JP7477152B2

JP7477152B2 - Ｈｔｌｖ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤

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Publication number: JP7477152B2
Application number: JP2020083940A
Authority: JP
Inventors: 和広森下; 新吾中畑
Original assignee: University of Miyazaki NUC
Current assignee: University of Miyazaki NUC
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2024-05-01
Anticipated expiration: 2040-05-12
Also published as: JP2021178783A

Description

本発明は、ＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤に関する。

ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ－１）感染者（キャリア）は、日本、南米、アフリカ、カリブ海沿岸諸国等を中心に世界で２千万人以上存在する。数％のキャリアにおいて、長期の潜伏期後、難治性血液がんである成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）、神経難病である熱帯性痙性対麻痺／ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）などを含むＨＴＬＶ－１関連疾患を発症する。一旦ＨＴＬＶ－１に感染すると生涯このウイルスを体内から排除することができず、さらにＡＴＬＬ細胞は抗がん剤耐性を示すことから予後不良となる。またＨＡＭ／ＴＳＰは、歩行障害、排尿障害などをきたし、ＱＯＬを低下させる。しかしながら、未だこれらの疾患に対する有効な発症予防薬や治療薬は開発されていない。

近年日本においてＡＴＬＬの新規治療法として、造血幹細胞移植や、分子標的薬であるモガムリズマブが開発され、一部の患者の予後が改善されている（非特許文献１）。

医薬品インタビューフォーム「ポテリジオ（登録商標）点滴静注２０ｍｇ」、２０２０年２月改定（第１版）

しかしながら、急性型ＡＴＬＬ患者の平均生存期間は半年程度と未だ極めて予後不良である。また、モガムリズマブや既存の抗がん剤は副作用が強く、適用患者も制限される。さらに、モガムリズマブは極めて高価である
そこで、本発明は、従来公知のＨＴＬＶ－１関連疾患の治療薬の代替となり、かつ安全で安価なＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、下記式１で表される化合物によって、上記課題を解決することを見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明の一形態によれば、下記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤が提供される。

式１中、Ｒ^１は、メチル基またはヒドロキシメチル基である。

本発明の他の形態によれば、上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＨＴＬＶ－１感染細胞の増殖抑制剤が提供される。

本発明の他の形態によれば、上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＮＦ－κＢ阻害剤が提供される。

本発明によれば、従来公知のＨＴＬＶ－１関連疾患の治療薬の代替となり、かつ安全で安価なＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤が提供される。

図１は、実施例の試験例１において、ＡＴＬＬ細胞株に対するクロロキンの増殖阻害効果を評価した結果を示すグラフである。図２は、実施例の試験例１において、ＡＴＬＬ患者の細胞検体に対するクロロキンの増殖阻害効果を評価した結果を示すグラフである。図３は、実施例の試験例１において、ＨＡＭ／ＴＳＰ細胞株に対するクロロキンの増殖阻害効果を評価した結果を示すグラフである。図４は、実施例の試験例１において、ＡＴＬＬ細胞株に対するヒドロキシクロロキンの増殖阻害効果を評価した結果を示すグラフである。図５は、実施例の試験例２において、ＡＴＬＬ細胞株におけるクロロキン処理によるアポトーシス誘導効果を評価した結果を示すグラフである。図６は、実施例の試験例３において、クロロキン処理によるＡＴＬＬ細胞株のアポトーシス誘導を抗ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ－３抗体を用いたウエスタンブロット法により解析した結果を示すグラフである。図７は、実施例の試験例４において、ＡＴＬＬ細胞株をクロロキンで処理し、ｐ４７タンパク質発現およびＮＦ－κＢシグナル伝達の阻害を失せスタンブロット法により解析した結果を示すグラフである。図８は、実施例の試験例５において、クロロキン処理によるｉｎｖｉｖｏＡＴＬＬ腫瘍抑制効果を評価した結果を示すグラフである。図９は、実施例の試験例５において、低用量クロロキン処理によるｉｎｖｉｖｏＡＴＬＬ腫瘍抑制効果を評価した結果を示すグラフである。

以下、本発明の一形態に係る実施の形態を説明する。本発明は、以下の実施の形態のみには限定されない。

本明細書において、範囲を示す「Ｘ～Ｙ」は「Ｘ以上Ｙ以下」を意味する。また、特記しない限り、操作および物性等の測定は室温（２０～２５℃）／相対湿度４０～５０％ＲＨの条件で測定する。

本発明の第１の形態は、上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤である。本発明の第２の形態は、上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＨＴＬＶ－１感染細胞の増殖抑制剤である。本発明の第３の形態は、上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＮＦ－κＢ阻害剤である。

本明細書において、第１の形態のＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤、第２の形態のＨＴＬＶ－１感染細胞の増殖抑制剤および第３の形態ＮＦ－κＢ阻害剤をまとめて、「本発明に係る薬剤」と称する。

本明細書において、「有効成分として含む」とは、ＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤、ＨＴＬＶ－１感染細胞の増殖抑制剤またはＮＦ－κＢ阻害剤として有効である程度に含むことを意味し、その他の成分を含むことを妨げるものではない。

［有効成分として用いられる化合物およびその薬学的に許容される塩］
本発明は、下記式１で表される化合物およびその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。

本明細書において、「薬学的に許容される塩」は、被験体へ投与された後、望ましくない生理学的効果を生じさせない、金属塩、アンモニウム塩、有機酸塩、無機酸塩、または有機塩基もしくは無機塩基との塩である。より具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、アンモニウム塩、メチルアミン塩、エチルアミン塩、アニリン塩、ジメチルアミン塩、ジエチルアミン塩、ピロリジン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、ピペラジン塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、フタル酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびｐ－トルエンスルホン酸塩等が例示できるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、上記式１で表される化合物およびその薬学的に許容される塩は、ヒドロキシクロロキン硫酸塩およびクロロキン二リン酸塩からなる群から選択される。

上記式１で表される化合物は、本願出願時の技術常識を参酌することにより、常法に従って合成してもよく、市販品を用いてもよい。

［本発明の各形態に係る用途］
上述のように、ＨＴＬＶ－１関連疾患であるＡＴＬＬの治療において、モガムリズマブなどの分子標的薬が知られている。しかし、モガムリズマブや既存の抗がん剤は副作用が強く、適用患者も制限される。

これに対し、本発明者らは、上記式１で表される化合物およびその薬学的に許容される塩がＨＴＬＶ－１感染細胞に対して様々な作用を発揮することを初めて見出し、本発明を完成させるに至った。

まず、本発明者らが検討を進めたところ、ＡＴＬＬ細胞およびＨＡＭ／ＴＳＰ細胞に対して、オートファジー阻害剤が有効であることを見出した。ＡＴＬＬ細胞は、癌シグナルとして知られるＮＦ－κＢ情報伝達経路が活性化し、細胞増殖や生存を維持している。さらに、ＨＴＬＶ－１感染細胞におけるＮＦ－κＢ情報伝達系の活性化は、ＡＴＬＬ細胞の特異的表面分子であり、臓器浸潤に関わるＣＡＤＭ１発現を促進する。本発明者らは、ＮＦ－κＢ情報伝達活性化機構として、ＮＦ－κＢの負の制御因子であるｐ４７分解がオートファジーにより亢進されていることを発見した。

これまでに抗マラリア薬であるクロロキン（ＣＱ）およびヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）がオートファジーを阻害することが報告されている。しかしながら、ＣＱ／ＨＣＱがＨＴＬＶ－１感染細胞に対して様々な作用を発揮することについては、何ら知られていない。

そこでＡＴＬＬ細胞およびＨＡＭ／ＴＳＰ細胞に対して、これらの薬効を検討したところ、ＣＱ／ＨＣＱがＮＦ－κＢ情報伝達系を阻害し、さらに極めて高い増殖抑制効果を示すことを明らかにした（後述の試験例４）。また、ＣＱ／ＨＣＱがＨＡＭ／ＴＳＰ細胞およびＡＴＬＬ細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導できることを明らかにした（後述の試験例２および３）。さらに、ＡＴＬＬモデルマウスを用いたｉｎｖｉｖｏでの実験により、ＣＱがＡＴＬＬ細胞による腫瘍の成長を抑制できることを明らかにした（後述の試験例５）。

ＨＴＬＶ－１関連疾患としては、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）、熱帯性痙性対麻痺／ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＴＳＰ／ＨＡＭ）、ＨＴＬＶ－１関連気管支肺炎（ＨＡＢ）、ＨＴＬＶ－１関連ぶどう膜炎（ＨＡＵ）、ＨＴＬＶ－１関連関節症（ＨＡＡＰ）などが挙げられる。これらのうち、本発明に係る薬剤の対象としては、好ましくは成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫および熱帯性痙性対麻痺／ＨＴＬＶ－１関連脊髄症である。

本発明に係る薬剤は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明に係る薬剤と薬理学的に許容されうる担体、希釈剤および賦形剤とを含むものであってもよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。

経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していてもよい。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、ショ糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。

非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含してもよい。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、本発明に係る薬剤を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄｃａｓｔｏｒｏｉｌ）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明に係る薬剤を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。

上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。本発明に係る薬剤の含有量としては、上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩として投薬単位剤形当たり通常５～５００ｍｇであり、とりわけ錠剤では２００～４００ｍｇであることが好ましい。

上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を含む本発明に係る薬剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与経路などによっても異なるが、例えば、成人のＨＴＬＶ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のために使用する場合には、上記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を１回量として、例えば０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは１～７ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１回経口投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて適宜投与量を調節してもよい。

以下に具体例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。

（細胞の前培養）
以下の例で用いられる細胞株のうち、ＫＫ１、ＫＯＢ、ＳＴ１、ＨＣＴ１、ＨＣＴ４、およびＨＣＴ５は、長崎大学より譲渡されたものであり、Ｓｕ９Ｔ１とＳ１Ｔは、鹿児島大学より譲渡されたものであり、ＭＴ２は、大分大学より譲渡されたものであり、ＭＴ１は、高知大学より譲渡されたものであり、ＭＯＬＴ４は、株式会社林原より購入した。

ヒトの細胞検体は、健常者および成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）患者のヘパリン採血より分取した末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を用いた。なお、ヒトからの血液試料の採取はすべて、インフォームドコンセントを行って血液提供者の意思を確認した後に実施したものである。

ＡＴＬＬ細胞株（ＫＫ１、ＭＴ１、ＫＯＢ、Ｓ１Ｔ、ＳＴ１、およびＳｕ９Ｔ１）、およびＴ－ＡＬＬ細胞株（ＭＯＬＴ４）を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｌ-グルタミン、フェノールレッド含有）（富士フイルム和光純薬株式会社製）中で培養した。なお、ＩＬ－２依存性ＡＴＬＬ細胞株においては０．７５μｇ／ｍＬＩＬ－２（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＩＬ－２、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）をさらに添加したＲＰＭＩ－１６４０培地中で培養した。

ＨＡＭ／ＴＳＰ細胞株（ＨＣＴ１、ＨＣＴ４、ＨＣＴ５）、健常者の細胞検体（ヒトＰＢＭＣ）およびＡＴＬＬ患者の細胞検体（Ｐｔ＃１、Ｐｔ＃２およびＰｔ＃３）は、２０％ＦＢＳ、１０μＭ２－メルカプトエタノール、０．７５μｇ／ｍｌＩＬ２を添加したＡＩＭ－Ｖ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中で培養した。

（試験例１）クロロキンまたはヒドロキシクロロキンのｉｎｖｉｔｒｏ薬効評価（ＭＴＴアッセイ）
前培養した細胞をＰＢＳ（－）緩衝液で洗浄した後、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し５０μＬずつ平底９６－Ｗｅｌｌｐｌａｔｅに添加した（ｎ＝３）。４００μＭのクロロキン（ＣＱ）（クロロキン二リン酸塩、Ｔｏｃｒｉｓ社製）またはヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）（ヒドロキシクロロキン硫酸塩、プラニケル（登録商標）、サノフィ株式会社製）を含む培養液（ＲＰＭＩ－１６４０培地またはＡＩＭ－Ｖ培地）を用意し、５段階の希釈系列（２、１０、２０、１００または２００μＭ）を作製した（薬剤を含まない培養液も用意した）。細胞を分注したｗｅｌｌに薬剤を含む培養液を５０μＬずつ添加し（最終濃度：１、５、１０、５０、１００または２００μＭ）、薬剤を含まない培養液を５０μＬずつ添加した。また、培養液を１００μＬずつ分注したｗｅｌｌを用意した。ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で４８時間培養した。培養後それぞれのｗｅｌｌにＣｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇＫｉｔ－８溶液（株式会社同仁化学研究所製）を１０μＬずつ添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で２時間または６時間（ヒトＰＢＭＣに対して）呈色反応を行い、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。薬剤を含まないｗｅｌｌの吸光度を細胞増殖率１００％としてそれぞれの薬剤濃度での細胞増殖率（％）を算出した。

結果を表１～４および図１～４に示す。

図１は、各種ＡＴＬＬ細胞株（ＫＫ１、ＫＯＢ、ＭＴ１、Ｓ１ＴおよびＳＴ１）、ＨＴＬＶ－１陰性Ｔ細胞株ＭＯＬＴ４、およびヒト健常者由来のＰＢＭＣ（ＨｕｍａｎＨｅａｌｔｈｙＰＢＭＣ）に対してクロロキンを処理した結果を示す。縦軸は細胞生存率（％）、横軸はクロロキンの投与量を示す。値は平均値±ＳＤ；＊、ユーロ（記号）、＃、‡、＄、＼、Ｐ＜０．０５、ＫＫ１、ＭＴ１、ＫＯＢ、Ｓ１Ｔ、ＳＴ１、ＭＯＬＴ４ｖｓ．ＣＤ４＋Ｔを示す。

図１に示すように、クロロキンは、解析した全てのＡＴＬＬ細胞株において、濃度依存的な増殖抑制効果を示した。そのＩＣ５０濃度は、３０μＭから７１μＭ程度であった（表１）。一方、健常者由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対する毒性作用は低く、高濃度（２００μＭ）の処理においてのみ抑制作用が見られた。ＨＴＬＶ－１陰性Ｔリンパ性白血病細胞株ＭＯＬＴ４に対しても、クロロキンによる一定の増殖阻害効果が観察された。したがって、クロロキンは、ＡＴＬＬ細胞に対して一貫した増殖抑制効果を有する阻害薬であることが示唆される。

図２は、ＡＴＬＬ患者の細胞検体（Ｐｔ＃１、Ｐｔ＃２およびＰｔ＃３）に対してクロロキンを処理した結果を示す。縦軸は細胞生存率（％）、横軸はクロロキンの投与量を示す。値は平均値±ＳＤを示す。

図２に示すように、クロロキンは、解析した全てのプライマリーＡＴＬＬ細胞において、濃度依存的な増殖抑制効果を示した。そのＩＣ５０濃度は、１９μＭから４９μＭ程度であった（表２）。したがって、クロロキンは、プライマリーＡＴＬＬ細胞に対して有効であることが示唆される。

図３は、ＨＡＭ／ＴＳＰ細胞株（ＨＣＴ１、ＨＣＴ４およびＨＣＴ５）に対してクロロキンを処理した結果を示す。縦軸は細胞生存率（％）、横軸はクロロキンの投与量を示す。値は平均値±ＳＤを示す。

図３に示すように、ＨＡＭ／ＴＳＰ細胞株においてもＡＴＬＬ細胞株と同様にクロロキンによる高い増殖抑制活性が示された。そのＩＣ５０は、１７μＭから６３μＭ程度であった（表３）。クロロキンは、ＨＡＭ／ＴＳＰ由来細胞に対しても感受性が高い阻害剤であることが分かる。

図４は、ＡＴＬＬ細胞株（ＫＫ１およびＳｕ９Ｔ１）、ＨＴＬＶ－１陰性Ｔ細胞株ＭＯＬＴ４、およびＡＴＬ患者の細胞検体（Ｐｔ＃２）に対してヒドロキシクロロキンを処理した結果を示す。縦軸は細胞生存率（％）、横軸はクロロキンの投与量を示す。値は平均値± ＳＤを示す。

図４に示すように、ヒドロキシクロロキンは、解析した全てのＡＴＬＬ細胞において、濃度依存的な増殖抑制効果を示した。そのＩＣ５０濃度は、１６μＭから６０μＭ程度であった（表４）。ＨＴＬＶ－１陰性Ｔリンパ性白血病細胞株ＭＯＬＴ４に対しても、ヒドロキシクロロキンによる増殖阻害効果が観察された。以上、ヒドロキシクロロキンは、ＡＴＬＬ細胞に対して増殖抑制効果を有する阻害薬であることが示唆される。

（試験例２）フローサイトメトリー解析によるアポトーシス評価
前培養した細胞をＰＢＳ（－）緩衝液で洗浄した後、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し１ｍＬずつ６－Ｗｅｌｌｐｌａｔｅに添加した。２００μＭのクロロキンを含む培養液を用意した（薬剤を含まない培養液も用意した）。細胞を分注したｗｅｌｌに薬剤を含む培養液を１ｍＬずつ添加し（最終濃度：１００μＭ）、薬剤を含まない培養液を１ｍＬずつ添加した。ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４時間培養した。

培養した細胞を遠心分離して上清を除去し、ペレットをＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙＢｕｆｆｅｒ（０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ（－）、以下ＦＡＣＳｂｕｆｆｅｒ）で１回洗浄し、再度ペレットをＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒに懸濁して細胞数を測定した。細胞が１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように細胞懸濁液を調整し、これをＦＡＣＳｔｕｂｅに１００μＬずつ分注した。遠心分離により上清を除去し、ＰＥ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶ抗体（最終濃度０．２μｇ／ｍｌ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）およびＤＡＰＩ（最終濃度０．０２ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ１００μＬを添加した。よく懸濁してから、４℃で３０分インキュベートした。その後、遠心分離を行い、ＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒ１００μＬずつで２回それぞれの細胞を洗浄した。洗浄した細胞を３ｍＬのＦＡＣＳＢｕｆｆｅｒで懸濁した後、Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＪＳＡＮ、ベイバイオサイエンス株式会社製）でＡｎｎｅｘｉｎＶおよびＤＡＰＩの蛍光シグナルを測定した。

結果を図５および表５に示す。

図５は、ＡＴＬＬ細胞株（ＫＫ１、ＫＯＢ、Ｓ１ＴおよびＭＴ２）に対して、クロロキンを処理し、アポトーシスの割合をフローサイトメトリーにて解析した結果を示す。正常細胞は、ＡｎｎｅｘｉｎＶ（ＡｎｎＶ）およびＤＡＰＩ陰性であり、初期アポトーシスは、ＡｎｎｅｘｉｎＶ（ＡｎｎＶ）陽性およびＤＡＰＩ陰性であり、後期アポトーシスおよびネクローシスは、ＡｎｎｅｘｉｎＶ（ＡｎｎＶ）およびＤＡＰＩ陽性である。

クロロキンは、アポトーシスの誘導能を有し、１００μＭ、２４時間の処理で７４～９５％のＡＴＬＬ細胞株がアポトーシスを引き起こしていることが示された（表５）。したがって、クロロキンは、アポトーシス誘導を介してＡＴＬＬ細胞の増殖を抑制することが示唆される。

（試験例３）ウエスタンブロット法によるアポトーシス評価
ウエスタンブロット法を用いて、クロロキンで処理したＡＴＬＬ細胞株（ＫＫ１およびＳ１Ｔ）におけるＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ－３の発現の経時的な変化を調べた。Ａｃｔｉｎをローディングコントロールとして使用した。

前培養した細胞をＰＢＳ（－）緩衝液で洗浄した後、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し１ｍＬずつ６－Ｗｅｌｌｐｌａｔｅに添加した。１００μＭのクロロキンを含む培養液を用意した（薬剤を含まない培養液も用意した）。細胞を分注したｗｅｌｌに薬剤を含む培養液を１ｍＬずつ添加し（最終濃度：５０μＭ）、薬剤を含まない培養液を５０μＬずつ添加した。ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で６、１２、１８または２４時間培養した。

培養した細胞を回収後、ＰＢＳ（－）緩衝液で洗浄し、細胞ペレットに１×ＳＤＳサンプル緩衝液（６２．５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を加え細胞を溶解した。９５℃で５分間煮沸後、サンプルを１５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ミニプロテアン３セル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により定電圧１００Ｖで２時間泳動した。ゲルはミニトランスブロットセル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）（２５０ｍＡ、３時間）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写し、転写膜は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加Ｔｒｉｓｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ／Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ／Ｔ）緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）により室温、１時間ブロッキング反応を行なった。１％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔで１０００倍希釈（抗ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ－３抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製））または２０００倍希釈（抗Ａｃｔｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製））後の一次抗体液を用いて４度で一晩反応させ、ＴＢＳ／Ｔ緩衝液にて５分×３回洗浄した。さらに１％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔにて２０００倍希釈後の二次抗体液にて室温で１時間反応させ、その後ＴＢＳ／Ｔ緩衝液にて５分×３回洗浄した。洗浄後ＬｕｍｉｌｉｇｈｔＰＬＵＳＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇｋｉｔ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ社製）にて化学発光させ、ルミノイメージアナライザーＬＡＳ－３０００（富士フイルム株式会社製）で画像解析を行った。

結果を図６に示す。

図６に示すように、クロロキン処理によるＡＴＬＬ細胞株のアポトーシス誘導は、抗ＣｌｅａｖｅｄＣａｓｐａｓｅ－３のウエスタンブロット解析においても確認された。

（試験例４）ウエスタンブロット法によるＮＦ－κＢシグナル伝達経路の評価
ウエスタンブロット法を用いて、クロロキンで処理したＡＴＬＬ細胞株（ＫＫ１およびＳ１Ｔ）におけるＣＡＤＭ１、ｐ４７、ＮＥＭＯ、ｐ－ＩκＢα、ＩκＢα、ＬＣ３－ＩおよびＬＣ３－ＩＩの発現の経時的な変化を調べた。Ａｃｔｉｎをローディングコントロールとして使用した。

前培養した細胞をＰＢＳ（－）緩衝液で洗浄した後、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し１ｍＬずつ平底６－Ｗｅｌｌｐｌａｔｅに添加した。１００μＭのクロロキンを含む培養液を用意した（薬剤を含まない培養液も用意した）。細胞を分注したｗｅｌｌに薬剤を含む培養液を１ｍＬずつ添加し（最終濃度：５０μＭ）、薬剤を含まない培養液を１ｍＬずつ添加した。ＣＯ_２インキュベーター中で３７℃、５％ＣＯ_２の条件で６、１２、１８または２４時間培養した。

培養した細胞を回収後、ＰＢＳ（－）緩衝液で洗浄し、細胞ペレットに１×ＳＤＳサンプル緩衝液（６２．５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５％２－メルカプトエタノール、０．０１％ブロモフェノールブルー）を加え細胞を溶解した。９５℃で５分間煮沸後、サンプルを１０％、１２％、または１５％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ミニプロテアン３セル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）により定電圧１００Ｖで２時間泳動した。ゲルはミニトランスブロットセル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）（２５０ｍＡ、３時間）を用いてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写し、転写膜は１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）添加Ｔｒｉｓｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ／Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ／Ｔ）緩衝液（１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）により室温、１時間ブロッキング反応を行なった。１％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔで５００倍希釈（抗ＣＡＤＭ１抗体）、２０００倍（抗Ａｃｔｉｎ抗体）、あるいは１０００倍希釈（抗ｐ４７抗体（Ａｂｎｏｖａ社製）、抗ＮＥＭＯ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ｐ－ＩκＢα抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗ＩκＢα抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および抗ＬＣ－３抗体（ＮｏｖｕｓＢｉｌｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製））後の一次抗体液を用いて４度で一晩反応させ、ＴＢＳ／Ｔ緩衝液にて５分×３回洗浄した。さらに１％ＢＳＡ／ＴＢＳ－Ｔにて２０００倍希釈後の二次抗体液にて室温で１時間反応させ、その後ＴＢＳ／Ｔ緩衝液にて５分×３回洗浄した。洗浄後ＬｕｍｉｌｉｇｈｔＰＬＵＳＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇｋｉｔ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅ社製）にて化学発光させ、ルミノイメージアナライザーＬＡＳ－３０００（富士フイルム株式会社製）で画像解析を行った。

結果を図７に示す。

図７に示すように、ウエスタンブロット解析において、クロロキン処理によりオートファジーのプロセスで分解されるオートファジータンパク質ＬＣ３－ＩＩの蓄積が観察された。よって、クロロキンの細胞内シグナル伝達作用機序として、オートファジー阻害を介していることが示唆される。

さらに、ＮＦ－κＢシグナル伝達抑制因子であるｐ４７タンパク質が蓄積し、ＩκＢαのリン酸化に伴うＩκＢαの蓄積が見られ、ＣＡＤＭ１の発現低下が誘導され、ＮＦ－κＢ活性化が抑制されていることが示唆される。

以上より、クロロキンによるＡＴＬＬ細胞のアポトーシス誘導は、ＮＦ－κＢシグナル経路阻害が関与していることが示唆される。

（試験例５）クロロキンのｉｎｖｉｖｏ薬効評価
以下の実験は、「宮崎大学動物実験規則」に基づき、宮崎大学動物実験委員会の承認のもと実施された（承認番号：２０１７－５０３）。

前培養したＡＴＬＬ細胞株Ｓｕ９Ｔ１またはＭＴ２を５４００×ｇ、５分間遠心して上清を除去した後、ペレットをＰＢＳ（－）に懸濁し、７０μｍのセルストレーナーを通し、細胞数をカウントした。カウント後、細胞懸濁液を遠心して上清を除去し、注射用生理食塩水に懸濁して０．５×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。２９Ｇ１／２針付きシリンジ（ＳＳ－０１０Ｆ２９１３、テルモ株式会社製）に細胞懸濁液２００μＬを充填し、マウス（ＮＯＧマウス（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ＲγＫＯ）、雄、８週齢、インビボサイエンス社）の皮下に全量を注入した。細胞移植後は、隔日でノギスを用いて腫瘍径を測定し、腫瘍容積が１５０ｍｍ^３に達したものを実験に使用し、無作為に２群に分けた。クロロキン５ｍｇ／ｋｇＢＷ及び５０ｍｇ／ｋｇＢＷまたは対照群として滅菌水を１回／日にて腹腔内投与した。投与は全１６回実施した。一般状態観察および生死判定は移植後毎日実施し、毎週ノギスを用いて腫瘍径を測定し、また体重の測定を行なった。最終投与日より１週間の観察期間を取り、その後安楽死処置を行い、血液および全身臓器を採取した。なお、異常所見発生時または腫瘍容積が１５００ｍｍ^３を超えた場合は安楽死処置した。２０％を超える体重減少や顕著な衰弱、体温低下などの事象が発生した場合は、試験委託者に報告の上、麻酔下で後大静脈より少量採血した後、放血により安楽死させた。また、採血した血液を使用して血液塗抹標本を作製した。安楽死処置後、解剖を行い、病理所見を記録した。

結果を図８および９に示す。図８Ａは、腫瘍径の比較、図８Ｂは、腫瘍径の増加率(エンドポイントの大きさ／投与開始日の大きさ)、図８Ｃは、腫瘍の浸潤が見られたマウスの割合、および図Ｄは、体重変化を示す。図９は、各群における腫瘍の成長を示す。

図８に示すように、ＡＴＬＬ細胞株Ｓｕ９Ｔ１を免疫不全マウスに皮下移植したＡＴＬＬモデルマウスにおいて、クロロキン投与は、ＡＴＬＬ細胞の腫瘍形成を阻害できることが分かる。生理食塩水を投与した対照群では、移植したＡＴＬＬ細胞株による腫瘍の増大が見られたのに対して、クロロキン投与群では、その腫瘍成長は抑制された（図８ＡおよびＢ）。さらに、対照群は移植したＡＴＬＬ細胞株によるリンパ節浸潤が高率に示すのに対して、クロロキン投与群ではリンパ節浸潤も阻害されていた（図８Ｃ）。また、クロロキン投与においてマウスの体重変化は見られなかった（図８Ｄ）。以上より、クロロキンは生体内においてもＡＴＬＬ細胞の増殖を阻害する薬剤であることが示唆される。

同様に、図９に示すように、ＭＴ２を皮下移植したＡＴＬＬモデルマウスにおいて、低用量のクロロキン投与によってもＡＴＬＬ細胞の腫瘍形成を阻害できることが分かる。５ｍｇ／ｋｇＢＷのクロロキン投与は、５０ｍｇ／ｋｇＢＷと同程度に腫瘍成長を抑制したことが分かる。

Claims

下記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、成人Ｔ細胞白血病・リンパ腫（ＡＴＬＬ）または熱帯性痙性対麻痺／ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）の発症予防、進展抑制または治療のための剤：

式１中、Ｒ^１は、メチル基またはヒドロキシメチル基である。
前記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩がヒドロキシクロロキン硫酸塩およびクロロキン二リン酸塩からなる群から選択される、請求項１に記載の剤。
下記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＨＴＬＶ－１感染細胞の増殖抑制剤：

式１中、Ｒ^１は、メチル基またはヒドロキシメチル基である。
下記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＨＴＬＶ－１感染細胞のＮＦ－κＢ阻害剤：

式１中、Ｒ^１は、メチル基またはヒドロキシメチル基である。
下記式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、ＨＴＬＶ－１感染細胞のアポトーシス誘導剤：

式１中、Ｒ ^１は、メチル基またはヒドロキシメチル基である。