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JP7350127B2 - 単細胞選別のための細胞培養プラットホームおよびｉＰＳＣの再プログラミングの増強 - Google Patents

単細胞選別のための細胞培養プラットホームおよびｉＰＳＣの再プログラミングの増強 Download PDF

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ピーター フリン，
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フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド
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Description

配列表に関する陳述
本願に関連した配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、明細書中に参考として援用される。配列表を含むテキストファイルの名前は、ＦＡＴＥ＿０９４＿００ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このキストファイルは４ ＫＢで、２０１１年１２月１５日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂによって電子的に提出される。
関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１０年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／４２６，３６９号、および２０１１年６月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／４９６，９９１号の利益を主張し、この米国仮特許出願の各々は、それらの全体が参考として援用される。
発明の背景
技術分野
本発明は、一般に、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成し、培養するためのフィーダーフリー条件を含めた、幹細胞を培養するための細胞培養条件、培地、および培養プラットフォームに関する。
関連技術の説明
多能性幹細胞生物学を適用することにより、再生医療の新しい扉が開かれる。着床前胚盤胞を成長因子のカクテル中で培養することによってヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を得ることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、拡大した自己再生細胞集団を療法に関連する細胞系統に分化させることができる、多くの有望な細胞療法の手法が導かれている。ＥＳＣ生物学のさらなる適用において、および着床前遺伝子解析を用いることによって、いくつかの遺伝病の背景からＥＳＣ系を得、したがって、これらの疾患を組織培養ディッシュにおいてモデリングすることが可能になった。しかし、ＥＳＣ技術にはいくらかの制限がある：ＥＳＣを得ることができる遺伝的背景の範囲は技術的かつ政治的に制限され、ＥＳＣの遺伝的背景は必ずしも公知ではなく、ＥＳＣ由来細胞療法の使用は基本的に同種異系移植であり、それには従来の組織／臓器移植と同じ拒絶反応の危険性が伴う。
大きな進歩では、多能性細胞集団を成体の最終分化細胞から生成し、そのように得られた細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称される。ｉＰＳＣ技術により、任意のドナー由来の細胞を多能性の自己再生性の状態に再プログラミングすることが可能になり、したがって、任意の遺伝的背景から均一の細胞集団を拡大することが可能になる。ｉＰＳＣは、ＥＳＣに関する倫理的な考慮事項を克服し、ハイスループットな薬物スクリーニングのための任意の遺伝的なヒト疾患のモデルまたは生体異物薬物毒性スクリーニングのための肝細胞および心筋細胞を得るために使用することができる。さらに、ｉＰＳＣにより、最終的に、移植片拒絶を予防することができる、自己移植における患者自身の細胞から生成した細胞療法がもたらされ得る。発現および分化の分析により、クローンｉＰＳＣ培養物の間に複数のＥＳＣ系を比較した際に認められるものと同程度の変動があり、ｉＰＳＣが分子レベルではＥＳＣに非常に近いことが示されている。
ｉＰＳＣは、一般に、完全な再プログラミングのために必要であることが示されているいくつかの重要な遺伝子、すなわち、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇの組合せを異所性発現させることにより生成されている。ｉＰＳＣは、最初に、重要な転写因子を発現させるための組込みウイルス系を用いて生成された。現在、ポリシストロニック系および誘導系を含めたレトロウイルス系およびレンチウイルス系が、ｉＰＳＣの生成において首尾よく用いられている。しかし、挿入変異誘発に起因する恒久的なゲノムの変化およびｉＰＳＣ分化後の外因性の遺伝子再活性化の潜在性により、その後の薬物スクリーニングおよびこれらの方法によって生成された細胞の治療への適用に関する潜在的な問題が示され得る。実際に、同じウイルス系を用いて生成したｉＰＳＣクローン間で有意な差異が報告されており、げっ歯類において、分化したニューロスフェアとして移植するとクローンの大部分が腫瘍を形成する。研究により、同じウイルスによる方法を用いて生成したｉＰＳＣは、一度分化すると異なって挙動し得ることが示唆されている。異所性遺伝子組込み部位が異なることにより、異なる挿入変異誘発および導入遺伝子の発現の後成的な制御がもたらされ得る。組込み系を含むｉＰＳＣ生成方法については、多くのクローンを得、スクリーニングして、多能性の状態と分化した状態のどちらにおいても安定であるクローンを同定することが必要になる場合がある。したがって、所与のドナー細胞供給源からクローンｉＰＳＣを急速に得るための方法が有益であることになる。ｉＰＳＣを生成するために、アデノウイルスまたはエピソームの一過性発現などの非組込み系を用いることも、効率が低いが実証されている。これらの系では、ｉＰＳＣの生成における安全性および安定性の問題が克服され得るが、任意のＤＮＡに基づく再プログラミング方法を用いる場合にはゲノムへの組込みの潜在性があり、これにより、ｉＰＳＣ由来細胞療法の開発においてそれらを用いる前に評価する必要がある。
切り出し可能なウイルス系およびゲノム全域にわたる発現プロファイリングにより、発現カセットが組み込まれたｉＰＳＣは、ウイルス因子が切り取られた同じクローンよりもＥＳＣと類似していないことが示されている。さらに、現在では、最も一般的に使用される転写因子をＥ．ｃｏｌｉにおいて細胞透過性ペプチドとの融合タンパク質として発現させる、タンパク質のみの再プログラミングが実証されている。精製タンパク質の複数回投与をマウス線維芽細胞に適用することにより、ｉＰＳＣが生成した。このタンパク質のみの系を用いた再プログラミングの効率は非常に低かった。これは、タンパク質形質導入の効率、タンパク質の比活性および／またはタンパク質の安定性に起因する可能性がある。
多能性遺伝子を異所性発現させることまたはそれらをタンパク質形質導入またはｍＲＮＡによって導入することによる分化細胞の再プログラミングのプロセスには、数ヶ月、および熟練の幹細胞生物学者の知識が必要である。再プログラミングされた細胞の同定は、最初に、目測でのＥＳＣ様コロニー形態のスクリーニングである。そのようなコロニーは手動で選び取らなければならず、通常、機械的に継代し、拡大する。多能性因子を導入することによっても、形質転換された細胞コロニーならびに不完全に再プログラミングされた細胞が作製される。研究者は、形質転換された細胞のバックグラウンドから真のｉＰＳＣコロニーを同定することが可能であり得るが、これは効率的なプロセスではない。次いで、真の多能性集団としてさらに特徴付け、認識することが必要であり、通常、多能性のマーカー、遺伝子発現および後成的分析ならびに多能性集団の３種の胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）に分化する能力についての免疫細胞化学染色を含む。多能性細胞を同定し、選択したら、そのような細胞は一般にコロニーとして成長し、長期にわたって細胞を維持するために、細胞を選び取り、機械的に解離させた後に再プレーティングすることによって手動で継代することが必要である。
種々の着床前段階および着床後段階に由来する胚性幹細胞は、別個の多能性の状態を示す。例えば、胚盤胞の内部細胞集団に由来する細胞は、より「ナイーブ」であるとみなされ、無作為に分化する傾向がより高くより「プライムされた」とみなされる着床後由来細胞とはかなり異なる重要な性質を有する。ナイーブ細胞は、より「基底状態（ｇｒｏｕｎｄｅｄ ｓｔａｔｅ）」であるようであり、それらの未分化状態を維持するために外因性のシグナル伝達を必要としない。他方では、プライムされた細胞は、それらの未分化状態を維持するために、ＴＧＦβ、アクチビンおよびｂＦＧＦを含めた重要なサイトカインの外因性のシグナル伝達を必要とし、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ細胞経路に大きく依存する。
ｉＰＳＣの生成プロセスを改善することにより、技術的障壁を劇的に低下させ、プロセスを迅速化することができ、その後の、薬物スクリーニングおよび細胞療法などの当該技術を工業的に適用するためのスケールアップおよび細胞の分化が可能になる。外因性の材料を使用せずにｉＰＳＣをより効率的に作製し、再プログラミングされた細胞をより効率的に同定し、選択するための方法が必要である。ヒト多能性幹細胞のナイーブな状態を促進するｉＰＳＣを生成する方法が、再生医療、例えば、疾患矯正、定方向分化および製造規模の拡大における今後の適用において著しく有利になることになる。さらに、ｉＰＳＣを、単細胞継代およびスケーラビリティを可能にする定義済みの培養条件でより効率的に作製するための方法が必要である。
発明の簡単な要旨
本発明の一実施形態は、多能性細胞をフィーダーフリー環境において培養する方法であって、マウス胚性幹細胞ではない多能性細胞を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも１種含む培地中のフィーダーフリー環境において培養し、培養している間、細胞の多能性を維持するステップを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、培地は、細胞の多能性を維持しながら少なくとも１回の細胞分裂を可能にするために十分な量の作用剤を含む。さらなる実施形態では、培地は、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも２種含む。特定の実施形態では、培地は、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも３種または４種含む。
別の特定の実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はＲｏｃｋ阻害剤を含む。特定の実施形態では、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビン（ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）またはＹ２７６３２である。
一実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はＴＦＧβ阻害剤を含み、特定の実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＡ－８３－０１またはＳＢ４３１５４２である。
ある実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はＧＳＫ３阻害剤を含み、特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯである。
本発明の一実施形態では、細胞の多能性を維持する作用剤はＭＥＫ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２９０１である。
特定の実施形態では、培地は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含む。本発明のさらに特定の実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のいくつかの実施形態では、細胞の多能性が少なくとも５回の細胞分裂にわたって維持される。他の実施形態では、細胞の多能性が少なくとも１０回の細胞分裂にわたって維持される。
いくつかの実施形態では、細胞を成長因子およびサイトカインの不在下、必要に応じて、可溶性フィブロネクチンの存在下で培養する。さらなる実施形態では、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）の不在下で培養し、さらに別の実施形態では、培地はｂＦＧＦを実質的に含まない。
本発明の特定の実施形態では、多能性細胞はヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である。
本発明の別の実施形態は、マウス胚性幹細胞ではない多能性細胞を成長因子およびサイトカインの不在下で培養するステップを含む、多能性細胞を培養する方法を提供する。
ある実施形態では、方法は、多能性細胞を、細胞の多能性を維持しながら少なくとも１回の細胞分裂を可能にするため、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される、細胞の多能性を維持する作用剤を少なくとも１種含む培地中で培養するステップを含む。
一実施形態では、多能性細胞はヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である。
さらなる実施形態では、培地は、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも２種、少なくとも３種、または４種の作用剤を含み、特定の実施形態では、培地は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、他の特定の実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のさらに別の実施形態は、解離したヒト多能性細胞を得る方法であって、ヒト多能性細胞を解離させて、解離細胞を得るステップと、解離細胞を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される、解離細胞の生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を増強する作用剤を少なくとも１種含む培地と接触させ、それにより、解離細胞の生存能力を増強するステップとを含む方法を提供する。特定の実施形態では、解離細胞の生存能力が少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％増強される。
他の実施形態では、本発明の方法は、培地中で解離細胞を、解離細胞の多能性を維持しながら少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも５回、または少なくとも１０回の継代にわたって培養するステップをさらに含む。
ある実施形態では、培養後の解離細胞の核型は、解離させる前の細胞集団の核型と実質的に同様である。
いくつかの実施形態では、方法は、作用剤の存在下で解離させるステップを含む。さらに他の実施形態では、方法は、多能性細胞を、解離させる前に作用剤と接触させるステップを含む。特定の実施形態では、解離細胞を培地と接触させるステップは、解離細胞を培地中に懸濁させるステップを含む。
他の実施形態では、本発明は、フィーダーフリー環境における細胞の能力（ｐｏｔｅｎｃｙ）を増大させる方法であって、細胞をフィーダーフリー環境において、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の低分子作用剤を含む培地と接触させて、培地と接触させる前の細胞と比較して能力が増大した細胞を得るステップを含む方法を提供する。特定の実施形態では、培地は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
一実施形態では、接触させるステップは、細胞の能力を増大させるために十分な条件下で細胞を培養するステップを含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、多能性細胞、多分化能細胞、非多能性細胞、および体細胞からなる群から選択される。
特定の実施形態では、細胞は、マウス胚性幹細胞ではない。他の特定の実施形態では、細胞はヒト細胞であり、ある実施形態では、細胞は人工多能性幹細胞である。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞を少なくとも１種の多能性因子と接触させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または低分子を含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は外因性転写因子である。特定の実施形態では、外因性転写因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇをコードするポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ポリペプチドは、細胞膜を横切る輸送を可能にするアミノ酸配列を含む。他の特定の実施形態では、外因性転写因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリヌクレオチドを含む。
さらに他の実施形態では、能力が増大している細胞は、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ １－８１からなる群から選択される少なくとも１種の多能性幹細胞マーカーの発現、多能性幹細胞の形態、生殖細胞系列伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）に寄与する能力、奇形腫の形成、出発系統とは異なる系統に分化または分化転換する能力、およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける三系統分化の１つまたは複数によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、能力が増大している細胞は、培地と接触させる前の細胞と比較して少なくとも２倍高いレベルのＯｃｔ４を発現する。さらに他の実施形態では、能力が増大している細胞は、従来法で培養したｉＰＳＣと比較して少なくとも２倍低いＸｉｓｔ活性を有する。さらなる実施形態では、能力が増大している細胞は、密集した、ドーム形のコロニー形態を有する。
いくつかの実施形態では、能力が増大している細胞は、ＴＦＧβ、アクチビン、およびＭＥＫシグナル伝達経路の外因性の刺激の不在下で、および必要に応じて、ｂＦＧＦ経路の外因性の刺激の不在下で複製し、かつ多能性を維持する。
他の実施形態では、方法は、能力が増大している細胞を、フィーダーフリー環境において、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、またはｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１種の存在下で培養して、細胞の能力を維持しながら少なくとも１回の細胞分裂を可能にするステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞をＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤の存在下で培養し、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明は、上記の実施形態のいずれかによって作製される、能力が増大している細胞も提供する。
本発明は、さらに、フィーダーフリー環境における細胞集団の再プログラミングの効率を改善する方法であって、細胞集団を、フィーダーフリー環境において、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の低分子作用剤と、再プログラミングを誘導し、それにより、再プログラミングの効率を、細胞集団を低分子作用剤と接触させていない場合の再プログラミングの効率と比較して少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも３００％、または少なくとも５００％改善するために十分な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、細胞をＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤と接触させ、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
いくつかの実施形態では、再プログラミング前の細胞集団は、非多能性細胞を含む。他の実施形態では、再プログラミングの効率を、再プログラミングのために必要とされる時間によって、または再プログラミングされた細胞の数によって測定する。
さらに他の実施形態では、再プログラミングを誘導するために十分な条件は、細胞集団を、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種の外因性転写因子と接触させることを含む。特定の実施形態では、条件は、細胞集団を、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリペプチドまたはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４をコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む。
本発明のさらに別の実施形態は、細胞集団をフィーダーフリー環境において選別して、多能性細胞が富化された細胞集団を得る方法であって、フィーダーフリー環境において細胞の混成集団を含む解離細胞の懸濁物を得るステップと、懸濁物中の細胞を選別して、１種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を得、それにより、多能性細胞が富化された富化細胞集団を得るステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、懸濁物は、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、またはｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１種を含む。さらなる実施形態では、選別は、磁気ビーズまたはフローサイトメトリーによるものである。特定の実施形態では、選別は、磁気ビーズによるものである。他の特定の実施形態では、選別は、フローサイトメトリーによるものである。
いくつかの実施形態では、方法は、富化細胞集団を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、またはｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１種を、必要に応じて、可溶性フィブロネクチンと組み合わせて含む培地中で培養するステップをさらに含む。
特定の実施形態では、懸濁物中の細胞の混成集団を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、またはｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１種と選別前に接触させる。ある実施形態では、細胞の混成集団を、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤と接触させ、他のある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
特定の実施形態では、細胞の混成集団は、１種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を含む。特定の実施形態では、１種または複数種の多能性のマーカーは、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＤ１３３／プロミニン（ｐｒｏｍｉｎｉｎ）、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＮａｎｏｇまたはＳｏｘ２を含む。具体的な実施形態では、多能性のマーカーは、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１６０、およびＣＤ３０からなる群から選択される。
特定の実施形態では、方法は、細胞の混成集団を１種または複数種の多能性因子と接触させて、再プログラミングを誘導するステップを含む。いくつかの実施形態では、接触させるステップは、１種または複数種の多能性因子を細胞の混成集団内の細胞に導入するステップ含む。ある実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇをコードするポリヌクレオチドを含む。他の特定の実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、多能性細胞は人工多能性細胞である。
いくつかの実施形態では、富化細胞集団が、１種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞に関して少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％富化されている。
別の実施形態では、本発明は、人工多能性幹細胞を得る方法であって、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップと、細胞集団を含む解離細胞の懸濁物を調製するステップと、懸濁物中の細胞を選別して、１種または複数種の多能性のマーカーを発現している選別細胞を得るステップと、１種または複数種の多能性のマーカーを発現している選別細胞を培養するステップとを含み、ここで、ｉＰＳＣが得られる方法を提供する。特定の実施形態では、選別された細胞をサイトカインおよび成長因子の不在下、必要に応じて、フィーダーフリー環境において、および必要に応じて、可溶性フィブロネクチンの存在下で培養する。
いくつかの実施形態では、細胞集団を、ｉ）ＴＧＦβ阻害剤；ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、またはｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１種と接触させる。特定の実施形態では、細胞集団を、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤と接触させ、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
他の実施形態では、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップは、細胞集団を、１種または複数種の多能性因子と接触させるステップを含む。特定の実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇをコードするポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導するステップは、細胞集団を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、またはｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１種と接触させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞をＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤と接触させ、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
他の実施形態では、懸濁物は、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、またはｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１種を含む。特定の実施形態では、懸濁物は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
いくつかの実施形態では、選別は、フローサイトメトリーによるかまたは磁気ビーズによるものである。特定の実施形態では、細胞を選別して、少なくとも１種 、２種、３種、４種、またはそれより多い多能性のマーカーを発現している細胞を得る。他の特定の実施形態では、１種または複数種の多能性のマーカーは、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＮａｎｏｇまたはＳｏｘ２を含む。他の特定の実施形態では、１種または複数種の多能性のマーカーは、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、およびＣＤ３０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１種または複数種の多能性のマーカーは、ＳＳＥＡ４、ＣＤ３０、およびＴＲＡ１６０またはＴＲＡ１８１である。別の実施形態では、細胞を、特異的なマーカーを用いて選別して、再プログラミングされていない細胞を再プログラミング集団から枯渇させる。
いくつかの実施形態では、培養するステップは、細胞を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の低分子作用剤を含む、培地中で培養するステップを含む。特定の実施形態では、培地は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
特定の実施形態では、細胞をフィーダーフリー環境において培養する。ある実施形態では、細胞をフィーダーフリー環境において処理し、懸濁させ、選別し、培養する。
いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞は、約２～２２日間に得られる。特定の実施形態では、人工多能性幹細胞は、約４～約１８日間に得られる。
他の実施形態では、人工多能性幹細胞は、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約４～約２２日間以内に得られる。ある実施形態では、人工多能性幹細胞は、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約６～約１８日間以内に得られ、他のある実施形態では、人工多能性幹細胞は、細胞集団を処理して再プログラミングを誘導した後約１０～約１６日間以内に得られる。
本発明は、別の実施形態において、上記の方法のいずれかによって得られる人工多能性幹細胞も提供する。
本発明は、さらに、多能性細胞を細胞集団から枯渇させる方法であって、多能性細胞を有する細胞の混成集団を含む解離細胞の懸濁物を得るステップと、懸濁物中の細胞を選別して、１種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞を除去し、それにより、多能性細胞を細胞集団から枯渇させるステップとを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞の混成集団は、多分化能細胞または（成体）体細胞を含む。
他の実施形態では、懸濁物中の細胞の混成集団を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の低分子作用剤を含む培地中で、懸濁物を得る前に培養する。特定の実施形態では、培地は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のさらなる実施形態では、懸濁物は、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の低分子作用剤を含む。特定の実施形態では、懸濁物は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
いくつかの実施形態では、選別は、フローサイトメトリーによるものである。他の実施形態では、選別は、抗体でコーティングした磁気ビーズ富化によるものである。
本発明のいくつかの実施形態は、ゲノム安定性を有する多能性細胞を得る方法であって、細胞を、フィーダーフリー環境において、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の低分子作用剤と、ｃ－ｍｙｃの不在下、ゲノム安定性を有する多能性細胞を得るために十分な条件下で接触させるステップを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞、多能性細胞、多分化能細胞、非多能性細胞、および体細胞である。いくつかの具体的な実施形態では、細胞は、非多能性細胞を含む。
ある実施形態では、条件は、細胞を少なくとも１種の多能性因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される外因性転写因子である。特定の実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、低分子作用剤はＲｏｃｋ阻害剤を含む。特定の実施形態では、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンまたはＹ２７６３２であり、さらに特定の実施形態では、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明の他の実施形態では、低分子作用剤はＴＦＧβ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤は、Ａ－８３－０１またはＳＢ４３１５４２である。
いくつかの実施形態では、低分子作用剤はＧＳＫ３阻害剤を含み、特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯである。
本発明の他の実施形態では、低分子作用剤はＭＥＫ阻害剤を含む。いくつかの特定の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２９０１である。
本発明のいくつかの実施形態では、低分子作用剤は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明は、多能性細胞を培養して、細胞のゲノム安定性を維持する方法であって、多能性細胞を、ｉ）ＴＦＧβ阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤からなる群から選択される、多能性細胞のゲノム安定性を維持する作用剤を少なくとも１種含む培地中のフィーダーフリー環境において培養し、培養している間、多能性細胞のゲノム安定性を維持するステップを含む方法をさらに含む。
ある実施形態では、条件は、細胞を少なくとも１種の多能性因子と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇポリペプチド、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、もしくはＮａｎｏｇをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される外因性転写因子である。特定の実施形態では、多能性因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＫｌｆ４ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも２種、少なくとも３種、または４種の作用剤を含む。
本発明のいくつかの実施形態では、作用剤はＲｏｃｋ阻害剤を含む。特定の実施形態では、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンまたはＹ２７６３２であり、さらに特定の実施形態では、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明の他の実施形態では、作用剤はＴＦＧβ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤は、Ａ－８３－０１またはＳＢ４３１５４２である。
いくつかの実施形態では、作用剤はＧＳＫ３阻害剤を含み、特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯである。
本発明の他の実施形態では、作用剤はＭＥＫ阻害剤を含む。いくつかの特定の実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２９０１である。
本発明のいくつかの実施形態では、作用剤は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明のいくつかの実施形態では、多能性細胞を、培地中で少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも５回、少なくとも１０回、または少なくとも１５回の継代にわたって、多能性細胞のゲノム安定性を維持しながら培養する。
図１は、種々の低分子カクテルの、フィーダーフリー基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）におけるヒト多能性幹細胞の単細胞培養に対する影響を示す図である。Ａ．単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞を、フィーダーフリー環境において低分子の種々の組合せで処理した場合の、異なる形態が明らかであった。ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉの組合せを含有する培地は、ヒト多能性幹細胞の頑強な成長および生存能力をもたらした。Ｂ．一部の低分子、すなわち、ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは多能性幹細胞の維持を支持し、その他の低分子、すなわち、Ｒｏｃｋｉは多能性幹細胞の単細胞への解離を容易にし、これらの低分子の独特の組合せ、すなわち、ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは、単細胞への解離を支持し、その一方で、多能性マーカーであるＴｒａ１８１について陽性であった増殖性が高いコロニーによって示される通り、未分化状態を維持した。Ｔｒａ１８１、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．ｈｉＰＳＣを細胞１×１０５個でＭａｔｒｉｇｅｌ上に播種し、４日後に、トリパンブルーによって測定された生存細胞の数およびパーセント生存能力についてスコア化したところ、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉ／ＲＯＣＫｉの組合せが、生存能力および増殖を支持した。Ｄ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせると、チアゾビビンと一緒に培養したコロニーは、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉとＹ２７６３２により支持された培養物と比較して、より密集した形態であるようである。Ｅ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせたＹ２７６３２またはチアゾビビン中で培養したｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の表面発現についてのフローサイトメトリー分析により、チアゾビビンが、Ｙ２７６３２を有する組合せと比較して細胞の未分化の状態での維持をよりよく支持することが示されている。 図１は、種々の低分子カクテルの、フィーダーフリー基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）におけるヒト多能性幹細胞の単細胞培養に対する影響を示す図である。Ａ．単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞を、フィーダーフリー環境において低分子の種々の組合せで処理した場合の、異なる形態が明らかであった。ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉの組合せを含有する培地は、ヒト多能性幹細胞の頑強な成長および生存能力をもたらした。Ｂ．一部の低分子、すなわち、ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは多能性幹細胞の維持を支持し、その他の低分子、すなわち、Ｒｏｃｋｉは多能性幹細胞の単細胞への解離を容易にし、これらの低分子の独特の組合せ、すなわち、ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは、単細胞への解離を支持し、その一方で、多能性マーカーであるＴｒａ１８１について陽性であった増殖性が高いコロニーによって示される通り、未分化状態を維持した。Ｔｒａ１８１、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．ｈｉＰＳＣを細胞１×１０５個でＭａｔｒｉｇｅｌ上に播種し、４日後に、トリパンブルーによって測定された生存細胞の数およびパーセント生存能力についてスコア化したところ、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉ／ＲＯＣＫｉの組合せが、生存能力および増殖を支持した。Ｄ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせると、チアゾビビンと一緒に培養したコロニーは、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉとＹ２７６３２により支持された培養物と比較して、より密集した形態であるようである。Ｅ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせたＹ２７６３２またはチアゾビビン中で培養したｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の表面発現についてのフローサイトメトリー分析により、チアゾビビンが、Ｙ２７６３２を有する組合せと比較して細胞の未分化の状態での維持をよりよく支持することが示されている。 図１は、種々の低分子カクテルの、フィーダーフリー基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）におけるヒト多能性幹細胞の単細胞培養に対する影響を示す図である。Ａ．単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞を、フィーダーフリー環境において低分子の種々の組合せで処理した場合の、異なる形態が明らかであった。ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉの組合せを含有する培地は、ヒト多能性幹細胞の頑強な成長および生存能力をもたらした。Ｂ．一部の低分子、すなわち、ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは多能性幹細胞の維持を支持し、その他の低分子、すなわち、Ｒｏｃｋｉは多能性幹細胞の単細胞への解離を容易にし、これらの低分子の独特の組合せ、すなわち、ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは、単細胞への解離を支持し、その一方で、多能性マーカーであるＴｒａ１８１について陽性であった増殖性が高いコロニーによって示される通り、未分化状態を維持した。Ｔｒａ１８１、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．ｈｉＰＳＣを細胞１×１０５個でＭａｔｒｉｇｅｌ上に播種し、４日後に、トリパンブルーによって測定された生存細胞の数およびパーセント生存能力についてスコア化したところ、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉ／ＲＯＣＫｉの組合せが、生存能力および増殖を支持した。Ｄ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせると、チアゾビビンと一緒に培養したコロニーは、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉとＹ２７６３２により支持された培養物と比較して、より密集した形態であるようである。Ｅ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせたＹ２７６３２またはチアゾビビン中で培養したｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の表面発現についてのフローサイトメトリー分析により、チアゾビビンが、Ｙ２７６３２を有する組合せと比較して細胞の未分化の状態での維持をよりよく支持することが示されている。 図１は、種々の低分子カクテルの、フィーダーフリー基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）におけるヒト多能性幹細胞の単細胞培養に対する影響を示す図である。Ａ．単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞を、フィーダーフリー環境において低分子の種々の組合せで処理した場合の、異なる形態が明らかであった。ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉの組合せを含有する培地は、ヒト多能性幹細胞の頑強な成長および生存能力をもたらした。Ｂ．一部の低分子、すなわち、ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは多能性幹細胞の維持を支持し、その他の低分子、すなわち、Ｒｏｃｋｉは多能性幹細胞の単細胞への解離を容易にし、これらの低分子の独特の組合せ、すなわち、ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは、単細胞への解離を支持し、その一方で、多能性マーカーであるＴｒａ１８１について陽性であった増殖性が高いコロニーによって示される通り、未分化状態を維持した。Ｔｒａ１８１、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．ｈｉＰＳＣを細胞１×１０５個でＭａｔｒｉｇｅｌ上に播種し、４日後に、トリパンブルーによって測定された生存細胞の数およびパーセント生存能力についてスコア化したところ、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉ／ＲＯＣＫｉの組合せが、生存能力および増殖を支持した。Ｄ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせると、チアゾビビンと一緒に培養したコロニーは、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉとＹ２７６３２により支持された培養物と比較して、より密集した形態であるようである。Ｅ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせたＹ２７６３２またはチアゾビビン中で培養したｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の表面発現についてのフローサイトメトリー分析により、チアゾビビンが、Ｙ２７６３２を有する組合せと比較して細胞の未分化の状態での維持をよりよく支持することが示されている。 図１は、種々の低分子カクテルの、フィーダーフリー基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）におけるヒト多能性幹細胞の単細胞培養に対する影響を示す図である。Ａ．単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞を、フィーダーフリー環境において低分子の種々の組合せで処理した場合の、異なる形態が明らかであった。ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉの組合せを含有する培地は、ヒト多能性幹細胞の頑強な成長および生存能力をもたらした。Ｂ．一部の低分子、すなわち、ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは多能性幹細胞の維持を支持し、その他の低分子、すなわち、Ｒｏｃｋｉは多能性幹細胞の単細胞への解離を容易にし、これらの低分子の独特の組合せ、すなわち、ＲＯＣＫｉ／ＭＥＫｉ／ＴＧＦβｉ／ＧＳＫｉは、単細胞への解離を支持し、その一方で、多能性マーカーであるＴｒａ１８１について陽性であった増殖性が高いコロニーによって示される通り、未分化状態を維持した。Ｔｒａ１８１、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．ｈｉＰＳＣを細胞１×１０５個でＭａｔｒｉｇｅｌ上に播種し、４日後に、トリパンブルーによって測定された生存細胞の数およびパーセント生存能力についてスコア化したところ、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉ／ＲＯＣＫｉの組合せが、生存能力および増殖を支持した。Ｄ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせると、チアゾビビンと一緒に培養したコロニーは、ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉとＹ２７６３２により支持された培養物と比較して、より密集した形態であるようである。Ｅ．ＭＥＫｉ／ＴＦＧβｉ／ＧＳＫｉと組み合わせたＹ２７６３２またはチアゾビビン中で培養したｈｉＰＳＣのＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の表面発現についてのフローサイトメトリー分析により、チアゾビビンが、Ｙ２７６３２を有する組合せと比較して細胞の未分化の状態での維持をよりよく支持することが示されている。 図２は、ヒト多能性幹細胞のフィーダーフリーおよび単細胞培養への適合を示す図である。Ａ．フィーダー細胞上で生成したｉＰＳＣを、ＳＭＣ４培地を利用して、フィーダーフリーおよび単細胞の培養条件に容易に適合させた。しかし、単細胞への解離および従来の培養条件における培養の際には細胞生存が攪乱され、細胞付着および成長の制限が認められた。Ｂ．フィーダーフリー環境に適合させたら、ｉＰＳＣを、ＳＭＣ４培地中で連続的に維持した場合、フィーダーフリー表面上で単細胞として常套的に培養した。 図２は、ヒト多能性幹細胞のフィーダーフリーおよび単細胞培養への適合を示す図である。Ａ．フィーダー細胞上で生成したｉＰＳＣを、ＳＭＣ４培地を利用して、フィーダーフリーおよび単細胞の培養条件に容易に適合させた。しかし、単細胞への解離および従来の培養条件における培養の際には細胞生存が攪乱され、細胞付着および成長の制限が認められた。Ｂ．フィーダーフリー環境に適合させたら、ｉＰＳＣを、ＳＭＣ４培地中で連続的に維持した場合、フィーダーフリー表面上で単細胞として常套的に培養した。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図３は、単細胞の長期維持およびフィーダーフリーでのヒト多能性幹細胞の培養を示す図である。Ａ．フィーダーフリー培養においてＳＭＣ４培地中で１０回の継代にわたって維持した、単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、免疫蛍光検査による分析によって、多能性マーカーであるＮａｎｏｇおよびＴｒａ１８１を発現した。Ｂ．図３Ｂは、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかに入れた４時間後の７アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ）染色細胞のパーセントを示す。単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞は、７ＡＡＤ染色およびフローサイトメトリー分析によって認められるとおり、従来の培地ではなくＳＭＣ４培地中で培養した場合に生存能力の有意な増大を示した。Ｃ．フローサイトメトリーによる定量的集団解析により、単細胞に解離させ、ＳＭＣ４培地中で維持したほぼ全ての細胞が未分化状態の複数のマーカーを発現したことが明らかになった。Ｄ．包括的発現解析により、単細胞として継代し、フィーダー細胞を含まないＳＭＣ４培地中で維持したｉＰＳＣと、Ｈ１細胞を含めた、フィーダー細胞上で培養し、継代の間、細胞凝集塊として維持したヒトＥＳＣとの間の高い相関が明らかになった。Ｅ．ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めた、ヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣにおいて、外因性因子陽性対照（４日後に再プログラミング因子を発現している、レンチウイルスを感染させた線維芽細胞）とは異なり、有効に活動停止した。フィーダーフリーｉＰＳＣにおける再プログラミング因子の内在性の発現はＨ１およびＨｕＥＳ９を含めたＥＳＣと同様であった。Ｇ．フィーダーフリー環境において単細胞として１１回継代した後、ヒト多能性幹細胞は、通常の核型を保持した。Ｈ．ＳＭＣ４培地を従来の分化培地と交換した１４日後、フィーダーフリー環境において維持した細胞は、胚体外のマーカーに加えて、通常、ナイーブ幹細胞および全能性幹細胞によってのみ発現される外胚葉、内胚葉および中胚葉を示す遺伝子発現を示した。Ｉ．免疫蛍光検査による分析：ＳＭＣ４培地を用いてフィーダー細胞フリー系において培養し、単細胞として継代したｉＰＳＣは、従来の分化培地に移すと容易に３種の体細胞型の全てへと発達した。中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）；内胚葉、Ｓｏｘ１７。Ｊ．奇形腫形成の分析により、ＳＭＣ４培地中で培養したヒト多能性幹細胞は３種の胚葉を表す細胞型を生じ、したがって、それらの多能性の潜在性を保持していることが実証されている。 図４は、増強された単細胞選別およびその後のヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を示す図である。多能性マーカーの発現に基づくヒト多能性幹細胞の選別およびその後の最適化されたＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養における選別された細胞の維持の実証。Ａ．選別する前に、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ－１８１に対する抗体マーカーで標識した。細胞を、ＦＡＣｓ技術を用い、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の表面マーカー発現に基づいて選別した。選別後、細胞を最初にＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に播種し、この培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。選別の１日後、選別された細胞を分割し、５日目までには、数百の細胞からなる大きなコロニーが存在していた。Ｂ．選別された細胞は、多能性マーカーであるＴｒａ１６０の発現を保持した。Ｔｒａ１６０、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．選別後に５回継代、およそ１ヶ月の培養後、定量的フローサイトメトリー分析により、ＳＳＥＡ４染色およびＴｒａ１８１染色に基づいて、大多数の選別されたｉＰＳＣがそれらの多能性状態を保持したことが明らかになった。Ｄ．６ウェルプレートのウェル当たり５００事象、フィーダーフリー表面上でｃｍ２当たりおよそ５２事象のクローンの密度を含めた、ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞に由来する種々の密度をプレーティングし、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充した。選別した７日後に、播種したウェルのそれぞれにおいて多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが現れた。Ｅ．得られたアルカリホスファターゼ陽性コロニーをスコア化した。播種した事象のおよそ８～１０％がコロニーを生じ、ウェル当たり１６，０００事象がほぼ集密なウェルを生じた。Ｎ．Ｃ．、正確な計数を妨げる集密度に起因して計数されず。Ｆ．ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞を、直接９６ウェル－プレートに、ウェル当たり１事象、およそｃｍ２当たり３事象を含めた種々の密度で選別して入れた。選別した８日後にウェルをアルカリホスファターゼについて染色した。Ｇ．８日目に各ウェルをアルカリホスファターゼコロニーについてスコア化した。 図４は、増強された単細胞選別およびその後のヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を示す図である。多能性マーカーの発現に基づくヒト多能性幹細胞の選別およびその後の最適化されたＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養における選別された細胞の維持の実証。Ａ．選別する前に、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ－１８１に対する抗体マーカーで標識した。細胞を、ＦＡＣｓ技術を用い、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の表面マーカー発現に基づいて選別した。選別後、細胞を最初にＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に播種し、この培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。選別の１日後、選別された細胞を分割し、５日目までには、数百の細胞からなる大きなコロニーが存在していた。Ｂ．選別された細胞は、多能性マーカーであるＴｒａ１６０の発現を保持した。Ｔｒａ１６０、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．選別後に５回継代、およそ１ヶ月の培養後、定量的フローサイトメトリー分析により、ＳＳＥＡ４染色およびＴｒａ１８１染色に基づいて、大多数の選別されたｉＰＳＣがそれらの多能性状態を保持したことが明らかになった。Ｄ．６ウェルプレートのウェル当たり５００事象、フィーダーフリー表面上でｃｍ２当たりおよそ５２事象のクローンの密度を含めた、ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞に由来する種々の密度をプレーティングし、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充した。選別した７日後に、播種したウェルのそれぞれにおいて多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが現れた。Ｅ．得られたアルカリホスファターゼ陽性コロニーをスコア化した。播種した事象のおよそ８～１０％がコロニーを生じ、ウェル当たり１６，０００事象がほぼ集密なウェルを生じた。Ｎ．Ｃ．、正確な計数を妨げる集密度に起因して計数されず。Ｆ．ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞を、直接９６ウェル－プレートに、ウェル当たり１事象、およそｃｍ２当たり３事象を含めた種々の密度で選別して入れた。選別した８日後にウェルをアルカリホスファターゼについて染色した。Ｇ．８日目に各ウェルをアルカリホスファターゼコロニーについてスコア化した。 図４は、増強された単細胞選別およびその後のヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を示す図である。多能性マーカーの発現に基づくヒト多能性幹細胞の選別およびその後の最適化されたＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養における選別された細胞の維持の実証。Ａ．選別する前に、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ－１８１に対する抗体マーカーで標識した。細胞を、ＦＡＣｓ技術を用い、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の表面マーカー発現に基づいて選別した。選別後、細胞を最初にＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に播種し、この培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。選別の１日後、選別された細胞を分割し、５日目までには、数百の細胞からなる大きなコロニーが存在していた。Ｂ．選別された細胞は、多能性マーカーであるＴｒａ１６０の発現を保持した。Ｔｒａ１６０、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．選別後に５回継代、およそ１ヶ月の培養後、定量的フローサイトメトリー分析により、ＳＳＥＡ４染色およびＴｒａ１８１染色に基づいて、大多数の選別されたｉＰＳＣがそれらの多能性状態を保持したことが明らかになった。Ｄ．６ウェルプレートのウェル当たり５００事象、フィーダーフリー表面上でｃｍ２当たりおよそ５２事象のクローンの密度を含めた、ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞に由来する種々の密度をプレーティングし、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充した。選別した７日後に、播種したウェルのそれぞれにおいて多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが現れた。Ｅ．得られたアルカリホスファターゼ陽性コロニーをスコア化した。播種した事象のおよそ８～１０％がコロニーを生じ、ウェル当たり１６，０００事象がほぼ集密なウェルを生じた。Ｎ．Ｃ．、正確な計数を妨げる集密度に起因して計数されず。Ｆ．ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞を、直接９６ウェル－プレートに、ウェル当たり１事象、およそｃｍ２当たり３事象を含めた種々の密度で選別して入れた。選別した８日後にウェルをアルカリホスファターゼについて染色した。Ｇ．８日目に各ウェルをアルカリホスファターゼコロニーについてスコア化した。 図４は、増強された単細胞選別およびその後のヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を示す図である。多能性マーカーの発現に基づくヒト多能性幹細胞の選別およびその後の最適化されたＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養における選別された細胞の維持の実証。Ａ．選別する前に、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ－１８１に対する抗体マーカーで標識した。細胞を、ＦＡＣｓ技術を用い、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の表面マーカー発現に基づいて選別した。選別後、細胞を最初にＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に播種し、この培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。選別の１日後、選別された細胞を分割し、５日目までには、数百の細胞からなる大きなコロニーが存在していた。Ｂ．選別された細胞は、多能性マーカーであるＴｒａ１６０の発現を保持した。Ｔｒａ１６０、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．選別後に５回継代、およそ１ヶ月の培養後、定量的フローサイトメトリー分析により、ＳＳＥＡ４染色およびＴｒａ１８１染色に基づいて、大多数の選別されたｉＰＳＣがそれらの多能性状態を保持したことが明らかになった。Ｄ．６ウェルプレートのウェル当たり５００事象、フィーダーフリー表面上でｃｍ２当たりおよそ５２事象のクローンの密度を含めた、ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞に由来する種々の密度をプレーティングし、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充した。選別した７日後に、播種したウェルのそれぞれにおいて多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが現れた。Ｅ．得られたアルカリホスファターゼ陽性コロニーをスコア化した。播種した事象のおよそ８～１０％がコロニーを生じ、ウェル当たり１６，０００事象がほぼ集密なウェルを生じた。Ｎ．Ｃ．、正確な計数を妨げる集密度に起因して計数されず。Ｆ．ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞を、直接９６ウェル－プレートに、ウェル当たり１事象、およそｃｍ２当たり３事象を含めた種々の密度で選別して入れた。選別した８日後にウェルをアルカリホスファターゼについて染色した。Ｇ．８日目に各ウェルをアルカリホスファターゼコロニーについてスコア化した。 図４は、増強された単細胞選別およびその後のヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を示す図である。多能性マーカーの発現に基づくヒト多能性幹細胞の選別およびその後の最適化されたＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養における選別された細胞の維持の実証。Ａ．選別する前に、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ－１８１に対する抗体マーカーで標識した。細胞を、ＦＡＣｓ技術を用い、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の表面マーカー発現に基づいて選別した。選別後、細胞を最初にＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に播種し、この培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。選別の１日後、選別された細胞を分割し、５日目までには、数百の細胞からなる大きなコロニーが存在していた。Ｂ．選別された細胞は、多能性マーカーであるＴｒａ１６０の発現を保持した。Ｔｒａ１６０、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．選別後に５回継代、およそ１ヶ月の培養後、定量的フローサイトメトリー分析により、ＳＳＥＡ４染色およびＴｒａ１８１染色に基づいて、大多数の選別されたｉＰＳＣがそれらの多能性状態を保持したことが明らかになった。Ｄ．６ウェルプレートのウェル当たり５００事象、フィーダーフリー表面上でｃｍ２当たりおよそ５２事象のクローンの密度を含めた、ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞に由来する種々の密度をプレーティングし、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充した。選別した７日後に、播種したウェルのそれぞれにおいて多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが現れた。Ｅ．得られたアルカリホスファターゼ陽性コロニーをスコア化した。播種した事象のおよそ８～１０％がコロニーを生じ、ウェル当たり１６，０００事象がほぼ集密なウェルを生じた。Ｎ．Ｃ．、正確な計数を妨げる集密度に起因して計数されず。Ｆ．ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞を、直接９６ウェル－プレートに、ウェル当たり１事象、およそｃｍ２当たり３事象を含めた種々の密度で選別して入れた。選別した８日後にウェルをアルカリホスファターゼについて染色した。Ｇ．８日目に各ウェルをアルカリホスファターゼコロニーについてスコア化した。 図４は、増強された単細胞選別およびその後のヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を示す図である。多能性マーカーの発現に基づくヒト多能性幹細胞の選別およびその後の最適化されたＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養における選別された細胞の維持の実証。Ａ．選別する前に、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ－１８１に対する抗体マーカーで標識した。細胞を、ＦＡＣｓ技術を用い、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の表面マーカー発現に基づいて選別した。選別後、細胞を最初にＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に播種し、この培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。選別の１日後、選別された細胞を分割し、５日目までには、数百の細胞からなる大きなコロニーが存在していた。Ｂ．選別された細胞は、多能性マーカーであるＴｒａ１６０の発現を保持した。Ｔｒａ１６０、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．選別後に５回継代、およそ１ヶ月の培養後、定量的フローサイトメトリー分析により、ＳＳＥＡ４染色およびＴｒａ１８１染色に基づいて、大多数の選別されたｉＰＳＣがそれらの多能性状態を保持したことが明らかになった。Ｄ．６ウェルプレートのウェル当たり５００事象、フィーダーフリー表面上でｃｍ２当たりおよそ５２事象のクローンの密度を含めた、ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞に由来する種々の密度をプレーティングし、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充した。選別した７日後に、播種したウェルのそれぞれにおいて多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが現れた。Ｅ．得られたアルカリホスファターゼ陽性コロニーをスコア化した。播種した事象のおよそ８～１０％がコロニーを生じ、ウェル当たり１６，０００事象がほぼ集密なウェルを生じた。Ｎ．Ｃ．、正確な計数を妨げる集密度に起因して計数されず。Ｆ．ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞を、直接９６ウェル－プレートに、ウェル当たり１事象、およそｃｍ２当たり３事象を含めた種々の密度で選別して入れた。選別した８日後にウェルをアルカリホスファターゼについて染色した。Ｇ．８日目に各ウェルをアルカリホスファターゼコロニーについてスコア化した。 図４は、増強された単細胞選別およびその後のヒト多能性幹細胞のフィーダーフリー培養を示す図である。多能性マーカーの発現に基づくヒト多能性幹細胞の選別およびその後の最適化されたＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養における選別された細胞の維持の実証。Ａ．選別する前に、ヒト多能性幹細胞を単細胞に解離させ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ－１８１に対する抗体マーカーで標識した。細胞を、ＦＡＣｓ技術を用い、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の表面マーカー発現に基づいて選別した。選別後、細胞を最初にＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に播種し、この培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。選別の１日後、選別された細胞を分割し、５日目までには、数百の細胞からなる大きなコロニーが存在していた。Ｂ．選別された細胞は、多能性マーカーであるＴｒａ１６０の発現を保持した。Ｔｒａ１６０、赤色；ＤＡＰＩ、青色。Ｃ．選別後に５回継代、およそ１ヶ月の培養後、定量的フローサイトメトリー分析により、ＳＳＥＡ４染色およびＴｒａ１８１染色に基づいて、大多数の選別されたｉＰＳＣがそれらの多能性状態を保持したことが明らかになった。Ｄ．６ウェルプレートのウェル当たり５００事象、フィーダーフリー表面上でｃｍ２当たりおよそ５２事象のクローンの密度を含めた、ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞に由来する種々の密度をプレーティングし、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充した。選別した７日後に、播種したウェルのそれぞれにおいて多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが現れた。Ｅ．得られたアルカリホスファターゼ陽性コロニーをスコア化した。播種した事象のおよそ８～１０％がコロニーを生じ、ウェル当たり１６，０００事象がほぼ集密なウェルを生じた。Ｎ．Ｃ．、正確な計数を妨げる集密度に起因して計数されず。Ｆ．ＳＳＥＡ４＋ヒト多能性幹細胞およびＴｒａ１８１＋ヒト多能性幹細胞を、直接９６ウェル－プレートに、ウェル当たり１事象、およそｃｍ２当たり３事象を含めた種々の密度で選別して入れた。選別した８日後にウェルをアルカリホスファターゼについて染色した。Ｇ．８日目に各ウェルをアルカリホスファターゼコロニーについてスコア化した。 図５は、ＳＭＣ４培地の不在下および存在下での再プログラミングのカイネティクスを示す図である。Ａ．Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃを異所性発現させることによって再プログラミングを開始した７日後、細胞を、従来の培地中で維持したか、またはＳＭＣ４培地に切り換えた。再プログラミングの２０日後に、従来の培地での培養では、あったとしてもわずかなｉＰＳＣ様コロニーが形成されたが、ＳＭＣ４培地に切り換えた細胞では、多くのｉＰＳＣ様コロニーが現れた。Ｂ．ＳＭＣ４培地中の多くのｉＰＳＣ様コロニーでアルカリホスファターゼが発現されたが、従来の培養ではわずかなコロニーでアルカリホスファターゼが発現された。 図５は、ＳＭＣ４培地の不在下および存在下での再プログラミングのカイネティクスを示す図である。Ａ．Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃＭｙｃを異所性発現させることによって再プログラミングを開始した７日後、細胞を、従来の培地中で維持したか、またはＳＭＣ４培地に切り換えた。再プログラミングの２０日後に、従来の培地での培養では、あったとしてもわずかなｉＰＳＣ様コロニーが形成されたが、ＳＭＣ４培地に切り換えた細胞では、多くのｉＰＳＣ様コロニーが現れた。Ｂ．ＳＭＣ４培地中の多くのｉＰＳＣ様コロニーでアルカリホスファターゼが発現されたが、従来の培養ではわずかなコロニーでアルカリホスファターゼが発現された。 図６は、ＳＭＣ４培地中で培養することにより、ナイーブな特性が促進されることを示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞のＳＭＣ４培地への適合および従来法で維持されたヒト多能性幹細胞との比較の概略図。Ｂ．どちらもそれぞれの培地中で１１回の継代にわたって培養した、ＩＭＲ９０親細胞（従来法で得られたｈｉＰＳＣ（Ｃｏｎｖ）およびＳＭＣ４培地に適合させたｈｉＰＳＣ（ＳＭＣ４培地））に由来するｈｉＰＳＣの間の、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、どちらのｈｉＰＳＣも、互いに類似しており、それらの親のＩＭＲ９０細胞とは異なることが実証されている。Ｃ．Ｘｉｓｔの発現は、従来の様式で培養したｈｉＰＳＣではそれらの親のＩＭＲ９０細胞系と比較して適度に抑制されたが、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣでは有意に抑制され、女性のｈＥＳＣ、ＨＵＥＳ９のレベルと類似していた。Ｄ．Ｘ染色体に位置する遺伝子が、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣにおいて、従来法で培養したｈｉＰＳＣにおける発現と比較してより高度に発現された。Ｅ．フィーダー細胞上に戻したところ、ＳＭＣ４培地中で維持したｈｉＰＳＣは、従来の培地中で培養したｈｉＰＳＣと比較して、三次元的な形状が多く平らな形態が少ないことによって認められるように、マウスＥＳＣにより類似した形態を示す。 図６は、ＳＭＣ４培地中で培養することにより、ナイーブな特性が促進されることを示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞のＳＭＣ４培地への適合および従来法で維持されたヒト多能性幹細胞との比較の概略図。Ｂ．どちらもそれぞれの培地中で１１回の継代にわたって培養した、ＩＭＲ９０親細胞（従来法で得られたｈｉＰＳＣ（Ｃｏｎｖ）およびＳＭＣ４培地に適合させたｈｉＰＳＣ（ＳＭＣ４培地））に由来するｈｉＰＳＣの間の、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、どちらのｈｉＰＳＣも、互いに類似しており、それらの親のＩＭＲ９０細胞とは異なることが実証されている。Ｃ．Ｘｉｓｔの発現は、従来の様式で培養したｈｉＰＳＣではそれらの親のＩＭＲ９０細胞系と比較して適度に抑制されたが、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣでは有意に抑制され、女性のｈＥＳＣ、ＨＵＥＳ９のレベルと類似していた。Ｄ．Ｘ染色体に位置する遺伝子が、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣにおいて、従来法で培養したｈｉＰＳＣにおける発現と比較してより高度に発現された。Ｅ．フィーダー細胞上に戻したところ、ＳＭＣ４培地中で維持したｈｉＰＳＣは、従来の培地中で培養したｈｉＰＳＣと比較して、三次元的な形状が多く平らな形態が少ないことによって認められるように、マウスＥＳＣにより類似した形態を示す。 図６は、ＳＭＣ４培地中で培養することにより、ナイーブな特性が促進されることを示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞のＳＭＣ４培地への適合および従来法で維持されたヒト多能性幹細胞との比較の概略図。Ｂ．どちらもそれぞれの培地中で１１回の継代にわたって培養した、ＩＭＲ９０親細胞（従来法で得られたｈｉＰＳＣ（Ｃｏｎｖ）およびＳＭＣ４培地に適合させたｈｉＰＳＣ（ＳＭＣ４培地））に由来するｈｉＰＳＣの間の、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、どちらのｈｉＰＳＣも、互いに類似しており、それらの親のＩＭＲ９０細胞とは異なることが実証されている。Ｃ．Ｘｉｓｔの発現は、従来の様式で培養したｈｉＰＳＣではそれらの親のＩＭＲ９０細胞系と比較して適度に抑制されたが、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣでは有意に抑制され、女性のｈＥＳＣ、ＨＵＥＳ９のレベルと類似していた。Ｄ．Ｘ染色体に位置する遺伝子が、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣにおいて、従来法で培養したｈｉＰＳＣにおける発現と比較してより高度に発現された。Ｅ．フィーダー細胞上に戻したところ、ＳＭＣ４培地中で維持したｈｉＰＳＣは、従来の培地中で培養したｈｉＰＳＣと比較して、三次元的な形状が多く平らな形態が少ないことによって認められるように、マウスＥＳＣにより類似した形態を示す。 図６は、ＳＭＣ４培地中で培養することにより、ナイーブな特性が促進されることを示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞のＳＭＣ４培地への適合および従来法で維持されたヒト多能性幹細胞との比較の概略図。Ｂ．どちらもそれぞれの培地中で１１回の継代にわたって培養した、ＩＭＲ９０親細胞（従来法で得られたｈｉＰＳＣ（Ｃｏｎｖ）およびＳＭＣ４培地に適合させたｈｉＰＳＣ（ＳＭＣ４培地））に由来するｈｉＰＳＣの間の、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、どちらのｈｉＰＳＣも、互いに類似しており、それらの親のＩＭＲ９０細胞とは異なることが実証されている。Ｃ．Ｘｉｓｔの発現は、従来の様式で培養したｈｉＰＳＣではそれらの親のＩＭＲ９０細胞系と比較して適度に抑制されたが、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣでは有意に抑制され、女性のｈＥＳＣ、ＨＵＥＳ９のレベルと類似していた。Ｄ．Ｘ染色体に位置する遺伝子が、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣにおいて、従来法で培養したｈｉＰＳＣにおける発現と比較してより高度に発現された。Ｅ．フィーダー細胞上に戻したところ、ＳＭＣ４培地中で維持したｈｉＰＳＣは、従来の培地中で培養したｈｉＰＳＣと比較して、三次元的な形状が多く平らな形態が少ないことによって認められるように、マウスＥＳＣにより類似した形態を示す。 図６は、ＳＭＣ４培地中で培養することにより、ナイーブな特性が促進されることを示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞のＳＭＣ４培地への適合および従来法で維持されたヒト多能性幹細胞との比較の概略図。Ｂ．どちらもそれぞれの培地中で１１回の継代にわたって培養した、ＩＭＲ９０親細胞（従来法で得られたｈｉＰＳＣ（Ｃｏｎｖ）およびＳＭＣ４培地に適合させたｈｉＰＳＣ（ＳＭＣ４培地））に由来するｈｉＰＳＣの間の、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、どちらのｈｉＰＳＣも、互いに類似しており、それらの親のＩＭＲ９０細胞とは異なることが実証されている。Ｃ．Ｘｉｓｔの発現は、従来の様式で培養したｈｉＰＳＣではそれらの親のＩＭＲ９０細胞系と比較して適度に抑制されたが、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣでは有意に抑制され、女性のｈＥＳＣ、ＨＵＥＳ９のレベルと類似していた。Ｄ．Ｘ染色体に位置する遺伝子が、ＳＭＣ４培地中で培養したｈｉＰＳＣにおいて、従来法で培養したｈｉＰＳＣにおける発現と比較してより高度に発現された。Ｅ．フィーダー細胞上に戻したところ、ＳＭＣ４培地中で維持したｈｉＰＳＣは、従来の培地中で培養したｈｉＰＳＣと比較して、三次元的な形状が多く平らな形態が少ないことによって認められるように、マウスＥＳＣにより類似した形態を示す。 図７は、ＳＭＣ４培地中で生成し、維持することにより、ヒト多能性幹細胞の未分化の状態が改善されることを示す図である。Ａ．ＳＭＣ４培地中で生成し、ＳＭＣ４培地中、ＦＦ培養で維持したクローンＦＴｉ９１および９３、ならびに従来の培地中で生成し、フィーダー細胞で維持したクローンＦＴｉ９９の並行した生成の概略図。Ｂ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、得られた多能性系間の密接な関連性および出発細胞系（ＦＴＣ１）からの離れた関連性が示されている。Ｃ．Ｈｕｅｓ９、Ｈ１、ＦＴｉ９９、ＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３の中で４倍差次的に発現された遺伝子全てに基づく階層クラスタリングであり、これは、従来の系において培養した多能性系とＳＭＣ４培地中で培養した多能性系の間の分離が実証されている。Ｄ．ＳＭＣ４培地群（ＦＴｉ９１および９３）と従来の培地群（Ｈ１、Ｈｕｅｓ９およびＦＴｉ９９）との間で比較した、ナイーブな分化および系統分化に関連する選択された遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現であり、これは、ＳＭＣ４培地セットにおける、多能性に関連する多くの遺伝子の発現の増加および系統特異的な遺伝子発現の有意な低下が示されている。Ｅ．ナイーブ状態のｈｉＰＳＣを得る種々の方法の概略図。下のパネルには、プライムされた状態に対するナイーブな状態の利点が記載されている。 図７は、ＳＭＣ４培地中で生成し、維持することにより、ヒト多能性幹細胞の未分化の状態が改善されることを示す図である。Ａ．ＳＭＣ４培地中で生成し、ＳＭＣ４培地中、ＦＦ培養で維持したクローンＦＴｉ９１および９３、ならびに従来の培地中で生成し、フィーダー細胞で維持したクローンＦＴｉ９９の並行した生成の概略図。Ｂ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、得られた多能性系間の密接な関連性および出発細胞系（ＦＴＣ１）からの離れた関連性が示されている。Ｃ．Ｈｕｅｓ９、Ｈ１、ＦＴｉ９９、ＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３の中で４倍差次的に発現された遺伝子全てに基づく階層クラスタリングであり、これは、従来の系において培養した多能性系とＳＭＣ４培地中で培養した多能性系の間の分離が実証されている。Ｄ．ＳＭＣ４培地群（ＦＴｉ９１および９３）と従来の培地群（Ｈ１、Ｈｕｅｓ９およびＦＴｉ９９）との間で比較した、ナイーブな分化および系統分化に関連する選択された遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現であり、これは、ＳＭＣ４培地セットにおける、多能性に関連する多くの遺伝子の発現の増加および系統特異的な遺伝子発現の有意な低下が示されている。Ｅ．ナイーブ状態のｈｉＰＳＣを得る種々の方法の概略図。下のパネルには、プライムされた状態に対するナイーブな状態の利点が記載されている。 図７は、ＳＭＣ４培地中で生成し、維持することにより、ヒト多能性幹細胞の未分化の状態が改善されることを示す図である。Ａ．ＳＭＣ４培地中で生成し、ＳＭＣ４培地中、ＦＦ培養で維持したクローンＦＴｉ９１および９３、ならびに従来の培地中で生成し、フィーダー細胞で維持したクローンＦＴｉ９９の並行した生成の概略図。Ｂ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、得られた多能性系間の密接な関連性および出発細胞系（ＦＴＣ１）からの離れた関連性が示されている。Ｃ．Ｈｕｅｓ９、Ｈ１、ＦＴｉ９９、ＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３の中で４倍差次的に発現された遺伝子全てに基づく階層クラスタリングであり、これは、従来の系において培養した多能性系とＳＭＣ４培地中で培養した多能性系の間の分離が実証されている。Ｄ．ＳＭＣ４培地群（ＦＴｉ９１および９３）と従来の培地群（Ｈ１、Ｈｕｅｓ９およびＦＴｉ９９）との間で比較した、ナイーブな分化および系統分化に関連する選択された遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現であり、これは、ＳＭＣ４培地セットにおける、多能性に関連する多くの遺伝子の発現の増加および系統特異的な遺伝子発現の有意な低下が示されている。Ｅ．ナイーブ状態のｈｉＰＳＣを得る種々の方法の概略図。下のパネルには、プライムされた状態に対するナイーブな状態の利点が記載されている。 図７は、ＳＭＣ４培地中で生成し、維持することにより、ヒト多能性幹細胞の未分化の状態が改善されることを示す図である。Ａ．ＳＭＣ４培地中で生成し、ＳＭＣ４培地中、ＦＦ培養で維持したクローンＦＴｉ９１および９３、ならびに従来の培地中で生成し、フィーダー細胞で維持したクローンＦＴｉ９９の並行した生成の概略図。Ｂ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、得られた多能性系間の密接な関連性および出発細胞系（ＦＴＣ１）からの離れた関連性が示されている。Ｃ．Ｈｕｅｓ９、Ｈ１、ＦＴｉ９９、ＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３の中で４倍差次的に発現された遺伝子全てに基づく階層クラスタリングであり、これは、従来の系において培養した多能性系とＳＭＣ４培地中で培養した多能性系の間の分離が実証されている。Ｄ．ＳＭＣ４培地群（ＦＴｉ９１および９３）と従来の培地群（Ｈ１、Ｈｕｅｓ９およびＦＴｉ９９）との間で比較した、ナイーブな分化および系統分化に関連する選択された遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現であり、これは、ＳＭＣ４培地セットにおける、多能性に関連する多くの遺伝子の発現の増加および系統特異的な遺伝子発現の有意な低下が示されている。Ｅ．ナイーブ状態のｈｉＰＳＣを得る種々の方法の概略図。下のパネルには、プライムされた状態に対するナイーブな状態の利点が記載されている。 図７は、ＳＭＣ４培地中で生成し、維持することにより、ヒト多能性幹細胞の未分化の状態が改善されることを示す図である。Ａ．ＳＭＣ４培地中で生成し、ＳＭＣ４培地中、ＦＦ培養で維持したクローンＦＴｉ９１および９３、ならびに従来の培地中で生成し、フィーダー細胞で維持したクローンＦＴｉ９９の並行した生成の概略図。Ｂ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現およびピアソン係数に基づく階層クラスタリングにより、得られた多能性系間の密接な関連性および出発細胞系（ＦＴＣ１）からの離れた関連性が示されている。Ｃ．Ｈｕｅｓ９、Ｈ１、ＦＴｉ９９、ＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３の中で４倍差次的に発現された遺伝子全てに基づく階層クラスタリングであり、これは、従来の系において培養した多能性系とＳＭＣ４培地中で培養した多能性系の間の分離が実証されている。Ｄ．ＳＭＣ４培地群（ＦＴｉ９１および９３）と従来の培地群（Ｈ１、Ｈｕｅｓ９およびＦＴｉ９９）との間で比較した、ナイーブな分化および系統分化に関連する選択された遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現であり、これは、ＳＭＣ４培地セットにおける、多能性に関連する多くの遺伝子の発現の増加および系統特異的な遺伝子発現の有意な低下が示されている。Ｅ．ナイーブ状態のｈｉＰＳＣを得る種々の方法の概略図。下のパネルには、プライムされた状態に対するナイーブな状態の利点が記載されている。 図８は、再プログラミングプロセスの間に生成した非ｉＰＳＣコロニーを示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期の典型的な細胞集団：免疫染色により、大多数の成長が速い細胞が、ＳＳＥＡ４陰性であり、必然的に非多能性細胞であるコロニーを形成したことが示された。これらの細胞は、形質転換され、高度に増殖性であり、直ちに成長し、培養物の優位を占めた。コロニー１はｉＰＳＣコロニーになる潜在性を有するＳＳＥＡ４陽性コロニーを示し、コロニー２は、高い増殖速度を有するが、多能性マーカー染色に対しては陰性である形質転換された集団を示す。Ｂ．多くの非ｉＰＳＣコロニーは単一の多能性マーカーの発現を示したが、真のｉＰＳＣコロニーは、複数の多能性マーカーの発現を示した。再プログラミングの後期では種々のコロニーが形成され、一部のコロニー、すなわち、コロニー１はＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方に対して二重に陽性であったが、他のコロニー、例えば、コロニー４および５は、マーカーのうちの１つに対してのみ陽性であったか、またはいずれに対しても陽性ではなかった。 図８は、再プログラミングプロセスの間に生成した非ｉＰＳＣコロニーを示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期の典型的な細胞集団：免疫染色により、大多数の成長が速い細胞が、ＳＳＥＡ４陰性であり、必然的に非多能性細胞であるコロニーを形成したことが示された。これらの細胞は、形質転換され、高度に増殖性であり、直ちに成長し、培養物の優位を占めた。コロニー１はｉＰＳＣコロニーになる潜在性を有するＳＳＥＡ４陽性コロニーを示し、コロニー２は、高い増殖速度を有するが、多能性マーカー染色に対しては陰性である形質転換された集団を示す。Ｂ．多くの非ｉＰＳＣコロニーは単一の多能性マーカーの発現を示したが、真のｉＰＳＣコロニーは、複数の多能性マーカーの発現を示した。再プログラミングの後期では種々のコロニーが形成され、一部のコロニー、すなわち、コロニー１はＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方に対して二重に陽性であったが、他のコロニー、例えば、コロニー４および５は、マーカーのうちの１つに対してのみ陽性であったか、またはいずれに対しても陽性ではなかった。 図９は、ｉＰＳＣなどの多能性細胞の、細胞選別を用いた選択を示す図である。多能性細胞と非多能性細胞の混合物から多能性細胞を富化し、選択するために使用する単細胞の培養系および細胞選別方法体系の概略図。 図１０は、多能性マーカーの同定を示すグラフである。ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋細胞に特異的なさらなるマーカーを調査するために、種々の表面マーカーを評価した。Ｔｒａ１６０の発現は、それがＴｒａ１８１の発現とよく相関することが実証されているので、その検出を陽性対照として用いた。ＣＤ２００およびＣＤ９０については、ＳＳＥＡ－／Ｔｒａ１８１－集団とＳＳＥＡ＋／Ｔｒａ１８１＋集団のどちらでも同様に染色されるので、多能性細胞に特異的ではないようであるが、一方で、ＣＤ９では、ＳＳＥＡ＋／Ｔｒａ１８１＋集団に対するわずかな特異性が認められる。しかし、ＣＤ５０およびＣＤ３０では、ＳＳＥＡ－／Ｔｒａ１８１－集団と比較して、ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋集団が優先的に同定されるようである。 図１１は、ＣＤ３０がＮａｎｏｇを発現しているクローンに特異的であることを示す図である。Ａ．種々のｈｉＰＳＣ系のＳＳＥＡ４／Ｔｒａ１８１発現の代表的なフロープロファイルであり、得られたクローンは全て、ＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方を発現している複数の集団を表すことが実証される。Ｂ．（Ａ）において見出されるゲーティングに基づいて、各細胞系のＣＤ３０およびＣＤ９のフロープロファイルを評価した。ＣＤ３０はクローンＦＴＣ８クローン１およびＦＴｉ３１のみが発現するようであるが、ＣＤ９は全てのクローンが発現する。Ｃ．種々の系の相対的なＮａｎｏｇの発現も評価した。Ｄ．ＣＤ３０の発現のみがＮａｎｏｇの発現と相関することを実証している概略表。 図１１は、ＣＤ３０がＮａｎｏｇを発現しているクローンに特異的であることを示す図である。Ａ．種々のｈｉＰＳＣ系のＳＳＥＡ４／Ｔｒａ１８１発現の代表的なフロープロファイルであり、得られたクローンは全て、ＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方を発現している複数の集団を表すことが実証される。Ｂ．（Ａ）において見出されるゲーティングに基づいて、各細胞系のＣＤ３０およびＣＤ９のフロープロファイルを評価した。ＣＤ３０はクローンＦＴＣ８クローン１およびＦＴｉ３１のみが発現するようであるが、ＣＤ９は全てのクローンが発現する。Ｃ．種々の系の相対的なＮａｎｏｇの発現も評価した。Ｄ．ＣＤ３０の発現のみがＮａｎｏｇの発現と相関することを実証している概略表。 図１１は、ＣＤ３０がＮａｎｏｇを発現しているクローンに特異的であることを示す図である。Ａ．種々のｈｉＰＳＣ系のＳＳＥＡ４／Ｔｒａ１８１発現の代表的なフロープロファイルであり、得られたクローンは全て、ＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方を発現している複数の集団を表すことが実証される。Ｂ．（Ａ）において見出されるゲーティングに基づいて、各細胞系のＣＤ３０およびＣＤ９のフロープロファイルを評価した。ＣＤ３０はクローンＦＴＣ８クローン１およびＦＴｉ３１のみが発現するようであるが、ＣＤ９は全てのクローンが発現する。Ｃ．種々の系の相対的なＮａｎｏｇの発現も評価した。Ｄ．ＣＤ３０の発現のみがＮａｎｏｇの発現と相関することを実証している概略表。 図１１は、ＣＤ３０がＮａｎｏｇを発現しているクローンに特異的であることを示す図である。Ａ．種々のｈｉＰＳＣ系のＳＳＥＡ４／Ｔｒａ１８１発現の代表的なフロープロファイルであり、得られたクローンは全て、ＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方を発現している複数の集団を表すことが実証される。Ｂ．（Ａ）において見出されるゲーティングに基づいて、各細胞系のＣＤ３０およびＣＤ９のフロープロファイルを評価した。ＣＤ３０はクローンＦＴＣ８クローン１およびＦＴｉ３１のみが発現するようであるが、ＣＤ９は全てのクローンが発現する。Ｃ．種々の系の相対的なＮａｎｏｇの発現も評価した。Ｄ．ＣＤ３０の発現のみがＮａｎｏｇの発現と相関することを実証している概略表。 図１２は、再プログラミングプロセスの間に再プログラミングされていない細胞を枯渇させることにより、再プログラミングされた細胞が富化されることを示す図である。再プログラミングプロセスの間に、再プログラミングされた細胞と再プログラミングされていない細胞の混成集団が存在し、ほんの少数の細胞集団が、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の発現によって示されるように、完全な多能性に再プログラミングされた細胞を示した（黒い点線の矢印によって示される）。しかし、再プログラミングされていない細胞を混成集団から除去したまたは枯渇させたところ、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１陽性集団の有意な富化が実証された。灰色の実線の矢印によって示されるように、ＣＤ１３陰性の細胞集団は、ＣＤ１３が低い集団細胞および高い集団細胞と比較して、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１陽性細胞が有意に富化された集団を示した。 図１３は、ＩＭＲ９０およびＡＳＣを含めた種々の供給源からの単細胞選別および多能性幹細胞の富化による細胞の再プログラミングの増強を示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期にある細胞集団を、ＳＳＥＡ４＋細胞の単細胞選別によって富化した。再プログラミングされた細胞および再プログラミングされていない細胞を含有する出発細胞集団を、酵素によって単細胞に解離させ、独特の多能性のマーカーについて染色し、免疫結合体化した磁気ビーズによって表面マーカーの発現に基づいて選別して、ＳＳＥＡ４について陽性である細胞集団を得た。このＳＳＥＡ４＋細胞の富化の後、ＳＳＥＡ４＋細胞１０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたディッシュ上に播種し、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかで、ＦＦ環境において培養した。選別の８日後にＡＰ染色を行った。これらの右端の小さな挿入パネルは、代表的な細胞形態の画像である。従来の培養ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかったが、ＳＭＣ４培地では多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが得られた。Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＳＭＣ４培地の存在下または不在下での細胞の再プログラミングにより得られるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋コロニーの数をスコア化した。Ｃ．ＳＭＣ４培地を用いたフィーダーフリー条件および単細胞の培養においてＩＭＲ９０線維芽細胞または脂肪幹細胞のいずれかから得られるｉＰＳＣクローンは多能性のマーカーを発現した。Ｄ．単細胞選別方法を用いて得られたｉＰＳＣクローンの集団全体のフローサイトメトリー分析により、大多数の細胞が、重要な多能性マーカーについて陽性であったことが明らかになった。Ｅ．ＳＳＥＡ４についての単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めたヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞または脂肪幹細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣでは、３日後に再プログラミング因子を発現しているレンチウイルスを感染させた対照線維芽細胞とは異なり、有効にサイレンシングされた。Ｇ．ＳＳＥＡ４に基づく単細胞選別を用いて生成したｉＰＳＣは、分化すると３種の体細胞全てに容易に発達した。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）。 図１３は、ＩＭＲ９０およびＡＳＣを含めた種々の供給源からの単細胞選別および多能性幹細胞の富化による細胞の再プログラミングの増強を示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期にある細胞集団を、ＳＳＥＡ４＋細胞の単細胞選別によって富化した。再プログラミングされた細胞および再プログラミングされていない細胞を含有する出発細胞集団を、酵素によって単細胞に解離させ、独特の多能性のマーカーについて染色し、免疫結合体化した磁気ビーズによって表面マーカーの発現に基づいて選別して、ＳＳＥＡ４について陽性である細胞集団を得た。このＳＳＥＡ４＋細胞の富化の後、ＳＳＥＡ４＋細胞１０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたディッシュ上に播種し、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかで、ＦＦ環境において培養した。選別の８日後にＡＰ染色を行った。これらの右端の小さな挿入パネルは、代表的な細胞形態の画像である。従来の培養ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかったが、ＳＭＣ４培地では多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが得られた。Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＳＭＣ４培地の存在下または不在下での細胞の再プログラミングにより得られるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋コロニーの数をスコア化した。Ｃ．ＳＭＣ４培地を用いたフィーダーフリー条件および単細胞の培養においてＩＭＲ９０線維芽細胞または脂肪幹細胞のいずれかから得られるｉＰＳＣクローンは多能性のマーカーを発現した。Ｄ．単細胞選別方法を用いて得られたｉＰＳＣクローンの集団全体のフローサイトメトリー分析により、大多数の細胞が、重要な多能性マーカーについて陽性であったことが明らかになった。Ｅ．ＳＳＥＡ４についての単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めたヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞または脂肪幹細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣでは、３日後に再プログラミング因子を発現しているレンチウイルスを感染させた対照線維芽細胞とは異なり、有効にサイレンシングされた。Ｇ．ＳＳＥＡ４に基づく単細胞選別を用いて生成したｉＰＳＣは、分化すると３種の体細胞全てに容易に発達した。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）。 図１３は、ＩＭＲ９０およびＡＳＣを含めた種々の供給源からの単細胞選別および多能性幹細胞の富化による細胞の再プログラミングの増強を示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期にある細胞集団を、ＳＳＥＡ４＋細胞の単細胞選別によって富化した。再プログラミングされた細胞および再プログラミングされていない細胞を含有する出発細胞集団を、酵素によって単細胞に解離させ、独特の多能性のマーカーについて染色し、免疫結合体化した磁気ビーズによって表面マーカーの発現に基づいて選別して、ＳＳＥＡ４について陽性である細胞集団を得た。このＳＳＥＡ４＋細胞の富化の後、ＳＳＥＡ４＋細胞１０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたディッシュ上に播種し、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかで、ＦＦ環境において培養した。選別の８日後にＡＰ染色を行った。これらの右端の小さな挿入パネルは、代表的な細胞形態の画像である。従来の培養ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかったが、ＳＭＣ４培地では多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが得られた。Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＳＭＣ４培地の存在下または不在下での細胞の再プログラミングにより得られるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋コロニーの数をスコア化した。Ｃ．ＳＭＣ４培地を用いたフィーダーフリー条件および単細胞の培養においてＩＭＲ９０線維芽細胞または脂肪幹細胞のいずれかから得られるｉＰＳＣクローンは多能性のマーカーを発現した。Ｄ．単細胞選別方法を用いて得られたｉＰＳＣクローンの集団全体のフローサイトメトリー分析により、大多数の細胞が、重要な多能性マーカーについて陽性であったことが明らかになった。Ｅ．ＳＳＥＡ４についての単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めたヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞または脂肪幹細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣでは、３日後に再プログラミング因子を発現しているレンチウイルスを感染させた対照線維芽細胞とは異なり、有効にサイレンシングされた。Ｇ．ＳＳＥＡ４に基づく単細胞選別を用いて生成したｉＰＳＣは、分化すると３種の体細胞全てに容易に発達した。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）。 図１３は、ＩＭＲ９０およびＡＳＣを含めた種々の供給源からの単細胞選別および多能性幹細胞の富化による細胞の再プログラミングの増強を示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期にある細胞集団を、ＳＳＥＡ４＋細胞の単細胞選別によって富化した。再プログラミングされた細胞および再プログラミングされていない細胞を含有する出発細胞集団を、酵素によって単細胞に解離させ、独特の多能性のマーカーについて染色し、免疫結合体化した磁気ビーズによって表面マーカーの発現に基づいて選別して、ＳＳＥＡ４について陽性である細胞集団を得た。このＳＳＥＡ４＋細胞の富化の後、ＳＳＥＡ４＋細胞１０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたディッシュ上に播種し、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかで、ＦＦ環境において培養した。選別の８日後にＡＰ染色を行った。これらの右端の小さな挿入パネルは、代表的な細胞形態の画像である。従来の培養ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかったが、ＳＭＣ４培地では多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが得られた。Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＳＭＣ４培地の存在下または不在下での細胞の再プログラミングにより得られるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋コロニーの数をスコア化した。Ｃ．ＳＭＣ４培地を用いたフィーダーフリー条件および単細胞の培養においてＩＭＲ９０線維芽細胞または脂肪幹細胞のいずれかから得られるｉＰＳＣクローンは多能性のマーカーを発現した。Ｄ．単細胞選別方法を用いて得られたｉＰＳＣクローンの集団全体のフローサイトメトリー分析により、大多数の細胞が、重要な多能性マーカーについて陽性であったことが明らかになった。Ｅ．ＳＳＥＡ４についての単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めたヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞または脂肪幹細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣでは、３日後に再プログラミング因子を発現しているレンチウイルスを感染させた対照線維芽細胞とは異なり、有効にサイレンシングされた。Ｇ．ＳＳＥＡ４に基づく単細胞選別を用いて生成したｉＰＳＣは、分化すると３種の体細胞全てに容易に発達した。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）。 図１３は、ＩＭＲ９０およびＡＳＣを含めた種々の供給源からの単細胞選別および多能性幹細胞の富化による細胞の再プログラミングの増強を示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期にある細胞集団を、ＳＳＥＡ４＋細胞の単細胞選別によって富化した。再プログラミングされた細胞および再プログラミングされていない細胞を含有する出発細胞集団を、酵素によって単細胞に解離させ、独特の多能性のマーカーについて染色し、免疫結合体化した磁気ビーズによって表面マーカーの発現に基づいて選別して、ＳＳＥＡ４について陽性である細胞集団を得た。このＳＳＥＡ４＋細胞の富化の後、ＳＳＥＡ４＋細胞１０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたディッシュ上に播種し、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかで、ＦＦ環境において培養した。選別の８日後にＡＰ染色を行った。これらの右端の小さな挿入パネルは、代表的な細胞形態の画像である。従来の培養ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかったが、ＳＭＣ４培地では多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが得られた。Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＳＭＣ４培地の存在下または不在下での細胞の再プログラミングにより得られるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋コロニーの数をスコア化した。Ｃ．ＳＭＣ４培地を用いたフィーダーフリー条件および単細胞の培養においてＩＭＲ９０線維芽細胞または脂肪幹細胞のいずれかから得られるｉＰＳＣクローンは多能性のマーカーを発現した。Ｄ．単細胞選別方法を用いて得られたｉＰＳＣクローンの集団全体のフローサイトメトリー分析により、大多数の細胞が、重要な多能性マーカーについて陽性であったことが明らかになった。Ｅ．ＳＳＥＡ４についての単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めたヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞または脂肪幹細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣでは、３日後に再プログラミング因子を発現しているレンチウイルスを感染させた対照線維芽細胞とは異なり、有効にサイレンシングされた。Ｇ．ＳＳＥＡ４に基づく単細胞選別を用いて生成したｉＰＳＣは、分化すると３種の体細胞全てに容易に発達した。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）。 図１３は、ＩＭＲ９０およびＡＳＣを含めた種々の供給源からの単細胞選別および多能性幹細胞の富化による細胞の再プログラミングの増強を示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期にある細胞集団を、ＳＳＥＡ４＋細胞の単細胞選別によって富化した。再プログラミングされた細胞および再プログラミングされていない細胞を含有する出発細胞集団を、酵素によって単細胞に解離させ、独特の多能性のマーカーについて染色し、免疫結合体化した磁気ビーズによって表面マーカーの発現に基づいて選別して、ＳＳＥＡ４について陽性である細胞集団を得た。このＳＳＥＡ４＋細胞の富化の後、ＳＳＥＡ４＋細胞１０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたディッシュ上に播種し、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかで、ＦＦ環境において培養した。選別の８日後にＡＰ染色を行った。これらの右端の小さな挿入パネルは、代表的な細胞形態の画像である。従来の培養ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかったが、ＳＭＣ４培地では多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが得られた。Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＳＭＣ４培地の存在下または不在下での細胞の再プログラミングにより得られるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋コロニーの数をスコア化した。Ｃ．ＳＭＣ４培地を用いたフィーダーフリー条件および単細胞の培養においてＩＭＲ９０線維芽細胞または脂肪幹細胞のいずれかから得られるｉＰＳＣクローンは多能性のマーカーを発現した。Ｄ．単細胞選別方法を用いて得られたｉＰＳＣクローンの集団全体のフローサイトメトリー分析により、大多数の細胞が、重要な多能性マーカーについて陽性であったことが明らかになった。Ｅ．ＳＳＥＡ４についての単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めたヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞または脂肪幹細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣでは、３日後に再プログラミング因子を発現しているレンチウイルスを感染させた対照線維芽細胞とは異なり、有効にサイレンシングされた。Ｇ．ＳＳＥＡ４に基づく単細胞選別を用いて生成したｉＰＳＣは、分化すると３種の体細胞全てに容易に発達した。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）。 図１３は、ＩＭＲ９０およびＡＳＣを含めた種々の供給源からの単細胞選別および多能性幹細胞の富化による細胞の再プログラミングの増強を示す図である。Ａ．再プログラミングプロセスの初期にある細胞集団を、ＳＳＥＡ４＋細胞の単細胞選別によって富化した。再プログラミングされた細胞および再プログラミングされていない細胞を含有する出発細胞集団を、酵素によって単細胞に解離させ、独特の多能性のマーカーについて染色し、免疫結合体化した磁気ビーズによって表面マーカーの発現に基づいて選別して、ＳＳＥＡ４について陽性である細胞集団を得た。このＳＳＥＡ４＋細胞の富化の後、ＳＳＥＡ４＋細胞１０，０００個をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングしたディッシュ上に播種し、従来の培地またはＳＭＣ４培地のいずれかで、ＦＦ環境において培養した。選別の８日後にＡＰ染色を行った。これらの右端の小さな挿入パネルは、代表的な細胞形態の画像である。従来の培養ではアルカリホスファターゼ陽性コロニーは検出されなかったが、ＳＭＣ４培地では多くのアルカリホスファターゼ陽性コロニーが得られた。Ｂ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＳＭＣ４培地の存在下または不在下での細胞の再プログラミングにより得られるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋コロニーの数をスコア化した。Ｃ．ＳＭＣ４培地を用いたフィーダーフリー条件および単細胞の培養においてＩＭＲ９０線維芽細胞または脂肪幹細胞のいずれかから得られるｉＰＳＣクローンは多能性のマーカーを発現した。Ｄ．単細胞選別方法を用いて得られたｉＰＳＣクローンの集団全体のフローサイトメトリー分析により、大多数の細胞が、重要な多能性マーカーについて陽性であったことが明らかになった。Ｅ．ＳＳＥＡ４についての単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣは、Ｈ１およびＨｕＥＳ９を含めたヒトＥＳＣと同様の多能性マーカーのアレイを発現したが、それらの最初の源である線維芽細胞または脂肪幹細胞はそれを発現しなかった。Ｆ．再プログラミング因子の外因性の発現は、単細胞選別およびフィーダーフリー培養を用いて生成したｉＰＳＣでは、３日後に再プログラミング因子を発現しているレンチウイルスを感染させた対照線維芽細胞とは異なり、有効にサイレンシングされた。Ｇ．ＳＳＥＡ４に基づく単細胞選別を用いて生成したｉＰＳＣは、分化すると３種の体細胞全てに容易に発達した。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、ベータチューブリンＩＩＩ（β ＴＵＢ ＩＩＩ）。 図１４は、多能性幹細胞の独特の集団を選択するための単細胞選別を示す図である。Ａ．ＦＡＣＳ選別を用いて、再プログラミングプロセスの初期にあるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋であった独特かつ希少な細胞集団を選択し、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養に移行させ、上記培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。さらに６日間培養した後、ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋由来ｉＰＳＣコロニーはフィーダーフリー培養において成長しているようであった。しかし、ＳＳＥＡ４－／Ｔｒａ１８１－コロニーをフィーダーフリー培養に移行させ、維持した場合には、培養の１４日後にアルカリホスファターゼを発現しているコロニーは検出されなかった。Ｂ．種々のＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋選別細胞は、それらのＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の発現を維持しながらコロニーに発達した。 図１４は、多能性幹細胞の独特の集団を選択するための単細胞選別を示す図である。Ａ．ＦＡＣＳ選別を用いて、再プログラミングプロセスの初期にあるＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋であった独特かつ希少な細胞集団を選択し、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を補充したフィーダーフリー培養に移行させ、上記培地を２４～７２時間後にＳＭＣ４培地と交換した。さらに６日間培養した後、ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋由来ｉＰＳＣコロニーはフィーダーフリー培養において成長しているようであった。しかし、ＳＳＥＡ４－／Ｔｒａ１８１－コロニーをフィーダーフリー培養に移行させ、維持した場合には、培養の１４日後にアルカリホスファターゼを発現しているコロニーは検出されなかった。Ｂ．種々のＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋選別細胞は、それらのＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の発現を維持しながらコロニーに発達した。 図１５は、フィーダーフリー条件下でｉＰＳＣを生成し、主要な特徴付けをするためのハイスループットな手法を示す図である。３因子（Ｏｃｔ、Ｓｏｘ、Ｋｌｆ）誘導線維芽細胞を、ＳＭＣ４培地を使用して（および、選別の間、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を使用して）二段階で選別して、効率的な９６ウェルプレーティングプラットフォームを作製した。個々のコロニーを含有するウェルに印をつけ、４×９６ウェルプレートへと拡大した。１つのセットをマスタープレートと名付け、拡大し、他の３つのプレートは、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１を含めた表面マーカーの発現についてのフローサイトメトリー分析、Ｎａｎｏｇを含めた重要なマーカーの発現および導入遺伝子サイレンシングについてのｑＲＴ ＰＣＲならびにＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを含めた多能性マーカーについての免疫蛍光検査を含めた特徴付けのために処理した。特徴付けの読出し情報に基づいて、選択されたｈｉＰＳＣクローンを、さらなる分析のために拡大し、貯蔵した。データパネルは、ＦＴＣ５のハイスループットなプラットフォームにおけるｈｉＰＳＣの生成の間に調査した（９６ウェルプレートのウェル３１～４０によって示される）クローンのスナップショットを示す。ｑＰＣＲパネルでは、発現をＧａｐｄｈに対して正規化した。Ｎａｎｏｇの発現はＨ１ ｈＥＳＣと比例し、一方で、導入遺伝子の発現はＦＴＣ５の感染の４日後（感染４日目）と比例する。特徴付けの読出し情報に基づいて、選択されたｈｉＰＳＣクローンを、さらなる分析のために拡大し、貯蔵した。強調表示されている例では、ウェル３７を、その多パラメータ多能性プロファイルに基づいて拡大のための候補として同定し、ＦＴＣ５クローン１と称した。免疫蛍光検査による画像を５×拡大率で取得した。 図１６は、ＳＭＣ４培地の存在下での、３因子（ポリシストロニックＯＫＳ）ｈｉＰＳＣの、ハイスループットなプラットフォームにおけるクローン性およびＦＦ誘導を示す図である。Ａ．上記の戦略で得られたクローンＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３を多能性マーカーの発現について染色した。Ｂ．ＦＴＣ１（包皮線維芽細胞）、Ｈ１およびＨｕｅｓ９（ｈＥＳＣ系）、ＦＴｉ９１および９３（ＦＴＣ１由来ｈｉＰＳＣクローン）ならびに感染後４日目（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）（感染後４日目）についての多能性のマーカーの内在性の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現をＧａｐｄｈに対して正規化し、各遺伝子群内で比較した。Ｃ．Ｏｃｔ４プロモーターのメチル化の状態。白丸は、メチル化されていないＣｐＧアイランドを示し、黒丸はメチル化されたＣｐＧアイランドを示す。Ｄ．分化の２８日後のクローンＦＴｉ９１および９３のＥＢの形成および分化。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｅ．ＦＦ培養およびＳＭＣ４培地中で生成し、維持したｈｉＰＳＣクローンから得た奇形腫の組織学的切片。黒い矢印は、対象の領域を指す：中胚葉、白色脂肪組織；外胚葉、ニューロン；内胚葉、腺。 図１６は、ＳＭＣ４培地の存在下での、３因子（ポリシストロニックＯＫＳ）ｈｉＰＳＣの、ハイスループットなプラットフォームにおけるクローン性およびＦＦ誘導を示す図である。Ａ．上記の戦略で得られたクローンＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３を多能性マーカーの発現について染色した。Ｂ．ＦＴＣ１（包皮線維芽細胞）、Ｈ１およびＨｕｅｓ９（ｈＥＳＣ系）、ＦＴｉ９１および９３（ＦＴＣ１由来ｈｉＰＳＣクローン）ならびに感染後４日目（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）（感染後４日目）についての多能性のマーカーの内在性の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現をＧａｐｄｈに対して正規化し、各遺伝子群内で比較した。Ｃ．Ｏｃｔ４プロモーターのメチル化の状態。白丸は、メチル化されていないＣｐＧアイランドを示し、黒丸はメチル化されたＣｐＧアイランドを示す。Ｄ．分化の２８日後のクローンＦＴｉ９１および９３のＥＢの形成および分化。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｅ．ＦＦ培養およびＳＭＣ４培地中で生成し、維持したｈｉＰＳＣクローンから得た奇形腫の組織学的切片。黒い矢印は、対象の領域を指す：中胚葉、白色脂肪組織；外胚葉、ニューロン；内胚葉、腺。 図１６は、ＳＭＣ４培地の存在下での、３因子（ポリシストロニックＯＫＳ）ｈｉＰＳＣの、ハイスループットなプラットフォームにおけるクローン性およびＦＦ誘導を示す図である。Ａ．上記の戦略で得られたクローンＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３を多能性マーカーの発現について染色した。Ｂ．ＦＴＣ１（包皮線維芽細胞）、Ｈ１およびＨｕｅｓ９（ｈＥＳＣ系）、ＦＴｉ９１および９３（ＦＴＣ１由来ｈｉＰＳＣクローン）ならびに感染後４日目（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）（感染後４日目）についての多能性のマーカーの内在性の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現をＧａｐｄｈに対して正規化し、各遺伝子群内で比較した。Ｃ．Ｏｃｔ４プロモーターのメチル化の状態。白丸は、メチル化されていないＣｐＧアイランドを示し、黒丸はメチル化されたＣｐＧアイランドを示す。Ｄ．分化の２８日後のクローンＦＴｉ９１および９３のＥＢの形成および分化。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｅ．ＦＦ培養およびＳＭＣ４培地中で生成し、維持したｈｉＰＳＣクローンから得た奇形腫の組織学的切片。黒い矢印は、対象の領域を指す：中胚葉、白色脂肪組織；外胚葉、ニューロン；内胚葉、腺。 図１６は、ＳＭＣ４培地の存在下での、３因子（ポリシストロニックＯＫＳ）ｈｉＰＳＣの、ハイスループットなプラットフォームにおけるクローン性およびＦＦ誘導を示す図である。Ａ．上記の戦略で得られたクローンＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３を多能性マーカーの発現について染色した。Ｂ．ＦＴＣ１（包皮線維芽細胞）、Ｈ１およびＨｕｅｓ９（ｈＥＳＣ系）、ＦＴｉ９１および９３（ＦＴＣ１由来ｈｉＰＳＣクローン）ならびに感染後４日目（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）（感染後４日目）についての多能性のマーカーの内在性の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現をＧａｐｄｈに対して正規化し、各遺伝子群内で比較した。Ｃ．Ｏｃｔ４プロモーターのメチル化の状態。白丸は、メチル化されていないＣｐＧアイランドを示し、黒丸はメチル化されたＣｐＧアイランドを示す。Ｄ．分化の２８日後のクローンＦＴｉ９１および９３のＥＢの形成および分化。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｅ．ＦＦ培養およびＳＭＣ４培地中で生成し、維持したｈｉＰＳＣクローンから得た奇形腫の組織学的切片。黒い矢印は、対象の領域を指す：中胚葉、白色脂肪組織；外胚葉、ニューロン；内胚葉、腺。 図１６は、ＳＭＣ４培地の存在下での、３因子（ポリシストロニックＯＫＳ）ｈｉＰＳＣの、ハイスループットなプラットフォームにおけるクローン性およびＦＦ誘導を示す図である。Ａ．上記の戦略で得られたクローンＦＴｉ９１およびＦＴｉ９３を多能性マーカーの発現について染色した。Ｂ．ＦＴＣ１（包皮線維芽細胞）、Ｈ１およびＨｕｅｓ９（ｈＥＳＣ系）、ＦＴｉ９１および９３（ＦＴＣ１由来ｈｉＰＳＣクローン）ならびに感染後４日目（Ｄａｙ ４ Ｐ．Ｉ．）（感染後４日目）についての多能性のマーカーの内在性の発現のｑＲＴ－ＰＣＲ。発現をＧａｐｄｈに対して正規化し、各遺伝子群内で比較した。Ｃ．Ｏｃｔ４プロモーターのメチル化の状態。白丸は、メチル化されていないＣｐＧアイランドを示し、黒丸はメチル化されたＣｐＧアイランドを示す。Ｄ．分化の２８日後のクローンＦＴｉ９１および９３のＥＢの形成および分化。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｅ．ＦＦ培養およびＳＭＣ４培地中で生成し、維持したｈｉＰＳＣクローンから得た奇形腫の組織学的切片。黒い矢印は、対象の領域を指す：中胚葉、白色脂肪組織；外胚葉、ニューロン；内胚葉、腺。 図１７は、ゲノムの完全性を維持し、多能性細胞を富化することができるＳＭＣ４培地中での多能性幹細胞の生成および維持を示す図である。Ａ．アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションによって評価されるコピー数の変動。下の表は、ＳＭＣ４培地で培養したヒト多能性幹細胞とそれらの親細胞系との間のコピー数の変動が最小であることを実証しているデータの解釈の概要である。Ｂ．Ｇ－バンド染色した中期細胞の細胞発生分析。下の表は、長期にわたってＳＭＣ４培地中でフィーダーフリー培養した後のゲノム安定性を示すデータの概要である。 図１７は、ゲノムの完全性を維持し、多能性細胞を富化することができるＳＭＣ４培地中での多能性幹細胞の生成および維持を示す図である。Ａ．アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーションによって評価されるコピー数の変動。下の表は、ＳＭＣ４培地で培養したヒト多能性幹細胞とそれらの親細胞系との間のコピー数の変動が最小であることを実証しているデータの解釈の概要である。Ｂ．Ｇ－バンド染色した中期細胞の細胞発生分析。下の表は、長期にわたってＳＭＣ４培地中でフィーダーフリー培養した後のゲノム安定性を示すデータの概要である。 図１８は、ＦＦおよびＳＭＣ４培養下でのＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のクローンｈｉＰＳＣの特徴付けを示す図である。ハイスループットなプラットフォームの再現性を決定するために、さらなる患者同意の系（ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｎｓｅｎｔｅｄ ｌｉｎｅ）ＦＴＣ５およびＦＴＣ７を、ｈｉＰＳＣの生成について試験した。Ａ．ＯＫＳを用いて誘導し、マルチプレックスプラットフォームを使用して生成した個々のＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のｈｉＰＳＣクローンにおいて発現される多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｔｒａ１８１、ＮａｎｏｇおよびＴｒａ１６０の代表的免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ）による染色。Ｂ．分化の誘導の２８日後のＦＴＣ５由来ｈｉＰＳＣおよびＦＴＣ７由来ｈｉＰＳＣの代表的な系統特異的染色。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｃ．種々の継代で長期にわたってＦＦおよび単細胞培養した後のＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のｈｉＰＳＣクローン由来のＧ－バンド染色した中期細胞の細胞遺伝学的分析。 図１８は、ＦＦおよびＳＭＣ４培養下でのＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のクローンｈｉＰＳＣの特徴付けを示す図である。ハイスループットなプラットフォームの再現性を決定するために、さらなる患者同意の系（ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｎｓｅｎｔｅｄ ｌｉｎｅ）ＦＴＣ５およびＦＴＣ７を、ｈｉＰＳＣの生成について試験した。Ａ．ＯＫＳを用いて誘導し、マルチプレックスプラットフォームを使用して生成した個々のＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のｈｉＰＳＣクローンにおいて発現される多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｔｒａ１８１、ＮａｎｏｇおよびＴｒａ１６０の代表的免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ）による染色。Ｂ．分化の誘導の２８日後のＦＴＣ５由来ｈｉＰＳＣおよびＦＴＣ７由来ｈｉＰＳＣの代表的な系統特異的染色。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｃ．種々の継代で長期にわたってＦＦおよび単細胞培養した後のＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のｈｉＰＳＣクローン由来のＧ－バンド染色した中期細胞の細胞遺伝学的分析。 図１８は、ＦＦおよびＳＭＣ４培養下でのＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のクローンｈｉＰＳＣの特徴付けを示す図である。ハイスループットなプラットフォームの再現性を決定するために、さらなる患者同意の系（ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｎｓｅｎｔｅｄ ｌｉｎｅ）ＦＴＣ５およびＦＴＣ７を、ｈｉＰＳＣの生成について試験した。Ａ．ＯＫＳを用いて誘導し、マルチプレックスプラットフォームを使用して生成した個々のＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のｈｉＰＳＣクローンにおいて発現される多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｔｒａ１８１、ＮａｎｏｇおよびＴｒａ１６０の代表的免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ）による染色。Ｂ．分化の誘導の２８日後のＦＴＣ５由来ｈｉＰＳＣおよびＦＴＣ７由来ｈｉＰＳＣの代表的な系統特異的染色。内胚葉、ＦｏｘＡ２；中胚葉、アルファ平滑筋アクチン（αＳＭＡ）；外胚葉、Ｔｕｊ１。Ｃ．種々の継代で長期にわたってＦＦおよび単細胞培養した後のＦＴＣ５由来およびＦＴＣ７由来のｈｉＰＳＣクローン由来のＧ－バンド染色した中期細胞の細胞遺伝学的分析。 図１９は、細胞表面マーカーを使用して多能性培養物を維持する方法を示す図である。Ａ．フィーダーフリーおよびＳＭＣ４プラットフォームにおけるＴｒａ１８１富化によって実証された通り、培養している間に多能性幹細胞の集団がさらに富化された。Ｂ．多能性細胞集団を培養している間、集団内のいくらかの割合の細胞が分化し始め、それらの多能性を失う可能性がある。多能性の選択方法、すなわちＴｒａ１８１富化を用いて、未分化細胞の均一な培養が達成された。 図１９は、細胞表面マーカーを使用して多能性培養物を維持する方法を示す図である。Ａ．フィーダーフリーおよびＳＭＣ４プラットフォームにおけるＴｒａ１８１富化によって実証された通り、培養している間に多能性幹細胞の集団がさらに富化された。Ｂ．多能性細胞集団を培養している間、集団内のいくらかの割合の細胞が分化し始め、それらの多能性を失う可能性がある。多能性の選択方法、すなわちＴｒａ１８１富化を用いて、未分化細胞の均一な培養が達成された。 図２０は、非多能性細胞、半多能性細胞、および完全多能性幹細胞の不均一な集団からの分化細胞の分離を示す図である。再プログラミングされたヒト線維芽細胞の集団のＦＡＣＳ選別：多能性マーカーであるＳＳＥＡ４－／Ｔｒａ１８１－（青色の囲み枠；左下の囲み枠）に対して二重に陰性である細胞を選別した場合にはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性コロニーは検出されず、これにより、１週間培養した後、多能性および潜在的な腫瘍形成性が喪失することが示されるが、それに対して、二重陽性集団ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋（オレンジ色の囲み枠；右上の囲み枠）を選別すると、ＡＰ＋コロニーの形成によって証明されるように、多能性細胞の集団が選択され、富化される。 図２１は、フィーダーフリー培養におけるヒト多能性幹細胞のサイトカインを含まない培養を示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞は、ゼラチンでコーティングした表面上で、ＳＭＣ４培地を補充し、ｂＦＧＦを含めたいかなるサイトカインも不在の下で培養した場合、それらの成長および形態を維持した。Ｂ．ヒト多能性幹細胞コロニー内の個々の細胞を示す拡大画像。Ｃ．３回目の継代においてＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１が共発現したことにより、サイトカインを含まずに培養したヒト多能性幹細胞がそれらの未分化状態を維持したことのさらなる証拠がもたらされた。 図２１は、フィーダーフリー培養におけるヒト多能性幹細胞のサイトカインを含まない培養を示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞は、ゼラチンでコーティングした表面上で、ＳＭＣ４培地を補充し、ｂＦＧＦを含めたいかなるサイトカインも不在の下で培養した場合、それらの成長および形態を維持した。Ｂ．ヒト多能性幹細胞コロニー内の個々の細胞を示す拡大画像。Ｃ．３回目の継代においてＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１が共発現したことにより、サイトカインを含まずに培養したヒト多能性幹細胞がそれらの未分化状態を維持したことのさらなる証拠がもたらされた。 図２１は、フィーダーフリー培養におけるヒト多能性幹細胞のサイトカインを含まない培養を示す図である。Ａ．ヒト多能性幹細胞は、ゼラチンでコーティングした表面上で、ＳＭＣ４培地を補充し、ｂＦＧＦを含めたいかなるサイトカインも不在の下で培養した場合、それらの成長および形態を維持した。Ｂ．ヒト多能性幹細胞コロニー内の個々の細胞を示す拡大画像。Ｃ．３回目の継代においてＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１が共発現したことにより、サイトカインを含まずに培養したヒト多能性幹細胞がそれらの未分化状態を維持したことのさらなる証拠がもたらされた。
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成し、培養するためのフィーダーフリー条件を含めた、幹細胞を培養するための頑強な培養システムを提供する。詳細には、本発明は、フィーダーフリー環境における多能性細胞の長期培養；フィーダーフリー環境における細胞の再プログラミング；多能性細胞の単細胞への解離；多能性細胞の細胞選別；再プログラミングの効率の改善；ナイーブ多能性細胞の生成；および多能性細胞を同定し、選択するためのマーカーの同定を可能にする培養プラットフォームを提供する。本発明の培地および培養方法は、単細胞に解離させたヒト幹細胞の生存能力および生存を支持し、幹細胞の未分化状態を維持して、解離した単細胞を、分化を伴わずに培養し、継代することを可能にする。
定義
本明細書で使用される場合、「再プログラミング」または「脱分化」または「細胞能力の増大」または「発生能の増大」という用語は、細胞の能力を増大させる、または細胞を分化の程度が低い状態に脱分化させる方法を指す。例えば、細胞能力が増大した細胞は、再プログラミングされていない状態にある同じ細胞と比較して発生の可塑性がより高い（すなわち、より多くの細胞型に分化することができる）。言い換えれば、再プログラミングされた細胞とは、再プログラミングされていない状態にある同じ細胞よりも分化の程度が低い状態にある細胞である。
本明細書で使用される場合、「能力」という用語は、細胞が利用できる発生の選択肢（すなわち、発生能）全ての合計を指す。当業者は、細胞能力は、最大の発生能を有する最も可塑性の細胞である全能性幹細胞から、最小の発生能を有する最小の可塑性の細胞である最終分化細胞までにわたる連続体であることを認識されよう。細胞能力の連続体は、これらに限定されないが、全能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、小能性細胞、単能性細胞、および最終分化細胞を含む。最も厳密な意味では、幹細胞は多能性である；したがって、いかなる成熟細胞型も生じさせることができる。しかし、多分化能、小能性または単能性の前駆細胞は、時には系統制限幹細胞（例えば、間葉幹細胞、脂肪組織由来幹細胞など）および／または前駆細胞と称される。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、細胞の、体部または細胞体（すなわち、胚本体（ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｐｅｒ））の全ての系統を形成する能力を指す。例えば、胚性幹細胞は、３種の胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の各々から細胞を形成することができる多能性幹細胞の一種である。多能性とは、完全な生物体を生じさせることができない不完全または部分的に多能性の細胞（例えば、胚盤葉上層幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物体を生じさせることができる、より初期の、より多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）までにわたる発生能の連続体である。細胞の多能性のレベルは、細胞の多能性特性を評価することによって決定することができる。多能性特性としては、これらに限定されないが、ｉ）多能性幹細胞の形態、ｉｉ）これらに限定されないが、ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４；ＴＲＡ１－６０／８１；ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇおよび／またはＳｏｘ２、ならびに本発明に記載の通り、ＣＤ３０およびＣＤ５０を含めた多能性幹細胞マーカーの発現；ｉｉｉ）マウスキメラにおける、多能性マウス幹細胞の、生殖細胞系列伝達に寄与する能力；ｉｖ）四倍体胚補完アッセイを用いた、多能性幹細胞の、胚本体に寄与する能力；ｖ）多能性幹細胞の奇形腫の形成；ｖｉ）胚様体の形成：およびｖｉｉ）不活性なＸ染色体の再活性化が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞の形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。通常の胚性幹細胞形態は、丸く小さな形状であり、核細胞質比が高く、核小体が顕著に存在し、細胞間の間隔が典型的であることによって特徴付けられる。
本明細書で使用される場合、「多分化能」という用語は、成体幹細胞の、１つの系統の複数の細胞型を形成する能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系統、例えば、リンパ系細胞および骨髄系細胞の全ての細胞を形成することができる。
「接着」とは、容器に付着している細胞、例えば、適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュまたはフラスコに付着している細胞を指す。特定のクラスの細胞は持続性ではない、または、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で成長しない。特定のクラスの細胞（「非接着性細胞」）は、接着させることなく培養物中で維持され、かつ／または増殖する。
「培養」または「細胞培養」とは、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ環境において維持し、成長させ、かつ／または分化させることを指す。「細胞培養培地（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｄｉａ）」、「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ）」（それぞれの場合において単数の「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」）、「補充物」および「培地補充物」とは、細胞培養物を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」とは、組織または体の外側で、例えば、滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュまたはフラスコ中で細胞を持続させ、繁殖させ（成長させる）、かつ／または分化させることを指す。「培養」では、培地を、栄養分、ホルモンおよび／または細胞を繁殖させ、かつ／または持続させるために役立つ他の因子の供給源として利用することができる。
本明細書で使用される場合、「解離した」細胞とは、他の細胞から、または表面（例えば、培養プレート表面）から実質的に分離または精製されている細胞を指す。例えば、細胞は、動物または組織から、機械的または酵素的方法によって解離させることができる。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで凝集する細胞は、例えば、クラスター、単細胞または単細胞とクラスターの混合物の懸濁物へと酵素によってまたは機械的に解離させることによって互いから解離させることができる。さらに別の代替的な実施形態では、接着性細胞を培養プレートまたは他の表面から解離させる。したがって、解離とは、細胞と細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（例えば、培養表面）との相互作用を破壊すること、または細胞間のＥＣＭを破壊することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「富化する」および「富化すること」という用語は、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して比例的に増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型（すなわち、特定の特性を有する細胞）に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合またはパーセントは、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較し上昇する。細胞集団を、当技術分野で公知の細胞選択および選別方法によって、標的細胞型について富化することができる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞集団を、本明細書の実施例に記載の選別または選択プロセスによって富化する。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも約２０％富化される、つまり、富化細胞集団は、集団を富化する前の集団においてよりも、標的細胞型を比例的に約２０％多く含む。一実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して、比例的に少なくとも約３０＋％、４０＋％、５０＋％、６０＋％、７０＋％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％、または少なくとも約９８％、または特定の実施形態では、約９９％富化される。
本発明の特定の態様では、細胞集団を、多能性細胞または多能性特性を示す細胞の量に関して富化する。本発明の特定の実施形態では、再プログラミングを受けている細胞集団を、多能性特性、例えば、これらに限定することなく、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＣＤ３０またはＣＤ５０を含めた、多能性マーカーの発現を有する標的細胞について富化する。本発明の別の特定の実施形態では、再プログラミングを受けている細胞集団などの細胞集団から、例えば、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７を挙げることができる、分化している細胞または非多能性細胞に特異的な表面マーカーを使用して非多能性細胞を枯渇させる。したがって、生じた細胞集団は、多能性細胞が富化された細胞集団と記載することができる。本発明のある態様では、富化細胞集団内の細胞を、別個の遺伝子またはタンパク質の発現プロファイル、例えば、少なくとも２種の多能性マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＣＤ３０およびＣＤ５０の細胞表面発現を有する標的細胞について富化する。いくつかの実施形態では、細胞集団を、２種以上の多能性マーカーを発現している標的細胞について富化する。特定の実施形態では、細胞集団を、ＳＳＥＡ４をＴｒａ－１８１またはＴｒａ－１６０のいずれかと組み合わせて発現している標的細胞について富化する。さらに特定の実施形態では、細胞集団を、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１、およびＣＤ３０を発現している標的細胞について富化する。一実施形態では、富化細胞集団内の細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％が多能性細胞などの標的細胞型である。
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞集団を、多能性マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＣＤ３０およびＣＤ５０の細胞表面発現に基づいて選別し、そのようなマーカーを発現している細胞の画分を採取して、多能性細胞について富化された細胞集団を得ることによって、細胞の集団を多能性細胞について富化する方法を提供する。本発明の他の実施形態では、細胞集団を、分化しているまたは分化した細胞のマーカー、例えば、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、およびＣＤ７の細胞表面発現に基づいて選別し、細胞集団からそのような細胞を枯渇させて、多能性細胞について富化された細胞集団を得ることによって、細胞集団を多能性細胞について富化する。特定の実施形態では、細胞集団をＣＤ１３の発現に基づいて選別し、ＣＤ１３＋細胞を細胞集団から除去して、多能性細胞が富化された細胞集団を得る。
本明細書で使用される場合、「フィーダー細胞」または「フィーダー」とは、第２の種類の細胞と共培養され、第２の種類の細胞が成長することができる環境をもたらす１種の細胞を説明するために使用される用語であり、なぜなら、フィーダー細胞から第２の細胞種を支持するための成長因子および栄養分が提供されるからである。フィーダー細胞は、必要に応じて、それらが支持する細胞とは異なる種由来である。例えば、幹細胞を含めた特定の種類のヒト細胞を、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、および不死化マウス胚線維芽細胞によって支持することができる。フィーダー細胞は、一般には、他の細胞と共培養する場合に、それらが支持する細胞よりも成長することを防ぐために、放射線照射またはマイトマイシンｃなどの抗有糸分裂剤による処理によって不活性化することができる。前述に限定されることなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒトフィーダー、例えば、ヒト皮膚線維芽細胞またはヒト胚性幹細胞であってよい。別のフィーダー細胞型はマウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）であってよい。
本明細書で使用される場合、「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境とは、基本的にフィーダー細胞を含まず、フィーダー細胞を培養することによって予備馴化（ｐｒｅ－ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）されていない細胞培養物または培地などの環境を指す。「予備馴化」培地とは、フィーダー細胞を培地中である期間にわたって、例えば、少なくとも１日間にわたって培養した後に回収した培地を指す。予備馴化培地は、培地中で培養されたフィーダー細胞から分泌される成長因子およびサイトカインなどの多くのメディエーター物質を含有する。
本発明のいくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、これらに限定することなく、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、および胚性幹細胞を含めたヒトフィーダー細胞を含まず、特定の実施形態では、さらに、フィーダー細胞によって予備馴化されていない。本発明のさらなる実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、動物フィーダー細胞を含まず、さらに、特定の実施形態では、フィーダー細胞で予備馴化されていない。本発明のある実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、ヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、他のある実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的にヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、フィーダー細胞で予備馴化されていない。
ゲノム安定性とは、細胞の、ＤＮＡを忠実に複製し、ＤＮＡ複製プロセスの完全性を維持する能力を指す。本明細書において、本発明の細胞を記載するために使用される場合、「ゲノム的に安定な細胞」および「ゲノム安定性を有する細胞」とは、正常なヒト体細胞と比較した変異および染色体異常（例えば、転座、異数性、コピー数の変動および重複など）の頻度と実質的に同様の変異および染色体異常の頻度を示す細胞を指す。
「成分」とは、起源が化学的であるにせよ生物学的であるにせよ、細胞の成長および／または分化を維持し、かつ／または促進するために細胞培養培地において使用することができる任意の化合物または他の材料を指す。「構成成分」「栄養分」および「成分」という用語は、互換的に使用することができる。細胞培養培地のために使用される従来の成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などを含んでよいが、これらに限定されない。ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の培養を促進し、かつ／または維持する他の成分は、当業者が所望の効果のために必要とするとおりに選択することができる。
「単離する」または「単離すること」とは、組成物または材料を、その天然の環境から分離すること、および採取すること、例えば、個々の細胞または細胞培養物を組織または体から分離することを指す。一態様では、細胞集団または細胞の組成物は、天然ではそれに結合する可能性がある細胞および材料を実質的に含まない。「単離された」または「精製された」または「実質的に純粋な」とは、標的細胞集団に関しては、総細胞集団を構成する標的細胞に関して少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、および特定の実施形態では、少なくとも約９５％純粋な細胞集団を指す。細胞集団または細胞の組成物の純度は、当技術分野で周知の適切な方法によって評価することができる。例えば、多能性細胞の実質的に純粋な集団とは、総細胞集団を構成する多能性細胞に関して少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、および特定の実施形態では、少なくとも約９５％、およびある実施形態では、約９８％純粋な細胞集団を指す。「基本的に純粋な」という用語は、本明細書では、「実質的に純粋な」と互換的に使用される。
「継代する」または「継代すること」とは、細胞が所望の程度まで増殖した場合に、細胞を複数の細胞培養表面または容器へと小分けし、プレーティングする行為を指す。いくつかの実施形態では、「継代する」または「継代すること」とは、細胞を小分けし、希釈し、プレーティングすることを指す。細胞を初代培養表面または容器からその後の表面または容器のセットへと継代すると、その後の培養は、本明細書では、「二次培養」または「最初の継代」などと称することができる。新しい培養容器へと小分けし、プレーティングする行為の各々が１回の継代とみなされる。
「プレーティング」とは、１つまたは複数の細胞を培養容器内に、細胞が細胞培養容器に接着し、その上に拡散するように置くことを指す。
「多能性因子」とは、単独で、または他の作用剤と組み合わせてのいずれかで、細胞の発生能を増大させることができる作用剤を指す。多能性因子としては、限定することなく、細胞の発生能を増大させることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および低分子が挙げられる。例示的な多能性因子としては、例えば、転写因子および低分子再プログラミング作用剤が挙げられる。転写因子とは、本明細書における使用に他の指示がなければ、タンパク質（すなわち、ポリペプチド）ならびにタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指し得る。例示的な転写因子としては、例えば、Ｏｃｔ、Ｋｌｆ、Ｍｙｃ、およびＳｏｘポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。さらなる転写因子の例は本明細書において提供される。
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、それに反する指定がなければ、互換的に従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、特定の長さに限定されない、例えば、ポリペプチドは、全長のタンパク質配列または全長のタンパク質の断片を含んでよく、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに天然に存在する、および天然に存在しない当技術分野で公知の他の修飾を含んでよい。本発明の方法において使用されるポリペプチドは、種々の周知の組換え法および／または合成法のいずれを用いても調製することができる。
本発明の方法は、ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、Ｓｏｘ－２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇなど、またはその基質、補因子および／または下流のエフェクター）の活性断片、例えば、本明細書に記載のポリペプチドの、全ての中間の長さを含めた、少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１０００などの連続したアミノ酸、またはそれより多くを含む活性断片を使用する。特定の実施形態では、使用される断片または断片の組合せは、本明細書に記載の方法において使用される場合に、多能性を調節し、誘導し、かつ／または維持する能力を保持する。
別の態様では、本発明では、本明細書に記載のポリペプチド組成物（例えば、Ｓｏｘ－２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇなど、またはその基質、補因子および／または下流のエフェクター）の変異体を使用する。一般に本発明に包含されるポリペプチド変異体は、一般には、その長さに沿って、本明細書に記載のポリペプチド配列に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれより高い同一性（下記の通り決定される）を示す。特定の実施形態では、使用される変異体または変異体の組合せは、本明細書に記載の多能性を誘導する能力を保持する。
別の態様では、本発明は、その長さに沿って、本開示に従って使用される野生型哺乳動物ポリペプチドの対応する領域に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれより高い同一性（下記の通り決定される）を示すポリペプチド変異体を使用する。
ポリペプチド変異体は、天然に存在するポリペプチドと、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入により異なり得る。そのような変異体は、天然に存在し得るか、または、例えば、本発明の方法において使用される上記のポリペプチド配列のうちの１つまたは複数を改変することによって合成により生成することができ、当技術分野で周知のいくつもの技法のいずれかを用いてそれらの影響を評価することができる。
「増殖する」とは、１つの細胞が２つの基本的に同一の細胞へと分裂する性質または細胞集団の数が増加する（例えば、複製するために）性質を指す。
「繁殖」とは、細胞が組織または体の外側で、例えば、プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュまたはフラスコなどの滅菌容器内で成長（例えば、細胞増殖によって複製する）ことを指す。
「初代培養物」とは、単離された細胞が、培地を伴う最初の培養容器に配置された、細胞、組織および／または培養物を指す。細胞、組織および／または培養物は、維持され得、かつ／または増殖し得るが、その細胞、組織および／または培養物が最初の容器内に残っている限りは、その細胞、組織および／または培養物は初代培養物と称される。
「低分子再プログラミング作用剤」または「低分子再プログラミング化合物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、単独で、または他の多能性因子と組み合わせてのいずれかで細胞の発生能を増大させることができる低分子を指す。「低分子」とは、分子量が約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約．５ｋＤ未満である作用剤を指す。低分子は、核酸、ペプチド模倣物、ペプトイド、炭水化物、脂質または他の有機分子もしくは無機分子であってよい。化学的混合物および／または生物学的混合物、例えば、真菌抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物のライブラリーは当技術分野で公知であり、本発明のアッセイのいずれを用いてもスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、本明細書で使用される低分子再プログラミング作用剤は、分子量が１０，０００ダルトン未満、例えば、８０００ダルトン未満、６０００ダルトン未満、４０００ダルトン未満、２０００ダルトン未満、例えば、５０～１５００ダルトン、５００～１５００ダルトン、２００～２０００ダルトン、５００～５０００ダルトンである。
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」および「基本的に含まない」という用語は、互換的に使用され、組成物、例えば、細胞集団または培地を記載するために使用される場合、特定の物質を含まない、例えば、特定の物質を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まない組成物、または、従来の手段によって測定したところ検出不可能な組成物を指す。特定の物質または組成物の構成成分の不在について言及する場合、「不在」という用語に同様の意味を適用することができる。
本発明において使用するための細胞 本発明において使用するための出発細胞集団は、基本的に任意の適切な供給源に由来してよく、細胞型または多能性の状態に関して不均一であっても均一であってよい。一実施形態では、細胞は哺乳動物の細胞であり、特定の実施形態では、細胞は、げっ歯類、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、または霊長類からなる群から選択される哺乳動物から単離する。ある実施形態では、哺乳動物はヒトである。他のある実施形態では、本発明に従って使用または処理される細胞は、基本的に任意の利用できる成体細胞型を含めた成体細胞である。
細胞は、体性幹細胞、非多能性幹細胞、不完全に多能性の幹細胞もしくは部分的に多能性の幹細胞、多分化能細胞、小能性細胞、単能性細胞、最終分化細胞、または前述の細胞の任意の組合せを含む細胞の混成集団であってよい。本発明の方法において使用される多能性細胞は、胚性幹細胞を含めた天然に存在する幹細胞であってよい、または人工多能性幹細胞であり得る。「混成」細胞集団とは、発生能の程度が様々な細胞集団である。例えば、細胞の混成集団は、再プログラミングを受けている細胞を含んでよく、したがって、混成集団は、多能性細胞、部分的に多能性の細胞、および非多能性細胞、例えば、完全に分化した細胞を含む。
一実施形態では、出発細胞集団は、成体または新生児の幹／前駆細胞から選択される。特定の実施形態では、幹／前駆細胞の出発集団は、中胚葉幹／前駆細胞、内胚葉幹／前駆細胞、および外胚葉幹／前駆細胞からなる群から選択される。
別の実施形態では、幹／前駆細胞の出発集団は、中胚葉幹／前駆細胞である。説明的な中胚葉幹／前駆細胞の例としては、これらに限定されないが、中胚葉幹／前駆細胞、内皮幹／前駆細胞、骨髄幹／前駆細胞、臍帯幹／前駆細胞、脂肪組織由来幹／前駆細胞、造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）、間葉幹／前駆細胞、筋肉幹／前駆細胞、腎臓幹／前駆細胞、骨芽細胞幹／前駆細胞、軟骨細胞幹／前駆細胞などが挙げられる。
他の関連する実施形態では、幹／前駆細胞の出発集団は、外胚葉幹／前駆細胞である。説明的な外胚葉幹／前駆細胞の例としては、これらに限定されないが、神経幹／前駆細胞、網膜幹／前駆細胞、皮膚幹／前駆細胞などが挙げられる。
他の関連する実施形態では、幹／前駆細胞の出発集団は、内胚葉幹／前駆細胞である。説明的な内胚葉幹／前駆細胞の例としては、これらに限定されないが、肝臓幹／前駆細胞、膵臓幹／前駆細胞、上皮幹／前駆細胞などが挙げられる。
ある特定の実施形態では、出発細胞集団は、膵島細胞、ＣＮＳ細胞、ＰＮＳ細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、造血細胞、骨細胞、肝臓細胞、脂肪細胞、腎細胞、肺細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、濾胞細胞、血管細胞、上皮細胞、免疫細胞、内皮細胞などからなる群から選択される、不均一または均一の細胞集団であってよい。
再プログラミングの誘導および細胞の能力の増大
細胞における多能性を誘導するため、または能力を増大させるため（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．、およびＹａｍａｎａｋａ， Ｓ．、Ｃｅｌｌ １２６巻、６６３～６７６頁（２００６年）；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ １３１巻、８６１～８７２頁（２００７年）；Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８巻、１９１７～１９２０頁（２００７年）；Ｚｈｏｕら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４巻、３８１～３８４頁（２００９年）；Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４巻、４７２～４７６頁（２００９年）；Ｙａｍａｎａｋａら、２００９年；Ｓａｈａ， Ｋ．、Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｒ．、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５巻、５８４～５９５頁（２００９年））、および再プログラミングの効率を改善するため（Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２巻、５２５～５２８頁（２００８年ａ）；Ｓｈｉら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ３巻、５６８～５７４頁（２００８年ｂ）；Ｈｕａｎｇｆｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６巻、７９５～７９７頁（２００８年ａ）；Ｈｕａｎｇｆｕら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６巻、１２６９～１２７５頁（２００８年ｂ）；Ｓｉｌｖａら、Ｐｌｏｓ Ｂｉｏ ６巻、ｅ２５３． ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ． ｐｂｉｏ． ００６０２５３（２００８年）；Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓら、ＰＮＡＳ １０６巻、８９１２～８９１７頁（２００９年）；Ｉｃｈｉｄａら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ５巻、４９１～５０３頁（２００９年）；Ｍａｈｅｒａｌｉ， Ｎ．、Ｈｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，
Ｋ．、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １９巻、１７１８～１７２３頁（２００９年ｂ）；Ｅｓｔｅｂａｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６巻、７１～７９頁（２０１０年）；およびＦｅｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ４巻、３０１～３１２頁（２００９年））の種々の戦略が追求されている。
一般に、再プログラミングの技法は、特定の細胞の経路を、ポリヌクレオチドに基づく手法、ポリペプチドに基づく手法および／または低分子に基づく手法を用いて直接的に、または間接的に調節することを伴う。細胞の発生能は、例えば、細胞を、１種または複数種の多能性因子と接触させることによって増大させることができる。「接触させること」とは、本明細書で使用される場合、多能性因子（例えば、低分子、タンパク質、ペプチドなどのような）の存在下で細胞を培養すること、または多能性因子を細胞に導入することを含み得る。多能性因子は、タンパク質などの転写因子を含めた因子の存在下、転写因子を細胞に導入することが可能になる条件下で細胞を培養することによって、細胞に導入することができる。例えば、Ｚｈｏｕ Ｈら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ２００９年５月８日；４巻（５号）：３８１～４頁；ＷＯ／２００９／１１７４３９を参照されたい。細胞への導入は、例えば、一過性の方法、例えば、タンパク質形質導入、マイクロインジェクション、組込みによらない遺伝子送達、ｍＲＮＡ形質導入など、または任意の他の適切な技法を用いて促進することができる。いくつかの実施形態では、転写因子を、細胞に導入された組換えベクターからの発現によって、または細胞を外因性転写因子ポリペプチドの存在下で、ポリペプチドが細胞に進入するようにインキュベートすることによって細胞に導入する。
特定の実施形態では、多能性因子は転写因子である。細胞の能力を増大させること、確立すること、または維持することに関連する例示的な転写因子としては、これらに限定されないが、Ｏｃｔ－３／４、Ｃｄｘ－２、Ｇｂｘ２、Ｇｓｈ１、ＨｅｓＸ１、ＨｏｘＡ１０、ＨｏｘＡ１１、ＨｏｘＢ１、Ｉｒｘ２、Ｉｓｌ１、Ｍｅｉｓ１、Ｍｅｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｎｋｘ２．２、Ｏｎｅｃｕｔ、Ｏｔｘ１、Ｏｘｔ２、Ｐａｘ５、Ｐａｘ６、Ｐｄｘ１、Ｔｃｆ１、Ｔｃｆ２、Ｚｆｈｘ１ｂ、Ｋｌｆ－４、Ａｔｂｆ１、Ｅｓｒｒｂ、Ｇｃｎｆ、Ｊａｒｉｄ２、Ｊｍｊｄ１ａ、Ｊｍｊｄ２ｃ、Ｋｌｆ－３、Ｋｌｆ－５、Ｍｅｌ－１８、Ｍｙｓｔ３、Ｎａｃ１、ＲＥＳＴ、Ｒｅｘ－１、Ｒｙｂｐ、Ｓａｌｌ４、Ｓａｌｌ１、Ｔｉｆ１、ＹＹ１、Ｚｅｂ２、Ｚｆｐ２８１、Ｚｆｐ５７、Ｚｉｃ３、Ｃｏｕｐ－Ｔｆ１、Ｃｏｕｐ－Ｔｆ２、Ｂｍｉ１、Ｒｎｆ２、Ｍｔａ１、Ｐｉａｓ１、Ｐｉａｓ２、Ｐｉａｓ３、Ｐｉａｓｙ、Ｓｏｘ２、Ｌｅｆ１、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ６、Ｔｃｆ－７、Ｔｃｆ７ｌ１、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｈａｎｄ１、Ｍａｄ１、Ｍａｄ３、Ｍａｄ４、Ｍｘｉ１、Ｍｙｆ５、Ｎｅｕｒｏｇ２、Ｎｇｎ３、Ｏｌｉｇ２、Ｔｃｆ３、Ｔｃｆ４、Ｆｏｘｃ１、Ｆｏｘｄ３、ＢＡＦ１５５、Ｃ／ＥＢＰβ、ｍａｆａ、Ｅｏｍｅｓ、Ｔｂｘ－３；Ｒｆｘ４、Ｓｔａｔ３、Ｓｔｅｌｌａ、およびＵＴＦ－１が挙げられる。例示的な転写因子としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、およびＮａｎｏｇが挙げられる。
低分子再プログラミング作用剤も多能性因子であり、これも、本発明の方法において再プログラミングを誘導するため、および細胞能力を維持または増大させるために使用することができる。本発明のいくつかの実施形態では、体細胞の多能性を誘導するため、細胞の能力を増大させるもしくは維持するため、または再プログラミングの効率を改善するために、１種または複数種の低分子再プログラミング作用剤を使用する。
いくつかの実施形態では、再プログラミングの効率を改善するために、低分子再プログラミング作用剤を本発明の方法において使用する。再プログラミングの効率の改善は、（１）再プログラミングおよび多能性細胞の生成のために必要な時間の減少（例えば、多能性細胞を生成するための時間を、低分子を用いない同様のまたは同じプロセスと比較して少なくとも１日短縮することによって）、またはその代わりに、またはそれと組み合わせて、（２）特定のプロセスによって生成される多能性細胞の数の増加（例えば、所与の期間内に再プログラミングされた細胞の数が、低分子を用いない同様のまたは同じプロセスと比較して少なくとも１０％、３０％、５０％、１００％、２００％、５００％など増加すること）によって測定することができる。いくつかの実施形態では、再プログラミング効率の２倍～２０倍の改善が観察される。いくつかの実施形態では、再プログラミング効率が２０倍超改善される。いくつかの実施形態では、低分子再プログラミング作用剤を用いない方法と比較して１００倍超の効率の改善が認められる（例えば、生成する多能性細胞の数が１００倍超増加する）。
いくつかのクラスの低分子再プログラミング作用剤は、細胞の能力を増大させ、確立し、かつ／または維持するために重要であり得る。例示的な低分子再プログラミング作用剤としては、これらに限定されないが、：Ｈ３Ｋ９のメチル化を阻害する、またはＨ３Ｋ９の脱メチル化を促進する作用剤；Ｈ３Ｋ４の脱メチル化を阻害する、またはＨ３Ｋ４のメチル化を促進する作用剤；ヒストンの脱アセチル化を阻害する、またはヒストンのアセチル化を促進する作用剤；Ｌ－型Ｃａチャネルアゴニスト；ｃＡＭＰ経路の活性化因子；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）阻害剤；核受容体リガンド；ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤；ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤；ＨＤＡＣ阻害剤；Ｅｒｋ阻害剤；ＲＯＣＫ阻害剤；ＦＧＦＲ阻害剤；およびＰＡＲＰ阻害剤が挙げられる。例示的な低分子再プログラミング作用剤としては、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤；ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤；ＨＤＡＣ阻害剤；Ｅｒｋ阻害剤；およびＲＯＣＫ阻害剤が挙げられる。これらのクラスの低分子作用剤の各々は下により詳細に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の方法の１種または複数種の転写因子と置き換えて、多能性を誘導するため、再プログラミングの効率を改善するため、および／または細胞の能力を増大させるもしくは維持するために、低分子再プログラミング作用剤を使用する。例えば、いくつかの実施形態では、細胞を、１種または複数種の低分子再プログラミング作用剤と接触させ、ここで、作用剤は再プログラミングの効率を改善するために十分な量で含まれる。他の実施形態では、本発明の方法の転写因子に加えて１種または複数種の低分子再プログラミング作用剤を使用する。一実施形態では、細胞を、少なくとも１種の多能性転写因子および少なくとも１種の低分子再プログラミング作用剤と、細胞の能力を増大させ、確立し、かつ／もしくは維持するため、または再プログラミングプロセスの効率を改善するための条件下で接触させる。
別の実施形態では、細胞を、少なくとも１種の多能性転写因子および少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、または少なくとも１０種の低分子再プログラミング作用剤と、細胞の能力を増大させ、確立し、かつ／もしくは維持するため、または再プログラミングの効率を改善するために十分な条件下で、および、そのために十分な時間にわたって接触させる。細胞の能力または分化の状態は、本明細書の他の箇所に記載の通り多能性特性をモニタリングすることによって評価することができる。
一実施形態では、細胞を、１種または複数種の多能性因子および／または低分子再プログラミング作用剤の組合せを含む組成物と接触させ、ここで、多能性因子および低分子により、細胞の多能性が増大する、または誘導される。本発明の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで接触させることができることが意図されている。
多能性細胞の特徴付け
再プログラミングを誘導した後、再プログラミングされた細胞を、多能性に関連する、該当する検出可能な形態学的変化、分子的変化および／または生化学的変化に基づいて選択することができる。細胞の能力の評価において別々にまたは組み合わせてモニタリングすることができる細胞の多能性の特異的な特性としては、これらに限定されないが、遺伝子発現、メチル化、ならびにｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける特性、例えば、ｉ）丸くて平らな多能性幹細胞の形態；ｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウス多能性幹細胞）、ＳＳＥＡ３／４（ヒト多能性幹細胞）；ＴＲＡ１－６０／８１；ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、Ｎａｎｏｇおよび／またはＳｏｘ２、ならびに本発明によって提供されるＣＤ３０およびＣＤ５０、ならびに前述のものの組合せを含めた多能性幹細胞マーカーの発現；ｉｉｉ）マウスキメラにおける、多能性幹細胞の生殖細胞系列伝達に寄与する能力；ｉｖ）四倍体胚補完アッセイを用いた、多能性幹細胞の、胚本体に寄与する能力；ｖ）多能性幹細胞の奇形腫の形成；ｖｉ）胚様体の形成およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおける三系統分化；ならびにｖｉｉ）不活性なＸ染色体の再活性化が挙げられる。ある実施形態では、上記の特性のいずれかのサブセットを使用して、細胞能力をモニタリングする。一実施形態では、多能性細胞は、平らな丸いコロニー形態、ＳＳＥＡ４およびＯｃｔ４の発現、ならびにキメラおよび奇形腫を形成する能力を有することによって特徴付けられる。
本明細書で考察されている通り、多能性は連続体として存在し、人工多能性幹細胞は、「プライムされた」状態および「ナイーブな」状態の両方で存在し、おそらくナイーブな状態にある細胞の方が分化の潜在性が大きいようである。従来の培地中で生成した人工多能性幹細胞は、プライムされた状態で存在し、着床後胚盤胞に由来する細胞によりよく似ているが、ナイーブｉＰＳＣは、マウス胚性幹細胞または着床前胚盤胞に由来する細胞によりよく似ている多能性特性を示す。プライムされた細胞の状態およびナイーブ細胞の状態は、コロニー形態、重要なシグナル伝達経路の阻害または活性化に対する細胞の応答、遺伝子発現のサイン、および胚体外の細胞に関連する遺伝子を再活性化する能力の差異を含めた種々の差異によって定義することができる。例えば、プライムされた多能性の状態を示す従来のｉＰＳＣは平らなコロニー形態を示すが、ナイーブｉＰＳＣはマウス胚性幹細胞と同様の密集したドーム形のコロニー形態を示す。さらに、従来のｉＰＳＣは、未分化の状態を維持するためには、重要なサイトカイン、例えば、ＴＧＦβ、アクチビン、およびｂＦＧＦの外因性のシグナル伝達を必要とし、ＥＲＫ／ＭＥＫ細胞シグナル伝達に依存し、細胞を、例えば、ＴＧＦβ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤と接触させることによってこれらの経路が阻害されると分化する。対照的に、ナイーブ細胞は、外因性のシグナル伝達を必要とせず、ＴＧＦβシグナル伝達経路およびＭＥＫシグナル伝達経路の阻害剤で処理した場合でさえ、多能性を維持する。
さらに、遺伝子発現解析により、ナイーブ多能性細胞とプライム多能性細胞の間の有意差が示されている。例えば、ナイーブｉＰＳＣではＸｉｓｔの発現が有意に抑制されているが、従来のｉＰＳＣはＸｉｓｔの発現のそれほど大きくない抑制のみを示し、ナイーブ細胞は、従来のｉＰＳＣにおいて見出される発現と比較して、有意なＸ染色体の再活性化およびＸ染色体に位置する遺伝子の発現の増加を示し、ナイーブ細胞は、これらに限定することなく、Ｇａｔａ６、ＣＤＸ２、およびＣＧＢを含めた胚体外の幹細胞マーカーを発現する。対照的に、分化の初期のマーカー、例えば、Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、およびＢｒａｃｈｙｕｒｙの系統特異的な遺伝子などは、従来のｉＰＳＣにおいて、ナイーブｉＰＳＣと比較してより高度に発現される。ナイーブな多能性の状態にある細胞を同定するために有用なさらなるマーカーとしては、Ｋｌｆ４、Ｔｂｘ３、Ｇｂｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｓｏｃ３の増大またはＯｔｘ２、Ｓｏｘ１７、Ｃｅｒ１、ＦｏｘＡ２、Ｚｉｃ１、Ｌｈｘ２、Ｘｉｓｔの低下が挙げられる。
本発明の特定の実施形態では、ナイーブ細胞が示すＸｉｓｔの発現は、従来のｉＰＳＣと比較して少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍低下する。本発明のいくつかの実施形態では、ナイーブな多能性の状態にある細胞では、Ｘｉｓｔの発現が従来のｉＰＳＣの２倍低く、Ｘ染色体に位置する少なくとも５種の遺伝子の発現が従来のｉＰＳＣの３倍高いレベルである。
Ｘ染色体の再活性化は、Ｘ染色体に位置する少なくとも５種の遺伝子、少なくとも１０種の遺伝子、または特定の実施形態では少なくとも１００種の遺伝子の発現の、従来のｉＰＳＣにおけるそのような遺伝子のレベルと比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、またはそれより高いレベルの上昇によって示すことができる。
本発明の特定の実施形態では、本発明の多能性細胞は、例えば、少なくとも１回、３回、５回、７回、１０回、１５回、２０回またはそれより多くの継代などの複数回の細胞継代にわたって多能性特性を保持する。
本発明の方法において使用するための培地プラットフォーム
本発明の培地（すなわち、培養プラットフォーム）は、化学的に定義された保存基本培地、および、
フィーダーフリー環境における多能性細胞の長期培養；
フィーダーフリー環境における細胞の再プログラミング；
多能性細胞の単細胞への解離；
多能性細胞の細胞選別；
未分化状態の維持；
再プログラミングの効率の改善；および
ナイーブ多能性細胞の生成
を可能にする低分子阻害剤を含めた低分子の種々の組合せを含む。
本発明の培地に使用するための化学的に定義された保存基本培地は、幹細胞の維持、成長、および／または分化を支持するために適した定義済みの任意の基本培地、例えば、従来のヒト胚性幹細胞用培地であってよい。本発明に従って使用することができる定義済みの基本培地の例としては、これらに限定されないが、とりわけ、ダルベッコ改変イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２（１：１ＤＭＥＭおよびＦ－１２、ｖｏｌ：ｖｏｌ）；１９９培地；Ｆ－１２（Ｈａｍ）栄養混合物；Ｆ－１０（Ｈａｍ）栄養混合物；最小必須培地（ＭＥＭ）、ウイリアムズ培地Ｅ；およびＲＰＭＩ１６４０が挙げられ、これらは全て、Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．から入手可能である。これらの培地の多くのいくつかのバージョンが利用可能であり、本発明の培地を構築するために特に有用な培地としては、これらに限定されないが、：ＤＭＥＭ１１９６６、ＤＭＥＭ１０３１４、ＭＥＭ１１０９５、ウイリアムズ培地Ｅ１２２５１、Ｈａｍ Ｆ１２ １１０５９、ＭＥＭ－アルファ１２５６１、および培地－１９９ １１１５１が挙げられる（全てＧｉｂｃｏ－ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である（１９９５～１９９６年カタログ））。培地は、例えば、以下の１つまたは複数を含んでよい：アミノ酸、ビタミン、有機塩、無機塩、微量元素、緩衝塩、糖、ＡＴＰなど（適切な基本培地の成分は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｏｆ Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から入手可能である）。
本発明の細胞培養培地において使用するための低分子、およびそのクラスは下により詳細に記載されている。特定の実施形態では、本発明の培地は、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１種または複数種、２種以上、または３種以上を含む。ある実施形態では、本発明の培地は、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む。本発明の細胞培養培地および方法において使用するための例示的なＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤は下に記載されている。培地は、ＰＡＲＰ阻害剤、例えば、Ｏｌａｐａｒｉｂ（ＡＺＤ－２２８１）などをさらに含んでよい。
ＧＳＫ－３β阻害剤
ＧＳＫ－３βの阻害剤としては、これらに限定されないが、ＧＳＫ－３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ－３β変異体、ならびにＧＳＫ－３βを標的とするｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なＧＳＫ－３β阻害剤としては、これらに限定されないが、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ－Ａ０１４４１８、リチウム、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ－８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－（２－フェニルキナゾリン－４－イル）アミン、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム（ｃｙｃｌｏｐｅｎａｄｉｅｎｙｌｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）複合体、ＴＤＺＤ－８ ４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン、２－チオ（３－ヨードベンジル）－５－（１－ピリジル）－［１，３，４］－オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、ＡＲ－ＡＯ １４４－１８、３－（１－（３－ヒドロキシプロピル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］－４－ピラジン－２－イル－ピロール－２，５－ジオン；ＴＷＳｌ １９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３ Ｈ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２またはそのミリストイル化形態；２－クロロ－１－（４，５－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン、ＳＢ２１６７６３、およびＳＢ４１５２８６が挙げられる。本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なＧＳＫ３阻害剤としてはＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、およびケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）が挙げられるが、特定の実施形態ではＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤
ＥＲＫ／ＭＥＫ経路の例示的な阻害剤としては、これらに限定されないが、ＭＥＫまたはＥＲＫに対する抗体、ドミナントネガティブＭＥＫまたはＥＲＫ変異体、ならびにＭＥＫおよび／またはＥＲＫの発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤としては、これらに限定されないが、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ９８０５９、ＵＯ１２６、ＳＬ３２７、ＡＲＲＹ－１６２、ＰＤ１８４１６１、ＰＤ１８４３５２、スニチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、アキシチニブ、ＧＳＫｌ １２０２１２、ＡＲＲＹ－４３８１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＸＬ５１８、ＡＺＤ８３３０、ＲＤＥＡｌ １９、ＡＺＤ６２４４、ＦＲ１８０２０４およびＰＴＫ７８７が挙げられる。
さらなるＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤としては、国際公開特許出願ＷＯ ９９／０１４２６、ＷＯ ０２／０６２１３、ＷＯ ０３／０７７９１４、ＷＯ ０５／０５１３０１およびＷＯ ２００７／０４４０８４に開示されている化合物が挙げられる。
さらなる説明的なＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤の例としては、以下の化合物が挙げられる：－－６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２，３－ジヒドロキシ－プロポキシ）－アミド；６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－（テトラヒドロ－ピラン－２－イルメチル（ｙｌｍ－ ｅｔｈｙｌ））－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、１－［６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－イル］－２－ヒドロキシ－エタノン、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－１，１－ジメチル－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－（テトラヒドロ－フラン－２－イルメチル（ｙｌｍ－ ｅｔｈｙｌ））－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－フルオロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（２，４－ジクロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－ｅ－５－カルボン酸（２－ヒドロキシ－エトキシ）－アミド、以後ＭＥＫ阻害剤１と称される；２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－－オキソ－１，６－ジヒドロピリジン－３－カルボキサミド；以後ＭＥＫ阻害剤２と称される；および４－（４－ブロモ－２－フルオロフェニルアミノ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－１，５－ジメチル－６－－オキソ－１，６－ジヒドロピリダジン－３－カルボキサミドまたはそれらの薬学的に許容される塩。ある実施形態では、本発明の細胞培養培地において使用するためのＭＥＫ／ＥＲＫ阻害剤はＰＤ９８０５９である。
ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤
例示的なＡＬＫ５阻害剤としては、ＡＬＫ５に対する抗体、ＡＬＫ５のドミナントネガティブ変異体、およびＡＬＫ５の発現を抑制するアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なＡＬＫ５阻害剤としては、これらに限定されないが、ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、Ｗｎｔ３ａ／ＢＩＯ、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＳＭ１６、ＩＮ－１１３０、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５０５１２４、およびピリミジン誘導体が挙げられ、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／００６５８３を参照されたい。
さらに、「ＡＬＫ５阻害剤」は非特異的なキナーゼ阻害剤を包含しないものとし、「ＡＬＫ５阻害剤」は、ＡＬＫ５に加えて、ＡＬＫ４および／またはＡＬＫ７を阻害する阻害剤、例えば、ＳＢ－４３１５４２などを包含するものと理解されるべきである（例えば、Ｉｎｍａｎら、Ｊ ＭｏＩ． Ｐｈａｍａｃｏｌ． ６２巻（１号）：６５～７４頁（２００２年）を参照されたい。
ＡＬＫ５を阻害することの効果を示す本明細書のデータを考慮して、ＴＧＦβ／アクチビン経路を阻害することも同様の効果を有すると考えられる。したがって、例えば、ＴＧＦβ／アクチビン経路の上流または下流の任意の阻害剤を、本明細書の各パラグラフに記載のＡＬＫ５阻害剤と組み合わせて、またはその代わりに用いることができる。例示的なＴＧＦβ／アクチビン経路阻害剤としては、これらに限らないが、：ＴＧＦβ受容体阻害剤、ＳＭＡＤ２／３リン酸化の阻害剤、ＳＭＡＤ２／３とＳＭＡＤ４の相互作用の阻害剤、ならびにＳＭＡＤ６およびＳＭＡＤ７の活性化因子／アゴニストが挙げられる。さらに、下記のカテゴリー化は、ただ単に組織的な目的のためのものであり、当業者には、化合物が、経路内の１つまたは複数の点に影響を及ぼし得、したがって、化合物が２種以上の定義済みのカテゴリーにおいて機能し得ることが分かるであろう。
ＴＧＦβ受容体阻害剤としては、ＴＧＦβ受容体に対する抗体、ＴＧＦβ受容体のドミナントネガティブ変異体およびＴＧＦβ受容体を標的とするｓｉＲＮＡまたはアンチセンス核酸を挙げることができる。阻害剤の特定の例としては、これらに限らないが、ＳＵ５４１６；２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－ｔｅｒｔ－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩（ＳＢ－５０５１２４）；レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍｂ）（ＣＡＴ－１５２）；メテリムマブ（ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＡＴ－１９２）；ＧＣ－１００８；ＩＤｌ １；ＡＰ－１２００９；ＡＰ－１１０１４；ＬＹ５５０４１０；ＬＹ５８０２７６；ＬＹ３６４９４７；ＬＹ２１０９７６１；ＳＢ－５０５１２４；ＳＢ－４３１５４２；ＳＤ－２０８；ＳＭ１６；ＮＰＣ－３０３４５；Ｋｉ２６８９４；ＳＢ－２０３５８０；ＳＤ－０９３；グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）；３，５，７，２’，４’－ペンタヒドロキシフラボン（ｐｅｎｔａｈｙｄｒｏｘｙｆｉａｖｏｎｅ）（Ｍｏｒｉｎ）；アクチビン－Ｍ１０８Ａ；Ｐ１４４；可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ；およびＴＧＦβ受容体を標的とするアンチセンストランスフェクト腫瘍細胞が挙げられる（例えば、Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３巻（１８号）：５２６２～５２７０頁（２００７年）；Ｋａｍｉｎｓｋａら、Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｐｏｌｏｎｉｃａ ５２巻（２号）：３２９～３３７頁（２００５年）；およびＣｈａｎｇら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ １２巻：４３９３～４４０１頁（２００７年）を参照されたい。
本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なＴＧＦβ受容体阻害剤としては、ＳＢ４３１５４２、Ａ－８３－０１、およびＲｅｐＳｏｘが挙げられる。特定の実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤はＳＢ４３１５４２である。
ＲＯＣＫ阻害剤
ＲＯＣＫは、Ｒｈｏ（３種のアイソフォーム－ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢおよびＲｈｏＣが存在する）の標的タンパク質としての機能を果たすセリン／トレオニンキナーゼである。例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、これらに限定されないが、ＲＯＣＫに対する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体、ならびにＲＯＣＫの発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、これらに限定されないが、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ファスジル（Ｆａｓｕｄｉｌ）、ＡＲ１２２－８６、Ｙ２７６３２ Ｈ－１１５２、Ｙ－３０１４１、Ｗｆ－５３６、ＨＡ－１０７７、ヒドロキシル－ＨＡ－１０７７、ＧＳＫ２６９９６２Ａ、ＳＢ－７７２０７７－Ｂ、Ｎ－（４－ピリジル）－Ｎ’－（２，４，６－トリクロロフェニル）尿素、３－（４－ピリジル）－１Ｈ－インドール、および（Ｒ）－（＋）－トランス－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキシアミドが挙げられる。
本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なＲＯＣＫ阻害剤としては、チアゾビビン、Ｙ２７６３２、ピリンテグリン（ｐｙｒｉｎｔｅｇｒｉｎ）、およびブレビスタチンが挙げられる。ある実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。
ＦＧＦＲ阻害剤
例示的なＦＧＦＲ阻害剤としては、これらに限定されないが、ＦＧＦＲに対する抗体、ドミナントネガティブＦＧＦＲ変異体、ならびにＦＧＦＲの発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が挙げられる。他の例示的なＦＧＦＲ阻害剤としては、これらに限定されないが、ＲＯ－４３９６６８６、ＣＨＩＲ－２５８、ＰＤ １７３０７４、ＰＤ １６６８６６、ＥＮＫ－８３４、ＥＮＫ－８３５、ＳＵ５４０２、ＸＬ－９９９、ＳＵ６６６８、Ｒ０４３８３５９６、およびＢＩＢＦ－１１２０が挙げられる。
ＰＡＲＰ阻害剤
ＰＡＲＰ阻害剤は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（「ＰＡＲＰ」）を阻害する。ＰＡＲＰタンパク質は、細胞においてＤＮＡ修復経路を調節するように機能するＤＮＡ修復酵素である。ＰＡＲＰは、塩基除去修復（ＢＥＲ）経路に関与し、ＰＡＲＰを阻害することにより、再プログラミングの間の細胞のゲノム安定性または多能性細胞の維持が促進され得る。本発明の細胞培養培地において使用するための例示的なＰＡＲＰ阻害剤としては、限定することなく、イニパリブ（ｉｎｉｐａｒｉｂ）、ベリパリブ（ｖｅｌｉｐａｒｉｂ）、およびオラパリブ（ｏｌａｐａｒｉｂ）（ＡＺＤ－２２８１）が挙げられる。
本発明の細胞培養培地中の低分子の量は変えることができ、使用する特定の分子および組合せ、培地中で培養する細胞の種類、および本発明の培地への使用の特定の適用を含めた特定の培養条件に従って最適化することができる。いくつかの実施形態では、低分子は、培地中に、多能性を誘導するため、再プログラミングの効率を改善するため、または細胞の能力を増大させるためもしくは維持するために十分な濃度で存在する。
特定の実施形態では、本発明の細胞培養培地中の好ましい低分子の濃度および組合せが表１に示されている。本発明の細胞培養培地の特定の実施形態では、細胞培養培地は表１に記載の「ＳＭＣ４」培地である。ＳＭＣ４培地は、表１に示されている従来のヒトＥＳＣ培地および特定の経路修飾因子および添加物を含む。培地の構成成分は、培地中に、表１に示されているそのような構成成分に最適な範囲内の量で存在してよく、表１に示されている最適な濃度で存在する。ＳＭＣ４培地の複数の実施形態は、必要に応じて、表２に示されている代替培地および経路修飾因子および活性化因子の任意の１つまたは複数を、表２に示されている最適な範囲内の濃度で、および、ある実施形態では、表２に示されている最適な範囲内の濃度で含んでよい。培地の特定の実施形態では、ＳＭＣ４培地は、可溶性フィブロネクチンを含み、全体を通して「ＳＭＣ４＋フィブロネクチン」と称される。
いくつかの実施形態では、本発明の培地は、Ｏｃｔポリペプチド、Ｋｌｆポリペプチド、Ｍｙｃポリペプチド、およびＳｏｘポリペプチドのうちの１つまたは複数をさらに含む。いくつかの実施形態では、培地は細胞を含まない。いくつかの実施形態では、培地は、細胞、例えば、非多能性細胞、部分的に多能性の細胞、多能性細胞、または種々の能力の状態の細胞を含有する細胞の混成集団をさらに含む。
表１．細胞培養の構成成分および添加物。
下記の表には、単細胞継代および細胞選別および富化の手順を受けている細胞の生存能力および多能性を増強するため、再プログラミングプロセスを増強するため、ならびに多能性幹細胞を未分化の状態に維持するために使用することができる分子、およびそれらが影響を及ぼすシグナル伝達経路の例が列挙されている。
Figure 0007350127000001
 ＳＭＣ４＋フィブロネクチンとは、上記の通り、可溶性フィブロネクチンを約５μｇ／ｍＬの濃度を含むＳＭＣ４培地を指す。フィブロネクチンは約０５～５００μｇ／ｍＬの濃度範囲でＳＭＣ４培地中に存在し得る。
表２．フィーダーフリー系における単細胞継代、細胞選別および培養における細胞の多能性および生存能力を増強するための特定の代替的な細胞培養構成成分および添加物
Figure 0007350127000002
Figure 0007350127000003
Figure 0007350127000004
 サイトカインおよび成長因子
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の細胞培養培地は、サイトカインおよび／または成長因子を実質的に含まず、必要に応じて、フィーダーフリー環境である。他の実施形態では、細胞培養培地は、補充物、例えば、血清、抽出物、成長因子、ホルモン、サイトカインなどを含有する。
種々の成長因子および培地におけるそれらの使用は当技術分野で周知であり、それらとしては、例えば、ＥＣＭタンパク質、ラミニン１、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲンアイソタイプ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、細胞表面接着タンパク質、細胞－シグナル伝達タンパク質、カドヘリン、細胞内クロライドチャネル１、膜貫通受容体ＰＴＫ７、インスリン様成長因子、インヒビンベータＡ、ＴＧＦβ／アクチビン／節（ｎｏｄａｌ）シグナル伝達経路の誘導因子、およびアクチビンＡが挙げられる。培地において使用するサイトカインとしては、例えば、以下の１つまたは複数を挙げることができる：成長因子、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１８）、種々のコロニー－刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー－刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γなど）および幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびエリスロポエチン（Ｅｐｏ）。これらのサイトカインは、商業的に、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．から入手することができ、また、天然または組換え型のどちらであってもよい。いくつかの実施形態では、多種多様な哺乳動物の細胞を培養するために、基本培地は、ＦＧＦを約０．０１～１００ｎｇ／ｍｌ、約０．２～２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、および、特定の実施形態では、約０．５～１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含有する。他のサイトカインを使用する場合、経験的に決定される濃度または確立されたサイトカインの技術分野で手引きされる濃度で添加することができる。
本培地に含めることができるさらなる構成成分は、インスリン（特にインスリンＺｎ＋＋として）およびトランスフェリンである。これらのさらなる成分は市販されており（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．から）、本培地に約０．１～約１００μｇ／ｍｌまたは約１～約１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で処方することができる。さらに、組換えインスリンまたはインスリンの亜鉛ベースの塩で動物またはヒト由来のインスリンを置き換えることができる。他の成分または代替物を、当業者に公知のように補充組成物に加えることができる。
その代わりに（またはそれに加えて）、サイトカインおよび同様の補充物の構成成分を基本培地に含めることができる。そのような構成成分は、一般には、補充組成物は従来、基本培地を保管するために定期的に用いられる約４℃の温度ではなく約－２０℃で保管されるので、補充組成物と一緒に含める。サイトカインおよび同様の構成成分は、－２０℃に近い温度でより好都合であり得る。
本発明の方法において使用するための基質
任意の適切な容器または細胞培養容器を、基本培地および／または細胞培養補充物中の細胞培養物の支持体として使用することができる。支持体上の基質コーティングは必要ない。しかし、培養容器の表面を、接着促進性基層（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ＲＧＤを含有するポリペプチド、ゼラチンなど）でコーティングすることにより、細胞の付着が促進され、それにより、本明細書に開示されている細胞培養培地および補充物の効果が増強され得る。細胞を培養し、継代するための適切な基質は当技術分野で公知であり、それらとしては、限定することなく、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、エラスチン、オステオポンチン、天然に存在する細胞系により産生されたマトリックス、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の混合物、ならびに、合成または人工の表面、例えば、ポリアミン単層およびカルボキシ末端単層が挙げられる。
フィーダーフリー環境
細胞は、一般には、フィーダー細胞上でまたはフィーダー細胞で予備馴化され、ウシ胎仔血清を含有する培養環境で培養されているが、そのような環境は、臨床的な使用および治療的な使用のための細胞を作製するためには不適当な場合がある。例えば、そのような異物が混入した環境において培養された細胞は、一般に、動物の構成成分に曝露することにより、免疫拒絶反応および処置される患者に未確認の病原体が伝染する重大な危険性がもたらされる可能性があり、また、動物レトロウイルスを潜在的に再活性化する恐れがあるので、ヒト細胞移植には不適当であるとみなされる。動物を含まない培地を用いた培養系、例えば本発明のフィーダーフリー環境により、臨床グレードの細胞系、特にｈＥＳＣ細胞系およびｉＰＳＣ細胞系を作製することが容易になる。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のフィーダーフリー環境は、これらに限定することなく、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、および胚性幹細胞を含めたヒトフィーダー細胞を基本的に含まず、フィーダー細胞によって予備馴化されていない。本発明のさらなる実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的に、動物フィーダー細胞を含まず、さらに、いくつかの実施形態では、フィーダー細胞で予備馴化されていない。本発明の特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的にヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、さらにより特定の実施形態では、フィーダーフリー環境は、基本的にヒトフィーダー細胞と動物フィーダー細胞のどちらも含まず、フィーダー細胞で予備馴化されていない。
本発明のフィーダーフリー細胞培養培地は、多能性細胞の培養、細胞の再プログラミング、多能性細胞の単細胞への解離、多能性細胞の細胞選別、ナイーブ多能性細胞の生成、および細胞の未分化状態の維持を含めた、本発明の方法において使用される。本発明の特定の方法では、フィーダーフリー環境は、多能性を誘導するため、再プログラミングの効率を改善するため、および／または細胞の能力を増大させるもしくは維持するための方法において使用される。ある実施形態では、フィーダーフリー環境は、ｂＦＧＦを含めたサイトカインおよび成長因子を実質的に含まない。
解離
細胞を単細胞、例えば、単細胞懸濁物に解離させることは、酵素的または機械的な手段によって実現することができる。細胞を単細胞に解離させることができる当技術分野で公知の任意の酵素剤を、本発明の方法において使用することができる。本発明の一実施形態では、解離作用剤は、トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ－Ｓｅｌｅｃｔ、コラゲナーゼＩＶおよびディスパーゼから選択される。
キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）、またはＡｃｃｕＭａｘも、本発明の方法による細胞の解離において単独で、または酵素剤と組み合わせて用いることができる。単細胞への解離を容易にするために、解離作用剤をカルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳに溶解させることができる。
解離の間およびその後の細胞の生存を増強するために、生存促進物質（例えば、成長因子、細胞死およびアポトーシスに関与する細胞経路の阻害剤、または馴化培地）を添加することができる。いくつかの実施形態では、従来の培地で培養した細胞を解離させ、単細胞を、１種または複数種の低分子阻害剤を有する本発明の細胞培養物、例えば、ＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に入れる。解離した単細胞は、必要に応じて、フィーダーフリー環境に置くことができる。他の実施形態では、細胞をフィーダーフリー環境において培養した後に解離させ、１種または複数種の低分子阻害剤を有する本発明の細胞培養物、例えば、ＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に入れ、必要に応じてフィーダーフリー環境に置いてもよい。
単細胞への酵素による解離を機械力により支持することができる。あるいは、解離作用剤は、ピペットまたは先の尖ったミクロキャピラリーなどの機械的ツールを使用して細胞を引き離すことによるものなどの機械力のみであってよい。
細胞培養および培地収集の一般的な技法は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８巻：１４８頁、１９９７年）；Ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ（Ｋ． Ｋｉｔａｎｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７巻：７３頁、１９９１年）；Ｌａｒｇｅ
Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２巻：３７５頁、１９９１年）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈら、Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ． １９巻：２５１頁、１９９０年）に概説されている。他の対象の読み物としては、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｍｅｄｉａ（Ｍ． ＭｃＬｕｈａｎ、Ｍｅｎｔｏｒ Ｎ．Ｙ．、１９６４年）およびＴｈｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｉｓ ｔｈｅ Ｍａｓｓａｇｅ（Ｍ． ＭｃＬｕｈａｎ ＆ Ｑ． Ｆｉｏｒｅ、Ｂａｎｔａｍ
Ｎ．Ｙ．、１９６７年）が挙げられる。
本発明の実施において有用な一般的な技法のさらなる詳細について、実践者は、細胞生物学、組織培養、および発生学における標準の教本および総説を参照することができる。「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ． １９８７年）；「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」（Ｐ． Ｍ． Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３年）；「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」（Ｍ． Ｖ． Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２２５巻：９００頁、１９９３年）；「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｐ． Ｄ． Ｒａｔｈｊｅｎら、１９９３年）が挙げられる。幹細胞の分化は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ． ７５巻：１７３頁、１９９７年；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ、Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ． １０巻：３１頁、１９９８年に概説されている。
富化および枯渇の戦略
本発明は、ｉＰＳＣ生成の効率を上昇させる方法として細胞集団を多能性細胞について富化するための戦略も提供する。富化戦略により、クローンｉＰＳＣコロニーを比較的短い時間で得、ｉＰＳＣ生成の効率を改善する方法が提供される。本発明の富化方法は、再プログラミングされるように誘導された細胞集団を選別して、多能性のマーカーを発現している細胞を同定し、それを得、それにより、多能性細胞が富化された細胞集団を得ることを含む。選別される細胞は、再プログラミングされるように誘導されていてよく、また、再プログラミングを受けている細胞の混成集団を含んでよく、したがって、集団は、多能性細胞、部分的に多能性の細胞、および非多能性細胞、例えば、完全に分化した細胞を含む。一実施形態では、選別される細胞集団は、再プログラミングされるように誘導されており、多能性のマーカーを発現している。いくつかの実施形態では、細胞を、約４～３０日間、約４～２４日間、約６～２２日間、または約８～約１２日間にわたって再プログラミングを誘導した後に培養する。さらなる富化方法体系は、分化または非多能性のマーカーを発現している細胞を枯渇させて、多能性細胞が富化された集団を得ることを包含する。
本発明の富化戦略は、選別される細胞集団の単細胞懸濁物を得ることを含む。本発明の一実施形態では、単細胞懸濁物は、集団内の細胞を解離させることおよび細胞を再懸濁させることによって得られる。細胞を維持するため、または細胞選別を実施するために、解離細胞を、任意の適切な溶液または培地に再懸濁させることができる。特定の実施形態では、単細胞懸濁物は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤のうちの１つまたは複数を含有する。ある実施形態では、単細胞懸濁物は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、ある特定の実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。
本発明の富化プロセスでは、細胞を選別して多能性細胞を得る、または細胞について、再プログラミングされていない細胞または非多能性細胞を枯渇させ、それにより、多能性細胞が富化された細胞集団を得る。一実施形態では、単細胞懸濁物を調製し、次いで、単細胞を、選別するために、例えば、多能性のマーカーについて、例えば、適切な抗体を使用して染色することによって調製する。細胞は、細胞を選別する任意の適切な方法、例えば、磁気ビーズまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による選別によって選別することができる。
細胞は、Ｏｃｔ、Ｓｏｘ、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３／４；ＴＲＡ１－６０／８１；ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ１（マウス）、および本発明において実証されているＣＤ３０およびＣＤ５０の発現を含めた種々の多能性のマーカーに基づいて選別することができる。種々の実施形態では、細胞を、少なくとも２種、少なくとも３種、または少なくとも４種の多能性のマーカーに基づいて選別する。ある実施形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４の発現に基づいて選別し、ある特定の実施形態では、ＴＲＡ１８１またはＴＲＡ１６０と組み合わせたＳＳＥＡ４の発現に基づいて選別する。ある実施形態では、細胞を、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１またはＴｒａ１６０およびＣＤ３０に基づいて選別する。ある実施形態では、細胞について、最初に、再プログラミングされていない細胞を、これらに限定されないが、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７を含み得る、分化している細胞の表面マーカーを使用して枯渇させ、次いで、多能性マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１およびＣＤ３０について富化する。
選別して多能性マーカーに対して陽性である細胞を得た後の所望の細胞画分は、多能性細胞が富化された細胞集団である。多能性細胞が富化された集団は、細胞培養系、例えば、従来のｈＥＳＣ培地または本発明の細胞培養培地などに入れることができる。細胞培養系は、フィーダー細胞が補充されていてよい、または必要に応じて、フィーダーフリー環境であってよい。いくつかの実施形態では、選別された、多能性のマーカーを発現している細胞を、フィーダー細胞が補充された培養系に置き、次いで、フィーダーフリー環境に移す。細胞培養系は、表１に示されている特定の経路修飾因子および添加物のうちの１つまたは複数が補充されていてよい。一実施形態では、細胞培養培地は、フィーダーフリー環境であり、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤のうちの少なくとも１つを含み、特定の実施形態では、細胞培養培地は、ＴＦＧβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含み、ある実施形態では、ＴＦＧβ阻害剤はＳＢ４３１５４２であり、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、Ｒｏｃｋ阻害剤はチアゾビビンである。本発明の他の特定の実施形態では、細胞培養系は、表１に示されているＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングした組織プレート、従来のｈＥＳＣ培地、および特定の経路修飾因子を含むフィーダーフリー環境である。一実施形態では、細胞培養系は、表１に記載のＳＭＣ４培地を、必要に応じて、表２に示されている代替培地および経路修飾因子のいずれかと組み合わせて含む。
富化細胞集団を、本明細書に記載の細胞培養物系において培養して、一般には、選別の約３～約２５日後；選別の約５～９日後、または選別の約５～７日後に現れるｉＰＳＣコロニーを得ることができる。ｉＰＳＣコロニーを、クローンを拡大するために選び取ることまたは選別することができる。本発明の富化戦略を使用して、細胞集団を多能性細胞について３倍に富化する。
本発明は、細胞集団から望ましくない細胞を枯渇させる方法も提供する。いくつかの実施形態では、細胞集団、例えば、再プログラミングを受けている細胞集団または多能性細胞の集団から分化細胞を枯渇させる。本発明の方法では、多能性細胞の集団または再プログラミングされるように誘導された細胞から、分化細胞の細胞表面マーカーを有する細胞を枯渇させることができる。細胞集団を、分化している細胞の表面マーカー、例えば、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７に基づいて選別することができ、分化している細胞のマーカーを発現している細胞を、細胞集団から除去して、多能性細胞が富化された細胞集団を得ることができる。本発明の特定の実施形態では、分化している細胞の表面マーカーとしてＣＤ１３を使用する。
他の実施形態では、分化するように誘導された細胞集団、例えば、所望の系統に分化するように誘導された細胞集団から多能性細胞を枯渇させて、分化している細胞または分化した細胞の集団を得る。いくつかの実施形態では、分化細胞の集団は、特定の系統に分化するように誘導されたＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの細胞集団を含む。上記の選別技法、例えば、集団内の細胞を磁気ビーズまたはＦＡＣｓによって、多能性のマーカーに基づいて選別することを用いて、細胞集団から多能性細胞を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、分化細胞を含む細胞集団を、ＦＡＣｓによって、多能性マーカーを使用して選別し、多能性マーカーを発現している細胞が枯渇した画分を得る。他の実施形態では、細胞集団を、ＦＡＣｓによって、分化のマーカー、例えば、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６、またはＣＤ７のような系統特異的なマーカーに基づいて選別して、多能性のマーカーが枯渇した画分を得る。本発明の特定の実施形態では、分化している細胞の表面マーカーとしてＣＤ１３を使用する。
本発明の実施では、特に反する指示がなければ、当技術分野の技術の範囲内にある化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞プロトコール、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の方法を用い、その多くは例証するために下に記載されている。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月更新）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ． Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびＩＩ巻（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８５年）；Ａｎａｎｄ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ． Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ． ＨａｍｅｓおよびＳ． Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；Ｆｉｒｅら、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｏ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２００５年）；Ｓｃｈｅｐｅｒｓ、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、２００５年）；Ｅｎｇｅｌｋｅ、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）：Ｔｈｅ Ｎｕｔｓ ＆ Ｂｏｌｔｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ、２００３年）；Ｇｏｔｔ、ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、Ｅｄｉｔｉｎｇ， ａｎｄ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００４年）；Ｓｏｈａｉｌ、Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（ＣＲＣ、２００４年）；ＣｌａｒｋｅおよびＳａｎｓｅａｕ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ：Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ＆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｎｕｔｓ ＆ Ｂｏｌｔｓ ｓｅｒｉｅｓ；ＤＮＡ Ｐｒｅｓｓ、２００６年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ
Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ． Ｈ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９９８年）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ～ＩＶ巻（Ｄ． Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣＣ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００２年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｉ巻：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００６年）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＩＩ巻：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓｔａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００６年）；Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｕｒｓａｄ Ｔｕｒｋｓｅｎ編、２００６年）；Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｄａｒｗｉｎ Ｊ． Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｄｏｎａｌｄ Ｇ． Ｐｈｉｎｎｅｙ、およびＢｒｕｃｅ Ａ． Ｂｕｎｎｅｌｌ編、２００８年）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ａ． Ｋｌｕｇ、およびＣｒａｉｇ Ｔ． Ｊｏｒｄａｎ編、２００１年）；Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ
Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｋｅｖｉｎ Ｄ． Ｂｕｎｔｉｎｇ編、２００８年）Ｎｅｕｒａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ｌｅｓｌｉｅ Ｐ． Ｗｅｉｎｅｒ編、２００８年）；Ｈｏｇａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ
ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｙｒｏ（第２版、１９９４年）；Ｎａｇｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（第３版、２００２年）、およびＴｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ． Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、第４版、（Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、２０００年）を参照されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」は、その内容からそうでないことが明らかでない限り、複数の参照対象を含む。
本明細書全体を通して、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、規定されたステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を包含するが、任意の他のステップまたは要素またはステップもしくは要素の群を排除しないことを意味すると理解される。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句に続くいかなるものも包含し、それに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であること、および他の要素は存在し得ないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とは、この句の後に列挙されているいかなる要素も包含し、列挙されている要素についての本開示に明記されている活性または作用に干渉または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という句は、列挙されている要素が必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、また、それらは、列挙されている要素の活性または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在してもしなくてもよいことを示す。
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態をもたらすことができる。本明細書において参照され、かつ／または本出願のデータシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要であれば、なおさらなる実施形態をもたらすために、種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるように改変することができる。
上記の詳細な記載に照らして、これらおよび他の変化を実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、全ての可能性のある実施形態を、そのような特許請求の範囲に権利が与えられる等価物全範囲と共に包含するものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
（実施例１）
実験的方法
Ａ．多能性幹細胞の細胞培養
フィーダーフリーに適合させる前に、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を、フィーダー細胞（マイトマイシンＣで処理したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））上で維持し、従来の培地で培養した。本出願において使用される場合、「従来の培地」とは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％ｖ／ｖのノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）および１００μＭのβ－メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する基本ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培地を指す。従来の培地は、表１の最初の項にも記載されている。ｈｉＰＳＣを５～７日ごとに、先の細いガラスピペットを使用してコロニーを小さな片に機械的に切り、こすり取ることによって継代し（凝集塊継代）、採取し、新しく播種した、マイトマイシンＣ処理したＭＥＦ細胞上に１：３～１：６に希釈継代し、ｈＥＳＣ培地を毎日添加した。細胞培養物を、加湿インキュベーターセットにおいて３７℃、５％ＣＯ２で維持した。フィーダー細胞を伴う従来の培地中で、凝集塊継代を用いて細胞を培養するステップは、本明細書では、「従来の培養」と称される。
単細胞に解離させるために、ｈｉＰＳＣをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）で１回洗浄し、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）またはＴｒｙｐＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で３～５分処理し、その後ピペッティングして単細胞へと破壊した。次いで、上記の通り単細胞懸濁物を従来の培地と等体積で混合し、３００ｇで５分間遠心沈澱させ、ＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に再懸濁させた。ほとんどの場合、単細胞に解離させた細胞を、０．４μＭのＰＤ０３２５９０１、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１、５μＭのチアゾビビンおよび２μＭのＳＢ４３１５４２（全てＢｉｏｖｉｓｉｏｎ）を含めた種々の低分子および添加物を補充した従来のｈＥＳＣ培地で構成されるＳＭＣ４培地中で維持した。低分子は、ＤＭＳＯ中５～２５μＭのストック濃度で、－２０℃で維持してから培地に添加した。全ての作業培地を４℃で最大４週間維持した。Ｒｏｃｋ阻害剤に関して、細胞を未分化の状態で維持するためには、Ｙ２７６３２と比較して、チアゾビビンと一緒に培養することが好ましかった。
適切な培地中に再懸濁させた後、細胞を、予めＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（１：２５希釈；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたフィーダーフリー組織培養プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に移して３７℃で１～２時間置いた。この様式では、細胞は常套的に新鮮な培地を１日おきに受け、集密度が６６～７５％に到達したら継代した。上記６６～７５％の集密度は通常、継代してから４～５日後に起こった。各継代細胞を単細胞に再解離させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした新しい組織培養プレートに１：５～１：１０の希釈継代で移した。定義済みの、成長因子を含まない培養のために、細胞懸濁物を予め１％ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）でコーティングした組織培養プレートに加えた。ＳＭＣ４培地がｂＦＧＦを含めた全てのサイトカインおよび成長因子を実質的に含まないこと以外は上記の通りに細胞を維持し、継代した。
凍結させるために、細胞を単細胞に解離させ、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充したＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に再懸濁させ、クライオバイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）に入れた。蓋をしたら、クライオバイアルをＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙ（Ｎａｌｇｅｎｅ）の中に入れ、－８０℃で一晩保持した。次の日に、クライオバイアルを長期間保管するために液体窒素に移した。解凍するために、凍結したクライオバイアルを３７℃のウォーターバスに、氷の大部分が融解するまでおよそ１～２分入れた。次いで、解凍した細胞溶液を新鮮な従来のｈＥＳＣ培地と穏やかに混合し、３００ｇで５分間遠心沈澱させた。細胞溶液をＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に再懸濁させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした組織培養プレートに移した。他の細胞培養インキュベーションの全てと同様に、細胞を加湿インキュベーターセット中、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
Ｂ．再プログラミングの誘導
再プログラミングプロセスを開始するために、再プログラミング因子の異所性発現（ヒトＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、およびＮａｎｏｇの多様な組合せで）をレンチウイルスの形質導入または他の方法、例えば、タンパク質のみの処理を用いて実現した。ほとんどの場合、出発細胞は、１０％集密度（すなわち、６ウェルプレートのウェル当たり細胞１×１０５個）で、ゼラチン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）でコーティングした表面上にプレーティングした。ウイルス感染の方法については、新しく採取したレンチウイルスを出発細胞に１：２希釈で加え、４μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充し、３２℃、６５０ｇで１．５時間スピン感染させた。培養物を３７℃、５％ＣＯ２に移してさらに７時間置いた。インキュベーションが達成されたら、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、新鮮な培地を供給した。細胞、例えば、ＩＭＲ９０線維芽細胞をフィーダーフリー培養系において感染させることは難しく、このプロセスを、最初の感染の４８時間後にもう１回繰り返した。再プログラミングの誘導の非遺伝学的方法、例えば、細胞に直接タンパク質を適用することの使用について、８μｇ／ｍＬの再プログラミング因子からなるタンパク質混合物、またはカクテルを細胞溶液に添加し、２４時間維持してから培地を換えた。このステップをさらに２～４回繰り返した。出発細胞は全て、それら自体のそれぞれの体細胞用培地で、最初にタンパク質を添加した後４日目まで培養し、その時点で培地を、一部は体細胞用培地に、そして一部は従来のｈＥＳＣ培地に切り換えた。集密になったら（通常４～６日）、細胞をトリプシン処理し、等量の培地と混合し、３００ｇで５分間遠心沈澱させ、１：１の体細胞／従来のｈＥＳＣ培地に再懸濁させ、より大きな培養プレートへと１：４～１：６で拡大した。例えば、６ウェルプレートの２つのウェル中の細胞を通常１０ｃｍディッシュ上に拡大する。拡大した次の日に、培地を従来のｈＥＳＣ培地に完全に切り換える。拡大した細胞が集密に達したら（通常８～１２日）、細胞を、富化（独特の集団富化を参照されたい）するために処理する。全ての場合において、培地を常套的に１日おきに交換した。
Ｃ．独特の集団富化
出発細胞を、Ｏｃｔ４および／またはＫｌｆ４および／またはＳｏｘ２および／またはＭｙｃを含有する個々のレンチウイルス構築物またはポリシストロニックベクターを含めた種々の戦略を用いて再プログラミングされるように誘導し、およそ８～１２日間（上記を参照されたい）培養した後、細胞を単細胞に解離させ（多能性幹細胞の細胞培養を参照されたい）、種々の多能性の表面マーカー、体細胞のマーカーおよび／または不完全な再プログラミングのマーカーで染色した。簡単に述べると、解離細胞を、ハンクス平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する染色溶液に再懸濁させ、氷上で保持した。製造者推奨の希釈に従って、結合体化させた一次抗体を細胞溶液に添加し、溶液を氷上で１５分間インキュベートした。細胞溶液を洗浄し、染色緩衝液に再懸濁させ、氷上で維持した。この時点で、蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、以下を参照されたい）および磁気細胞選別（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、以下を参照されたい）を含めた種々の富化／枯渇戦略をとった。
フローサイトメトリー選別をＦＡＣＳ Ａｒｉａ（ＢＤ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。使用した一次抗体は、明記されている通りＳＳＥＡ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｒａ－１８１（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｒａ－１６１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＣＤ５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含んだ。次いで、選別された細胞を遠心沈澱させ、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に再懸濁させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）でコーティングした組織培養プレートに移した。マイクロウェル、すなわち、９６ウェルプレートに選別して入れた場合、プレートを３００ｇで２分間遠心沈澱した。ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地を３～４日間、１日おきに交換した。３～４日後、一般には、培養の残りの時間はＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地をＳＭＣ４培地と交換した。コロニー形成は、一般には、選別の７～９日後に認められた。フローサイトメトリー分析をＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で実施した。
ＭＡＣＳミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）分離をプロトコールに従って実施した。簡単に述べると、細胞を単細胞へと解離させ（多能性幹細胞の細胞培養を参照されたい）、明記されている通りＳＳＥＡ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｒａ－１－８１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｒａ－１６０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＣＤ５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含めた、適切なＦＩＴＣと結合体化した一次抗体を用いて染色した。次いで、細胞を抗－ＦＩＴＣミクロビーズ（Ａｎｔｉ－ＦＩＴＣ Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で磁気的に標識した。次いで、標識した細胞懸濁物をＬＳ ＭＡＣＳ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）にローディングした。陽性選択された画分または陰性選択された画分のいずれかから採取した細胞を、３００ｇで５分間遠心沈澱し、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地に再懸濁させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした組織培養プレートに移した。翌日、新鮮な培地を培養物に加え、その後、１日おきに交換した。３～４日後、一般には、培養の残りの時間はＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地をＳＭＣ４培地と交換した。一般には選別の５～７日後にコロニーが現れた。
Ｄ．アルカリホスファターゼ染色
細胞を４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）中に３０秒間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、アルカリホスファターゼ染色キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。簡単に述べると、亜硝酸ナトリウム溶液（Ｓｏｄｉｕｍ Ｎｉｔｒｉｔｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１ｍＬをＦＲＶ－アルカリ性溶液（ＦＲＶ－Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１ｍＬに加え、混合し、２５℃で２分間インキュベートした。次いで、この溶液を４５ｍＬのＨ２Ｏと混合し、その後、ナフトールＡＳ－ＢＩアルカリ性溶液（Ｎａｐｈｔｈｏｌ ＡＳ－ＢＩ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１ｍＬを加えた。アルカリ性色素混合物を固定した細胞に加え、２５℃で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳ洗浄した。次いで、細胞をアルカリホスファターゼの存在についてスコア化した。
Ｅ．免疫蛍光検査による染色
細胞を、４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を使用して１５分間固定し、０．２％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中０．１５％ｖ／ｖのトリトンＸ－１００（ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて２５℃で１時間透過性を上げた。透過性を上げた後、細胞を、ＰＢＳＴ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１％ｖ／ｖのＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＰＢＳＴＢ）を用いて２５℃で３０分間ブロッキングした。ＰＢＳＴＢを穏やかに除去した後、細胞を、ＰＢＳＴＢ中の一次抗体と一緒に４℃で一晩インキュベートした。この試験において使用した一次抗体は、Ｎａｎｏｇ（Ａｂｃａｍ）、Ｔｒａ－１－６０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｔｒａ－１８１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＳＳＥＡ４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、β－ＩＩＩ チューブリン（β－ＩＩＩ Ｔｕｂｕｌｉｎ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、α－平滑筋アクチン（α－Ｓｍｏｏｔｈ Ｍｕｓｃｌｅ Ａｃｔｉｎ）（Ｓｉｇｍａ）およびＳｏｘ１７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含んだ。一晩インキュベートした後、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄し、ＰＢＳＴＢ中に１：２００希釈した二次抗体（Ａｌｅｘａ ４８８または５５５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２５℃で１時間染色した。細胞をＰＢＳＴ中で３回洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。染色された細胞の画像を蛍光顕微鏡検査およびＣＣＤカメラを使用して捕捉した。
Ｆ．分化の誘導および奇形腫の形成
フィーダーフリーｉＰＳＣを、単層として、および胚様体としての両方で分化させた。単層分化については、細胞は通常、分化の際にそれらの増殖を減少させるので、ｉＰＳＣを集密近くまで到達させた後に分化培地に切り換えた。簡単に述べると、集密になったら、ＳＭＣ４培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２０％ ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ 非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）および１００μＭのβ－メルカプトエタノールを含有する分化培地に切り換えた。培地を切り換えたら、ｉＰＳＣを１４日間分化させた。培地を２～３日ごとに替えた。胚葉体（「ＥＢ」）の形成および分化については、ｈｉＰＳＣを、アキュターゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて単細胞に解離し、分化培地に再懸濁させて、最終濃度を１ｍＬ当たり細胞７５，０００個にし、５ｕＭのチアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖａｎ）を加えた。細胞を、Ｖ底９６ウェルの非組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）にウェル当たり１００μＬで播種し、９５０ｇで５分間遠心分離した。翌日、密集した「球様凝集塊」を超低結合６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にＰ１０００を用いておよそウェル当たりＥＢ３０～４０個で移した。７日後に、移したＥＢをＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングした６ウェルプレートに１：１で移した。３週間培養した後、細胞を固定し、染色した。
奇形腫移植および分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって行った。簡単に述べると、単細胞に解離させた１００～２００万個のｈｉＰＳＣを、ＳＭＣ４培地１００μＬ（ｕＬ）を補充した培地およびＭａｔｒｉｇｅｌ１００ｕＬ中に混合し、Ｂｅｉｇｅ ＳＣＩＤマウスの腎被膜および睾丸に導入した。発生した奇形腫を回収し、切片作製し、種々の分化細胞型および構造について分析した。
Ｇ．ＲＴ－ｑＰＣＲおよびｑＰＣＲ分析
ＲＮＡを、ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（ＭＤＳ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離し、０．５μｇのＲＮＡを用いて、ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを生成した。相対的な遺伝子発現レベルを、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および下で表３に列挙されているＦＡＭで標識したＴａｑＭａｎプローブを使用して決定した。
表３：ＡＢＩプライマーおよびプローブ
Figure 0007350127000005
Figure 0007350127000006
 Ｈ．遺伝子発現解析
全ＲＮＡを、Ｐｉｃｏ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して細胞から単離した。簡単に述べると、ビオチン化したａＲＮＡを、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ＩＩ ａＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）用の標準のプロトコールを使用して、任意選択のＳｅｃｏｎｄ Ｒｏｕｎｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎを利用して調製し、次いで、ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ ＩＩ Ｂｉｏｔｉｎ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用し、標準のプロトコールを用いてビオチン標識したａＲＮＡへと転写した。ビオチン標識したａＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの推奨に従って精製し、断片化した。２０μｇの断片化したａＲＮＡを使用して、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ２．０チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ． Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）と、４５℃で１６時間にわたってハイブリダイズさせた。アレイを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ ４５０で染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００ ７Ｇを使用してスキャンした。画像データを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｏｌｅソフトウェアを使用し、初期状態の解析設定を用いて解析した。アレイを、対数尺度ロバストマルチアレイ解析（ｌｏｇ ｓｃａｌｅ ｒｏｂｕｓｔ ｍｕｌｔｉ－ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＭＡ）によって正規化し、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３．１（Ｔｉｂｃｏ Ｓｐｏｔｆｉｒｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）で可視化した。
Ｉ．核型分析およびコピー数変動分析
２０のＧ－バンド染色した中期細胞に対する細胞遺伝学的分析を、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩに所在するＣｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓが実施した。
高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ１２ｘ１３５ｋ）およびその後のコピー数変動分析をＷｉＣｅｌｌ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって行った。
（実施例２）
フィーダーフリー培養環境および酵素による単細胞への解離および多能性幹細胞の継代を可能にするための細胞培養条件および方法
本実施例は、多能性細胞集団の培養および解離に関する。そのような細胞集団としては、これらに限定されないが、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および人工多能性細胞、例えば、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）によって、または多能性因子を導入することによって生成されるもの－人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる。多能性幹細胞の培養条件には、伝統的に、放射線照射またはマイトマイシンＣ処理によって有糸分裂が不活性にされているが、幹細胞の培養を支持するために必要な成長因子および栄養分を提供するフィーダー細胞の使用が含まれていた。フィーダー細胞を使用せずに幹細胞集団を培養するステップは、幹細胞の均一な集団が必要である研究および工業的な適用にとって、または拡大した工業的活動が幹細胞生成物のための異種を含まない定義済みの培養条件を必要とする、研究および工業的な適用にとって有利になる。本実施例では、特定の細胞シグナル伝達経路のいくつかの低分子修飾因子を試験して、個々の低分子または低分子の組合せ（「カクテル」）をフィーダーフリー系における多能性細胞の培養を増強するために使用することができるかどうかを確立した。
多能性細胞集団を、フィーダーは使用しないが、その代わりに、より明確な細胞外マトリックス、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を従来のｈＥＳＣ細胞培養培地（例えば、表１の最初の項に記載の従来の／基本培地処方物）において使用して培養したところ、細胞の生存能力および多能性は支持されなかった（図１）。しかし、Ｒｏｃｋキナーゼの低分子阻害剤を使用することにより、これらの条件下で細胞の生存能力が改善された。さらに、ＭＡＰキナーゼ、ＴＧＦβおよびＷｎｔ／β－カテニン経路の低分子阻害剤を使用することにより、フィーダーの不在下で細胞の多能性が維持されたが、細胞の生存能力の変化を認めることができた。Ｒｏｃｋキナーゼ阻害剤と、ＭＥＫ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤およびＧＳＫ３阻害剤の組合せにより、フィーダーフリー環境において培養したときに多能性幹細胞の生存能力と多能性の両方が維持された。
多能性細胞、例えば、ＥＳＣまたはｉＰＳＣは、一般には、凝集塊として成長する。伝統的に、これらの細胞は、当技術分野の研究者によって認識される形態を有するコロニーを手動で選び取ることによって拡大し、継代されてきた。そのような手順は、本文書の実施例１に記載されている（凝集塊継代として記載されている）。次いで、選び取ったコロニーを機械的に壊し、解離細胞を再プレーティングする。多能性細胞集団の急速な拡大には、酵素による単細胞の継代の使用が有効となる。トリプシンおよびアキュターゼなどの酵素が、継代の間に細胞を単細胞に解離させるために一般に使用される。
特定の実証では、ｉＰＳＣ細胞は、フィーダーフリー環境において単細胞として酵素により継代し、播種したときに、図３Ｂにおける７ＡＡＤの組込みにより認めることができるように、生存能力の有意な降下を示した。表１に列挙されているものなどの培地組成物を含む本発明の培養プラットフォームを使用することによって多能性細胞集団をフィーダーフリー培養で培養し、単細胞継代のために酵素により解離させ、細胞の生存能力および多能性の維持がはるかに改善された。より詳細には、従来の／基本ｈＥＳＣ培地処方物とＭＡＰキナーゼ経路、ＴＧＦβ経路、Ｗｎｔ／β－カテニン経路およびＲｈｏ／Ｒｏｃｋ経路などの細胞シグナル伝達経路の修飾因子の組合せを使用することによって、単細胞への解離およびフィーダーフリー培養を必要とする適用の間、多能性幹細胞の生存能力および多能性が維持された。
図２に示されている通り、フィーダー細胞培養において、凝集塊継代を用いて生成したｉＰＳＣを、アキュターゼなどの酵素を用いて単細胞に解離し、フィーダーフリー系において、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上に、表１に記載のＳＭＣ４培地組成物またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地組成物を使用して単細胞としてプレーティングした。細胞の生存能力は、解離細胞を、これらの培地に記載の低分子の組合せを含有する培地に置いた場合にのみ維持された。従来の培地を使用することにより、多能性細胞を酵素により単細胞に解離し、フィーダーフリー環境にプレーティングしたときに大量の細胞が損失した。細胞をフィーダーフリー培養および単細胞継代に適合させたら、それらを、ＳＭＣ４培地を用いてこのように連続的に維持した。フィーダーフリーの、単細胞継代条件に適合させたｈｉＰＳＣ細胞の完全な特徴付けが図３に示されている。これらの細胞の多能性状態は、複数回の継代の後に維持された：多能性マーカーを、免疫蛍光検査および遺伝子発現によって同定した。さらに、細胞の約９９．８％がフローサイトメトリーによって測定されるＳＳＥＡ４およびＴｒａ１－８１陽性染色を維持した。これらの細胞の遺伝子発現プロファイルは、フィーダー上で培養したヒトＥＳＣと同様であった。ｈｉＰＳＣの導入遺伝子サイレンシングが維持され、核型は通常であり、かつフィーダー細胞培養で成長させた同じクローンと同一であった。さらに、このように継代し維持したｈｉＰＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化と奇形腫の形成の両方によって実証された通り、３種の胚葉に分化した（図３Ｉおよび３Ｊ）。
（実施例３）
多能性および細胞の生存能力を維持しながら多能性細胞からの単細胞選別を可能にするための方法および培養条件
実施例２に記載の通り、ＥＳＣまたはｉＰＳＣの幹細胞培養物は、常套的にフィーダー細胞上で培養し、細胞コロニーを手動で選択することによって継代し、その後それを機械的に解離させた後に再プレーティングする。熟練した研究者は、多能性、非分化特性を有する幹細胞コロニーを、コロニー形態に基づいて認識し、これを、多能性細胞を選択する方法として用いることができる。したがって、多能性集団または所望の特性を有する集団を、一部の細胞があまり望ましくない特性を有する、例えば、培養物または死細胞の凝集塊中の分化の徴候を示す細胞の細胞集団から選び取り、手動で富化することができる。このプロセスは、労力を要し、所望の細胞集団を選び取ることは熟練した研究者に依存する。したがって、細胞を所望の特性に基づいて個別に選択する場合に細胞富化または選別技術を用いることは、この分野に大きな利益を与えることになる。現在利用可能な技法、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いたそのような富化ステップには、多能性細胞集団を単細胞様式へと酵素により継代した後に、富化し、また培養物に播種することが必要になる。さらに、フィーダーにより支持した培養物を使用することは、これらの技法にはあまり望ましくないことになり、フィーダーフリー培養系を用いることが必要である。
特定の実施形態では、表１に記載の本発明の培地組成物ならびに実施例１および２に記載の方法を用いて、多能性または細胞の生存能力を喪失することなく、多能性細胞集団を単細胞に解離させ、磁気活性化細胞選別（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて富化し、フィーダーフリー培養物上に播種した。
特定の例では、図４に示されている通り、ＳＭＣ４培地（表１）で維持した、単細胞に解離させた多能性細胞の集団を選択し、ＦＡＣＳにより、細胞表面マーカーに対して陽性の細胞ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋に基づいて選別した。これらの表面抗原は、多能性に対するマーカーとして一般に使用されている。次いで、選別された二重の陽性集団をフィーダーフリー培養（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）ＥＣＭコーティング）に移し、ＳＭＣ４培地（表１）またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地のいずれかで２～４日間成長させた後、ＳＭＣ４培地（表１）に再度切り換えた。選別してから２４時間以内に細胞分裂が認められ、細胞は選別の５日後までにほぼ集密になった。選別された細胞を、さらに５回の継代にわたって単細胞培養し、ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋細胞についての二重染色フローサイトメトリーによって判断したところ、未分化状態のマーカーを発現するだけでなく、実質的に純粋な多能性細胞の集団も示したことが示された（図４Ｂおよび４Ｃ）。
培養している間に多能性幹細胞を富化し、選別する例では、多能性細胞と分化細胞の両方を含有する培養物を、Ｔｒａ１８１に対して陽性の細胞について富化し、次いで、Ｔｒａ１８１＋細胞の継代を継続して、純粋な多能性幹細胞の集団を維持した（図１７Ｃ）。
多能性細胞の単細胞選別の効率を調査した。図４ＤおよびＥにおいて認めることができるように、ＦＡＣＳ機器によって測定された種々の数の選別後事象を、ＳＭＣ４培地またはＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地のいずれかを用いてフィーダーフリー培養系にプレーティングし、アルカリホスファターゼ陽性細胞の数をスコア化した。アルカリホスファターゼは、多能性のコロニー形成の初期の指標である。播種した細胞の数当たりのアルカリ陽性コロニーの数によって示される、定量化した選別後播種効率はこの系ではおよそ８～１０％であることが分かった（図４Ｅ）。多能性細胞集団の維持における単細胞選別の潜在性のさらなる実証では、ｉＰＳＣ培養物を単細胞に解離させ、蛍光を結合体化した、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１に特異的な抗体で標識し、ＦＡＣＳに適用し、これらのマーカーに基づいて選択した。選択されたＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋細胞を、ＦＡＣＳ機器から直接９６ウェルプレートに、ウェル当たり１～９事象でプレーティングした。ウェル当たりわずか１事象により、クローンアルカリホスファターゼ陽性コロニーが生じた（図４Ｆおよび４Ｇ）。したがって、そのような単細胞選別系を、特定の細胞表面マーカーに関連する好ましい特性に基づいて多能性細胞のクローン選択を行うために用いた。
（実施例４）
フィーダーフリー培養系において細胞を多能性の状態に効率的に再プログラミングさせる方法および条件
工業的適用および／または臨床的適用のためのｉＰＳＣの使用には、完全に定義済みの培養条件、詳細には、異種を含まない条件において細胞を生成し、選択し、維持することが必要である。したがって、フィーダーフリー培養条件において細胞を再プログラミングさせることが非常に望ましい。しかし、線維芽細胞およびケラチノサイトは皮膚生検材料または毛包を介して入手するので、これらが再プログラミングに最も一般的に使用される細胞型であるが、これらの細胞型の再プログラミングの効率は非常に低く、これらの細胞をフィーダーフリー培養において再プログラミングさせるための効率的な方法はまだ実証されていない。
実施例２に記載の通り、細胞シグナル伝達経路－詳細には、ＭＡＰキナーゼ経路、ＴＧＦβ経路、Ｗｎｔ／β－カテニン経路およびＲｈｏ／Ｒｏｃｋ経路の阻害剤が存在する従来のｈＥＳＣ幹細胞用培地を使用することにより、フィーダー細胞の不在下で多能性培養物を成長させ、維持すること、およびこれらの培養物を、酵素による単細胞継代を用いて拡大することが可能になった。本実施例では、フィーダー細胞を欠く培養系においてｉＰＳＣ細胞を生成した。詳細には、ヒト線維芽細胞を、多能性因子であるＯｃｔ４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２およびＣ－ｍｙｃを発現しているウイルスに感染させた。再プログラミングプロトコールを、フィーダー細胞ではなくＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）にプレーティングした細胞を用いて実施例１に記載の通り行った。
従来のｈＥＳＣ幹細胞用培地またはＳＭＣ４培地（表１）に列挙されている特定の経路修飾因子を補充した従来のｈＥＳＣ培地のいずれかを用いて、フィーダーフリー細胞の再プログラミングの比較を行った。図５に認めることができるように、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＭｙｃを発現している個々のレンチウイルスを用いて再プログラミングを誘導した２０日後に、ＳＭＣ４培地を補充したフィーダーフリー培養物では多くのｉＰＳＣ様コロニーが認められたが、従来のｈＥＳＣ培地単独で維持した培養物に認められたコロニーはわずかであった、または全く認められなかった。ＳＭＣ４培地中で生成したコロニーのその後の特徴付けにより、それらの多くが真のｉＰＳＣコロニーであることが示された。これらの細胞は、免疫蛍光検査、フローサイトメトリーおよび遺伝子発現プロファイリングを用いた、多能性マーカーであるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ １－８１の発現により、多能性であることが決定された（図１３Ｃ～Ｅ）。さらに、細胞は、分化培地で培養したときに、３種の胚葉全てに有効に分化することが示された。したがって、フィーダーフリー培養系におけるｉＰＳＣの効率的な生成が本発明によって実証された。他の再プログラミングの方法と比較したこの手法の効率は、実施例８および表４に記載されている。
（実施例５）
ナイーブな状態の多能性細胞の生成および維持において使用する細胞培養組成物
最近の研究により、後成的な再プログラミングを通じて、最終分化細胞は、前駆体様の状態（Ｘｉｅ， Ｈ．、Ｙｅ， Ｍ．、Ｆｅｎｇ， Ｒ．、およびＧｒａｆ， Ｔ． ２００４年）、異なる分化した細胞の状態（Ｓｚａｂｏ、Ｂｈａｔｉａ ２０１０年）または、元の胚様の状態（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６年）例えば、ｉＰＳＣにまで戻って再度コース設定する（ｒｅｃｏｕｒｓｅ）能力を有することが実証された。ｉＰＳＣの生成はより常套的になってきたが、所与の実験において、非常に低い百分率の体細胞のみがｉＰＳＣに再プログラミングされる。この低効率には、体細胞の増殖性の状態、遺伝子の活性化または抑制を導くさらなる変異誘発、遺伝子送達の様式および環境要因を含めたいくつかのパラメータが起因する。ｉＰＳＣとして同定された全ての細胞がＥＳＣに類似した挙動をするとは限らないことも報告されている。例えば、遺伝子発現プロファイリングにより、多くのｉＰＳＣが、それらのＥＳＣ対応物に対して発現プロファイルの有意差を示すことが実証された。さらに、Ｘｉｓｔ活性の試験およびＸ染色体の再活性化の分析により、一部のＥＳＣはナイーブな状態（すなわち、多能性の基底状態）にあるが、得られたｉＰＳＣの全てではないが大部分はプライムされた状態（すなわち、分化するようにプライムされた）にあることが示されている。まとめると、これらの差異が、多能性の低下およびｉＰＳＣの特定の細胞型への分化の効率が低いことの一因である可能性があり、これにより再生医療におけるｉＰＳＣの価値が下がっている。
ナイーブな状態およびプライムされた状態の背後にある機構に関与する重要な細胞経路を標的にすることにより、本発明者らは、従来のｉＰＳＣを含めたプライムされた状態で存在する多能性幹細胞を、ナイーブな状態に形質転換する能力を実証した。表１に列挙されている培地組成物を使用して、そのようなプライムされた多能性細胞および従来のｉＰＳＣをナイーブな状態にさらに再プログラミングさせることが可能であった。より詳細には、体細胞を再プログラミングさせることまたは細胞シグナル伝達経路、例えば、ＭＡＰキナーゼ経路、ＴＧＦβ経路、および／またはＷｎｔ／β－カテニン経路の修飾因子を含有する培地中でｉＰＳＣを培養することにより、生成または培養したｉＰＳＣの遺伝子発現のサインが従来のｉＰＳＣ（従来の培地中で生成し、かつ／または培養し、細胞シグナル伝達経路の修飾因子と接触させていないｉＰＳＣ）よりもＥＳＣ様になる。階層クラスタリングにおいて実証されている通り、従来の培地で得られたｈｉＰＳＣとＳＭＣ４培地で得られたｈｉＰＳＣは互いに同様であり、どちらもそれらの親系統であるＩＭＲ９０とは異なった（図６Ｂ）。しかし、ＳＭＣ４培地中で培養したｉＰＳＣをフィーダー細胞上に戻してプレーティングしたときに、それらは、従来法で培養したｉＰＳＣよりもマウスＥＳＣによく似ており、このことはナイーブ状態の別の実証であった（図６Ｅ）。さらに、ＳＭＣ４培地中で培養したｉＰＳＣでは、Ｘｉｓｔ活性が有意に低下し、Ｘ染色体の遺伝子の発現が増強された（図６Ｃおよび６Ｄ）。最後に、ＳＭＣ４培地中で培養したｉＰＳＣは、３種の胚葉全てに分化しただけでなく、ナイーブな状態にある細胞のみが保有する能力である、胚体外の細胞に関連する遺伝子を再活性化する能力も実証された（図３Ｈ）。したがって、プライムされた状態で存在するｉＰＳＣを含めた多能性幹細胞をＳＭＣ４培地中で培養することにより、ナイーブ状態が促進され、また、分化の潜在性が増強された。
ＳＭＣ４補充培地および細胞選別プラットフォームを使用して生成したｈｉＰＳＣクローンの多能性の状態を決定するために（図７）、ｈｉＰＳＣを、同じ開始線維芽細胞系ならびにＯｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＭｙｃを発現している３－因子ポリシストロニックベクターから得たが、凝集塊継代およびフィーダー細胞（ＦＴｉ９９）を含めた従来の培養下で維持した。ｈＥＳＣ由来の種々のクローンならびにｍＲＮＡのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ包括的遺伝子発現解析を行った（図７Ｂ）。全ての多能性系が対照線維芽細胞系と異なるプロファイルを有し（ＦＴＣ１、ピアソンスコア０．８８６）互いに基本的に同様の発現プロファイルを有する（ピアソンスコア０．９６９）ことが分かった。ヒートマップサインを作成して、ｈＥＳＣ／ＦＴｉ９９（フィーダー細胞および従来の培地で生成し、維持したｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣ）群とＦＴｉ９１／ＦＴｉ９３（フィーダーフリーおよびＳＭＣ４培地で生成し、維持したｈｉＰＳＣ）群の間で４倍差次的に発現された１，７３９種のプローブを示した（図７Ｃ）。１，７３９種の差次的に発現された転写物内の遺伝子の深さ分析では、興味深い傾向が同定された：ＦＴｉ９１／ＦＴｉ９３群では一般にナイーブな状態に関連するいくつかの多能性遺伝子が上方制御されたが、より有意に、この群内で、プライムな状態に関連する多くの分化遺伝子は抑制された（図７Ｄ）。ＳＭＣ４培地で生成したｈｉＰＳＣに関する本発明者らの包括的分析により、培養条件が、未分化の状態の決定において、出発細胞系または誘導戦略と比較してより影響力の大きい役割を果たすことが示唆されている。データにより、ＳＭＣ４培養条件において得られた、またはそれに適合させたクローンは、好ましい品質、例えば、初期の系統マーカーの発現の低下を伴う高度に未分化の状態を伴うナイーブな特性が実証されることも示唆されている（図７Ｅ）。
（実施例６） 真正なｈｉＰＳＣを同定するための抗体カクテルの同定
多能性幹細胞表面マーカーを調査した。ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１の発現に加えて、ＣＤ３０およびＣＤ５０の発現も同定し、さらなる多能性の表面マーカーを示すとみなした（図１０）。Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２を発現しているポリシストロニックなレンチウイルスを用いて再プログラミングされた細胞は、種々の能力の状態を示し、真の多能性のマーカー、例えば、Ｎａｎｏｇの発現を担持するわずかな細胞を用いて同定される。現在まで、表面マーカーの発現に基づいて真に多能性のｈｉＰＳＣを同定する信頼できる方法は存在していない。例えば、図１１において認められるように、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ１８１およびＣＤ９について陽性と同定された一部のクローン集団は、Ｎａｎｏｇを発現せず、ｈｉＰＳＣであると不正確に同定されたことになる。
本発明は、真に多能性細胞のマーカーであるＮａｎｏｇを発現している細胞の集団を同定する細胞表面マーカーの組合せを提供する。詳細には、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１である表面マーカーに対して陽性の細胞により、Ｎａｎｏｇを発現している細胞が同定される（図１１）。
追加富化の別の例では、再プログラミングを受けている細胞集団を選別して、ＣＤ１３表面マーカーの発現に対して陽性の細胞を同定し、これらのＣＤ１３＋細胞を再プログラミング細胞集団から除去した。ＣＤ１３＋集団は体細胞および再プログラミングされていない細胞と相関し、再プログラミング細胞集団からＣＤ１３＋細胞を枯渇させることにより、ＳＳＥＡ４／Ｔｒａ１８１陽性細胞の富化が増強された（図１２）。図１２において実証されている通り、体細胞を、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２を発現しているポリシストロニックベクターを用いて２１日間再プログラミングさせたとき、多様な表面マーカーの発現パターンを有する種々の細胞集団が生み出され、細胞の少数のサブセットのみがＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１陽性細胞を示した（点線の矢印、図１２）。しかし、同じ集団を、ＣＤ１３発現に基づいて最初に評価したところ（実線の矢印、図１２）、ＣＤ１３に対して陰性の（すなわち、ＣＤ１３細胞が枯渇した）集団サブセットは、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１を発現している細胞について有意に富化された集団を示した（１１．０４％、図１２）。反対に、高レベルのＣＤ１３を発現した細胞のサブセットは、ＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方を発現したわずかな細胞を示した（１．１４％、図１２）。
（実施例７）
分化細胞からの人工多能性幹細胞の生成における単細胞選別の使用
図８Ａにおいて認めることができるように、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｍｙｃを発現している個々のレンチウイルスを用いて誘導した再プログラミングプロセスの初期にある線維芽細胞培養物は、形態学的に異なる細胞のコロニーを含有した。これらの細胞の一部は多能性のマーカーに対して陽性に染色されたが、他はただ単に形質転換された成長が速い細胞であった。再プログラミングプロセスのこの段階では、細胞形態単独では、どの細胞コロニーがｉＰＳＣを形成するようになるかは明らかにならない。成長がより速く、形質転換されたが多能性ではない細胞がすぐに培養物を引き継ぐ。したがって、再プログラミングプロセスの初期にあるｉＰＳＣを選択する富化ステップを有することが有利であることになる。さらに、図８に示されている通り、一部のコロニーは再プログラミングプロセスの間にいくつかの多能性マーカーを発現し、それは、真のｉＰＳＣであったが、一部のコロニーは完全には再プログラミングされておらず、一部の多能性のマーカーのみを発現した。図８Ｂのコロニー１は、ＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方に対して陽性であったが、コロニー４および５は、どちらかのマーカーに対してのみ陽性であった。したがって、コロニー形態によるのではなく、多能性の細胞表面マーカーまたはいくつかのマーカーを同時に用いて多能性細胞を選択することがより効率的であり、技術的な困難が少ないことになる。
本明細書に記載の細胞培養組成物を、同様に本明細書において提供される細胞の富化および／または選別方法体系と組み合わせて用いると、再プログラミングプロセスの間に多能性の表面マーカーを示した個々の細胞を選択することによって、より多数のｉＰＳＣをより短期間で得ることが可能であった。より詳細に、図９ＡおよびＢに概略的に示されている通り、再プログラミングの間に多能性のマーカーに基づいて単細胞を選別し、富化することを用いてｉＰＳＣを生成するための２つの経路を、本発明の方法を用いて実行した。
経路Ａでは、再プログラミングの開始後、種々の能力の状態にある細胞の混成集団を生成した。細胞の混成集団は、分化細胞、部分的に再プログラミングされた細胞、再プログラミングされた細胞、および再プログラミングを受けている細胞を含有した。磁気ビーズ選別またはフローサイトメトリー選別などの方法（方法体系については実施例１を参照されたい）を用いて、細胞集団を多能性マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４を発現した細胞について富化した。富化されたら、細胞をＳＭＣ４培地（表１）、または、特定の実施形態では、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地でおよそ３日間、その後、ＳＭＣ４培地と交換し、およそ６～１０日間の培養期間の後、ｉＰＳＣコロニーを、マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１の生培養物染色に基づいて同定し、クローンを拡大するために選び取ったまたは選別した（図９）。
経路Ｂの概略図（図９）の下で、再プログラミングの開始後早期に、細胞の混成集団を選別して、２種以上の多能性のマーカーについて陽性である希少な細胞集団を得た。そのようなマーカーとしては、これらに限らないが、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１が挙げられる。選択された、多能性マーカーの組合せを発現している細胞を、フィーダー細胞を補充した培養系またはフィーダーフリー培養系、詳細には、表１に記載の細胞培養培地組成物を補充した培養系に移した。このように、上記の方法体系と比較してタイムラインおよび技術的障壁を有意に減少させてｉＰＳＣコロニーを生成した。
この技術の特定の実証では、ＩＭＲ９０線維芽細胞に、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２およびＫｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）を発現しているレンチウイルスを感染させた。数日間フィーダーフリー培養した後、再プログラミング細胞を、それらの体細胞用培地からＳＭＣ４培地（表１）を補充したフィーダーフリー培養に切り換えた。再プログラミングを開始した８日後に、フローサイトメトリー分析により、感染細胞集団が、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４を発現した細胞のそれほど大きくない亜集団を含有することが分かった（図１３Ａ）。実施例１に記載の通り磁気活性化細胞選別を用いて、多能性集団を、ＳＳＥＡ４を発現している細胞について３倍に富化した（図１３Ａ）。細胞を、ＳＳＥＡ４を発現している細胞について富化した後、選別された細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含有し、従来のｈＥＳＣ培地もしくはＳＭＣ４培地、または特定の実施形態では、ＳＭＣ４＋フィブロネクチン培地のいずれかを補充したフィーダーフリー培養に移した。培養物のアルカリホスファターゼ染色により、ＭＥＫ、ＧＳＫ３、ＲｏｃｋキナーゼおよびＴＧＦβの低分子阻害剤を使用することにより、単細胞選別を用いた多能性細胞の富化が支持されたが、従来の基本培地ではそれが支持されなかったことが示されている（図１３Ａ）。
３つの独立した実験を定量化することにより、低分子阻害剤の存在下のみで単細胞選別による多能性細胞の選択が明白に実証された（図１３Ｂ）。このように富化された細胞由来のコロニーを、ＳＭＣ４培地中でさらに培養し、これは真のｉＰＳＣであると特徴付けられた：真のｉＰＳＣは、免疫蛍光検査およびフローサイトメトリーにおいて多能性マーカーであるＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１に対して陽性に染色され（図１３ＣおよびＤ）；ヒトＥＳＣと同様の遺伝子発現プロファイルを示し（図１３Ｅ）；外因性の導入遺伝子の有意なサイレンシングを示し（図１３Ｆ）、３種の胚葉全てに分化することができた（図１３Ｇ）。同じプロトコールを使用したが、従来の培養条件（フィーダー細胞を含有し、ＳＭＣ４を欠く従来の培地からなる）を用いた場合には、多能性細胞コロニーはめったに観察されなかった。したがって、細胞の再プログラミングの間に、単細胞選別を用いて、多能性の細胞表面マーカーに基づいて多能性細胞集団を頑強に富化する能力は、細胞シグナル伝達経路阻害剤および表１に列挙されている添加物の使用に依存した。さらに、培養系において添加物としてフィブロネクチンを３日間使用したところ、選別後播種の改善が観察された。この再プログラミングプロセスは、ヒト脂肪由来の幹細胞を含めた他の出発細胞型に対しても同様に完了した。
当該技術のさらなる例では、多能性の細胞集団を再プログラミングされていない細胞、部分的に再プログラミングされた細胞および完全に再プログラミングされた細胞の混合物から富化するためにＦＡＣＳを使用した。前述の実施例と同様に、ＩＭＲ９０線維芽細胞に、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２およびＫｌｆ４／ｃおよびＭｙｃ（ＯＳＫＭ）を発現しているレンチウイルスを感染させた。線維芽細胞を感染させた数日後、細胞培養物をＳＭＣ４培地でのフィーダーフリー培養に切り換えた。感染細胞集団は、多能性マーカーであるＳＳＥＡ４とＴｒａ１８１の両方に対して陽性であるそれほど大きくない細胞集団を含有した（図１４Ａ）。両方の多能性マーカーに対して陽性である細胞を選択し、両方のマーカーに対して陰性であるか、または一方のマーカーのみに対して陽性である細胞から離して選別した。表１に記載の通りに補充した培地を用いた、いくつかの実施形態ではフィブロネクチンを含有する表１に記載の通りに補充した培地を用いた、その後のフィーダーフリー培養物を比較することにより、両方のマーカーに対して陽性である細胞由来の培養物は、その後に多能性ｉＰＳＣとして特徴付けられたコロニーを形成したが、ＦＡＣＳによって多能性のマーカーに対して陰性であるとゲーティングされた細胞は、アルカリホスファターゼ陽性コロニーを産生しなかったことが示された（図１４Ａ、Ｂ）。より詳細には、基本培地処方物への添加物としてのシグナル伝達分子ＭＥＫ、ＧＳＫ、ＲｏｃｋおよびＴＧＦβの阻害剤により、再プログラミングプロセスの初期にある多能性細胞の選別選択および富化におけるＦＡＣＳの使用が容易になった。さらに、培養系においてフィブロネクチンを添加物として３日間使用したところ、選別後播種の改善が観察された。
次に、ＳＭＣ４培地および培養系の利点を用いて、フィーダーフリーおよびクローニングにより得られるｈｉＰＳＣを生成するためのハイスループットな方法を開発した。スキームは、再プログラミングされるように誘導された細胞をＳＭＣ４培地で処理し、多能性マーカーの組合せによって示される、忠実に再プログラミングされた希少な個々の細胞を選択するように工夫した。さらに、本発明者らは、再プログラミングプロセスとマルチプレックスプラットフォームを組み合わせて、最上位のクローンを二重マーカーフローサイトメトリー、ｑＲＴＰＣＲおよび免疫蛍光検査の選択アッセイに基づいて有効に選択した（図１５）。
最適化されたマルチプレックスプロトコールでは、３－因子（ＯＫＳ）ポリシストロニックウイルスを用いて再プログラミングを開始し、ＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋集団の最初のバルクのＦＡＣＳ選別を感染の２０日後に完了し、その後、３０日目に、９６ウェル－プレートにＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋細胞をＦＡＣＳ再選別して入れた（図１５およびＢ）。この戦略により、複数のクローンを得ることが可能になり、多能性マーカーを発現し、外因性の遺伝子活性の減弱およびＯｃｔ４プロモーターの脱メチル化を示したクローンであるＦＴＣ１クローン１および２が生成された（図１５Ａ～Ｃ）。ＦＴＣ１クローン１および２も、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで３つの体細胞系統に分化することにより、多能性であることが示された（図１５Ｄ、Ｅ）。選択されたクローンを、染色体の完全性についても評価し、それらの親系統および通常の核型からのコピー数の変動が、ＦＦ培養液で２０回連続して単細胞継代した後でさえも最小であり、これは他の再プログラミング戦略に対する顕著な改善であることが実証された（図１７）。
プラットフォームの再現性を決定するために、さらなる線維芽細胞系であるＦＴＣ５およびＦＴＣ７を、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２を発現しているポリシストロニックベクターを用いて再プログラミングされるように誘導し、図１５に記載のハイスループットプラットフォームに適用した。図１８に記載の通り、ＦＴＣ５およびＦＴＣ７線維芽細胞系に由来するコロニーは、それらの未分化の状態を維持し、それらの多能性およびゲノム安定性を保持することが示された。したがって、３種の多能性因子、ＳＭＣ４培地およびマルチプレックス特徴付けプラットフォームを組み合わせることにより、フィーダーフリー再プログラミングのカイネティクスが有意に増強され、その一方で、クローンで得られ、ゲノム的に安定なｈｉＰＳＣをハイスループットな様式で同定し、選択し拡大することが可能になる。
（実施例８）
複数のｉＰＳＣクローンを迅速に生成するための方法および培養組成物
ヒトｉＰＳＣを、多能性遺伝子、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇを異所性発現させることによって生成することは、非効率的かつ技術的に困難なプロセスである。レンチウイルスまたはレトロウイルスによる多能性因子導入遺伝子の宿主細胞のゲノムへの組込みを、フィーダー細胞支持体を含む培養系と組み合わせてもたらす戦略が、ｉＰＳＣを生成するための伝統的に最も効率的な方法であった。ヒトｉＰＳＣを生成するためのウイルスおよびフィーダー細胞方法体系を用いた歴史的研究についての文献レビューにより、０．００１％～０．０１％の効率で感染細胞がｉＰＳ細胞になることが示されており、潜在的な多能性細胞は感染後２１～３０日の期間で認められ、これらは、感染後３０日間～４５日間の間に手動の「凝集塊」継代によって、クローンで得られる（表４）。
多能性遺伝子を導入するための他の方法としては、エピソームベクター系および改変されたタンパク質の形質導入が挙げられる。そのような方法は、ｉＰＳＣ技術の最終の臨床的適用に向かう重要な発展であると考えられる。しかし、これらの方法体系は、ウイルス系を用いた再プログラミングよりもさらに効率が低い。さらに、フィーダー細胞フリー系を従来の幹細胞用培地処方物と組み合わせて使用する場合でも、再プログラミングプロセスの効率は低下する、または一部の条件では不可能であり、これにより工業的および治療的な使用のためのｉＰＳＣの開発が妨げられている。体細胞の再プログラミングは、確率論的なプロセスとして特徴付けられており、大多数の細胞が時間の経過とともに最終的に再プログラミングされる。しかし、単一の再プログラミングにおいて複数のｉＰＳＣクローンを作製するための頑強な、技術的に容易な、効率的な、かつスケーラブルな方法はまだ記載されていない。
本発明は、クローンｉＰＳＣコロニーを、現行の方法よりも比較的短い時間で、かつより低い技術的障壁で得るための細胞培養条件および方法体系を提供する。詳細には、図１３Ｂに認めることができるように、特定のシグナル伝達経路の低分子阻害剤をＳＭＣ４培地において添加物として使用することにより、フィーダーフリー培養の環境において、ＳＭＣ４培地を使用しない場合をはるかに超える効率でｉＰＳＣコロニーを生成することが可能になった。ＭＥＫ、ＧＳＫ、ＲｏｃｋおよびＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害剤を使用して、フィーダーフリー環境における効率的な再プログラミングを可能にした。
図１３および表４から認めることができるように、３つの独立した再プログラミング実験では、再プログラミングプロセスにおいて、フィーダーフリー環境で従来のｈＥＳＣ培地を使用した場合にはコロニーは認められなかった、または１つのコロニーが認められたが、低分子培養添加物（すなわち、ＳＭＣ４培地）により、フィーダーフリー再プログラミング事象が０．０３５％の効率まで増強され、感染の１４～２１日後にコロニーがもたらされ、２８～３５日までにクローンのｉＰＳＣが得られた。したがって、低分子阻害剤を使用することにより、再プログラミングまでの時間、再プログラミングされた細胞のパーセントに関して再プログラミングの効率が上昇した。この手法を用いて生成したコロニーは、免疫蛍光検査および遺伝子発現プロファイリングなどの標準の手順を用いて、多能性であると特徴付けられた。
この技術のさらなる実証では、分化細胞を、個々の多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、およびＭｙｃを発現しているウイルスに感染させ、ＳＭＣ４培地およびフィーダーフリー培養環境（表１）で８～１２日間培養した。この時点で、および、実施例６ならびに図１３および１４に記載の通り、細胞を、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳ単細胞選別を用いて富化して、多能性マーカー、例えば、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１８１についての陽性染色によって定義される、小さな多能性細胞の集団を得た。この手法を用いて、ｉＰＳＣを作製するためのタイムラインを著しく縮小し、再プログラミングされた細胞のパーセントの点で０．２２％の効率が実証され、コロニーは、選別のすぐ後、数日のうちに現れた（１０～１６日）。この再プログラミングの効率により、感染の２１～２８日後までにクローンのｉＰＳＣを得ることが可能になった。
再プログラミングの効率の改善のさらなる実証では、３種（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２）または４種（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、およびｍｙｃ）の多能性因子を同じプロモーターエレメントから発現させるポリシストロニックベクター系を、最適化されたＳＭＣ４培地と、フィーダーフリー培養と、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ１８１を使用した単細胞選別系とを組み合わせて用い、その結果、０．７５６％の再プログラミング効率がもたらされ、コロニーは感染の６～８日後に最初に認められた。この方法は、感染のちょうど４日後にｉＰＳＣコロニーが存在していたほど効率的であった。これらの技法により、ｉＰＳＣを生成する伝統的な方法に対して有意な改善が示される。
表４：種々の戦略における再プログラミングのカイネティクス。
Ｎ．Ｉ．、同定されず；＊ｉＰＳＣ様コロニーの形態学的出現；＊＊播種した細胞当たりのＳＳＥＡ４＋／Ｔｒａ１８１＋の数として算出した；＊＊＊ｉＰＳＣコロニーを拡大し、クローン系として維持するために必要な時間（Ｔｒａ１８１／ＳＳＥＡ４染色に基づく）。灰色の枠は、文献検索からのデータを示す。個々の因子ウイルス；感染は、それぞれが重要な転写因子のうちの１つを発現している個々のウイルスを組み合わせることによって行い、３はＯｃｔ４／Ｋｌｆ４／Ｓｏｘ２の組合せを表し、４はＯｃｔ４／Ｋｌｆ４／Ｓｏｘ２／ｃＭｙｃの組合せを表す。
Figure 0007350127000007
Figure 0007350127000008
 （実施例９）
単細胞選別および富化を用いて多能性細胞集団を分化細胞集団から枯渇させる方法
薬物スクリーニングおよび幹細胞生物学の一部の臨床的適用には、ＥＳＣまたはｉＰＳＣなどの多能性細胞から特定の系統に分化した均一の細胞集団を生成することが必要である。分化細胞集団に多能性細胞が混入することにより、誤ったスクリーニング結果がもたらされる可能性がある、または、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて腫瘍／奇形腫の形成がもたらされる可能性さえある。細胞集団を分化細胞について富化するか、または多能性細胞を細胞集団から枯渇させるかのいずれかの方法は、本明細書の実施例３および６に記載の選別技術を含んでよい。細胞培養培地において低分子添加物を使用することにより、特に、本発明によって提供されるように、単細胞選別プロセスの間に多能性細胞が分化または部分的に分化することが妨げられ、これにより、完全に分化した細胞の集団から多能性細胞を陰性選択することが可能になる。逆に、細胞選別によって分化細胞を細胞集団から陽性選択することは、多能性細胞が多能性の表面マーカーに対して完全に陽性のままである培養条件下ではより有効であり得る。図２０において認めることができるように、完全に分化した線維芽細胞と多能性細胞の混成集団は、表１に記載の培養環境において細胞を前培養した場合には、ＦＡＣＳを用いて有効に分離された。選別手順の間に低分子培養添加物も使用することができ、それにより単細胞懸濁物が安定化される。図２０から、多能性マーカーに対して陰性であるとして選択された細胞は、その後の培養およびアルカリホスファターゼについての染色において完全に多能性細胞を含まないことが確かめられたことが理解され得る。
（実施例１０）
多能性幹細胞のフィーダーフリー培養におけるサイトカインおよび成長因子を含まない培養
実施例２において考察されている通り、従来のヒト多能性培養系は、フィーダー細胞、および、ヒト多能性幹細胞を未分化の状態に維持するための外因性の刺激として機能するｂＦＧＦなどのサイトカインを含む。しかし、フィーダー細胞および組換えサイトカインを産生するためのプロセスは、異種汚染物質の供給源として機能する。さらに、フィーダー細胞から分泌される重要な因子（複数可）およびサイトカインによって刺激される正確な細胞経路はまだ同定されていない。したがって、ヒト多能性幹細胞の従来の培養は、不明確な系を表し、臨床グレードの製造への移行を妨げる可能性がある。
この問題に取り組むために、本発明は、実施例２において考察されているフィーダーフリーおよび単細胞継代系を、ｂＦＧＦおよび他のサイトカインおよび成長因子をＳＭＣ４培地処方物から除去することによってさらに改変したさらなる実施形態を包含する。さらに、本発明の一実施形態では、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は動物由来の細胞外マトリックスを表し、完全には特徴付けられていないので、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）をゼラチンで置き換えた。本発明のこれらの実施形態により、ｉＰＳＣを含めた多能性幹細胞の内因性自己再生および維持を可能にする、完全に定義済みかつサイトカインを含まない培養系が提供された。
図２１Ａおよび２１Ｂにおいて実証されている通り、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、およびＳｏｘ２を含有するポリシストロニックベクター系を用いて生成し、フィーダーフリー環境において維持したｉＰＳＣなどのヒト多能性幹細胞は、さらなるサイトカインまたは成長因子、例えばｂＦＧＦを欠くＳＭＣ４培地を有する、ゼラチンでコーティングした培養表面で容易に単細胞継代された。この完全に定義済みの系において数回の継代後、ｉＰＳＣは、Ｔｒａ１８１およびＳＳＥＡ４の共発現によって実証された通り、それらの多能性の状態を維持した（図２１Ｃ）。さらに、本発明者らは、この完全に定義済みかつサイトカインを含まない系におけるｉＰＳＣの生成を実証した。したがって、一実施形態では、本発明は、ＳＭＣ４培地とゼラチンの組合せを含む、成長因子およびサイトカインが存在しない完全に定義済みの培養系を提供する。
（実施例１１）
多能性幹細胞の生成および維持におけるゲノム安定性
複数の試験により、多能性幹細胞の再プログラミングプロセスおよびその後の培養により、ゲノムの異常の傾向がより高くなり得ることが示唆されている。さらに、フィーダーフリー培養により、核型異常細胞のクローン成長を生じることが示されている。図１７Ａ、１７Ｂおよび１８Ｃにおいて実証されている通り、本発明は、再プログラミングさせてゲノム安定性を有する細胞を得る方法、ならびに再プログラミングされたゲノム安定性を有する細胞を維持する方法を提供する。本発明の方法では、細胞を本発明者らのＯｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２を含有する３因子ポリシストロニック構築物を使用して再プログラミングさせ、ＳＭＣ４培地中で培養した場合に、再プログラミングプロセスの間、ならびに長期フィーダーフリー培養の間の両方でゲノム安定性が維持された。図１７Ａにおいて認められるように、高分解能比較ゲノムハイブリダイゼーションにより、長期フィーダーフリー培養において、ＳＭＣ４培地を使用してｈｉＰＳＣを生成し、維持した場合に、最小のコピー数の変動が検出されたことが実証された。さらに、図１７Ｂおよび１８Ｃにおいて実証されている通り、常套的な長期フィーダーフリー培養および単細胞培養の間、ゲノム安定性が維持された。
（実施例１２）
細胞表面マーカーを使用した、培養している間の多能性細胞の細胞集団の維持
多くの場合、幹細胞培養物の多能性を維持するために、分化細胞を多能性細胞培養物から除去することが有用である。現在まで、このプロセスには、分化細胞を細胞培養物から手動で選び取ること、または未分化細胞を実質的に分化した集団から採取することが必要である。どちらのプロセスも重労働であり、技術訓練を必要とし、常に培養物中の細胞の真の多能性の状態を示すとは限らない形態に基づいた細胞の選択に依拠する（図８）。
改善されたプロセスにおいて、本発明は、常套的な培養の間に未分化細胞を効率的かつ正確に選択する能力を提供する。図１９Ａにおいて実証されている通り、ＳＭＣ４培地およびＦＦ培養液において維持したｈｉＰＳＣの集団は、未分化の多能性細胞の細胞培養物を維持するために容易に富化または選別された。別の例では、図１９Ｂに記載の通り、通常は廃棄されることになる、大部分が分化細胞の集団を細胞培養物から除去して、Ｔｒａ１８１の発現によって表されるように、大部分が未分化の多能性細胞を得ることができる。

Claims (23)

  1. 単細胞に解離したヒト多能性幹細胞を含む治療細胞を単離する方法であって、
    前記方法が、
    ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）をフィーダーフリー培地中で培養することであって、Ｒｏｃｋ、ＧＳＫ３、ＭＥＫ、およびＴＧＦβのそれぞれを特異的に阻害することを含む、培養すること、及び
    前記ヒトｉＰＳＣと、１または複数の解離酵素とを接触させて単細胞に解離させたヒト多能性幹細胞を得ること、を含み、
    前記ヒトｉＰＳＣが基底状態の多能性を有するナイーブヒトｉＰＳＣを含み、前記基底状態の多能性を有するナイーブヒトｉＰＳＣが、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、またはＣＧＢのうちの１または複数の再活性化された発現を示すことを特徴とする、方法。
  2. 前記方法が、１種または複数種の多能性のマーカーを発現する１または複数の単一の解離した多能性幹細胞を選択して単離し、１または複数の単一の解離した多能性幹細胞を得ることにより、前記単細胞に解離したヒト多能性幹細胞を選別することを更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. １つの選択された単一の解離した多能性幹細胞を拡大して、それから誘導された人工多能性幹細胞のクローン集団を得ることを更に含む、請求項２に記載の方法。
  4. 単細胞の多能性幹細胞を得る方法であって、前記方法が、
    ａ）ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、またはＣＧＢのうちの１または複数の再活性化された発現を示すことを特徴とする、基底状態の多能性を有するナイーブヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を乖離すること；
    ｂ）それにより得られた乖離した細胞を、フィーダーフリー培地中で懸濁して、フィーダーフリー細胞懸濁物を提供すること；
    ｃ）前記フィーダーフリー細胞懸濁物を、１種または複数種の多能性のマーカーを発現する細胞について選別して、単一のｉＰＳＣについて富化された細胞集団を得ること；および
    ｄ）ステップｃ）から得られたｉＰＳＣをフィーダーフリー培地中で単離することであって、前記フィーダーフリー培地中でＲｏｃｋ、ＧＳＫ３、ＭＥＫ、およびＴＧＦβのそれぞれを特異的に阻害することを更に含む、単離すること、
    を含む、方法。
  5. 選別が、１種または複数種の多能性のマーカーを発現する細胞のための、磁気ビーズまたはフローサイトメトリーによるものである、請求項４に記載の方法。
  6. 単一の人工多能性幹細胞について富化された細胞集団が、１種または複数種の多能性のマーカーを発現している細胞に関して少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、または少なくとも５００％富化されている、請求項４または５に記載の方法。
  7. 前記１種または複数種の多能性のマーカーが、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＮａｎｏｇまたはＳｏｘ２を含む、請求項４または５に記載の方法。
  8. Ｒｏｃｋ、ＧＳＫ３、ＭＥＫ、およびＴＧＦβのそれぞれを特異的に阻害することが、前記フィーダーフリー培地中に、（ａ）チアゾビビンまたはＹ２７６３２、（ｂ）Ａ－８３－０１またはＳＢ４３１５４２、（ｃ）ＢＩＯまたはＣＨＩＲ９９０２１、および（ｄ）ＰＤ９８０５９またはＰＤ０３２５９０１を含めることを含む、請求項４または５に記載の方法。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の方法により生成されるヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む組成物であって、前記ヒトｉＰＳＣが、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、またはＣＧＢのうちの１または複数の再活性化された発現を示すことを特徴とする、基底状態の多能性を有するナイーブヒトｉＰＳＣを含む、組成物。
  10. 単離された人工多能性幹細胞であって、（ａ）前記細胞が、フィーダーフリー培地組成物と接触しており、（ｂ）前記人工多能性幹細胞が、基底状態の多能性を有するナイーブヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり、前記基底状態の多能性を有するナイーブヒトｉＰＳＣが、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、またはＣＧＢのうちの１または複数の再活性化された発現を示すことを特徴とし、且つ（ｃ）前記ナイーブヒトｉＰＳＣが、再プログラミング細胞と、ｉ）ＴＦＧβ受容体阻害剤、ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、およびｉｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤を含む作用剤の混合物を含むフィーダーフリー培地とを接触させることを含む方法により得られる、単離された人工多能性幹細胞。
  11. 前記細胞が、Ｏｃｔ４を含むタンパク質をコードする１または複数の外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の単離された人工多能性幹細胞。
  12. （ｉ）前記再プログラミング細胞が、体細胞、多能性細胞、人工多能性幹細胞、またはプライムされた多能性細胞であり、
    （ｉｉ）前記ナイーブヒトｉＰＳＣが、ＴＦＧβ受容体、アクチビン、およびＭＥＫシグナル伝達経路の外因性の刺激の不在下で複製し、かつ多能性を維持し、
    （ｉｉｉ）前記ナイーブヒトｉＰＳＣが、フィーダーフリー環境において少なくとも１回の細胞分裂を可能にする、
    請求項１０または１１に記載の単離された人工多能性幹細胞。
  13. 前記ナイーブヒトｉＰＳＣの基底状態の多能性が、前記作用剤の混合物との接触なしに得られた人工多能性幹細胞と比較して、以下の特徴の１又は複数：
    ａ）クローン性の改善；
    ｂ）Ｘ染色体の再活性化の増大；
    ｃ）フィーダーフリー条件下での自己再生能の改善；
    ｄ）フィーダーフリー条件下での単一細胞の生存率の改善；及び
    ｅ）少なくとも５０％低いＸｉｓｔ活性を有すること、
    によって特徴付けられる、請求項１２に記載の単離された人工多能性幹細胞。
  14. 基底状態の多能性を有さないヒト細胞と、ＲＯＣＫ阻害剤、並びにＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＭＥＫ阻害剤を含む作用剤の混合物とを含む組成物であって、
    （ａ）前記ヒト細胞が、Ｏｃｔ４をコードする、１または複数の外因性ポリヌクレオチドを含み；
    （ｂ）前記組成物がフィーダーフリーであり；
    （ｃ）前記作用剤の混合物が、前記ヒト細胞において基底状態の多能性を誘導するのに有効な量で存在し；
    （ｄ）前記基底状態の多能性が、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、またはＣＧＢのうちの１または複数の再活性化された発現を特徴とする、組成物。
  15. 前記基底状態の多能性を有さないヒト細胞が、再プログラミング細胞である、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記再プログラミング細胞が、体細胞、多能性細胞、人工多能性幹細胞、またはプライムされた多能性細胞である、請求項１５に記載の組成物。
  17. 再プログラミングされた細胞またはその集団であって、（ａ）前記細胞が、基底状態の多能性を有するナイーブヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であり、（ｂ）前記再プログラミングされた細胞が、ＧＡＴＡ６、ＣＤＸ２、またはＣＧＢのうちの１または複数の再活性化された発現を示し、（ｃ）前記再プログラミングされた細胞が、
    Ａ）フィーダーフリー環境において、Ｏｃｔ４と、Ｓｏｘ２およびＫｌｆ４の一方または両方とを含む再プログラミング因子を非多能性細胞の集団に導入して再プログラミングを誘導すること、
    Ｂ）ステップＡ）の細胞を、以下の作用剤の混合物：
    ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
    ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
    ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
    ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
    と、接触させることを含む方法によって得られ、
    前記接触がフィーダーフリー条件下である、再プログラミングされた細胞またはその集団。
  18. 前記方法が、
    Ｃ）ステップ（Ｂ）からの前記細胞を解離させること；および
    Ｄ）（Ｃ）の細胞を単細胞選別して、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ５０、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＯＣＴ４、ＮａｎｏｇまたはＳｏｘ２を含む１種または複数種の多能性のマーカーを発現する個々の細胞を得ること、を更に含む、請求項１７に記載の再プログラミングされた細胞またはその集団。
  19. 前記方法が、ステップ（Ｄ）からの個々の細胞を、
    ｉ）ＴＧＦβ受容体阻害剤、
    ｉｉ）ＧＳＫ３阻害剤、
    ｉｉｉ）ＭＥＫ阻害剤、および
    ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤
    のうちの１または複数を含むフィーダーフリー培地中で培養することを更に含む、請求項１８に記載の再プログラミングされた細胞またはその集団。
  20. 前記再プログラミングされた細胞の集団が、クローン細胞を含む、請求項１８に記載の再プログラミングされた細胞またはその集団。
  21. 前記再プログラミングされた細胞が、通常の核型および／または通常の染色体コピー数を含む、改善したゲノム安定性を示す、請求項１７に記載の再プログラミングされた細胞またはその集団。
  22. 前記再プログラミングされた細胞が、解離後に、クローン性の改善、および／または生存率の増強を有する、請求項２１に記載の再プログラミングされた細胞またはその集団。
  23. 前記細胞が、生存率の増強を有する、解離した人工多能性幹細胞またはその集団である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の再プログラミングされた細胞またはその集団。
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