JP7463357B2 - Ｐｄｅ４ｄ７及びｄｈｘ９発現に基づく術前のリスク層別化 - Google Patents
Ｐｄｅ４ｄ７及びｄｈｘ９発現に基づく術前のリスク層別化 Download PDFInfo
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Description
本発明は、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法に関する。さらに、本発明は、診断キット、前立腺がん被験体の術前リスク層別化方法における診断キットの使用、前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイル及びＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルの使用、及び対応するコンピュータプログラム製品に関する。
がんは、一群の細胞が制御不能な増殖、浸潤、及びときにより転移を示す疾患の一種である。これら３つのがんの悪性度は、自己限定性で浸潤も転移もしない良性腫瘍と鑑別される。前立腺がん（ＰＣａ）は、男性の皮膚以外の悪性腫瘍の中で最も発生頻度が高く、２０１２年には世界で１１０万人が新たに診断されたと推定される（非特許文献１）。
高齢化のため、ＰＣａの発生率は今後数年間でさらに高まる（非特許文献２を参照）。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の血中濃度測定、直腸指診（ＤＲＥ）、経直腸的超音波検査（ＴＲＵＳ）によるルーチン診断により、非がん性で良性の前立腺疾患を最初に選択する過剰診断がなされ（非特許文献３及び４を参照）：米国だけでも、年間約１００万件の前立腺生検が実施され、約２５万人の新規患者が見出されるが、その約７５％は不必要な実施であり、患者は重大な合併症（尿崩症、出血、尿閉）を発症し、総費用は２０億米ドルを超える（生検１回あたり約２，１００米ドル）。生検が陰性であった男性１００人中少なくとも４人は副作用のために入院する可能性が高く、生検を受けた患者１０，０００人中９人は現在用いられている手技で死亡するリスクがある（非特許文献５参照）。
米国では、年間約２５万件のＰＣａが新たに見いだされ、そのうち約２０万件は、限局性疾患（非特許文献６及び７を参照）、すなわち、限局性前立腺がんであると特徴つけられる。この状態は、放射線治療や、特に手術による前立腺の部分的又は全体的な除去（前立腺切除術）等の一次治療のアプローチにより、ある程度は治癒しうる。しかし、当該治療法には重篤な副作用が伴い、特に前立腺切除術では尿失禁や勃起障害が頻繁に起こる。根治的前立腺切除術を受けた男性の最大５０％が尿失禁を発症する。術後１年経過後も、１５％～５０％の男性が当該問題を報告するという複数の研究結果もある。勃起障害も同様に根治的前立腺切除術（ＲＰ）の重大な副作用である。手術を受けた男性のうち、勃起力をある程度回復できるのは約半数に過ぎない。さらに、限局性ＰＣａに対する通常治療はすべて高額であり（通常２～３万ドル程度）、米国では毎年５０億ドルの直接的費用が発生する。
米国では、診断時に臨床的に限局性疾患がある約２０万人の男性のうち、最大でも５０％が超低リスク又は低リスクのがんであるといわれる（非特許文献８を参照）。このため、ＮＣＣＮ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ）は最近、ＰＣａ治療ガイドラインを改訂し、当該低リスクの疾患がある患者のための緩慢かつ便利な治療法の選択肢として、積極的サーベイランス（ＡＳ）を拡大した（非特許文献９参照）。適当な患者をＡＳに向けることで、当該患者のＱＯＬは、一次治療を受けた男性と比較して大幅に改善され、ＡＳにかかる５年間のコストは、患者一人あたり１０，０００米ドル以下と報告される（非特許文献６を参照）。
さらに、患者にとって選択すべき治療法として（ＡＳと比較して）手術が選択される場合、患者の腫瘍の潜在的悪性度により手術範囲を層別化することが有意に有利である。例えば、神経温存手術法は、疾患が低リスクと予測される男性に一般適用されると、根治的な前立腺切除術の副作用を最小限に抑制しうる。同様に、欧州泌尿器科学会（ＥＡＵ）の最新の前立腺がんガイドラインによると、高リスクのがんが予測される場合、より限定的な手技と比較して、複雑で時間がかかり、合併症の発生率が高いという事実にもかかわらず、拡大リンパ節郭清が推奨される（非特許文献１０を参照）。その結果、より限定的なリンパ節郭清ではリンパ節転移の約５０％を見逃すことが示されているが、限局性前立腺がんの男性の管理するため、個々の腫瘍の潜在的悪性度を術前に高度に正確に予測して、個々の患者に最適なケアを提供する必要がある。
特許文献１は、被験体のがんの診断、予後及びがん進行を決定する方法、システム及びキットを開示す。被験体のがんの治療モダリティを決定する方法、システム及びキットがさらに開示される。当該方法、システム及びキットは、バイオマーカーの発現に基づく分析を含む。被験体におけるがん状態に用いるプローブセットがさらに開示される。
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本発明の目的は、前立腺がん患者の術前リスク層別化方法を提供することであり、これにより、個々の腫瘍の潜在的悪性度を術前に予測することができる。本発明のさらなる目的は、診断キット、前立腺がん対象者の術前リスク層別化方法における診断キットの使用、前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイル及びＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルの使用、並びに対応するコンピュータプログラム製品の提供である。
本発明の第一態様では、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法が提示され、当該方法は、以下の：
－被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの決定工程；
－前記被験体から得られた同一又は別の生物学的試料中のＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルの決定工程；及び
－前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく、前記被験体の術前予後リスクスコアの決定工程；
を含む。
－被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの決定工程；
－前記被験体から得られた同一又は別の生物学的試料中のＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルの決定工程；及び
－前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく、前記被験体の術前予後リスクスコアの決定工程；
を含む。
ｃＡＭＰシグナル伝達経路は、前立腺がんの発生と進行に重要な機能を担うことが知られている（Merkle D. and Hoffmann R., “Roles of cAMP and cAMP-dependent protein kinase in the progression of prostate cancer: Cross-talk with the androgen receptor”, Cellular Signalling, Vol. 23, No. 3, pages 507-515, 2011を参照）。ｃＡＭＰの合成にはアデニル酸シクラーゼが関与するが、ｃＡＭＰの破壊にはサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）が唯一の細胞内機構として関与するようだ。ＰＤＥは、シグナル伝達の終結及び、重要なことに、細胞の３Ｄマトリクス内でｃＡＭＰシグナル伝達を区画化できる。これは、局在化したアンカータンパク質／シグナルソームによって隔離された、異なるＰＤＥアイソフォームの亜集団を介して、ｃＡＭＰを空間的に個別に破壊することにより、達成される（例えば、Conti M. and Beavo J., "Biochemistry and physiology of cyclic nucleotide phosphodiesterases: essential components in cyclic nucleotide signaling", Annual Review of Biochemistry, Vol.76, pages 481-511, 2007を参照）。このように、異なるＰＤＥアイソフォームの発現及び／又は活性の変化は、疾患の発症及び進行中に下流のシグナル伝達経路を変化させる可能性があり、新たなバイオマーカーや標的治療介入の標的となりうる。実際、ｃＡＭＰを分解するＰＤＥ４ファミリーの発現変化は、脳卒中、先端筋萎縮症、統合失調症、ＣＯＰＤ等の様々な疾患に関連すると考えられている。最近では、特定のＰＤＥ４アイソフォーム（ＰＤＥ４Ｄ７）の下方制御が前立腺がんに影響を与える可能性が示されている（例えば、Boettcher R.ら、「Human phosphodiesterase 4D7 (PDE4D7) expression is increased in TMPRSS2-ERG positive primary prostate cancer and independently adds to a reduced risk of post-surgical disease progression」、British Journal of Cancer、Vol.113、No.10、Pages 1502-1511、2015参照）。ＰＤＥ４Ｄ７アイソフォームは、ＵＣＲ１とＵＣＲ２の調節ドメインをともに含むため、いわゆる長アイソフォームである。ＵＣＲ１は、短ＰＤＥ４アイソフォームではなく、長ＰＤＥ４アイソフォームに見られ、ＰＫＡやＭＫ２を含む様々なプロテインキナーゼによる調節が可能となり、また、ＥＲＫによる触媒ユニットのリン酸化の機能的結果を決定する。機能的には、ｃＡＭＰに対する細胞の脱感作システムの一部を提供し、例えば、ＥＲＫとＡＭＰＫの活性化につながるシグナル伝達経路間のクロストークを可能にする。
ＤＨＸ９等のヒトヘリカーゼには、細胞ネットワークのハブとして作用して、細胞ストレス応答し、生存のための細胞ホメオスタシスを維持し、又は細胞死を誘導しうることを実証新なエビデンスがある。興味深いことに、最近、様々なヒトがん細胞株が、インビトロ及びインビボで、ＤＨＸ９ヘリカーゼ活性の抑制に感受性であることが示された。ＤＨＸ９を抑制後の腫瘍細胞の遺伝子発現プロファイリングでは、腫瘍の発生や進行に関わる一連の経路が脱調節されることが明らかになった。さらに、最近、ＤＨＸ９は、ゲノムの安定性を維持する、Ｒループ関連ＤＮＡ損傷の解決に主要な役割を果たすことが明らかになった。当該プロセスが阻害されると、多くのがんで実証されている現象であるゲノムレベルでの再構成により、がんの発生や進行につながるおそれがある。この最近の知見は、本発明者らが作成した、長期的な追跡調査を行った臨床的な前立腺がん患者コホートにおいて、ＤＨＸ９遺伝子の発現と前立腺がん再発までの期間との間に有意な関連性があることを示すデータ（未発表データ）により強力に裏付けられている。
本発明者らは、前立腺がん細胞において、ＰＤＥ４Ｄ７とヘリカーゼＤＨＸ９との間の相互作用を同定し、確認した。さらに、ＤＨＸ９のＮ－末端ドメインがｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によってインビトロでリン酸化されることが示された。これにより、ＰＫＡによる翻訳後修飾が、ＤＨＸ９の活性や細胞内での局在に何らかの影響を与えているのか、またＰＤＥ４Ｄ７との相互作用が、ＤＨＸ９のマイクロドメインのサイクリックＡＭＰを調節することでリン酸化に影響を与えているのか、という疑問が提起される。これにより、新たに同定されたＤＨＸ９の相互作用体としてのＰＤＥ４Ｄ７は、前立腺がん発生におけるＤＨＸ９の機能を直接的又は間接的に制御する上で重要な役割を果たす可能性がある。
ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づき、前立腺がん被験体の術前予後リスクスコアを決定することで、疾患の生物学を表すさらなる分子情報が得られる。ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の予後的機能は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく術前予後リスクスコアを決定することで、術前の患者のリスク評価に利用される。これにより、術前の設定で被験体の層別化が改善され、より良好な一次治療の決定につながる可能性がある。例えば、術前予後リスクスコアにより、前立腺がん患者の特定の亜集団に対して積極的なサーベイランス対積極的介入（例えば、根治的前立腺切除術）を選択するか否かの提案がより優れうる。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ７」又は「ＰＤＥ４Ｄ７」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体７、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ７遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１６５８９９．１に定義された配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ７転写産物の上記ＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１９に記載されたヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ７ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００１１５９３７１．１に定義されたタンパク質配列に対応する、配列番号２０に記載された対応するアミノ酸配列に関する。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ７」又は「ＰＤＥ４Ｄ７」はまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ７＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２１）及びＰＤＥ４Ｄ７＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２２）で生成することができ、かつプローブ配列番号２３により検出することができるアンプリコンに関する。
ＰＤＥ４Ｄ７ポリペプチドはまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ７－２＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号２４）及びＰＤＥ４Ｄ７＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号２５）で検出することができ、プローブ配列番号２６で検出することができる。
用語「ＰＤＥ４Ｄ７」はまた、ＰＤＥ４Ｄ７に対して高度な相同性を示すヌクレオチド配列を含み、例えば、配列番号１９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である核酸配列か、又は配列番号２０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列か、又は配列番号２０に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列であるか、又は配列番号１９に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列である。
用語「ＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９」又は「ＤＨＸ９」は、ヒトＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１３５７．４（ＥＮＳＧ００００１３５８２９）に定義される配列、具体的には、ＤＨＸ９転写産物の上記ＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号７４に記載されるヌクレオチド配列をいい、また、ＤＨＸ９ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００１３４８．２に定義されるタンパク質配列に対応する、配列番号７５に記載される対応するアミノ酸配列に関する。
用語「ＤＨＸ９」はまた、ＤＨＸ９に対して高度の相同性を示すヌクレオチド配列を含み、例えば、配列番号７４に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である核酸配列か、又は配列番号７５に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列か、又は配列番号７５に示される配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列か、又は配列番号７４に記載された配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列である。
用語「生物学的試料」又は「被験体から得られた試料」は、被験体、例えば前立腺がん患者から当業者に公知の適当な方法を介して得られたいかなる生物学的物質をも意味する。用いられる生物学的試料は、例えば、核酸（特にＲＮＡ）又はタンパク質が保存される方法で、臨床的に許容される方法で収集されうる。
生物学的試料としては、体組織及び／又は血液、汗、及び尿等の流体があげられるが、これらに限定されない。さらに、当該生物学的試料は、がん性上皮細胞又はがん性であることが疑われる組織に由来する上皮細胞等の上皮細胞に由来する細胞抽出物、又はそれらを含む細胞の集団を含みうる。生物学的試料は、腺組織に由来する細胞の集団を含んでもよく、例えば、試料は、男性被験体の前立腺に由来してよい。さらに、必要であれば、得られた体組織及び体液から細胞を精製し、次いで、生物学的試料として用いてよい。いくつかの実施形態では、当該試料は、組織試料、尿試料、尿沈渣試料、血液試料、唾液試料、精液試料、循環腫瘍細胞を含む試料、細胞外小胞、前立腺分泌エキソソームを含む試料、又は細胞株もしくはがん細胞株でありうる。
一の特定の実施形態では、生検又は切除試料が得られ、及び／又は用いられうる。当該試料は、細胞又は細胞溶解物を含みうる。
また、生物学的試料の内容物が濃縮工程に供されることも考えられる。例えば、試料は、特定の細胞型、例えば、前立腺細胞の細胞膜又は細胞小器官に特異的なリガンド、例えば、磁性粒子で機能化されたリガンドと接触されうる。その後、磁性粒子により濃縮された材料を、上記又は以下に記載されるように、検出及び分析工程に用いてよい。
さらに、細胞、例えば、腫瘍細胞は、流体又は液体試料、例えば、血液、尿等の濾過プロセスを介して濃縮されうる。当該濾過プロセスはまた、上記のように、リガンド特異的相互作用に基づく濃縮工程と組み合わせることができる。
用語「前立腺がん」とは、前立腺の細胞が変異して、制御不能状態で増殖し始めたときに生じる、男性生殖器系の前立腺のがんをいい、通常、前立腺がんは、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の上昇レベルに関連する。本発明の一実施形態では、用語「前立腺がん」とは、ＰＳＡレベルが４．０を超えるがんに関する。別の実施形態では、用語「ＰＳＡレベル」とは、ＰＳＡレベルが２．０を超えるがんに関する。用語「ＰＳＡレベル」とは、血中のＰＳＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）をいう。
用語「非進行性前立腺がん状態」は、個体の試料が「生化学的再発」及び／又は「臨床的再発」を示すパラメータ値を示さないことをいう。
用語「進行性前立腺がん状態」は、個体の試料が「生化学的再発」及び／又は「臨床的再発」を示すパラメータ値を示すことをいう。
用語「生化学的再発」は、一般に、試料中の前立腺がん細胞の存在を示す、増加したＰＳＡの再発性生物学的値をいう。しかしながら、また、当該存在の検出に用いうる、又は当該存在の疑義を生じさせる他のマーカーを用いうる。
用語「臨床的再発」とは、例えば、インビボイメージングを用いて測定される腫瘍細胞の存在を示す臨床的徴候の存在をいう。
本明細書中で用いられる用語「前立腺がんを予知する」とは、例えば、所定の期間中、治療中又は治療後の、診断された又は検出された前立腺がんの経過又は転帰の予測をいう。当該用語はまた、生存又は疾患からの回復の可能性の決定、並びに被験体の期待生存時間の予測をいう。予後は、具体的には、６ヶ月、１年、２年、３年、５年、１０年、又はその他の期間等、将来に至る期間の被験体の生存可能性の確立を含みうる。
ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、前立腺がん被験体の集団から導かれた回帰関数と組み合わされることが好ましい。
回帰分析は、独立変数のいずれかが変化し、他の独立変数が固定されているときに、従属変数（又は「基準変数」）の典型的な値がどのように変化するかを理解するのに役立つ。従属変数と独立変数の間の関係は回帰関数として把握され、独立変数値が付与される場合、従属変数を予測するのに用いることができる。従属変数は、例えば、手術後５年以内の生化学的再発等の二値変数でありうる。この場合、回帰は、独立変数のロジット関数に基づくロジスティック回帰であり、ここでは、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを含むか又はからなる。当該回帰関数により、例えば、手術後の５年生化学的再発リスクの改善予測が可能であろう。
本方法は、さらに、以下の：
－前記術前予後リスクスコアに基づく前記被験体の一次治療の提案工程を含む、ことが好ましく、ここで、前記一次治療は、（ｉ）少なくとも前立腺部分切除術； （ｉｉ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びそれらの併用から選択される積極的治療；並びに（ｉｉｉ）積極的サーベイランスからなる群から選択される。
－前記術前予後リスクスコアに基づく前記被験体の一次治療の提案工程を含む、ことが好ましく、ここで、前記一次治療は、（ｉ）少なくとも前立腺部分切除術； （ｉｉ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びそれらの併用から選択される積極的治療；並びに（ｉｉｉ）積極的サーベイランスからなる群から選択される。
様々な国内及び国際的なガイドラインでは、将来の疾患進行リスク及び平均余命に応じて、前立腺がん被験体に対して様々な治療法が推奨されている。例えば、一般に、非常に低リスク及び低リスクの前立腺がんの積極的サーベイランス（ＡＳ）が推奨されるが、高リスクのがんでは根治的前立腺切除術が適応とされる。しかしながら、既知の臨床的リスク記述子は、全ての患者の、疾患の範囲又は悪性度のいずれかを効果的に描出するものではない。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）の非常に低リスク及び低リスクのグループでは、初回治療後にがんが１０～２５％再発するリスクのある患者の集団が有意に多いことが明らかにされている。同様に、中間リスク群では、生化学的進行のリスクが低い亜集団が存在することが知られている。術前予後リスクスコアに基づいて被験体に対する一次治療を提案することにより、例えば、積極的サーベイランスｖｓ積極的介入（例えば、根治的前立腺全摘除術）を選択するか否かについて、前立腺がん患者の特定の亜集団に対してより良い推奨がなされる。
さらに、好ましくは、本発明は、以下の：
－ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン－α－１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択された１又はそれ以上の参照遺伝子による、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又は前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルの正規化工程を含む。ここで、前記術前予後リスクスコアは、前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される。
－ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン－α－１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択された１又はそれ以上の参照遺伝子による、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又は前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルの正規化工程を含む。ここで、前記術前予後リスクスコアは、前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される。
１又はそれ以上の参照遺伝子に関して遺伝子発現プロファイルを正規化することで、及び正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて術前予後リスクスコアを決定することで、術前予後リスクスコアの決定のばらつきを低減することができる。これにより、遺伝子発現プロファイルの実際の変動と測定プロセスによる変動とを区別することができる。この点に関し、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰは、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９遺伝子発現プロファイルを正規化する参照遺伝子として特に適することが見出されている。
遺伝子発現プロフィールは、１又はそれ以上のプライマー及び／又はプローブ及び／又はそれらの１又はそれ以上のセットを用いてｍＲＮＡ発現を検出して、決定することができる。さらに、遺伝子発現プロファイルは、増幅に基づく方法及び／又はマイクロアレイ分析及び／又はＲＮＡ配列決定により決定することができる。遺伝子発現プロファイルの決定としては，生物試料から抽出したＲＮＡに対してリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ｑＰＣＲ）を行うことがあげられる。他の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、ＲＮＡ配列決定、従来のＰＣＲ（例えば、ゲル電気泳動による終点分析を使用）、又はマルチプレックスＰＣＲで決定される。ＲＴ－ｑＰＣＲの場合、遺伝子発現プロファイルの決定としては、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９及び１又はそれ以上の参照遺伝子の各々の閾値サイクル（Ｃｔ）値の決定があげられる。ＰＣＲは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰから選択される参照遺伝子を測定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブを用いて行うことができる。
１又はそれ以上の参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰの少なくとも２つ、少なくとも３つ、又はすべてを含むのが好ましい。
ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９遺伝子発現プロファイルの正規化に追加して又は代替的に用いられうる他の参照遺伝子としては、以下の：ヒトアクチン、β、ｍＲＮＡ（ＡＣＴＢ）；ヒト６０Ｓ酸性リボソームリン酸化タンパク質Ｐ０ ｍＲＮＡ（ＲＰＬＰ０）；ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ指向）ポリペプチドＡ、２２０ｋＤａ（ＰＯＬＲ２Ａ）；β－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；及びアミノレブリン酸－デルタ－シンターゼ（ＡＬＡＳ－１）があげられる。
いくつかの好ましい実施形態では、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９用の正規化された遺伝子発現プロファイルは、適当な変換関数を用いて、所定の範囲の値、例えば、１～５の範囲に変換される。変換関数は、好ましくは、前立腺がん被験体の集団（有利には、回帰関数の導出に用いられるのと同じ集団でありうる）に由来する生物学的試料について、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９について、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１及びＴＢＰのすべてで正規化された遺伝子発現プロファイル等、対応する正規化された遺伝子発現プロファイルから導出される。一の好ましい実施形態では、変換関数は、正規化された遺伝子発現プロファイルを所定の範囲の値に変換する線形変換でありうる。当該変換は、例えば、前立腺がん被験体の集団の生物学的試料のＰＤＥ４Ｄ７（又はＤＨＸ９）について正規化された遺伝子発現プロファイル値の頻度分布を考慮して、及び頻度分布を所望の範囲に変換する変換を決定して、決定することができる。当該変換関数を利用すると、遺伝子発現プロファイルは、小さな正の値の範囲等、ユーザにとって直感的な方法で表現することができる。これは、例えば組織病理学的悪性度分類（Ｇｌｅａｓｏｎ）又はマルチパラメトリックＭＲＩ放射線スコアリング（ＰＩＲＡＤＳ）等、臨床ルーチンで用いられる他のカテゴリーと類似する。
一の特定の実施形態では、変換された正規化された遺伝子発現プロファイルは、以下の：
ＴＮＧＥＰ＝（（（ＧＥＮＥ＿ｎｏｒｍ＋Ａ）＊Ｂ）＋１） （１）
（式中、「ＴＮＧＥＰ」は変換された正規化された遺伝子発現プロファイルであり、「ＧＥＮＥ＿ｎｏｒｍ」は正規化されたＰＤＥ４Ｄ７又はＤＨＸ９遺伝子発現プロファイル値であり、Ａ及びＢは変数であり、「ＧＥＮＥ＿ｎｏｒｍ」を所望の値範囲にマッピングするために適当に選択される）のように決定される。
ＴＮＧＥＰ＝（（（ＧＥＮＥ＿ｎｏｒｍ＋Ａ）＊Ｂ）＋１） （１）
（式中、「ＴＮＧＥＰ」は変換された正規化された遺伝子発現プロファイルであり、「ＧＥＮＥ＿ｎｏｒｍ」は正規化されたＰＤＥ４Ｄ７又はＤＨＸ９遺伝子発現プロファイル値であり、Ａ及びＢは変数であり、「ＧＥＮＥ＿ｎｏｒｍ」を所望の値範囲にマッピングするために適当に選択される）のように決定される。
ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又はＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルの決定は、生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対するＲＴ－ｑＰＣＲの実施を含み、ここで、Ｃｑ値は、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９、及び１又はそれ以上の参照遺伝子各々について決定され、術前リスクスコアの決定は、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９のＣｑ値を、１又はそれ以上の参照遺伝子の各々についてのＣｑ値を用いて正規化し、及び当該正規化されたＣｑ値に基づいて術前リスクスコアを計算することを含むことが特に好ましい。
例えば、ＰＤＥ４Ｄ７の正規化されたＣｑ値は、以下の：
Ｎ（ＣｑＰＤＥ４Ｄ７）＝Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）-（ＣｑＰＤＥ４Ｄ７） （２）
（式中、Ｎ（ＣｑＰＤＥ４Ｄ７）はＰＤＥ４Ｄ７の正規化された遺伝子発現プロファイル値（定量サイクル、Ｃｑ）、Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）は１又はそれ以上の参照遺伝子のＰＣＲ Ｃｑ値の算出平均であり、ＣｑＰＤＥ４Ｄ７はＰＤＥ４Ｄ７のＰＣＲ Ｃｑ値である）
を適用して、生成されうる。
同様に、ＤＨＸ９についての正規化されたＣｑ値は、以下の：
Ｎ（Ｃｑ ＤＨＸ９）＝Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）-（ＣｑＤＨＸ９） （３）
（式中、Ｎ（ＣｑＤＨＸ９）はＤＨＸ９の正規化された遺伝子発現プロファイル値（定量サイクル、Ｃｑ）、Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）は１又はそれ以上の参照遺伝子のＰＣＲ Ｃｑ値の算出平均、ＣｑＤＨＸ９はＤＨＸ９のＰＣＲ Ｃｑ値である）
を適用することにより生成されうる。
Ｎ（ＣｑＰＤＥ４Ｄ７）＝Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）-（ＣｑＰＤＥ４Ｄ７） （２）
（式中、Ｎ（ＣｑＰＤＥ４Ｄ７）はＰＤＥ４Ｄ７の正規化された遺伝子発現プロファイル値（定量サイクル、Ｃｑ）、Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）は１又はそれ以上の参照遺伝子のＰＣＲ Ｃｑ値の算出平均であり、ＣｑＰＤＥ４Ｄ７はＰＤＥ４Ｄ７のＰＣＲ Ｃｑ値である）
を適用して、生成されうる。
同様に、ＤＨＸ９についての正規化されたＣｑ値は、以下の：
Ｎ（Ｃｑ ＤＨＸ９）＝Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）-（ＣｑＤＨＸ９） （３）
（式中、Ｎ（ＣｑＤＨＸ９）はＤＨＸ９の正規化された遺伝子発現プロファイル値（定量サイクル、Ｃｑ）、Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ＿ｇｅｎｅｓ）は１又はそれ以上の参照遺伝子のＰＣＲ Ｃｑ値の算出平均、ＣｑＤＨＸ９はＤＨＸ９のＰＣＲ Ｃｑ値である）
を適用することにより生成されうる。
本発明のさらなる態様では、以下の：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；
前記被験体から得られた同一又は別の生物学的試料中のＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；及び
場合によっては、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン－α－１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される１又はそれ以上の参照遺伝子についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；
を含む、診断キットが提供され、
ここで、前記診断キットは、さらに、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づいて術前予後リスクスコアを計算するための命令を含み、前記命令は、コンピュータにより実行される場合、コンピュータプログラム製品に格納されて、以下の：
－前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく、被験体の術前予後リスクスコアの決定工程、を含む方法を実行し、ここで、場合によっては、前記方法は、以下の：
－前記１又はそれ以上の参照遺伝子による、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又はＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルの正規化工程、を含み、ここで、場合によっては、前記術前予後リスクスコアは、前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される。
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；
前記被験体から得られた同一又は別の生物学的試料中のＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；及び
場合によっては、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン－α－１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される１又はそれ以上の参照遺伝子についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；
を含む、診断キットが提供され、
ここで、前記診断キットは、さらに、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づいて術前予後リスクスコアを計算するための命令を含み、前記命令は、コンピュータにより実行される場合、コンピュータプログラム製品に格納されて、以下の：
－前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく、被験体の術前予後リスクスコアの決定工程、を含む方法を実行し、ここで、場合によっては、前記方法は、以下の：
－前記１又はそれ以上の参照遺伝子による、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又はＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルの正規化工程、を含み、ここで、場合によっては、前記術前予後リスクスコアは、前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される。
術前予後リスクスコアを計算する命令は、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを、前立腺がん被験体の集団から導かれた回帰関数と組み合わせる命令を含むことが好ましい。
本発明のさらなる態様では、前立腺がん被験体の手術前リスク層別化の方法における上記診断キットの使用が提示される。
本発明のさらなる態様では、前立腺がん被験体の術前リスク層別化におけるホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイル及びＤＥｘＨボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルの使用が提示され、以下の：
－被験体から得られた生物学的試料中のＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルを決定すること、
－前記被験体から得られた前記生物学的試料と同一又は別の生物学的試料中のＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを決定すること、及び
－前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づいて、被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、を含む。
－被験体から得られた生物学的試料中のＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルを決定すること、
－前記被験体から得られた前記生物学的試料と同一又は別の生物学的試料中のＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを決定すること、及び
－前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づいて、被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、を含む。
ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、前立腺がん被験体の集団から導かれた回帰関数と組み合わされることが好ましい。
本発明の他の態様では、コンピュータによりプログラムが実行される場合、コンピュータに以下の：
－ホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイル及びＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルに基づいて、前立腺がん被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、を含む、方法を実行させる命令を含むコンピュータプログラムが提供され、
ここで、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルは、被験体から得られた生物学的試料中で決定されており、かつ、前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、被験体から得られた前記生物学的試料と同一又は別の生物学的試料中で決定されていた。
－ホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイル及びＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルに基づいて、前立腺がん被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、を含む、方法を実行させる命令を含むコンピュータプログラムが提供され、
ここで、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルは、被験体から得られた生物学的試料中で決定されており、かつ、前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、被験体から得られた前記生物学的試料と同一又は別の生物学的試料中で決定されていた。
ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、前立腺がん被験体の集団から導かれた回帰関数と組み合わされることが好ましい。
さらなる好ましい実施形態では、被験体に対する手術後の予後リスクスコアは、術前予後リスクスコア及び手術後の臨床リスクスコアＣＡＰＲＡ－Ｓに基づいて決定される。
当該術前予後リスクスコア及び術後の臨床リスクスコアＣＡＰＲＡ－Ｓは、前立腺がん被験体の集団から得られた回帰関数と組み合わされることが好ましい。
これらのさらなる好ましい実施形態は、請求項１記載の方法、請求項７記載の診断キット、請求項９記載の診断キットの使用、請求項１０記載の遺伝子発現プロファイルの使用、及び請求項１２記載のコンピュータプログラムにより実現することができる。
請求項１に記載の方法、請求項７に記載の診断キット、請求項９に記載の診断キット、請求項１０に記載の遺伝子発現プロファイル、及び請求項１２に記載のコンピュータプログラムは、特に、従属請求項に定義されるように、類似及び／又は同一の好ましい実施形態を有することを理解されたい。
また、本発明の好ましい実施形態は、従属請求項のいなかる組み合わせであってもよく、又は、上記の実施形態と、各々の独立クレームとの組み合わせであってよいことは理解される。
本発明のこれら及び他の態様は、以下に記載する実施形態から明らかになり、説明される。
〔術前のリスク層別化の概要〕
図１は、前立腺がん被験体の手術前リスク層別化の方法の実施形態のフローチャートを概略的及び例示的に示す。
この方法は工程Ｓ１００で開始する。
工程Ｓ１０２では、１又はそれ以上の生物学的試料は、前立腺がんと診断された第１セットの患者（被験体）から各々得られる。好ましくは、前立腺がんのモニタリングは、当該前立腺がん患者から、生物学的試料を得た後、少なくとも１年、少なくとも２年、又は約５年の期間で実施される。
図１は、前立腺がん被験体の手術前リスク層別化の方法の実施形態のフローチャートを概略的及び例示的に示す。
この方法は工程Ｓ１００で開始する。
工程Ｓ１０２では、１又はそれ以上の生物学的試料は、前立腺がんと診断された第１セットの患者（被験体）から各々得られる。好ましくは、前立腺がんのモニタリングは、当該前立腺がん患者から、生物学的試料を得た後、少なくとも１年、少なくとも２年、又は約５年の期間で実施される。
工程Ｓ１０４では、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、例えば、各生物学的試料から抽出されたＲＮＡ上でＲＴ－ｑＰＣＲ（リアルタイム定量ＰＣＲ）を実施して、第１セットの患者の各々から得られた同一又は異なる生物学的試料について得られる。例示的な遺伝子発現プロファイルとしては、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の発現レベル（例えば、値）があげられるが、これは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及び／又はＴＢＰ等の参照遺伝子セットの各セットの値を用いて正規化することができる。一の実施形態では、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイル値は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰからなる群から選択される１又はそれ以上の参照遺伝子、例えば、これらの参照遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は好ましくは全てからなる群から選択される１又はそれ以上の参照遺伝子で正規化される。
工程Ｓ１０６では、ＰＤＥ４Ｄ７及び第１セットの患者について得られた生物学的試料の少なくとも一部について得られたＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイル及びモニタリングから得られた各結果に基づいて、術前予後リスクスコアを割り当てる回帰関数が決定される。一の可能な実施形態では、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９の正規化された遺伝子発現プロファイルは、まず、適当な変換関数を用いて、上記の１～５の範囲等の所定の範囲の値に変換される。上記のように、当該変換は、前立腺がん被験体の集団（ここでは、第１セットの患者）の生物学的試料について、例えばＰＤＥ４Ｄ７（又はＤＨＸ９）の正規化された遺伝子発現プロファイル値の度数分布を考慮し、及び頻度分布を所望の範囲に変換する変換を決定して、決定することができる。一の特定の実施形態では、正規化された変換遺伝子発現プロファイル値は、上記式（１）で特定されるように決定される。
工程Ｓ１０８では、１又はそれ以上の生物学的試料が、患者（被験体又は個体）から得られる。患者は、新規の患者であってよく、又は第１セットの一人であってよい。
工程Ｓ１１０では、例えば、生物学的試料上でＰＣＲを実施して、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロフィールが得られる。一の実施形態では、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイル値は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰからなる群から選択される１又はそれ以上の参照遺伝子、例えば、当該参照遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は好ましくは全てからなる群から選択される１又はそれ以上の参照遺伝子で正規化される。これは、工程Ｓ１０４と実質的に同じである。さらに、ＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９の正規化された遺伝子発現プロファイルは、工程Ｓ１０６に関して記載されるように、予め変換することができる。
工程Ｓ１０４及びＳ１１０で追加的又は代替的に用いられうる他の参照遺伝子としては、ヒトアクチン、ベータ、ｍＲＮＡ（ＡＣＴＢ）；ヒト６０Ｓ酸性リボソームホスホプロテインＰ０ ｍＲＮＡ（ＲＰＬＰ０）；ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ指向）ポリペプチドＡ、２２０ｋＤａ（ＰＯＬＲ２Ａ）；ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；及びアミノレブリン酸デルタ－シンターゼ（ＡＬＡＳ－１）があげられる。
工程Ｓ１１２では、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づいて、回帰関数を用いて、患者の術前予後リスクスコアを決定する。これについては、後述する。手術前の予後スコアをユーザにとって直感的なものにするため、その値が１～５の範囲のような所定の値範囲に入るように決定してよい。これは、回帰関数自体を用いて既に達成されるか、又は回帰関数の出力値を所望の値の範囲に変換する適当な後続変換により達成されうる。ここでも、組織病理学的悪性度分類（Ｇｌｅａｓｏｎ）や多パラメトリックＭＲＩ放射線スコアリング（ＰＩＲＡＤＳ）等、臨床ルーチンで用いられる他のカテゴリーと同様である。
Ｓ１１４では、術前予後リスクスコアに基づいて、例えば、患者又は患者の保護者、医師、又は他の医療従事者に対して治療勧告が提供されうる。この目的のため、術前予後リスクスコアは、術前予後リスクスコアの価値に基づいて、予め定義されたリスクグループのセットの１つに分類されうる。治療に関する推奨事項を提供することとしては、ａ）割り当てられたリスク群に基づいて、少なくとも２つのリスク群が異なる治療法と関連する患者に対する治療法を提案すること、ｂ）前立腺手術前後の患者の疾患進行リスクの予測値を算出すること、ｃ）前立腺手術前後の患者の治療反応予測値を算出すること、のうち１又はそれ以上があげられる。例示的な治療法としては、少なくとも前立腺部分切除術、放射線治療、化学療法、及びそれらの組み合わせから選択される能動的治療、ならびに観察のみ、すなわち、前立腺切除術又は能動的治療を実施しない（すなわち、能動的サーベイランス）ことがあげられる。
この方法は、Ｓ１１６で終了する。
この方法は、Ｓ１１６で終了する。
各リスク群は、各治療提案に関連する可能性があり、その悪性度は異なる。提案される治療法は各々、そのリスク群に割り付けられた第１セットの患者の結果に基づいてよく、前立腺がん発生の臨床リスク閾値を超えない最も積極的でない治療法を提供すると予測される治療法である。場合によっては、グリソンスコア、ＮＣＣＮリスクカテゴリー、術前ＣＡＰＲＡスコア等の他のリスクプロファイリング法よりも積極的でない治療法が提案されたリスク群に新たな患者を割り付けることができる。
一の実施形態では、工程Ｓ１０４及びＳ１１０での遺伝子発現プロファイルは、１又はそれ以上のプライマー及び／又はプローブ及び／又はそれらの１又はそれ以上のセットを用いてｍＲＮＡ発現を検出して、決定される。
ＰＤＥ４Ｄ７、ＤＨＸ９、及びそれらの転写産物ＩＤ（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）及びプライマー対及びプローブの対応するアミノ酸配列を含む１又はそれ以上の参照遺伝子の詳細な説明を表１に示す。この表はまた、各遺伝子について、センスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびにアンプリコンに特異的に結合するプローブ配列を示す。
表１：例示的プライマー及びプローブ核酸配列
工程Ｓ１０４及びＳ１１０でのＰＤＥ４Ｄ７及び／又はＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いる代わりに、他の手段、例えば、標準的な方法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によりＲＮＡ次世代配列決定（ＮＧＳ ＲＮＡｓｅｑ）を実施して、決定することができる。この場合、所定の値の範囲への記載された変換は、ＮＧＳ ＲＮＡｓｅｑにより提供される遺伝子発現プロファイル上で行うこともできる。
術前の患者リスク評価におけるＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の予後的検出力を探索するため、疾患再発との相関を検討した。
ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく組み合わせモデルを手術コホートで開発し、このモデルを異なる縦断的臨床転帰について検証した。結果は、ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを改善された術前予後リスクスコアにおいて組み合わせることで、患者層別化がより良好になることができ、一次治療の決定を最適化しうることを示す。
〔患者コホート及び試料〕
表２に示す人口統計学的特性を有する根治的前立腺全摘除術（ＲＰ）患者コホートを採用した。ＲＰ患者コホートについて、ドイツの単一の大規模臨床センターで２０００～２００４年に連続的に手術を受けた患者５７５例から、切除された前立腺の代表的な腫瘍領域から小さな生検パンチ（約１ｍｍ×２ｍｍ）で組織を採取した。
表２に示す人口統計学的特性を有する根治的前立腺全摘除術（ＲＰ）患者コホートを採用した。ＲＰ患者コホートについて、ドイツの単一の大規模臨床センターで２０００～２００４年に連続的に手術を受けた患者５７５例から、切除された前立腺の代表的な腫瘍領域から小さな生検パンチ（約１ｍｍ×２ｍｍ）で組織を採取した。
表２：根治的前立腺全摘除術（ＲＰ）患者コホートの人口統計学的特性
患者の年齢、術前ＰＳＡ値、生検における腫瘍の比、前立腺体積、ＰＳＡ濃度については、コホートの最小値と最大値を示し、中央値をカッコ内に示す。ＣＡＰＲＡ－Ｓのリスクカテゴリーは、患者数及び各リスク群の比率を示す。術後病理は、病理学的グリソンスコア及びグリソングレード群、病理学的病期、前立腺切除術後の外科的切除断端の状態、精嚢及び骨盤リンパ節への腫瘍浸潤の状態（患者数及び比率）で表す。この点に関し、被膜外への進展は、主要パラメータとして提供されたものではなく、病理学的病期ｐＴ３ａに由来することに留意されたい。追跡調査では、全患者について、術後数カ月の平均及び中央値の追跡調査期間が実証された。転帰カテゴリーは、累積５年及び１０年生化学的再発（ＢＣＲ）及び転移（ＣＲ）に対する臨床的再発を示す。治療カテゴリーには、手術後に救助放射線療法（ＳＲＴ）又は救助アンドロゲン遮断療法（ＳＡＤＴ）を開始してから５年及び１０年の累積値が記載されている。死亡率は、前立腺がん特異的生存率（ＰＣＳＳ）及び全生存率（ＯＳ）として示す。総転帰について、５年後又は１０年後に各々転帰を経験した男性の数を、男性の総数に対する比率で示す。ここでは、事象の比率を括弧内に示す。
〔検査方法〕
ＲＴ－ｑＰＣＲ（定量的リアルタイムＰＣＲ）用のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ、ＲＮＡ抽出、並びに統計分析からの試料を含めるための品質管理及び手順を含む全ての用いた実験室方法は、Ｂｏｔｔｃｈｅｒ Ｒ．らに既載の通りであり、又は、ＤＨＸ９の場合は、標準的な方法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によりＲＮＡ次世代配列決定（ＮＧＳ ＲＮＡｓｅｑ）に基づいた。関心対象の遺伝子及び参照遺伝子の測定のＲＴ－ｑＰＣＲで用いられるプライマー及びプローブも、表１に示す。ＮＧＳ ＲＮＡｓｅｑの場合、得られたＦａｓｔＱファイルをヒトゲノムにアラインさせて、標準的な方法により処理した。各遺伝子について、得られたＴＰＭ（転写産物／キロベース百万；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎａ－ｓｅｑｂｌｏｇ．ｃｏｍ／ｒｐｋｍ－ｆｐｋｍ－ａｎｄ－ｔｐｍ－ｃｌｅａｒｌｙ－ｅｘｐｌａｉｎｅｄ（２０１８年１０月７日検索）参照）の形での遺伝子発現値である。
ＲＴ－ｑＰＣＲ（定量的リアルタイムＰＣＲ）用のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブ、ＲＮＡ抽出、並びに統計分析からの試料を含めるための品質管理及び手順を含む全ての用いた実験室方法は、Ｂｏｔｔｃｈｅｒ Ｒ．らに既載の通りであり、又は、ＤＨＸ９の場合は、標準的な方法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）によりＲＮＡ次世代配列決定（ＮＧＳ ＲＮＡｓｅｑ）に基づいた。関心対象の遺伝子及び参照遺伝子の測定のＲＴ－ｑＰＣＲで用いられるプライマー及びプローブも、表１に示す。ＮＧＳ ＲＮＡｓｅｑの場合、得られたＦａｓｔＱファイルをヒトゲノムにアラインさせて、標準的な方法により処理した。各遺伝子について、得られたＴＰＭ（転写産物／キロベース百万；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｎａ－ｓｅｑｂｌｏｇ．ｃｏｍ／ｒｐｋｍ－ｆｐｋｍ－ａｎｄ－ｔｐｍ－ｃｌｅａｒｌｙ－ｅｘｐｌａｉｎｅｄ（２０１８年１０月７日検索）参照）の形での遺伝子発現値である。
〔結果〕
ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９発現のロジスティック回帰モデル
ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９の発現値をロジスティック回帰モデルで用いた組み合わせモデルを作成した。以下の表１に示すように、従属変数は、完全な５年の転帰を有するＲＰ患者コホートの４８１例（１６９件；３５．１４％）のサブコホートにおいて、前立腺がん手術後の５年生化学的再発（ＢＣＲ）として採用された。ｌｏｇｉｔ（ｐ）回帰関数をｐ＝１／（１＋ｅ＾（－ｌｏｇｉｔ（ｐ）））に変換し、個々の患者が術後５年以内に生化学的再発を経験する確率ｐを算出した。表２～６は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の発現値を組み合わせるロジスティック回帰モデリングの結果を示す。表１は、コホートサイズ（＃４８１）及び５年生化学的再発（ＢＣＲ）を伴う陽性例数と５年ＢＣＲがない陰性例数の観点から、ロジスティック回帰モデルの入力を示す。表２は、モデル適合に関する情報を提供し、表３は、回帰モデルの係数（又は重み）と各々の統計量の概要を示す。表４は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９のオッズ比の概要を示し、表５及び６は、「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９」回帰モデルの分類表及びＲＯＣ曲線分析のデータの概要を示す。
ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９発現のロジスティック回帰モデル
ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９の発現値をロジスティック回帰モデルで用いた組み合わせモデルを作成した。以下の表１に示すように、従属変数は、完全な５年の転帰を有するＲＰ患者コホートの４８１例（１６９件；３５．１４％）のサブコホートにおいて、前立腺がん手術後の５年生化学的再発（ＢＣＲ）として採用された。ｌｏｇｉｔ（ｐ）回帰関数をｐ＝１／（１＋ｅ＾（－ｌｏｇｉｔ（ｐ）））に変換し、個々の患者が術後５年以内に生化学的再発を経験する確率ｐを算出した。表２～６は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９の発現値を組み合わせるロジスティック回帰モデリングの結果を示す。表１は、コホートサイズ（＃４８１）及び５年生化学的再発（ＢＣＲ）を伴う陽性例数と５年ＢＣＲがない陰性例数の観点から、ロジスティック回帰モデルの入力を示す。表２は、モデル適合に関する情報を提供し、表３は、回帰モデルの係数（又は重み）と各々の統計量の概要を示す。表４は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９のオッズ比の概要を示し、表５及び６は、「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９」回帰モデルの分類表及びＲＯＣ曲線分析のデータの概要を示す。
表１：ロジスティック回帰モデルの入力
表２：全体的なモデル適合
表３：係数と標準誤差
表４：奇数比及び９５％信頼区間
表５：分類表（カットオフ値ｐ＝０．５）
表６： ＲＯＣ曲線分析
〔異なる長期臨床転帰に関する併用モデルの検証〕
併用モデルは、生化学的再発（ＢＣＲ）、臨床的再発（局所転移及び／又は遠隔転移への進行）（ＣＲ）、及び前立腺がん特異的死亡等、術後の様々な臨床的に関連する終点予測に検証された。併用モデルの予後的パワーを、同様の様々な臨床的に関連する終点について、ＰＤＥ４Ｄ７又はＤＨＸ９のみの予後的パワーと比較した。
併用モデルは、生化学的再発（ＢＣＲ）、臨床的再発（局所転移及び／又は遠隔転移への進行）（ＣＲ）、及び前立腺がん特異的死亡等、術後の様々な臨床的に関連する終点予測に検証された。併用モデルの予後的パワーを、同様の様々な臨床的に関連する終点について、ＰＤＥ４Ｄ７又はＤＨＸ９のみの予後的パワーと比較した。
図２は、ＲＰ患者コホートのサブコホート（＃４８１）における前立腺がん手術後の５年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ曲線分析の結果を示す（表７も参照）。表８に示したように、５年間のＡＵＣ（曲線下面積）は、ＰＤＥ４Ｄ７単独では０．６５９、ＤＨＸ９単独では０．６２４、併用モデルでは０．７１３と算出された（図２及び表８では「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９」として示した）。標準誤差は、各々０．０２５４（ＰＤＥ４Ｄ７）、０．０２８０（ＤＨＸ９）及び０．０２４２（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９）、９５％信頼区間は、各々０．６１５～０．７０２（ＰＤＥ４Ｄ７）、０．５７９～０．６６７（ＤＨＸ９）及び０．６７０～０．７５３（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９）であった。表９は、ＲＯＣ曲線の対比較を示す。ＰＤＥ４Ｄ７単独及び併用モデルＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９のＡＵＣは有意に異なることが示された（ｐ＝０．００２２）。ＤＨＸ９単独及び併用モデルＰＤＥ４Ｄ７＆ＤＨＸ９（ｐ＝０．０００８）のＡＵＣは、わずかに有意性が高かったものの、同様の結果が得られた。
表７：サブコホート
表８：ＲＯＣ曲線分析
表９：ＲＯＣ曲線のペアワイズ比較
表１０：サブコホート
表１１：ＲＯＣ曲線分析
表１２：ＲＯＣ曲線の対比較
図４は、ＲＰ患者コホートのサブコホート（＃３０２）における前立腺がん手術後の１０年間の前立腺がん特異的死亡のＲＯＣ曲線分析の結果を示す（表１３も参照）。表１４に示したように、１０年間のＡＵＣ（曲線下面積）は、ＰＤＥ４Ｄ７単独では０．７２９、ＤＨＸ９単独では０．６２２、併用モデルでは０．７５４と算出された（図４及び表１４では「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９」として示した）。標準誤差は、各々０．０５８８（ＰＤＥ４Ｄ７）、０．０５９３（ＤＨＸ９）及び０．０４８１（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９）、９５％信頼区間は、各々０．６７６～０．７７９（ＰＤＥ４Ｄ７）、０．５６４～０．６７６（ＤＨＸ９）及び０．７０２～０．８０２（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９）であった。表１５は、ＲＯＣ曲線の対比較を示す。ＤＨＸ９単独及び併用モデルＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９のＡＵＣは有意に異なることが示された（ｐ＝０．０４０３）。
表１３：サブコホート
表１４：ＲＯＣ曲線分析
表１５：ＲＯＣ曲線の対比較
提供された結果により、ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９遺伝子発現値の組み合わせロジスティック回帰モデルを用いて術後５年目の生化学的再発を予測すると、予後マーカーとしてＰＤＥ４Ｄ７単独を用いた場合と比較して、ＲＯＣ分析における曲線下面積（ＡＵＣ）が２．５％（終点として前立腺がん特異的死亡の場合）と８％（終点として臨床的再発の場合）の間で改善されることを示す。
〔独立したデータセットにおける前立腺がん手術後の転移を予測する併用モデルの独立した試験〕
図５は、独立したデータセット（Taylor B.S. et al., “Integrative genomic profiling of human prostate cancer”, Cancer Cell, Vol. 18, No. 1, pages 11 to 22, 2010によるデータ）における前立腺がん手術後の転移を予測する併用モデル（表１６の「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９」として示される）の独立した試験を示す。表１６に示したように、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９について、転移クラスＡＵＣ（曲線下面積）は０．７３６と算出された。標準誤差は０．０７７７、９５％信頼区間は０．６５１～０．８０９であった。
図５は、独立したデータセット（Taylor B.S. et al., “Integrative genomic profiling of human prostate cancer”, Cancer Cell, Vol. 18, No. 1, pages 11 to 22, 2010によるデータ）における前立腺がん手術後の転移を予測する併用モデル（表１６の「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９」として示される）の独立した試験を示す。表１６に示したように、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９について、転移クラスＡＵＣ（曲線下面積）は０．７３６と算出された。標準誤差は０．０７７７、９５％信頼区間は０．６５１～０．８０９であった。
表１６：独立データセット
表１７：ＲＯＣ曲線分析
表１８：Ｙｏｕｄｅｎ指標
〔術後転移を予測するＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９併用モデルと術後臨床リスクスコアＣＡＰＲＡ－Ｓとのロジスティック回帰モデル〕
ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９の併用モデル及び術後の臨床リスクスコアＣＡＰＲＡ－Ｓを、追加のロジスティック回帰モデル（以下に「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９とＣＡＰＲＡ－Ｓ」と記載）の作成に用いた。以下の表１９に示すように、従属変数を、Ｔａｙｌｅｒ Ｂ．Ｓ．ら（上記参照）の独立データにおいて、前立腺がん手術後の転移クラスとして採用した。ｌｏｇｉｔ（ｐ）回帰関数をｐ＝１／（１＋ｅ＾（－ｌｏｇｉｔ（ｐ）））に変換し、個々の患者が術後に転移を経験する確率ｐを計算した。表２０～２６は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９とＣＡＰＲＡ－Ｓスコアを組み合わせるロジスティック回帰モデルの結果を示す。表１９には、ロジスティック回帰モデルの入力値を、試料サイズ（＃１２９）、転移陽性例数、転移陰性例数で示した。表２０は、モデル適合に関する情報を提供し、表２１は、回帰モデルの係数（又は重み）の概要を、各々の統計量と共に示す。表２２は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９のオッズ比とＣＡＰＲＡ－Ｓスコアの概要を示し、表２３及び２４は、回帰モデルの較正試験の結果を示す（Ｈｏｓｍｅｒ＆Ｌｅｍｅｓｈｏｗ試験による）。最後に、表２５及び２６は、「ＰＤＥ４Ｄ７＆ＤＨＸ９＆ＣＡＰＲＡ－Ｓ」回帰モデルの分類表及びＲＯＣ曲線分析のデータの概要を示す。
ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９の併用モデル及び術後の臨床リスクスコアＣＡＰＲＡ－Ｓを、追加のロジスティック回帰モデル（以下に「ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９とＣＡＰＲＡ－Ｓ」と記載）の作成に用いた。以下の表１９に示すように、従属変数を、Ｔａｙｌｅｒ Ｂ．Ｓ．ら（上記参照）の独立データにおいて、前立腺がん手術後の転移クラスとして採用した。ｌｏｇｉｔ（ｐ）回帰関数をｐ＝１／（１＋ｅ＾（－ｌｏｇｉｔ（ｐ）））に変換し、個々の患者が術後に転移を経験する確率ｐを計算した。表２０～２６は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９とＣＡＰＲＡ－Ｓスコアを組み合わせるロジスティック回帰モデルの結果を示す。表１９には、ロジスティック回帰モデルの入力値を、試料サイズ（＃１２９）、転移陽性例数、転移陰性例数で示した。表２０は、モデル適合に関する情報を提供し、表２１は、回帰モデルの係数（又は重み）の概要を、各々の統計量と共に示す。表２２は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９のオッズ比とＣＡＰＲＡ－Ｓスコアの概要を示し、表２３及び２４は、回帰モデルの較正試験の結果を示す（Ｈｏｓｍｅｒ＆Ｌｅｍｅｓｈｏｗ試験による）。最後に、表２５及び２６は、「ＰＤＥ４Ｄ７＆ＤＨＸ９＆ＣＡＰＲＡ－Ｓ」回帰モデルの分類表及びＲＯＣ曲線分析のデータの概要を示す。
表１９：ロジスティック回帰モデルの入力
表２０：全体的なモデル適合
表２１：係数と標準誤差
表２２：オッズ比及び９５％信頼区間
表２３：Ｈｏｓｍｅｒ ＆ Ｌｅｍｅｓｈｏｗ試験
表２４：Ｈｏｓｍｅｒ ＆ Ｌｅｍｅｓｈｏｗ試験の偶発事象表
表２５：分類表（カットオフ値ｐ＝０．５）
表２６：ＲＯＣ曲線分析
図６は、前立腺がん手術後の転移を予測するＰＤＥ４Ｄ７＆ＤＨＸ９及びＰＤＥ４Ｄ７＆ＤＨＸ９＆ＣＡＰＲＡ－Ｓ併用モデルのＲＯＣ分析を示す（Taylor B.S. et al., “Integrative genomic profiling of human prostate cancer”, Cancer Cell, Vol. 18, No. 1, pages 11 to 22, 2010によるデータ）。表２８に示したように、転移クラスＡＵＣ（曲線下面積）は、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９単独では０．７３６、ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９及びＣＡＰＲＡ－Ｓでは０．８４０と算出された。標準誤差は各々０．０７７７（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９）及び０．０６３６（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９及びＣＡＰＲＡ－Ｓ）、９５％信頼区間は各々０．６５１～０．８０９（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９）及び０．７６５～０．８９９（ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９及びＣＡＰＲＡ－Ｓ）であった。表２９は、ＲＯＣ曲線の対比較を示す。ＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９単独のＡＵＣ、並びに併用モデルＰＤＥ４Ｄ７及びＤＨＸ９及びＣＡＰＲＡ－ＳのＡＵＣは、０，１０４（又は１０，４％）のＡＵＣの差により有意差があることが明らかに検証された（ｐ＝０．０３２３）。
表２７：独立データセット
表２８：ＲＯＣ曲線分析
表２９：ＲＯＣ曲線の対比較
〔考察〕
原発性限局性前立腺がんの治療法の決定は、主に将来の疾患進行リスクと平均余命の組み合わせによる。提供されたデータから、ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９の併用を術前リスクスコアに用いると、ＰＤＥ４Ｄ７を予後マーカーとして単独で用いるよりも価値が高まることが示される。このように、ＤＨＸ９は、治療法の意思決定を支援するがん特異的生存の予測及び、術後の生化学的再発又は転移への臨床的再発への疾患特異的転帰に関する臨床予測モデルにおけるＰＤＥ４Ｄ７への予後的価値を付加しうる。
原発性限局性前立腺がんの治療法の決定は、主に将来の疾患進行リスクと平均余命の組み合わせによる。提供されたデータから、ＰＤＥ４Ｄ７とＤＨＸ９の併用を術前リスクスコアに用いると、ＰＤＥ４Ｄ７を予後マーカーとして単独で用いるよりも価値が高まることが示される。このように、ＤＨＸ９は、治療法の意思決定を支援するがん特異的生存の予測及び、術後の生化学的再発又は転移への臨床的再発への疾患特異的転帰に関する臨床予測モデルにおけるＰＤＥ４Ｄ７への予後的価値を付加しうる。
開示された具現化に対する他の変形例は、図面、開示、及び添付の請求の範囲の研究から、請求の範囲に記載された発明を実施する際に当業者により理解され、実施されうる。
クレームにおける、語「含む」は、他の要素又は工程を除外せず、冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、複数を除外しない。
図１に示す方法の１又はそれ以上の工程は、コンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラム製品内に実装することができる。コンピュータプログラム製品は、ディスク、ハードドライブ等の、制御プログラムが記録される（記憶される）非一時的コンピュータ読取可能な記録媒体を含むことができる。非一時的コンピュータ読取り可能媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、又は他のいかなる磁気記憶媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、又は他のいかなる光学媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ－ＥＰＲＯＭ、又は他のメモリチップ又はカートリッジ、又はコンピュータが読み出して用いることができる他のいかなる非一時的媒体もがあげられる。
あるいは、本方法の１又はそれ以上の工程は、伝送可能な搬送波等の一時的媒体に実装することができ、この伝送可能な搬送波において、制御プログラムは、例えば無線波及び赤外線データ通信の間に生成されるような、音波又は光波等の伝送媒体を使用するデータ信号として具現化される。
例示的な方法は、１又はそれ以上の汎用コンピュータ、専用コンピュータ、プログラムされたマイクロプロセッサ又はマイクロコントローラ及び周辺集積回路素子、ＡＳＩＣ又は他の集積回路、デジタル信号プロセッサ、個別素子回路等のハードワイヤード電子又は論理回路、ＰＬＤ、ＰＬＡ、ＦＰＧＡ、グラフィカルカードＣＰＵ、又はＰＡＬ等のプログラマブル論理デバイスに実装することができる。一般に、図１に示されたフローチャートを実行することができる有限状態マシンを実行することができるいかなる装置を用いて、前立腺がん患者における治療選択のリスク層別化方法の１又はそれ以上の工程を実行することができる。理解されるように、本方法の工程はすべてコンピュータで実施することができるが、いくつかの実施形態では、工程のうちの１又はそれ以上を少なくとも部分的に手動で実施することができる。
コンピュータプログラム命令はまた、コンピュータ、他のプログラマブルデータ処理装置、又は他の装置にロードされて、コンピュータ、他のプログラマブル装置、又は他の装置で一連の操作工程を実行させて、コンピュータ又は他のプログラマブル装置上で実行される命令が、本明細書に特定される機能／動作を実行するためのプロセスを提供するように、コンピュータ実施プロセスを生成することができる。
本発明は、これまで、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルに基づいて記載されてきたが、これは、参照遺伝子セットの各々の値を用いて正規化することができるＰＤＥ４Ｄ７の発現レベル（例えば、値）を含むことができ、遺伝子発現プロファイルは、他のＰＤＥ４Ｄ変異体からの発現情報をさらに含むことができる。例えば、他のＰＤＥ４Ｄ変異体は、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８及びＰＤＥ４Ｄ９の１又はそれ以上を含んでもよい。次いで、診断キットは、前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中の他のＰＤＥ４Ｄ変異体の各々について遺伝子発現プロファイルを決定する少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブをさらに含んでもよい。しかしながら、好ましくは、ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルのみ、特に、参照遺伝子セットの各々の値を用いて正規化することができるＰＤＥ４Ｄ７の発現レベル（例えば、値）のみが用いられる。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ１」又は「ＰＤＥ４Ｄ１」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体１、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ１遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列： ＮＭ＿００１１９７２２２．１に定義される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ１転写産物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１に記載されるヌクレオチド配列、に関し、また、ＰＤＥ４Ｄ１ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入れ参照配列ＮＰ＿００１１８４１５１．１に定義されるタンパク質配列に対応する、配列番号２に記載される対応するアミノ酸配列にも関する。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ１」又は「ＰＤＥ４Ｄ１」はまた、プライマー対ＰＤＥ１Ｄ１Ｄ２＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３）及びＰＤＥ１Ｄ１Ｄ２＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号４）により生成することができ、プローブ配列番号５により検出することができるアンプリコンに関する。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ２」又は「ＰＤＥ４Ｄ２」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体２、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ２遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９７２２１．１に定義された配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ２転写産物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号６に記載されたヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ２ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００１１８４１５０．１に定義されたタンパク質配列に対応する配列番号７に記載された対応するアミノ酸配列もいう。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ３」又は「ＰＤＥ４Ｄ３」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体３、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ３遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６２０３．４に定義された配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ３転写産物の上記に示されたＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号８に記載されたヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ３ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００６１９４．２に定義されたタンパク質配列に対応する配列番号９に記載された対応するアミノ酸配列もいう。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ４」又は「ＰＤＥ４Ｄ４」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体４、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ４遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１０４６３１．１に定義された配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ４転写産物の上記に示されたＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１０に記載されたヌクレオチド配列であり、また、ＰＤＥ４Ｄ４ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００１０９８１０１．１に定義されたタンパク質配列に対応する配列番号１１に記載された対応するアミノ酸配列にも関する。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ５」又は「ＰＤＥ４Ｄ５」とは、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体５、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ５遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９７２１８．１に定義された配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ５転写産物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１２に記載されたヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ５ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００１１８４１４７．１に定義されたタンパク質配列に対応する配列番号１３に記載された対応するアミノ酸配列をいう。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ５」又は「ＰＤＥ４Ｄ５」はまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ５＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号１４）及びＰＤＥ４Ｄ５＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号１５）により生成することができ、プローブ配列番号１６により検出することができるアンプリコンに関する。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ６」又は「ＰＤＥ４Ｄ６」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体６、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ６遺伝子をいい、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９７２２３．１に定義された配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ６転写産物の上記に示されたＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号１７に記載されたヌクレオチド配列、及びＰＤＥ４Ｄ６ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００１１８４１５２．１に定義されたタンパク質配列に対応する配列番号１８に記載された対応するアミノ酸配列にも関する。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ８」又は「ＰＤＥ４Ｄ８」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体８、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ８遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９７２１９．１に定義される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ８転写産物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号２７に記載されるヌクレオチド配列、に関し、また、ＰＤＥ４Ｄ８ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入れ参照配列ＮＰ＿００１１８４１４８．１に定義されるタンパク質配列に対応する、配列番号２８に記載される対応するアミノ酸配列にも関する。
用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ９」又は「ＰＤＥ４Ｄ９」は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライス変異体９、すなわち、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ９遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１１９７２２０．１に定義される配列、具体的には、ＰＤＥ４Ｄ９転写産物の上記のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号２９に記載されるヌクレオチド配列、に関し、また、ＰＤＥ４Ｄ９ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列ＮＰ＿００１１８４１４９．１に定義されるタンパク質配列に対応する配列番号３０に記載される対応するアミノ酸配列にも関する。用語「ホスホジエステラーゼ４Ｄ９」又は「ＰＤＥ４Ｄ９」はまた、プライマー対ＰＤＥ４Ｄ９＿ｆｏｒｗａｒｄ（配列番号３１）及びＰＤＥ４Ｄ９＿ｒｅｖｅｒｓｅ（配列番号３２）により生成することができ、プローブ配列番号３３により検出することができるアンプリコンに関する。
用語「ＰＤＥ４Ｄ１」、「ＰＤＥ４Ｄ２」、「ＰＤＥ４Ｄ３」、「ＰＤＥ４Ｄ４」、「ＰＤＥ４Ｄ５」、「ＰＤＥ４Ｄ６」、「ＰＤＥ４Ｄ８」及び「ＰＤＥ４Ｄ９」はまた、各々、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８及びＰＤＥ４Ｄ９に対して高度の相同性を示すヌクレオチド配列を含み、例えば、核酸配列が、配列番号１、６、８、１０、１２、１７、２７又は２９で表される配列と各々少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるか、又はアミノ酸配列が、配列番号２、７、９、１１、１３、１８、２８又は３０で表される配列と各々少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるか、又は配列番号２、７、９、１１、１３、１８、２８又は３０で表される配列と各々少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列であるか、又は配列番号１、６、８、１０、１２、１７、２７又は２９で表される配列と各々少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
クレーム中の引用符号は、その範囲を限定するものと解釈してはならない。
本発明は、被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイルの決定工程、被験体から得られた前記生物学的試料と同一又は別の生物学的試料中のＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルの決定工程、かつ、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく、被験体の術前予後リスクスコアの決定工程を含む、前立腺がん被験体の術前リスク層別化の方法に関する。これにより、術前の設定で被験体の層別化が改善され、より良好な一次治療の決定につながりうる。例えば、当該術前予後リスクスコアにより、前立腺がん患者の特定の亜集団に対して積極的なサーベイランス対積極的介入（例えば、根治的前立腺切除術）を選択するか否かについて、より優れた推奨を行いうる。
添付された配列表（2018PF00399_sequencing list_ST25）は、その全体が参照により本明細書に援用される。
Claims (9)
- 以下の：
前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中のホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；
前記前立腺がん被験体から得られた同一又は別の生物学的試料中のＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；及び
場合によっては、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン－α－１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択される１又はそれ以上の参照遺伝子についての遺伝子発現プロファイルを決定するための、少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ；
を含む、診断キットであって、
ここで、前記診断キットは、さらに、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づいて術前予後リスクスコアを計算するための命令を含み、前記命令は、コンピュータにより実行される場合、コンピュータプログラム製品に格納されて、以下の：
－前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルに基づく、前記前立腺がん被験体の術前予後リスクスコアの決定工程、かつ、
－前記術前予後リスクスコアに基づく前記前立腺がん被験体の一次治療を提案することを含む方法を実行し、ここで、場合によっては、前記方法は、以下の：
－前記１又はそれ以上の参照遺伝子による、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又は前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルの正規化工程、を含み、ここで、場合によっては、前記術前予後リスクスコアは、正規化された前記遺伝子発現プロファイルに基づいて決定され、かつ、
前記術前予後リスクスコアを計算するための命令は、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを、前記前立腺がん被験体の集団から得られた回帰関数と組み合わせるための命令を含み、かつ、前記一次治療の提案には、積極的サーベイランスと積極的介入のどちらを選択するか、が含まれる、診断キット。 - 前記一次治療は、（ｉ）少なくとも前立腺部分切除術；（ｉｉ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びそれらの併用から選択される積極的治療；並びに（ｉｉｉ）積極的サーベイランスからなる群から選択される、請求項１に記載の診断キット。
- 前記１又はそれ以上の参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰの少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又はすべてを含む、請求項１に記載の診断キット。
- 前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又は前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルの決定には、生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対してＲＴ－ｑＰＣＲを行うことを含み、ここで、Ｃｑ値が、前記ＰＤＥ４Ｄ７及び／又は前記ＤＨＸ９、並びに前記１又はそれ以上の参照遺伝子の各々について決定され、かつ、前記術前予後リスクスコアの決定工程は、前記ＰＤＥ４Ｄ７及び／又は前記ＤＨＸ９のＣｑ値を前記１又はそれ以上の参照遺伝子の各々のＣｑ値を用いて正規化し、かつ、正規化された前記Ｃｑ値に基づいて前記術前予後リスクスコアを計算することを含む、請求項１に記載の診断キット。
- コンピュータによりプログラムが実行される場合、コンピュータに以下の：
－ホスホジエステラーゼ４Ｄ変異体７（ＰＤＥ４Ｄ７）の遺伝子発現プロファイル及びＤＥｘＨ－ボックスヘリカーゼ９（ＤＨＸ９）の遺伝子発現プロファイルに基づいて、前立腺がん被験体の術前予後リスクスコアを決定すること、及び
－前記術前予後リスクスコアに基づく前記前立腺がん被験体の一次治療を提案すること
を含む、方法を実行させる命令を含むコンピュータプログラムであって、
ここで、前記術前予後リスクスコアの決定することにおいて、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、前記前立腺がん被験体の集団に由来する回帰関数と組み合わされ、かつ、前記一次治療の提案には、積極的サーベイランスと積極的介入のどちらを選択するか、が含まれ、かつ、
ここで、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイルは、前記前立腺がん被験体から得られた生物学的試料中で決定されており、かつ、前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルは、前記前立腺がん被験体から得られた前記生物学的試料と同一又は別の生物学的試料中で決定されていた、
コンピュータプログラム。 - 前記一次治療は、（ｉ）少なくとも前立腺部分切除術；（ｉｉ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びそれらの併用から選択される積極的治療；並びに（ｉｉｉ）積極的サーベイランスからなる群から選択される、請求項５に記載のコンピュータプログラム。
- さらに、以下の：
－ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン－α－１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）からなる群から選択された１又はそれ以上の参照遺伝子による、前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又は前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを正規化すること；
を含む、請求項５に記載のコンピュータプログラムであって、
ここで、前記術前予後リスクスコアは、正規化された前記遺伝子発現プロファイルに基づいて決定される、コンピュータプログラム。 - 前記１又はそれ以上の参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰの少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又はすべてを含む、請求項７に記載のコンピュータプログラム。
- 前記ＰＤＥ４Ｄ７の遺伝子発現プロファイル及び／又は前記ＤＨＸ９の遺伝子発現プロファイルを決定することは、前記生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対してＲＴ－ｑＰＣＲを行うことを含み、ここで、Ｃｑ値が、前記ＰＤＥ４Ｄ７及び／又は前記ＤＨＸ９、並びに前記１又はそれ以上の参照遺伝子の各々について決定され、かつ、前記術前予後リスクスコアの決定することは、前記ＰＤＥ４Ｄ７及び／又は前記ＤＨＸ９のＣｑ値を前記１又はそれ以上の参照遺伝子の各々のＣｑ値を用いて正規化し、かつ、正規化された前記Ｃｑ値に基づいて前記術前予後リスクスコアを計算することを含む、請求項５に記載のコンピュータプログラム。
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