JP7479135B2 - 抗ｒｓウイルスを認識する抗体、並びに該抗体を用いた免疫測定方法及び免疫測定器具 - Google Patents
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Description
本発明は、ＲＳウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具並びにそのための抗ＲＳウイルス抗体に関する。
モノクローナル抗体は、特定の抗原のみを認識するため、その特定の抗原の検出に広く用いられている。ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）のエンベロープには、糖蛋白質であるＧ蛋白質と、細胞融合に関連するＦ蛋白質とが存在する（非特許文献１）。Ｇ蛋白質は、ＲＳウイルスのサブタイプ（Ａ型、Ｂ型）間でアミノ酸配列の違いが大きいことが知られている（非特許文献１）。一方、Ｆ蛋白質は、ＲＳウイルスのサブタイプ（Ａ型、Ｂ型）間でもアミノ酸配列の違いが小さいことが知られており、多くのＲＳウイルス検査キットがＦ蛋白質を検出している。しかしながら、Ｆ蛋白質に対する抗体の親和性を高めることのみによっては、臨床分離株を漏れなく検出できるような実用に足る陽性検出率を示すＲＳウイルス検査キットを開発することは非常に困難であった（特許文献１）。
また、ＲＳウイルスのＮ蛋白質は核蛋白質とも呼ばれ、391のアミノ酸残基からなる。Ｎ蛋白質は、ヌクレオカプシドと呼ばれるリボ核蛋白質複合体の構成成分であり、ＲＳウイルスのゲノムＲＮＡを囲みらせん構造を形成している。Ｎ蛋白質は、ＲＳウイルスのサブタイプ（Ａ型、Ｂ）間で最もアミノ酸配列の違いが小さいことが知られている。しかしながら、Ｎ蛋白質に対する抗体のみで臨床分離株を漏れなく検出することは非常に困難であり、臨床分離株を漏れなく検出できるようなＲＳウイルス検査キットの開発には、Ｆ蛋白質に対する抗体とＮ蛋白質に対する抗体とを混合する必要があった（特許文献１）。
Collins PL and Karron RA. Respiratory syncytial virus. In: Knipe DM et al., eds. Fields Virology, 6th ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia: pp 1086-1123 (2013).
現在、各種抗ＲＳウイルス抗体を用いた検査試薬が販売されている。しかしながら、これらの従来のＲＳウイルス検査試薬でＲＳウイルスの検出を行った場合、感度が充分ではなかった。
上記の現状に鑑み、本発明は、感度の高い抗ＲＳウイルス抗体、及びそれを用いた検査試薬を提供することを目的とする。
本発明者らは、検体に含まれるＲＳウイルスを効率よく判定部位に捕捉してイムノクロマトグラフィー装置の感度を高めるために、ＲＳウイルスのＮ蛋白質（核タンパク質）に対する抗体を用いることでＲＳウイルスの検出感度を向上させ得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[２] 配列番号１で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[３] 抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、dsFv、diabody及びminibodyからなる群から選択されるペプチド断片である、[１]又は[２]の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[４] [１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用試薬。
[５] イムノクロマト法試薬である、[４]のＲＳウイルス検出用試薬。
[６] [１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用キット。
[７] [１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫学的検出法により、ＲＳウイルスを検出する方法。
[８] イムノクロマト法である、[７]の方法。
[１] 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[２] 配列番号１で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する重鎖可変領域、及び配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列と90％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＲＳウイルスＮ蛋白質への結合活性を有する軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[３] 抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、dsFv、diabody及びminibodyからなる群から選択されるペプチド断片である、[１]又は[２]の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
[４] [１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用試薬。
[５] イムノクロマト法試薬である、[４]のＲＳウイルス検出用試薬。
[６] [１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用キット。
[７] [１]～[３]のいずれかのモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫学的検出法により、ＲＳウイルスを検出する方法。
[８] イムノクロマト法である、[７]の方法。
本発明の方法は、免疫測定に抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を用いるので感度が高い。また、本発明により、本発明の新規な検出方法に用いる免疫測定器具及びモノクローナル抗体が提供される。
本発明の方法により検出される被検対象は、ＲＳウイルスであり、Ｎ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いる。
本発明の方法では、Ｎ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫測定を行う。ここで、「認識する」とは、特異的に反応する、すなわち、抗原抗体反応する、という意味である。「特異的」とは、タンパク質と該抗体が混じり合う液系において、該抗体が抗原のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、又は何らかの結合反応や会合反応を起こしたとしても、該抗体の抗原との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。
本発明のモノクローナル抗体を基に、抗原結合部位のみを分離させた抗原結合性断片も本発明の方法に使用することができる。すなわち、公知の方法により作製された、ＲＳウイルスのＮ蛋白質に結合するＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、dsFv、diabody、minibodyなどの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）を用いる場合もこれらの断片はモノクローナル抗体に包含され、本発明の範囲に含まれる。また、モノクローナル抗体のクラスはIgGに限定されず、IgMやIgYでもよい。
本発明の方法に用いるモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、目的の抗原を含む複合体や抽出物、あるいは抗原又はそれらの部分ペプチドを被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。免疫に用いるペプチドの長さは特に限定されないが、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上のペプチドを用いて免疫原とすることができる。免疫原は培養液から得ることもできるが、任意の抗原をコードするＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。免疫原とする任意の抗原又はその部分ペプチドは以下に例示するようなタンパク質と融合タンパク質として発現させ、精製の後、又は未精製のまま免疫原として用いることもできる。融合タンパク質の作製には、当業者が「タンパク質発現・精製タグ」として一般的に用いる、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＲＡＧタグ、ポリヒスチジンタグなどが利用できる。これらとの融合タンパク質は、消化酵素を用いて任意の抗原あるいはその部分ペプチド部分とそれ以外のタグ部分とを切断し、分離精製した後に免疫原として用いることが好ましい。
免疫した動物からのモノクローナル抗体の調製は、周知のケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により容易に行うことができる。すなわち、免疫した動物から、脾細胞やリンパ球等の抗体産生細胞を回収し、これを常法によりマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングし、クローニングされた各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、動物の免疫に用いた抗原と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択する。
腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法などが挙げられる。また免疫動物種とモノクローナル抗体のクラスに応じて、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬのいずれかを結合させた担体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法によっても精製することが可能である。
本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる。また、本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる。
重鎖可変領域は配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域の活性、すなわちＲＳウイルスのＮ蛋白質への結合活性を有するタンパク質からなる重鎖可変領域も含む。軽鎖可変領域は配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の軽鎖可変領域の活性、すなわちＲＳウイルスのＮ蛋白質への結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変流域も含む。
このような配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列と、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。
このような配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号１、２、３又は４のアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。
本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体は、上記の重鎖可変領域及び重鎖定常領域並びに上記の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３個のドメインCH1、CH2及びCH3から構成されている。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域である。また、軽鎖定常領域は、１個のドメインCLで構成されている。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域である。
本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体は、上記の重鎖をコードするDNA及び軽鎖をコードするDNAを発現ベクターに挿入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を培養することにより産生させることができる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするDNAは配列番号１のアミノ酸配列よりわかる。
本発明の免疫測定方法では、上記のようにして作製したモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片（以下、実施例の前までの記述において、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、「抗体」は、「抗体又はその抗原結合性断片」を意味する）と検体中の抗原との抗原抗体反応を利用した免疫測定により測定する。このための免疫測定法としては、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法、免疫染色法、サンドイッチ法など、当業者にとって周知のいずれの方法も用いることができる。なお、本発明において、「測定」には、定量、半定量、検出のいずれもが包含される。
免疫測定としては、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法においては、２つの抗体で抗原を挟む形で複合体を形成させ、該複合体を検出する。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばイムノクロマトグラフィー法やELISA法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は、上記したＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いること以外は、周知のサンドイッチ法により行うことができる。
サンドイッチ法には、抗原を認識する１種類又は２種類以上の抗体（固相に固定化される抗体と、標識抗体）が用いられる。２種類以上の抗体を用いる場合、これらの２種類の抗体のうち、少なくともいずれか一方が、上記したＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体である。また、同じ２つの抗体で抗原を挟んで複合体を形成させてもよい。
サンドイッチ法を検出原理とする免疫測定において、抗体が固定化される固相としては、抗体を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。また、抗体を標識する物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。前述の種々の材料による免疫測定法の中でも、特に臨床検査の簡便性と迅速性の観点から、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法であるイムノクロマト法が好ましい。
本発明では、Ｎ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体を用いてラテラルフロー式に免疫測定を行うことができる免疫測定器具をも提供する。本発明が提供する免疫測定器具は、測定対象物（抗原）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートから成り、抗体１及び抗体２の少なくとも一方が本発明のＮ蛋白質を抗原として認識するモノクローナル抗体である免疫測定器具である。該免疫測定器具をイムノクロマト試験片とも呼ぶ。
支持体は、被検出物質（抗原）を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜であり、液体及びそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜としたものがより好ましい。抗体を固定化したメンブレンを抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm～0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。標識抗体を含浸させ乾燥させた多孔性基材を乾燥パッドとも呼ぶ。
標識抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、着色ポリスチレン粒子及び着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。抗体を固定化した粒子を抗体固定化粒子と呼ぶ。抗体の固定化量は、特に限定されないが、標識領域に数ngから数十μg存在すればよい。
検出領域は、被検出物質（抗原）を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、抗原を捕捉するための抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設ける。検出領域は支持体に含まれていればよく、支持体上に抗体を固定化すればよい。抗体の固定化量は、特に限定されないが検出領域に数ngから数十μg固定化すればよい。
サンプルパッドは、検体を滴加するための部位であり、多孔性材料である。サンプルパッドは免疫測定器具の最も上流にある部位である。該材料には一般的に用いられるろ紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm～1mm程度のパッド状であることが好ましい。検体には、検体を他の溶液に浮遊して得られる試料等、検体を用いて調製された試料も含む。
吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。
バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯等が、部分的な重なりをもって貼付し固定されるための部材である。バッキングシートは、これらの材料が最適な間隔で配置し固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いた方が好ましい。
本発明の免疫測定器具には、さらに対照表示領域(部材）が存在していてもよい。対照表示領域は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示領域は、検出領域の下流に存在し、検体試料が検出領域を通過し、対照表示領域に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示領域には、標識担体を結合させた抗体に結合する物質を固相化しておいてもよいし、検体が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固相化しておいてもよい。標識担体を結合させた抗体がマウスモノクローナル抗体の場合、抗マウスIgG抗体を用いればよい。
免疫測定器具の大きさは限定されないが、例えば、縦の長さ数cm～十数cm、横の長さ数mm～数cm程度である。
本発明の免疫測定器具は、格納容器内に収められていてもよく、該格納容器により、例えば紫外線や空気中の湿気による劣化を防ぐことができる。また、汚染性、感染性の有る検体試料を用いる場合、格納容器によりアッセイを行う試験者が汚染又は感染するのを防止することができる。例えば適当な大きさの樹脂製ケースを格納容器として用い、該ケース中に本発明の器具を収納すればよい。格納容器とその中に納められた免疫測定器具を、一体として免疫測定デバイスという場合がある。
本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体を含むＲＳウイルス検出用試薬は前記免疫測定器具を含む。また、本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体を含むＲＳウイルス検出用キットは前記免疫測定器具を含む。該キットは、他にブロッシャー、検体採取器具等を含んでいてもよい。
本発明の方法においては、抗体１を固定化した固相支持体に毛管現象を利用して、着色ポリスチレン粒子や金コロイド等の適当な標識物質で標識した被検出物質（標識試薬）と結合し得る抗体２と被検出物質の複合体を展開移動させる。この結果、固定化した物質-被検出物質-標識試薬の複合体が固相支持体上に形成され、該複合体から発する標識試薬のシグナル（金コロイドの場合は、被検出物質と結合し得る物質を固定化した固相支持体部分が赤くなる）を検出することにより、被検出物質を検出することができる。該免疫測定方法は、５～３５℃、好ましくは室温で行うことができる。
なお、検出領域の数及び標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１つに限られるものではなく、複数の測定対象物に対応する抗体を用いることで、２以上の抗原を同一の免疫測定器具にて検出することができる。
本発明の方法により、ＲＳウイルスに感染しているか否かを検出することができ、被検体試料中にＮ蛋白質が検出された場合に、ＲＳウイルスに感染していると判断することができる。
本発明のＮ蛋白質を認識する抗体を用いた場合、ＲＳウイルスを特異的に認識することができ、Ｎ蛋白質を認識する抗体は、他のウイルス、例えばアデノウイルス（Adenovirus)、コクサッキーウイルス（Coxsackievirus）、エコーウイルス（Echo virus）、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）、ヒトニューモウイルス（Human Metapneumovirus)、インフルエンザウイルス（Influenza virus)、麻疹ウイルス（Measles virus）、ムンプスウイルス（Mumps virus）、パラインフルエンザウイルス（Parainfluenza virus）を認識することはなく、これらのウイルスを誤検出することはない。
また、ＲＳウイルスのＦ蛋白質を認識する抗体を用いた場合に検出できない臨床分離株でも、本発明のＲＳウイルスのＮ蛋白質を認識する抗体を用いた場合に検出することができる。
被検体試料としては、検体として、咽頭若しくは鼻腔ぬぐい液、咽頭若しくは鼻腔洗浄液、鼻腔吸引液、唾液、血清、直腸拭い液、便、便懸濁液、尿、角膜拭い液等を用いればよい。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１ 抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の作製
１．ＲＳウイルスＮ蛋白質抗原の調製
ＲＳウイルスを感受性のある哺乳類細胞に感染させ、数日間培養した後にＲＳウイルス感染細胞の培養液を紫外線照射で不活化したものを用いた。
１．ＲＳウイルスＮ蛋白質抗原の調製
ＲＳウイルスを感受性のある哺乳類細胞に感染させ、数日間培養した後にＲＳウイルス感染細胞の培養液を紫外線照射で不活化したものを用いた。
２．ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の作製
１．のＲＳウイルス不活化抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから腸骨リンパ節を摘出する、「マウス腸骨リンパ節法」(Sado Y et al., Acta Histochem. Cytochem. 39: 89-94 (2006))により抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が複数得られた。
１．のＲＳウイルス不活化抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから腸骨リンパ節を摘出する、「マウス腸骨リンパ節法」(Sado Y et al., Acta Histochem. Cytochem. 39: 89-94 (2006))により抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が複数得られた。
取得した細胞株をプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりIgGを精製し、精製抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体（以下、「抗Ｎ蛋白質抗体」と称することがある。）を複数得た。
以下の実施例では複数得られた抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体のうち、反応性及び特異性を考慮して選択した抗体を用いた。
実施例２ ＲＳウイルスを測定する免疫測定器具
１．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を緩衝液で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Ｎ蛋白質抗体、吸収体側に抗マウスIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを温風下で十分に乾燥させ、抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンを得た。
１．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を緩衝液で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Ｎ蛋白質抗体、吸収体側に抗マウスIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを温風下で十分に乾燥させ、抗Ｎ蛋白質抗体固定化メンブレンを得た。
２．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を着色ポリスチレン粒子に共有結合させ、浮遊液に懸濁し、超音波処理により十分に分散させた、抗Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｎ蛋白質抗体固定化粒子と呼ぶ。
実施例１で作製した抗Ｎ蛋白質抗体を着色ポリスチレン粒子に共有結合させ、浮遊液に懸濁し、超音波処理により十分に分散させた、抗Ｎ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｎ蛋白質抗体固定化粒子と呼ぶ。
３．抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布及び乾燥
２で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量塗布し、温風化で十分に乾燥させた。本明細書において、標識体パッドと呼ぶ。
２で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量塗布し、温風化で十分に乾燥させた。本明細書において、標識体パッドと呼ぶ。
４．ＲＳウイルス検査デバイスの作製
１で作製した抗体固定化メンブレンと２及び３で作製した標識体パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）とを貼り合せて5mm幅に切断し、ＲＳウイルス検査デバイスとした。
１で作製した抗体固定化メンブレンと２及び３で作製した標識体パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）とを貼り合せて5mm幅に切断し、ＲＳウイルス検査デバイスとした。
５．ＲＳウイルス検査デバイスの特異性及び正確性の確認
４で作製したＲＳウイルス検査デバイスに、呼吸器感染症を引き起こすウイルスを含む検体浮遊液（10mM Tris（pH8.0）、1%(w/v)ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、3%(w/v)アルギニン、3%(w/v)BSA）を50μＬ滴加し、5分間静置した。
４で作製したＲＳウイルス検査デバイスに、呼吸器感染症を引き起こすウイルスを含む検体浮遊液（10mM Tris（pH8.0）、1%(w/v)ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、3%(w/v)アルギニン、3%(w/v)BSA）を50μＬ滴加し、5分間静置した。
抗マウスIgG抗体及び抗Ｎ蛋白質抗体の両方の塗布位置で発色を目視で確認できた場合に＋と判定した。抗マウスIgG抗体の塗布位置のみで発色を目視で確認でき、抗Ｎ蛋白質抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は－と判定した。また、抗マウスIgG抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は無効と判定した。
結果を表１に示す。
表１に示された通り、本発明の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体を用いた免疫測定器具は、ＲＳウイルスに反応するものの、他の呼吸器感染症の病因ウイルスに対して交差反応性を示さないことから、ＲＳウイルスに対して特異的に反応することが確認できた。
実施例３ 抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体の可変領域解析
１．抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域の塩基配列解析
実施例１にて作製された抗Ｎ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をタカラバイオ株式会社へ送付し、抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域の塩基配列解析を依頼した。タカラバイオ株式会社にて、ハイブリドーマ細胞株からRNAを抽出し、5'-RACE PCRにより得られた抗Ｎ蛋白質抗体可変領域の増幅産物から塩基配列を得た。
１．抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域の塩基配列解析
実施例１にて作製された抗Ｎ蛋白質抗体を産生するハイブリドーマ細胞株をタカラバイオ株式会社へ送付し、抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域の塩基配列解析を依頼した。タカラバイオ株式会社にて、ハイブリドーマ細胞株からRNAを抽出し、5'-RACE PCRにより得られた抗Ｎ蛋白質抗体可変領域の増幅産物から塩基配列を得た。
２．抗Ｎ蛋白質抗体の可変領域のアミノ酸配列予測
１で得られた塩基配列情報から、IMGT（登録商標）データベースの塩基配列分析ツールであるIMGT / V-QUESTを用いて可変領域のアミノ酸配列を予測した。結果を表２に示す。
１で得られた塩基配列情報から、IMGT（登録商標）データベースの塩基配列分析ツールであるIMGT / V-QUESTを用いて可変領域のアミノ酸配列を予測した。結果を表２に示す。
実施例４ 抗ＲＳウイルスＮ蛋白質抗体の感度比較
臨床検体から分離され培養されたＲＳウイルス3株について、本発明の抗Ｎ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬と、市販の抗F蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬の検出感度を比較した。
臨床検体から分離され培養されたＲＳウイルス3株について、本発明の抗Ｎ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬と、市販の抗F蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬の検出感度を比較した。
2016年に採取された臨床検体から分離したＲＳウイルス3株を、それぞれVero細胞に接種し増殖させた。緩衝液を用いてＲＳウイルス感染細胞培養上清の2倍希釈系列を調製し、そのうち所定量を検体浮遊液へ添加したものを試料とした。
結果を表３に示す。
臨床検体から分離されたウイルス3株を用いて感度比較試験を実施した結果、3株中2株において、抗Ｎ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬は抗Ｆ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬と同等以上の感度を示した。
3株のうち1株については、抗Ｆ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬では全く反応がみられなかったのに対し、抗Ｎ蛋白質抗体を用いた抗原検出試薬では高い検出感度を示した。
本発明の抗体を用いてＲＳウイルス感染症を特異的に検出することができる。
配列番号１～４ 合成
Claims (9)
- 配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- 抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ及びｍｉｎｉｂｏｄｙからなる群から選択されるペプチド断片である、請求項１に記載の抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片。
- 請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含むＲＳウイルス検出用試薬又はキット。
- 固相に固定化される抗体又はその断片及び標識化された抗体又はその断片を含むサンドイッチ型免疫測定試薬又はキットであり、固相に固定化される抗体又はその断片及び標識化された抗体又はその断片の少なくとも一方が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、請求項３に記載のＲＳウイルス検出用試薬又はキット。
- 前記固相に固定化される抗体又はその断片が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２又は３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、請求項４に記載のＲＳウイルス検出用試薬又はキット。
- 前記標識化された抗体又はその断片が、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３又は４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＲＳウイルスＮ蛋白質モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片である、請求項４に記載のＲＳウイルス検出用試薬又はキット。
- イムノクロマト法の試薬又はキットである、請求項４～６のいずれか１項に記載のＲＳウイルス検出用試薬。
- 請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫学的検出法により、ＲＳウイルスを検出する方法。
- イムノクロマト法である、請求項８に記載の方法。
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