢＤ部分を有さない１３Ｆ１１－１３Ｅ８と比較した。簡潔に述べると、ラットに、およそ３ｍｇ／ｋｇ（体重）で静脈内投薬して、血液試料を、種々の時点で採取して、固定化ｈＩＧＦ２Ｒ－ＥＣＤに関してＥＬＩＳＡを使用して、ＶＨＨ構築物の濃度を決定した。１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤピーク血清レベル（Ｃ_ｍａｘ）は、図１３Ｃに示されるように１０００ｎＭを上回った。およそ２０ナノモルを動物に注入して、推定血清容量１０ｍＬで、このＣ_ｍａｘは、注入した用量のおよそ５０％に相当し、注入した用量の５０％が、投薬後の１時間、循環中に依然として存在しており、良好なバイオアベイラビリティを示した。他方で、１３Ｆ１１－１３Ｅ８は、循環から迅速に浄化され、注射後２時間以内にはもう、検出することができなかった（図１３Ｃ）。

（例８）：小分子キナーゼ阻害剤：Ｙ２７６３２、パクリチニブ、サクビトリル（ａｔ）、ロサルタンを用いた場合の、Ｌｘ準最終複合体及びマレイミド官能基化部分の合成、ならびに分析による特性決定
８．１．本発明の状況で利用することができるＹ２７６３２－Ｌｘ（準最終部分）ＳＦＭ及びＹ２７６３２マレイミド官能基化部分の構造

８．１．１．Ｙ２７６３２－Ｌｘ－Ｃｌ（１ａ）の合成、及び分析による特性決定

ＡｇＮＯ_３（８５ｍｇ、５００μｍｏｌ、１．０当量）を、乾燥ＤＭＦ（２４．８ｍＬ）中のＰｔＣｌ_２（エタン－１，２－ジアミン）（ＬｘＣｌ_２；１６３ｍｇ、５００μｍｏｌ、１．０当量）の懸濁液に添加した。混合物を、暗所にてアルゴン雰囲気下で、室温で一晩攪拌した。その後、懸濁液を、０．２μｍのシリンジフィルターに通して濾過して、活性化Ｐｔ錯体の２０．２ｍＭストック溶液を得た。次に、ＭｉｌｌｉＱ水（１４ｍＬ）中のＹ２７６３２×２ＨＣｌ（４０ｍｇ、１２５μｍｏｌ、１．０当量）の溶液（１Ｍ ＮａＯＨを使用して、ｐＨを６．９５に調節した）に、上記で調製した、活性化Ｐｔ錯体の２０．２ｍＭのストック溶液（１２．４ｍＬ、２５０μｍｏｌ、２．０当量）を添加した。反応混合物を、暗所にてアルゴン雰囲気下で、６０℃で４．５時間攪拌した。続いて、反応混合物を、０．２μｍフィルターに通して濾過して、０．９％ＮａＣｌを溶液に添加して（１ｍＬ）、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、ＭｉｌｌｉＱ水／ＭｅＯＨ（８５：１５、６ｍＬ）中に溶解して、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：３６分以内に１５％～３５％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＯＨ／０．１％ＴＦＡ）によって実施した。生成物画分を凍結乾燥して、無色固体として、生成物１ａが得られた（４１．８ｍｇ、収率４３．８％）。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 8.57 - 8.47 (m, 2 H), 7.74 - 7.68 (m, 2 H), 6.09 - 5.78 (m, 2 H), 5.72 - 5.40 (m, 2 H), 3.21 - 3.11 (m, 1 H), 2.80 - 2.51 (m, 4 H), 2.48 - 2.37 (m, 1 H), 2.10 - 2.01 (m, 2 H), 1.98 - 1.84 (m, 2 H), 1.67 - 1.51 (m, 3 H), 1.32 - 1.15 (m, 5 H).
¹⁹⁵Pt NMR (86.0 MHz, CD₃OD): δ -2512.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９５．６％純粋であることが示された（保持時間１５．８分；勾配：１８分以内に５％～２５％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．１．２．Ｙ２７６３２－Ｌｘ－Ｉ（１ｃ）の合成、及び分析による特性決定

ＭｉｌｌｉＱ水（１２５μＬ）中のＹ２７６３２×２ＨＣｌ（１０ｍｇ、３１μｍｏｌ、１．０当量）及びＰｔ（エタン－１，２－ジアミン）Ｉ_２（ＬｘＩ_２；１４．９０ｍｇ、２９μｍｏｌ、０．９５当量）を、乾燥ＤＭＦ（２５０μＬ）中に溶解して、反応混合物を、６０℃で４８時間振盪した。次に、反応混合物を、ＭｉｌｌｉＱ／ＭｅＯＨ（１：１、３ｍＬ）中の１０ｍＭ ＮａＩで希釈して、２５℃で１時間インキュベートし、その後、懸濁液を、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：４０分以内に１５％～５０％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ））によって実施した。生成物含有画分を収集して、凍結乾燥して、黄色固体として、生成物１ｃが得られた（１１．０ｍｇ、収率４１．１％）。
HRMS (ESI⁺) C₁₆H₂₉N₅OPt [M+H]⁺ 629.1065, 実測値629.1092.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９９．１％純粋であることが示された（保持時間１３．３分；勾配：２０分以内に５％～５０％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．１．３．Ｍａｌ－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－Ｙ２７６３２（１ｅ）の合成、及び分析による特性決定

Ｙ２７６３２×２ＨＣｌ（１８ｍｇ、５６μｍｏｌ、１．０当量）、Ｍａｌ－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（４９ｍｇ、５６μｍｏｌ、１．０当量）及びトリエチルアミン（１９．６μＬ、１１２μｍｏｌ、２．０当量）を、乾燥ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を、２５℃で４５分間攪拌した。次に、反応混合物を、ＭｉｌｌｉＱ／ＭｅＯＨ（１：１、３ｍＬ）で希釈して、その後、懸濁液を、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：８０分以内に２０％～４０％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ））によって実施した。生成物含有画分を収集して、凍結乾燥して、黄色固体として、生成物１ｅが得られた（２２．３ｍｇ、収率３６．３％）。
HRMS (ESI⁺) C₄₈H₇₀N₉O₁₃[M+H]⁺ 980.5088, 実測値980.5093.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９７．１％純粋であることが示された（保持時間１０．１分；勾配：２０分以内に２０％～１００％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．１．４．Ｍａｌ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－Ｙ２７６３２（１ｆ）の合成、及び分析による特性決定

Ｙ２７６３２×２ＨＣｌ（２０ｍｇ、６２μｍｏｌ、１．０当量）、Ｍａｌ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＰＮＰ（４８ｍｇ、６６μｍｏｌ、１．０５当量）及びトリエチルアミン（２２．２μＬ、１２５μｍｏｌ、２．０当量）を、乾燥ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解し、反応混合物を、２５℃で４５分間攪拌した。次に、反応混合物を、ＭｉｌｌｉＱ／ＭｅＯＨ（１：１、３ｍＬ）で希釈して、その後、懸濁液を、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：８０分以内に２０％～４０％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ））によって実施した。生成物含有画分を収集して、凍結乾燥して、黄色固体として、生成物１ｆが得られた（２３．５ｍｇ、収率３９．２％）。
HRMS (ESI⁺): C₄₃H₆₀N₉O₉[M+H]⁺ 846.4509, 実測値846.4472.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９５．６％純粋であることが示された（保持時間１０．５分；勾配：２０分以内に２０％～１００％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．２．本発明の状況で利用することができるサクビトリル－Ｌｘ ＳＦＭの構造

８．２．１．サクビトリル－ｐｙ－Ｌｘ－Ｉ（２ｃ）の合成、及び分析による特性決定

８．２．１．１．サクビトリル－ｐｙの合成、及び分析による特性決定

サクビトリルヘミカルシウム（１００ｍｇ、０．２３２ｍｍｏｌ、１．０当量）、ピリジン－４－イルメタノール（３０ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＤＭＡＰ（３ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、０．１当量）を、乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中に溶解した。続いて、ＥＤＣ×ＨＣｌ（６７ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ、１．５当量）及びさらなるＤＭＦ（０．５ｍＬ）を添加した。得られた混合物を、アルゴン雰囲気下で、室温で４日間攪拌した。反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈して、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて、濾過して、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、シリカによるカラムクロマトグラフィによって精製し（溶離液：０～３％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）、無色固体を得た（７３ｍｇ、収率６２．４％）。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.58 (d, 2 H), 7.60 - 7.54 (m, 2 H), 7.54 - 7.49 (m, 2 H), 7.46 - 7.40 (m, 2 H), 7.37 - 7.30 (m, 1 H), 7.27 - 7.22 (m, 4 H), 5.62 (d, 1 H), 5.13 (s, 2 H), 4.31-4.19 (m, 1 H), 4.13 (q, 2 H), 2.89 - 2.80 (m, 2 H), 2.76 - 2.69 (m, 2 H), 2.66 - 2.50 (m, 2 H), 2.49 - 2.42 (m, 2 H), 1.99-1.90 (m, 1 H), 1.59-1.49 (m, 1 H), 1.24 (t, 3 H), 1.16 (d, 3 H).
HRMS (ESI⁺) C₃₀H₃₅N₂O₅[M+H]⁺ 計算値503.2540, 実測値503.2599.

８．２．１．２．サクビトリル－ｐｙ－Ｌｘ－Ｉ（２ｃ）の合成、及び分析による特性決定

Ｐｔ（エタン－１，２－ジアミン）Ｉ_２（ＬｘＩ_２；７６．０ｍｇ、１４９．２μｍｏｌ、５当量）を、乾燥ＤＭＦ（２００μＬ）中のサクビトリル－ｐｙ（１５．０ｍｇ、２９．８μｍｏｌ、１．０当量）の溶液中に溶解して、反応混合物を、２５℃で２２時間振盪した。次に、反応混合物を、水／ＭｅＯＨ（１：１、３ｍＬ）で希釈して、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：４０分以内に４５％～１００％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ））によって実施した。生成物含有画分を収集して、凍結乾燥して、黄色固体を得た（１４ｍｇ、収率４７．０％）。
HRMS (ESI⁺) C₃₂H₄₂IN₄O₅ ¹⁹⁵Pt [M]⁺ 計算値884.1845, 実測値884.1856.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９５．８％純粋であることが示された（保持時間１５．９分；勾配：２０分以内に２０％～１００％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．２．２．サクビトリル－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ－ｐｙ－Ｌｘ－Ｉ（２ｏ）の合成、及び分析による特性決定

８．２．２．１．２，３，５，６－テトラフルオロフェニル３－（ピリジン－４－イル）プロパノエートの合成、及び分析による特性決定

３－（ピリジン－４－イル）プロピオン酸（５００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．０当量）、２，３，５，６－テトラフルオロフェノール（６０４ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ、１．１当量）及びＥＤＣ×ＨＣｌ（７６１ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ、１．２当量）を、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した。得られた混合物を、室温で１６時間攪拌した。続いて、混合物を、０．１Ｍ ＨＣｌ（２回）、食塩水（１回）で抽出して、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させて、その後、溶媒を減圧下で除去した。反応により、白色固体が得られた（５３０ｍｇ、収率４７．７％）。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.49 (m, 2 H), 7.91 (m, 1 H), 7.35 (d, 2 H), 3.21 (t, 2 H), 3.02 (t, 2 H).

８．２．２．２．Ｎ－（ヒドロキシエチル）－３－（ピリジン－４－イル）プロパンアミドの合成、及び分析による特性決定

３－（ピリジン－４－イル）プロピオン酸－ＴＦＰ（４７８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．０当量）、２－アミノ－エタノール（９８ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＩＰＥＡ（２２２μＬ、１．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した。得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。続いて、溶媒を減圧下で除去して、残渣を、シリカによるカラムクロマトグラフィによって精製し（溶離液：０～３％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）、無色固体を得た（２６０ｍｇ、収率８３．３％）。
¹H NMR (400 MHz, CD₃OD): δ 8.36 - 8.44 (m, 2 H), 7.31 (d, 2 H), 3.54 (t, 2 H), 3.26 (t, 2 H), 2.97 (t, 2 H), 2.55 (t, 2 H).

８．２．２．３．サクビトリル－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ－ｐｙの合成、及び分析による特性決定

サクビトリルヘミカルシウム（２００ｍｇ、０．４８７ｍｍｏｌ、１．０当量）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－３－（ピリジン－４－イル）プロパンアミド（１１４ｍｇ、０．５８４ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＤＭＡＰ（６ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ、０．１当量）を、乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中に溶解した。続いて、ＥＤＣ×ＨＣｌ（１４０ｍｇ、０．７５１ｍｍｏｌ、１．５当量）及びさらなるＤＭＦ（０．５ｍＬ）を添加した。得られた混合物を、アルゴン雰囲気下で、室温で２０時間攪拌した。反応混合物を水（２０ｍＬ）で希釈して、ＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させて、濾過して、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、シリカによるカラムクロマトグラフィによって精製し（溶離液：０～５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）、無色固体を得た（９９ｍｇ、収率３３．５％）。
HRMS (ESI⁺) C₃₅H₄₁IN₃O₆ [M+H]⁺ 計算値588.3068, 実測値588.3083.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が１００％純粋であることが示された（保持時間１４．０分；勾配：２０分以内に２０％～１００％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．２．２．４．サクビトリル－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ－ｐｙ－Ｌｘ－Ｉ（２ｏ）の合成、及び分析による特性決定

Ｐｔ（エタン－１，２－ジアミン）Ｉ_２（ＬｘＩ_２；３４．６ｍｇ、２７２．８μｍｏｌ、４．０当量）を、乾燥ＤＭＦ（４１６μＬ）中のサクビトリル－ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＣＯ－ｐｙ（４０．０ｍｇ、６８．２μｍｏｌ、１．０当量）の溶液中に溶解して、反応混合物を、５０℃で２７時間振盪した。次に、反応混合物を、水／ＭｅＯＨ（１：１、３ｍＬ）で希釈して、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：４０分以内に６５％～９０％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ））によって実施した。生成物含有画分を収集して、凍結乾燥して、黄色固体を得た（２６．７ｍｇ、収率３６．２％）。
HRMS (ESI⁺) C₃₆H₄₉IN₅O₆ ¹⁹⁵Pt [M]⁺ 計算値969.2370, 実測値969.2388.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９６．４％純粋であることが示された（保持時間１５．２分；勾配：２０分以内に２０％～１００％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．３．本発明の状況で利用することができるパクリチニブ－Ｌｘ ＳＦＭ及びマレイミド官能基化パクリチニブ部分の構造

８．３．１．パクリチニブ－Ｌｘ－Ｉ（３ｃ）の合成、及び分析による特性決定

パクリチニブ（２０ｍｇ、４２．３μｍｏｌ、１当量）及びＰｔ（エタン－１，２－ジアミン）Ｉ_２（ＬｘＩ_２；９６．９ｍｇ、１９０．４μｍｏｌ、４．５当量）を、乾燥ＤＭＦ（２５０μＬ）中に溶解して、反応混合物を、６０℃で４８時間振盪した。次に、反応混合物を、水／ＭｅＯＨ（１：１、３ｍＬ）で希釈して、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：４０分以内に４５％～８０％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＯＨ（＋０．１％ＴＦＡ））によって実施した。生成物含有画分を収集して、凍結乾燥して、黄色固体として、化合物３ｃが得られた（１３．１ｍｇ、収率２８．６％）。
HRMS (ESI⁺) C₃₀H₄₁IN₆O₃ ¹⁹⁵Pt [M]²⁺ 計算値427.5962, 実測値427.5999.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９２．７％純粋であることが示された（保持時間１０．７分；勾配：２０分以内に２０％～１００％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．３．２．Ｍａｌ－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－パクリチニブ（３ｅ）の合成、及び分析による特性決定

８．３．２．１．Ｍａｌ－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－Ｃｌの合成、及び分析による特性決定

Ｍａｌ－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＯＨ（１０ｍｇ、１４．２μｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（２００μＬ）中に溶解して、氷／水浴中で０℃に冷却した。続いて、塩化チオニル（１．９ｍｇ、１５．６μｍｏｌ、１．１当量）を添加して、混合物を、０℃で１５分間攪拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。
HRMS (ESI⁺) C₃₃H₄₉ ³⁵ClN₆O₁₀[M+H] ⁺ 計算値725.3271, 実測値725.3298.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９０％を上回って純粋であることが示された（保持時間９．６分；勾配：２０分以内に２０％～５０％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）。波長２７３ｎｍで測定した）。

８．３．２．２．Ｍａｌ－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－パクリチニブ（３ｅ）の合成、及び分析による特性決定

パクリチニブ（６．７ｍｇ、１４．２μｍｏｌ、１．０当量）を、ＤＭＦ（３００μＬ）中に溶解して、Ｍａｌ－ＰＥＧ_４－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－Ｃｌ（１０．３ｍｇ、１４．２μｍｏｌ、１．０当量）に添加した。続いて、ＤＩＰＥＡ（４．６ｍｇ、３５．５μｍｏｌ、２．５当量）及びヨウ化テトラブチルアンモニウムを添加して（１．０ｍｇ、２．８μｍｏｌ、０．２当量）、混合物を、６０℃で２４時間攪拌した。生成物生成は、ＨＲＭＳによって確認した。
HRMS (ESI⁺) C₆₁H₈₁N₁₀O₁₃[M+H] ⁺ 計算値1161.5979, 実測値1161.5886.

８．４．本発明の状況で利用することができるロサルタン－Ｌｘ ＳＦＭの構造

８．４．１．ロサルタン－Ｌｘ－Ｃｌ（４ａ）の合成、及び分析による特性決定

ＡｇＮＯ_３（２６．１ｍｇ、１５３．３μｍｏｌ、１．０当量）を、乾燥ＤＭＦ（８．３ｍＬ）中のＰｔＣｌ_２（エタン－１，２－ジアミン）（ＬｘＣｌ_２；５０ｍｇ、１５３．３μｍｏｌ、１．０当量）の懸濁液に添加して、暗所にてアルゴン雰囲気下で、室温で一晩攪拌した。次に、懸濁液を、０．２μｍのシリンジフィルターに通して濾過して、活性化Ｐｔ錯体の１８．５ｍＭストック溶液を得た。続いて、乾燥ＤＭＦ（５００μＬ）中のロサルタンカリウム（２０ｍｇ、４３．４μｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、上記で調製した、活性化Ｐｔ錯体の１８．５ｍＭのストック溶液（１．７６ｍＬ、３２．５μｍｏｌ、０．７５当量）を添加した。反応混合物を、２２℃で１．５時間攪拌した。続いて、１Ｍ ＨＣｌ（７０．４μＬ、２当量）及び０．９％ＮａＣｌ（１ｍＬ）を混合物に添加して、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、ＭｉｌｌｉＱ水／ＭｅＯＨ（１：１、３ｍＬ）中に溶解して、０．２μｍシリンジフィルターに通して濾過した。精製は、分取用逆相ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２２×２５０ｍｍ；勾配：４０分以内に２０％～５０％のＢ、但し、溶離液Ａ：９５／５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ）及び溶離液Ｂ：５／９５の水／ＭｅＣＮ（＋０．１％ＴＦＡ））によって実施した。生成物含有画分を凍結乾燥して、無色固体として、生成物４ａが得られた（１１ｍｇ、収率４７．４％）。
HRMS (ESI⁺) C₂₄H₃₁ ³⁵Cl₂N₈O¹⁹⁵Pt [M]⁺ 計算値712.1641, 実測値712.1628.

ＨＰＬＣ（Ｇｒａｃｅ Ａｌｌｔｉｍａ Ｃ１８ ５μｍカラム、２５×４．６ｍｍ）により、生成物が９４．３％純粋であることが示された（保持時間９．６分；勾配：１８分以内に５％～２５％の水／０．１％ＴＦＡ中のＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ。波長２７３ｎｍで測定した）。

（例９）：準最終複合体及びマレイミド官能基化部分の、本発明の結合分子へのコンジュゲーション。
９．１．Ｌｘ ＳＦＭの、結合分子へのコンジュゲーション
ビパラトピック１３Ｆ１１－１３Ｅ８（分子量およそ２７．９ｋＤ、１０５μＬ、５ｎｍｏｌ、１．３３ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、ホウ酸緩衝液（２０μＬ、２５０ｍＭホウ酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ８．０）及びＨ_２Ｏ（２００μＬ）で希釈して、その後、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の溶液（ＴＣＥＰ×ＨＣｌ；２μＬ、Ｈ_２Ｏ中に１０ｍＭ、１０ｎｍｏｌ、２．０当量）を添加した。混合物を、サーモシェーカーにおいて、３７℃で２時間インキュベートした。同時に、ＳＦＭ １ｃの溶液（１０μＬ、２０ｍＭ ＮａＩ中に５ｍＭ、５０ｎｍｏｌ、１０．０当量）を、チオ尿素の水溶液（１０μＬ、２０ｍＭ）と混合して、サーモシェーカーにおいて、３７℃で２時間インキュベートした。続いて、上記で調製した、本発明の結合分子及びチオ尿素で処置したＳＭＦの溶液を混合して、サーモシェーカーにおいて、３７℃で１時間インキュベートした。コンジュゲートを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターを使用したスピン濾過によって精製して（ＰＢＳで４回洗浄）、その後、コンジュゲートを、ＰＢＳ中で復元及び保存した。Ｙ２７６３２対１３Ｆ１１－１３Ｅ８比は、ＳＥＣ－ＭＳによって決定される場合、１．０であった。

９．２．マレイミド官能基化部分の、結合分子へのコンジュゲーション
ビパラトピック１３Ｆ１１－１３Ｅ８（分子量およそ２７．９ｋＤ、１０５μＬ、５ｎｍｏｌ、１．３３ｍｇ／ｍＬ、１．０当量）を、ホウ酸緩衝液（２０μＬ、２５０ｍＭホウ酸ナトリウム、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭジエチレントリアミン五酢酸、ｐＨ８．０）及びＨ_２Ｏ（２００μＬ）で希釈して、その後、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩の溶液（ＴＣＥＰ×ＨＣｌ；２μＬ、Ｈ_２Ｏ中に１０ｍＭ、１２０ｎｍｏｌ、２．０当量）を添加した。混合物を、サーモシェーカーにおいて、３７℃で２時間インキュベートした。続いて、上記で調製した、本発明の結合分子の溶液を、マレイミド官能基化部分１ｅ（２．５μＬ、ＤＭＳＯ中に１０ｍＭ、５０ｎｍｏｌ、１０．０当量）と混合して、０℃で１時間インキュベートした。コンジュゲートを、１０ｋＤａ ＭＷＣＯフィルターを使用したスピン濾過によって精製して（ＰＢＳで４回洗浄）、その後、コンジュゲートを、ＰＢＳ中で復元及び保存した。Ｙ２７６３２対１３Ｆ１１－１３Ｅ８比は、ＳＥＣ－ＭＳによって決定される場合、１．０であった。

（例１０）：ＶＨＨの内在化
１０．１ ＩＧＦ２Ｒ ＶＨＨ
一価１３Ｆ１１及びビパラトピック１３Ｆ１１－１３Ｅ８が、ｈＩＧＦ２Ｒ発現細胞において内在化されるかどうかを評価するために、Ａ５４９細胞（図１６Ａ）及びｈＩＧＦ２Ｒを一過的にトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２細胞（図１６Ｂ）を、ＡＬｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされた２５ｎＭ ＶＨＨ（例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）とともにインキュベートした。ｈＩＧＦ２Ｒトランスフェクト細胞ＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２でのＩＧＦ２Ｒ発現を検出するために、マウス抗ＩＧＦ２Ｒ ｍＡｂが包含され（図１６Ｂ、右の欄）、ｍＡｂは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５にコンジュゲートされたヤギ抗マウスｍＡｂで検出された。さらに、偽トランスフェクトＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２細胞を、１３Ｆ１１及び１３Ｆ１１－１３Ｅ８とともにインキュベートした（図１６Ｃ）。確実に内在化されたＶＨＨ又はマウス抗ＩＧＦ２Ｒのシグナルのみが存在することを確実にするために、酸洗浄（０．２Ｍグリシン－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ２．３）を使用して、細胞表面上の標的受容体に結合したＶＨＨ又はマウス抗ＩＧＦ２Ｒを除去した。ｈＩＧＦ２ＲトランスフェクトＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２細胞を、氷上で１３Ｆ１１－１３Ｅ８－Ａ６４７とインキュベートすることと、続いて、これらの細胞を、氷上に残したまま、酸洗浄で処置して、内在化を防止することとによって、酸洗浄手順の効率を検証した（図１０Ｄ）。ビパラトピック１３Ｆ１１－１３Ｅ８は、Ａ５４９細胞において明らかに内在化したのに対して、一価１３Ｆ１１に関しては、内在化は観察されなかった（図１６Ａ）。他方で、ＶＨＨはともに、ｈＧＦ２Ｒを一過的にトランスフェクトしたＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２細胞では内在化しなかったが、１３Ｆ１１－１３Ｅ８に関しては、より高い強度の染色が観察された（図１６Ｂ）。内在化の差は、おそらく標的細胞上のＩＧＦ２Ｒ発現レベルの差に関係している。予想通り、ＶＨＨ構築物はともに、偽トランスフェクトＮＩＨ ３Ｔ３ ２．２細胞では内在化しなかった（図１６Ｃ）。酸洗浄対照実験により、酸洗浄処置は、膜結合性ＶＨＨ全てを除去するのに十分であることが示された（図１６Ｄ）。まとめると、ビパラトピック１３Ｆ１１－１３Ｅ８は、細胞表面上でｈＩＧＦ２Ｒを発現する細胞において、明らかに内在化する。

ビパラトピック構築物１３Ｆ１１－１３Ｅ８及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１の内在化速度（エンドサイトーシス速度定数、ｋ_ｅ）を、ｈＩＧＦ２Ｒ及びｒＩＧＦ２ＲをトランスフェクトしたＳＣＣ－ＶＩＩ細胞に関する動力学的内在化アッセイを用いて決定した。簡潔に述べると、１０ｎＭのＩＲＤ８００ＣＷコンジュゲート１３Ｆ１１－１３Ｅ８又は１３Ｅ８－１３Ｆ１１（例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）を、ｈＩＧＦ２Ｒ発現ＳＣＣ細胞又はｒＩＧＦ２Ｒ発現ＳＣＣ細胞に添加して、３７℃で、種々の時点から最大１２分までの間、インキュベートした。次に、細胞を氷上に置くことによって、内在化を意図的に停止させた。続いて、細胞を冷ＰＢＳで洗浄して、上述するように、内在化しないＶＨＨ構築物（結合した画分）を、酸洗浄を使用して、内在化した構築物（内部移した画分）と分離して、その後、両方の画分の蛍光を測定した。構築物はともに、ｈＩＧＦ２Ｒ発現ＳＣＣ細胞において、類似したエンドサイトーシス速度定数（ｋ_ｅおよそ１．５分^－１）で内在化する（図１７）。経時的な蛍光の明らかな増加が、図１７において示され得るように、ｒＩＧＦ２Ｒ発現ＳＣＣ細胞においても、内在化が観察された（ｋ_ｅおよそ０．７分^－１）。

生存活性化ＨＳＣ ＬＸ－２における一価１３Ｆ１１ならびにビパラトピック１３Ｆ１１－１３Ｅ８及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１の内在化を、ｐＨｒｏｄｏ ｐＨ依存性プローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して可視化した。ｐＨプローブは、周囲のｐＨが結果的に減少するため、より蛍光性になっている。エンドソーム及びリソソームは、細胞質ｐＨ７．０と比較して、それぞれ、６．５及び４．５で維持されたｐＨを有し、したがって、ＶＨＨ－ｐＨｒｏｄｏ構築物の内在化は、それが、エンドソーム経路を介して内在化する場合に可視化させることができる。ＬＸ－２細胞を、５０ｎＭのｐＨｒｏｄｏ－ｒｅｄコンジュゲート１３Ｆ１１、１３Ｆ１１－１３Ｅ８及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１（例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）とともに、３７℃で２時間インキュベートした。ｍＣｈｅｒｒｙフィルター及び４０倍の油対物レンズを備えた広視野ＰＥＸＳｃｏｐｅ顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ社）を使用して、５分間隔で、画像を撮った。一価構築物と比較して、ビパラトピック構築物１３Ｆ１１－１３Ｅ８及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１の両方に関して、より顕著な細胞内蛍光の増加が、１５分以降観察された（図１８）。ビパラトピック１３Ｆ１１－１３Ｅ８は、１３Ｅ８－１３Ｆ１１と比較して、４０分の期間にわたって、蛍光のより高い増加を示し、内在化のより高い速度を示している。さらに、内在化された１３Ｆ１１－１３Ｅ８及び１３Ｅ８－１３Ｆ１１は、核周囲の区画（エンドソーム／リソソーム）に蓄積する。

１０．２．ＰＤＧＦＲＢ ＶＨＨ
ＶＨＨ構築物ＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐの内在化の速度を決定するために、例１０．１においてＩＧＦ２Ｒ構築物に関して記載するのと類似した方法を使用して、ｈＰＤＧＦＲＢ発現ＳＣＣ細胞及びＬＸ－２細胞に関する動力学的内在化アッセイを実施した。ＳＰ０２Ｐ－ＳＰ２６Ｐの内在化は、ｈＰＤＧＦＲＢ発現ＳＣＣ細胞及びＬＸ－２細胞の両方において観察された（図１９）。

（例１１）：ＮＤＣ－Ｌｘ－パクリチニブは、収縮アッセイにおいて、活性化された肝星細胞（ＨＳＣ）の弛緩を誘導する。
ＪＡＫ２阻害剤パクリチニブ（３ｃ）にコンジュゲートされたビパラトピックＶＨＨ １３Ｆ１１－１３Ｅ８（例９．１に記載されるようなコンジュゲーション方法）の弛緩効力を、ヒトＨＳＣ系ＬＸ－２を用いた収縮アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。２４ウェルプレートのウェルに、ＢＳＡ ０．５ｍＬを充填して、３７℃で１時間放置して、その後、ウェルをＰＢＳで洗浄して、乾燥させた。続いて、１Ｍ ＮａＯＨ、１０×ＰＢＳ、滅菌水、２×ＤＭＥＭ、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ及び１ｍｇ／ｍＬ Ｉ型コラーゲンの混合物をウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートして、コラーゲンをゲル化させた。アッセイの２４時間前に、培地を、２％ ＦＢＳを補充したＤＭＥＭと置き換えたＬＸ－２細胞を収集して、培地（ＤＭＥＭ中の２％ＦＣＳ）１ｍＬ当たり２×１０^５個の細胞で再懸濁して、５００μｌをゲルに添加して、３７℃で３時間インキュベートした。細胞をコラーゲンゲルに結合した後、培地を除去して、１μＭ １３Ｆ１１－１３Ｅ８－Ｌｘ－パクリチニブ、１μＭ １３Ｆ１１－１３Ｅ８－Ｃｙ５（例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法、陰性対照）又は１μＭ 収縮阻害剤２，３－ブタンジオンモノキシム（ＢＤＭ、陽性対照）を有する新鮮な培地５００μｌと置き換えた。ピペットチップ又はスパチュラを縁周辺で動かすことによって、コラーゲンゲルを、ウェルの側面から剥離させ、細胞を、３７℃で最大７日間インキュベートした。２４時間毎に、カメラ（ＪＡＩ ＣＶ－Ａ５５－ＩＲ）を用いて、固定の距離又は高さでコラーゲンゲルの写真を撮った。コラーゲンのゲルの面積を、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（ＣＣ ２０１７）を使用してピクセルで定量化した。０％収縮阻害のいかなる阻害剤も用いずにインキュベートされたゲル、及び１００％収縮阻害の１μＭ ＢＤＭ（陽性対照）でインキュベートしたゲルを設定して、収縮阻害のパーセントを定量化した。構築物１３Ｆ１１－１３Ｅ８－Ｌｘ－パクリチニブは、最大７６％、収縮阻害を誘導することが可能であったのに対して、キナーゼ阻害剤を備えていないナノボディ構築物（１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ｍａｌ－Ｃｙ５）は、収縮を阻害しなかった（図２０）。

（例１２）：硬変肝切片におけるターゲティングされたＩＧＦ２Ｒの発現
ＩＧＦ２Ｒ受容体発現が、硬変肝においてアップレギュレートされるかどうかを評価するために、健常（ＳＨＡＭ）及び硬変（ＢＤＬ）ラットの両方から得られる組織（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、回腸、脳）の各種凍結切片（例１３に概要されるような調製手順）を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされた１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ（１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ－Ａ６４７、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）で染色した。凍結切片化後、組織切片を、５０ｎＭ蛍光１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ－ＡＦ６４７で染色して、４℃で一晩インキュベートした。続いて、切片を洗浄して、ＤＡＰＩで染色して、モウィオールマウンティング（ｍｏｗｉｏｌ ｍｏｕｎｔｉｎｇ）培地（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて標本にして、２０倍の対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７００レーザー走査型共焦点顕微鏡で画像化した。１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤ－ＡＦ６４７は、ＢＤＬラット由来の肝臓において、細胞に明らかに結合し、ＳＨＡＭラット由来の肝臓では、細胞に結合せず（図２１）、硬変肝におけるＩＧＦ２Ｒの強力なアップレギュレーションを示す。さらに、ＢＤＬラット及びＳＨＡＭラット由来の他の組織に対して、染色は、全く観察することができなかったか、又はわずかな染色を観察することができたに過ぎず、このことは、ＩＧＦ２Ｒ発現が、硬変肝に非常に制限されることを示す（図２２）。

（例１３）：小分子キナーゼ阻害剤にコンジュゲートされた本発明のＩＧＦ２Ｒ結合分子を用いた、活性化された肝星細胞をｉｎ ｖｉｖｏでターゲティングすることによる、門脈圧亢進症の選択的低減
ｉｎ ｖｉｖｏ機能性を評価するために、例９．２に概要されるように、１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤを、Ｙ２７６３２マレイミド修飾官能部分（１ｅ）にコンジュゲートした（検査コンジュゲート）。競合体を提供するために、類似した量の１３Ｆ１１－１３Ｅ８－ＡＢＤを、匹敵する類似の調製で、Ｎ－エチルマレイミドにコンジュゲートした（偽コンジュゲート）。

門脈圧亢進症を示す動物を確立するために（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｆｉｂｒｏｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１７（１６２７）：９１－１２２．）、スプラーグドーリーラットを、腹腔内でのケタミン／キシラジン誘導性麻酔下での正中部回復術により、胆管結紮に供した（ＢＤＬラット）。健常な対照を提供するために、ラットの第２のコホートを、胆管の実際の結紮を除いて、同じ外科手技に供した（ＳＨＡＭラット）。手術は、疼痛コントロール薬物療法（皮下でのカプロフェン）を用いて経過観察した。手術のおよそ５週後、ケタミン／キシラジン麻酔したラットを、正中部回復術に供し、その後、カテーテルを１つ、回腸部の静脈を通じて門脈へ挿入し、またカテーテルを１つ、大腿動脈に挿入した。それぞれ、門脈圧及び平均動脈圧の評価のために、カテーテルを圧記録装置に接続した。

カテーテル法及び血行動態安定化後、ラットに、５ｍｇ／ｋｇ 検査コンジュゲート又は偽コンジュゲートを、外側尾静脈を通じて静脈内投薬して、圧力を連続的にモニタリングした（例１３．１）。投薬の１時間後、動物を屠殺して、その後、ｅｘ ｖｉｖｏ分析用に、組織を単離した（例１３．２）。

１３．１．小分子キナーゼ阻害剤にコンジュゲートされた本発明のＩＧＦ２Ｒ結合分子による、門脈圧の選択的低減
ＢＤＬにおいて、検査コンジュゲートの注入は、動脈圧が一定のままであるものの（ＭＡＰ）、門脈圧（ＰＰ）の漸減をもたらしたが、偽コンジュゲートの注入は、それをもたらさず、門脈圧亢進症の選択的軽減が示された（図２３Ａ）。偽コンジュゲートを注入した動物において、圧力はともに、一定のままであり、検査コンジュゲートによる門脈圧の低減が、小分子キナーゼ阻害剤によって媒介されることを示した（図２３Ｂ）。ＳＨＡＭラットでは、検査コンジュゲートも、偽コンジュゲートも、門脈圧又は動脈圧に影響を及ぼさず、ＢＤＬラットで観察される効果が、罹患状態に特異的であることを示した。

１３．２．小分子キナーゼ阻害剤にコンジュゲートされた本発明のＩＧＦ２Ｒ結合分子による、ＩＧＦ２Ｒのｉｎ ｖｉｖｏターゲティング
単離後、検査コンジュゲート注入ＢＤＬ及びＳＨＡＭラットから得られる肝臓を、パラホルムアルデヒドで固定して、ＰＢＳ中の３０％（ｗ／ｖ）スクロースに浸漬させて、クライオミクロトームを使用して切片化した。検査コンジュゲートをｉｎ ｓｉｔｕで検出するために、組織切片を、コンジュゲートの１３Ｆ１１－１３Ｅ８部分を認識するウサギポリクローナル抗ＶＨＨ抗血清、続いて、共焦点蛍光顕微鏡による可視化のためのフルオロフォアＡｌｅｘａ－４８８にコンジュゲートされた抗ウサギ抗体を使用して染色した（例１２を参照）。図２４Ａに示されるように、検査コンジュゲートは、ＢＤＬラットの肝臓において検出され、ＳＨＡＭラットの肝臓では検出されなかった。さらに、同じ切片の、過剰な、フルオロフォアＡｌｅｘａ－６４７にコンジュゲートされた１３Ｆ１１－１３Ｅ８（１３Ｆ１１－１３Ｅ８－Ａ６４７、例９．２に記載されるようなコンジュゲーション方法）による第２の染色により、ＢＤＬラットの肝臓における検査コンジュゲートの分布が、ＩＧＦ２Ｒの（組織）分布と重なることが実証された（図２４Ｂ）。これらの結果により、肝臓における検査コンジュゲートの存在が、ＩＧＦ２Ｒの（硬変特異的な）発現によって駆動され、分子標的のｉｎ ｖｉｖｏターゲティングが、実際に達成されたことが示される。ＩＧＦ２Ｒ分布を検出するためのＡｌｅｘａ－６４７コンジュゲート１３Ｆ１１－１３Ｅ８を使用した第２の染色により、ＩＧＦ２Ｒ分子全てに、ｉｎ ｖｉｖｏ研究のほんの１時間以内に検査コンジュゲートが到達していたわけではないことが示されたことは、注目すべきである。この１時間の時点を超えるＢＤＬ肝臓における検査コンジュゲートのさらなる蓄積が起きた可能性が高かった。

配列番号３６９：＜２２３＞Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカー
配列番号３７０：＜２２３＞ヘキサヒスチジンタグ
配列番号３７１：＜２２３＞ＥＰＥＡタグ

Claims (29)

1. 少なくとも２つの単一可変抗体ドメイン及び少なくとも１つの診断用又は治療用の分子を含む結合分子であって、前記少なくとも２つの単一可変抗体ドメインは、相互に独立して、肝星細胞（ＨＳＣ）及び／又は筋線維芽細胞上に発現される膜貫通受容体に特異的に結合することが可能である、ここで、前記膜貫通受容体は、血小板由来増殖因子ベータ受容体（ＰＤＧＦＢＲ）であり、及び、
   前記少なくとも２つの単一可変抗体ドメインは、
   少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、
   配列番号１１によるＣＤＲ１配列
   配列番号１３によるＣＤＲ２配列及び
   配列番号１５によるＣＤＲ３配列
   を含み、
   少なくとも１つの単一可変抗体ドメインが、
   配列番号１５５によるＣＤＲ１配列
   配列番号１５７によるＣＤＲ２配列及び
   配列番号１５９によるＣＤＲ３配列
   を含む、上記結合分子。
2. 前記少なくとも２つの単一可変抗体ドメインが、ヒト化されているかもしくはラクダ化されている、及び／又は下記の置換：
   i) ヒト化の程度を高める置換
   ii) 化学的安定性を高める置換及び／又は
   iii) 発現レベルを高める置換
   から選択される１つ又は２つ以上の置換を含む、請求項１に記載の結合分子。
3. 少なくとも１つの単一可変抗体ドメイン（単数）、及び／又は少なくとも２つの単一可変抗体ドメイン（複数）が、互いに独立して、免疫グロブリン単一可変ドメイン抗体（ＩＳＶＤ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）、重鎖のみの抗体の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の結合分子。
4. 少なくとも２つの単一可変抗体ドメインが、ともに単一可変ドメイン抗体である、請求項１～３のいずれかに記載の結合分子。
5. 少なくとも２つの単一可変抗体ドメインが、ともに重鎖のみの抗体の可変ドメインである、請求項１～４のいずれかに記載の結合分子。
6. 少なくとも２つの単一可変抗体ドメインが、
   配列番号９の配列（ＳＰ０２Ｐ）を有する単一抗体ドメインを含むか又は該単一可変抗体ドメインからなり、及び
   配列番号１５３の配列（ＳＰ２６Ｐ）を有する単一抗体ドメインを含むか又は該単一可変抗体ドメインからなる、
   請求項１～５のいずれかに記載の結合分子。
7. 治療用又は診断用の分子が、リンカー及び／又はスペーサーによって、少なくとも２つの単一可変抗体ドメインに結合されている、請求項１～６のいずれかに記載の結合分子。
8. リンカー及び／又はスペーサーが、遷移金属錯体を含むか、又は遷移金属錯体からなる、請求項７に記載の結合分子。
9. リンカー及び／又はスペーサーが、シス－白金（ＩＩ）錯体を含む、請求項８に記載の結合分子。
10. リンカー及び／又はスペーサーが、不活性二座部分を含む、請求項９に記載の結合分子。
11. 半減期延長剤を含む、請求項１～１０のいずれかに記載の結合分子。
12. 半減期延長剤が、半減期延長剤を伴わない結合分子と比較して、増加された半減期を結合分子に付与する１つ又は２つ以上の基、残基、部分又は結合単位を含むか、あるいは前記１つ又は２つ以上の基、残基、部分又は結合単位からなる、請求項１１に記載の結合分子。
13. 増加された半減期を結合分子に付与する基、残基、部分又は結合単位が、アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合ＶＨＨもしくは抗体Ｆｃテイル又はそれらの断片である、請求項１１又は１２に記載の結合分子。
14. 筋線維芽細胞が、肝筋線維芽細胞である、請求項１～１３のいずれかに記載の結合分子。
15. 筋線維芽細胞が、ＨＳＣ又は門脈線維芽細胞に由来する、請求項１～１４のいずれかに記載の結合分子。
16. 結合分子の、受容体への結合が、リガンド又は抗体の内在化の誘導を可能にする、請求項１～１５のいずれかに記載の結合分子。
17. 前記少なくとも２つの単一可変抗体ドメインが、リンカーアミノ酸配列によって分離されている、請求項１～１６のいずれかに記載の結合分子。
18. 治療用の分子が、キナーゼ阻害剤である、請求項１～１７のいずれかに記載の結合分子。
19. 治療用の分子が、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、ＪＡＫ－２阻害剤又はネプリライシン阻害剤、又はアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストから選択される、請求項１～１８のいずれかに記載の結合分子。
20. 治療用の分子が、毒素である、請求項１～１９のいずれかに記載の結合分子。
21. 医薬としての使用のための請求項１～２０のいずれかに記載の結合分子。
22. 肝硬変、肝線維症及び／又は門脈圧亢進症の防止及び／又は処置のための、請求項１～２０のいずれかに記載の結合分子。
23. 食道静脈瘤及び／又は痔核と関連付けられる疾患又は障害の防止及び／又は処置のための、請求項１～２０又は２２のいずれかに記載の結合分子。
24. 内部もしくは外部静脈瘤出血を特徴とする疾患又は障害の防止及び／又は処置のための、請求項１～２０、２２及び２３のいずれかに記載の結合分子。
25. 請求項１～２４のいずれかに記載の結合分子をコードする核酸。
26. 請求項２５に記載の核酸を含む、請求項１～２４のいずれかに記載の結合分子の発現のための宿主細胞。
27. 請求項１～２４のいずれかに記載の少なくとも１つの結合分子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
28. 診断用の分子を含み、前記診断用の分子が、造影剤である、請求項１～２０のいずれかに記載の結合分子。
29. 請求項２８に記載の少なくとも１つの結合分子と、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む、診断用組成物。