JP7369991B2 - ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用化合物のスクリーニング方法、および、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用医薬組成物 - Google Patents

Description

本出願の開示は、ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用化合物のスクリーニング方法、および、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用医薬組成物に関する。

Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病（Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ ｄｉｓｅａｓｅ、以下「ＤＤＤ」と記載することがある。）は、頚部、腋窩や鼠径部等の皮膚が擦れ易い部分に網目状に色素沈着を生じさせる常染色体優性遺伝形式の遺伝性皮膚疾患である。ＤＤＤは生命にかかわる重篤な症状は引き起こさないが、見た目の問題から患者に精神的な負担が生じる。ＤＤＤの原因遺伝子は、２００６年に報告されたＫＲＴ５に続き、２０１３年にタンパク質の糖鎖修飾を行うＰｏｆｕｔ１が原因遺伝子として報告された。

上記のとおり、ＤＤＤに関する報告はあるものの、ＤＤＤの病態は未だに明らかではなく、現在のところ有効な治療方法もない。疾患治療の研究には、当該疾患を有したマウス等のモデル動物を作製し、当該モデル動物を用いて疾患の病態を調べたり、当該モデル動物に被験化合物を投与し、治療用化合物をスクリーニングすることが、一般的に行われている。Ｐｏｆｕｔ１遺伝子に関しても、ノックアウトマウスは知られている（非特許文献１参照）。

Ｏｋａｍｕｒａ Ｙｏｓｈｉａｋｉ ｅｔ ａｌ．，"Ｐｏｆｕｔ１ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｐｅｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｔｃｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｕｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ"， Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ． １２５（８）：６６３－７３， ２００８．

上記非特許文献１に記載のとおり、Ｐｏｆｕｔ１遺伝子をノックアウトしたマウスは知られている。しかしながら、非特許文献１に記載のＰｏｆｕｔ１ノックアウトマウスは、マウスでのＰｏｆｕｔ１の働き、特に心循環器系の発生の解析を目的として作製されたものである。そして、非特許文献１に記載のＰｏｆｕｔ１ノックアウトマウスは、Ｐｏｆｕｔ１遺伝子をノックアウトしているものの、（１）表現型として毛色に変化はなく、皮膚にも色素斑を示さない、（２）皮膚病であるＤＤＤの治療効果を確認する際に邪魔となる体毛を有する、という問題がある。

本出願の開示は、上記問題点を解決するためになされたものであり、鋭意研究を行ったところ、（１）Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスと、ヘアレスマウスを交配すると、（２）色素斑を形成することができ、且つ、体毛を有しない（ヘアレス）ノックアウトマウスを作製できること、（３）その結果、ＤＤＤの病態研究に用いたり、ＤＤＤ治療用化合物のスクリーニング方法に使用できること、を新たに見出した。

すなわち、本出願の開示の目的は、ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用化合物のスクリーニング方法、および、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用医薬組成物を提供することである。

本出願の開示は、以下に示す、ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用化合物のスクリーニング方法、および、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用医薬組成物に関する。

（１）Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスと、ヘアレスマウスを交配して得られた、ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス。
（２）前記ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合性ノックアウトマウスが、色素斑を形成する表現型を示す、
上記（１）に記載のヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス。
（３）上記（１）または（２）に記載のヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスに被験化合物を投与する工程と、
色素斑を抑制する被験化合物を選択する被験化合物選択工程と、
を含む、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用化合物のスクリーニング方法。
（４）フコースを有効成分として含む、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用医薬組成物。

本出願で開示するヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスは、ＤＤＤの新たなモデル動物である。したがって、ＤＤＤ治療用化合物のスクリーニング方法等に用いることができる。

図１は図面代用写真で、図１Ａは実施例１で作製したＤＤＤモデルマウスの写真、図１ＢはＤＤＤモデルマウスの作製に用いたヘアレスマウスの写真である。 図２は図面代用写真で、図２Ａは実施例１で作製したＤＤＤモデルマウスの色素斑の病理組織写真、図２Ｂはヘアレスマウス（コントロール）の皮膚の病理組織写真である。 図３は図面代用写真で、実施例２において、図３ＡはＤＤＤモデルマウスにＤＤＤ医薬組成物を外用する前の写真、図３ＢはＤＤＤ医薬組成物を８週間外用後の写真である。 図４は、図３Ａおよび図３Ｂに示す任意に設定した５カ所について、画像解析ソフトウエアのＩｍａｇｅＪで皮疹部分の色調を解析した結果を示すグラフである。 図５は図面代用写真で、実施例２において、図５ＡはＤＤＤ医薬組成物を外用前のＤＤＤモデルマウスの色素斑の病理組織写真、図５ＢはＤＤＤ医薬組成物を外用した後のＤＤＤモデルマウスの色素斑の病理組織写真である。 図６は、実施例２において、ＤＤＤ医薬組成物がヒト角化細胞の増殖を抑制することを示すグラフである。

以下に、本出願で開示するヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス（以下、「ＤＤＤモデルマウス」と記載することもある。）、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用化合物のスクリーニング方法（以下、単に「スクリーニング方法」と記載することもある。）、および、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用医薬組成物（以下、「ＤＤＤ医薬組成物」と記載することもある。）について、詳しく説明する。

（ＤＤＤモデルマウスの実施形態）
先ず、ＤＤＤモデルマウスについて説明する。ＤＤＤモデルマウスは、Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスと、ヘアレスマウスを交配することで得られる。Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスは公知の方法で作製すればよく、例えば、以下の手順で作製すればよい。
（ａ）ノックアウトする遺伝子（Ｐｏｆｕｔ１）をマウスのゲノムから分離する。そして、その遺伝子と周辺部分を含む塩基配列を創り出すが、全く同じではなく、不活性化するように一部変更する。一般的には、観察可能な差異（色や蛍光など）をもたらすマーカー遺伝子を組み込むことで、一部変更を行う。
（ｂ）マウスの胚盤胞（初期のマウスの胚であり、球状の未分化細胞が胚体外細胞に囲まれている）由来の胚性幹細胞を分離する。胚性幹細胞は、例えば、白色マウスの胚性幹細胞を用い、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞培養ができる。
（ｃ）上記（ｂ）で得られた胚性幹細胞に、上記（ａ）で作製した塩基配列を、電気穿孔法等の手段を用いて遺伝子導入する。次に、上記（ａ）で組み入れたマーカー遺伝子を利用し、実際に新しい塩基配列へ組換えを起こした胚性幹細胞（ヘテロ接合型）を分離する。
（ｄ）上記（ｃ）で分離した相同組換えを起こした胚性幹細胞を、例えば、グレー色のマウスの胚盤胞に注入し、当該胚盤胞は雌マウスの子宮に注入され、子マウスが出産される。この子マウスは、体の一部がオリジナルの胚盤胞に由来し、他の部分は遺伝子操作された細胞に由来する２つの細胞を含んだキメラになる。そのため、毛色は白とグレーのまだらになる。
（ｅ）新たに生まれたマウスのうち、生殖細胞（卵子もしくは精子）が、遺伝子操作された細胞由来のものだけが利用される。これらのマウスを白色マウスと掛け合わせると、全身が白色の、機能的な遺伝子を１個以上持っている（ヘテロ接合型）のＤＤＤモデルマウスが得られる。

ＤＤＤモデルマウスは、上記の手順や非特許文献１に記載の手順にしたがって作製してもよいし、例えば、国立遺伝学研究所等の機関から入手したものを用いてもよい。

ヘアレスマウスも、公知のヘアレスマウスを用いればよい。なお、ヘアレスマウスは、Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスと交配することで、ＤＤＤモデルマウスが得られれば特に制限はないが、本出願で開示するＤＤＤモデルマウスは、（１）体毛がない、および、（２）色素斑が形成される、という表現型以外は健康なマウスが好ましい。したがって、免疫系が阻害されたヘアレスマウス（ヌードマウス）より、ヘアレス（Ｈｒ）遺伝子がノックアウトされたことにより、体毛の無いヘアレスマウスの方が望ましい。ヘアレスマウスは、上記の手順により、ヘアレス遺伝子をノックアウトすることで作製してもよいし、研究機関等から入手したものを用いてもよい。

Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスと、ヘアレスマウスとの交配は、一般的な手順で行えばよい。交配により、ヘアレス遺伝子がノックアウトされ、且つ、Ｐｏｆｕｔ１遺伝子がヘテロ接合型（Ｐｏｆｕｔ１^wt/ko）にノックアウトされた新規な遺伝子型のＤＤＤモデルマウスが得られる。なお、得られたＤＤＤモデルマウスは、（１）体毛が無い、および、（２）色素斑を形成する、という表現型を示すが、表現型は生後直ぐに示される必要はなく、例えば、色素斑は所定時間育成後に、形成されればよい。なお、以上の説明は、実験動物として一般的に用いられるマウスの例を示したが、ラットやウサギ等、他の動物であってもよい。

（スクリーニング方法の実施形態）
スクリーニング方法の実施形態は、
・ＤＤＤモデルマウスに被験化合物を投与する工程と、
・色素斑を抑制する被験化合物を選択する被験化合物選択工程と、
を含む。

被験化合物としては、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、抗体、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等を挙げることができる。

ＤＤＤモデルマウスへの被験化合物の投与は、経口投与、皮膚への貼着、又は注射等による体内投与等、ＤＤＤモデルマウスの体内に取り込まれる方法であれば特に制限は無い。そして、投与した被験化合物により、ＤＤＤモデルマウスの皮膚に形成された色素斑が少なくなる（色素が薄くなる）か否かを判定することで、色素斑を抑制する化合物を選択すればよい。

（ＤＤＤ医薬組成物の実施形態）
ＤＤＤ医薬組成物は、ＤＤＤの治療に有効となる成分を含んでいれば特に制限はない。ＤＤＤ医薬組成物の剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、粉剤、ロゼンジ、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ、エアロゾル剤(固形としてまたは液体媒質中)、軟膏剤、ゼラチン軟および硬カプセル剤、座剤、滅菌注射用溶液および滅菌封入粉剤等が挙げられる。

また、ＤＤＤ医薬組成物は、担体、賦型剤、希釈剤を含んでいてもよい。例えば、ラクトース、デキストロース、シュクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ガムアカシア、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル－およびプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が挙げられる。更に、ビタミン、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、保存剤、甘味剤または着香剤を加えてもよい。また、ＤＤＤ医薬組成物を公知の薬剤と組み合わせてもよい。

以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。

＜実施例１＞
［ＤＤＤモデルマウスの作製］
Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスは、国立遺伝学研究所から入手した。なお、本実施例では、全身でＰｏｆｕｔ１遺伝子がノックアウトされた“Ｐｏｆｕｔ１ ｎｕｌｌ ｍｏｕｓｅ”を用いた。また、ヘアレスマウスは、星野試験動物飼育所から入手した“Ｈｏｓ：ＨＲＭ－２”を用いた。入手したＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス、および、ヘアレスマウスを常法により交配、飼育することで、ＤＤＤモデルマウスを作製した。図１Ａは、約８カ月飼育後のＤＤＤモデルマウスの写真である。また、図１Ｂは交配に用いたヘアレスマウスの写真である。

ヒトでは、Ｐｏｆｕｔ１遺伝子がヘテロ接合型でノックアウトされると、ＤＤＤが発症すると言われている。しかしながら、Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスは、Ｐｏｆｕｔ１遺伝子をノックアウトしているにもかかわらず、毛を剃っても色素斑は確認できなかった。一方、実施例１で作製したＤＤＤモデルマウスは、図１Ａの矢印に示すように色素斑の形成が確認された。以上の結果から、Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスとヘアレスマウスを交配することで、Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスを単にヘアレス化したという表現型を示すのみでなく、色素斑が形成できるという予期し得ない表現型を示す新規のマウスを作製することができた。

［皮膚の色素細胞の確認］
次に、実施例１で作製したＤＤＤモデルマウスと、ヘアレスマウスの皮膚の色素細胞を調べた。皮膚サンプルは、以下の手順で準備した。
（ａ）ＤＤＤモデルマウスの背部の色素斑と、コントロールであるヘアレスマウスの同じ位置（正常皮膚）からパンチ生検にて皮膚を採取した。
（ｂ）採取した皮膚は５％パラホルムアルデヒドにて固定し、パラフィン包埋、４μｍの厚さでスライドガラスに載せた未染標本を作製した。
（ｃ）未染標本をヘマトキシリン・エオジン染色して観察した。

図２Ａは実施例１で作製したＤＤＤモデルマウスの色素斑の病理組織写真で、写真中の矢印で示す周囲に隙間がある（核の周囲が透明な）細胞が色素細胞である。図２Ｂはヘアレスマウス（コントロール）の皮膚の病理組織写真で、矢印（黒色）は色素細胞を示している。図２Ａおよび図２Ｂに示すとおり、実施例１で作製した色素斑が形成されたＤＤＤモデルマウスの色素斑部では、比較対象であるヘアレスマウスより、表皮基底層の色素細胞の数が多いこと、および、色素細胞の密度が高い部分と低い部分のばらつきがあることを確認した。また、ＤＤＤモデルマウス表皮は、ヘアレスマウスの表皮と比較して、肥厚していた。

＜実施例２＞
［ＤＤＤ医薬組成物の効果確認］
（１）医薬組成物の調整
０．５ｇのフコース（ｆｕｃｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と、５ｍＬのｄｄｗ（二回蒸留水）を混合することで、１０％フコース溶液を作製した。なお、ＤＤＤモデルマウスにフコースを塗付する際には、０．１６ｇの親水クリーム（日興製薬社製、親水クリーム「ニッコー」）と、４０μＬの１０％フコース溶液を混合することで、２％フコースクリームを用事調整し、実施例２のＤＤＤ医薬組成物を作製した。
（２）ＤＤＤ医薬組成物の外用
ＤＤＤモデルマウスの背部にみられる色素斑部のおよそ４平方センチメートルに、用事調整したＤＤＤ医薬組成物を０．２ｇ、１日１回、１週間に５日間外用し、８週間後に評価した。

（３）目視による効果確認
図３ＡはＤＤＤ医薬組成物を外用前の写真、図３Ｂは８週間外用後の写真である。なお写真中の５カ所の□は、任意に設定した対比部分である。図３Ａおよび図３Ｂに示す写真から明らかなように、ＤＤＤ医薬組成物を８週間外用後は、目視で色素斑の減少が確認できた。

（４）画像解析による効果確認
図３Ａおよび図３Ｂに示す任意に設定した５カ所について、画像解析ソフトウエアのＩｍａｇｅＪで皮疹部分の色調を解析した。具体的には、ＤＤＤ医薬組成物の外用前と外用後で、撮像したカラー写真をグレイスケールに変換し、ＩｍａｇｅＪで白を２５６、黒を１として明暗を定量した。１点は２０１ｘ２０１ポイントの面積の平均値とした。図４は、ＩｍａｇｅＪによる解析結果を示すグラフである。任意に設定した５カ所とも、ＤＤＤ医薬組成物の外用後の値が大きくなったことから、ＤＤＤ医薬組成物の外用により、色素斑が薄くなったことを、画像解析からも確認できた。また、設定した５カ所点の数値をｐａｉｒｅｄ ｔ－ｔｅｓｔで検定したところ、ｐ＝０．００６であった。したがって、ＤＤＤ医薬組成物の外用により、色素斑が有意に改善したことを確認した。

（５）切片による効果確認
次に、ＤＤＤ医薬組成物の外用前と外用後の皮膚切片を、上記［皮膚の色素細胞の確認］と同様の手順で作製した。図５ＡはＤＤＤ医薬組成物の外用前のＤＤＤモデルマウスの色素斑の病理組織写真、図５ＢはＤＤＤ医薬組成物の外用後のＤＤＤモデルマウスの色素斑の病理組織写真である。図５Ａおよび図５Ｂを対比すると、ＤＤＤ医薬組成物の外用前は、色素細胞（写真の矢印）の数が多く、且つ、色素細胞の分布にばらつきがあった。一方、ＤＤＤ医薬組成物の外用後は、色素細胞の数が少なくなるとともに、高密度に分布する箇所がなくなった。以上の結果より、ＤＤＤ医薬組成物の外用により、色素斑が有意に改善したことを、病理組織写真による色素細胞の観察からも確認した。

以上の結果より、フコースがＤＤＤの治療に有用であることを確認した。また、実施例で作製したＤＤＤモデルマウスは、ＤＤＤ治療用化合物のスクリーニング方法に使用できることを確認した。

（６）ヒト角化細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖抑制の確認
上記のとおり、実施例２に示すＤＤＤ医薬組成物は、ＤＤＤモデルマウスの色素斑を有意に改善することを確認したが、ＤＤＤ医薬組成物のヒトへの影響を調べるため、以下の手順により、ヒト細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏの実験も行った。
（ａ）ヒト角化細胞には、ＨａＣａＴ細胞（Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ社製）を用いた。ＤＤＤ患者では病変部の表皮の増殖による表皮の肥厚が著しい。つまり、表皮を構成する細胞である角化細胞の増殖抑制は、治療効果の1つとして有用であると考えられる。ＨａＣａＴ細胞は、成人男性皮膚から樹立された不死化角化細胞あり、フコースによりＨａＣａＴ細胞の増殖抑制が示されたことから、ヒトへの外用により、患者の病変部の表皮肥厚が抑制され、皮膚の正常化が望める可能性がある。
（ｂ）９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに、１５００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでＨａＣａＴ細胞を常法により２４時間培養した。ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｆｕｃｏｓｅは１０μｇ／ｍＬの濃度で、ｈｉｇｈ ｄｏｓｅ ｆｕｃｏｓｅは１００μｇ／ｍＬの濃度で、培地に加えて、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）（同仁化学研究所製）を取扱説明書に沿って使用して、増殖能を定量化した。
（ｃ）図６は、増殖能の測定結果を示すグラフである。図６に示すように、実施例２に示すＤＤＤ医薬組成物は、ヒトの表皮細胞の増殖能を抑制することを確認した。

本出願で開示するＤＤＤモデルマウスは、ヘアレスで且つ色素斑を形成するという表現型を示すことから、ＤＤＤの病態の解明やＤＤＤ治療用の化合物のスクリーニングに用いることができる。したがって、大学、医療機関、製薬会社等におけるＤＤＤの治療用化合物の開発に有用である。

Claims (3)

1. Ｐｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスと、ヘアレス遺伝子がノックアウトされたマウスを交配して得られた、ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス。
2. 前記ヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合性ノックアウトマウスが、色素斑を形成する表現型を示す、
   請求項１に記載のヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウス。
3. 請求項１または２に記載のヘアレスＰｏｆｕｔ１ヘテロ接合型ノックアウトマウスに被験化合物を投与する工程と、
   色素斑を抑制する被験化合物を選択する被験化合物選択工程と、
   を含む、Ｄｏｗｌｉｎｇ－Ｄｅｇｏｓ病治療用化合物のスクリーニング方法。