JP7370569B2 - アミロイドβタンパク質オリゴマーと結合するヒト化抗体 - Google Patents

Description

本発明はアミロイドβタンパク質オリゴマーと結合するヒト化抗体に関する。

アルツハイマー型認知症（ＡＤ）は、認知症の最も頻繁な病態であり、今日では、世界中で４７００万人の認知症患者が存在すると推測されており、このうち約７０％をＡＤが占めている。ＡＤ患者脳の病理学的な主な特徴は、線維化した不溶性アミロイドβ（Ａβ）ペプチドからなる老人斑又はアミロイド斑と過剰にリン酸化したタウタンパク質からなる神経原線維変化沈着の形成である。ＡＤでは、神経細胞膜を貫通して局在する前駆体膜タンパク質である「アミロイド前駆体タンパク質」（ＡＰＰ）からプロテアーゼ切断によって生理的にモノマーの形態で産生されたＡβペプチドが重合し、可溶性Ａβオリゴマーを形成し、シナプス機能障害から致死的なタウカスケードへの引き金となり、認知機能障害が発症すると考えられている。最近、脳内Ａβオリゴマーやタウタンパク質の直接的なＰＥＴイメージング解析が可能となり、それぞれ脳内蓄積はＡβオリゴマーが先行する形で、認知症発症の約１５年前から始まっていることが明らかとった。

可溶性Ａβオリゴマーは、嗅内野皮質にプレクリニカルＡＤの段階から蓄積を開始し（非特許文献１）、脳内では神経細胞内に局在するが、ＡＤ患者脳では神経細胞外にもびまん性老人斑様の局在を認める（非特許文献１；非特許文献２）。細胞外の可溶性Ａβオリゴマーを制御すると、神経細胞内Ａβオリゴマーの蓄積阻止、ひいては神経細胞変性やシナプス変性阻止と記憶障害発症予防効果（非特許文献１）や記憶障害回復効果（非特許文献２）が達成されることが証明されている。

Ａβモノマーには結合せず、Ａβオリゴマーにのみに特異的に結合するヒト化抗体が報告されている（特許文献１及び２）。このヒト化抗体は、抗認知機能障害剤、アルツハイマー病治療剤、老人班形成抑制剤、及びアミロイドβアミロイド線維形成阻害剤の有効成分として使用できる。また、このヒト化抗体を用いて、被験者から採取された試料におけるＡβオリゴマーを検出することにより、被験者がＡＤ候補であるか否かの診断に役立つデータの取得が可能となる。

国際公開第２０１１／０１６５６７号 国際公開第２０１１／０１６５６８号

Ｔａｋａｍｕｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．，２０１１，６：２０ Ｔａｋａｍｕｒａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２０１２，９１：１１７７－１１８６

本発明は、Ａβモノマーには結合せず、Ａβオリゴマーにのみに特異的に結合する新たなヒト化抗体を提供することを課題とする。また、本発明は、かかる抗体を有効成分として用いて、抗認知機能障害剤、アルツハイマー病治療剤、老人班形成抑制剤、及びアミロイドβアミロイド線維形成阻害剤を提供することも課題とする。さらに、本発明は、このヒト化抗体を用いて、被験者から採取された試料におけるＡβオリゴマーを検出することにより、被験者のＡＤ診断を行う方法を提供することも課題とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意検討を行ったところ、Ａβモノマーには結合せず、Ａβオリゴマーにのみに特異的に結合するマウス抗体６Ｈ４をヒト化することにより、Ａβオリゴマーへの結合特異性が顕著に高いヒト化モノクローナル抗体が得られることを見出した。本発明はかかる知見に基づいてさらに検討を加えることにより完成したものであり、以下の態様を含む。

項１．
アミロイドβタンパク質（Ａβ）オリゴマーと結合するヒト化モノクローナル抗体であって、
ＣＤＲ１として配列番号１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号２に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、
ＣＤＲ１として配列番号４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号５に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含むヒト化モノクローナル抗体。
項２．
配列番号７に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖と、
配列番号８に記載のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含む、項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
項３．
配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する重鎖と、
配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する軽鎖と
を含む、請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
項４．
Ａβオリゴマーに選択的結合を示す、項１～３のいずれ一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。
項５．
項１～４のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、抗認知機能障害剤。
項６．
項１～４のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、アルツハイマー病治療剤。
項７．
項１～４のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、老人班形成抑制剤。
項８．
項１～４のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含有する、Ａβアミロイド線維形成阻害剤。
項９．
項１～４のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を用いて、被験者から採取された試料に含まれるＡβオリゴマーを検出する工程を含み、
Ａβオリゴマーの検出量を、基準値より多い場合にはアルツハイマー型認知症（ＡＤ）であり、基準値より少ない場合にはアルツハイマー型認知症（ＡＤ）ではない、という基準と比較することにより、前記被検者がＡＤを発症しているか否かを試験する方法。
項１０．
項９に記載の方法のために用いられる、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を含むキット。

本発明によれば、Ａβオリゴマーへの結合特異性が顕著に高いヒト化モノクローナル抗体が得られる。

Ｈ鎖可変領域ＶＨ０のアミノ酸配列、およびＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３，ＶＨ４において配列番号７で示されるアミノ酸配列から改変されたアミノ酸残基を示している。図中第１行および第２行はＨ鎖可変領域のアミノ酸番号を表し、各行におけるアルファベットは改変されたアミノ酸（１文字表記）を表している。 Ｌ鎖可変領域ＶＬ０のアミノ酸配列、およびＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４において配列番号８で示されるアミノ酸配列から改変されたアミノ酸残基を示している。図中第１行および第２行はＬ鎖可変領域のアミノ酸番号を表し、各行におけるアルファベットは改変されたアミノ酸（１文字表記）を表している。 5種類の抗体（6H4, 市販6E10, VH0VL0, VH3VL4, VH4VL3）のＡβオリゴマー選択的結合能を示したグラフである。縦軸は450nm波長の吸光度、横軸はインヒビター（inhibitor）として用いたＡβオリゴマーあるいはＡβモノマーの濃度を示している。各グラフの実線がＡβオリゴマーで、破線がＡβモノマーをインヒビターとして用いた抗体結合活性を示し、Prizm6.0(GraphPad社)でIC50値を求めＡβオリゴマー選択的結合能を提示している。 左半分はＡβオリゴマーが惹起する細胞死の6H4抗体及びそのヒト化抗体による中和活性を示したグラフである。縦軸に、培地中に放出された死細胞由来のLDHの量(Triton-X添加時との％比較)を、横軸は添加抗体を示す。右半分はＡβオリゴマーが惹起する細胞毒性による細胞ダメージを、Live/Dead二色蛍光アッセイで検討した結果を示す（左縦列は生細胞、中縦列は視細胞、右縦列は重ね画像）。横最上段はＡβオリゴマー添加なし、横第二段はＡβオリゴマー添加時、横第三段はＡβオリゴマー＋6H4、横第四段はＡβオリゴマー＋VH0VL0、横第四段はＡβオリゴマー＋VH4V。

１． 本発明のヒト化モノクローナル抗体
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）オリゴマーと結合するヒト化抗体であって、ＣＤＲ１として配列番号１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号２に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、ＣＤＲ１として配列番号４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号５に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含むヒト化モノクローナル抗体である。

本発明において、Ａβオリゴマーとはヒト由来Ａβオリゴマーを指す。

アミロイドの主要構成成分であるＡβタンパク質とは、４０～４２アミノ酸からなるペプチドで、アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ； ＡＰＰ）という前駆体タンパク質から、プロテアーゼの作用によって産生されることが知られている。ＡＰＰから生成されるアミロイド分子には、超遠心沈査画分に回収されるアミロイド線維とは別に、可溶性のモノマーに加えオリゴマーの非線維性重合体がある。本発明における「Ａβオリゴマー」とは、非線維性重合体を指すものである。

本発明における「Aβオリゴマー」には、例えばAβ40(Aβ1-40)オリゴマー、Aβ42(Aβ1-42)オリゴマー、またN末端に蛍光色素6-Carboxytetramethylrhodamine(6-TAMRA)標識したAβ40(Aβ1-40) Aβ40(Aβ1-40)をAβ40(Aβ1-40)もしくはAβ42(Aβ1-42)とともに重合反応させることにより、オリゴマーを多く含む標品（Ａβ1-40もしくはＡβ1-42オリゴマー）を調製した。電子顕微鏡で観察すると粒状から非定形分子が混在した形態が見られる。Blue Native-PAGEでは分子量13.5～720kDa(Ａβ1-42オリゴマー), 分子量13.5～1,000kDaをそれぞれ示す分子であり、Native-PAGE後のイムノブロット解析では６H4は3-merと5-merを選択的に認識する。

配列番号１～６のアミノ酸配列をそれぞれ表１に示す。

配列番号１～３は、Ａβオリゴマーに対するマウスモノクローナル抗体６Ｈ４（特許第５１１３８５３号）の重鎖のＣＤＲ１～３である。また、配列番号４～６は、Ａβオリゴマーに対するマウスモノクローナル抗体６Ｈ４の軽鎖のＣＤＲ１～３である。

本発明のヒト化モノクローナル抗体は、重鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、本発明のヒト化抗体は、重鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することがより好ましい。本発明のヒト化抗体は、重鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することがさらに好ましい。本発明のヒト化抗体は、重鎖が、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有することがもっとも好ましい。

本発明のヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖が、配列番号８に記載のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。また、本発明のヒト化抗体は、軽鎖が、配列番号８に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することがより好ましい。発明のヒト化抗体は、軽鎖が、配列番号８に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有することがさらに好ましい。本発明のヒト化抗体は、軽鎖が、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有することがもっとも好ましい。

本明細書において、２つのアミノ酸配列の同一性％は、コンピュータープログラムを用いて決定する。そのようなコンピュータープログラムとしては、本発明においてはＢＬＡＳＴを用いる。ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は適宜設定できる。

あるポリペプチドと同等の活性を有するポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法等を用いて、配列番号７及び配列番号８に記載のアミノ酸配列にそれぞれ適宜変異を導入することにより、該アミノ酸配列と同等の活性を有する重鎖及び軽鎖をそれぞれ調製することができる。

変異が導入されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、並びに芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる。アミノ酸変異が、上記の同じ群に属するアミノ酸同士の置換であれば、当該部位においては変異導入前後でアミノ酸側鎖の性質が保存されることになる。

変異が導入される好ましいアミノ酸部位は、重鎖について、配列番号７に記載のアミノ酸配列における、２、５、１０～１３、１５、１９、２３、４３、４５、４６、７２、７７、８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０及び１１７番目のアミノ酸部位が挙げられる。

変異が導入される好ましいアミノ酸部位は、軽鎖について、配列番号８に記載のアミノ酸配列における、２、３、７、４、５、７、８、４１、４４、５０、５１、７９、８６、８８、９０、１０５、１０９及び１１１番目のアミノ酸部位が挙げられる。

上述の修飾に加え、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、活性を保持している限り、他の物質にさらに連結されていてもよい。他の物質としては、例えばペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等が挙げられる。これらの修飾は、付加的な機能を付与するか、または抗体を安定化するために実施され得る。

２． 本発明のヒト化モノクローナル抗体を含む医薬
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、Ａβオリゴマーに特異的に結合する性質を有する。この性質を利用して、本発明のヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含む医薬を提供できる。

そのような医薬としては、抗認知機能障害剤、抗認知機能障害剤、老人班形成抑制剤及びＡβアミロイド線維形成阻害剤等が挙げられる。

本発明のヒト化モノクローナル抗体を医薬の有効成分として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することができる。例えば必要に応じて、水または他の任意の薬学的に許容される液体で無菌性溶液もしくは懸濁液にすることによって、非経口的に投与されうる注射可能な形態へと調製することができる。例えば、本発明のヒト化モノクローナル抗体を、許容される担体または溶媒、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤などと混合して、医薬としての使用に必要な一般に許容される単位用量にすることができる。「薬学的に許容される」という用語は、その物質が不活性であり、かつ薬物用の希釈剤またはビヒクルとして使用される従来物質を含むことを示す。

生理食塩水、グルコース、およびアジュバント（Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、および塩化ナトリウムなど）を含む他の等張性溶液を、注射用水溶液として使用することができる。これらは、アルコール、具体的にはエタノールおよびポリアルコール（例えばプロピレングリコール及びポリエチレングリコール）、ならびに非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０（商標）またはＨＣＯ－５０）などの適切な可溶化剤とともに使用することができる。

ゴマ油又はダイズ油を油性液体として用いることができ、これらと共に可溶化剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを用いてもよい。緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、鎮痛薬（塩酸プロカインなど）、安定剤（ベンジルアルコール、フェノールなど）、及び抗酸化剤を製剤に用いることができる。調製した注射液は適切なアンプルに充填することができる。

投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。

３． 本発明の試験方法
本発明の試験方法は、
本発明のヒト化モノクローナル抗体を用いて、被験者から採取された試料に含まれるＡβオリゴマーを検出する工程を含み、
Ａβオリゴマーの検出量を、基準値より多い場合にはアルツハイマー型認知症（ＡＤ）であり、基準値より少ない場合にはアルツハイマー型認知症（ＡＤ）ではない、という基準と比較することにより、前記被検者がＡＤを発症しているか否かを試験する方法である。

試料中のＡβオリゴマーの測定は、本発明のヒト化モノクローナル抗体を用いて行うことができ、具体的な手法としては、例えば、化学発光を利用するサンドイッチ固相酵素免疫アッセイ（化学発光－ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、イムノブロット、フローサイトメトリー、質量分析法、免疫組織化学法等の方法を用いることができる。

本方法においては、被験者から採取した試料と、本発明のヒト化モノクローナル抗体とを接触させる。ここで「接触」とは、例えば、試験管内における被験者から採取した試料に、上記各抗体を添加することにより行われうる。この場合において、添加される抗体の形状としては、溶液又は凍結乾燥等により得られる固体等の形状が適宜使用できる。水溶液として添加される場合にあっては本発明のヒト化モノクローナル抗体のみを含有する水溶液であってもよいし、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤及び矯味剤からなる群より選択される少なくとも一種の添加剤をさらに含む溶液であってもよい。抗体の添加する濃度は特に限定されない。例えば、ヒト免疫グロブリン製剤と同様に凍結乾燥状態で、５００ｍｇ、１０００ｍｇ、２５００ｍｇ製剤などが好適に使用されうる。

本発明の試験方法において用いる「基準値」は、ＡＤを発症しているヒト個体と、ＡＤを発症していないヒト個体とからそれぞれ十分量ずつの試料を用意し、これらの試料それぞれに含まれるＡβオリゴマー量を検出することにより設定することができる。この際、Ａβオリゴマー量は、本発明のヒト化モノクローナル抗体を用いて検出することができる。

本発明の試験方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのどちらでも行なうことが可能であるが、患者の負担がより軽減できるという点で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行なわれることが好ましい。

本発明の試験方法における「試料」とは、被験者由来の組織であれば特に制限されない。例えば被験者の脳（脳実質等）、臓器、体液（血液、脳脊髄液等）を挙げることができる。本発明において好ましくは血液（より好ましくは血漿）または脳脊髄液である。

４． 本発明のキット
本発明のキットは、本発明の試験方法のために用いられる、本発明のヒト化モノクローナル抗体を含むキットである。

本発明のキットは、本発明のヒト化モノクローナル抗体の他、本発明の試験についての手順書を含み、さらに、本発明の試験に必要な試薬及び／又は器具を含んでいてもよい。

上記手順書には、本発明の試験方法において必要な「基準値」についての記述が含まれていてもよい。そのような記述は、「基準値」を直接的に記載したものであってもよいし、「基準値」の設定方法についての説明であってもよい。

上記に加え、本発明のキットは、任意で、さらに本発明の試験方法に必要な試薬を含んでいてもよい。そのような試薬としては、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定化剤、保存剤、ブロッキング溶液、反応溶液及び反応停止液等が挙げられる。本発明のキットは、これらの試薬を単独で含んでいてもよいし、複数種を含んでいてもよい。

＜実施例１＞
抗Ａβオリゴマー抗体ヒト化抗体の作製
（１）抗Ａβオリゴマー６H４ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
始めに、IMGTとKabat [Sequences of Proteins of Immunological Internet, US Dept. Health and Human Services (1991)]の報告に基づいて、以前に作製した抗Ａβオリゴマーマウスモノクローナル抗体６H４のＶＨのアミノ酸配列（配列番号７）のＣＤＲ配列を決定した。その結果、ＶＨのＣＤＲ１～３を配列番号１～３とした。

まず、抗Ａβオリゴマー6H4マウス抗体のVHのアミノ酸配列6H4HV0およびこれと最も相同性の高いhuman germline gene(IGVH2-5)を参考に、抗Ａβオリゴマー6H4ヒト化抗体のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。 6H4VHのCDR1～3のアミノ酸配列（配列番号1～3）を移植するためのヒト抗体のVHのフレームワーク領域（FR）のアミノ酸配列をBLAST search algorithmsで得たTop 200候補から、key FRアミノ酸配列と正準ループ構造を維持できる相同性の組み合わせを考慮することで、4 acceptor frameworksを選択した。軽鎖に見合うcharge pairsへと可変領域のC末端配列に修復もしくは除去操作を加え、ヒト抗体のVHの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に、murine 6H4 VHのCDRのアミノ酸配列(配列番号1～3)を移植し、抗Ａβオリゴマー6H4ヒト化抗体のVHのアミノ酸配列6H4VH1～VH4(配列番号9～12)を設計した。

その結果、VH0VL0のFRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、6H4VH0では配列番号7で示されるアミノ酸配列の2番目のVal、5番目のLys、10番目のGly、11番目のIle、12番目のLeu、13番目のGln、15番目のSer、19番目のSer、23番目のSer、43番目のSer、45番目のGlu、46番目のGly、72番目のSer、77番目のArg、81番目のPhe、83番目のLys、84番目のIle、86番目のSer、87番目のVal、89番目のThr、90番目のAla、117番目のAlaをそれぞれ選択した。

これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも1つ以上のアミノ酸配列を6H4の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するアミノ酸配列を含むヒト化抗体のVHを設計した。

具体的には、VHについては、配列番号７で示されるアミノ酸配列の2番目のValをIleに、5番目のLysをArgに、10番目のGlyをThrもしくはAlaに、11番目のIleをLeuに、12番目のLeuをValに、13番目のGlnをLysに、15番目のSerをThrに、19番目のSerをThrに、23番目のSerをThrに、43番目のSerをProに、45番目のGluをGlnに、46番目のGlyをAlaに、および72番目のSerをThrに、77番目のArgをLysに、81番目のPheをValに、83番目のLysをThrに、84番目のIleをMetもしくはLeuに、86番目のSer->Asn, Asp、87番目のVal->Pro、89番目のThrをProに、90番目のAla->Val、117番目のAlaをSerに置換するアミノ酸改変の少なくとも１つの改変を導入した。

次に、H鎖と同様にして、VLのアミノ酸配列（配列番号8）のCDR1～3の配列を配列番号4～6と決定し、抗Aβオリゴマー6H4ヒト化抗体のVLのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。

抗Ａβオリゴマー6H4マウス抗体のVLのアミノ酸配列6H4HL0およびこれと最も相同性の高いhuman germline gene(IGKV2-29)を参考に、6H4 VLのCDR1～3のアミノ酸配列（配列番号4～6）を移植するためのヒト抗体のVLのFRのアミノ酸配列をBLAST search algorithmsで得たTop 200候補から、key FRアミノ酸配列と正準ループ構造を維持できる相同性の組み合わせを考慮することで、4 acceptor frameworksを選択した。ヒト抗体のVLの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に、murine 6H4 VLのCDRのアミノ酸配列(配列番号4～6)を移植し、配列番号Xで表される抗Ａβオリゴマー6H4ヒト化抗体のVLのアミノ酸配列6H4VL1～VL4（配列番号13～16）を設計した。

その結果、VH0VL0のFRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、6H4VL0では2番目のVal、3番目のLeu、7番目のThr、14番目のSer、15番目のLeu、17番目のAsp、18番目のGlu、41番目のThr、44番目のLys、50番目のLys、51番目のLeu、79番目のLys、86番目のGlu、88番目のLeu、90番目のVal、105番目のAla、109番目のLeu、111番目のLeuをそれぞれ選択した。

これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも1つ以上のアミノ酸配列を6H4の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するアミノ酸配列を含むヒト化抗体のVLを設計した。

具体的には、6H4VL0では2番目のValをIleに、3番目のLeuをValに、7番目のThrをSerに、14番目のSerをThrに、15番目のLeuをProに、17番目のAspをGlnもしくはGluもしくはAlaに、18番目のGluをProに、41番目のThrをPheに、44番目のLysをArgに、50番目のLysをArgもしくはGlnもしくはLysに、51番目のLeuをArgに、79番目のLysをArgに、86番目のGluをAspに、88番目のLeuをValに、90番目のValをIleに、105番目のAlaをGlnもしくはProに、109番目のLeuをValに、111番目のLeuをIleに置換するアミノ酸改変の少なくとも１つの改変を導入した。

HV0LV0のFRに存在する、少なくとも1つのアミノ酸残基を改変した抗Ａβオリゴマー6H4ヒト化抗体の抗体V領域として、VH0VL0、VH1VL1、VH1VL2、VH1VL3,VH1VL4、VH2VL1,VH2VL2,VH2VL3,VH2VL4, VH3VL1,VH3VL2,]VH3VL3,VH3VL4, VH4VL1,VH4VL2、VH4VL3,VH4VL4をそれぞれ設計した。

Ｈ鎖可変領域VH0、VH1、VH2、VH3、VH4およびＬ鎖可変領域VL0、VL1、VL2、VL3、VL4のアミノ酸配列をそれぞれ図１および図２に示した。

（２）抗Ａβオリゴマーヒト化抗体の作製
抗Ａβオリゴマーヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードするDNAは、6H4VHおよび6H4VLのアミノ酸配列をコードするDNA（配列番号17、18）で用いられているコドンを利用し、アミノ酸改変を行う場合は、哺乳動物細胞において高頻度で使用されるコドンを用いて、作製した。

抗Ａβオリゴマー6H4ヒト化抗体の6H4VH0および6H4VL0のアミノ酸配列をコードするDNA配列を配列番号17、18にそれぞれ示す。また、アミノ酸改変を行った可変領域の作製には、6H4VHおよび6H4VLのアミノ酸配列をコードするDNAで用いられているコドンを利用し、作製した。

これらDNA配列を用いて、ヒト化抗体の発現ベクターの構築およびヒト化抗体の発現をそれぞれ行った。

（３）抗Ａβオリゴマーヒト化抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
上記（１）で設計した配列番号7に表される抗Ａβオリゴマーヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列６H４ＶH０、および上記（２）の方法により設計した図１に示されるVH1、VH2、VH3、VH4をコードするｃＤＮＡを全合成にて作成した。

（４）抗Ａβオリゴマーヒト化抗体のVＬをコードするｃＤＮＡの構築
上記（１）で設計した配列番号8に表される抗Ａβオリゴマーヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列6H4VL0、および上記（２）の方法により設計した図２に示されるVL1、VL2、VL3、VL4をコードするｃＤＮＡを全合成にて作成した。

（５）抗Ａβオリゴマーヒト化抗体発現ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターｐVITRO-DHFR3の適当な位置に上記（３）および（４）で得られた6H4VH0またはVH1、VH2、VH3、VH4をコードするcDNA、並びに6H4VL0、VL1、VL2、VL3、VL4のいずれか１つをコードするcDNAを挿入し、各種抗Ａβオリゴマーヒト化抗体発現ベクターを構築した。

（６）動物細胞を用いた抗Ａβオリゴマーヒト化抗体の発現
上記（５）で得られた抗Ａβオリゴマーヒト化抗体発現ベクターを用いて抗Ａβオリゴマーヒト化抗体の動物細胞での発現を、常法[Antibody Engineering, A Practical Guide, W.H. Freeman and Company(1992)]により行い、抗Ａβオリゴマーキメラ抗体（VH0VL0）と抗Ａβオリゴマーヒト化抗体（VH1VL1、VH1VL2、VH1VL3,VH1VL4、VH2VL1,VH2VL2,VH2VL3,VH2VL4, VH3VL1,VH3VL2,]VH3VL3,VH3VL4, VH4VL1,VH4VL2、VH4VL3,VH4VL4）を産生する形質転換株を取得した。

（７）精製抗Ａβオリゴマーヒト化抗体取得
本実施例（６）で得られた形質転換株を、CHO-S細胞を用いて通常の培養法で培養した後、培養上清を回収し、Protein A精製でIgG1抗Ａβオリゴマーヒト化抗体画分を取得し、透析後蛋白濃度を測定した。

その結果、抗体のＶＨが６H４ＶH０、ＶＬが６H４ＶL０からなる抗Ａβオリゴマーヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ０、抗体のＶＨが６H４ＨＶ０、ＶＬがＬＶ２aからなるＨＶ０ＬＶ２a、抗体のＶＨが６H４ＶH０、ＶＬがＶL４からなるＶH０ＶL４、および抗体のＶＨがＶH１２、ＶＬがＶL４からなるＶH１２ＶL４の１７種類を作製した。

＜実施例2＞ Inhibition ELISA
このアッセイ法に用いたＡβオリゴマーは合成Ａβ1-40(HCl form)をPBSにより0.1mg/mlの濃度に希釈し37℃で1時間保温することで調整した。Ａβモノマーは合成Ａβ1-40(TFA form)をPBSにより0.1mg/mlの濃度に希釈し37℃で1時間保温することで調整した。まず、96well-immunoplateにＡβオリゴマー400ng/wellを固相化し、続いてBSAを用いてブロッキングを行った。ヒト化抗体及び6H4抗体及びコントロールとして抗Ａβ抗体(6E10)を100pg/ml～100μg/mlの範囲で段階希釈したＡβモノマーあるいはＡβオリゴマーをそれぞれ混合し２時間保温後、上記96well-immunoplateにそれぞれ添加し室温にて１０分間保温した。固相化Ａβオリゴマーと各抗体の結合力は、HRP標識抗マウスもしくは抗ヒトIgG抗体とTMB溶液を用いた発色反応を450nmの吸光度を測定することで検出した。

この方法を用いて、6H4抗体と17種類の抗Ａβオリゴマーヒト化抗体（VH0VL0、VH1VL1、VH1VL2、VH1VL3,VH1VL4、VH2VL1、VH2VL2、VH2VL3、VH2VL4、VH3VL1、VH3VL2、VH3VL3、VH3VL4、VH4VL1、VH4VL2、VH4VL3、VH4VL4）のＡβオリゴマー選択的結合能を調べるために、各抗体と段階希釈したＡβオリゴマーあるいはＡβモノマー（inhibitor）を事前に混合した溶液をＡβオリゴマー固相済み96-well-immunoplateに加えて反応させた。またＡβオリゴマー及びＡβモノマーと区別なく結合するコントロール抗体として市販の6E10抗体を用いた。抗体がＡβオリゴマーと選択的に結合する場合、Ａβモノマーと事前に混合した抗体は溶液中のＡβモノマーには吸収されないため固相化Ａβオリゴマーと結合できる。逆にＡβオリゴマーと事前に混合した抗体は溶液中のＡβオリゴマーに吸収されるため濃度が高くなるにしたがって固相化Ａβオリゴマーへの結合力が低下する。結果、すべてのヒト化抗体においてＡβオリゴマーで濃度依存的な抗体結合力の低下が検出されたのに対し、ＡβモノマーではＡβオリゴマーほどの大きな結合力の低下は検出されなかった(図３左グラフ参照)。一方で一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単なるヒト抗体のＦＲへのマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまうことが多いが本ケースも同様でVHOLVOのIC50は6H4に比し低下が認められた。VH3VL4とVH4VL3では結合活性が著明に改善できていた(図３右表参照)。これらの結果は、VH0VL同様に、２種類の抗体(VH3VL4, VH4VL3) はＡβオリゴマーに選択的に結合する抗体であることを示唆しており、市販コントロール6E10とは異なり、抗Ａβオリゴマーマウス抗体6H4と同様にＡβオリゴマーへの特異的選択的結合能を示すことが明らかとなった (図3参照) 。

＜実施例3＞ Ａβオリゴマー誘発性神経毒性中和活性
また、6H4抗体及びそのヒト化抗体（VH0VL0と、そのキメラ抗体に劣るKd値の一つであるヒト化抗体VH1VL4、ほぼ同等のKd値である５種類のVH2VL3、VH2VL4、VH3VL1、VH3VL2とVH4VL1、一方で勝るKd値である２種類のVH3VL4とVH4VL3のＡβオリゴマー誘発性神経毒性中和活性は以下の方法を用いて評価した。まず、ヒト神経芽種細胞(SH-SY5Y) を24well plateに15,000個/wellの密度で10%FBSを含むDMEM中で24時間培養した。次に、培地を抗体添加または無添加のＡβ1-42(37.5μg 12.5μM)+Tamura標識Ａβ1-40(12.5μg 12.5μM) を含む血清不含培地に置き換えてさらに24時間培養した。Ａβオリゴマーが惹起する細胞死は、培地中に放出された死細胞由来のLDHの量をCytoTox96キット(Promega社製) により測定した（図4左半参照）。Ａβオリゴマーが惹起する細胞毒性は、Live/Dead二色蛍光アッセイを製造元の指示(Molecular Probes, Eugene, Oregon) に従って評価した（図4右半参照：代表例として6H4, VH0VL, VH4VL3を提示）。

配列番号１；ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２；ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号３；ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４；ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号５；ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号６；ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７；6H4VH0のアミノ酸配列
配列番号８；6H4VL0のアミノ酸配列
配列番号９；6H4VH1のアミノ酸配列
配列番号１０；6H4VH2のアミノ酸配列
配列番号１１；6H4VH3のアミノ酸配列
配列番号１２；6H4VH4のアミノ酸配列
配列番号１３；6H4VL1のアミノ酸配列
配列番号１４；6H4VL2のアミノ酸配列
配列番号１５；6H4VL3のアミノ酸配列
配列番号１６；6H4VL4のアミノ酸配列
配列番号１７；6H4VH０をコードするDNA配列
配列番号１８；6H4VL0をコードするDNA配列

Claims (8)

1. アミロイドβタンパク質（Aβ）オリゴマーと特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体であって、
   ＣＤＲ１として配列番号１に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号２に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、 ＣＤＲ１として配列番号４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号５に記載のアミノ酸配列、及びＣＤＲ３として配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含み、
   （Ａ） 配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、
   配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖と
   を含む、又は
   （Ｂ） 配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖と、
   配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖と
   を含む、
   ヒト化モノクローナル抗体。
2. Ａβオリゴマーに選択的結合を示す、請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
3. 請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含有する、抗認知機能障害剤。
4. 請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含有する、アルツハイマー病治療剤。
5. 請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含有する、老人班形成抑制剤。
6. 請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体を有効成分として含有する、Ａβアミロイド線維形成阻害剤。
7. 請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体を用いて、被験者から採取された試料に含まれるＡβオリゴマーを検出する工程を含み、
   Ａβオリゴマーの検出量を、基準値より多い場合にはアルツハイマー型認知症（ＡＤ）であり、基準値より少ない場合にはアルツハイマー型認知症（ＡＤ）ではない、という基準と比較することにより、前記被検者がＡＤを発症しているか否かを試験する方法。
8. 請求項７に記載の方法のために用いられる、請求項１又は２に記載のヒト化モノクローナル抗体を含むキット。