JP7363390B2 - 細胞凝集塊分散装置および細胞凝集塊分散方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞凝集塊分散装置および細胞凝集塊分散方法に関する。

細胞培養の過程で行われる細胞凝集塊の分散作業は、作業者ごとの技術の差が顕著に影響する作業であることが知られている。細胞凝集塊の分散作業とは、細胞凝集塊に対し、狭い隙間を通過させることにより、細胞凝集塊を構成する細胞同士を引き剥がし、細胞凝集塊を１個～１０個程度の単一細胞、または小さな細胞凝集塊に分散させる作業である。細胞凝集塊を通過させる隙間は、ピペットをマイクロチューブ内に挿入し、その先端をマイクロチューブの底面に密着させたときに、ピペットの先端とマイクロチューブの底面との間に形成される。ピペットの挿入角度、ピペットを密着させる力の正確性については、作業者ごとの技術に大きく依存しており、形成される隙間の大きさ、ひいては、細胞凝集塊の分散効率が、作業者ごとにばらついてしまうことが問題となっている。培養細胞の品質を安定化させる上で、このような細胞凝集塊の分散作業については、オートメーション化することが求められている。細胞凝集塊の分散のオートメーション化に関する技術については、特許文献１～特許文献３等に開示されている。

米国特許出願公開第２０１８／００８０００２号明細書 米国特許出願公開第２０１７／０１５９００３号明細書 米国特許出願公開第２０１７／０１９１０１９号明細書

ピペット先端の消耗等により、ピペットの先端と収容槽の底面との距離が変化している場合があり、その場合には、変化に応じてピペットの押し付けの位置を微調整する必要がある。しかしながら、この微調整を、オートメーション化した細胞凝集塊の分散作業の過程で行うことは難しく、細胞凝集塊の分散作業については手動で行わざるを得ないため、細胞凝集塊の分散効率が低くなってしまう。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞凝集塊を高い効率で安定して分散することを可能とする、細胞凝集塊分散装置、細胞凝集塊分散方法、および細胞凝集塊回収方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明は以下の手段を採用している。

（１）本発明の一態様に係る細胞凝集塊分散装置は、細胞凝集塊が含まれた液体を収容する収容槽と、前記収容槽の内底面に先端を押し付けるピペットと、前記収容槽の外底面を支持する弾性体と、を備えている。

（２）前記（１）に記載の細胞凝集塊分散装置において、前記弾性体が、前記ピペットの押し付け方向と平行な方向に、伸縮するように配置されたばねであり、前記ばねの一端が、前記収容槽の外底面に固定されていてもよい。

（３）前記（１）に記載の細胞凝集塊分散装置において、前記弾性体が、一方の側に前記収容槽を支持する第一支持部材と、前記ピペットの押し付け方向と平行な方向に、伸縮するように配置されたばねと、を備え、前記ばねの一端が、前記第一支持部材の他方の側に固定されていてもよい。

（４）前記（１）～（３）のいずれか一つに記載の細胞凝集塊分散装置において、前記弾性体が、前記ばねの他端を固定するとともに、前記ばねを支持する第二支持部材を、さらに備えていてもよい。

（５）前記（１）～（４）のいずれか一つに記載の細胞凝集塊分散装置において、前記ピペットが、前記先端に近づくにつれて細くなっていることが好ましい。

（６）前記（１）～（５）のいずれか一つに記載の細胞凝集塊分散装置において、前記収容槽の底部のうち、前記ピペットの先端を押し付ける部分が、前記弾性体側に凹んでいることが好ましい。

（７）前記（１）～（６）のいずれか一つに記載の細胞凝集塊分散装置において、前記収容槽が、前記底部側が閉口され、前記底部と反対側に延在するように立設された、一本以上のチューブであってもよい。

（８）前記（７）に記載の細胞凝集塊分散装置において、前記チューブの外周部を囲むガイド部材を、さらに備えていることが好ましい。

（９）本発明の一態様に係る細胞凝集塊分散方法は、前記（１）～（８）のいずれか一つに記載の細胞凝集塊分散装置を用いた細胞凝集塊分散方法であって、前記収容槽に、細胞凝集塊が含まれた液体を収容する液体収容工程と、前記収容槽の内底面に、前記ピペットの先端を押し付けるピペット押し付け工程と、前記ピペットの先端を、前記収容槽の内底面から引き離すピペット引き離し工程と、を有する。
（１０）前記（９）に記載の細胞凝集塊分散方法において、前記ピペット押し付け工程と、前記ピペット引き離し工程と、を交互に５０回以上繰り返すことが好ましい。

本発明の細胞凝集塊分散装置は、収容槽が弾性体によって支持されており、ピペットの押し付けの力が強過ぎた場合であっても、その力の一部を弾性体が吸収する。そのため、収容槽の底部に過大な圧力が加わるのを防ぐことができ、圧力によって収容槽の底部が破損するのを防ぐことができる。収容槽の底部が破損する虞がなく、ピペットの押し付けの力を加減する必要がないため、底部に完全に密着するまでピペットを押し付けることができ、押し付けが不十分であるような問題を回避することができる。したがって、ピペット先端の消耗等により、ピペットの先端と収容槽の底面との距離が変化している場合であっても、変化に応じてピペットの押し付けの位置調整を行う必要がないため、ピペット操作を自動で行うことが可能となる。自動化によって、ピペットを押し付ける力の大きさ、向き等が均一化されるため、細胞凝集塊を、高い効率で安定して、単体の細胞に分散させることができる。

（ａ）本発明の第一実施形態に係る細胞凝集塊分散装置の斜視図である。（ｂ）（ａ）の細胞凝集塊分散装置の一部を拡大した図である。 本発明の第一実施形態に係る細胞凝集塊方法について説明する図である。 本発明の第二実施形態に係る細胞凝集塊分散装置の斜視図である。 本発明の第三実施形態に係る細胞凝集塊分散装置の斜視図である。 （ａ）～（ｈ）細胞凝集塊の分散状態を示す画像である。 分散過程における細胞凝集塊のサイズ変化を示すグラフである。 分散過程における細胞凝集塊の細胞の数の変化を示すグラフである。

以下、本発明を適用した実施形態に係る細胞凝集塊分散装置および細胞凝集塊分散方法について、図面を用いて詳細に説明する。なお、以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために、便宜上特徴となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などが実際と同じであるとは限らない。また、以下の説明において例示される材料、寸法等は一例であって、本発明はそれらに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することが可能である。

＜第一実施形態＞
図１（ａ）は、本発明の第一実施形態に係る細胞凝集塊分散装置１００の構成を模式的に示す斜視図である。図１（ｂ）は、図１（ａ）の細胞凝集塊分散装置１００のうち、一点鎖線で囲まれる領域Ｒを拡大した図である。細胞凝集塊分散装置１００は、収容槽１０１と、ピペット１０２と、弾性体１０３と、を備えている。

収容槽１０１は、細胞凝集塊が含まれた液体Ｌを収容する容器である。収容槽１０１としては、細胞凝集塊に対するピペット１０２の押し付け効果を高める上で、底面積が小さいマイクロチューブを用いることが好ましい。ここでは、底部側が閉口され、底部１０１ａと反対側（上側）に延在するように立設されたマイクロチューブを複数本用いる場合について例示している。

収容槽１０１の底部のうち、ピペットの先端１０２ａを押し付ける部分が、弾性体１０３側に凹んでいることが好ましい。この場合、ピペットの先端１０２ａを凹んでいる部分（凹部）に挿入することができ、凹部の側壁に支持されることになるため、ピペット１０２を押し付ける角度の安定性を高めることができる。

ピペット１０２は、その先端１０２ａが、収容槽の内底面１０１ａと対向するように設置され、かつ内底面１０１ａとの距離を自在に調整することができ、少なくとも、内底面に押し付けることができるように構成されている。

ピペット１０２は、先端１０２ａに近づくにつれて細くなっていることが好ましい。この場合、細胞凝集塊に対し、ピペット１０２を押し付ける圧力を高めることができ、細胞凝集塊の分散効率を高めることができる。また、先端１０２ａの開口部の内径は、０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下であることが好ましい。内径が０．５ｍｍ未満であると、分散された細胞を取り込むことが難しい。内径が１０ｍｍを超えると、分散されていない細胞凝集塊が入り込み、分散効率が低下する。

弾性体１０３は、収容槽の外底面１０１ｂを支持している。弾性体１０３は、一方の側（上側）１０４ａに収容槽１０１を支持する第一支持部材１０４と、ピペット１０２の動作方向（押し付け、引き離し方向）Ｄに、伸縮するように配置されたばね１０５と、を備えている。ばねの一端１０５ａは、第一支持部材１０４の他方の側（下側）１０４ｂに固定されている。

弾性体１０３は、ばねの他端１０５ｂを固定するとともに、ばね１０５を支持する第二支持部材１０６を、さらに備えていることが好ましい。この場合、ピペット１０２を押し付ける際の安定性を高めることができる。

ばね１０５のばね定数は、１０Ｎ／ｍ以上５０，０００Ｎ／ｍ以下であることが好ましい。ばね定数が１０Ｎ／ｍ未満であると、弾性体１０３による十分な反発力が得られず、ピペット１０２を押し付ける力が弱められ、細胞凝集塊の分散が妨げられてしまう。反対に、ばね定数が５０，０００Ｎ／ｍを超えると、弾性体１０３による反発力が強過ぎて、収容槽の底部１０１ａにかかる過大な圧力を抑える効果が小さくなってしまう。

図１では、ばね１０５が、第一支持部材１０４、第二支持部材１０６の対向する角同士を連結するように、四箇所に設置されている場合について例示している。ばね１０５は、第一支持部材１０４を介して収容槽１０１を支持する役割を担っている。そのため、第一支持部材１０４および収容槽１０１が傾かないように、すなわち、ばね１０５の反発力が、第一支持部材１０４の全体に均一に作用するように、対称配置されている。具体的には、例えば、ピペットの動作方向Ｄからの平面視において、第一支持部材１０４の中心から等距離の位置に描かれる円上に、複数のばねが等間隔で並んでいることが好ましい。

図２（ａ）～（ｃ）は、上述した細胞凝集塊分散装置１００を用いた、細胞凝集塊方法について説明する図である。細胞凝集塊分散方法は、主に、次の工程を有する。

まず、図２（ａ）に示すように、収容槽１０１に、細胞凝集塊が含まれた液体Ｌを収容する（液体収容工程）。このとき、ピペットの先端１０２ａは、収容槽の内底面１０１ａから離間しており、収容槽１０１内を待機した状態となっている。

次に、図２（ｂ）に示すように、収容槽の内底面１０１ａに対し、ピペットの先端１０２ａを押し付け、密着させる。（ピペット押し付け工程）。ただし、ピペットの先端１０１ａと収容槽の内底面１０２ａと間に、分散後の細胞単体の大きさ程度の隙間Ｓ（図示せず）を設けておく。もしくは、収容槽の内底面１０１ａに対し、ピペットの先端１０２ａを押し付け、密着させることで、ピペットの先端１０１ａと収容槽の内底面１０２ａと間に、分散後の細胞単体の大きさ程度の隙間Ｓが形成される。こうすることにより、隙間Ｓを通過しようとする細胞凝集塊からは、ピペット１０２の開口部との接触によって、付着している細胞が剥がれるため、残った単体の細胞の塊を取り出すことができる。

次に、図２（ｃ）に示すように、ピペットの先端１０２ａを、収容槽の内底面１０１ａから引き離し、分散されていない細胞凝集塊を、ピペット１０２の押し付け位置に流入させる（ピペット引き離し工程）。ピペット１０２の押し付け位置に細胞凝集塊集まり出したところで、再びピペット１０２を押し付け、隙間Ｓ内の細胞凝集塊が分散されたところで、ピペット１０２の引き離しを行う。

以後、収容槽１０２内の細胞全体が細胞単体サイズになるまで、ピペット押し付け工程、ピペット引き離し工程）を交互に繰り返して行うことにより、細胞凝集塊の分散を行うことができる。繰り返しの回数は、収容槽１０１に収容する液体Ｌの量によるが、収容槽１０１内の全細胞凝集塊を単体の細胞に分散させるためには、５０回以上とすることが好ましい。

以上のように、本実施形態の細胞凝集塊分散装置１００では、収容槽１０１が弾性体によって支持されており、ピペットの押し付けの力が強過ぎた場合であっても、その力の一部を弾性体が吸収する。そのため、収容槽１０１の底部に過大な圧力が加わるのを防ぐことができ、圧力によって収容槽１０１の底部が破損するのを防ぐことができる。収容槽１０１の底部が破損する虞がなく、ピペットの押し付けの力を加減する必要がないため、底部に完全に密着するまでピペットを押し付けることができ、押し付けが不十分であるような問題を回避することができる。したがって、ピペット先端の消耗等により、ピペットの先端と収容槽の底面との距離が変化している場合であっても、変化に応じてピペットの押し付けの位置調整を行う必要がないため、ピペット操作を自動で行うことが可能となる。自動化によって、ピペットを押し付ける力の大きさ、向き等が均一化されるため、細胞凝集塊を、高い効率で安定して、単体の細胞に分散させることができる。

図３は、本発明の第二実施形態に係る細胞凝集塊分散装置２００の構成を模式的に示す斜視図である。細胞凝集塊分散装置２００では、収容槽１０２としてチューブ状（筒状）の容器が複数用いられ、それらの外周部を囲むガイド部材１０７を、さらに備えている。その他の構成は、第一実施形態の細胞凝集塊分散装置１００の構成と同様であり、細胞凝集塊分散装置１００と対応する箇所については、形状の違いによらず、同じ符号で示している。

ガイド部材１０７は、厚み方向に貫通孔１０８ａを有する板状部材１０８と、板状部材１０８を支持する第三支持部材１０９と、で構成されている。複数のチューブ状の収容槽１０２が、一本ずつ貫通孔１０８ａを連通し、底部が弾性体１０５に接するように設置されている。貫通孔１０８ａの内径は、収容槽１０２の外径と同程度であり、連通する収容槽１０２が傾かないように固定している。

第二実施形態の構成によれば、倒れやすいチューブ状の収容槽１０２を、支持部材である弾性体１０３に対して垂直に立設させることができる。そのため、収容槽１０２に対するピペットの挿入角度が、ほぼ固定されることになるため、細胞凝集塊を通過させる隙間の大きさがばらつく原因の一つを解消することができる。

図４は、本発明の第三実施形態に係る細胞凝集塊分散装置３００の構成を模式的に示す斜視図である。細胞凝集塊分散装置３００では、弾性体１０３に第一支持部材１０４が備わっておらず、収容槽の底部がばね１０５で直接支持されている。その他の構成は、第一実施形態の細胞凝集塊分散装置１００の構成と同様であり、細胞凝集塊分散装置１００と対応する箇所については、形状の違いによらず、同じ符号で示している。

ばね１０５は、ピペットの押し付け方向と平行な方向（動作方向Ｄ）に、伸縮するように配置され、一端１０５ａが、収容槽の外底面１０１ｂに固定されている。図４では、さらに、ばねの他端１０５が板状の第二支持部材に接続され、支持されている場合について例示している。

第一実施形態、第二実施形態の細胞凝集塊分散装置１００、２００では、第一支持部材１０４があることにより、いずれの収容槽１０２に対しても、ばね１０５による反発力が一様に作用することになる。そのため、例えば、一部の収容槽１０１に挿入するピペット１０２の先端が、寸法誤差により、収容槽１０１の底部に密着していない場合であっても、この収容槽１０２に作用する反発力を、局所的に強めることは難しい。これに対し、第三実施形態の細胞凝集塊分散装置３００では、いずれの収容槽１０２もばね１０５による反発力を直接受けるように構成されており、局所的に、密着に必要な分の反発力を作用させることができる。

以下、実施例により本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。

上述した細胞凝集塊分散装置および細胞凝集塊分散方法を用いて、細胞凝集塊分散を行った。収容槽として、４８本のマイクロチューブを用い、それぞれに対し、細胞凝集塊が含まれた液体１０μｌを収容した。収容槽の内底面に対する、ピペットの押し付け、引き離しを、自動で１０分間に１９５回繰り返して行った。

図５（ａ）～（ｈ）は、それぞれ、ピペットの押し付け、引き離しの繰り返し回数（ピペッティングの回数）を、０回、１５回、４５回、７５回、１０５回、１３５回、１６５回、１９５回としたときの細胞凝集塊の分散状態を画像化したものである。

図６は、図５（ａ）～（ｈ）の画像に基づいて、分散過程における細胞凝集塊のサイズ変化を示すグラフである。グラフの横軸は、ピペットの押し付け、引き離しの繰り返し回数を示している。グラフの縦軸は、全収容槽の細胞凝集塊の平均のサイズを示している。ピペットの押し付け、引き離しを繰り返すほど、細胞凝集塊の分散が進み、サイズが小さくなっていることが分かる。ただし、繰り返し回数が５０回以上になると、ほぼ変わらなくなることから、細胞凝集塊は、最小単位の細胞に分散したことが分かる。

図７は、図５（ａ）～（ｈ）の画像に基づいて、分散過程における細胞の数の変化を示すグラフである。グラフの横軸は、ピペットの押し付け、引き離しの繰り返し回数を示している。グラフの縦軸は、全収容槽に含まれる細胞の数を示している。ピペットの押し付け、引き離しを繰り返すほど、細胞凝集塊の分散が進み、細胞数が単調に増加していることが分かる。

図５～７に示す結果から、ピペット操作を自動化することにより、細胞凝集塊の分散を、高い効率で安定して、かつ高速で行えていることが分かる。ピペット操作の自動化に伴い、ピペット先端の位置調整を行えていないのにもかかわらず、このように安定して分散が行われているのは、ピペット先端の位置ずれの影響が、弾性体の反発力によって抑えられているためであると考えられる。

１００、２００、３００・・・細胞凝集塊分散装置
１０１・・・収容槽
１０１ａ・・・収容槽の内底面
１０１ｂ・・・収容槽の外底面
１０２・・・ピペット
１０２ａ・・・ピペットの先端
１０３・・・弾性体
１０４・・・第一支持部材
１０４ａ・・・第一支持部材の一方の側
１０４ｂ・・・第一支持部材の他方の側
１０５・・・ばね
１０５ａ・・・ばねの一端
１０５ｂ・・・ばねの他端
１０６・・・第二支持部材
１０７・・・ガイド部材
１０８・・・板状部材
１０８ａ・・・貫通孔
１０９・・・第三支持部材
Ｄ・・・ピペットの動作方向
Ｌ・・・液体
Ｒ・・・領域
Ｓ・・・隙間

Claims (9)

1. 細胞凝集塊が含まれた液体を収容する収容槽と、
   前記収容槽の内底面に先端を押し付けるピペットと、
   前記収容槽の外底面を支持する弾性体と、を備え、
   前記弾性体が、前記ピペットの押し付け方向と平行な方向に、伸縮するように配置されたばねであり、前記ばねの一端が、前記収容槽の外底面に固定されていることを特徴とする細胞凝集塊分散装置。
2. 前記弾性体が、一方の側に前記収容槽を支持する第一支持部材と、前記ピペットの押し付け方向と平行な方向に、伸縮するように配置されたばねと、を備え、
   前記ばねの一端が、前記第一支持部材の他方の側に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞凝集塊分散装置。
3. 前記弾性体が、前記ばねの他端を固定するとともに、前記ばねを支持する第二支持部材を、さらに備えていることを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の細胞凝集塊分散装置。
4. 前記ピペットが、前記先端に近づくにつれて細くなっていることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞凝集塊分散装置。
5. 前記収容槽の底部のうち、前記ピペットの先端を押し付ける部分が、前記弾性体側に凹んでいることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞凝集塊分散装置。
6. 前記収容槽が、前記底部側が閉口され、前記底部と反対側に延在するように立設された、一本以上のチューブであることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞凝集塊分散装置。
7. 前記チューブの外周部を囲むガイド部材を、さらに備えていることを特徴とする請求項６に記載の細胞凝集塊分散装置。
8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞凝集塊分散装置を用いた細胞凝集塊分散方法であって、
   前記収容槽に、細胞凝集塊が含まれた液体を収容する液体収容工程と、
   前記収容槽の内底面に、前記ピペットの先端を押し付けるピペット押し付け工程と、
   前記ピペットの先端を、前記収容槽の内底面から引き離すピペット引き離し工程と、を有することを特徴とする細胞凝集塊分散方法。
9. 前記ピペット押し付け工程と、前記ピペット引き離し工程と、を交互に５０回以上繰り返すことを特徴とする請求項８に記載の細胞凝集塊分散方法。

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