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JP7596532B2 - アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物及びＰＨＡ生産量の向上方法 - Google Patents

アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物及びＰＨＡ生産量の向上方法 Download PDF

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Description

CGMCC CGMCC 23600
本発明は、微生物の技術分野に関するものであり、具体的には、ポリヒドロキシアルカノエートの生産量を向上させるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子、並びにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作された微生物及びＰＨＡ生産量の向上方法に関するものである。
ポリヒドロキシアルカノエート（Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ、ＰＨＡ）は、微生物から合成される再生・分解が可能で複数の材料特性を備える高分子ポリマーであり、医学、材料および環境保護の分野において広く使用される見込みがある。ポリヒドロキシアルカノエートは、主に炭素源及びエネルギーの貯蔵担体として微生物の細胞内に広く存在する。ＰＨＡは、モノマーの種類や重合方法に応じて、硬くて脆い硬質プラスチックないし柔軟なエラストマー等、一連の多様な材料特性を有するものである。ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）はＰＨＡの一種であって、細菌から生成される商業的に有用な複合生体高分子であり、生分解性／熱可塑性材料としての使用、一部の抗生物質の有機合成用のキラル中心の供給源としての使用、および薬物伝達や骨置換用の基質としての使用などを含む、複数種の潜在的な用途がある。ポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）（ＰＨＢＨＨｘ；ＰＨＢＨと略する）もＰＨＡの一種であり、不溶性微小球状粒子として細胞質に存在する。
ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ；カプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）とも言う）は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成を研究するための重要なモデル細菌であり、現在多く研究されているＰＨＢの生成に用いられる菌株である。炭素が過剰で窒素が不足すると、菌株はＰＨＢを大量に蓄積することができる。一方、細胞内の他の炭素源の代謝が活発である場合、ＰＨＢの合成は影響されてしまう。現在、ラルストニア・ユートロファ内におけるＰＨＢの合成経路はすでに明らかにされている。具体的には、アシルＣｏＡ（Ａｃｙｌ－ＣｏＡ）は、ｐｈａＡ（β－ケトチオラーゼ）の作用下でアセトアセチルＣｏＡ（ａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ ＣｏＡ）を合成し、さらにｐｈａＢ（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ）により３－ヒドロキシ酪酸を合成する。菌株の発酵生産性能が、ＰＨＡの生産に影響を及ぼす重要な要素であるため、ＰＨＡの合成と蓄積に有利な遺伝子および菌株を開発することは重要な意義を持つ。
本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートの生産量を向上させることができるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーディング遺伝子、並びにポリヒドロキシアルカノエートを生産するための遺伝子操作された微生物を提供することを目的とする。
具体的には、本発明は、以下の技術案を提供する。
第１に、本発明はアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）変種を提供し、配列番号３１で示される野生型アセトアセチルＣｏＡレダクターゼに比べて、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、
（１）１４１番目のバリンの、イソロイシンまたはロイシンへの突然変異、
（２）１２番目のメチオニンの、トレオニン、セリン、アラニン、ロイシン、リジンまたはイソロイシンへの突然変異、
（３）１９４番目のイソロイシンの、バリン、ロイシンまたはメチオニンへの突然変異、
（４）４２番目のグルタミン酸の、リジン、グルタミン、ロイシン、アスパラギン酸、プロリン、トレオニン、アスパラギンまたはヒスチジンへの突然変異、および
（５）５５番目のフェニルアラニンの、バリン、アラニンまたはイソロイシンへの突然変異
のうちの１種または複数種を有する。
本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、配列番号３１で示される野生型アセトアセチルＣｏＡレダクターゼに比べて、突然変異として、上記（１）～（５）のいずれか一種の突然変異を含んでもよく、上記（１）～（５）に係る突然変異のいずれか２つ、３つ、４つまたは５つの組合わせを含んでもよい。
本発明は、上記の単一の変異部位を含む変種、及びいずれか２つ、３つ、４つまたは５つの変異部位を含む変種が、いずれも菌株の生物量とＰＨＡの含有量を顕著に向上させ、さらにＰＨＡの生産量を顕著に向上させることができることを実験により証明した。
第２に、本発明は、上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をコードする核酸分子を提供する。
上記で提供されるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列及びコドン規則に基づいて、当業者は上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をコードする核酸分子のヌクレオチド配列を獲得できる。同じアミノ酸配列をコードする核酸分子のヌクレオチド配列は唯一ではないが、上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をコードすることができる核酸分子はいずれも本発明の保護範囲内にある。
本発明のいくつかの実施形態において、前記核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号３～２８のいずれかが示すとおりである。
第３に、本発明は、上記核酸分子を含有する生体材料を提供し、前記生体材料は、発現カセット、ベクターまたは宿主細胞である。
本発明のいくつかの実施形態において、上記核酸分子を含有する発現カセットは、プロモーター、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をコードする核酸分子、及びターミネーターを作動可能に連結することによって得られる。発現の需要及び発現カセットの上下流の配列に応じて、発現カセットはターミネーターを含まなくてもよく、エンハンサー等の他の転写・翻訳調節因子を含んでもよい。
本発明のいくつかの実施形態において、上記核酸分子を含有するベクターはプラスミドベクターであり、これらのプラスミドベクターには、複製型ベクターと非複製型ベクターが含まれる。上記核酸分子を載せるベクターはプラスミドベクターに限らず、ファージ、ウィルス等のベクターであってもよい。
本発明のいくつかの実施形態において、上記核酸分子、発現カセットまたはベクターを含有する大腸菌細胞およびラルストニア・ユートロファ細胞が提供されるが、宿主細胞の種類はこれらに限らず、いずれの微生物細胞またはタンパク質の発現に使用できる動物細胞であってもよい。
第４に、本発明は、遺伝子操作された微生物のＰＨＡ生産量を向上させるためのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種またはそのコーディング遺伝子の使用を提供し、配列番号３１で示される野生型アセトアセチルＣｏＡレダクターゼに比べて、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、
（１）１４１番目のバリンの、イソロイシンまたはロイシンへの突然変異、
（２）１２番目のメチオニンの、トレオニン、セリン、アラニン、ロイシン、リジンまたはイソロイシンへの突然変異、
（３）１９４番目のイソロイシンの、バリン、ロイシンまたはメチオニンへの突然変異、
（４）４２番目のグルタミン酸の、リジン、グルタミン、ロイシン、アスパラギン酸、プロリン、トレオニン、アスパラギンまたはヒスチジンへの突然変異、および
（５）５５番目のフェニルアラニンの、バリン、アラニンまたはイソロイシンへの突然変異
のうちの１種または複数種を有する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、ＷＰ０１８９７３７０７．１、ＭＢＩ１３６５５５０．１、ＷＰ０１９６２１００３．１、ＰＺＯ８８４４５．１、ＷＰ１８８５５７４９９．１、ＷＰ０１８９５４５７８．１、ＷＰ１０９７２２４８６．１、ＨＢＲ９７１９０．１、ＲＫＺ３４０１１．１、ＰＣＩ２９７９４．１、ＷＰ１５２１２８５４６．１、ＷＰ０４３５７７３５２．１、ＷＰ０２８５３４３７０．１、ＷＰ１６３１４６３８３．１、ＷＰ０２０５５９８７７．１、ＥＥＶ２２３８３．１、ＷＰ０５４６７４８７７．１、ＷＰ１１６４７３４１２．１、ＷＰ０６２１５２４２７．１、ＷＰ０７０４６９２４４．１、ＭＢＥ０６２３８２３．１、ＷＰ１６６５７００８７．１、ＷＰ１８７６７１９６３．１、ＷＰ１２４６３５５８３．１、ＷＰ１７５８２９４８８．１、ＷＰ０４１０９９８３２．１のいずれか１種である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記コーディング遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３～２８のいずれかが示すとおりである。
上記の使用は、
（１）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを前記微生物に導入する方式、および
（２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の１つまたは複数のコピーを前記微生物のゲノムに挿入する方式
のいずれか１種または複数種により実現される。
本発明のいくつかの実施形態において、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は不活性化されていない。
本発明のいくつかの実施形態において、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は完全に保留されている。
上記の使用において、前記遺伝子操作された微生物は、さらに、
（１）ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、および
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性を向上させる修飾
のうちの１種または複数種を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、元のＰＨＡポリメラーゼに比べて、前記ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種は、１４９番目のアスパラギンのセリンへの突然変異および１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの突然変異を含有する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号２９が示すとおりである。
本発明のいくつかの実施形態において、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性の向上は、配列番号３０で示されるプロモーターにて、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現される。
上記の使用において、前記微生物はラルストニア・ユートロファ、大腸菌またはハロモナス菌であることが好ましい。
本発明のいくつかの実施形態において、前記遺伝子操作された微生物のＰＨＡ生産量を向上させることは、遺伝子操作された微生物の脂質を炭素源としてＰＨＡを生産する際のＰＨＡ生産量を向上させることである。
本発明のいくつかの実施形態において、前記遺伝子操作された微生物のＰＨＡ生産量を向上させることは、遺伝子操作された微生物の植物油を炭素源としてＰＨＡを生産する際のＰＨＡ生産量を向上させることである。
上記植物油は、パーム油、落花生油、大豆油、亜麻仁油、菜種油、ヒマシ油、コーン油から選択される１種または複数種の混合物を含む。
第５に、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体を生産する微生物を構築するための、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種、そのコーディング遺伝子または前記コーディング遺伝子を含む生体材料の使用を提供する。
本発明で提供されるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が微生物のＰＨＡ生産量を向上させることができる機能に基づいて、これらの変種をコードする核酸分子及びこれらの核酸分子を含有する生体材料を、ＰＨＡまたはその誘導体を生産する菌株の構築に使用することができる。
本発明において、ＰＨＡの誘導体とは、ＰＨＡを前駆体物質として合成される代謝物を意味する。ＰＨＡの合成能力が向上する場合、一般的にＰＨＡを前駆体として合成される代謝物の生産量もそれに応じて向上することができる。
上記の使用において、前記微生物はラルストニア・ユートロファ、大腸菌またはハロモナス菌であることが好ましい。
本発明のいくつかの実施形態において、配列番号３～２８のいずれかで示される核酸分子をラルストニア・ユートロファに導入してＰＨＡを生産する菌株を構築する。
第６に、本発明は、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
配列番号３１で示される野生型アセトアセチルＣｏＡレダクターゼに比べて、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、
（１）１４１番目のバリンの、イソロイシンまたはロイシンへの突然変異、
（２）１２番目のメチオニンの、トレオニン、セリン、アラニン、ロイシン、リジンまたはイソロイシンへの突然変異、
（３）１９４番目のイソロイシンの、バリン、ロイシンまたはメチオニンへの突然変異、
（４）４２番目のグルタミン酸の、リジン、グルタミン、ロイシン、アスパラギン酸、プロリン、トレオニン、アスパラギンまたはヒスチジンへの突然変異、および
（５）５５番目のフェニルアラニンの、バリン、アラニンまたはイソロイシンへの突然変異
のうちの１種または複数種を有する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、ＷＰ０１８９７３７０７．１、ＭＢＩ１３６５５５０．１、ＷＰ０１９６２１００３．１、ＰＺＯ８８４４５．１、ＷＰ１８８５５７４９９．１、ＷＰ０１８９５４５７８．１、ＷＰ１０９７２２４８６．１、ＨＢＲ９７１９０．１、ＲＫＺ３４０１１．１、ＰＣＩ２９７９４．１、ＷＰ１５２１２８５４６．１、ＷＰ０４３５７７３５２．１、ＷＰ０２８５３４３７０．１、ＷＰ１６３１４６３８３．１、ＷＰ０２０５５９８７７．１、ＥＥＶ２２３８３．１、ＷＰ０５４６７４８７７．１、ＷＰ１１６４７３４１２．１、ＷＰ０６２１５２４２７．１、ＷＰ０７０４６９２４４．１、ＭＢＥ０６２３８２３．１、ＷＰ１６６５７００８７．１、ＷＰ１８７６７１９６３．１、ＷＰ１２４６３５５８３．１、ＷＰ１７５８２９４８８．１、ＷＰ０４１０９９８３２．１のいずれか１種である。
本発明において、標的酵素またはその変種の発現は、
（１）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方法、および
（２）アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の１つまたは複数のコピーをゲノムに挿入する方法
のいずれか１種または複数種により実現される。
本発明のいくつかの実施形態において、ゲノムにアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子のコピーを１つ挿入することで、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させる。
本発明のいくつかの実施形態において、ゲノム中のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の挿入位置は、ｐｈａＣ遺伝子のコーディング領域または当該コーディング領域の下流にある。
本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子は、配列番号３～２８のいずれかが示すとおりである。これらのコーディング遺伝子の配列は、ラルストニア・ユートロファのコドン選好性に応じて、そして人工最適化およびスクリーニングを組み合わせることで得られる、ラルストニア・ユートロファにおいてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の配列を効率良くかつ正確に発現できる配列であり、これらの配列を使用することは、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種がラルストニア・ユートロファにおいてＰＨＡ合成を向上させる効果をよりよく発揮することを促進するのに有利である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は不活性化されていない。
本発明のいくつかの実施形態において、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は完全に保留されている。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＨＢＨを合成するための遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファが提供され、ＰＨＢＨの合成を促進するため、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、さらに、
（１）ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、および
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性を向上させる修飾
のうちの１種または複数種を含む。
ここで、ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種は、Ｃ６脂肪酸（３－ヒドロキシヘキサン酸）を重合できるように、細菌のＰＨＡポリメラーゼのアミノ酸配列を変異させてもよい。先行技術におけるＣ６脂肪酸（３－ヒドロキシヘキサン酸）を重合できるＰＨＡポリメラーゼ変種を使用してもよく、先行技術におけるＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種の変異部位を組み合わせることで、新たなより効率的なＰＨＡポリメラーゼ変種を得てもよい。
本発明のいくつかの実施形態において、元のＰＨＡポリメラーゼに比べて、前記ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種は、１４９番目のアスパラギンのセリンへの突然変異および１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの突然変異を含有する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号２９が示すとおりである。
上記のＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種の発現は、
（１）前記ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーティング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、および
（２）前記ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーティング遺伝子の１つまたは複数のコピーをゲノムに挿入する方式
のいずれか１種または複数種により実現される。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させるとともに、ゲノムにおける元のＰＨＡポリメラーゼのコーディング遺伝子を不活性化させる。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子をゲノムに挿入する。
本発明のいくつかの実施形態において、ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子を含有する発現プラスミドを導入する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記発現プラスミドは安定的に発現するプラスミドであり、プラスミドの安定的な発現は、プラスミドにおいて菌株の成長に必須となる代謝物の合成遺伝子を担持するとともに、ゲノムにおける当該合成遺伝子を不活性化させることにより実現される。
本発明のいくつかの実施形態において、前記配列番号２９で示されるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーディング遺伝子を含有するプラスミドはさらにｐｒｏＣ遺伝子を含有し、かつ前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファのゲノムにおけるｐｒｏＣ遺伝子は不活性化されている。
上記の酵素の発現の向上は、下記の（１）～（４）のいずれか１種または複数種の方式により実現することができる。
（１）前記酵素のコーディング遺伝子を含有するベクターを導入する方式、
（２）ゲノムにおける前記酵素のコーディング遺伝子のコピー数を増やす方式、
（３）ゲノムにおける前記酵素のコーディング遺伝子の転写および／または翻訳調節因子（プロモーター等を含む）の配列を変化させる方式、および
（４）前記酵素のコーディング遺伝子のヌクレオチド配列を変化させる方式。
上記の酵素活性の向上は、前記酵素の１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入により実現することができる。
本発明のいくつかの実施形態において、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性の向上は、配列番号３０で示されるプロモーターにて、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現される。
本発明のいくつかの実施形態において、配列番号３０で示されるプロモーターにて、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることは、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子とその上流にある遺伝子との遺伝子間領域に配列番号３０で示されるプロモーターを挿入することにより実現される。
本発明のいくつかの実施形態において、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、野生型ラルストニア・ユートロファ、ラルストニア・ユートロファＨ１６菌株またはラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０を出発菌株として修飾を経て得られるものである。
ここで、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＢＰＳ－０５０は、すでに２０２１年１０月１３日にＣｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（略称ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号、中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）に受託され、その分類学上の位置はラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）であり、受託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２３６００である。
本発明は、上記出発菌株において発現する本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が、ＰＨＡの生産量を顕著に向上させることができることを実験により証明した。
第７に、本発明は、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの形質転換体ライブラリーを提供し、前記形質転換体ライブラリーは上記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファのうちの少なくとも２株を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記形質転換体ライブラリーにおける遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、ＷＰ０１８９７３７０７．１、ＭＢＩ１３６５５５０．１、ＷＰ０１９６２１００３．１、ＰＺＯ８８４４５．１、ＷＰ１８８５５７４９９．１、ＷＰ０１８９５４５７８．１、ＷＰ１０９７２２４８６．１、ＨＢＲ９７１９０．１、ＲＫＺ３４０１１．１、ＰＣＩ２９７９４．１、ＷＰ１５２１２８５４６．１、ＷＰ０４３５７７３５２．１、ＷＰ０２８５３４３７０．１、ＷＰ１６３１４６３８３．１、ＷＰ０２０５５９８７７．１、ＥＥＶ２２３８３．１、ＷＰ０５４６７４８７７．１、ＷＰ１１６４７３４１２．１、ＷＰ０６２１５２４２７．１、ＷＰ０７０４６９２４４．１、ＭＢＥ０６２３８２３．１、ＷＰ１６６５７００８７．１、ＷＰ１８７６７１９６３．１、ＷＰ１２４６３５５８３．１、ＷＰ１７５８２９４８８．１、ＷＰ０４１０９９８３２．１といったアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種から選択されるいずれか１種を発現し、前記形質転換体ライブラリーにおける各遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファが発現するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のアミノ酸配列は異なる。
本発明のいくつかの実施形態において、前記形質転換体ライブラリーは、上記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファのうちのいずれか２～２６株を含む。
第８に、本発明は、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの構築方法を提供し、前記方法は、ラルストニア・ユートロファを修飾することにより前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させるステップを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファのＰＨＢＨ合成能力を促進するために、前記方法は、さらに、ラルストニア・ユートロファに対して、
（１）ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、および
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性を向上させる修飾
のうちの１種または複数種を行うことを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は、配列番号２９が示すとおりである。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、配列番号３０で示されるプロモーターにて、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーティング遺伝子の転写を開始させることを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーティング遺伝子をゲノムに挿入することを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーティング遺伝子を含むプラスミドを導入することを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種のコーティング遺伝子およびｐｒｏＣ遺伝子を含有するプラスミドを導入すること、及びゲノムにおけるｐｒｏＣ遺伝子を不活性化させることを含む。
ここで、遺伝子の不活性化は遺伝子ノックアウト、発現の沈黙化、ＲＮＡ干渉等の方式により実現することができる。
第９に、本発明は前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファの下記のいずれか１種の使用を提供する。
（１）ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産における使用、および
（２）ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産に用いられる菌株の選別・育成における使用。
本発明において、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）はポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸－共－３－ヒドロキシヘキサン酸）（ＰＨＢＨＨｘ；ＰＨＢＨと略する）、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシ吉草酸の共重合体（ＰＨＢＶ）等を含むが、これらに限定されない。
上記の使用において、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産に用いられる菌株の選別・育成は、具体的には、本発明が提供する遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを出発菌株とした、遺伝子操作改造、変異誘発または馴化の方法による、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産に用いられる菌株の選別・育成であってもよい。
第１０に、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体の発酵生産方法を提供し、前記方法は、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを培養して培養物を得るステップを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファに対して活性化培養を行い、活性化された菌体を種培地に接種して種培養を行い、種培養液を得た後、当該種培養液を発酵培地に接種し、前記培養物を得ることを含む。
上記培養では、通常のラルストニア・ユートロファ培養用培地を選択してもよい。培地には、炭素源、窒素源及び無機塩が含まれてもよい。ここで、炭素源として、植物油（例えば、パーム油）、スクロース、グルコース、糖蜜、マルトース、フルクトース、アラビノースのうちの１種または複数種の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。窒素源として、コーンスティープリカー、酵母エキス、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウムのうちの１種または複数種の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。無機塩として、リン酸塩、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩、鉄塩、マンガン塩、カルシウム塩、ホウ酸塩、コバルト塩、銅塩、ニッケル塩、モリブデン塩のうちの１種または複数種の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、培養した培養物に対して分離および抽出を行い、ポリヒドロキシアルカノエートまたはその誘導体を収集するステップをさらに含む。
第１１に、本発明は、遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡの生産量の向上方法を提供し、前記方法は、ラルストニア・ユートロファを修飾することによりアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させることを含む。
配列番号３１で示される野生型アセトアセチルＣｏＡレダクターゼに比べて、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、
（１）１４１番目のバリンの、イソロイシンまたはロイシンへの突然変異、
（２）１２番目のメチオニンの、トレオニン、セリン、アラニン、ロイシン、リジンまたはイソロイシンへの突然変異、
（３）１９４番目のイソロイシンの、バリン、ロイシンまたはメチオニンへの突然変異、
（４）４２番目のグルタミン酸の、リジン、グルタミン、ロイシン、アスパラギン酸、プロリン、トレオニン、アスパラギンまたはヒスチジンへの突然変異、および
（５）５５番目のフェニルアラニンの、バリン、アラニンまたはイソロイシンへの突然変異
のうちの１種または複数種を有する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、ＷＰ０１８９７３７０７．１、ＭＢＩ１３６５５５０．１、ＷＰ０１９６２１００３．１、ＰＺＯ８８４４５．１、ＷＰ１８８５５７４９９．１、ＷＰ０１８９５４５７８．１、ＷＰ１０９７２２４８６．１、ＨＢＲ９７１９０．１、ＲＫＺ３４０１１．１、ＰＣＩ２９７９４．１、ＷＰ１５２１２８５４６．１、ＷＰ０４３５７７３５２．１、ＷＰ０２８５３４３７０．１、ＷＰ１６３１４６３８３．１、ＷＰ０２０５５９８７７．１、ＥＥＶ２２３８３．１、ＷＰ０５４６７４８７７．１、ＷＰ１１６４７３４１２．１、ＷＰ０６２１５２４２７．１、ＷＰ０７０４６９２４４．１、ＭＢＥ０６２３８２３．１、ＷＰ１６６５７００８７．１、ＷＰ１８７６７１９６３．１、ＷＰ１２４６３５５８３．１、ＷＰ１７５８２９４８８．１、ＷＰ０４１０９９８３２．１のいずれか１種である。
上記の方法において、前記発現は、
（１）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、および
（２）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子の１つまたは複数のコピーをゲノムに挿入する方式
のいずれか１種または複数種により実現される。
本発明のいくつかの実施形態において、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は不活性化されていない。
本発明のいくつかの実施形態において、前記微生物のゲノムの原位置のｐｈａＢ遺伝子は完全に保留されている。
本発明のいくつかの実施形態において、前記コーティング遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３～２８のいずれかが示すとおりである。
上記の使用において、前記遺伝子操作された微生物は、さらに、
（１）ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、および
（２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性を向上させる修飾
のうちの１種または複数種を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、元のＰＨＡポリメラーゼに比べて、前記ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種は、１４９番目のアスパラギンのセリンへの突然変異および１７１番目のアスパラギン酸のグリシンへの突然変異を含有する。
本発明のいくつかの実施形態において、前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列は配列番号２９が示すとおりである。
本発明のいくつかの実施形態において、（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性の向上は、配列番号３０で示されるプロモーターにて、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーティング遺伝子の転写を開始させることにより実現される。本発明のいくつかの実施形態において、前記遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡの生産量の向上方法は、遺伝子操作された微生物が脂質を炭素源としてＰＨＡを生産する際のＰＨＡ生産量を向上させる方法である。
本発明のいくつかの実施形態において、前記遺伝子操作された微生物から生産されるＰＨＡの生産量の向上方法は、遺伝子操作された微生物が植物油を炭素源としてＰＨＡを生産する際のＰＨＡ生産量を向上させる方法である。
上記の植物油は、パーム油、落花生油、大豆油、亜麻仁油、菜種油、ヒマシ油、コーン油から選択される１種または複数種の混合物を含む。
本発明の有益な効果は、以下の通りである。すなわち、本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーティング遺伝子は、菌株のＰＨＡの合成および蓄積を有意に促進するとともに、菌株の生物量の向上を促進し、さらに、ＰＨＡの生産量を顕著に向上させることができ、本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーティング遺伝子により構築される、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、細胞乾燥重量およびＰＨＡの生産量が顕著に向上し、ＰＨＡの遺伝子操作された菌株の開発に新たな遺伝子資源および菌株資源を提供し、ＰＨＡの発酵生産效率の向上および生産コストの低減において重要な応用価値がある。
本発明の適用は、下記の明細書に記載または例示された形態に限定されない。本発明は、他の実施形態に適用でき、且つ多種の態様で実施または実行することができる。また、本明細書で使用される句や用語は、説明を目的とするものであり、限定とみなされるべきではない。本明細書で使用される「含む」、「包含する」または「有する」、「含有する」、「係る」及びそれらの変形は、以下に挙げられた事項及びその等価物並びに他の事項を含むことを意図する。
本発明が提供する具体的な実施形態の一部または全部は、本発明が、菌株のＰＨＡ生産量を顕著に向上できるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーティング遺伝子を見出したことに基づくものである。これらのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子は、ＰＨＡの合成に必要となる他の遺伝子を有する菌株に導入されることにより、これらの菌株のＰＨＡ生産量を向上させることに用いられ、遺伝子操作された微生物を得ることができる。これらの遺伝子操作された微生物は、ＰＨＡの生産に適用することができ、従来のＰＨＡ発酵生産菌株の発酵生産性能を向上させることができる。本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現することに加え、遺伝子操作された微生物は、さらに他の修飾が施されてもよく、本発明は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の発現という修飾を、少なくともＰＨＡポリメラーゼ（ｐｈａＣ）変種の発現、ｐｈａＪの強化発現といった修飾と組み合わせて行うことで、ＰＨＡの生産量をさらに向上できることを見出した。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３１で示される野生型アセトアセチルＣｏＡレダクターゼに比べて、
（１）１４１番目のバリンの、イソロイシンまたはロイシンへの突然変異、
（２）１２番目のメチオニンの、トレオニン、セリン、アラニン、ロイシン、リジンまたはイソロイシンへの突然変異、
（３）１９４番目のイソロイシンの、バリン、ロイシンまたはメチオニンへの突然変異、
（４）４２番目のグルタミン酸の、リジン、グルタミン、ロイシン、アスパラギン酸、プロリン、トレオニン、アスパラギンまたはヒスチジンへの突然変異、および
（５）５５番目のフェニルアラニンの、バリン、アラニンまたはイソロイシンへの突然変異
のうちの１種または複数種を有するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を提供する。
本発明は、上記（１）～（５）に示す突然変異のいずれか１種または複数種の突然変異を有する条件を満した上で、例えば、ＷＰ０１８９７３７０７．１、ＭＢＩ１３６５５５０．１、ＷＰ０１９６２１００３．１、ＰＺＯ８８４４５．１、ＷＰ１８８５５７４９９．１、ＷＰ０１８９５４５７８．１、ＷＰ１０９７２２４８６．１、ＨＢＲ９７１９０．１、ＲＫＺ３４０１１．１、ＰＣＩ２９７９４．１、ＷＰ１５２１２８５４６．１、ＷＰ０４３５７７３５２．１、ＷＰ０２８５３４３７０．１、ＷＰ１６３１４６３８３．１、ＷＰ０２０５５９８７７．１、ＥＥＶ２２３８３．１、ＷＰ０５４６７４８７７．１、ＷＰ１１６４７３４１２．１、ＷＰ０６２１５２４２７．１、ＷＰ０７０４６９２４４．１、ＭＢＥ０６２３８２３．１、ＷＰ１６６５７００８７．１、ＷＰ１８７６７１９６３．１、ＷＰ１２４６３５５８３．１、ＷＰ１７５８２９４８８．１、ＷＰ０４１０９９８３２．１のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、もしくは上記数値におけるいずれか２つからなる範囲の類似性を有するアミノ酸配列を有するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を提供する。
アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種は、全長アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼの断片、切断されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼなど、アセトアセチルＣｏＡから３－ヒドロキシ酪酸が生産されることを促進する活性を有するすべてのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３～２８のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する、上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をコードする遺伝子を提供する。これらの遺伝子はラルストニア・ユートロファにおいて発現するように最適化されたものである。
本発明が提供する上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーティング遺伝子は、菌株の乾燥重量及びＰＨＡの含有量を顕著に向上させ、さらに菌株のＰＨＡ生産量を効果的に向上させることができる。
いくつかの実施形態において、本発明は、ゲノムに上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子が挿入された、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０菌株のゲノムに上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子が挿入された、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。これらの遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０菌株に比べて有意に向上されたＰＨＡ生産量を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０菌株のゲノムにおけるｐｈａＣの欠失位置に上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子が挿入された、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ラルストニア・ユートロファＨ１６菌株のゲノムに上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子が挿入された、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。これらの遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは比較的に高いＰＨＢ生産量を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ラルストニア・ユートロファＨ１６菌株のゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子の位置に上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子が挿入された、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ラルストニア・ユートロファＨ１６菌株のゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子がＰＨＡポリメラーゼ変種（配列は配列番号２９が示すとおりである）をコードする遺伝子に置き換えられ、そのゲノムにおけるｐｈａＪ遺伝子の転写を配列番号３０で示されるプロモーターにより開始させ、そしてそのゲノムに上記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子が挿入された、遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファを提供する。これらの遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファは有意に向上されたＰＨＢＨ生産量を有する。
同じ発酵培養の条件下で、上記実施形態における遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファのポリヒドロキシアルカノエートの収率は、出発菌株に比べて顕著に向上した。
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。
実施例１ アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する形質転換体ライブラリーの構築及びアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のスクリーニング
本実施例では、ラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０を出発菌株とし、異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を含有する形質転換体ライブラリーを構築し、具体的には以下のステップを含む。
ステップ１：基礎プラスミドの構築
ラルストニア・ユートロファのゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行うことで、ｐｈａＣの上流および下流に相同な断片ｐｈａＣ－Ｈ１およびｐｈａＣ－Ｈ２を得、後続操作を容易にするため、ｐｈａＣ－Ｈ１、ｐｈａＣ－Ｈ２の後端、前端にＢｓａＩを添加した。修飾後のプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ（Ｏｒｉｔａ，Ｉ．，Ｉｗａｚａｗａ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１３，６３～６９）をテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行うことで、ベクターの断片を得、使用したプライマー配列は表１が示すとおりである。ｐｈａＣ－Ｈ１、ｐｈａＣ－Ｈ２をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によりベクターの断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃ（配列は配列番号１が示すとおりである）を得た。
ステップ２：遺伝子合成
スクリーニングしようとする異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子がそれぞれ、ラルストニア・ユートロファにおいて良好に発現できるように、配列を最適化した。最適化されたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子をそれぞれ合成し、後続操作を容易にするため、合成されたＤＮＡ配列の上流にＧＧＴＣＴＣＡＴＣを添加し、下流にＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣを添加した。
ステップ３：標的遺伝子を含有する目的菌株の構築
ステップ１で構築したｐＫＯ－Ｃプラスミドと、遺伝子合成により得られたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子を含有するプラスミドとを、Ｇｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ法により組み立て、それぞれ異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子を持つ組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃ－Ｎ（Ｎは載せたアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子を表す）を得た。各プラスミドをトランスフェクションによりそれぞれ大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに、接合導入法によりラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０株に導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、スペクチノマイシン５００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含有するＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノムのｐｈａＣ－Ｈ１およびｐｈａＣ－Ｈ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。第一の相同組換え菌をスクロース１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからスペクチノマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーＦｐｈａＣＨ１－Ｆ：ｔｇｇｔｃｔｇｇｃｔｇｇｃｇｇａｃｔｇａｇ、及びプライマーｐｈａＣＨ２－Ｒ：ｇｇｃｇａａｃｔｃａｔｃｃｔｇｃｇｃｃｔｃによるＰＣＲにより、標的遺伝子（異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子）が挿入された組換え菌を同定した。得られた組換え菌はプラスミドが安定なラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｒｏＣΔｐｈａＣ：：Ｎであり、合計２２１個の形質転換体が得られた。
ステップ４：ラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＢ遺伝子を過剰発現する組換え菌の構築
ステップ３における組換えプラスミドの構築方法を参照し、Ｇｉｂｓｏｎ組み立て法により、ラルストニア・ユートロファの元のｐｈａＢ遺伝子を含有する組換えプラスミドを構築した。具体的な方法は、以下の通りである。
ステップ１で得られたｐＫＯ－ＣプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行うことで、プラスミド骨格断片を得、ラルストニア・ユートロファのゲノムをテンプレートとして増幅を行うことで、ｐｈａＢ遺伝子の断片を得、上記の２つの断片をＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法により連結させ、組換えプラスミドｐＫＯ－Ｃ－ｐｈａＢを得た。構築の過程において使用したプライマーは、表２に示すとおりである。
ｐＫＯ－Ｃ－ｐｈａＢプラスミドをトランスフェクションにより大腸菌Ｓ１７－１に導入し、上記のステップ３の方法に従って組換え菌を構築し、最終的にｐｈａＢ遺伝子がラルストニア・ユートロファのｐｈａＣ遺伝子の位置に取り込まれた過剰発現菌株ＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＢを得た。
ステップ５：ラルストニア・ユートロファのＰＨＡ生産量を顕著に向上できるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のスクリーニング
（１）異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する組換え菌の発酵培養
ステップ３で得られた異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する組換え菌を、平板画線法により画線状に塗布し、単一のクローンを得、単一のクローンを種培地（４ｍＬ）に接種して、１２時間培養した。一晩培養した菌液をＬＢ活性化培地１０ｍＬが入ったガラス製三角フラスコ１００ｍＬに移植し、接種終了時のＯＤ量が約０．１となるように、３０℃、２２０ｒｐｍで、８ｈ培養することで、移植・培養を行った。ＰＨＡ発酵生産の培養では、ＯＤ値が６～７の前培養種を、発酵培地３０ｍＬが入った２５０ｍＬのシェイクフラスコに０．１ＯＤで接種した後、さらに一定量の乳化剤を加えた。４８ｈ後に発酵を停止し、発酵液を採取し、遠心分離して菌体を得た。菌体を重量が一定となるまで乾燥した。
上記発酵培地の処方は、パーム油１％、ＮＨ４Ｃｌ １ｇ／Ｌ、微量元素溶液Ｉ １０ｍＬ／Ｌおよび微量元素溶液ＩＩ １ｍＬ／Ｌである。ここで、微量元素溶液Ｉの組成は、ＭｇＳＯ４ ２０ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２ ２ｇ／Ｌである。微量元素溶液ＩＩの組成は、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １００ｍｇ／Ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３ ３００ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２００ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ２０ｍｇ／Ｌ、ＮａＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ３０ｍｇ／Ｌである。上記試薬はＳｉｎｏｐｈａｒｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したものである。
（２）ＰＨＡの含有量の測定
エステル化溶液の調製：無水メタノール４８５ｍＬを取り、安息香酸１ｇ／Ｌを加え、濃硫酸１５ｍＬをゆっくりと加えて、約５００ｍＬのエステル化溶液を調製した。
サンプルの調製：サンプルを精密に秤量した後、エステル化チューブにエステル化溶液２ｍＬとクロロホルム２ｍＬとを加えた。ＰＨＡサンプルを１０ｍｇ程度秤量し、同様に処理して標準サンプルとした。エステル化チューブに蓋をして密封した後、１００℃で４時間反応させた。反応終了後、エステル化チューブを室温まで冷却させ、脱イオン水１ｍＬを加え、ボールテックスで振蕩して十分に混合させ、分層するまで静置した。水相と有機相が完全に分離した後、下層の有機相を採取してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）解析に用いた。
ＰＨＡ組成及び含有量に対するＧＣ解析：島津製作所のＧＣ－２０１４型ガスクロマトグラフを使用した。クロマトグラフの構成は、ＨＰ－５型キャピラリカラム、水素炎イオン化検出器ＦＩＤ、ＳＰＬスプリット注入口であり、高純度窒素ガスをキャリアガスとし、水素ガスを燃焼ガスとし、空気を助燃ガスとし、ＡＯＣ－２０Ｓ型オートサンプラを使用し、アセトンを洗浄液とした。ＧＣ解析プログラムの設定について、注入口の温度を２４０℃とし、検出器の温度を２５０℃とし、カラム開始温度を８０℃とし、１．５分間維持し、３０℃／分の速度で１４０℃まで昇温させ、そして０分間維持し、４０℃／分の速度で２４０℃まで昇温させ、そして２分間を維持し、合計時間を８分間とした。ＧＣの結果については、内部標準法を使用し、ピーク面積に基づき、ＰＨＡの組成及び含有量を定量的に算出した。
異なるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する組換え菌のＰＨＡ生産量を測定した。スクリーニングにより、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のほとんどが、ラルストニア・ユートロファのＰＨＡ生産量を顕著に向上させることができず、それどころか、多くのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が、ラルストニア・ユートロファのＰＨＡ生産量を明らかに低減（４０％以下にまで低減）させ、わずか２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が、ラルストニア・ユートロファのＰＨＡ生産量（ＰＨＡ含有量が８３％以上に達している）を顕著に向上させることができることが分かった。これら２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する組換え菌のＰＨＡ生産量および菌体乾燥重量の測定結果は表３が示すとおりであり、出発菌株であるラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０を対照菌株とし、対照菌株のＣＤＷは１０．３４ｇ／Ｌであり、ＰＨＡの割合は８２．２１％であり、Ｈの割合は８．１５ｍｏｌ％であった。
（３）元のｐｈａＢを過剰発現する組換え菌の発酵培養およびＰＨＡ含有量の測定
上記のステップ４で得られた元のｐｈａＢ遺伝子を過剰発現する組換え菌を上記（１）における方法に従って発酵培養し、そして上記（２）における方法に従ってＰＨＡ含有量の測定を行い、出発菌株であるラルストニア・ユートロファＢＰＳ－０５０を対照菌株とした。
発酵の結果は表４が示すとおりである。結果は、ラルストニア・ユートロファ自身のｐｈａＢ遺伝子を過剰発現してもＰＨＡ生産量を向上させることができないことを示している。
実施例２ アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の保存部位の分析
実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種（表３に示すもの）の保存部位を分析するとともに、１６個のＰＨＡ生産量が４０％未満のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を無作為に選択し、これらのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種に対してマルチプルアライメントを行い、そして一定のコンピューターアルゴリズムにより結果を分析して、最終的にＰＨＡ生産量を効率よく向上できるアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種の保存部位を確定した。ラルストニア・ユートロファのｐｈａＢ遺伝子を配列の基准とする場合、保存部位はそれぞれＶ１４１Ｉ、Ｍ１２Ｔ、Ｉ１９４Ｖ、Ｅ４２Ｋ、Ｆ５５Ｖであった。
実施例３ Ｈ１６を出発菌株とするアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する形質転換体ライブラリーの構築及びその性能に対する検証
本実施例では、ラルストニア・ユートロファＨ１６を出発菌株（ラルストニア・ユートロファＨ１６菌株のｐｈａＣ遺伝子が変異しておらず、ｐｈａＪ遺伝子の上流にプロモーターが導入されていないもの）とし、ラルストニア・ユートロファＨ１６において、実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をそれぞれ発現させた。
組換えプラスミドと組換え菌の構築方法は実施例１を参照し、違いは、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーティング遺伝子をゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子に挿入した後、実施例１における上流および下流の相同断片のプライマーｐｈａＣＨ１－Ｆ、ｐｈａＣＨ１－Ｒを、ｉｐｈａＣＨ１ Ｆ：ｔｇｇｔａｃｃｃｇｇｃｃａａｇｔｃｔｇｔｇｔｇｇａａｃｔａｃｇｔｇｇｔｃｇａｃ；ｉｐｈａＣＨ１ Ｒ：ＴＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＴｔｃａｔｇｃｃｔｔｇｇｃｔｔｔｇａｃｇｔａｔｃに変更したことにあり、その他の操作は実施例１と同じであって、実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をそれぞれ発現する組換え菌を構築した。
構築した組換え菌に対し、実施例１の方法に従って発酵培養およびＰＨＡ生産量の測定を行い、菌体乾燥重量およびＰＨＡ生産量の測定結果は表５が示すとおりである。結果は、実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が同様にラルストニア・ユートロファＨ１６菌株の細胞乾燥重量およびＰＨＡ含有量を向上でき、さらにＰＨＡ生産量を効率よく向上できることを示している。
実施例４ Ｈ１６株の遺伝子組み換え菌を出発菌株とするアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する形質転換体ライブラリーの構築及びその性能に対する検証
本実施例では、ラルストニア・ユートロファＨ１６を出発菌株とし、そのゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子をｐｈａＣ遺伝子変種（コードするタンパク質配列は配列番号２９が示すとおりである）に変異させ、そして、ゲノムにおけるｐｈａＪ遺伝子の上流に配列番号３０で示されるプロモーターを挿入したうえで、実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をそれぞれ発現させた。具体的な方法は以下の通りである。
ステップ１：ラルストニア・ユートロファのゲノムにおけるｐｈａＣ遺伝子の置き替え
ｐｈａＣ遺伝子変種の遺伝子合成配列は配列番号２が示すとおりであり、当該配列はｐｈａＣ遺伝子の上流および下流の約６００ｂｐの断片及びｐｈａＣ変種を含有するとともに、合成配列の上流にＧＧＴＣＴＣＡＴＣが、下流にＧＴＧＡＡＧＡＧＡＣＣが、後続のベクターとの連結を容易にするために添加された。合成遺伝子をＧｏｌｄｅｎ ｇａｔｅ法によりｐＫＯ－Ｃベクター断片に連結させることで、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃを得た。
組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃを大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに、接合導入法によりラルストニア・ユートロファＨ１６に導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用し、カナマイシン２００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含有するＬＢプレートで陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノムのＨ１およびＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。第一の相同組換え菌をスクロース１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからカナマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーｐｈａＣ－Ｈ１ ＦＰおよびｐｈａＣ－Ｈ２ ＲＰによるＰＣＲにより、ｐｈａＣ遺伝子が置き換えされた組換え菌を同定した。得られた組換え菌はラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃである。
ステップ２：ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の上流に特定のプロモーターが挿入された組換え菌の構築
（１）ステップ１で得られたラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃのゲノムをテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行い、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ１ Ｒｐを用いて、ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターの上流に相同な断片Ｈ１を得、ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｆｐ、ｐｈａＪ－Ｈ２ Ｒｐを用いて、ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターの下流に相同な断片Ｈ２を得た。
（２）ｐｈａＪ遺伝子のプロモーターｐｈａＪ４３（配列番号３０）を遺伝子合成した。
（３）ＰＣＲによって得られたＨ１、Ｈ２及びｐｈａＪ４３プロモーターをＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によりベクター断片に連結させ、組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ｐｈａＪ４３を得た。上記で使用したプライマーは表６が示すとおりである。
（４）組換えプラスミドｐＫ１８ｍｏｂ－ｐｈａＪ４３を大腸菌Ｓ１７－１に導入し、さらに、接合導入法によりラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃに導入し、自殺プラスミドが宿主菌内で複製できない特性を利用して、カナマイシン２００μｇ／ｍＬとアプラマイシン１００μｇ／ｍＬを同時に含有するＬＢプレートを用いて陽性クローンをスクリーニングした。相同な断片を有する組換えプラスミドがゲノムのＨ１とＨ２が存在する特定の位置に組み込まれた当該陽性クローンを、第一の相同組換え菌とした。第一の相同組換え菌をスクロース１００ｍｇ／ｍＬを含むＬＢプレート上に画線状に塗布して、単一のクローンを培養し、これらの単一のクローンからカナマイシン耐性のないクローンをスクリーニングし、プライマーｐｈａＪ ＦｐとｐｈａＪ ＲｐによるＰＣＲにより、相応のサイズの組換え菌を同定した。得られた組換え菌はラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ４３である。
（５）ラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ４３において、実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をそれぞれ発現させた。
組換えプラスミドと組換え菌の構築方法は実施例１を参照し、実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種をそれぞれ発現するＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ４３組換え菌を構築した。
構築した組換え菌に対し、実施例１の方法に従って発酵培養およびＰＨＡ生産量の測定を行った。結果は、対照菌（本実施例中のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現しない組換え菌ＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ４３）に対する、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現する組換え菌の、細胞乾燥重量とＰＨＡ含有量における上昇割合が実施例１に相当することを示している。これにより、実施例１でスクリーニングした２６個のアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が同様に、ラルストニア・ユートロファＲｅΔｐｈａＣ：：ｐｈａＣａｃ＿ｐｈａＪ４３菌株の細胞乾燥重量とＰＨＡ含有量を顕著に向上させ、さらにＰＨＡ生産量を顕著に向上させることができることが証明されている。
実施例５ 組換え菌の発酵実験
以上の実施例１、３および４で構築された組換え菌について、他の植物油を炭素源とする発酵実験を行った。すなわち、実施例１、３および４で使用された発酵培地におけるパーム油をそれぞれ大豆油または亜麻仁油に変換し、その他の発酵方法は実施例１と同じであった。結果は、各組換え菌が大豆油または亜麻油を炭素源として発酵を行う場合、その細胞乾燥重量とＰＨＡ生産量がパーム油を炭素源とする場合の結果と一致する傾向にあり、顕著な差異がないことを示している。上記では、一般的な説明および具体的な実施形態を用いて、本発明を詳細に説明したが、本発明に基づいて、いくつかの修正または改善を行ってもよいことは、当業者にとって自明である。従って、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で行われたこれらの修正または改善はいずれも本発明の保護範囲に属する。
本発明は、アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーティング遺伝子を発現する遺伝子操作された微生物、微生物のＰＨＡ生産量を向上させるためのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーティング遺伝子の使用、ならびに微生物のＰＨＡ生産量の向上方法を提供する。微生物においてアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させることで、微生物のＰＨＡの合成および蓄積能力が顕著に向上するとともに、微生物の生物量の向上が促進され、さらにＰＨＡの生産量が効果的に向上する。本発明が提供するアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種及びそのコーティング遺伝子、ならびに遺伝子操作された微生物は、ＰＨＡの生産菌株の開発に新たな遺伝子資源および菌株資源を提供し、ＰＨＡの発酵生産效率の向上および生成コストの低減において、重要な経済価値と応用の見通しを有する。

Claims (6)

  1. 遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファがパーム油を炭素源とした場合に生産するＰＨＡの生産量を向上させるためのアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種またはそのコーディング遺伝子の使用であって、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が、ＷＰ０１８９７３７０７．１であり、前記コーディング遺伝子が、配列番号３で示されるものであることを特徴とする、前記使用。
  2. 前記使用が、
    （１）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドをラルストニア・ユートロファに導入する方式、および
    （２）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の１個または複数のコピーをラルストニア・ユートロファのゲノムに挿入する方式
    のいずれか１種または複数種により実現されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
  3. 前記遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファが、さらに、
    （１）ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、および
    （２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性を向上させる修飾
    を含み、
    前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列が、配列番号２９が示すとおりであり、
    前記（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性の向上が、配列番号３０で示されるプロモーターにて、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
  4. 遺伝子操作されたラルストニア・ユートロファがパーム油を炭素源とした場合に生産するＰＨＡの生産量の向上方法であって、
    ラルストニア・ユートロファを修飾することでアセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種を発現させることを含み、
    前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種が、ＷＰ０１８９７３７０７．１であり、前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子が、配列番号３で示されるものである
    ことを特徴とする、前記向上方法。
  5. 前記発現が、
    （１）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子を含むプラスミドを導入する方式、および
    （２）前記アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ変種のコーディング遺伝子の１個または複数のコピーをゲノムに挿入する方式
    のいずれか１種または複数種により実現されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
  6. 前記方法が、ラルストニア・ユートロファに対して、
    （１）ＰＨＢＨを合成できるＰＨＡポリメラーゼ変種を発現させる修飾、および
    （２）（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性を向上させる修飾
    を行うことをさらに含み、
    前記ＰＨＡポリメラーゼ変種のアミノ酸配列が、配列番号２９が示すとおりであり、
    前記（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼの発現および／または酵素活性の向上が、配列番号３０で示されるプロモーターにて、ゲノム中の（Ｒ）－エノイルＣｏＡヒドラターゼのコーディング遺伝子の転写を開始させることにより実現されることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
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