JP7551760B2 - 哺乳動物細胞培養プロセス - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、細胞培養、及び哺乳動物細胞における組換えタンパク質又は組換えウイルスの産生の分野に関する。本発明は特に、乳酸塩及び高濃度のシステインを与える新規フィード培地、並びに哺乳動物細胞を培養するための方法、又は異種タンパク質若しくは組換えウイルスなどの関心対象の産物を該フィード培地を使用して産生するための方法に関する。
本発明は、細胞培養、及び哺乳動物細胞における組換えタンパク質又は組換えウイルスの産生の分野に関する。本発明は特に、乳酸塩及び高濃度のシステインを与える新規フィード培地、並びに哺乳動物細胞を培養するための方法、又は異種タンパク質若しくは組換えウイルスなどの関心対象の産物を該フィード培地を使用して産生するための方法に関する。
発明の背景
バイオ医薬品工業における組換え治療用タンパク質の大半は、正確なタンパク質の折り畳み及び翻訳後修飾の能力に因り、哺乳動物細胞培養によって産生される。哺乳動物培養系内では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、工業的生産プロセスにおいて最適な宿主である。それらの主な利点は、それらのヒトに似た翻訳後修飾パターンである。さらに、ＣＨＯ細胞は、安全な宿主であることがすでに証明されており、新規な治療薬の製造のために承認される可能性が高い。高品質の産物を産生する高い生産性を有する安定なＣＨＯ細胞株の開発は、過去数年間の間に十分になされてきたが、細胞培養の成績のさらなる改善が絶えず必要とされる。しかしながら、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０及びＢＨＫ２１などの他の哺乳動物細胞株も、タンパク質の発現又はウイルスの産生のためにバイオ医薬品工業において使用され得る。
バイオ医薬品工業における組換え治療用タンパク質の大半は、正確なタンパク質の折り畳み及び翻訳後修飾の能力に因り、哺乳動物細胞培養によって産生される。哺乳動物培養系内では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、工業的生産プロセスにおいて最適な宿主である。それらの主な利点は、それらのヒトに似た翻訳後修飾パターンである。さらに、ＣＨＯ細胞は、安全な宿主であることがすでに証明されており、新規な治療薬の製造のために承認される可能性が高い。高品質の産物を産生する高い生産性を有する安定なＣＨＯ細胞株の開発は、過去数年間の間に十分になされてきたが、細胞培養の成績のさらなる改善が絶えず必要とされる。しかしながら、ＨＥＫ２９３、ＮＳ０及びＢＨＫ２１などの他の哺乳動物細胞株も、タンパク質の発現又はウイルスの産生のためにバイオ医薬品工業において使用され得る。
プロセス開発のための主な戦略は、培地の設計である。なぜなら、細胞は、その環境と常に相互作用しているからである。増殖、生産性、及び産物の品質は、使用される培地の選択及び組成に直接影響を受ける。栄養分に関する細胞の需要を満たし、かつ阻害性物質の蓄積を最小限とするための、細胞培養培地の最適化は、プロセスの成績に対して多くの影響を及ぼす。
培地の組成が詳細に観察されなければならないだけでなく、培地の開発に関して、細胞の代謝のより深い理解が、等しく非常に重要である。ＣＨＯ細胞及び他の哺乳動物細胞の代謝は、炭素源及び窒素源などの物質の非効率的な高い取り込みによって特徴付けられ、これらの物質は、高濃度の細胞障害性又は阻害性の副産物、例えば乳酸塩、アンモニア、及び様々な他の増殖阻害性代謝物に至る。細胞障害性又は阻害性の副産物は、フェッドバッチプロセスにおいて特に問題である。なぜなら、培地は交換されず、よって、細胞障害性副産物が、時間と共に蓄積するからである。
哺乳動物細胞及び特にＣＨＯ細胞のそうした負の特徴を克服する目的で、ｐＨ、温度又はｐＣＯ２などのプロセスパラメーターに影響を及ぼす、数多くの戦略が開発され適用されてきた。さらに、複雑なフィーディング戦略及び細胞株の工学操作が、阻害性化合物の形成を減少させるために適用される。
近年、改善された増殖、生産性、及び産物の品質に主に焦点を当てた、バイオ医薬品の生産のための哺乳動物細胞を用いたバイオプロセスが、十分に開発されている。高い細胞接種密度（ＳＣＤ）の使用により、細胞の非生産的な増殖期は回避され、改善された空時収量がもたらされる。しかしながら、培地の設計を調整することによる、最適化された栄養分の細胞への供給の需要は、高い細胞接種密度を有する培養液についてさらにより顕著である。なぜなら、このような培養液は、生存率の低下、特にプロセスの終了時に向けての生存率の低下をもたらし得る、阻害性又は細胞障害性の可能性のある代謝物を蓄積する傾向がより高いからである。
したがって、高密度な哺乳動物細胞培養液の増殖を支持し、同時に多量のタンパク質の産生を支持する、安定な培地のさらなる開発の要望は依然としてますます増大している。歴史的には、動物細胞の培養用の培地は、血漿、血清、又は組織抽出物を含み、これらは、これらの複合培地成分の高度な多様性及び成分が不明瞭であること及び生得のウイルス汚染のリスクを有することに因り、不安定かつ非常に変わりやすい培養プロセスをもたらした。それ以来、所定の化合物しか含有していない、化学組成の規定された無血清培地の使用が、増加し、今日のバイオ医薬品工業における標準である。
細胞培養培地は大半が、エネルギー源、例えば炭水化物又はアミノ酸、脂質、ビタミン、微量元素、塩、増殖因子、ポリアミン、及び非栄養成分、例えば緩衝液、界面活性剤、又は消泡剤からなる。フェッドバッチ培養に使用される培地は、２つの亜群に分類することができる：プロセス培地（Ｐ培地）すなわち基礎培地及びフィード培地（Ｆ培地）。基礎培地は、初期の濃度で全ての必須成分を含有し、接種のために使用される。フィード培地は大部分が、プロセス中に高濃度の栄養分を提供する。したがって、細胞培養培地は、多くの異なる化合物の複合組成物であり、そして改善された増殖、生産性、又は産物の品質をもたらす化合物を同定することは難題である。近年の培地の開発における主な難題の１つは、異なる条件下で培養された異なる細胞株に適用可能な培地の実現である。培地は、使用される細胞株が、共通の発現ベクターを用いて共通の宿主から得られるという前提下で使用され、このことは、栄養分の供給に関してそれらの同じような要求を意味する。このアプローチは、時系列を短縮させ、培地の細胞株特異的な調整を回避することによって、迅速なプロセスの開発を可能とする。培地の設計はまた、製造の上流における所望の分子の重要な品質特性に対して大きな影響を及ぼし、これは、市場に出ている又は開発中である多種多様なバイオ医薬品を考えると、培地の開発のさらなる課題となる。培地の設計の複雑さに加えて、様々な培養技術は、培地組成の選択について様々な要求を暗示している。最適化されたフィーディング戦略又はプロセスの種類の選択では、例えば高い生細胞密度（ＶＣＤ）を支持する灌流における、補充についての要求は異なる。したがって、細胞培養培地は、多くの異なる化合物の複雑な組成物であり、改善された増殖、生産性、又は産物の品質をもたらす化合物を同定することは課題である。
システインは、哺乳動物細胞培養培地の定型的な成分である。それは必須アミノ酸であるとは考えられていないが、それにも関わらず、細胞培養及びタンパク質合成のための重要なアミノ酸であると考えられている。当技術分野において、不十分なシステインレベルは、タンパク質力価の低下をもたらすことが知られている。特に、フィード中の不十分なシステインレベルは、細胞内のシステインの枯渇をもたらす可能性がある。この枯渇は、抗酸化分子、例えばグルタチオン（ＧＳＨ）及びタウリンなどに負の影響を及ぼし、複数の有害な細胞性作用を伴う酸化的ストレスをもたらす。システインは細胞培養培地の必須成分であることが知られているが、しかしながら、より高い濃度のシステインのフィーディングは、不適切なジスルフィド結合対形成及び細胞外環境における増加したタンパク質の凝集をもたらす可能性がある（Ali A. S., et al., Biotechnol. J., 2019, 14: 1800352）。
乳酸塩は、他方で、細胞増殖及び生存率に対して有害な作用を及ぼす、所望ではない副産物として知られている。高いレベルの乳酸塩は、細胞培養プロセスに対して明らかに負の影響を及ぼすことが報告され、それ故、後期培養段階において乳酸塩の蓄積を減少させる及び／又は乳酸塩の消費を誘導することが試みられた（Li J., et al., Biotechnol Bioeng, 2012, 109(5): p 1173-1186）。したがって、先行技術に記載されているように、哺乳動物細胞培養液中の乳酸塩の蓄積又は乳酸塩の産生は、アスパラギンと酸性シスチンの組合せを含んでいる培地によって回避されたが（国際公開公報第２００６/０２６４０８号、例えば実施例１０、図４２）、特に乳酸塩は減少せず、むしろ、廃棄物と考えられ、よって、細胞培養液には添加もフィードもされなかった。Li et al.は、代替的なフィードバックによりｐＨを制御する戦略として乳酸塩を使用し、初めて、乳酸塩を消費する代謝状態下で、外因性の乳酸塩のフィーディングが、プロセスの利点をもたらし得、特に低下したアンモニウムレベル及びより低い二酸化炭素レベルをもたらし得る。アンモニアは、アミノ酸代謝の副産物であり、細胞増殖に対して負の影響を及ぼす。欧州特許第２１３５９４６Ａ１号及びKishishita et al., J. Biosci Bioeng. (2015), 120 (1), 78-84のような他の当技術分野の最新技術の文書は、とりわけ乳酸塩を含んでいる培養培地を用いる細胞培養プロセスを開示しているが、これは回避されるべきであるか又は低濃度に維持されるべきである、所望ではない廃棄物であると思われることを明確に教義している（欧州特許第２１３５９４６Ａ１号の段落［００４６］及びKishishita et al., p. 81、左欄、第２段落、１～３行を参照）。
Ritacco F.V. et al, Biotechnol. Prog., 2018, 34(6): 1407-1426は、ＣＨＯ細胞培養培地の開発のいくつかのアプローチを概説している。それは、１４０８頁から１４１０頁にかけての段落において、グルコースの消費による生成物としての乳酸塩は、哺乳動物細胞培養液中の細胞の増殖を阻害し得ることを開示している。それぞれの分析は、指数関数的増殖期において、ＣＨＯ細胞は主に、好気性解糖を介してエネルギーを生成し、酸素濃度に関係なく乳酸塩を産生し、一方、静止期の細胞は殆ど、酸化的リン酸化を行ない、乳酸塩を消費する。しかし、一般的にこの開示から、乳酸塩は回避されるべきであることを導くことができる。さらに、上昇したアスパラギン濃度は、乳酸塩及びアンモニウムを減少させるのに有用であり得るが（１４１２頁、左欄、第４段落、１８～２０行）、この文脈におけるシステインの役割は議論されていない。
高収量の異種タンパク質及び組換えウイルスを含むバイオ医薬品を高い製品の品質で生産するために、フェッドバッチ培養液中で哺乳動物細胞を培養するためのさらに改善された方法の需要がますます増加している観点から、改善された細胞培養培地、及び該細胞培養培地を使用した方法の必要性が依然としてある。それ故、本発明の目的は、哺乳動物細胞における関心対象の産物の産生のための、改善されたフェッドバッチ法を提供することである。
発明の要約
本発明は、細胞培養の成績及び／又は製品の品質に対する、乳酸塩及びシステインの驚くべき組合せ効果に関する。
本発明は、細胞培養の成績及び／又は製品の品質に対する、乳酸塩及びシステインの驚くべき組合せ効果に関する。
１つの態様では、（ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；（ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；（ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；（ｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び（ｅ）場合により、関心対象の産物を単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて関心対象の産物を産生する方法が提供される。好ましくは、フィード培地は、１日１回、より好ましくは連続的に添加される。関心対象の産物は好ましくは、異種タンパク質又は組換えウイルスであり、並びに／あるいは基礎培地及びフィード培地は好ましくは、無血清であり、かつ化学組成が規定されている。特定の好ましい実施態様では、乳酸塩／システインのモル比は、約１０：１から５０：１、好ましくは約１０：１から約３０：１である。
乳酸塩は、３mmol/Ｌ/日以上、５mmol/Ｌ/日以上、７mmol/Ｌ/日以上、又は１０mmol/Ｌ/日以上で添加され得る。特定の実施態様では、細胞培養培地中の乳酸塩は、０．５ｇ/Ｌ以上、１ｇ/Ｌ以上、２ｇ/Ｌ以上、好ましくは２から４ｇ/Ｌで維持される。
システインは、システイン又はその塩及び／若しくは水和物、シスチン又はその塩、あるいはシステインを含んでいるジペプチド又はトリペプチドとして提供され得る。提供される形状に関係なく、システインは、０．２５mM/日以上、０．３mM/日以上、又は０．４mM/日以上で添加され得る。
特定の実施態様では、核酸は異種タンパク質をコードし、産物の力価及び／又は細胞の比生産性は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の産物の力価及び／又は細胞の比生産性と比較して増加し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下でシステインが添加されている。代替的には又はそれに加えて、核酸は異種タンパク質をコードし、異種タンパク質の集団における高マンノース構造の相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下でシステインが添加されている。好ましくは、高マンノース構造はマンノースを５個持つ構造である。代替的には又はそれに加えて、核酸は異種タンパク質をコードし、異種タンパク質の集団における酸性種の（合計に対する）相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。
異種タンパク質は好ましくは、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質である。１つの実施態様では、抗体、二重特異的抗体又は三重特異的抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である。
ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；及びｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて哺乳動物細胞を培養する方法も提供される。
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて哺乳動物細胞を培養する方法も提供される。
別の態様では、ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における酸性種を減少させる方法が提供され；ここで、異種タンパク質の集団における酸性種の相対量は、同じ方法によって産生される異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における酸性種を減少させる方法が提供され；ここで、異種タンパク質の集団における酸性種の相対量は、同じ方法によって産生される異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。
さらに別の態様では、ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における高マンノース構造を減少させる方法が提供され；ここでの異種タンパク質の集団における高マンノース構造の相対量は、同じ方法によって産生される異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでの高マンノース構造はマンノースを５個持つ構造である。
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における高マンノース構造を減少させる方法が提供され；ここでの異種タンパク質の集団における高マンノース構造の相対量は、同じ方法によって産生される異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでの高マンノース構造はマンノースを５個持つ構造である。
さらに別の態様では、（ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；（ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；（ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；（ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び（ｅ）場合により、異種タンパク質を哺乳動物細胞から単離する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて異種タンパク質を産生する場合に、産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐ方法が提供され；ここで異種タンパク質の集団における産物の品質の特徴に対する負の作用は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地は、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて異種タンパク質を産生する場合に、産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐ方法が提供され；ここで異種タンパク質の集団における産物の品質の特徴に対する負の作用は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地は、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。
本発明に記載の方法に使用される哺乳動物細胞は、任意の哺乳動物細胞又は細胞株であり得、好ましくは哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である。
本発明に記載の方法のいずれかによって、好ましくは本明細書に記載のようなフェッドバッチプロセスにおいて産生される、異種タンパク質における酸性種を減少させる又は異種タンパク質における高マンノース構造を減少させる方法によって産生される異種タンパク質も提供される。異種タンパク質はまた、本明細書に記載のような異種タンパク質を産生する場合に、産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐ方法によって産生され得る。
さらに別の態様では、本発明は、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における酸性種を減少させるための、フィード培地中の乳酸塩の使用に関し、ここでのフィード培地には、０．２２５mM/日以上でシステインが添加されている。
フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における高マンノース構造を減少させるための、フィード培地中の乳酸塩の使用も提供され、ここでのフィード培地は、０．２２５mM/日以上でシステインを含む。好ましくは、高マンノース構造は、マンノースを５個持つ構造である。
フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質の産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐための、フィード培地中の乳酸塩の使用も提供され、好ましくは、ここでの産物の品質の特徴に対する負の作用は、増加した高マンノース構造、増加した低分子量種、及び／又は増加した酸性種である。
フェッドバッチプロセスにおける異種タンパク質の力価及び／又は細胞の特異的生産性を増加させるための、フィード培地中の乳酸塩及びシステインの使用も提供される。好ましくは、フェッドバッチプロセスは、哺乳動物細胞を培養する工程を含み、ここでの哺乳動物細胞は好ましくはＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である。
さらに別の態様では、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/mM）で乳酸塩及びシステインを含んでいる、哺乳動物細胞のフェッドバッチ培養のためのフィード培地が提供される。好ましくは、フィード培地は、別々に添加するための１つ以上のフィード補助物質を含む。
さらに別の態様では、（ａ）乳酸塩及び場合によりシステインを含んでいる、哺乳動物細胞のフェッドバッチ培養のための濃縮フィード培地、及び（ｂ）システインを含んでいる濃縮フィード培地とは隔離された水性補助物質を含んでいる、キットが提供され、ここでのフィード培地及び補助物質は、細胞培養出発容量の５％未満、好ましくは３．５％未満の１日１回の添加で、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/mM）及び０．２２５mM/日以上のシステインを与える。
発明の詳細な説明
「含んでいる」又は「含まれた」という一般的な実施態様は、より具体的な実施態様である「からなる」を包含する。さらに、単数形及び複数形は、限定された意味で使用されない。本明細書において使用する単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、単数形のみを示すと明記されていない限り、単数形と複数形の両方を示す。
「含んでいる」又は「含まれた」という一般的な実施態様は、より具体的な実施態様である「からなる」を包含する。さらに、単数形及び複数形は、限定された意味で使用されない。本明細書において使用する単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」は、単数形のみを示すと明記されていない限り、単数形と複数形の両方を示す。
「細胞培養」又は「細胞培養液」という用語は、全ての規模で（例えばマイクロタイタープレートから大規模な工業的バイオリアクターまで、すなわちmL規模以下から１０，０００Ｌを超える規模まで）、全ての異なるプロセスモードで（例えばバッチ培養、フェッドバッチ培養、灌流培養、連続培養）、全てのプロセス制御モード（例えば非制御、完全自動化、及び例えばｐＨ、温度、酸素含量の制御を伴う制御されたシステム）で、全種類の発酵システム（例えば使い捨てシステム、ステンレス鋼システム、ガラス製品システム）での、細胞の培養及び発酵のプロセスを含む。本発明によると、細胞培養は、哺乳動物細胞培養であり、かつフェッドバッチ培養である。好ましい実施態様では、細胞培養液は、１Ｌを超える、好ましくは２Ｌを超える、１０Ｌを超える、１，０００Ｌを超える、５０００Ｌを超える、より好ましくは１０，０００Ｌを超える容量の細胞培養である。
本明細書において使用する「フェッドバッチ」という用語は、細胞に、栄養分を含有しているフィード培地が連続的に又は周期的にフィードされる、細胞培養液に関する。フィーディングは、細胞培養開始直後の０日目に、又はより典型的には培養開始から１日後、２日後、又は３日後に開始され得る。フィーディングは、前以て決められた計画に従い得、例えば毎日、２日間毎に、３日間毎になどである。あるいは、培養液は、細胞増殖、栄養分、又は毒性の副産物についてモニタリングされ得、フィーディングは、それに応じて調整されてもよい。一般的には、以下のパラメーターが連日決定されることが多く、これらは、生細胞濃度、産物の濃度（力価）、及びいくつかの代謝物、例えばグルコース、ｐＨ、乳酸塩、モル浸透圧濃度（塩含量の尺度）、及びアンモニウム（増殖速度に負に影響を及ぼし、かつ生存バイオマスを減少させる増速阻害物質）を対象とする。バッチ培養（フィーディングを伴わない培養）と比較して、より高い産物の力価に、フェッドバッチモードでは到達することができる。典型的には、フェッドバッチ培養を、ある時点で停止させ、細胞及び／又は培地を収集し、関心対象の産物、例えば異種タンパク質又は組換えウイルスを単離及び／又は精製する。フェッドバッチプロセスは典型的には、約２～３週間、例えば約１０～２４日間、約１２～２１日間、約１２～１８日間、好ましくは約１２～１６日間維持される。特に、異種タンパク質の産生のためのフェッドバッチプロセスは典型的には、約２～３週間、例えば約１０～２４日間、約１２～２１日間、約１２～１８日間、好ましくは約１２～１６日間維持される。
組換えウイルス産生のために、細胞に典型的には、所望の細胞密度で組換えウイルスを形質導入する。フィーディングは、細胞培養開始直後の０日目に、又はより典型的には培養開始から１日後、２日後、又は３日後に開始され得、ここでの細胞は、細胞接種時に、又は特定の期間の後、所望の細胞密度に到達した時（これは、フィーディンの開始された後、例えば培養開始後１～７日目、好ましくは培養開始後２～５日目、より好ましくは培養開始後３～５日目であり得る）に、所望の細胞密度で組換えウイルスが形質導入される。あるいは、細胞は、組換えウイルスをコードしている１つ以上の核酸分子を用いて安定にトランスフェクトされても、又は、細胞は、組換えウイルスをコードしている１つ以上の核酸分子を用いて一過性にトランスフェクトされても、又はその組合せであってもよい。哺乳動物細胞へのウイルスの形質導入と同様に、一過性のトランスフェクションでは細胞は、細胞接種時に、又は特定の期間の後、所望の細胞密度に到達した時（これは、フィーディンの開始された後、例えば培養開始後１～７日目、好ましくは培養開始後２～５日目、より好ましくは培養開始後３～５日目であり得る）に、所望の細胞密度で、組換えウイルスをコードしている１つ以上の核酸がトランスフェクトされ得る。
定義によると、宿主細胞に導入されたの任意の核酸、配列、又は遺伝子は、導入された配列が、宿主細胞内の内因性の核酸、配列、又は遺伝子と同一であったとしても、宿主細胞に対する「異種核酸」、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種ＲＮＡ」又は「導入遺伝子」又は「組換え遺伝子」と呼ばれる。よって、「異種」又は「組換え」タンパク質又はＲＮＡは、異種の核酸、配列、又は遺伝子、好ましくはＤＮＡから発現されるタンパク質又はＲＮＡである。好ましい実施態様では、導入された核酸、配列、又は遺伝子は、問題の宿主細胞の内因性の核酸配列又は遺伝子とは同一ではない。
本明細書において使用する「コードする」又は「をコードする」という用語は広義には、ポリマー巨大分子内の情報を使用して、第一の分子とは異なる第二の分子の産生を指令する、任意のプロセスを指す。第二の分子は、第一の分子の化学的性質とは異なる化学構造を有していてもよい。例えば、いくつかの態様では、「コードする」という用語は、半保存的ＤＮＡ複製プロセスを説明し、ここでは二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる新規に合成された相補的姉妹鎖をコードするための、鋳型として使用される。他の態様では、ＤＮＡ分子は、ＲＮＡ分子（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する転写プロセスによって）をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は、翻訳というプロセスにおけるように、ポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスを説明するために使用される場合、「コードする」という用語はまた、アミノ酸をコードするトリプレットコドンにまで拡大される。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを取り込む逆転写酵素プロセスによって、ＤＮＡ分子をコードすることができる。別の態様では、ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードすることができ、ここではその場合に使用されるような「コードする」は、転写プロセスと翻訳プロセスの両方を取り込むと理解される。
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は同義語として使用される。これらの用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語はまた、グリコシル化、糖化、アセチル化、リン酸化、酸化、アミド化、又はタンパク質プロセシングを含むがこれらに限定されない反応を通して翻訳後修飾されたタンパク質も含む。修飾及び変化、例えば、他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失又は挿入は、該分子がその生物学的な機能的活性を維持しつつ、ポリペプチドの構造内で行なわれ得る。例えば、特定のアミノ酸配列の置換は、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列内に行なわれ得、類似した又は修飾された特性を有するタンパク質を得ることができる。アミノ酸の修飾は、例えば、その基礎となる核酸配列に対して、部位特異的突然変異誘発又はポリメラーゼ連鎖反応により媒介される突然変異誘発を実施することによって調製されることができる。よって、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語はまた、例えば、免疫グロブリン成分（例えばＦｃ成分）と増殖因子（例えばインターロイキン）からなる融合タンパク質、抗体又は任意の抗体に由来する分子フォーマット若しくは抗体断片も含む。
本明細書において使用する「関心対象の産物」という用語は、哺乳動物細胞において産生される任意の産物、特に、異種タンパク質及び組換えウイルスを指す。
本明細書において使用する「細胞培養培地」という用語は、好ましく緩衝化された培地中に最小限の必須栄養分及び成分、例えばビタミン、微量元素、塩、塊状の塩、アミノ酸、脂質、炭水化物を含んでいる、哺乳動物細胞を培養するための培地である。典型的には、哺乳動物細胞用の細胞培養培地は、ほぼ中性のｐＨ、例えば約６．５～約７．５、好ましくは約６．８～約７．３、より好ましくは約７のｐＨを有する。このような細胞培養培地の非制限的な例としては、市販の培地、例えばＨａｍ Ｆ１２（シグマ社、ダイゼンホーフェン、ドイツ）、ＲＰＭＩ－１６４０（シグマ社）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＩＭＤＭ；シグマ社）、最少必須培地（ＭＥＭ；シグマ社）、イスコフ改善ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；シグマ社）、ＣＤ－ＣＨＯ（インビトロジェン社、カールズバッド、ＣＡ州）、ＣＨＯ－Ｓ（インビトロジェン社）、無血清ＣＨＯ培地（シグマ社）、及びタンパク質非含有ＣＨＯ培地（シグマ社）など、並びに、様々な供給源からの専売特許を有する培地が挙げられる。細胞培養培地は、基礎細胞培養培地であってもよい。細胞培養培地はまた、フィード培地及び／又は添加物が添加された、基礎細胞培養培地であってもよい。細胞培養培地はまた、細胞が発酵槽又はバイオリアクター中で培養されるならば、発酵ブロスとも称され得る。
本明細書において使用する「基礎培地」又は「基礎細胞培養培地」という用語は、以下に定義されているような哺乳動物細胞を培養するための細胞培養培地である。それは、その中で細胞が細胞培養操作開始時から培養される培地を指し、それは典型的には別の培地への添加物としては使用されないが、様々な成分が基礎培地に添加されてもよい。基礎培地は、場合によりさらなる添加物（又は補助物質）及び／又はフィード培地が培養（すなわち細胞培養培地を生じる細胞培養操作）中に添加され得る、基剤としての役目を果たす。基礎細胞培養培地は、細胞培養プロセス開始時から提供される。一般的には、基礎細胞培養培地は、栄養分、例えば炭素源、アミノ酸、ビタミン、塊状の塩（例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウム）、様々な微量元素（例えば硫酸マンガン）、ｐＨ緩衝剤、脂質、及びグルコースを提供する。主要な塊状の塩は通常、基礎培地中にのみ提供され、細胞培養液中の最終モル浸透圧濃度は約２８０～３５０ミリオスモル/kgを超えるべきではなく、よって、細胞培養液は、妥当な浸透圧ストレスで成長及び増殖することができる。
本明細書において使用する「フィード」又は「フィード培地」という用語は、哺乳動物細胞の培養液中のフィードとして使用される、栄養分の濃縮物／濃縮された栄養組成物に関する。したがって、それは、細胞培養液に添加される、濃縮物として提供される。それは、細胞培養液の希釈を最小限にするために「濃縮されたフィード培地」として提供され、典型的にはフィード培地は、容器中の培養出発容量（ＣＳＶ、０日目の開始容量を意味する）に基づいて、１０～５０ml/Ｌ/日、好ましくは１５～４５ml/Ｌ/日、より好ましくは２０～４０ml/Ｌ/日、さらにより好ましくは３０ml/Ｌ/日で提供される。これは、培養出発容量の約１～５％、好ましくは約１．５～４．５％、より好ましくは約２～４％、さらにより好ましくは約３％の１日１回の添加に相当する。高密度播種又は超高密度播種を使用した培養では、より高いフィーディング速度、例えば１０～５０ml/Ｌ/日、１５～４５ml/Ｌ/日、又は２５～４５ml/Ｌ/日が有益であり得る。これは、培養出発容量の約１～５％、約１．５～４．５％、又は約２．５～４．５％の１日１回の添加に相当する。フィーディング速度は、フィーディング期間中の平均フィーディング速度として理解されるべきである。フィード培地は典型的には、基礎細胞培養培地の全てではなくても大半の成分をより高い濃度で有する。一般的には、フィード培地は、細胞培養中に消費される栄養分、例えばアミノ酸及び炭水化物を置き換え、一方、塩及び緩衝液はあまり重要ではなく、これは一般的に基礎培地と共に与えられる。フィード培地は典型的には、フェッドバッチモードで、（基礎）細胞培養培地／発酵ブロスに添加される。基礎培地に（繰り返し又は連続的に）添加されたフィード培地により、細胞培養培地が得られる。フィードは、連続的な添加若しくはボーラス添加のような異なるモードで、又は灌流に関連した技術（ケモスタット又はハイブリッド灌流システム）を介して添加されてもよい。好ましくは、フィード培地は１日１回添加されるが、より頻繁に、例えば１日２回、又はより低い頻度で、例えば２日間毎に添加されてもよい。より好ましくはフィード培地は、連続的に添加される。栄養分の添加は一般的に、培養中（すなわち０日目以後）に行なわれる。基礎培地とは対照的に、フィード培地は典型的には、主要な塊状の塩（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＭｇＳＯ４、Ｃａ（ＮＯ３）２）などの「モル浸透圧濃度の高い活性な化合物」を除いて、基礎培地と類似している全成分を提供する、高度に濃縮された栄養分溶液（例えば６倍超）からなる。典型的には、減少した塊状の塩を伴なわない又は伴う、６倍又はそれ以上の基礎培地の濃縮液が、化合物の良好な溶解性、及び、細胞培養液中のモル浸透圧濃度を約２７０～５５０ミリオスモル/kg、好ましくは約２８０～４５０ミリオスモル/kg、より好ましくは約２８０～３５０ミリオスモル/kgで維持するのに十分に低いモル浸透圧濃度（例えば２７０～１５００ミリオスモル/kg、好ましくは３１０～８００ミリオスモル/kg）を維持する。フィード培地は、１つの完全なフィード培地として添加されても、又は、細胞培養液に別々に添加するための１つ以上のフィード補助物質を含んでいてもよい。１つ以上のフィード補助物質の使用が、例えば定期的なフィーディング、及びグルコースの添加のためにしばしば実施される要求に応じたフィーディングなどの、異なるフィーディング計画に因り必要とされる場合があり、それ故、典型的には少なくとも別々のフィードとして提供される。１つ以上のフィード補助物質の使用もまた、特定の化合物の低い溶解度、特定の化合物の異なるｐＨにおける溶解度、及び／又は、高濃度でのフィード培地中の化合物の相互作用に因り必要であり得る。フィード培地好ましくは、化学組成が規定されている（場合により組換えタンパク質、例えばインシュリン又はインシュリン様成長因子を含んでいる）。それは、細胞を含有しないか、培養液中の細胞と接触していないか、又は細胞由来の代謝廃棄物を含有していない。したがって、本明細書において使用する「フィード培地」という用語は、細胞培養液から得られた予め調整された培地又は細胞培養液中の培養培地、すなわち細胞の存在下における培養培地（本明細書では細胞培養培地とも称される）を除外する。
本明細書において使用する「フィード補助物質」という用語は、使用前にフィード培地に添加され得るか、又は、フィード培地とは別に基礎培地及び／又は細胞培養培地に添加され得る、栄養分の濃縮物に関する。したがって、化合物は、フィード培地若しくはフィード補助物質と共に提供され得るか、又は化合物は、フィード培地及びフィード補助物質と共に提供され得る。例えば、システインは、フィード培地及びフィード補助物質と共に、２フィード戦略で添加されてもよい。フィード培地として、「フィード補助物質」は、細胞培養液の希釈を回避するために濃縮物として提供される。
細胞培養培地（基礎培地及びフィード培地の両方）は好ましくは、無血清であり、かつ化学組成が規定されている。基礎培地及び／又はフィード培地はさらにタンパク質非含有であってもよい。本明細書において使用する「無血清培地」は、インビトロでの細胞培養のための細胞培養培地を指し、これは動物起源の血清を含有していない。これが好ましいのは、血清が、前記の動物に由来する混入物質、例えばウイルスを含有している可能性があり、血清は組成が十分に規定されておらず、バッチ毎に異なるためである。本発明に記載の基礎培地及びフィード培地は、無血清である。
本明細書において使用する「化学組成の規定された培地」は、この中の全ての成分が既知である、インビトロでの細胞培養に適した細胞培養培地を指す。より具体的には、それは、動物の血清、又は植物、酵母、若しくは動物の加水分解物などのあらゆる補助物質を含まない。それ故、化学組成の規定された培地はまた無血清である。本発明に記載の基礎培地及びフィード培地は好ましくは、化学組成が規定されている。１つの実施態様では、基礎培地及び／又はフィード培地は、無血清であり、かつ化学組成が規定され、場合により組換え増殖因子、例えばインシュリン又はインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）を含む。本明細書において言及されているような基礎培地及び／又はフィード培地は、かつて細胞培養培地を準備するための細胞培養液中にあった、培養しようとする哺乳動物細胞によって産生されたタンパク質を除いた、さらに他のタンパク質を全く含まない。
本明細書において使用する「タンパク質非含有培地」は、タンパク質を全く含んでいない（かつて細胞培養液中で培養しようとした細胞によって産生されたタンパク質を除いて）、インビトロでの細胞培養のための細胞培養培地を指し、ここでのタンパク質は、任意の長さのポリペプチドを指すが、単一のアミノ酸、ジペプチド、又はトリペプチドを除く。具体的には、増殖因子、例えばインシュリン及びインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）は、培地中に存在しない。好ましくは、本発明に記載の基礎培地及びフィード培地は、化学組成が規定され、かつタンパク質非含有である。
本明細書において使用する「生存率」という用語は、当技術分野において公知である方法、例えば自動顕微鏡細胞計数（イノバティスＡＧ社、ビーレフェルト）に基づいたセデックス機器を用いたトリパンブルー排除法によって決定されるような、細胞培養液中の生細胞の比率％を指す。しかしながら、蛍光定量法（例えばヨウ化プロピジウムに基づく）、生細胞のエネルギー代謝を反映するために使用される熱量定量法又は酵素法、例えばＬＤＨ乳酸デヒドロゲナーゼ又は特定のテトラゾリウム塩、例えばアラマーブルー、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）又はＴＴＣ（塩化テトラゾリウム）を使用する方法などの、生存率の決定のための数多くの他の方法が存在する。
本明細書において使用する「産生している」又は「多量に産生している」、「産生」、「産生及び／又は分泌」、「産生している」、「産生細胞」又は「高い収量で産生している」という用語は、核酸によってコードされている関心対象の産物、例えば、異種タンパク質又は組換えウイルスの産生に関する。「増加した産生及び／又は分泌」又は「高い収量での産生」は、関心対象の産物、例えば異種タンパク質又は組換えウイルスの発現に関し、異種タンパク質の脈絡において、細胞の比生産性の増加、増加した力価、細胞培養液の増加した全体的な生産性、又はその組合せを意味する。組換えウイルスの脈絡では、それは、細胞特異的及び／又は産生された全粒子の増加、細胞特異的及び／又は全感染性粒子の増加、あるいはその組合せを意味する。本明細書において使用する増加した力価は、同じ容量中の増加した濃度、すなわち、全収量の増加に関し、これは、異種タンパク質並びに組換えウイルスの為に使用され得る。
本明細書において使用する「増強」、「増強した」、「増強した」、「増加」、又は「増加した」という用語は一般的には、対照細胞培養液と比較して少なくとも約１０％の増加、例えば対照細胞培養液と比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％、又は少なくとも約２００％、又は少なくとも約３００％の増加、又は１０～３００％の間の任意の整数の増加を意味する。本明細書において使用する「対照細胞培養液」又は「対照哺乳動物細胞培養液」は、本発明に記載の同じ方法を使用した、同じ産物を産生する同じ細胞（同じ細胞クローン）を使用した細胞培養液であり、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において、０．１９mM/日以下のシステインが添加されている。
関心対象の産物を産生する方法
１つの態様では、本発明は、ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、関心対象の産物を単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて関心対象の産物を産生する方法に関する。好ましくは、関心対象の産物は、異種タンパク質又は組換えウイルス、より好ましくは異種タンパク質である。
１つの態様では、本発明は、ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、関心対象の産物を単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて関心対象の産物を産生する方法に関する。好ましくは、関心対象の産物は、異種タンパク質又は組換えウイルス、より好ましくは異種タンパク質である。
ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；及びｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて哺乳動物細胞を培養する方法も提供する。場合により、関心対象の産物はさらに精製又は単離されてもよい。好ましくは、関心対象の産物は、異種タンパク質又は組換えウイルス、より好ましくは異種タンパク質である。
本発明に記載の方法に使用されるフィード培地は、フェッドバッチプロセスのフィーディング期間中、１日１回、好ましくは連続的に添加される。１つの実施態様では、フィード培地は、０日目から５日目に開始して添加される。当業者は、これはまた、播種密度にも依存し得ることを理解しているだろう。通常の播種密度（０．７～１×１０６個の細胞/ml）では、フィーディングは典型的には、１～５日目、好ましくは２～３日目に開始される。フィーディングは典型的には、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも５日前まで、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも４日前まで、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも３日前まで、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも２日前まで、好ましくはプロセスの終了まで継続される。より好ましくはフィーディングは、２～３日目に開始され、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも２日前まで、より好ましくは細胞のフェッドバッチプロセスの終了まで継続される。高い播種密度（１超～４×１０６個の細胞/ml）のために、フィーディングは典型的には、０～４日目に、好ましくは０～２日目に開始される。フィーディングは典型的には、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも５日前まで、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも４日前まで、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも３日前まで継続され、プロセスの終了まで継続されてもよい。好ましくは、フィーディングは０～２日目に開始され、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも４日前又は３日前まで継続される。超高播種密度（４超～２０×１０６個の細胞/ml）のために、フィーディングは典型的には、０～３日目に、好ましくは０～１日目に開始される。フィーディングは典型的には、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも５日前まで、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも４日前まで、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも３日前まで継続され、プロセスの終了まで継続されてもよい。好ましくは、フィーディングは、０日目に開始され、フェッドバッチプロセスの終了の少なくとも４日前又は３日前まで継続される。したがって、フィード培地の添加開始に応じて、該方法はさらに、工程ｂｉ）から工程ｂ）（哺乳動物細胞を接種する工程）及びｃ）（フィード培地を添加する工程）を含み得、工程ｂｉ）は、基礎培地中で哺乳動物細胞を培養する工程を含む。乳酸塩又はシステインの添加を定義するための、本明細書において使用する「mmol×Ｌ－１×日－１」という単位はまた、mmol/Ｌ/日又はmM/日とも称され得る。それは、添加がボーラスの添加であるか、又は連続的な添加であるかに関係なく、１日あたりに与えられるmmol/Ｌを指す。本発明によると、細胞は好ましくは、工程（ｃ）において、及び／又は乳酸塩が培養液に添加される時に乳酸塩を消費する代謝状態にある。
本明細書において使用する「接種している」という用語は、哺乳動物細胞株などの、哺乳動物細胞の試料を収集する工程、及びそれらを増殖に必要とされる栄養分を含有する培地に入れる工程を指す。典型的には、哺乳動物細胞は、増殖又は産生のための基礎培地に入れられる。この工程は、播種とも称され得る。哺乳動物細胞は、異なる播種密度で基礎培地に接種してもよい。本明細書において言及されているような「播種する」又は「通常の播種」という用語は、約０．７～１×１０６個の細胞/mlから約１×１０６個の細胞/mlの標準的な播種密度を指し、「高播種」という用語は、１×１０６個の細胞/ml超から約４×１０６個の細胞/mlの播種密度を指し、「超高播種」という用語は、４×１０６個の細胞/ml超から約２０×１０６個の細胞/ml又はさらにはそれより高い、好ましくは約６×１０６個の細胞/mlから約１５×１０６個の細胞/ml、より好ましくは８×１０６個の細胞/mlから約１２×１０６個の細胞/mlの播種密度を指す。
乳酸塩／システインのモル比は、約１０：１から５０：１、好ましくは約１０：１から約３０：１、好ましくは約１５：１から約３０：１であり得る。
１つの実施態様では、乳酸塩は、３mmol/Ｌ/日以上、３．８mmol/Ｌ/日以上、５mmol/Ｌ/日以上、好ましくは７mmol/Ｌ/日以上、７．８mmol/Ｌ/日以上、１０mmol/Ｌ/日以上、又はさらには１５mmol/Ｌ/日以上で添加される。
細胞培養培地中の乳酸塩は、０．５ｇ/Ｌ以上、１ｇ/Ｌ以上、好ましくは２ｇ/Ｌ以上、好ましくは２～４ｇ/Ｌ、より好ましくは２～３ｇ/Ｌに維持される。細胞培養培地中の濃度は、乳酸塩が毒性となる５ｇ/Ｌ（約５６mM）より低く維持されるべきである。しがって、細胞培養培地中の乳酸塩の濃度は、約１ｇ/Ｌから約４．５ｇ/Ｌ（約１０～５０mM）、約２ｇ/Ｌから約４ｇ/Ｌ（約２０～４５mM）、好ましくは約２ｇ/Ｌから約３ｇ/Ｌ（約２０～３５mM）で維持される。乳酸塩（分子量＝８９．０７ｇ/mol）は、その塩、エステル、及び／又は水和物、並びに／あるいは乳酸として、好ましくは塩、例えば乳酸ナトリウム（分子量＝１１２．０６ｇ/mol）（ここでの１ｇ/Ｌの乳酸塩は、約１．２５ｇ/Ｌの乳酸ナトリウムに等しい）として提供され得る。例示的な乳酸塩のエステルは、例えば、乳酸エチル又は乳酸ブチルである。乳酸もまた、本発明の脈絡において使用されてもよい。しかしながら、それは、フィード培地のｐＨに影響を及ぼす可能性があり、したがって、好ましくはそれを水酸化ナトリウムで滴定して、フィード培地の成分への添加前又はそれとの混合前に乳酸ナトリウムとする。乳酸塩の塩、エステル、及び／若しくは水和物、又は乳酸は、本明細書で提供される乳酸塩の濃度と等モル濃度で提供される。好ましい実施態様では、基礎培地は、培地成分として添加される乳酸塩を含有していない。しかしながら、乳酸塩は、培養中に代謝物として基礎培地中に生成され得る。乳酸塩は、乳酸ナトリウム又は乳酸として得られ、これを水酸化ナトリウムで滴定することにより、フィード培地への添加前に乳酸ナトリウムとする。本明細書において使用する「乳酸塩」という用語は、Ｌ－乳酸塩を指す。したがって、例えば乳酸ナトリウム及び乳酸は、Ｌ－乳酸ナトリウム及びＬ－乳酸を指す。
システインは、システイン又はその塩及び／若しくは水和物、シスチン又はその塩、あるいはシステインを含んでいるジペプチド又はトリペプチドとして提供され得る。システインの塩及び／若しくは水和物、又はシスチン若しくはその塩、又はシステインを含んでいるジペプチド若しくはトリペプチドは、本明細書において提供されるシステインの濃度と等モル濃度で提供される。本明細書において使用する「システイン」及び「シスチン」という用語は、Ｌ－システイン及びＬ－シスチンを指す。本発明によると、システインは、０．２２５mM/日以上で添加され、ここでのシステインは、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じた細胞培養培地に添加される。好ましくは、システインは、０．２５mM/日以上、０．３mM/日以上、より好ましくは０．４mM/日以上、より好ましくは０．５mM/日以上で添加される。１つの実施態様では、システインは、０．２２５mM/日から約０．６mM/日、約０．２５mM/日から約０．６mM/日、約０．３mM/日から約０．６mM/日、又は約０．４mM/日から約０．６mM/日で添加される。
理論によって固めたくはないが、システインはタンパク質合成に、及びグルタチオン（
ＧＳＨ）の生成のために使用される。グルタチオンは、活性酸素種（ＲＯＳ）の除去によって、細胞内酸化還元平衡を維持する、重要な細胞内抗酸化物質として作用する。ＲＯＳは、化学的に反応性が高く、酸素代謝の副産物である。酸化ストレスの最中に、ＲＯＳレベルは上昇し、ＲＮＡ及びタンパク質の損傷を増強し、並びに、アポトーシスを促進する。したがって、システインの添加は、酸化ストレスの低減を介して、酸化還元平衡を維持することができ、これにより、より高い生存率に至り得る。
ＧＳＨ）の生成のために使用される。グルタチオンは、活性酸素種（ＲＯＳ）の除去によって、細胞内酸化還元平衡を維持する、重要な細胞内抗酸化物質として作用する。ＲＯＳは、化学的に反応性が高く、酸素代謝の副産物である。酸化ストレスの最中に、ＲＯＳレベルは上昇し、ＲＮＡ及びタンパク質の損傷を増強し、並びに、アポトーシスを促進する。したがって、システインの添加は、酸化ストレスの低減を介して、酸化還元平衡を維持することができ、これにより、より高い生存率に至り得る。
乳酸塩をより入手し易いことにより、グルコースの代わりにピルビン酸塩の代替の発生源として、好ましい乳酸塩の消費がもたらされ得る。乳酸塩は、細胞培養の初期段階で高度に産生され、細胞培養液中の、特に高密度又は超高密度の細胞培養液中の、乳酸塩の産生から乳酸塩の消費への代謝シフトは、およそ培養３日目である。およそ５日目から、乳酸塩は、特に高密度又は超高密度の細胞培養液中では、補充されることがなければ、制限され得る。多量の乳酸塩の消費は、より低い解糖系への投入量、したがってより低いＴＣＡへの投入量がもたらされると考えられる。これは、活性酸素種の産生の低下と共に、全代謝に影響を及ぼす。乳酸塩とシステインの組合せは、有益であり得る。なぜなら、それらは部分的には同じエフェクターに標的化するからである。システインは、活性酸素種レベルの低減と共に、グルタチオンの抗酸化経路に影響を及ぼし、乳酸塩は代謝をダウンレギュレートし、したがってＲＯＳの産生をダウンレギュレートする。
本発明に記載の方法は、インビトロで細胞を培養する方法であり、異種タンパク質又は組換えウイルスなどの関心対象の産物の高度な発現のために使用される、哺乳動物細胞株の使用を含む。したがって、１つの実施態様では、哺乳動物細胞は哺乳動物細胞株、好ましくは不死化細胞株である。哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株の好ましい例は、ＣＨＯ細胞（例えばＤＧ４４及びＫ１）、ＮＳ０細胞、ＨＥＫ２９３細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞）及びＢＨＫ２１細胞である。好ましくは、哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株は、懸濁液中での増殖に適応している。好ましい実施態様では、哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施態様では、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である。
本明細書において使用する「哺乳動物細胞」という用語は、異種タンパク質又は組換えウイルスなどの関心対象の産物の産生に適した哺乳動物細胞株を指し、これは「宿主細胞」とも称され得る。哺乳動物細胞は好ましくは、形質転換された及び／又は不死化された細胞株である。それらは、細胞培養液中の、好ましくは無血清細胞培養液中の及び／又は好ましくは懸濁培養液としての連続継代に適応し、初代の形質転換されていない細胞、又は器官構造の一部である細胞を含まない。異種タンパク質の産生のために好ましい哺乳動物細胞は、げっ歯類細胞、例えばハムスター細胞、特にＢＨＫ２１細胞、ＢＨＫ ＴＫ－細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞（ＣＨＯ－ＤＵＫＸ細胞又はＤｕｘＢ１１細胞とも称される）、ＣＨＯ－Ｓ細胞及びＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、又はこのような細胞株のいずれかの誘導体／子孫である。特に好ましいのは、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、及びＢＨＫ２１細胞であり、さらにより好ましいのは、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞である。最も好ましいのは、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞である。哺乳動物細胞、特にＣＨＯ－ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のグルタミンシンターゼ（ＧＳ）欠損誘導体も包含される。これらの細胞は、異種タンパク質を安定に発現しているクローンのグルタミンシンターゼに基づいた選択（例えばメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）による選択）に特に適している。本発明の１つの実施態様では、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、好ましくはＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＣＨＯ ＧＳ欠損細胞、又はその誘導体である。
組換えウイルスの産生のために好ましい哺乳動物細胞は、ハムスター又はヒトの細胞、特にＢＨＫ２１細胞、ＢＨＫ ＴＫ－細胞、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞（ＣＨＯ－ＤＵＫＸ細胞又はＤｕｘＢ１１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞及びＣＨＯ－ＤＧ４４細胞とも称される）、及びＨＥＫ２９３細胞、又はこのような細胞株のいずれかの誘導体／子孫である。より好ましくは、組換えウイルスの産生のための哺乳動物細胞は、ヒト細胞、好ましくは無血清懸濁培養に適合した、例えばＨＥＫ２９３細胞及びその誘導体（ＨＥＫ２９３Ｆ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含む）である。
哺乳動物細胞はさらに、異種タンパク質、例えば治療用タンパク質、好ましくは分泌された組換え治療用タンパク質をコードしている、１つ以上の発現カセット（群）を含み得る。宿主細胞はまた、マウス細胞、例えばマウス骨髄腫細胞、例えばＮＳ０細胞及びＳｐ２/０細胞、又はこのような細胞株のいずれかの誘導体／子孫であり得る。本発明の意味に使用され得る哺乳動物細胞の非制限的な例は、表１にも要約されている。しかしながら、こうした細胞、他の哺乳動物細胞（ヒト、マウス、ラット、サル、及びげっ歯類の細胞株を含むがこれらに限定されない）の誘導体／子孫も、本発明に、特にバイオ医薬品タンパク質の生産のために使用され得る。
哺乳動物細胞は、無血清条件下で、及び場合により動物起源のタンパク質／ペプチドを全く含有していない培地中で確立され、適応され、完全に培養された場合に、最も好ましい。市販の培地、例えばＨａｍ Ｆ１２（シグマ社、ダイゼンホーフェン、ドイツ）、ＲＰＭＩ－１６４０（シグマ社）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；シグマ社）、最少必須培地（ＭＥＭ；シグマ社）、イスコフ改善ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；シグマ社）、ＣＤ－ＣＨＯ（インビトロジェン社、カールズバッド、ＣＡ州）、ＣＨＯ－Ｓ（インビトロジェン社）、無血清ＣＨＯ培地（シグマ社）、及びタンパク質非含有ＣＨＯ培地（シグマ社）が、例示的な適切な栄養分溶液である。培地のいずれにも、必要に応じて、様々な化合物が補充され得、その非制限的な例は、組換えホルモン及び／又は他の組換え増殖因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インシュリン様増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコース、又は他の等価なエネルギー源、抗生物質、および微量元素である。任意の他の必要な補助物質も、当業者には公知であろう適切な濃度で含まれていてもよい。選択用遺伝子を発現している遺伝子的に改変された細胞の増殖及び選択のために、適切な選択物質が培養培地に添加される。
本明細書において使用する「異種タンパク質」という用語は、哺乳動物細胞によって天然には発現されず、かつ組換え技術を使用して哺乳動物に導入される、任意のタンパク質を指す。好ましくは、組換え核酸は、哺乳動物細胞に、例えばトランスフェクション又は形質導入によって導入される。核酸は、ゲノムに安定に組み込まれても、又は一過性に発現させてもよい。好ましくは、異種タンパク質をコードしている核酸は、ゲノムに安定に組み込まれる。異種タンパク質の発現のために好ましい哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ細胞、例えばＣＨＯ－ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞である。
異種タンパク質は、任意の治療に関連したタンパク質であり得る。治療用タンパク質の例は、以下に限定されないが、抗体、融合タンパク質、サイトカイン、及び増殖因子である。本発明の方法に従って哺乳動物細胞において産生される異種タンパク質としては、抗体又は融合タンパク質、例えばＦｃ－融合タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。他の異種タンパク質は、例えば、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体、及びその誘導体又は断片、並びに、アゴニスト若しくはアンタゴニストとしての役目を果たし得る及び／又は治療用途若しくは診断用途を有する、任意の他のポリペプチド及び骨格であり得る。
好ましい異種タンパク質は、抗体又はその断片若しくは誘導体、又は融合タンパク質である。したがって、本発明に記載の方法は有利には、抗体、好ましくはモノクローナル抗体の作製のために使用され得る。典型的には、抗体は単一特異的であるが、抗体は多重特異的であってもよい。したがって、本発明に記載の方法は、単一特異的抗体、多重特異的抗体、又はその断片、好ましくは抗体（単一特異的）、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又はその断片、好ましくはその抗原結合断片の作製のために使用され得る。特記されない限り、「抗体」という用語は、単一特異的抗体を指す。本発明の範囲内の例示的な抗体としては、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ４４ｖ６抗体、抗ＣＤ４９ｄ抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＥＧＦＲ１抗体（ＨＥＲ１）、抗ＥＧＦＲ２抗体（ＨＥＲ２）、抗ＧＤ３抗体、抗ＩＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ－５Ｒ抗体、又は抗ＩｇＥ抗体が挙げられるがこれらに限定されず、好ましくは抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４４抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＨＥＲ２/ｎｅｕ抗体（ｅｒｂＢ２）、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ２抗体、及び抗ＩｇＥ抗体からなる群より選択される。
本明細書において使用する「抗体」、「抗体群」、又は「免疫グロブリン（群）」という用語は、分化したＢリンパ球（形質細胞）から、外来物質（＝抗原）に対する宿主生物の反応として自然に形成される、グロブリンの中から選択されたタンパク質に関する。様々なクラスの免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＹ、ＩｇＷ。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体であり、より好ましくはＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体である。免疫グロブリン及び抗体という用語は、本明細書で同義語として使用される。抗体としては、モノクローナル抗体、単一特異的抗体、及び多重特異的（例えば二重特異的又は三重特異的）抗体、一本鎖抗体、抗体の抗原結合断片（例えばＦａｂ断片又はＦ（ａｂ'）２断片）、ジスルフィド結合したＦｖなどが挙げられる。抗体は、任意の種であり得、これには、キメラ抗体及びヒト化抗体が含まれる。「キメラ」抗体は、抗体のドメイン又は領域が異なる種に由来する、分子である。例えば、重鎖及び軽鎖の可変領域は、ラット又はマウスの抗体に由来し得、定常領域はヒト抗体に由来し得る。「ヒト化」抗体では、最小の配列のみが、非ヒト種に由来する。しばしば、ヒト抗体のＣＤＲアミノ酸残基のみが、非ヒト種、例えばマウス、ラット、ウサギ、又はラマのＣＤＲアミノ酸残基で置換されている。時に、抗原結合特異性及び親和性に対して影響を及ぼす、いくつかの重要なフレームワークアミノ酸残基も、非ヒトアミノ酸残基によって置換されている。抗体は、化学合成を通して、組換え手段若しくはトランスジェニック手段を介して、細胞（例えばハイブリドーマ）培養を介して、又は他の手段によって作製されてもよい。
典型的には、抗体は、重鎖と軽鎖によって各々が形成された２対のヘテロダイマーから構成される、四量体ポリペプチドである。ヘテロ二量体並びに四量体ポリペプチド構造の両方の安定化は、鎖間ジスルフィド橋を介して起こる。各鎖は、「免疫グロブリンドメイン」又は「免疫グロブリン領域」と呼ばれる構造ドメインから構成され、ここでの「ドメイン」又は「領域」という用語は、同義語として使用される。各ドメインは、約７０～１１０個のアミノ酸を含有し、緻密な３次元構造を形成している。重鎖及び軽鎖の両方が、そのＮ末端に、抗原の認識及び抗原との結合に関与する、あまり保存されていない配列を有する、「可変ドメイン」又は「可変領域」を含有している。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」とも称され、重鎖の可変領域は「ＶＨ」とも称される。
抗原結合断片としては、例えば「Ｆａｂ断片」（抗原結合断片＝Ｆａｂ）が挙げられるがこれらに限定されない。Ｆａｂ断片は、両鎖の可変領域からなり、これらは隣接する定常領域によって互いに結合している。これらは、慣用的な抗体から、例えばパパインを用いた、プロテアーゼによる消化によって形成され得るが、同じようにＦａｂ断片もまた、遺伝子工学操作によっても作製され得る。さらに抗体断片としては、Ｆ（ａｂ'）２断片が挙げられ、これらはペプシンを用いてのタンパク質分解的切断によって調製され得る。
遺伝子工学操作法を使用して、重鎖（ＶＨ）の可変領域及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）のみからなる、短縮された抗体断片を作製することが可能である。これらは、Ｆｖ断片（可変断片＝可変部分の断片）と称される。これらのＦｖ断片は、定常鎖のシステインによる２本の鎖の共有結合を欠いているので、Ｆｖ断片は安定化されていることが多い。短いペプチド断片、例えば１０～３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸によって、重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域を連結することが有利である。このようにして、ペプチドリンカーによって連結された、ＶＨとＶＬからなる、１本のペプチド鎖が得られる。この種の抗体タンパク質は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている。ｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、当業者には公知である。したがって、抗体断片及び抗原結合断片はさらに、Ｆｖ断片及び特にｓｃＦｖを含む。
近年、多量体誘導体としてｓｃＦｖを調製するための様々な戦略が開発されている。これは、特に、改善された薬物動態特性及び体内分布特性を有する、並びに、増加した結合力を有する、組換え抗体をもたらすことを目的とする。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖは、多量体化ドメインを有する融合タンパク質として調製された。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域又はコイルドコイル構造（らせん構造）、例えばロイシンジッパードメインであり得る。しかしながら、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域間の相互作用を多量体化（例えばディアボディーズ、トリボディーズ及びペンタボディーズ）のために使用する戦略も存在する。ディアボディによって、当業者は、二価ホモ二量体のｓｃＦｖ誘導体を意味する。ｓｃＦｖ分子内のリンカーを５～１０アミノ酸へと短縮化することにより、ホモ二量体が形成され、ここでは鎖間ＶＨ／ＶＬの重ね合わせが起こる。ディアボディーズはさらに、ジスルフィド橋の取り込みによって安定化され得る。ディアボディ－抗体タンパク質の例は、先行技術から公知である。
ミニボディによって、当業者は、二価でホモ二量体のｓｃＦｖ誘導体を意味する。それは、ヒンジ領域（例えばこれもＩｇＧ１に由来する）及びリンカー領域を介して、ｓｃＦｖに接続されている二量体化領域として、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を含有している、融合タンパク質からなる。ミニボディ抗体タンパク質の例は、先行技術から公知である。
トリボディによって、当業者は、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ｓｃＦｖ誘導体（ここでのＶＨ－ＶＬはリンカー配列を伴わずに直接融合している）により、三量体が形成される。
当業者はまた、二価、三価、又は四価の構造を有し、かつｓｃＦｖに由来する、いわゆるミニ抗体をよく知っているだろう。多量体化は、二量体、三量体、又は四量体のコイルドコイル構造によって行なわれる。本発明の好ましい実施態様では、関心対象の遺伝子は、上記のそうした所望のポリペプチドのいずれか、好ましくはモノクローナル抗体、その誘導体、又はその断片をコードしている。
抗体の重鎖のＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインから構成される免疫グロブリン断片は、それらの結晶化特性により（Ｆｃ＝結晶化可能な断片）、「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃ」と呼ばれる。これらは、例えばパパイン又はペプシンを用いたプロテアーゼによる消化によって従来の抗体から形成され得るが、遺伝子工学操作によって作製されてもよい。Ｆｃ断片のＮ末端部分は、どれだけ多くのヒンジ領域のアミノ酸が依然として存在しているかに応じて変化し得る。
抗原結合断片とＦｃ領域とを含んでいる抗体はまた、完全長抗体とも称され得る。完全長抗体は、単一特異的及び多重特異的な抗体、例えば二重特異的又は三重特異的な抗体であり得る。
本発明に記載の好ましい治療用抗体は、多重特異的抗体、特に二重特異的又は三重特異的抗体である。二重特異的抗体は典型的には、１つの分子内に、標的細胞（例えば悪性Ｂ細胞）とエフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージ）に対する抗原結合特異性を組み合わせている。例示的な二重特異的抗体は、以下に限定されないが、ディアボディーズ、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞誘導抗体）フォーマット、及びＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）フォーマットである。ディアボディフォーマットは、２本の別々のポリペプチド鎖上の２つの抗原結合特異性を有する重鎖及び軽鎖の同族の可変ドメインを隔離し、ここで２本のポリペプチド鎖は、非共有結合している。ＤＡＲＴフォーマットは、ディアボディフォーマットに基づいているが、それはＣ末端ジスルフィド橋を通した、さらなる安定化を与える。三重特異的抗体は、３つの抗原結合特異性を組み合わせた、モノクローナル抗体である。それらは、２つの異なる抗体の抗原認識ドメインを１つの二重特異的な分子へと再構成する、二重特異的抗体技術で構築され得る。例えば、癌細胞上のＣＤ３８と、Ｔ細胞上のＣＤ３及びＣＤ２８とに標的化する、三重特異的抗体が作製された。高い産物の品質を有する多重特異的抗体を作製することは特に難しい。
別の好ましい治療用タンパク質は、融合タンパク質、例えばＦｃ融合タンパク質である。したがって、本発明は有利には、融合タンパク質、例えばＦｃ融合タンパク質の作製のために使用され得る。さらに、本発明に従ってタンパク質の産生を増加させる方法は有利には、融合タンパク質、例えばＦｃ融合タンパク質の産生のために使用され得る。
融合タンパク質のエフェクター部分は、天然又は修飾された異種タンパク質の完全配列であっても配列の任意の一部であってもよい。免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリンサブタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、又はＩｇＡ２サブタイプ又はクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭから得ることができる。優先的には、それらは、ヒト免疫グロブリンに、より好ましくはヒトＩｇＧに、さらにより好ましくはヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２に由来する。Ｆｃ融合タンパク質の非制限的な例は、Ｎ結合グリコシル化部位を含んでいる、重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインに結合した、ＭＣＰ１－Ｆｃ、ＩＣＡＭ－Ｆｃ、ＥＰＯ－Ｆｃ、及びｓｃＦｖ断片などである。Ｆｃ融合タンパク質は、Ｎ結合グリコシル化部位を含んでいる重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインを、例えば他の免疫グロブリンドメイン、酵素的に活性なタンパク質部分又はエフェクタードメインを含んでいる別の発現構築物に導入することによる、遺伝子工学操作アプローチによって構築され得る。したがって、本発明に記載のＦｃ融合タンパク質は、例えばＮ結合グリコシル化部位を含んでいる、重鎖免疫グロブリン定常領域のＣＨ２ドメインに連結された、一本鎖Ｆｖ断片も含む。
さらなる態様では、関心対象の産物を産生する方法は、本発明の方法を使用して提供され、これはさらに、関心対象の産物を単離及び／又は精製する工程、並びに場合により関心対象の産物を薬学的に許容される製剤へと製剤化する工程を含む。１つの実施態様では、関心対象の産物は、異種タンパク質又は組換えウイルスである。具体的には、異種タンパク質を産生する方法は、本発明の方法を使用して提供され、これはさらに、異種タンパク質を単離及び／又は精製する工程、並びに場合により異種タンパク質を薬学的に許容される製剤へと製剤化する工程を含む。あるいは、組換えウイルスを産生する方法は、本発明の方法を使用して提供され、これはさらに、組換えウイルスを単離及び／又は精製する工程、並びに場合により組換えウイルスを、例えばワクチン接種又は遺伝子療法のための薬学的に許容される製剤へと製剤化する工程を含む。
異種タンパク質は、治療用タンパク質であり得、特に抗体、抗体断片、抗体誘導体、又はＦｃ融合タンパク質は好ましくは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収／単離される。治療用タンパク質を他の組換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質から精製して、異種タンパク質の実質的に均一な調製物を得ることが必要である。第一工程として、細胞及び／又は粒子状細胞片を、培養培地から除去する。さらに、異種タンパク質は、混入している可溶性タンパク質、ポリペプチド、及び核酸から、例えばイムノアフィニティカラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、セファデックスクロマトグラフィー、及びシリカゲル又は陽イオン樹脂、例えばＤＥＡＥのクロマトグラフィーによって精製される。哺乳動物細胞によって発現される異種タンパク質の精製法は、当技術分野において公知である。
好ましくは、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、多重特異的抗体、例えば二重特異的抗体若しくは三重特異的抗体、又は多重特異的なその抗原結合断片、又は融合タンパク質である。抗体又は多重特異的抗体（例えば二重特異的又は三重特異的抗体）は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体、好ましくはＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ４抗体であり得る。
別の実施態様では、関心対象の産物は、組換えウイルスである。本明細書において使用する「組換えウイルス」という用語は、特に遺伝子療法に適した、又は養子細胞移植用の細胞の修飾に適した、組換え技術を使用して産生された任意のウイルスを指す。組換えウイルスはまた、修飾されたタンパク質及び／又はウイルスに対して異種であるタンパク質も発現し得る。好ましい組換えウイルスとしては、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、組換えウイルスは、アデノ随伴ウイルス又は水疱性口内炎ウイルスである。アデノ随伴ウイルス又は水疱性口内炎ウイルスの産生に好ましい哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体である。組換えウイルスの産生のために、哺乳動物細胞は、組換えウイルスをコードしている核酸を含むように、安定に及び／又は一過性にトランスフェクトされ得るか、あるいは、哺乳動物細胞は、ウイルスを効率的に産生するように、組換えウイルスをコードしている核酸を含むように形質導入され得る。例えば、ＶＳＶは、無血清懸濁培養液中のＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体などの哺乳動物細胞の形質導入によって産生され得る。したがって、１つの実施態様では、本発明は、ａ）組換えウイルスをコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）組換えウイルスの発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、関心対象の産物を単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて関心対象の産物を産生する方法に関する。
組換えウイルスをコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程である工程（ａ）は、組換えウイルスをコードしている核酸を導入するための、細胞を形質導入又はトランスフェクトする工程を含み、ここでのトランスフェクションは、一過性トランスフェクションであっても、安定したトランスフェクションであっても、又はその組合せであってもよく、ここでのトランスフェクションは、プラスミドなどの複数の核酸分子の同時トランスフェクションを含み得る。組換えウイルスをコードしている核酸を含んでいる安定にトランスフェクトされた細胞では、組換えウイルスをコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞（異種タンパク質をコードしている安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞と同様に）が、基礎培地中に接種されることにより細胞培養液が得られ、一過性トランスフェクション又は形質導入が、基礎培地中に接種された哺乳動物細胞の接種により細胞培養液がもたらされた後、さらにはフィーディングが開始された後にさえ、行なわれ得る。哺乳動物細胞は、組換えウイルスをコードしている１つ以上の核酸分子を用いて一過性にトランスフェクトされ得るか、又は所望の細胞密度で組換えウイルスを用いて形質導入され得、フィーディングは、細胞培養を開始した直後である０日目又はそれ以後、典型的には培養を開始した１日後、２日後、又は３日後に開始され得、これは、哺乳動物細胞をトランスフェクト又は形質導入した前であっても後であってもよい。好ましい実施態様では、細胞は、組換えウイルスをコードしている１つ以上の核酸分子を用いて一過性にトランスフェクトされるか、又は、細胞接種時に若しくは一定の期間の後、所望の細胞密度に到達した時（これは、フィーディングが開始された後、例えば培養開始後１～７日目、好ましくは培養開始後２～５日目、より好ましくは培養開始後３～５日目であり得る）に、所望の細胞密度で組換えウイルスを用いて形質導入される。好ましくは、ＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体（例えばＨＥＫ２９３Ｆ細胞又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、接種後及び場合によりフィーディング後に、組換えウイルス（例えばＶＳＶ）を用いて形質導入して、組換えウイルス（例えばＶＳＶ）をコードしている核酸を含んでいるＨＥＫ２９３細胞又はその誘導体がもたらされる。無血清懸濁細胞培養液中の組換えウイルス、例えばＶＳＶを産生するための方法は、例えば、Elahi S.M. et al., (Journal of Biotechnology (2019) 289:114-149からそれ自体、当技術分野において公知である。
本発明に記載の方法の特定の他の実施態様では、核酸は異種タンパク質をコードし、産物の力価及び／又は細胞の比生産性は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の産物の力価及び／又は細胞の比生産性と比較して増加し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加されている。１つの実施態様では、産物の力価及び／又は細胞の比生産性は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％を超えて増加している。１つの実施態様では、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質である。
さらなる別の又は追加的な実施態様では、核酸は異種タンパク質をコードし、異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加されている。１つの実施態様では、異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の相対量は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少し得る。高マンノース構造は、マンノースを５個持つ構造、マンノースを６個持つ構造、マンノースを７個持つ構造、マンノースを８個持つ構造、及び／又はマンノースを９個持つ構造であり得る。好ましくは異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の減少した相対量は、異種タンパク質の集団中のマンノースを５個持つ構造の減少した相対量である。好ましい実施態様では、異種タンパク質は抗体である。より好ましくは、マンノースを５個持つ構造を有する抗体の集団の（合計に対する）相対量は、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満である。本明細書において使用する「異種タンパク質の集団」という用語は、同じ核酸によってコードされる試料中の全ての異種タンパク質を指す。異種タンパク質の集団は、例えば、集団中の個々の異種タンパク質のグリコシル化又は翻訳後修飾又は分解に関して、異種であり得る。
さらなる別の又は追加の実施態様では、核酸は異種タンパク質をコードし、異種タンパク質の集団中の酸性種の（合計に対する）相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。異種タンパク質の集団中の酸性種の相対量は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少し得る。１つの実施態様では、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群より選択される。好ましい実施態様では、異種タンパク質は抗体（単一特異的、二重特異的、又は三重特異的）又はその抗原結合断片である。
本発明に記載の方法の別の実施態様では、核酸は組換えウイルスをコードし、ウイルス力価は、同じ方法によって産生されたウイルス力価と比較して増加し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加されている。１つの実施態様では、ウイルスの力価は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％を超えて増加している。
本発明に記載の方法の特定の実施態様では、基礎培地は、無血清かつ化学組成の規定された培地であり、フィード培地は、無血清かつ化学組成の規定された培地である。さらに、基礎培地及びフィード培地は、タンパク質非含有であってもよい。
ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程（ここでの異種タンパク質の集団中の酸性種の（合計に対する）相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において、同濃度のシステインが添加されている）を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生された異種タンパク質中の酸性種を減少させる方法も提供される。１つの実施態様では、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群より選択される。好ましくは、異種タンパク質は、抗体（ここでの抗体は、単一特異的又は多重特異的な抗体であり得る）又はその抗原結合断片である。
異種タンパク質の集団中の酸性種の相対量は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少し得る。好ましくは、集団中の異種タンパク質の５０％未満が酸性種であり、より好ましくは集団中の異種タンパク質の４０％未満、３０％未満、２０％未満、さらにより好ましくは１０％未満が酸性種である。
本明細書において使用する「酸性種」という用語は、異種タンパク質の、特に翻訳後修飾によって産生された組換えモノクローナル抗体の、酸性荷電変異体を指す。酸性種は典型的には、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、例えば（ＷＣＸ）－１０を使用して回収され、液体クロマトグラフィー－質量分析によって特徴付けられ得る。酸性荷電変異体としては、メチオニン酸化、アスパラギン脱アミノ化、システイン化、糖化、還元されたジスルフィド結合が挙げられるがこれらに限定されない。
ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程（ここでの異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において、０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加されている）を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生された異種タンパク質中の高マンノース構造を減少させる方法も提供される。好ましい実施態様では、高マンノース構造は、マンノースを５個持つ構造である。１つの実施態様では、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群より選択される。好ましくは、異種タンパク質は、抗体（ここでの抗体は単一特異的抗体であっても、又は多重特異的抗体であってもよい）又はその抗原結合断片である。また、本明細書において、本発明に記載の方法によって、特に本発明に記載の異種タンパク質における高マンノース構造を減少させる方法によって、及び本発明に記載の異種タンパク質における酸性種を減少させる方法によって産生された異種タンパク質も提供される。
本明細書において使用する「高マンノース構造」という用語は、末端に置換されていないマンノース糖を含有している、高マンノースＮ結合グリカンを指す。これらのグリカンは典型的には、キトビオース（ＧｌｃＮＡｃ２）コアに付着した５～９個のマンノース残基を含有し、よって、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ６ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ７ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２、及びＭａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２グリカンを含み、これはそれぞれ、マンノースを５個持つ構造（Ｍａｎ－５）、マンノースを６個持つ構造（Ｍａｎ－６）、マンノースを７個持つ構造（Ｍａｎ－７）、マンノースを８個持つ構造（Ｍａｎ－８）、及びマンノースを９個持つ構造（Ｍａｎ－９）とも称される。高マンノース構造は、異種タンパク質の短い半減期に関連し、マンノースを５個持つ構造は、高マンノース構造の代表であると考えられ、典型的には高マンノース構造に近づくと決定される。したがって、高マンノース構造は好ましくは、マンノースを５個持つ構造である。
本明細書において使用する「関心対象の産物を単離する工程」という用語は、関心対象の産物を含んでいる細胞培養培地を、哺乳動物細胞から単離する工程、及び／又は関心対象の産物を、関心対象の産物を含んでいる細胞培養培地の収集後に細胞培養培地から精製する工程、及び／又は細胞を溶解する工程、及び哺乳動物細胞溶解液から関心対象の産物を精製する工程を含む。同様に、本明細書において使用する「異種タンパク質を単離する工程」又は「抗体を単離する工程」又は「組換えウイルスを単離する工程」という用語は、異種タンパク質及び／又は抗体又は組換えウイルスを含んでいる細胞培養培地を哺乳動物細胞から単離する工程、並びに／あるいは、異種タンパク質及び／又は抗体又は組換えウイルスを細胞培養培地から、異種タンパク質及び／又は抗体又は組換えウイルスを含んでいる細胞培養培地の収集後に精製する工程、並びに／あるいは、細胞を溶解する工程、並びに異種タンパク質及び／又は抗体又は組換えウイルスを哺乳動物細胞溶解液から精製する工程を含む。抗体又は組換えウイルスを含んでいる異種タンパク質を精製するための方法は、当技術分野において公知である。
ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、異種タンパク質を含んでいる細胞培養培地を哺乳動物細胞から単離する工程（ここでの異種タンパク質の集団における産物の品質の特徴に対する負の作用は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において、同濃度のシステインが添加されている）を含む、フェッドバッチプロセスにおいて異種タンパク質を産生する場合に、産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐ方法も提供される。１つの実施態様では、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群より選択される。好ましくは、異種タンパク質は、抗体（単一特異的抗体、二重特異的抗体、又は三重特異的抗体を含む）又はその断片である。産物の品質の特徴に対する負の作用は、以下に限定されないが、多量の若しくは増加した高マンノース構造（好ましくは高度なマンノースを５個持つ構造）、多量の若しくは増加した低分子量種、及び／又は多量の若しくは増加した酸性種であり得る。
プロセスの最適化は、多量に播種されたバイオプロセスにとって特に妥当である。より高い播種密度は、非生産的な指数関数的増殖期を最小限とし、比較的短く高度に生産的なプロセスをもたらす。ＣＨＯ細胞は、フェッドバッチプロセスにおける異種タンパク質、例えば抗体又は融合タンパク質のバイオ医薬品の生産のために最も一般的に使用される。そうしたプロセスは、最初に非生産的又はより生産的ではない増殖期（ここでの細胞は、バイオリアクター内に蓄積する）、続いて、静止期（ここで大半の産物が生成される）からなる。増殖期の長さは、プロセスの期間及び体積生産性に直接影響を及ぼす。Ｎ－１シードトレインにおける灌流システムの使用により、この増殖期は、Ｎ－１バイオリアクターにシフトされる。灌流モードは、許容可能な生存率を伴う、１mLあたり１００×１０６個の細胞までの高い細胞密度に到達するための、連続的な培地の交換による、連続的な廃棄代謝物の除去及び栄養分の添加を可能とする。Ｎ－１段階における灌流プロセスの適用を通して、それに続くＮ段階（すなわちフェッドバッチプロセス）において高い播種密度を達成することができ、その結果、直ちに高い生産性が得られる。超高播種密度（ｕＨＳＤ）フェッドバッチプロセスは、より短期間で同等な産物の品質を伴い同じ量の力価を生じることができ、これは製造能を向上させる。さらに、それらは、より少量の播種プロセスよりも、同じ長さの期間中に、より高い最終産物の力価を生じることができる。したがって、高い播種密度の培養液は、全体的な生産性を改善するのに有望であるが、培地の最適化に関して特に要求が厳しくかつ繊細でもある。超高播種密度プロセスを改善するために、本発明者らは、システイン及び／又は乳酸塩が、培養の成績に対して有益な効果を及ぼすことを発見した。驚くべきことには、これはまた、通常の播種密度を使用して細胞培養液を改善することも発見された。
本発明によると、システインは、０．２２５mM/日以上で添加される。特に、高密度播種プロセス又は超高密度播種プロセスでは、０．３mM/日以上、０．４mM/日以上、又は０．５mM/日以上でシステインを添加することが有益であり得る。１つの実施態様では、システインは、約０．３mM/日から約０．６mM/日、又は約０．４mM/日から約０．６mM/日で添加される。本発明による増加又は減少は、方法又は培養液と比較して決定され得、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加される。高密度播種プロセス又は超高密度播種プロセスにおいて、システインが０．３mM/日以上で添加される場合、１つの実施態様では、増加又は減少は、フィード培地に、乳酸塩の非存在下において０．２８mM/日以下のシステインが添加される方法又は培養液と比較して決定される。
しかしながら、ｕＨＳＤプロセスは、早期の生存率の低下によって特徴付けられることが多い。本発明の方法による乳酸塩及びシステインの添加は、これらの問題を克服する。したがって、１つの実施態様では、フェッドバッチプロセスは、ｕＨＳＤフェッドバッチプロセスである。
細胞培養液の成績を改善するための、フィード培地中の乳酸塩及びシステインの使用
１つの態様では、本発明は、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における酸性種を減少させるための、フィード培地中の乳酸塩の使用に関し、ここでのフィード培地はシステインを含む。好ましくは、フィード培地は、０．２２５mM/日以上のシステインを提供する。本発明の使用の１つの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群。好ましくは、異種タンパク質は、抗体（ここでの抗体は、単一特異的及び多重特異的であり得る）である。
１つの態様では、本発明は、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における酸性種を減少させるための、フィード培地中の乳酸塩の使用に関し、ここでのフィード培地はシステインを含む。好ましくは、フィード培地は、０．２２５mM/日以上のシステインを提供する。本発明の使用の１つの実施態様では、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群。好ましくは、異種タンパク質は、抗体（ここでの抗体は、単一特異的及び多重特異的であり得る）である。
本発明はまた、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質におけるマンノースを５個持つ構造などの高マンノース構造を減少させるための、フィード培地中の乳酸塩の使用に関し、ここでのフィード培地はシステインを含む。好ましくは、フィード培地は、０．２２５mM/日以上のシステインを提供する。
本発明はまた、異種タンパク質の産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐためのフィード培地における使用に関し、好ましくはここでの産物の品質の特徴に対する負の作用は、増加した高マンノース構造（例えばマンノースを５個持つ構造）、増加した低分子量種、及び／又は増加した酸性種である。１つの実施態様では、フィード培地は、０．２２５mM/日以上、例えば０．２５mM/日以上、０．３mM/日以上、又は０．４mM/日以上のシステインを提供する。
本発明はまた、フェッドバッチプロセスにおける異種タンパク質の力価及び／又は細胞の比生産性を増加させるための、フィード培地中の乳酸塩及びシステインの使用に関する。フェッドバッチプロセス中の組換えウイルス産生を増加させるための、フィード培地中の乳酸塩及びシステインの使用も提供する。
本発明の使用の１つの実施態様では、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群より選択される。好ましくは、異種タンパク質は、抗体（ここでの抗体は単一特異的及び多重特異的であり得る）である。本発明に記載の使用によるフェッドバッチプロセスは、哺乳動物細胞を培養する工程を含み、ここでの哺乳動物細胞は、本明細書に記載のような任意の哺乳動物細胞であり得、好ましくは哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である。
乳酸塩又は乳酸塩とシステインの使用は、本発明の方法による。したがって、乳酸塩及びシステインは、約８：１から５０：１、約１０：１から５０：１、好ましくは約１０：１から約３０：１、より好ましくは約１５：１から約３０：１、さらにより好ましくは約１５：１から約３０：１の乳酸塩／システインのモル比で添加される予定である。１つの実施態様では、乳酸塩は、３mmol/Ｌ/日以上、３．８mmol/Ｌ/日以上、５mmol/Ｌ/日以上、好ましくは７mmol/Ｌ/日以上の乳酸塩、７．８mmol/Ｌ/日以上、１０mmol/Ｌ/日以上、又はさらには１５mmol/Ｌ/日以上で添加される。細胞培養培地中の乳酸塩は、０．５ｇ/Ｌ以上、１ｇ/Ｌ以上、好ましくは２ｇ/Ｌ以上、好ましくは２～４ｇ/Ｌ、より好ましくは約２～３ｇ/Ｌで維持され得る。より具体的には、細胞培養培地中の乳酸塩の濃度は、約１ｇ/Ｌから約４．５ｇ/Ｌ（約１０～５０mM）、約２ｇ/Ｌから約４ｇ/Ｌ（約２０～４５mM）、好ましくは約２ｇ/Ｌから約３ｇ/Ｌ（約２０～３５mM）で維持される。乳酸塩（分子量＝８９．０７ｇ/mol）は、その塩及び／又は水和物、並びに／あるいは乳酸として、好ましくは乳酸ナトリウム（分子量＝１１２．０６ｇ/mol）として提供され得、ここでの１ｇ/Ｌの乳酸塩は、約１．２５ｇ/Ｌの乳酸ナトリウムに等しい。乳酸塩の塩及び／又は水和物あるいは乳酸は、本明細書で提供される乳酸塩の濃度と等モル濃度で提供される。好ましい実施態様では、基礎培地は、培地成分として添加された乳酸塩を含有していない。しかしながら、乳酸塩は、培養中に代謝物として基礎培地中に生成され得る。
システインは、システイン又はその塩及び／若しくは水和物、シスチン又はその塩、あるいは、システインを含んでいるジペプチド又はトリペプチドとして提供され得る。システインの塩及び／若しくは水和物、又はシスチン若しくはその塩、又はシステインを含んでいるジペプチド若しくはトリペプチドは、本明細書で提供されるシステインの濃度と等モル濃度で提供される。本発明によると、システインは、０．２２５mM/日以上で添加される。システインは、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に添加される。好ましくは、システインは、０．２５mM/日以上、０．３mM/日以上、より好ましくは０．４mM/日以上、より好ましくは０．５mM/日以上で添加される。１つの実施態様では、システインは、約０．２２５mM/日から約０．６mM/日、約０．２５mM/日から約０．６mM/日、約０．３mM/日から約０．６mM/日、又は約０．４mM/日から約０．６mM/日で添加される。
本発明に記載の使用の特定の実施態様では、異種タンパク質の産物の力価及び／又は細胞の比生産性は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の産物の力価及び／又は細胞の比生産性と比較して増加し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加されている。１つの実施態様では、産物の力価及び／又は細胞の比生産性は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％を超えて増加している。
別の実施態様では、異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の相対量は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少し得る。減少したとは、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較してを意味し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加されている。高マンノース構造は、マンノースを５個持つ構造、マンノースを６個持つ構造、マンノースを７個持つ構造、マンノースを８個持つ構造、及び／又はマンノースを９個持つ構造であり得る。好ましくは、異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の減少した相対量は、異種タンパク質の集団中のマンノースを５個持つ構造の減少した相対量である。好ましい実施態様では、異種タンパク質は抗体であり、マンノースを５個持つ構造を有する抗体の集団の（合計に対する）相対量は、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、又はさらには２％未満である。
さらなる別の又は追加の実施態様では、異種タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質からなる群より選択され得、異種タンパク質の集団中の酸性種の（合計に対する）相対量は、同じ方法によって産生された抗体の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。抗体の集団中の酸性種の相対量は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％減少し得る。好ましくは、異種タンパク質は、抗体（ここでの抗体は単一特異的又は多重特異的であり得る）である。
本発明に記載の使用の別の実施態様では、組換えウイルスが産生され、ウイルス力価は、同じ方法によって産生されたウイルス力価と比較して増加し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．２２５mM/日未満のシステインが添加されている。１つの実施態様では、ウイルス力価は、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、又は１００％を超えて増加している。
本発明による使用はまた、本明細書に記載のような、高い播種密度及び超高播種密度（ｕＨＳＤ）のフェッドバッチプロセスに使用されてもよい。
改善された細胞培養の成績のためのフィード培地
さらに別の態様では、本発明は、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/mM）で乳酸塩及びシステインを含んでいる、哺乳動物細胞フェッドバッチ培養のためのフィード培地に関し、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される。好ましくは、フィード培地は、別々に添加するための１つ以上のフィード補助物質を含む。特に、システインは、２フィードの戦略で添加され得、例えば、システインを含んでいるフィード培地とシステインを含んでいる別々に添加されるフィード補助物質を添加する。乳酸塩は好ましくは、フィード培地と共に添加されるが、フィード補助物質中で別々に添加されてもよい。特定の実施態様では、フィード培地又はフィード補助物質は化学組成が規定されている（場合により、インシュリン又はインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの組換えタンパク質を含んでいる）。さらに、本発明に記載のフィード培地又はフィード補助物質は、細胞を含有していない（すなわち、細胞を含んでいる細胞培養液ではない）、培養液（細胞培養液から得られた予め調整された培地）中の細胞と接触していない、及び／又は、細胞由来の代謝廃棄産物を含有していない。本発明に記載のフィード培地は、本明細書に記載の方法及び使用に使用され得、したがって、方法について明記かつ記載されている実施態様は同様にフィード培地にも適用される。
さらに別の態様では、本発明は、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/mM）で乳酸塩及びシステインを含んでいる、哺乳動物細胞フェッドバッチ培養のためのフィード培地に関し、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される。好ましくは、フィード培地は、別々に添加するための１つ以上のフィード補助物質を含む。特に、システインは、２フィードの戦略で添加され得、例えば、システインを含んでいるフィード培地とシステインを含んでいる別々に添加されるフィード補助物質を添加する。乳酸塩は好ましくは、フィード培地と共に添加されるが、フィード補助物質中で別々に添加されてもよい。特定の実施態様では、フィード培地又はフィード補助物質は化学組成が規定されている（場合により、インシュリン又はインシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの組換えタンパク質を含んでいる）。さらに、本発明に記載のフィード培地又はフィード補助物質は、細胞を含有していない（すなわち、細胞を含んでいる細胞培養液ではない）、培養液（細胞培養液から得られた予め調整された培地）中の細胞と接触していない、及び／又は、細胞由来の代謝廃棄産物を含有していない。本発明に記載のフィード培地は、本明細書に記載の方法及び使用に使用され得、したがって、方法について明記かつ記載されている実施態様は同様にフィード培地にも適用される。
フィード培地はまた、キットで提供されてもよい。したがって、本発明はまた、（ａ）乳酸塩及び場合によりシステインを含んでいる、哺乳動物細胞フェッドバッチ培養液のための濃縮フィード培地と、（ｂ）システインを含んでいる濃縮フィード培地とは隔離された水性補助物質とを含んでいるキットに関し、ここでのフィード培地及び補助物質は、細胞培養出発容量の５％未満、好ましくは４％未満、より好ましくは３．５％未満の１日１回の添加で、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/mM）及び０．２２５mM/日以上のシステインを与える。本発明に記載のキットによって提供されるフィード培地は、本明細書に記載の方法及び使用に使用され得、したがって、方法について明記かつ記載された実施態様は同様にキットにも適用される。
特に、フィード培地及びキットは、哺乳動物細胞を培養する工程を含んでいるフェッドバッチプロセスに特に有用であり、ここでの哺乳動物細胞は、本明細書に記載のような任意の哺乳動物細胞であり得、好ましくは、哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である。
フィード培地は、本発明の方法に従って、乳酸塩及びシステインを提供するように適応されている。したがって、フィード培地又はフィード培地を提供するキットは、約８：１から５０：１、約１０：１から５０：１、好ましくは約１０：１から約３０：１、より好ましくは約１５：１から約３０：１、さらにより好ましくは約１５：１から約２５：１の乳酸塩／システインのモル比で乳酸塩及びシステインを提供するように適応される。１つの実施態様では、乳酸塩は、３mmol/Ｌ/日以上、３．８mmol/Ｌ/日以上、５mmol/Ｌ/日以上、好ましくは７mmol/Ｌ/日以上、７．８mmol/Ｌ/日以上、１０mmol/Ｌ/日以上、又はさらには１５mmol/Ｌ/日以上で提供される。乳酸塩（分子量＝８９．０７ｇ/mol）は、その塩、エステル、及び／又は水和物として、並びに／あるいは乳酸として、好ましくは塩、例えば乳酸ナトリウム（分子量＝１１２．０６ｇ/mol）として提供され得、ここでの１ｇ/Ｌの乳酸塩は、約１．２５ｇ/Ｌの乳酸ナトリウムに等しい。乳酸塩の塩及び／又は水和物あるいは乳酸は、本明細書に提供される乳酸塩の濃度と等モル濃度で提供される。
システインは、システイン又はその塩及び／若しくは水和物、シスチン又はその塩、あるいは、システインを含んでいるジペプチド又はトリペプチドとして、本発明に記載のフィード培地又はキットで提供され得る。システインの塩及び／若しくは水和物、又はシスチン若しくはその塩、又はシステインを含んでいるジペプチド若しくはトリペプチドは、本明細書に提供されるシステインの濃度と等モル濃度で提供される。フィード培地又はキットは、基礎培地又は細胞培養培地に０．２２５mM/日以上でシステインを提供するように適応される。好ましくは、システインは、０．２５mM/日以上、０．３mM/日以上、より好ましくは０．４mM/日以上、より好ましくは０．５mM/日以上で添加される。１つの実施態様では、システインは、約０．２２５mM/日から約０．６mM/日、約０．２５mM/日から約０．６mM/日、約０．３mM/日から約０．６mM/日、又は約０．４mM/日から約０．６mM/日で添加される。
本発明に記載のフィード培地及びキットはまた、本明細書に記載のような、高い播種密度及び超高播種密度（ｕＨＳＤ）のフェッドバッチプロセスに使用され得る。
上記の観点から、本発明は、以下の項目も包含することが理解されるだろう：
項目１は、ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、関心対象の産物を単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて関心対象の産物を生成する方法を提供する。
項目２は、項目１に記載の方法を提供し、ここでのフィード培地は、１日１回、好ましくは連続的に添加される。
項目３は、項目１又は２に記載の方法を提供し、ここでの乳酸塩／システインのモル比は、約１０：１から５０：１、好ましくは約１０：１から約３０：１である。
項目４は、項目１～３のいずれか一項に記載の方法を提供し、ここでの乳酸塩は、３mmol/Ｌ/日以上、５mmol/Ｌ/日以上、７mmol/Ｌ/日以上、又は１０mmol/Ｌ/日以上で添加される。
項目５は、項目４に記載の方法を提供し、ここでの細胞培養培地中の乳酸塩は、０．５ｇ/Ｌ以上、１ｇ/Ｌ、２ｇ/Ｌ以上、好ましくは２～４ｇ/Ｌで維持される。
項目６は、項目１～５のいずれか一項に記載の方法を提供し、ここでのシステイン（ａ）は、システイン又はその塩及び／若しくは水和物、シスチン又はその塩、あるいは、システインを含んでいるジペプチド又はトリペプチドとして提供され、並びに／あるいは、（ｂ）システインは、０．２５mM/日以上、０．３mM/日以上、又は０．４mM/日以上で添加される。
項目７は、項目１～６のいずれか一項記載の方法を提供し、ここでの関心対象の産物は、異種タンパク質又は組換えウイルスである。
項目８は、項目１～７のいずれか一項記載の方法を提供し、ここでの核酸は、異種タンパク質をコードし、産物の力価及び／又は細胞の比生産性は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の産物の力価及び／又は細胞の比生産性と比較して増加し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加されている。
項目９は、項目１～８のいずれか一項記載の方法を提供し、ここでの核酸は異種タンパク質をコードし、異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでの高マンノース構造は、マンノースを５個持つ構造である。
項目１０は、項目１～９のいずれか一項記載の方法を提供し、ここでの核酸は異種タンパク質をコードし、異種タンパク質の集団中の酸性種の（合計に対する）相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。
項目１１は、項目１～１０のいずれか一項記載の方法を提供し、ここでの基礎培地及びフィード培地は、無血清かつ化学組成が規定されている。
項目１２は、項目１～１１のいずれか一項の方法を提供し、ここでの異種タンパク質は抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質である。
項目１３は、項目１２の方法を提供し、ここでの抗体、二重特異的抗体、又は三重特異的抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である。
項目１４は、ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；及びｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて哺乳動物細胞を培養する方法を提供する。
項目１５は、ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び、ｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生された異種タンパク質における酸性種を減少させる方法を提供し；ここでの、異種タンパク質の集団中の酸性種の相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において同濃度のシステインが添加されている。
項目１６は、ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及びｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生された異種タンパク質中の高マンノース構造を減少させる方法を提供し、ここでの異種タンパク質の集団中の高マンノース構造の相対量は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において、０．１９mM/日以下のシステインが添加され、好ましくはここでの高マンノース構造はマンノースを５個持つ構造である。
項目１７は、（ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；（ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；（ｃ）１つ以上のフィード補助物質を添加する工程を含む、フィード培地を細胞培養液に添加する工程（ここで、フィード培地は、細胞培養培地を生じる基礎培地に、又は結果として生じる細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mmol×Ｌ－１×日－１/mmol×Ｌ－１×日－１）で乳酸塩及びシステインが添加され、ここでのシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される）；（ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び（ｅ）場合により、異種タンパク質を哺乳動物細胞から単離する工程を含む、フェッドバッチプロセスにおいて異種タンパク質を産生する場合に、産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐ方法を提供し、ここでの、異種タンパク質の集団における産物の品質の特徴に対する負の作用は、同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、ここでのフィード培地には、乳酸塩の非存在下において、同濃度のシステインが添加されている。
項目１８は、項目１～１７のいずれか一項の方法を提供し、ここでは哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である。
項目１９は、項目１５～１７のいずれか一項の方法によって産生された異種タンパク質を提供する。
項目２０は、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における酸性種を減少させるための、フィード培地中の乳酸塩の使用を提供し、ここでのフィード培地には、０．２２５mM/日以上でシステインが添加されている。
項目２１は、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質における高マンノース構造を減少させるための、フィード培地中の乳酸塩の使用を提供し、ここでのフィード培地は、０．２２５mM/日以上でシステインを含み、好ましくはここでの高マンノース構造はマンノースを５個持つ構造である。
項目２２は、フェッドバッチプロセスにおいて産生される異種タンパク質の産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐための、フィード培地中の乳酸塩の使用を提供し、好ましくはここでの産物の品質の特徴に対する負の作用は、増加した高マンノース構造、減少した低分子量種、及び／又は増加した酸性種である。
項目２３は、フェッドバッチプロセスにおける異種タンパク質の力価及び／又は細胞の比生産性を増加させるための、フィード培地中の乳酸塩及びシステインの使用を提供する。
項目２４は、項目２０～２３のいずれか一項の使用を提供し、ここでのフェッドバッチプロセスは、哺乳動物細胞を培養する工程を含み、ここでの哺乳動物細胞は、ＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である。
項目２５は、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/mM）で乳酸塩及びシステインを含んでいる、哺乳動物細胞フェッドバッチ培養のためのフィード培地を提供する。
項目２６は、項目２５のフィード培地を提供し、ここでのフィード培地は、別々に添加するための１つ以上のフィード補助物質を含む。
項目２７は、（ａ）乳酸塩及び場合によりシステインを含んでいる哺乳動物細胞フェッドバッチ培養のための濃縮フィード培地と（ｂ）システインを含んでいる濃縮フィード培地とは隔離された水性補助物質とを含んでいるキットを提供し、ここでの、フィード培地及び補助物質は、細胞培養出発容量の５％未満、好ましくは３．５％未満の１日１回の添加で、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/mM）及び０．２２５mM/日以上のシステインを提供する。
実施例
実施例１：ｕＨＳＤ（超高播種密度）プロセス
モノクロ―ナルＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ）を産生しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（細胞株Ａ；ＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳ）を、３Ｌのガラス製のバイオリアクターシステム中でフェッドバッチモードで培養した。シードトレイン培養液は、振盪フラスコ中で、Ｎ－１段階まで処理され、これは、２Ｌの使い捨てのバイオリアクターシステム中で灌流モードで処理された。細胞播種密度は、０．４ｇ/ＬのシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ（２．３mMのシステイン；システインＨＣｌ Ｈ２Ｏの分子量＝１７３．６３g/mol）、０．０２８ｇ/ＬのＬ－シスチン２ＨＣｌ（０．３６mMのシステイン；シスチンＨＣｌの分子量＝１５７．６２mM）を含み乳酸塩を全く含んでいない、専売特許の基礎培地中、出発容量２．２Ｌ中で、１０×１０６個の細胞/mlに設定された。フェッドバッチ培養は、１３～１４日間実施された。フィード培地（１．２１ｇ/ＬのシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；０．００６９Ｍのシステインを含み、ラクトースを全く含まない）が、０日目からプロセスの終了まで連続的に添加され（０日目～９日目；４５ml/Ｌ/日；９日目から１４日目；２５ml/Ｌ/日）、グルコースは需要時にプロセスに添加され、３ｇ/Ｌ以上から５ｇ/Ｌまでに維持された。乳酸ナトリウム及び追加のシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏは、表２に示されているように、ボーラスの添加として添加された。乳酸塩の濃度が、標的濃度３ｇ/Ｌである中で、２ｇ/Ｌ未満に低下した場合、乳酸塩が、３日目から１３日目まで、ボーラスの添加によって、バイオプロセスｕＨＳＤ ＬＡＣ及びｕＨＳＤ ＬＡＣ／ＣＹＳに添加された（ストック溶液２３８．５ｇ/Ｌ；２．６８mol/ｌ）。プロセスｕＨＳＤ ＬＡＣ/ＣＹＳ及びｕＨＳＤ／ＣＹＳへのシステインのボーラスの添加は、７mlの容量で１日目から５日目まで実施された（ストック溶液のシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ：３０ｇ/Ｌ（２０．６９ｇ/Ｌのシステイン；０．１７mol/Ｌ）。培養試料は２４時間毎に採取され、細胞計数及び細胞生存率の決定は、セデックス社のHiResアナライザー（ロシュ社、ドイツ）を使用して実施された。グルコース及び乳酸塩は、Konelab Prime60i（サーモサイエンティフィック社、米国）を使用して決定された。抗体の濃度は、プロテインＡのＨＰＬＣ法（サーモサイエンティフィック社、米国）を用いて決定された。
実施例１：ｕＨＳＤ（超高播種密度）プロセス
モノクロ―ナルＩｇＧ１抗体（ｍＡｂ）を産生しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（細胞株Ａ；ＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳ）を、３Ｌのガラス製のバイオリアクターシステム中でフェッドバッチモードで培養した。シードトレイン培養液は、振盪フラスコ中で、Ｎ－１段階まで処理され、これは、２Ｌの使い捨てのバイオリアクターシステム中で灌流モードで処理された。細胞播種密度は、０．４ｇ/ＬのシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ（２．３mMのシステイン；システインＨＣｌ Ｈ２Ｏの分子量＝１７３．６３g/mol）、０．０２８ｇ/ＬのＬ－シスチン２ＨＣｌ（０．３６mMのシステイン；シスチンＨＣｌの分子量＝１５７．６２mM）を含み乳酸塩を全く含んでいない、専売特許の基礎培地中、出発容量２．２Ｌ中で、１０×１０６個の細胞/mlに設定された。フェッドバッチ培養は、１３～１４日間実施された。フィード培地（１．２１ｇ/ＬのシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；０．００６９Ｍのシステインを含み、ラクトースを全く含まない）が、０日目からプロセスの終了まで連続的に添加され（０日目～９日目；４５ml/Ｌ/日；９日目から１４日目；２５ml/Ｌ/日）、グルコースは需要時にプロセスに添加され、３ｇ/Ｌ以上から５ｇ/Ｌまでに維持された。乳酸ナトリウム及び追加のシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏは、表２に示されているように、ボーラスの添加として添加された。乳酸塩の濃度が、標的濃度３ｇ/Ｌである中で、２ｇ/Ｌ未満に低下した場合、乳酸塩が、３日目から１３日目まで、ボーラスの添加によって、バイオプロセスｕＨＳＤ ＬＡＣ及びｕＨＳＤ ＬＡＣ／ＣＹＳに添加された（ストック溶液２３８．５ｇ/Ｌ；２．６８mol/ｌ）。プロセスｕＨＳＤ ＬＡＣ/ＣＹＳ及びｕＨＳＤ／ＣＹＳへのシステインのボーラスの添加は、７mlの容量で１日目から５日目まで実施された（ストック溶液のシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ：３０ｇ/Ｌ（２０．６９ｇ/Ｌのシステイン；０．１７mol/Ｌ）。培養試料は２４時間毎に採取され、細胞計数及び細胞生存率の決定は、セデックス社のHiResアナライザー（ロシュ社、ドイツ）を使用して実施された。グルコース及び乳酸塩は、Konelab Prime60i（サーモサイエンティフィック社、米国）を使用して決定された。抗体の濃度は、プロテインＡのＨＰＬＣ法（サーモサイエンティフィック社、米国）を用いて決定された。
生細胞密度（ＶＣＤ）、生存率、産物の濃度、及び乳酸塩の濃度に対する、ラクトース、システイン、又はラクトースとシステインの作用は、図１Ａ～Ｄに示されている。
図１Ａ及びＢから読み取れるように、乳酸塩及びシステインを用いたフィーディング（ｕＨＳＤ ＬＡＣ／ＣＹＳ）並びにシステインのみを用いたフィーディング（ｕＨＳＤ ＣＹＳ）は、追加の乳酸塩及びシステインのフィードを伴うことなくフィードされた細胞（ｕＨＳＤ）及び乳酸塩のみをフィードされた細胞（ｕＨＳＤ ＬＡＣ）と比較して、約６日目から開始して、生存率及び生細胞密度を改善した。特に、培養終了に向けて、乳酸塩及びシステインをフィードされた細胞（ｕＨＳＤ ＬＡＣ／ＣＹＳ）の生存率は、システインのみをフィードされた細胞（ｕＨＳＤ ＣＹＳ）よりもさらに高いようである。
産生に関して、乳酸塩のフィーディング（ｕＨＳＤ ＬＡＣ）は、培養中のＩｇＧ力価に対して正の作用を及ぼしたが、これは、培養終了時まで持続できなかったようである。追加のシステインフィードを得ている細胞培養液（ｕＨＳＤ ＣＹＳ）中のＩｇＧ力価は、対照の細胞培養液（ｕＨＳＤ）と同等であった。驚くべきことには、乳酸塩及びシステインを含んでいる細胞培養液（ｕＨＳＤ ＬＡＣ／ＣＹＳ細胞）中のＩｇＧ力価は、乳酸塩又はシステインのみを含むボーラスフィードと比較して強く増加した。これは主に、１０日目以後の増加した比生産性（pg/細胞/日）に起因した（データは示されていない）。
図１Ｄに示されているように、およそ５日目から１０日目の間に培養液中の乳酸塩が枯渇し、ｕＨＳＤ ＬＡＣ／ＣＹＳ培養液中において持続的に２ｇ/Ｌ超であった。６日目及び９日目にｕＨＳＤ ＣＹＳ培養液中の乳酸塩の減少は、高い細胞濃度及び乳酸塩の高い比取り込み率に起因するようである。
全体的に高密度のフィーディングでは、乳酸ナトリウム及びシステインのボーラス添加を伴うｕＨＳＤプロセスにより、改善された産物の力価及び細胞の生存率のプロファイルが得られた。
実施例２：定型的なフェッドバッチプロセスにおける実験計画法の最適化試験
細胞培養液に対するシステイン及び／又は乳酸塩の効果をより詳細にさらに分析するために、本発明者らは、バイオリアクターを使用して、制御された条件下で、２つの異なる細胞株を用いて、定型的な播種密度を使用した、定型的なフェッドバッチプロセスを実施した。
細胞培養液に対するシステイン及び／又は乳酸塩の効果をより詳細にさらに分析するために、本発明者らは、バイオリアクターを使用して、制御された条件下で、２つの異なる細胞株を用いて、定型的な播種密度を使用した、定型的なフェッドバッチプロセスを実施した。
ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生している２つのＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳ細胞株（細胞株Ａ及びＢ）をそれぞれ、アンバー２５０バイオリアクターシステム中で培養した。実験は、実験計画法（ＤｏＥ）試験の一部であった。シードトレイン培養液を、振盪フラスコ中で処理し、播種細胞密度は、０．７×１０６個の細胞/mlに設定された。フェッドバッチ培養は、１４日間実施された。ｕＨＳＤプロセスとは対照的に、乳酸塩及びシスチンの連続的な適用が、これらの実験に適用されることにより、バイオリアクター中の高濃度の反応性化合物システインを減少させ、定型的な適用されるフィードに乳酸塩を含ませた。
フィード培地（１．１ｇ/ＬのシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ；０．００６３Ｍのシステイン）は、プロセス終了時まで（培養出発容量の）３０ml/Ｌ/日で２日目から連続的に添加され、グルコースは需要時にプロセスに添加された。培養試料は、２４時間毎に採取され、細胞計数及び細胞生存率の決定は、セデックスＨｉＲｅｓアナライザー（ロシュ社、ドイツ）を使用して実施された。グルコース及び乳酸塩は、Konelab Prime60i（サーモサイエンティフィック社、米国）を使用して決定された。抗体の濃度は、プロテインＡのＨＰＬＣ法（サーモサイエンティフィック社、米国）を用いて決定された。荷電変異体は、紫外線検出器を含むＨＰＬＣシステムに接続されたＰｒｐＰａｃＷＣＸ－１０分析用カラムを使用して分析された。サイズ変異体は、紫外線検出器を含むＨＰＬＣシステムに接続されたＢＥＨ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて分析された。Ｎグリカンの決定は、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ及びＨＴ グリカン試薬キットを使用して実施された。
様々な濃度のシステイン及び乳酸塩のフィーディングの相互作用を同定するために、実験計画法（ＤｏＥ）試験が実施された。ＤｏＥ試験は、複数の入力因子の変動を可能とし、様々な出力パラメーターに対するそれらの複合作用及び単独作用を決定する、データの収集及び分析のツールである。したがって、この種の試験は、プロセス中の複数の入力のレベルを同時に変化させることによって、プロセス中の複数の因子の相互作用を同定することができる。
実験計画法の試験は、Ｉ－最適計画に基づき、これは０～１．６７ml/Ｌ/日（すなわち、０、０．８４、及び１．６７ml/Ｌ/日、これは０．１２及び０．２４mM/日に相当する）のフィーディング範囲の因子のシスチン（１７．２ｇ/Ｌのシスチン（約１４３mMのシステインに相当する）を用いた２回目のフィードとしての）、及び０～３０ｇ/Ｌ（すなわち、０、１５、又は３０ｇ/Ｌ、これは０、０．１３３及び０．２６７Ｍに相当し、０、４、及び８mM/日で１日１回添加）のストック溶液での乳酸ナトリウム（３０ml/Ｌ/日で定型的なフィードに含まれる）を含んでいた。システインは、フィード培地（３０ml/Ｌ/日で６．３mM；０．１９mM/日の１日１回の添加に相当する）と共に添加されたので、０、０．８４、及び１．６４と称される試料中のシステインの１日あたりの総添加量は、それぞれ、０．１９、０．３１、及び０．４３mM/日である。
細胞株Ａについての定型的プロセスにおける、生細胞密度、生存率、及び産物の力価、及び乳酸塩の濃度に対するシステイン及び／又は乳酸塩のフィードの効果は図２Ａ～Ｄに示され、細胞株Ｂについては図２Ｅ～Ｈに示されている。どちらの細胞株についても、力価（図２Ｃ及びＧ）並びに細胞生存率（図Ｂ及びＦ）に対する有益な効果が、乳酸塩及びシスチンのフィードを用いて観察された。
収集時における収集物の生存率及び産物の力価に対する、乳酸塩とシスチンの組合せのフィーディングの正の効果が、実験計画法の等高線プロットに提示されている（細胞株Ａ：図３及び４；細胞株Ｂ：図６及び７）。より高い産物の力価が、細胞株Ｂを使用して達成され、図４及び７における産物の力価は、実験において最も高い力価、すなわち細胞株Ｂに対して正規化［％］されたものとして提供される。細胞株Ｂについての様々な濃度の使用は、最も高い産物の力価が、多量の乳酸塩及び多量のシステインで得ることができたことを示した。類似の結果が細胞株Ａについても示され、これも、多量の乳酸塩及び多量のシステインが、収集物の生存率及び産物の力価を増加させることを実証している。
既知の抗酸化剤としてのシステインはまた、抗体の酸性荷電変異体を増加させることが知られている。それ故、酸性荷電変異体（酸性ピーク群（ＡＰＧ））、低分子量種（ＬＭＷ）、及び高マンノース種などの産物の品質特性に対する、乳酸塩とシステインのフィーディングの組合せの効果が決定された。驚くべきことには、ＡＰＧ、ＬＭＷ及び高マンノース構造に対する乳酸塩のフィーディングの正の効果が実証され、これは、図５及び８（ＡＰＧ）、９（高マンノース）及び１０（ＬＭＷ）から読み取れる。
図５及び８は、それぞれ乳酸塩及びシスチンのフィーディングの関数として、細胞株Ａ及びＢについてのＡＰＧを示す。図５及び８から分かるように、システインのフィーディングに起因するＡＰＧの増加は、追加の乳酸塩のフィーディングを通して強く減少させることができる。さらに、図９Ａ及びＢから読み取れるように、抗体のマンノースを５個持つ構造（Ｍａｎ５）は、細胞株Ａ及び細胞株Ｂによって産生された２つの異なるＩｇＧ１抗体について、漸増する乳酸塩の濃度を用いて減少させることができる。最後に、図１０は、システイン（Ａ及びＣ）及び乳酸塩（Ｂ及びＤ）の濃度の関数として、細胞株Ａ及びＢについて、実験計画法の最も高い数値（細胞株Ｂを用いて得られた）に対して正規化されたＬＭＷを示す。図１０から分かるように、産生された抗体のＬＭＷは、漸増する乳酸塩又はシスチンのフィーディングを用いて減少し、その結果、高濃度の乳酸塩及び高濃度のシステインの両方を用いて、ＬＭＷが減少したという相乗作用が得られた。
実施例３：追加の細胞株を用いての結果の再現性
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生している、ＣＨＯ－ＤＧ４４ ＧＳ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳ細胞を含む、４つの追加のＣＨＯ細胞株を、アンバー１５バイオリアクターシステム中で培養した。細胞株Ｃ及びＦは各々、異なる特異性を有するＩｇＧ４モノクローナル抗体を産生し、細胞株Ｄ及びＥは各々、異なる特異性を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生する。シードトレイン培養液は振盪フラスコ中で処理され、播種細胞密度は、０．７×１０６個の細胞/mlに設定された。フェッドバッチ培養は、１４日間実施された。フィード培地は、２日目からプロセス終了まで連続的に添加され、グルコースは、実施例２に記載のように需要時にプロセスに添加された。さらに、プロセスは、表３に示されるような、システイン（１．１ｇ/ＬのシステインＨＣＬ Ｈ２Ｏ；０．００６３Ｍ）及び乳酸塩（２６７mM）を含んでいるフィード培地、又はシステインを含んでいるが乳酸塩を全く含んでいないフィード培地（３０ml/Ｌ/日の培養出発容量を用いた定型的な連続的なフィードとして添加、フィード１）、及び／又は２回目のシステインフィード（フィード２）を使用した、変動するフィーディングを用いて実施された。乳酸塩は、乳酸ナトリウムとして、又は乳酸として得られ、乳酸はＮａＯＨを用いて滴定されることにより、フィード培地に添加する前に乳酸ナトリウムとした。培養試料は、２４時間毎に採取され、細胞計数及び細胞の生存率の決定は、セデックス社のＨｉＲｅｓアナライザー（ロシュ社、ドイツ）を使用して実施された。グルコース、乳酸塩、及び抗体濃度は、Konelab Prime60i（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国）又はBiosen S-line（ＥＫＦディアグノスティクスＧｍｂＨ社、英国）を使用して決定された。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生している、ＣＨＯ－ＤＧ４４ ＧＳ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳ細胞を含む、４つの追加のＣＨＯ細胞株を、アンバー１５バイオリアクターシステム中で培養した。細胞株Ｃ及びＦは各々、異なる特異性を有するＩｇＧ４モノクローナル抗体を産生し、細胞株Ｄ及びＥは各々、異なる特異性を有するＩｇＧ１モノクローナル抗体を産生する。シードトレイン培養液は振盪フラスコ中で処理され、播種細胞密度は、０．７×１０６個の細胞/mlに設定された。フェッドバッチ培養は、１４日間実施された。フィード培地は、２日目からプロセス終了まで連続的に添加され、グルコースは、実施例２に記載のように需要時にプロセスに添加された。さらに、プロセスは、表３に示されるような、システイン（１．１ｇ/ＬのシステインＨＣＬ Ｈ２Ｏ；０．００６３Ｍ）及び乳酸塩（２６７mM）を含んでいるフィード培地、又はシステインを含んでいるが乳酸塩を全く含んでいないフィード培地（３０ml/Ｌ/日の培養出発容量を用いた定型的な連続的なフィードとして添加、フィード１）、及び／又は２回目のシステインフィード（フィード２）を使用した、変動するフィーディングを用いて実施された。乳酸塩は、乳酸ナトリウムとして、又は乳酸として得られ、乳酸はＮａＯＨを用いて滴定されることにより、フィード培地に添加する前に乳酸ナトリウムとした。培養試料は、２４時間毎に採取され、細胞計数及び細胞の生存率の決定は、セデックス社のＨｉＲｅｓアナライザー（ロシュ社、ドイツ）を使用して実施された。グルコース、乳酸塩、及び抗体濃度は、Konelab Prime60i（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国）又はBiosen S-line（ＥＫＦディアグノスティクスＧｍｂＨ社、英国）を使用して決定された。
４つの追加のＣＨＯ細胞株を用いての実験は、プロセスの成績に対する乳酸塩及びシスチンのフィーディングの組合せの正の効果を確認した。最も高い細胞の生存率及び産物の力価が、４つ全ての細胞株において、乳酸塩とシスチンのフィーディングの組合せを用いて得られた（図１１～１４参照）。
実施例４：ｕＨＳＤプロセスの実験計画法の最適化
ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生している、２つのＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳ細胞株Ａ及びＢを、アンバー２５０バイオリアクターシステム中で培養した。シードトレイン培養液は、振盪フラスコ中で、Ｎ－１段階まで処理され、これは、２Ｌの使い捨てのバイオリアクターシステム中で灌流モードで処理された。フェッドバッチ培養は１４日間実施された。フィード培地（１．１ｇ/ＬのシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ（０．００６３Ｍのシステイン）及び０、１５又は３０ｇ/Ｌの乳酸ナトリウム（０、０．１３３、又は０．２６７Ｍの乳酸塩）を、０日目からプロセス終了時まで連続的に添加した。播種細胞密度（ＳＣＤ）は、５～１０×１０６個の細胞/mlに設定された。グルコースは、需要時にプロセスに添加された。培養試料は２４時間毎に採取され、細胞計数及び細胞の生存率の決定は、セデックス社のＨｉＲｅｓアナライザー（ロシュ社、ドイツ）を使用して実施された。グルコース及び乳酸塩は、Konelab Prime60i（サーモサイエンティフィック社、米国）を使用して決定された。抗体の濃度は、プロテインＡのＨＰＬＣ法（サーモサイエンティフィック社、米国）を用いて決定された。
ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生している、２つのＣＨＯ－Ｋ１ ＧＳ細胞株Ａ及びＢを、アンバー２５０バイオリアクターシステム中で培養した。シードトレイン培養液は、振盪フラスコ中で、Ｎ－１段階まで処理され、これは、２Ｌの使い捨てのバイオリアクターシステム中で灌流モードで処理された。フェッドバッチ培養は１４日間実施された。フィード培地（１．１ｇ/ＬのシステインＨＣｌ Ｈ２Ｏ（０．００６３Ｍのシステイン）及び０、１５又は３０ｇ/Ｌの乳酸ナトリウム（０、０．１３３、又は０．２６７Ｍの乳酸塩）を、０日目からプロセス終了時まで連続的に添加した。播種細胞密度（ＳＣＤ）は、５～１０×１０６個の細胞/mlに設定された。グルコースは、需要時にプロセスに添加された。培養試料は２４時間毎に採取され、細胞計数及び細胞の生存率の決定は、セデックス社のＨｉＲｅｓアナライザー（ロシュ社、ドイツ）を使用して実施された。グルコース及び乳酸塩は、Konelab Prime60i（サーモサイエンティフィック社、米国）を使用して決定された。抗体の濃度は、プロテインＡのＨＰＬＣ法（サーモサイエンティフィック社、米国）を用いて決定された。
実験計画法（ＤｏＥ）試験は、０～４．８ml/Ｌ/日（すなわち、０、２．４、及び４．８ml/Ｌ/日、０、０．１２及び０．２４mM/日に相当する）のフィーディング範囲の因子のシスチン（５．９８ｇ/Ｌのシスチン（約４９．８３mMに相当する）を用いた２回目のフィードとしての）、及び０～３０ｇ/Ｌ（すなわち、０、１５、又は３０ｇ/Ｌ；０、０．１３３及び０．２６７Ｍに相当し、４５ml/Ｌ/日で５．９８及び１１．９６mM/日、及び２５ml/Ｌ/日で３．３２及び６．６４mM/日を１日１回添加）の乳酸ナトリウム（培養出発容量の０日目から９日目までは４５ml/Ｌ/日で、９日目から１４日目までは２５ml/Ｌ/日で定型的なフィードに含まれる）を含む、Ｉ－最適計画に基づいた。システインも、フィード培地（４５ml/Ｌ/日で６．３mMで；これは０．２８mM/日で１日１回の添加に相当する、及び２５ml/Ｌ/日で；これは０．１６mM/日の１日１回の添加に相当する）と共に添加されたので、２回目のフィードで０、２．４及び４．８ml/Ｌ/日を添加する試料中のシステインの１日あたりの総添加量は、４５ml/Ｌ/日の１日１回の添加で０．２８、０．４及び０．５２mM/日、及び２５ml/Ｌ/日の１日１回の添加で０．１６、０．２８及び０．４mM/日である。
産物の力価に対する乳酸とシスチンの組合せのフィーディングの正の効果は、１４日目の収集時に、細胞株Ａについては図１５に細胞株Ｂについては図１６に、実験計画法の等高線プロットに提示されている。より高い産物の力価が、細胞株Ｂを使用して達成され、図１５及び１６における産物の力価は、実験において最も高い力価、すなわち細胞株Ｂに対して正規化［％］されたものとして提供される。最も高い産物の力価は、試験された両方の細胞株について、多量の乳酸塩のフィーディング及び多量のシステインのフィーディングで得られた。
収集物の生存率と乳酸塩のフィーディングの正の相関が、図１７及び１８にさらに提示されている。Ｒ２の適合後及びＱ２の予測性能の良さが、各モデルについて提示されている。収集時における、酸性電荷変異体及び高マンノースなどの、産物の品質特性に対する効果が、図１９から図２２に提示されている。両方の細胞株について、多量のシステインのフィーディングに起因する酸性電荷変異体（ＡＰＧ）の増加が、追加の乳酸塩のフィーディングによって強く減少したことが示されている。
Claims (18)
- ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；
ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；
ｃ）乳酸塩及びシステインを含むフィード培地を細胞培養液に添加するか、あるいは乳酸塩及び／又はシステインを含む１つ以上のフィード補助物質を、乳酸塩及び／又はシステインを含むか、両者を含まないフィード培地と一緒に又は別々に細胞培養液に添加する、フィード培地を細胞培養液に添加する工程、ここで、この工程により、細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/日/mM/日）で乳酸塩及びシステインが添加され、及びシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される；
ｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び
ｅ）場合により、関心対象の産物を単離する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて関心対象の産物を産生する方法。 - 乳酸塩/システインのモル比が、約１０：１から５０：１である、請求項１記載の方法。
- 乳酸塩/システインのモル比が、約１０：１から約３０：１である、請求項２記載の方法。
- ａ）フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、乳酸塩が、３mM/日以上、５mM/日以上、７mM/日以上、又は１０mM/日以上で添加される；
ｂ）細胞培養培地中の乳酸塩が、０．５ｇ/Ｌ以上、１ｇ/Ｌ以上、又は２ｇ/Ｌ以上で維持される；
ｃ）フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、システインが、システイン又はその塩及び／若しくは水和物、シスチン又はその塩、あるいはシステインを含んでいるジペプチド又はトリペプチドとして提供される；並びに／あるいは
ｄ）フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、システインが、０．２５mM/日以上、０．３mM/日以上、又は０．４mM/日以上で添加される、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。 - 細胞培養培地中の乳酸塩が、２～４ｇ／Ｌで維持される、請求項４記載の方法。
- 関心対象の産物が、異種タンパク質又は組換えウイルスである、請求項１～５のいずれか一項記載の方法。
- 前記核酸が、異種タンパク質をコードし、そして
（ａ）産物の力価及び／又は細胞の比生産性は、フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、細胞培養培地に、０．１９mM/日以下のシステインが添加され、乳酸塩は添加されない点においてのみ相違する同じ方法によって産生された異種タンパク質の産物の力価及び／又は細胞の比生産性と比較して増加する；
（ｂ）産生された異種タンパク質の集団中の高マンノース構造を有する異種タンパク質の相対量（％）は、フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、細胞培養培地に、０．１９mM/日以下のシステインが添加され、乳酸塩は添加されない点においてのみ相違する同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団中の高マンノース構造を有する異種タンパク質の相対量（％）と比較して減少する；及び／又は
（ｃ）産生された異種タンパク質の集団中の酸性種の相対量（％）は、フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、細胞培養培地に、乳酸塩が添加されない点においてのみ相違する同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団中の酸性種の相対量（％）と比較して減少する、
請求項１～６のいずれか一項記載の方法。 - 前記高マンノース構造が、マンノースを５個持つ構造である、請求項７記載の方法。
- 基礎培地及びフィード培地が、無血清であり、化学組成が規定されている、請求項１～８のいずれか一項記載の方法。
- 異種タンパク質が、抗体又はその抗原結合断片、二重特異的抗体、三重特異的抗体、又は融合タンパク質である、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
- ａ）関心対象の産物をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；
ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；
ｃ）乳酸塩及びシステインを含むフィード培地を細胞培養液に添加するか、あるいは乳酸塩及び／又はシステインを含む１つ以上のフィード補助物質を、乳酸塩及び／又はシステインを含むか、両者を含まないフィード培地と一緒に又は別々に細胞培養液に添加する、フィード培地を細胞培養液に添加する工程、ここで、この工程により、細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/日/mM/日）で乳酸塩及びシステインが添加され、及びシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される；及び
ｄ）関心対象の産物の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて哺乳動物細胞を培養する方法。 - 関心対象の産物が、異種タンパク質又は組換えウイルスである、請求項１１記載の方法。
- ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；
ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；
ｃ）乳酸塩及びシステインを含むフィード培地を細胞培養液に添加するか、あるいは乳酸塩及び／又はシステインを含む１つ以上のフィード補助物質を、乳酸塩及び／又はシステインを含むか、両者を含まないフィード培地と一緒に又は別々に細胞培養液に添加する、フィード培地を細胞培養液に添加する工程、ここで、この工程により、細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/日/mM/日）で乳酸塩及びシステインが添加され、及びシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される；
ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び
ｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生された異種タンパク質中の酸性種を減少させる方法であって、産生された異種タンパク質の集団中の酸性種の相対量（％）は、フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、細胞培養培地に、乳酸塩が添加されない点においてのみ相違する同じ方法によって生産された異種タンパク質の集団中の酸性種の相対量（％）と比較して減少する、該方法。 - ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；
ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；
ｃ）乳酸塩及びシステインを含むフィード培地を細胞培養液に添加するか、あるいは乳酸塩及び／又はシステインを含む１つ以上のフィード補助物質を、乳酸塩及び／又はシステインを含むか、両者を含まないフィード培地と一緒に又は別々に細胞培養液に添加する、フィード培地を細胞培養液に添加する工程、ここで、この工程により、細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/日/mM/日）で乳酸塩及びシステインが添加され、及びシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される；
ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び
ｅ）場合により、異種タンパク質を単離する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて産生された異種タンパク質中の高マンノース構造を減少させる方法であって、産生された異種タンパク質の集団中の高マンノース構造を有する異種タンパク質の相対量（％）は、フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、細胞培養培地に、０．１９mM/日以下のシステインが添加され、乳酸塩は添加されない点においてのみ相違する同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団中の高マンノース構造を有する異種タンパク質の相対量（％）と比較して減少する、該方法。 - 前記高マンノース構造が、マンノースを５個持つ構造である、請求項１４記載の方法。
- ａ）異種タンパク質をコードしている核酸を含んでいる哺乳動物細胞を準備する工程；
ｂ）哺乳動物細胞を基礎培地に接種して、細胞培養液を準備する工程；
ｃ）乳酸塩及びシステインを含むフィード培地を細胞培養液に添加するか、あるいは乳酸塩及び／又はシステインを含む１つ以上のフィード補助物質を、乳酸塩及び／又はシステインを含むか、両者を含まないフィード培地と一緒に又は別々に細胞培養液に添加する、フィード培地を細胞培養液に添加する工程、ここで、この工程により、細胞培養培地に、約８：１から約５０：１の乳酸塩／システインのモル比（mM/日/mM/日）で乳酸塩／システインが添加され、及びシステインは、０．２２５mM/日以上で添加される；
ｄ）異種タンパク質の発現を可能とする条件下、細胞培養培地中で哺乳動物細胞を培養する工程；及び
ｅ）場合により、異種タンパク質を哺乳動物細胞から単離する工程
を含む、フェッドバッチプロセスにおいて異種タンパク質を産生する場合に、産物の品質の特徴に対するシステインの負の作用を防ぐ方法であって、異種タンパク質の集団における産物の品質の特徴に対する負の作用は、フィード培地を細胞培養液に添加する工程において、細胞培養培地に、乳酸塩が添加されない点においてのみ相違する同じ方法によって産生された異種タンパク質の集団と比較して減少し、及び産物の品質の特徴に対する負の作用は、増加した高マンノース構造、増加した低分子量種、及び／又は増加した酸性種である、該方法。 - フェッドバッチプロセスが、哺乳動物細胞を培養する工程を含み、哺乳動物細胞がＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞、又はＨＥＫ２９３細胞若しくはＣＨＯ細胞に由来する細胞である、請求項１～１６のいずれか一項の方法。
- 哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞又はＣＨＯ由来細胞である、請求項１７記載の方法。
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