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JP7399284B2 - 脳卒中または脳卒中による後遺症治療のためのシルデナフィル及びｒｏｃｋ阻害剤の用途 - Google Patents

脳卒中または脳卒中による後遺症治療のためのシルデナフィル及びｒｏｃｋ阻害剤の用途 Download PDF

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Description

本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む、薬学的組成物の脳卒中または脳卒中による後遺症の治療用途に関する。
脳卒中は、脳に血液を供給している血管が詰まったり破れたりして、その部分の脳組織が損傷して現れる神経学的症状であり、大きく虚血性脳卒中（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）と出血性脳卒中（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）の２つに分けられる。このうち、虚血性脳卒中は、脳組織への血液供給の減少または遮断によって脳組織が虚血状態になるときに発生し、出血性脳卒中は、血管が破れる場合、出血によって発生し、全体の脳卒中患者の約８０程度％を虚血性脳卒中が占めるものと報告される。
虚血性脳卒中が発症すると、血液の流れが一時的に途切れることにより、細胞が酸素と栄養分を得ることができなくなるが、手術や血栓溶解剤を用いて血管の流れを再開させる措置である再灌流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を通じて再酸素化（ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）が可能である。再灌流は、細胞に酸素と栄養分を供給するという点で回復過程において必須的であるが、脳血類の障壁が壊れた状態で再開されると、過剰である酸素化合物、即ち、活性酸素種(ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）が生成され、また、炎症反応が伴って脳浮腫がひどくなるか、または脳出血に変換されることもある。脳細胞は、一度血管が詰まると、１分当たり数百万個の細胞が死滅するため、脳梗塞治療において最も重要なのは時間である。しかし、最近の研究結果によると、患者ごとに同じ部位が詰まっても予後が異なることが分かる。予後の良い患者を分析した結果、その患者の脳は、脳血管が詰まると、自己保護機能で周辺の脳血管が拡張すると同時に詰まった部位の血流を助けることになると報告した。したがって、脳梗塞の発症時に周辺血管の拡張機能が患者の予後を異ならせることが分かる。
脳卒中は、脳への血管が詰まるか、または破裂されて生じる一時的な脳疾患で、深刻な後遺症を残す疾患であり、脳神経細胞の損傷によって運動機能の喪失、感覚異常、認知、言語障害、意識消失、嚥下機能の障害など出血及び閉鎖部位や範囲によって多様な神経学的症状を引き起こす。
また、脳卒中で発生する脳神経細胞の損傷の原因としては、過度の興奮性神経伝達物質の遊離、自由ラジカルの生成、タンパク質合成の阻害、遺伝子発現異常及び免疫反応の活性化などが挙げられ、脳神経細胞損傷機序の複雑性のため、いまだに脳神経細胞の損傷を保護できる治療剤が開発されていない。
一方、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）は、勃起不全と肺動脈高血圧治療に使用される薬物で、当該臓器に分布している平滑筋を弛緩させて血液供給を円滑にして勃起不全の改善と肺動脈の圧力を改善する効果を示し、２０ｍｇの錠剤は、肺動脈高血圧の治療に使用され、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇの錠剤は、勃起不全の治療に使用されることが知られている。
また、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）は、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制する働きをする物質であり、神経突起の再生、ミオシンリン酸化及び平滑筋の収縮における作用－誘導性Ｃａ2＋増減（ａｇｏｎｉｓｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃａ2＋ ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）の抑制などの機能を果たすことが知られている。より具体的には、ＲＯＣＫ阻害剤は、高血圧と喘息を引き起こす筋肉細胞の異常構造を軽減させ、視神経乳頭の血液の流れを増加させ、眼圧を持続的に減少させる機能があると報告されている。
ＲＯＣＫ阻害剤の炎症性疾患治療用途に関する研究（韓国登録特許公報第１０－１７９４００９号）及びシルデナフィルの骨格筋の再生及び増進用途に関する研究（韓国登録特許公報第１０－１８５２３５８号）は存在するが、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む薬学的組成物の脳卒中または脳卒中による後遺症の治療用途に関する研究が全く行われていないのが現状である。
前記背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解増進のためのものであり、この技術分野で通常の知識を有する者に既に知られている従来技術に該当することを認めるものと受け止められてはならない。
韓国登録特許公報第１０－１７９４００９号 韓国登録特許公報第１０－１８５２３５８号
本発明者らは、脳卒中治療に関する臨床的知識に基づいて、脳卒中または脳卒中による様々な後遺症の治療にホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤を併用するために研究した結果、シルデナフィルとＲＯＣＫ阻害剤をそれぞれ単独投与した場合と対比してシルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合、脳卒中による脳損傷のサイズ、運動機能の喪失、不安障害、認知機能の低下が有意に改善されることを最初に確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び
ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む、虚血性脳血管疾患または虚血性脳血管疾患による後遺症の治療用薬学的組成物を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び
ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む、虚血性脳血管疾患の予後改善用薬学的組成物を提供することにある。
また、本発明のさらに他の目的は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び
ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む認知機能増進用薬学的組成物を提供することにある。
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
前記のような本発明の目的を達成するため、本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び
ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む、虚血性脳血管疾患または虚血性脳血管疾患による後遺症の治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の一具現例として、前記虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中（脳梗塞）、血栓症、塞栓症、一過性虚血発作、白質異常症及び小梗塞からなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい。
本発明の他の具現例として、前記虚血性脳血管疾患による後遺症は、運動機能の喪失、不安障害、認知機能の低下からなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤は、ミロデナフィル（ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ）、シルデナフィル(ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、ユデナフィル（ｕｄｅｎａｆｉｌ）、ダサンタフィル（ｄａｓａｎｔａｆｉｌ）、アバナフィル（ａｖａｎａｆｉｌ）及びこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物及び水和物からなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記ＲＯＣＫ阻害剤は、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）、リパスジル（Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ）、ＲＫＩ－１４４７、Ｙ－２７６３２、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、Ｙ－３０１４１及びこれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物及び水和物からなる群から選ばれるいずれか一つであってもよい。
本発明のさらに他の具現例として、前記薬学的組成物は、脳血管閉塞後の再灌流前、再灌流と同時または再灌流後に投与するためのものであってもよい。
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、虚血性脳血管疾患または虚血性脳血管疾患による後遺症の治療方法を提供する。
また、本発明は、前記薬学的組成物の虚血性脳血管疾患または虚血性脳血管疾患による後遺症の治療用途を提供する。
また、本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び
ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む、虚血性脳血管疾患の予後改善用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、虚血性脳血管疾患の予後改善方法を提供する。
また、本発明は、前記薬学的組成物の虚血性脳血管疾患の予後改善用途を提供する。
また、本発明は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及び
ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む、認知機能増進用薬学的組成物を提供する。
また、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む、認知機能の増進方法を提供する。
また、本発明は、前記薬学的組成物の認知機能の増進用途を提供する。
本発明者らは、脳卒中治療に関連した臨床的知識に基づいて、脳卒中または脳卒中による後遺症の治療にシルデナフィルとＲＯＣＫ阻害剤を併用するために研究した結果、シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤を単独投与した場合と対比してシルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合、脳卒中または脳卒中による後遺症が有意に改善されることを最初に確認したところ、本発明による薬学的組成物は、脳卒中または脳卒中に関連した後遺症の治療または研究に有用に利用され得るものと期待される。
図１は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、薬物単独処理群及び薬物併用処理群の脳卒中による脳損傷のサイズを確認した結果を脳切片（ｂｒａｉｎ ｓｌｉｃｅ）画像で示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独処理群を、ＲＯＣＫ－Ｉは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）単独処理群を示し、ＳＲは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の併用処理群を示し、ｐｒｅは、中大脳動脈閉塞後の再灌流前投与群を示し、ｐｏｓｔは、中大脳動脈閉塞後の再灌流後投与群を示す。 図２は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、薬物単独処理群及び薬物併用処理群の脳卒中による直接的な脳損傷（ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）の減少レベルを確認した結果をグラフで示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独処理群を、ＲＯＣＫ－Ｉは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）単独処理群を示し、ＳＲは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の併用処理群を示し、ｐｒｅは、中大脳動脈閉塞後の再灌流前投与群を示し、ｐｏｓｔは、中大脳動脈閉塞後の再灌流後投与群を示す。 図３は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、薬物単独処理群及び薬物併用処理群の運動機能レベルを確認するためのＴｒａｃｉｎｇ ｆｉｇｕｒｅｓを示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独処理群を、ＲＯＣＫ－Ｉは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）単独処理群を示し、ＳＲは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の併用処理群を示し、ｐｒｅは、中大脳動脈閉塞後の再灌流前投与群を示し、ｐｏｓｔは、中大脳動脈閉塞後の再灌流後投与群を示す。 図４は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、薬物単独処理群及び薬物併用処理群の運動機能の喪失の改善レベルを確認した結果をグラフで示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独処理群を、ＲＯＣＫ－Ｉは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）単独処理群を示し、ＳＲは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の併用処理群を示す。 図５は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、薬物単独処理群及び薬物併用処理群の不安レベルを確認するためのＬｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ｂｏｘ ｔｅｓｔの結果を示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独処理群を、ＲＯＣＫ－Ｉは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）単独処理群を示し、ＳＲは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の併用処理群を示す。 図６は、Ｂａｒｎｅｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔに使用される脱出孔を示す。 図７は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、薬物単独処置群及び薬物併用処置群の認知機能を確認するためのＴｒａｃｉｎｇ ｆｉｇｕｒｅｓを示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独処理群を、ＲＯＣＫ－Ｉは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）単独処理群を示し、ＳＲは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の併用処理群を示し、ｐｒｅは、中大脳動脈閉塞後の再灌流前投与群を示し、ｐｏｓｔは、中大脳動脈閉塞後の再灌流後投与群を示す。 図８は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、薬物単独処理群及び薬物併用処理群の認知機能の低下の改善レベルを確認した結果をグラフで示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独処理群を、ＲＯＣＫ－Ｉは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）単独処理群を示し、ＳＲは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の併用処理群を示し、ｐｒｅは、中大脳動脈閉塞後の再灌流前投与群を示し、ｐｏｓｔは、中大脳動脈閉塞後の再灌流後投与群を示す。 図９は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、シルデナフィル単独治療群においてｆＥＰＳＰ ｓｌｏｐｅを測定し、脳卒中による神経可塑性減少の改善可否を確認した結果を示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独治療群を示し、ｐｒｅは、中大脳動脈閉塞後再の灌流前投与群を示し、ｐｏｓｔは、中大脳動脈閉塞後の再灌流後投与群を示す。 図１０は、対照群、脳卒中（脳梗塞）動物モデル、シルデナフィル単独治療群においてｆＥＰＳＰ ｓｌｏｐｅを測定し、脳卒中による神経可塑性減少の改善をグラフで示す。ここで、ＭＣＡｏ３０は、脳卒中（脳梗塞）動物モデルを示し、ＳＩＬは、シルデナフィル（ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）単独治療群を示し、ｐｒｅは、中大脳動脈閉塞後の再灌流前投与群を示し、ｐｏｓｔは、中大脳動脈閉塞後の再灌流後投与群を示す。
本発明者らは、脳卒中治療に関連した臨床的知識に基づいて、脳卒中または脳卒中による後遺症の治療にシルデナフィルとＲＯＣＫ阻害剤を併用するために研究した結果、シルデナフィルとＲＯＣＫ阻害剤をそれぞれ単独投与した場合と対比してシルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合、脳損傷の程度、運動機能の喪失、不安障害または認知機能の低下が有意に改善されることを最初に確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
そこで、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む、虚血性脳血管疾患または虚血性脳血管疾患による後遺症の治療用薬学的組成物を提供する。
本発明で対象とする疾患である「虚血性脳血管疾患」とは、脳の血管が何らかの理由で詰まって脳に必要な血液が供給されないために発生する疾患を総称する用語を意味し、脳虚血疾患ともいい、前記虚血性脳血管疾患とは、脳の血液の流れが減少して酸素とブドウ糖の供給が正常に行われず、脳細胞のうち脳虚血に敏感であることが知られている組織の神経細胞の死滅が誘発されて発生する疾患をいい、例としては、虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中（脳梗塞）、血栓症、塞栓症、一過性虚血発作、白質異常症及び小梗塞などがあり、好ましくは、虚血性脳卒中であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明で対象とする疾患である「虚血性脳血管疾患による運動機能の喪失」の症状としては、顔面麻痺、腕（または脚）の筋力喪失、構音障害などがあるが、これに制限されるものではない。
本発明で対象とする疾患である「虚血性脳血管疾患による不安障害」は、実際の危険または状況に応じた危険に比例する不安症状が６ヶ月間存在し、次のうち少なくともいずれか３つの症状が現れると報告されているが、これに制限されるものではない。緊張感または不安（ｆｅｅｌｉｎｇ ｗｏｕｎｄ－ｕｐ、ｔｅｎｓｅ、ｏｒ ｒｅｓｔｌｅｓｓ）、疲労、集中困難、敏感さ、かなりの筋肉の緊張、睡眠障害、また、Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗの結果（４，７０６人を含む３９ｃｏｈｏｒｔ）、脳卒中患者の２４％が等級尺度で評価すると不安症状があることが確認され、脳卒中患者の１８％は、脳卒中後の最初の５年間不安障害があることが確認された。持続的で頻繁で、深刻な情緒的不安定性を治療するための抗うつ剤の使用は適切であるが、適切な薬物の種類、期間または用量は、知られていない。
本発明で対象とする疾患である「虚血性脳血管疾患による認知機能の低下」の症状は、知覚、分析、言語、記憶、判断に関連した非常に複雑で包括的な症状であり、脳損傷の位置及び程度によって様々な認知機能の低下を示し、学習能力の低下、空間無視、時空間知覚力の低下、注意力の低下、記憶力の低下などがあるが、これに制限されるものではない。
本発明において、「ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＰＤＥ阻害剤）」は、様々な組織（ｔｉｓｓｕｅ）で発見された酵素である。前記ＰＤＥ阻害剤は、非選択的阻害剤から生じる副作用なしに選択された同種酵素の強力な阻害を提供し、ＰＤＥ－５阻害剤は、原発性肺高血圧（ｐｒｉｍａｒｙ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）と勃起不全（ｅｒｅｃｔｉｌｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）の治療に使用されることが知られており、例としては、ミロデナフィル（ｍｉｒｏｄｅｎａｆｉｌ）、シルデナフィル(ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）、バルデナフィル（ｖａｒｄｅｎａｆｉｌ）、タダラフィル（ｔａｄａｌａｆｉｌ）、ユデナフィル（ｕｄｅｎａｆｉｌ）、ダサンタフィル（ｄａｓａｎｔａｆｉｌ）、アバナフィル（ａｖａｎａｆｉｌ）などがあり、好ましくは、シルデナフィルであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、「ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を抑制する機能を果たす物質で、神経突起の再生、ミオシンリン酸化及び平滑筋の収縮における作用－誘導性Ｃａ２＋増減（ａｇｏｎｉｓｔ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃａ２＋ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）の抑制などの機能を果たすことが知られている。より具体的に、ＲＯＣＫ阻害剤は高血圧と喘息を引き起こす筋肉細胞の異常構造を軽減させ、視神経乳頭の血液の流れを増加させ、眼圧を持続的に減少させる機能があることが報告されており、例としては、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）、リパスジル（Ｒｉｐａｓｕｄｉｌ）、ＲＫＩ－１４４７、Ｙ－２７６３２、ＧＳＫ４２９２８６Ａ、Ｙ－３０１４１などがあり、好ましくは、下記化１で表されるＧＳＫ４２９２８６Ａ(Ｎ－(６－Ｆｌｕｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ)－６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－４－[４－(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ)であってもよいが、これに制限されるものではない。
Figure 0007399284000001
また、前記薬学的組成物は、脳血管閉塞後の再灌流前、再灌流と同時または再灌流後に投与するためのものであってもよく、好ましくは、中大脳動脈閉塞後の再灌流前、再灌流と同時または再灌流後に投与するためのものであってもよいが、これに制限されず、本発明において、「再灌流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）とは、臓器や組織において血液の流れが一時的に途絶えることにより、細胞が酸素と栄養分の供給が途絶えた場合、手術や血栓溶解剤を用いて血管の流れを再開させる措置をいう。
前述したように、本発明の一実施例において急性脳卒中（脳梗塞）動物モデルにおいて発生した脳損傷を治療するため、シルデナフィル（ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤）及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＯＣＫ阻害剤）を併用投与した場合、脳卒中による直接的な脳損傷(ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ)が前記シルデナフィルまたはＧＳＫ４２９２８６Ａを前記動物モデルにそれぞれ単独投与した場合に比べて有意に減少することを確認した（実施例２参照）。
また、本発明の他の実施例において急性期脳卒中（脳梗塞）動物モデルにおいて発生した運動機能の喪失を治療するため、シルデナフィル（ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤）及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＯＣＫ阻害剤）を併用投与した場合、運動機能の喪失の程度が前記シルデナフィルまたはＧＳＫ４２９２８６Ａを前記動物モデルにそれぞれ単独投与した場合に比べて有意に改善されることを確認した（実施例３参照）。
また、本発明のさらに他の実施例において急性期脳卒中（脳梗塞）動物モデルにおいて発生した不安障害を治療するため、シルデナフィル（ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤）及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＯＣＫ阻害剤）を併用投与した場合、脳卒中によって増加した不安の程度が前記動物モデルにＧＳＫ４２９２８６Ａを単独投与した場合に比べて有意に改善されることを確認した（実施例４参照）。
また、本発明のさらに他の具現例において急性期脳卒中（脳梗塞）動物モデルにおいて発生した認知機能の低下を治療するため、シルデナフィル（ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤）及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＯＣＫ阻害剤）を併用投与した場合、正常対照群の脱出時間と類似したレベルで脱出孔に達したことを観察したところ、認知機能の低下が有意に改善されることを確認し、前記併用投与群の一部個体は、正常対照群に比べて脱出孔に到達する時間を短縮し、脳卒中が発症していない正常対照群に比べて改善された認知機能（記憶力増進）を示すことを確認した（実施例５参照）。
前記実施例の結果は、シルデナフィルまたはＧＳＫ４２９２８６Ａをそれぞれ単独投与した場合と対比してシルデナフィル（ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤）及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＯＣＫ阻害剤）の併用投与時の脳卒中によって発生した脳損傷を効果的に減少させる効果を示し、脳卒中による後遺症である運動機能の喪失、不安障害、認知機能の低下をさらに効果的に改善させることを意味し、本発明によるシルデナフィル及びＧＳＫ４２９２８６Ａを含む薬学的組成物が脳卒中またはその後遺症（運動機能の喪失、不安障害、認知機能の低下）の治療剤として有用に用いられてもよいことを示唆する。
また、前記実施例の結果は、シルデナフィルまたはＧＳＫ４２９２８６Ａをそれぞれ単独投与した場合と対比してシルデナフィル（ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤）及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（ＲＯＣＫ阻害剤）を併用投与した場合、脱出時間を短縮したことは正常対照群と比較すると認知機能が増進されることを意味し、本発明によるシルデナフィル及びＧＳＫ４２９２８６Ａを含む薬学的組成物が認知機能増進剤として有用に用いられてもよいことを示唆する。
本発明による薬学的組成物は、ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、及びＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を有効成分として含み、さらに薬学的に許容可能な担体も含んでもよい。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものとして、生理食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これらに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液などの他の通常の添加剤をさらに含んでもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用製剤、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化してもよい。適切な薬学的に許容される担体及び製剤化については、レミントンの文献に開示されている方法を用いて、各成分に応じて好ましく製剤化してもよい。本発明の薬学的組成物は、剤形に特に制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤などで製剤化してもよい。
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか、または非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）してもよく、投与量は患者の状態及び体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選ばれてもよい。
本発明による組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られた要素によって決定されてもよい。本発明による組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次的または同時に投与されてもよく、単一または多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されてもよい。
具体的に、本発明による組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重に応じて異なり得、一般的には、体重１ｋｇ当り０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは０．０１～１００ｍｇを毎日または隔日投与するか、または１日１～３回に分けて投与してもよい。しかし、投与経路、虚血性脳血管疾患またはその後遺症、好ましくは、虚血性脳卒中またはその後遺症低下の重症度、性別、体重、年齢などによって増減できるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
一方、本発明の他の態様において、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与する段階を含む虚血性脳血管疾患またはその後遺症の調節または治療方法を提供し、好ましくは、虚血性脳卒中またはその後遺症の調節または治療方法を提供するが、これに制限されるものではない。
本発明において使用される用語の「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与によって虚血性脳血管疾患またはその後遺症、好ましくは、虚血性脳卒中またはその後遺症に対する症状が好転するか、または有利に変更されるすべての行為を意味する。
本発明において「個体」とは、疾患の調節又は治療方法を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒト又は非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例］
実施例１．実験材料及び実験方法
１－１．実験動物（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｉｍａｌｓ）
雄ラット、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、８週齢及び２６０－２８０ｇの実験動物を使用し、前記実験動物は、順天郷大学校の実験動物センター（天安）から得た。すべての実験動物は、特定の温度、湿度及び照明条件下で市販の飼料及び水を任意に提供した（明暗周期１２：１２、２２±２℃、５５±５％）。すべての動物プロトコルは、順天郷大学の実験室動物管理に対する行政パネルによって承認された（許可番号ＳＣＨ１６－００２４）。本発明に関連した実験を行うにおいて、前記実験動物の苦痛を避け、実験に使用される実験動物の数を最小限に抑えた。
１－２．中大脳動脈結紮（閉塞）モデル生成方法（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ（ＭＣＡｏ））
ラットは、２％イソフルランで麻酔され（２％ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ ｉｎ ｍｉｘｅｄ ｇａｓ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ａｎｄ ｎｉｔｒｏｕｓ ｏｘｉｄｅ、０．３：０．７）、手術中に加熱パッドを使用して体温を３７℃に維持した。
すべてのマイクロ鉗子（ｍｉｃｒｏ－ｆｏｒｃｅｐｓ）は、消毒した。４－０モノフィラメント（Ｎｙｌｏｎ ｓｕｔｕｒｅ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ｐｌｃ．）のチップは、歯科用シリコンで０．３７±０．０２ｍｍの厚さでコーティングし、フィラメント片は、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリ－Ｌ－リシン（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）でコーティングした。
前記モノフィラメントを左総頸動脈（ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ、ＣＣＡ）に挿入し、１８ｍｍの地点で内頸動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ、ＩＣＡ）に向かって進行し、中大脳動脈（Ｍｉｄｄｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｒｔｅｒｙ ＭＣＡ）の起始部を塞いだ。
次に、レーザードップラープローブ（ｌａｓｅｒ Ｄｏｐｐｌｅｒ ｐｒｏｂｅ、Ｍｉｌｌｗｅｙ、Ａｘｍｉｎｓｔｅｒ、ＵＫ）を頭頂骨に固定させて手術中に中大脳動脈によって供給された局所皮質血流を測定し、基準局所皮質血流で２０％減少した場合、閉塞が成功したものとみなした。
次に、左中大脳動脈閉塞により３０分間一時的な局所虚血が誘導された。虚血が発生し、３０分経過後、ラットは麻酔から回復し、中大脳動脈は、一時的な虚血から再灌流された。
中大脳動脈結紮（閉塞）の誘導を検証するため、手術後のすべてのラットは、下記の行動が可能であるかを確認した。
１）反対側の前足を伸ばせない。
２）神経学的欠損後、梗塞が発生した側の反対方向に回る行動（ｃｉｒｃｌｉｎｇ ｔｏｗａｒｄ ｃｏｎｔｒａｌａｔｅｒａｌ ｔｏ ｉｎｆａｒｃｔ）ができない。
前記中大脳動脈結紮（閉塞）の誘導モデルに本発明による薬学的組成物を適用し、指定された時間コースで様々な行動テスト（ｂｅｈａｖｉｏｒ ｔｅｓｔ）、電気生理学（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）、免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏ－ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）実験を行うときに使用した。
前記行動テストなどに対する経験のない中大脳動脈結紮（閉塞）の誘導モデル及び週齢が一致する正常ラットを対照群として使用した。
１－３．実験薬物処理（Ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）
本発明者らは、１）Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ ｃｉｔｒａｔｅ、２）ＧＳＫ４２９２８６Ａ及び３）Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ ｃｉｔｒａｔｅ及びＧＳＫ４２９２８６Ａをそれぞれ実験動物に適用して軽微な虚血性脳卒中で発生した直接的な脳損傷または様々な表現型後遺症に対してホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）及び／又はＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が及ぼす影響を評価した。
より具体的には、中大脳動脈閉塞後の再灌流３０分前及び中大脳動脈閉塞後の再灌流３０分後に下記の実験薬物をそれぞれ腹腔内に投与した。
１）Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ ｃｉｔｒａｔｅ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｓａｌｉｎｅ、Ｈａｎｍｉ Ｐａｒｍ．Ｃｏ．，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）
２）ＧＳＫ４２９２８６Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ／ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）
３）Ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ ｃｉｔｒａｔｅ（２０ｍｇ／ｋｇ／ｓａｌｉｎｅ）及びＧＳＫ４２９２８６Ａ（１０ｍｇ／ｋｇ／ＤＭＳＯ）
１－４．Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ測定
軽症虚血性脳卒中発症後の脳梗塞のサイズを測定するため、実験動物の頭部を切開し、脳を取り出して４℃で冷却して組織を硬化させた。
また、嗅覚電球から小脳（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ ｂｕｌｂ ｔｏ ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ）まで６個または７個の冠状面（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ）、２ｍｍの脳切片（ｂｒａｉｎ ｓｌｉｃｅ）を作製した。
次に、前記各冠状セクション脳切片を室温で２％ＴＴＣ溶液に２０分間浸漬した。
最後に、ＴＴＣ染色された冠状セクション脳切片は、モデルＤＰ７２デジタルカメラ及びＤＰ２－ＢＳＷ顕微鏡デジタルカメラソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）を使用して画像を生成し、画像分析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ、ＮＩＨ、ＵＳＡ）を使用して各脳切片の虚血性脳損傷の面積を測定した。ＴＴＣ染色は、脳梗塞区域のコア領域を区分するが、ピンク色の損傷した脳組織は、虚血半影(ｐｅｎｕｍｂｒａ)に区分され、これは梗塞コア領域の周辺部に位置し、赤色は損傷していない正常脳組織に区分される。
総脳梗塞の体積は、コアと虚血半影の和であり、損傷した体積は半球体積の平均百分率で計算し、以前の研究結果を参照して浮腫の体積を調整した。実験結果は、異なる動物グループに対する平均ＳＥＭとして提供し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの試験（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’s ｔｅｓｔ）により、ｐ－値＜０．０１または＜０．０５が統計的に有意なものとみなされた。
１－５．Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔ
Ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔは、新しい環境において好奇心によって活動が多くなるげっ歯類の探索的行動に基づく実験であり、移動した総距離は、一般的な運動活動を評価するためのパラメータとして使用される。
ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｂｌａｃｋ ｂｏｘ(６０×６０×４０ｃｍ；長さ、幅、高さ）は、手がかりのない隔離された部屋に配置し、実験動物は拡散した光の下でオープンフィールドボックスの中央領域に配置した。ＰＣベースのビデオ動作分析システムであるＥｔｈｏｖｉｓｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアを使用して３０分間、実験動物が動いた距離を記録し、分析した。
１－６．Ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ｂｏｘ ｔｅｓｔ
Ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ｂｏｘ ｔｅｓｔ(４５×２７×２７ｃｍ；長さ、幅、高さ）は２つの区画に分けられ、より具体的に、５分の３は明るい区画であり、５分の２は暗い区画である。各区画は、床に位置する９×９ｃｍの入口で互いに連結されている。
区画の中央で照明を調整して明るい区画を３００ラックス（ｌｕｘ）、暗い区画を０－１ラックス（ｌｕｘ）に設定し、実験動物を明るい区画に置いて実験動物が環境を探索する５分間ビデオカメラで記録した。
１－７．Ｂａｒｎｅｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔ
Ｂａｒｎｅｓ ｍａｚｅは、同じ距離の周りに２０個の孔がある円形プラットフォーム（直径１２２ｃｍ）からなっており、床から１０５ｃｍ上昇している。実験動物を観察しやすい高さでプラットフォームを囲むそれぞれのクァドラントの壁に４つの異なる視覚的キューが配置され、クァドラント区域の１つの孔（脱出孔）は、プラットフォームの下に脱出チャンバーを含む。また、実験動物の安全のために脱出チャンバーにベディング(ｂｅｄｄｉｎｇ)が追加された。脱出チャンバーを見つける動機付けのための不安を増幅させるため、メトロノームと明るい照明を使用した。より具体的には、メトロノームを使用して連続的に８０Ｈｚのノイズを生成し、プラットフォームの中心で測定された照度が３００ラックス（ｌｕｘ）を維持するようにした。
適応段階の間、プラットホームの中心で実験動物を黒いシリンダー内に位置させ、前記適応段階は４日間持続した。１０秒後、シリンダーが取り外されたとき、実験動物は中心からプラットフォームを探索し、この活動はビデオカメラによって記録された。また、実験動物が脱出孔を見つけるのに１８０秒の時間を与えた。実験動物が１８０秒以内に脱出孔から脱出チャンバーに入ったとき、１２０秒間前記孔に蓋を置いて光を遮断し、８０Ｈｚのノイズを止めた。
また、実験動物が脱出孔を見つけられなかった場合、実験動物を慎重に引っ張り、脱出チャンバーのある脱出孔に案内し、空間に対する学習を誘導した。前記学習は脱出口を見つけるための空間記憶を向上させるための適応段階であり、１５分間隔で３回各実験動物に対して行われた。
５日目の空間獲得段階（プローブ段階）には、実験動物に脱出口を見つけるために９０秒が与えられたが、脱出チャンバーは除去された。この段階は一回だけ行った。
脱出孔に連結された脱出チャンバーのあるクァドラント区域から移動した距離と持続時間は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ（登録商標）ソフトウェアで分析され、脱出孔に連結された脱出チャンバーに到達するための待機時間は手動で分析された。
１－８．ｆＥＰＳＰ ｓｌｏｐｅ測定
ｆＥＰＳＰ（Ｆｉｅｌｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ）は、海馬のＣＡ１からわずかに修正された部位でレコーディングした。行動試験の後、ウレタン（１．５ｇ／ｋｇ）を使用して動物を腹腔内麻酔させ、ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｆｒａｍｅに入れた。温度調節器（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）を使用し、手術過程で直腸温度を３７±０．３℃に維持した。
次に、頭皮が開かれて分離され、電極を導入するために頭蓋骨を通じて孔を開けた。
ブレグマ（ｂｒｅｇｍａ、頭蓋骨の冠状動脈と視床縫合糸の接合点）を基準とした座標（ｍｍ単位）は、次の通りである。
１）記録電極（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ, ｔｏ ｔｈｅ Ｓｃｈａｆｆｅｒ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ）：ブレグマから４．０後部、中心線から側面に３．０、深さ２．５
２）刺激電極（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ、ｔｏ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｕｍ ｒａｄｉａｔｕｍ ｏｆ ＣＡ１）：ブレグマから３．５後部、中心線から側面に２．０、海馬から３．５深さ。
電極の深さは、誘発された反応に対して最適化するかどうかを観察することにより最終的に決定した。ｆＥＰＳＰは、試験のために最大反応サイズの６０％に調整し、刺激は、ＢＮＣ－２１１０ ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＳＡ）及びＤｉｇｉｔａｌ Ｓｔｉｍｕｌｕｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ（Ｇｅｔｔｉｎｇ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって生成された。前記Ｓｃｈａｆｆｅｒ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ刺激に対するピラミダル神経細胞（Ｐｙｒａｍｉｄａｌ ｎｅｕｒｏｎ）の反応は、Ｐ５５Ａ．Ｃ．ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（３－１０００Ｈｚ ｂａｎｄｐａｓｓ、Ａｓｔｒｏ－Ｍｅｄ Ｉｎｃ．）を使用してレコーディングし、ＷｉｎＬＴＰ ｖｅｒ．２．０１ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＷｉｎＬＴＰ Ｌｔｄ．）を用いて分析した。また、単一パルス刺激によって反応が起こり、２０秒間隔で伝達された。安定的な基準線を３０～６０分間記録した。
Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＬＴＰ）は、強いシータパターン化された刺激（ｔｈｅｔａ ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｓｔｉｍｕｌｕｓ、ｓＴＰＳ、ｆｏｕｒ ｔｒａｉｎｓ ｏｆ １０ ｂｕｒｓｔｓ ｏｆ ５ ｐｕｌｓｅｓ ａｔ ４００Ｈｚ ｗｉｔｈ ａ ２００－ｍｓ ｉｎｔｅｒ－ｂｕｒｓｔ ｉｎｔｅｒｖａｌ、１５－s ｉｎｔｅｒ－ｔｒａｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）によって誘導された。これは、ｓＴＰＳ（ｂｕｒｓｔ ｏｆ ４００Ｈｚ ｓｔｉｍｕｌｉ）がＮＭＤＡ－受容体依存的で、ＣＡ１及びＤＧ領域の強力なＬＴＰが生体内のｓＴＰＳによって誘発されるためである。
ｆＥＰＳＰの変化を分析するため、ｆＥＰＳＰの傾きを６０秒間隔で平均化し、３０分の基準時間にわたって測定された平均ｆＥＰＳＰの傾きの百分率で表し、これは１００％と表した。週齢が一致する対照群に対するｆＥＰＳＰの反応も同じ方法を用いて測定した。
実施例２．シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与時、脳卒中後の脳組織の損傷程度の確認
急性期脳卒中（脳梗塞）モデルであるＭＣＡｏ３０を用いて、１）シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤単独投与、２）シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合において、脳卒中発症による直接的な脳組織の損傷程度を確認する実験を行った。前記実験は、１～４に記載された方法に基づいて行った。
その結果、図１及び図２に示すように、急性期脳卒中（脳梗塞）モデルであるＭＣＡｏ３０（脳卒中の範囲１００％基準）に比べてシルデナフィル単独投与群は、脳卒中発症後の脳組織の損傷が２６．７１％に減少し、ＲＯＣＫ阻害剤単独投与群は、脳卒中発症後の脳組織の損傷が２１．２８％に減少することを確認した。
また、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与群は、中大脳動脈閉塞後の再灌流前／後投与群の両方において前記各単独投与群と対比すると、脳卒中による脳組織の損傷のサイズが大きく減少することを確認した（４．５％）。
前記実験結果を数値で対比すると、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用療法の中大脳動脈閉塞後の再灌流前投与群は、脳卒中による脳組織の損傷のサイズにおいてシルデナフィル単独投与群に比べて６倍程度優れた「脳組織損傷の減少効果」を示し、ＲＯＣＫ阻害剤単独投与群に比べて４．８倍程度優れた「脳組織損傷の減少効果」を示すことが確認できる。
また、前記実験結果を総合すると、脳卒中発症後シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用療法を行う場合、脳卒中による直接的な脳組織損傷の減少効果が極大化されるだけでなく、シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤それぞれの単独療法と対比時の脳組織損傷の減少においてシナジー効果があることが分かった。
実施例３．シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合、ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔにより運動機能の喪失の改善可否の確認
急性期脳卒中（脳梗塞）モデルであるＭＣＡｏ３０を使用し、１）シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤単独投与、２）シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合において、脳卒中による後遺症の一つである運動機能の喪失の程度を確認するため、ｏｐｅｎ ｆｉｅｌｄ ｔｅｓｔを行い、運動機能は、正常対照群の運動機能を基準とした（運動機能の喪失なし、１００％）。ここで、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与は、中大脳動脈閉塞後の再灌流後に行った。
その結果、図４に示すように、脳卒中（脳梗塞）動物モデル（ＭＣＡｏ３０）は、平均５７．４％で運動機能（ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が失われていることを確認し、前記結果は、前記動物モデルを脳卒中による後遺症（運動機能の喪失の後遺症）動物モデルとして使用できることを確認したものである。
また、前記動物モデルに対するシルデナフィル単独投与群は、運動機能が７０．８％に改善され、前記動物モデルに対するＲＯＣＫ阻害剤単独投与群は、運動機能が７１％に改善されることを確認した。
また、シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤のそれぞれの単独投与群の運動機能に対して、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与群は、運動機能が９０．４％までさらに改善されることを確認した。
前記実験結果を数値で対比すると、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与群は、シルデナフィル単独投与群に比べて２．５倍程度優れた「運動機能の改善効果」を示し、ＲＯＣＫ阻害剤単独投与群に比べて２．４倍程度優れた「運動機能の改善効果」を示すことが確認できる。
また、前記実験結果を総合すると、脳卒中による運動機能の喪失の発生時にシルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用療法を行う場合、脳卒中による運動機能の喪失の改善効果が極大化されるだけでなく、シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤それぞれの単独療法と対比すると、運動機能の喪失の改善においてシナジー効果が現れることが分かった。
実施例４．シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合、Ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ｂｏｘ ｔｅｓｔにより不安障害の改善可否の確認
急性期脳卒中（脳梗塞）モデルであるＭＣＡｏ３０を使用し、１）シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤単独投与、２）シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合において、脳卒中による後遺症の一つである不安障害の程度を確認するため、Ｌｉｇｈｔ－ｄａｒｋ ｂｏｘ ｔｅｓｔを行い、不安の程度は、正常対照群を基準とした（不安なし、１００％）。ここで、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与は、中大脳動脈閉塞後の再灌流後に行った。
その結果、図５に示すように、脳卒中（脳梗塞）動物モデル（ＭＣＡｏ３０）は、正常対照群と比較すると、明るいところにとどまる時間が６２．０８％に減少し、不安レベルが悪化したことを確認した。
また、シルデナフィル単独投与群の場合、明るいところにとどまる時間が６３．６３%と観察され、脳卒中により悪化した不安レベル(不安障害）に対して有意な改善効果がないことを確認し、ＲＯＣＫ阻害剤単独投与群の場合、明るいところにとどまる時間が８４．２６％と観察され、脳卒中により悪化した不安レベル（不安障害）に対して改善効果があることを確認した。
また、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与群は、正常対照群と対比すると、明るいところにとどまる時間が９９．２％と観察され、ほぼ正常対照群と同じ程度に脳卒中により悪化した不安レベル（不安障害）に対する改善効果が有意であることを確認した。
前記実験結果を数値で対比すると、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与群は、ＲＯＣＫ阻害剤単独投与群に比べて１．７倍程度優れた「不安レベル（不安障害）に対する改善効果」を示すことが確認できる。
実施例５．シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合、Ｂａｒｎｅｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔにより認知機能（長期記憶、ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｍｅｍｏｒｙ）低下の改善可否の確認
急性期脳卒中（脳梗塞）動物モデルであるＭＣＡｏ３０を使用し、１）シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害剤単独投与、２）シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合において、脳卒中による後遺症の一つである認知機能の低下の程度を確認するため、Ｂａｒｎｅｓ ｍａｚｅ ｔｅｓｔを行い、認知機能は正常対照群の脱出時間を基準とした。
その結果、図８に示すように、脳卒中（脳梗塞）動物モデル（ＭＣＡｏ３０）の脱出孔を見つける脱出時間は、正常対照群と対比すると、約３倍増えることを確認した。前記結果は、記憶力低下が脳卒中による最も深刻な後遺症の一つであることを確認したものである。
また、シルデナフィル単独投与群とＲＯＣＫ阻害剤単独投与群の脱出時間は、すべて正常対照群の脱出時間と類似したレベルで測定され、シルデナフィルまたはＲＯＣＫ阻害を剤単独投与した場合に認知機能の低下が有意に改善されることを確認した。
また、シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤の併用投与群の脱出時間は、正常対照群の脱出時間と類似したレベルで測定されて認知機能の低下が有意に改善されることを確認し、特に一部の個体は、正常対照群と比較すると脱出時間が著しく短縮され、正常対照群の認知機能より増進された認知機能（記憶力増進）を示すことを確認した。
また、中大脳動脈閉塞後の再灌流前に薬物を投与した群より、再灌流後に薬物を投与した群の脱出時間が著しく有意に短縮され、中大脳動脈閉塞後の再灌流後の薬物投与群において認知機能の改善効果に優れていることを確認した。
前記実験結果に基づくと、中大脳動脈閉塞後の再灌流後にシルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与すると、脳卒中による認知機能の低下をさらに効果的に改善できるだけでなく、正常対照群に比べて認知機能を増進させることができることが分かる。
実施例６．シルデナフィル及びＲＯＣＫ阻害剤を併用投与した場合、神経可塑性の改善可否の確認
急性期脳卒中（脳梗塞）動物モデルであるＭＣＡｏ３０を使用し、１）シルデナフィルを中大脳動脈閉塞後の再灌流前に単独投与、２）シルデナフィルを中大脳動脈閉塞後の再灌流後に単独投与した場合において神経可塑性の改善可否を確認する実験を行い、認知機能は、正常対照群と比較した。
その結果、図９及び図１０に示すように、脳卒中モデルであるＭＣＡｏ３０は、ｆＥＰＳＰ ｓｌｏｐｅが８４．１１％に悪化することを確認した。
しかし、シルデナフィルの単独投与群のうち、中大脳動脈閉塞後の再灌流前の薬物投与群においてｆＥＰＳＰ ｓｌｏｐｅが１０２．３５％で正常対照群とほぼ同じレベルに改善され、中大脳動脈閉塞後の再灌流後の薬物投与群では、ｆＥＰＳＰ ｓｌｏｐｅが１５８．３１％に改善されることを確認した。
前記実験結果を数値で対比すると、中大脳動脈閉塞後の再灌流後の薬物投与群は、中大脳動脈閉塞後の再灌流前の薬物投与群に比べてｆＥＰＳＰ ｓｌｏｐｅが４．０６倍程度さらに改善されたところ、中大脳動脈閉塞後の再灌流後の薬物投与群において神経可塑性の改善効果が有意に向上することを確認し、前記結果は、実施例５の結果と一致する結果である。
また、前記実験結果を総合すると、脳卒中（脳梗塞）動物モデルにおいて中大脳動脈閉塞後の再灌流後シルデナフィルの単独投与療法を行う場合、脳卒中による神経可塑性減少の改善効果が最大化されることが分かる。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解できるだろう。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
本発明によれば、シルデナフィルとＲＯＣＫ阻害剤であるＧＳＫ４２９２８６Ａを併用処理することにより、前記薬物の単独処理に比べてより優れた脳組織損傷の減少、運動機能の喪失の改善、不安障害の改善または認知機能低下の改善の効果があることを確認した。そこで、前記シルデナフィルとＧＳＫ４２９２８６Ａを併用投与することにより、脳卒中の治療効果を高めるとともに、脳卒中によって患者に現れることが報告された様々な後遺症を改善させることができると思料されるところ、本発明は、脳卒中を含む各種虚血性脳血管疾患の治療に有用に利用できるものと期待される。

Claims (2)

  1. ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｔｙｐｅ ５ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と、
    ＲＯＣＫ阻害剤(Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｓｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)を含む、虚血性脳卒中（脳梗塞）の治療用薬学的組成物であって、
    前記ホスホジエステラーゼタイプ５活性阻害剤は、シルデナフィル(ｓｉｌｄｅｎａｆｉｌ）であり、
    前記ＲＯＣＫ阻害剤は、ＧＳＫ４２９２８６Ａ(Ｎ－(６－Ｆｌｕｏｒｏ－１Ｈ－ｉｎｄａｚｏｌ－５－ｙｌ)－６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏ－４－[４－(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ)である、薬学的組成物。
  2. 前記薬学的組成物は、脳血管閉塞後の再灌流前、再灌流と同時または再灌流後に投与するためのものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
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