JP7342448B2 - 粒子検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、粒子検出方法に関する。

高分子ミセルやリポソームといったナノ粒子を用いた医薬品の開発が長年進められており、特にリポソームに関しては実際に医薬品として世界で広く用いられているものもある。これらナノ粒子を用いた医薬品による治療はＤｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（以下、ＤＤＳ）と呼ばれ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ効果による患部への効率的な薬剤の送達により副作用を低減した治療が可能になるとして注目を浴びている。一方で、ナノ粒子を用いた医薬品であるため、一般的な低分子医薬品と比べて粒子の凝集性や会合、融合を考慮した品質管理が必要となる。

ナノ粒子医薬品の品質管理項目の一つである粒子径測定は一般に動的光散乱（以下、ＤＬＳ）もしくはレーザー回折散乱法により行われるが、粒子群から得られる散乱光を検出し、粒子径分布を計算する手法であるため、マイノリティーな粒子群の検出には向いていない。

マイノリティーな粒子群の検出には、粒子を個々に１つずつ測定する技術の方が正確な測定が可能と考えられ、例えば各粒子のブラウン運動を観察するナノトラッキングアナリシスや、個々の粒子の質量を測定する共振式質量測定法、電気的検出を用いるコールター法（電気的検知帯法；以下、ＥＳＺ）（例えば、非特許文献１参照）が知られている。これらの手法は、各検出手段から得られる情報（シグナル）が、各粒子に対して１対１で対応しているため粒子個々の評価をすることが可能であり、数的に含まれる割合の少ない粒子でも正確に測定が可能となるが、測定できる粒子径範囲（ダイナミックレンジ）が比較的狭いという課題がある。

Ｒ．Ｗ．Ｄｅ Ｂｌｏｉｓ．ｅｔ ａｌ、Ｔｈｅ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖｏｌｕｍｅ ４１、Ｎｕｍｂｅｒ ７、ｐｐ９０９－９１６（１９７０）

本発明の課題は、ナノ粒子医薬品中に含まれる広範な分布をもつ粒子を個々にかつ連続的に検出できる粒子検出方法を提供することにある。

本発明に係るナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法は、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、分離された粒子を２以上の流路に分断し、前記流路に設置された粒子検出部で前記粒子を検出することを特徴とする。

また、本発明に係るナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法の一態様においては、前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出する。

また、本発明に係るナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法の一態様においては、前記電気検出器の検出できる粒子径範囲が設置している流路によって異なる。

また、本発明に係るナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法の一態様においては、前記電気検出器の検出できる粒子径範囲の一部が重複している。

また、本発明に係るナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法の一態様においては、前記流路の本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とすることで、粒子を２以上の流路に分断する。

また、本発明に係るナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法の一態様においては、ピンチドフローフラクショネーションの原理を利用して、粒子を分離する。

さらに、本発明は上述した方法でナノ粒子医薬品中の粒子、凝集体、会合体、融合体のうち少なくとも１つを検出し、粒子径分布、平均粒径、モード径、中間粒子径、各粒子の体積割合、濃度、個数、積算濃度、積算個数のうち少なくとも１つのパラメーターまたは前記パラメーターの経時変化を測定する方法を含んでいる。

本発明により、ナノ粒子医薬品中で広範な粒子径分布を持って存在する粒子やマイノリティーな粒子、粒子群を精度よく連続的に検出する事ができ、バッチ処理の分離技術と比較して、大量な粒子サンプルの測定が可能になる。

図１（ａ）（ｂ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０へ水力学的ろ過（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ＨＤＦ）を応用したものを示す。図１（ａ）は、マイクロチップ１０の上面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）における領域１９０の拡大図である。 図２（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子検出部１０３を直列に２つ配置した場合の態様を示す。図２（ｂ）は、２つの粒子検出部１０３を１つの粒子が連続的に通過した場合の、測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図で、上側のグラフが上流側の粒子検出部１０３により測定されたもので、下側のグラフが下流側の粒子検出部１０３により測定されたことを示す。ここで、便宜上、２つの粒子検出部１０３のグラフの縦軸の位置をずらしたが、実際は粒子が通過しないときのベースラインとなる電流値はほぼ同一である。 図３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、アパーチャを直列に２つ配置した場合であり、図２とは異なり、電極を１対のみ用いた場合の態様を示す。図３（ｂ）は、２つのアパーチャを粒子が連続的に通過した場合の測定している電流値の経時変化の様子を模式的に示した図である。 図４（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示す。図４（ｂ）は、図４（ａ）の等価回路を示す。 図５（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数の粒子検出部１０３が並列に設置された場合の態様を示し、複数の粒子検出部１０３が、流体的に下流側の電極から電圧を印加することで、複数の粒子検出部１０３間での電気的干渉を低減する態様を示す。図５（ｂ）は、図５（ａ）の等価回路を示し、複数の粒子回収流路１０２が独立していることを示す。 図６は、本発明の一実施形態を示す図であり、１つの粒子回収流路１０２に対して複数のアパーチャが並列に設置され、より低コストな装置として利用できる態様を示す。 図７は、中継流路６０と電極挿入口５９を用いた、より安価に粒子検出部１０３を作製するための態様を示している。 図８（ａ）～（ｃ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＨＤＦを応用した態様を示す。図８（ａ）は、粒子回収流路１０２が２つのものを示し、図８（ｂ）は、粒子回収流路１０２が３つのものを示し、図８（ｃ）は、粒子回収流路１０２が３つで粒子分離流路１１０に分岐流路１０５をもつものを示す。 図９（ａ）は、図８（ｂ）の分岐部１１０Ａでの流体の流れを示す図であり、図９（ｂ）は、図９（ａ）の直線流路部分の拡大図を示す。 図１０（ａ）は、層流条件下における直線流路内での粒子の流れを示す図であり、図１０（ｂ）は、粒子拡散流路１１０Ｂでの粒子の流れの軌道を示す。 図１１（ａ）～（ｃ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０でＰＦＦを応用した態様を示す。図１１（ａ）は、粒子回収流路１０２が２つのものを示し、図１１（ｂ）は、粒子回収流路１０２が３つのものを示し、図１１（ｃ）は、図１１（ａ）（ｂ）の領域２１の拡大図を示す。 図１２（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０で非対称ＰＦＦを応用した態様を示す。図１２（ｂ）は、図１２（ａ）の領域２１の拡大図を示す。 図１３（ａ）は、本発明の一実施形態を示す図であり、粒子分離流路１１０で非対称ＰＦＦを応用し、拡大流路１７の狭窄流路壁面１６ｂ側の壁面が徐々に拡大する場合の態様を示す。図１３（ｂ）は、図１３（ａ）の領域２１の拡大図を示す。 図１４は、本発明の一実施形態を示す図であり、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成され、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットが電極挿入口５９としても機能するようにした態様を示す。 図１５（ａ）は、実施例１で用いたマイクロチップ１０の概要図を示す。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）の領域２１の拡大図を示す。 図１６は、実施例１における測定結果から作成された、処理済サンプルの粒子径分布を示す。 図１７は、実施例１における測定結果から作成された、未処理サンプルの粒子径分布を示す。 図１８は、比較例１における測定結果から作成された、処理済サンプルの粒子径分布を示す。 図１９は、比較例１における測定結果から作成された、未処理サンプルの粒子径分布を示す。 図２０は、実施例２における測定結果から作成された、経時変化検証用の加熱処理済抗体医薬品の粒子径分布を示し、図２０（ａ）は処理後０分、図２０（ｂ）は処理後１０分、図２０（ｃ）は処理後１２０分を示す。 図２１は、比較例２における測定結果から作成された、経時変化検証用の加熱処理済抗体医薬品の粒子径分布を示し、図２１（ａ）は処理後０分、図２１（ｂ）は処理後１０分、図２１（ｃ）は処理後１２０分を示す。 図２２は、実施例３における測定結果から作成された、抗体凝集体量比較用の加熱処理済抗体医薬品の粒子径分布を示し、図２２（ａ）は抗体医薬品Ａ、図２２（ｂ）は抗体医薬品Ｂ、図２２（ｃ）は抗体医薬品Ｃの結果を示す。 図２３は、比較例３における測定結果から作成された、抗体凝集体量比較用の加熱処理済抗体医薬品の粒子径分布を示し、図２３（ａ）は抗体医薬品Ａ、図２３（ｂ）は抗体医薬品Ｂ、図２３（ｃ）は抗体医薬品Ｃの結果を示す。 図２４は、参考例１における示差走査熱量計による抗体医薬品の熱安定性評価結果を示す。 図２５（ａ）は、実施例４における測定結果から作成された、未処理リポソーム製剤の粒子径分布を示しており、図２５（ｂ）は実施例４における保管リポソーム製剤の粒子径分布を示す。 図２６（ａ）は、比較例４における測定結果から作成された、未処理リポソーム製剤の粒子径分布を示しており、図２６（ｂ）は比較例４における保管リポソーム製剤の粒子径分布を示す。

本発明は、ナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法であって、粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、分離された粒子を２以上の流路に分断し、前記流路に設置された粒子検出部で前記粒子を検出することを特徴とする。以下、本発明の一実施形態について説明する。

ナノ粒子医薬品（以下、サンプルという場合がある）とは、流体中に、少なくとも部分的にナノオーダーの幅及び／または高さをもつ物質を含む流体を指し、例えば、高分子、ミセル、リポソーム、抗体、抗原、核酸、ペプチド、タンパク質、ウイルス、ウイルス様粒子、細胞または前記物質２以上で複合体を形成したものを含む流体を指し、最終的に医薬品として使用されることを意図したもの、または医薬品の候補となりうる前記物質を含む流体を指す。ナノ粒子医薬品中には前述した粒子の凝集体、会合体、融合体などが含まれている場合があり、粒径は１ｎｍ～１００μｍの範囲で分布している。

また、「垂直方向へ分離する」とは、流体の流れに対して厳密に垂直である必要はなく、流体の流れに対して凡そ垂直方向に粒子が分離すればよいものとする。

粒子検出装置の装置構成の一実施例を示す模式図である図１をもとに本発明の実施形態についての詳細を説明する。マイクロチップ１０における流路の断面は、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、円形や楕円形、多角形などの断面であってもよく、また部分的に矩形以外の形状であってもよい。また、流路高さは作製の容易さから均一であることが好ましいが、部分的に深さが異なっていてもよい。

サンプルは、インレット１４から導入され、送液部によって流路下流へと送液され、粒子導入流路１０１、粒子分離流路１１０、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂ、それぞれ対応する粒子検出部１０３ａまたは１０３ｂを通過して、アウトレット１０４ａまたは１０４ｂへ流出する。粒子分離流路１１０において、粒子径に応じて粒子が流体の流れに対して垂直方向へ分離され、分離された粒子が、粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂへと流れる。粒子回収流路１０２ａまたは１０２ｂを経て到達した粒子検出部１０３ａ、１０３ｂにおいて、電気的検出が行われる。この時、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂの内部は電解質を含む溶液で満たされ、電極５４ａ、５４ｂにそれぞれ接続された導線５５を介して電気測定器５６、電源５７に接続されている。粒子検出時は、電源５７により任意の値の電流が流れており、アパーチャ５３を介した閉回路ができている（図２参照）。さらに電気測定器５６は解析部６１に接続されており、電気測定器５６から得られた検出シグナルを解析部６１で計算し、粒子径分布を作成する。

インレット１４は、サンプルを保持できる構造であればよく、凹型構造であることが好ましい。また材質としては、溶出物が少ない金属やガラス、セラミクスを用いてもよいが、安価に製造するために高分子材料で形成されることが好ましい。粒子導入流路１０１は、インレット１４と、粒子分離流路１１０との間に形成される。粒子導入流路１０１は、粒子分離流路１１０における粒子の分離を補助するために配置されるが、マイクロチップ１０を小型化するために省いてもよい。

送液部は、シリンジポンプやペリスタポンプ、圧送ポンプ等の圧力勾配により送液させる方法を用いてもよいし、マイクロチップ１０の流路断面における不均一な速度分布を抑制するために電気浸透流ポンプを用いてもよい。この場合、ポンプから接続された配管はインレット１４へ直接接続することでインレット１４内に保持されているサンプルへ圧力を印加することで送液する。また、アウトレットへ配管を介してポンプを接続し、陰圧をかけることによりマイクロチップ１０の流路内の流体を吸引させることで送液してもよい。さらに、インレット１４の液面を、アウトレット１０４ａまたはアウトレット１０４ｂの液面よりも高くすることで、液面差により送液してもよく、この場合送液部は不要となる。より定量的な測定をするためには圧力勾配により粒子を通過させた方が好ましく、脈動がより少ない圧送ポンプで送液する態様が最も好ましい。

送液部の流量は、流路の断面積やアパーチャの断面積により任意の値に設定することが好ましく、一例として、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましい。

粒子回収流路１０２は、測定可能粒子径範囲（ダイナミックレンジ）を拡げる観点で２以上設ける。ここで、粒子検出部１０３は粒子回収流路１０２の内部または下流に設けられており、粒子回収流路１０２へ流入してきた粒子を検出するために用いられる。１つの粒子回収流路１０２に対して少なくとも１つの粒子検出部１０３が設けられている必要があり、２以上の粒子検出部１０３が設けられていてもよい（図２～６）。また、測定可能粒子径範囲を外れる粒子を回収する流路をさらに設けることもできる。１つの粒子回収流路１０２に対して２以上の粒子検出部１０３が設けられた態様においては、前記２以上の粒子検出部１０３は直列に配置されてもよい（図２、３）。例えば２つの粒子検出部１０３が直列に配置された場合、２つの粒子検出部１０３を通過した同一の粒子から生成されたシグナルの間隔から、流路内の粒子の通過速度を算出することができ、粒子の通過速度は回収流路１０２の流量に一般に比例するため、回収流路内の流体の流量を見積もることが可能となる。この時、図２に示す通り電極に印加する電圧は、上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極から印加する態様が好ましい。上流側のアパーチャ５３’の下流側の電極５４ｂ’または下流側のアパーチャ５３’’の上流側の電極５４ａ’’から電圧を印加した場合、前記２つの電極間で電圧降下が生じ、一方のアパーチャの電流値変化が、他方のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それらの影響を考慮しながら測定する必要がある。従って、２つまたは２つ以上のアパーチャを含む粒子検出部１０３を用いる場合、図３に示す通り上流側のアパーチャ５３’の上流側の電極５４ａ’と、下流側のアパーチャ５３’’の下流側の電極５４ｂ’’のみを用いて測定してもよい。なお、図７に示すように、粒子検出流路の上流と下流それぞれへ、中継流路６０を介して流体的かつ電気的にアパーチャと接続している電極挿入口５９を設け、ここへ電極５４を浸漬させることでＥＳＺによる粒子検出を行ってもよい。

また、１つの粒子回収流路１０２に対して２つ以上の粒子検出部１０３が設けられた態様において、前記２以上の粒子検出部１０３は並列に配置されてもよい（図４～６）。本態様により粒子検出部１０３の並列化された数に比例して処理量が増加するという優れた効果が得られる。この時、電気的に検出するための電極５４は、各アパーチャを挟むように配置され、粒子検出部１０３の数の２倍あれば測定は可能である。一方で、図６に示したように、各アパーチャに対して上流側に１本、下流側に粒子検出部１０３の数の分だけ電極を配置した態様でも測定は可能であり、電極の数を減らすことによる低コスト化という観点からは、こちらの態様の方が好ましい。ここで、粒子検出部１０３を並列化し、各アパーチャへ同時に電圧を印加した場合、各アパーチャを挟むように配置される複数の電極対へ電圧を同時に印加すると、図４（ａ）に示すように、等価回路は複雑なものとなり、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼすため、それら影響を考慮する必要がある。一方で、電圧を各アパーチャで個々に印加し、それぞれ個別に検出したい場合、測定しないアパーチャをグラウンド、シャーシへ接続せず、開回路の状態にすることで実施可能であり、前述の他のアパーチャへの影響はなくなる。この時、開回路の状態にするために、電極５４と電源５７の間にスイッチング回路を用いてもよく、リレー方式やフォトモス方式によるもので開回路の状態にしてもよい。粒子検出部１０３は、測定時に電磁ノイズが極力影響しない測定系を構築する方が好ましく、この点でスイッチング回路には、電磁石を用いるリレー方式よりも、フォトモスセンサーのような光電流を用いた方式の方が好ましい。但し、図５の通り、アパーチャの下流側の電極から上流側へ向けて電圧を印加した場合、あるアパーチャの電流値変化が、他のアパーチャの電流値へと影響を及ぼさないため、本態様を用いてもよい。

粒子検出部１０３は、アパーチャ５３と電気検出器とを含む。アパーチャ５３は、流路内に形成された流路直径よりも小さい穴を指し、粒子検出流路６２とアパーチャ形成構造５２により規定される。アパーチャの断面形状は、その製造工程によって種々の形状をとってもよく、エッチングやレーザー照射による加工では円、楕円の形状をとり、フォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるポリジメチルシロキサン（以下、ＰＤＭＳ）等の高分子材料による成形の場合は矩形となる。アパーチャの断面積は、測定する粒子よりも大きければよいが、一般にＥＳＺで測定可能な粒子径範囲は、アパーチャ断面積の２～６０％といわれているため、流入してくると想定される粒子の大きさに応じて設計する必要がある。また、図２、３及び１４に示すように、２つのアパーチャで粒子検出部１０３が構成されてもよい。また、図４～６に示すように、複数の粒子検出部を備えることで複数のアパーチャを構成し、それぞれのアパーチャの下流がアウトレットへ接続されており、各アウトレットが電極挿入口５９としても機能するようにした構成としてもよい。この場合、アパーチャの体積が凡そ同一であれば各アパーチャから得られるシグナルは凡そ同一となる。すなわち、各アパーチャ上流の回収流路へ流れてきた粒子全てを検出することが可能であり、濃度の定量的な測定という観点で好ましい態様といえる。ＥＳＺによる粒子検出の感度は、アパーチャと電極までの間の流路抵抗に比例して低下するため、得られたシグナルから粒子径を算出する場合は、このシグナル低下を加味する必要がある（式（１）参照）。この時、Ｌはアパーチャを形成する流路の長さ、ｄｅはアパーチャの等価直径、Ｌ’は中継流路６０の長さ、ｄｅ’は中継流路６０の等価直径とした。また、式（１）によるシグナル低下の加味はその流路構造に応じて適宜行うことが好ましく、必ずしも式（１）と完全に合致した式でなくてもよい。

粒子検出部１０３の電気検出器は、電極５４、電極５４に導線５５を介して接続される電気測定器５６、及び電源５７から主に構成される。２つの電極５４は、アパーチャ５３を挟んで配置される。電気測定器５６は、電気的特性を検知するものであればよく、電流測定器、電圧測定器、抵抗測定器、電荷量測定器が挙げられ、ＥＳＺの測定においては電流測定器を用いるのが最も好ましい。また、ＩＶアンプを用いて、電流電圧変換後に利得を上げて、微小な電流値変化を検出することが、より微小な粒子を検出する上で好ましい。また、アパーチャ内を通過した粒子を取りこぼしなく検出するために、電気測定器５６のサンプリング時間間隔は、粒子がアパーチャを通過するのに要する時間よりも十分短いことが好ましく、１秒間に１万回以上サンプリングすることが好ましく、１秒間に２万回以上サンプリングすることがさらに好ましい。

解析部６１では、測定結果を演算するための演算装置と、測定結果又はそれに由来する演算結果を記録するための記録媒体とを具備することができる。あるいは、これらの演算装置及び記録媒体は、電気測定器５６と一体化していてよいし、電気測定器５６に対して接続可能な外部装置であってもよい。記録媒体に記録されるデータには、サンプリングした電流値と、粒子が通過した際に発生する電流値変化、またその電流値変化から算出される粒子径、粒子数、粒子濃度、検出時間又は測定開始時からの経過時間が含まれる。

粒子分離流路１１０で用いる分離手法において水力学的ろ過（Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ＨＤＦ）を用いる場合、粒子分離流路１１０の上流部の末端が粒子導入流路１０１と接続しており、流体が流出する下流部の末端の分岐部１１０Ａを介して粒子回収流路１０２へと接続していればよい（図８）。この時、分岐部１１０Ａは、粒子を分離するために少なくとも２つ以上の粒子回収流路１０２へと流体的に接続されている必要があり、粒子回収流路を含む下流の流体力学的抵抗を考慮して、各流路やアパーチャの断面積、体積を設定する必要がある。例えば、図８（ｂ）、図９の通り回収流路１０２を３つ設けた場合、各回収流路へ流れる流量をＱａ、Ｑｂ、Ｑｃとすると、各流量の比は流路の幅ｗ、高さｈ、長さＬから算出され、具体的にはハーゲンポアズイユの式から直線流路内における流量は式（２）に従い計算される。

また、拡大図９（ｂ）の通り、層流条件下でのマイクロチップの流路内の速度分布は放物線となり、一般に式（３）中のｕ（ｒ）で表される（この時、ｗ０は円管の半径、ｒは円管中心からの距離、μは粘度、Ｌは円管の長さ、ΔＰは圧力損失を示す。）。

流路壁面からの任意の距離ｗ１とｗ２で区切られる放物線内の面積Ｓａ、Ｓｂ、Ｓｃの比は、各回収流路へ流れる流量Ｑａ、Ｑｂ、Ｑｃの比と等しくなる。この時、流路内に存在する粒子のうち、その粒子の中心または重心位置がｗ１よりも流路壁面近くに存在している粒子が回収流路１０２ａへ流入し、ｗ２よりも流路壁面近くに存在している粒子が回収流路１０２ｂへ流入し、ｗ１とｗ２の間に存在する粒子は、回収流路１０２ｃへ流入する。従って、回収流路１０２ａ、１０２ｂへ流れる最も大きい粒子の半径はそれぞれｗ１、ｗ２となるため、アパーチャの断面形状が円形の場合は、アパーチャの半径をｗ１またはｗ２以上とする必要があり、アパーチャの断面形状が略円形や楕円形の場合は、略円形または楕円形の中心または重心を通る最小半径をｗ１またはｗ２以上とする必要がある。また、アパーチャの断面形状が矩形の場合、２組の対向する辺それぞれがｗ１またはｗ２の２倍以上の長さである必要がある。加えてアパーチャの断面形状が多角形の場合、その内接円の半径をｗ１またはｗ２以上とする必要がある。

ここで、粒子分離流路１１０の末端以外の箇所に分岐部１１０Ａ（図８に図示されていない）を複数設け、１以上の分岐流路１０５を設ける態様をとってもよい（図８（ｃ））。分岐流路１０５は一方の流路壁面側のみに設けてもよいし、流路壁面の両側へ設けてもよい。また１以上の分岐流路１０５は、下流の回収流路１０２において同時に合流してもよく、徐々に合流する態様をとってもよい。

さらに、粒子分離流路１１０の分岐部１１０Ａ（図１０に図示されていない）の流体的に上流側に、粒子拡散流路１１０Ｂを形成してもよい（図１０（ｂ））。粒子拡散流路１１０Ｂの流体的な上流側が粒子導入流路１０１へと接続されており、流体的な下流側が分岐部１１０Ａへと接続している。また、粒子導入流路１０１を用いない態様の場合は、粒子拡散流路１１０Ｂの流体的な上流側が直接インレットへと接続される。

粒子拡散流路１１０Ｂは、流体的な上流側から下流側へ向けて、流路の幅または高さ、もしくは両方が拡大していく構造をとることが好ましい。これは、粒子回収流路が、粒子拡散流路１１０Ｂの流路幅方向に複数存在するのか、高さ方向に複数存在するのかで好ましい態様が異なるが、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィーによるマイクロチップの流路形成技術を用いる場合、その作製の容易さという点で、流路の幅が拡大していく構造が好ましい。

この粒子拡散流路１１０Ｂでは、単位時間当たりの粒子のブラウン運動、つまり拡散距離がその粒子径の平方根に反比例することを利用し、粒子拡散流路１１０Ｂを粒子が流れていく際に、その粒子径に応じて粒子が流路の拡大する方向へ拡散するため、拡大した流路壁面付近では、粒子径の小さい粒子の存在確率が高くなり、濃縮効果が得られる。ここで、図１０（ｂ）の流路壁面ａと粒子拡散流路壁面ａの接続する角度θａ、流路壁面ｂと粒子拡散流路壁面ｂの接続する角度θｂは、流路幅を拡大させる点で１８０°未満である必要がある。また、流路壁面ａ、流路壁面ｂで囲まれる流路内の流速１ｍ／秒以上となるような高流量の条件では、拡大部分での渦流れの発生が懸念されるため、１ｍ／秒未満となるような比較的低流量な条件で送液をするか、角度θａ、θｂを９０°よりも大きくすることが好ましい。一方で、粒子拡散流路１１０Ｂへ粒子が流入した際、粒子はその重さに応じて粒子が流れてきた方向（流体力学的な下流方向で、分岐部１１０Ａが存在する方向）に慣性力を受ける。つまり、粒子の密度が同じ場合、粒子径の大きい粒子ほど流路中央に近づく方向に慣性力を受けるため、より流路壁面では粒子径の小さい粒子の存在割合が高くなり、ＨＤＦにおける更なる分離能向上へと寄与する。また、角度θａ、θｂは非対称でも良く、一方の壁面を略直線に接続し、対向する他方の壁面のみを１８０°未満の角度で拡大させて接続してもよい。

粒子分離流路１１０で用いる分離手法においてＨＤＦを用いた場合、図８における粒子検出部１０３ａ、１０３ｂで検出できる粒子径範囲は、それぞれ全く同一でもよいが、広範な粒子径範囲を持つサンプルを測定するために異なる粒子径範囲を測定できるよう設定することが好ましく、その一部がお互いに重複している方が、分離しきれなかった粒子を検出でき、よりロバストな結果を得られる点でさらに好ましい。図８（ａ）に示したように、粒子回収流路１０２が２本の場合、粒子検出部１０３ａ、１０３ｂで検出できる粒子径範囲は、粒子検出部１０３ａを大きい粒子径範囲にし、粒子検出部１０３ｂを小さい粒子径範囲に設定してもよく、その逆でも問題はない。但しＨＤＦの理論に基づき、アパーチャが粒子により閉塞されないよう設定する必要がある。

粒子のカウント数からの濃度換算においては、各粒子回収流路１０２へ流れる流量は設定した送液部の流量と式（２）を用いて算出されるため、測定時間当たりの粒子のカウント数をこれで割ることにより、粒子濃度を算出する。

続いて、粒子分離流路１１０においてピンチドフローフラクショネーション（ＰＦＦ）の原理を利用した流路を用いる場合の構成の一例を図１１に示した。ＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合、粒子分離流路１１０は、分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂ、狭窄流路１６、及び拡大流路１７を含む。粒子を含む流体１００Ｐおよび粒子を含まない流体１００Ｎを保持するインレット１４ａ、１４ｂはそれぞれ分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂと流体的に接続している。分岐流路１８ａ、分岐流路１８ｂはその下流で合流し、狭窄流路１６の上流側へと流体的に接続される。その後、ＰＦＦの原理に基づいて狭窄流路１６の下流と接続している拡大流路１７で粒子が分離される。拡大流路１７の流路幅は、所定の位置で一定となり、拡大流路１７の下流で流体的に接続される回収流路１０２ａ、１０２ｂで粒子が回収され、回収流路の下流で接続される検出部１０３ａ、１０３ｂで粒子が検出される。ここで、回収流路は２本以上であれば何本設置してもよいが、流路の小型化、低コスト化の観点で５本以下にすることが好ましく、３本以下が最も好ましい。

また、非対称ＰＦＦの原理に基づいて、拡大流路１７を形成してもよい。この場合、図１２及び１３に示される通り、拡大流路１７にドレイン流路２２を設置してもよく、粒子の分離能を向上させる点では、この態様がより好ましい。ドレイン流路２２は、アウトレット２３と接続されており、流体が排出又は回収される。ドレイン流路へは５０％以上の流体が流れるよう設計することが好ましく、７０％以上の流体が流れるよう設計することがさらに好ましい。

さらに、狭窄流路１６と拡大流路１７が接続する構造は、図１１（ｃ）や図１３（ｂ）に示すように流路幅が徐々に拡大するように構成してもよい。流路幅が徐々に拡大する場合、拡大流路の壁面１７ｂが直線を描くように拡大して、スロープ４０を形成してもよいし、曲線を描くように拡大してもよい。拡大流路１７の流路幅が、段状に拡大するか又は直線的に拡大する場合、狭窄流路の壁面１６ａ、１６ｂと、当該壁面に続く拡大流路１７の壁面１７ａ、１７ｂとの間の角度２４ａ、２４ｂにより、拡大流路を規定することができる。例えば、段状に拡大する場合の角度２４ａ、２４ｂは９０°である。拡大流路１７の壁面が、徐々に直線的に拡大する場合、角度２４ａ、２４ｂは、９０°～１８０°で表される。拡大領域の壁面の角度２４ａ、２４ｂは、独立に９０°～１８０°の間の任意の角度をとることができ、一例として、１２０°、１３５°、１５０°、１８０°をとることができる。ただし、狭窄流路壁面１６ｂに対する拡大流路壁面１７ｂの角度２４ｂは９０°又はそれ未満の場合であっても、それが部分的な構造で、実質的には徐々に拡大していくような構造であれば、大半の流体は徐々にアウトレット２３の方向へ流れることから問題ない。

拡大流路１７の下流に接続する複数の粒子回収流路１０２は、少なくとも２つ設けられる必要があり、測定したい粒子径範囲に応じてその数を任意に増やすことが好ましい。各粒子回収流路１０２は、少なくとも１つの粒子検出部１０３があり、複数設けてもよい。

拡大流路１７は、ＨＤＦの項で記載した粒子拡散流路１１０Ｂとしての機能も持たせることで、さらに粒子の分離能を促進させる機能を付与させてもよいが、この場合は、拡大流路の長さは、粒子が拡散できる十分な長さを持つ必要があり、少なくとも１μｍ以上は必要となる。拡大流路１７の流路長さは、拡大する流路幅と角度２４ａ、２４ｂにより任意の値に決定される。

また、拡大流路を用いず、狭窄流路１６の下流に直接複数の粒子回収流路１０２を設けてもよい。

粒子分離流路１１０にＰＦＦの原理を利用した流路を用いた場合、粒子は狭窄流路壁面１６ａ側から１６ｂ側へ向けて存在しうる粒子の直径が大きくなっていくため、例えば図１１（ａ）の場合、粒子検出部１０３ａが小径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｂが大径粒子を検出するようにアパーチャの断面積を設定すること好ましい。また、図１１（ｃ）の場合、粒子検出部１０３ａが小径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｃが中径粒子を検出し、粒子検出部１０３ｂが大径粒子を検出するようにアパーチャの断面積を設定することが好ましい。つまり、狭窄流路壁面１６ａに近い粒子検出部１０３ほど、小さい粒子を検出できるようアパーチャの断面積を設定することが好ましい。例えば、０．１～２．０μｍの粒子を検出しようとする場合、図１１（ｃ）、図１２、図１３の場合、粒子検出部１０３ａでは直径０．１～０．３μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が０．４μｍ＾２（幅１μｍ、高さ０．４μｍの矩形状のもの、または半径０．３６μｍの円形状のもの）のものを設置し、粒子検出部１０３ｃでは直径０．２～０．８μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が２μｍ＾２（幅２μｍ、高さ１μｍの矩形状のもの、または半径０．８μｍの円形状のもの）のものを設置し、粒子検出部１０３ｂでは直径０．４～２．０μｍの粒子を検出するためにアパーチャ断面積が１４μｍ＾２（幅３．５μｍ、高さ４μｍの矩形状のもの、または半径２．１μｍの円形状のもの）のものを設置してもよい。

また粒子分離流路１１０でＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合、送液部により設定される流量は、０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの間に設定することが好ましく、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも２倍以上多いことが好ましい。粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも何倍以上であることが好ましいかについては、狭窄流路１６の流路幅と分離したい粒子の直径に依存し、例えば、分離したい粒子の直径が狭窄流路１６の流路幅の１／４であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐよりも３倍以上であることが好ましく、分離したい粒子の直径が狭窄流路１６の流路幅の１／１０であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００Ｐの流量よりも９倍以上であることが好ましい。つまり、ＰＦＦの原理に基づいて分離したい粒子の直径に対して、狭窄流路１６の流路幅がＮ倍であった場合、粒子を含まない流体１００Ｎの流量が、粒子を含む流体１００ＰよりもＮ－１倍以上多いことが好ましい。前記流量比であれば、分離したい粒子は狭窄流路の壁面１６ａを滑流することになるため、ＰＦＦの原理に基づいた粒子分離が可能となる。

さらに、粒子分離流路１１０でＰＦＦの原理を利用した流路を用いる場合において、粒子を含む流体１００Ｐに含まれる粒子全てを狭窄流路壁面１６ａに滑流させる必要はなく、相対的に大きい粒子径を持つ粒子のみを狭窄流路壁面１６ａに滑流させてもよい。例えば図１１（ｂ）、図１２、図１３の場合、小粒径の粒子を検出する粒子検出部１０３ａで検出できる最大粒子径以下の粒子を、狭窄流路壁面１６ａへ滑流させれば、最大粒子径以下の粒子が狭窄流路壁面１６ａに整列されなかったとしても、粒子検出部１０３ａでその分布をＥＳＺの原理に基づいて作成することができる。すなわち、ＰＦＦで分離しきれなかった粒子がいたとしても、粒子検出部でその粒子径分布が作成できるため、ＥＳＺがＰＦＦの分離能を補完するという優れた効果が得られる。

また、小粒径の粒子を検出する粒子検出部１０３ａで検出できる最大粒子径以上の粒子までしか狭窄流路壁面１６ａへ滑流させられない流量条件下であっても、前述のＨＤＦの理論に基づき、粒子検出部１０３ａのアパーチャが閉塞する粒子径の粒子が流入しないよう流路抵抗を設定することで、本発明の目的としている広範な粒子径分布を持つサンプルの測定が可能となる。すなわち、ＰＦＦによる中粒径、大粒径粒子の分離と、ＨＤＦによる小粒径粒子の分離と、ＥＳＺによる精密な粒子径分布の作成により、広範な粒子径分布を持つサンプルの測定が可能になるという優れた効果が得られる。この時、ＰＦＦにおける拡大流路１７が、前述の粒子拡散流路１１０Ｂの役割も併せて果たすため、単位時間あたりの拡散距離の大きい小粒径粒子の分離を促進させるという優れた効果が得られる。またこの態様において、小粒径粒子は粒子検出部１０３ｃにも流入し、場合によっては粒子検出部１０２ｂにも流入するため、粒子検出部１０３ａへ流入してくる小粒径粒子は粒子サンプルを含む流体１００Ｐの一部となる。その流入量は、粒子拡散流路１１０Ｂの役割を果たす拡大流路１７の長さが、小粒径粒子が拡散するのに十分な距離であれば、粒子回収流路１０２ａとその下流の流路構造から算出される流量に比例するため、その算出された値から定量することができる。ここで、拡大流路１７の長さにおける「小粒径粒子が拡散するのに十分な距離」とは、粒子を含まない流体１００Ｎの流量と粒子を含む流体１００Ｐの流量の和が０．１μＬ／ｈｏｕｒから１ｍＬ／ｈｏｕｒの範囲であれば、１μｍ以上が好ましく、より好ましくは１００μｍ以上が好ましい。

粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、ＤＬＤ（決定論的側方変位法）、ディーン力または慣性力による粒子分離の原理を用いる場合、粒子導入流路１０１は少なくとも１本が必要であり、より安定した分離を行うために複数本導入し、そのうちの１つからサンプルを導入し、残りの粒子導入流路１０１から粒子を含まない流体を導入させてもよい。

粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、電場による粒子分離を行う場合、分離流路内に、流体の流れに対して垂直方向に一対の電極を配置した流路構造とすることが好ましい。この時、粒子はその大きさだけでなく、流体中での表面電荷も分離の要素に入るため、粒子回収流路１０２内またはその下流の粒子検出部１０３はそれを考慮した設計とする必要がある。

粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、磁場による粒子分離を行う場合、分離流路内または分離流路外に、流体の流れに対して垂直方向に一対の磁場発生部品、また磁場発生装置を配置する構成とすることが好ましい。この時、粒子はその大きさだけでなく、粒子の磁性も分離の要素に入るため、粒子回収流路１０２内またはその下流の粒子検出部１０３はそれを考慮した設計とする必要がある。

粒子分離流路１１０で用いる分離手法において、表面弾性波や音響泳動による粒子分離を行う場合、分離流路内または分離流路外に、流体の流れに対して垂直方向に一対の音響トランスデューサ―を配置した流路構造とすることが好ましい。この時、粒子はその大きさだけでなく、粒子の剛性や密度も分離の要素に入るため、粒子回収流路１０２内またはその下流の粒子検出部１０３はそれを考慮した設計とする必要がある。

粒子検出流路６２は、ＥＳＺ以外の原理に基づいた構造とすることもでき、例えば、ナノトラッキングアナリシス、ＤＬＳ、散乱光検出、レーザー回折散乱法、共振式質量測定法、光遮蔽法、顕微鏡観察法、フローサイトメトリーを用いることが出来る。

また本発明は、製剤の過程で生じたナノ粒子医薬品中の粒子や凝集体、会合体、融合体を検出することにより、粒子径分布、平均粒径、モード径、中間粒子径、各粒子の体積割合、濃度、個数、積算濃度、積算個数のうち少なくとも１つのパラメーターまたは前記パラメーターの経時変化を測定することが可能である。この測定結果を基に、ナノ粒子医薬品の安定性、安全性、凝集・会合・融合に関わる物理特性の評価することが可能である。また、ナノ粒子医薬品に対して加熱、加圧、攪拌、振動、懸濁溶液組成の変更、凍結融解等のストレスを加えることで意図的にナノ粒子医薬品中の粒子の凝集体や会合体、融合体を生成させ、ナノ粒子医薬品の安定性、安全性、凝集・会合・融合に関わる物理特性の評価を行ってもよい。

ここで経時変化とは、時間の経過とともにナノ粒子医薬品またはその候補となる物質の粒子径、体積またはその個数が変化すること以外に、ナノ粒子医薬品の製剤過程またはその候補となる物質の製造過程で施される処理前後での前記変化も含むこととする。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

粒子検出装置の製造
図１５で示されるマイクロチップ１０を、一般的なフォトリソグラフィーとソフトリソグラフィー技術を用いて作製した。具体的な手順を以下に示す。
４インチベアシリコンウェハ（株式会社フィルテック）上へ、フォトレジストＳＵ－８ ３００５（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を滴下後、スピンコーター（ＭＩＫＡＳＡ社）を用いてフォトレジスト薄膜を形成した。この時、目的膜厚に応じて、ＳＵ－８ ３００５へ希釈剤Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｏｎｅ（東京応化工業社）を添加した。続いて、マスクアライナー（ウシオ電機社）と、任意のパターンを形成したクロムマスクを用いて流路パターンをフォトレジスト膜へ形成し、ＳＵ－８Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社）を用いて流路パターンを現像することで、用いたい流路の鋳型を作製した。
続いて、作製した鋳型へ、未硬化のＬＳＲ７０７０ＦＣ（モメンティブパフォーマンス社）を流し込み、８０℃で２時間加熱することで、流路の形状を転写されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を作製した。硬化したＰＤＭＳを鋳型から慎重に剥がし、カッターで任意の大きさに成形後、パンチャーを用いて流路のインレット、アウトレットを形成した。剥離したＰＤＭＳとスライドガラス（松浪ガラス社）を酸素プラズマ発生装置（メイワフォーシス社）で表面処理後、ＰＤＭＳとスライドガラスを貼り合わせることでマイクロチップ１０を作製した。
流路１３の高さは粒子検出部１０３ａ、粒子検出部１０３ｃ以外すべて５．５μｍとし、流路１３の端部に、基板１１の上面に貫通するインレット１４ａ、１４ｂ、アウトレット１０４ａ、１０４ａ’、１０４ｂ、１０４ｂ’、１０４ｃ、１０４ｃ’、２３（それぞれ穴の径２ｍｍ）を設けた。流路１３は、分岐流路１８ａ（幅２０μｍ、長さ１．５ｍｍ）、分岐流路１８ｂ（幅４０μｍ、長さ５００μｍ）、狭窄流路１６（幅６μｍ、長さ２０μｍ）、拡大流路１７（拡大角度１３５度、最大拡大時流路幅６００μｍ、長さ０．５ｍｍ）、ドレイン流路２２（幅５００μｍ、長さ１．７ｍｍ）、粒子回収流路１０２ａ（幅７５μｍ、長さ４ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｃ（幅１４０μｍ、長さ７．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｂ（幅５１２μｍ、長さ３．７５ｍｍ）とした。また、粒子検出部１０２ａの２つのアパーチャは、どちらも幅１．６μｍ、高さ０．６μｍ、長さ２．５μｍとし、粒子検出部１０２ｃの２つのアパーチャは、どちらも幅２．６μｍ、高さ１．２μｍ、長さ３μｍとし、粒子検出部１０２ｂの２つのアパーチャは、どちらも幅５．８μｍ、高さ５．５μｍ、長さ１０μｍとした。各粒子検出部の形状は図１４と同様であり、また式（１）において算出されるｋ値は、アパーチャ抵抗と、アパーチャから電極が挿入されているアウトレットまでの流路の抵抗比から、３．０とした。

電気検出実施例
作製したマイクロチップ１０は、基板上へ載置され、マイクロチップ１０内の複数の粒子検出部１０３へ電極を接続した。電極は一対の白金線より構成され、一方の電極は導線を介してプログラマブル電流増幅器ＣＡ５３５０（エヌエフ回路社）へ接続され、ＡＤコンバーターを介してＰＣへと接続され、送信されてきたデジタルの信号をＬａｂＶｉｅｗにより解析した。また粒子検出部１０３へ接続される電極のもう一方は９Ｖの乾電池へ導線を介して接続した。
各インレットは、テフロンチューブを介してプレッシャーポンプＰ－ＰｕｍｐＢａｓｉｃ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ社）へ接続し、一定の流量で送液した。

大粒子検出装置の製造
クロムマスクのパターンとスピンコーターを用いた薄膜形成条件が異なる点以外は上述の粒子検出装置と同様にして大粒子検出用マイクロチップを作製した。この時、流路１３の高さは粒子検出部１０３ａ、粒子検出部１０３ｃ以外すべて１５μｍとして設計し、流路１３は、狭窄流路１６（幅２０μｍ、長さ６０μｍ）、拡大流路１７（拡大角度１３５度、最大拡大時流路幅５７０μｍ、長さ１．２５ｍｍ）、ドレイン流路２２（幅５４５μｍ、長さ１．４ｍｍ）、粒子回収流路１０２ａ（幅７５μｍ、長さ４ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｃ（幅１４０μｍ、長さ７．５ｍｍ）、粒子回収流路１０２ｂ（幅３５０μｍ、長さ３．７ｍｍ）とした。また、粒子検出部１０２ａの２つのアパーチャは、どちらも幅２μｍ、高さ２．５μｍ、長さ１０μｍとし、粒子検出部１０２ｃの２つのアパーチャは、どちらも幅４μｍ、高さ５μｍ、長さ１０μｍとし、粒子検出部１０２ｂの２つのアパーチャは、どちらも幅１５μｍ、高さ１５μｍ、長さ１０μｍとした。

サンプル調製
（１）未処理サンプル
直径０．３μｍリポソーム（片山化学工業）を、ポアサイズ０．１μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行った、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液）で１００００倍希釈した。
（２）処理済サンプル
上述の直径０．３μｍリポソームを上述の０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈後、オートクレーブ（高圧蒸気滅菌）処理（１２１℃、２気圧、２０分）を施し、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液でさらに１００倍希釈した。
（３）未処理抗体医薬品
ポアサイズ０．１μｍのシリンジフィルター（メルクミリポア社製）を用いて異物除去を行った、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液（リン酸緩衝液）で、市販の抗体医薬品Ａ、Ｂ、Ｃをそれぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう希釈した。
（４）経時変化検証用の加熱処理済抗体医薬品
抗体医薬品Ｃを、製剤の状態で６０℃３０分の加熱処理を行い、室温で１０分放置後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液で１ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう希釈し、希釈した時間を処理後０分とした。
（５）抗体凝集体量比較用の加熱処理済抗体医薬品
抗体医薬品Ａ、Ｂ、Ｃを、それぞれ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液で１ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう希釈し、６８℃３０分の加熱処理を行った。
（６）示差走査熱量計測定用抗体医薬品
抗体医薬品Ａ、Ｂ、Ｃを、それぞれ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液で１５時間透析を行った。
（７）未処理リポソーム製剤
アムビソーム（登録商標、大日本住友製薬）を、メーカー指定のプロトコルにて調製した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳ溶液で１００倍希釈した。
（８）保管リポソーム製剤
上述の未処理リポソーム製剤を４０℃で１０日間保管した。

（実施例１）
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した処理済サンプルを２．４μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを１０μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき３つの各粒子回収流路１０２へ流入した粒子を１分間検出し、測定結果を１つのヒストグラムへまとめると図１６の通りとなった。この時、リポソームは比重１．０５μｇ／ｍＬの真球として重量濃度換算（μｇ／ｍＬ）し、ヒストグラムとしてまとめた。
未処理サンプルについても同様にして実験を行い、得られた測定結果を１つのヒストグラムへまとめると図１７の通りとなった。
両者を比較すると、処理済サンプルでのみ０．５μｍ以上の領域に凝集体または融合体とみられる大粒子の分布が見られ、オートクレーブ処理によりリポソームの凝集体または融合体が発生していることが確認できた。

（比較例１）
処理済サンプルを、ＡｇｇｒｅｇａｔｅｓＳｉｚｅｒ（島津製作所社）により測定を行い、図１８に示す測定結果が得られた。また、未処理サンプルも同様に測定を行い、図１９に示す測定結果が得られた。なお、ＡｇｇｒｅｇａｔｅｓＳｉｚｅｒは、粒子群にレーザー光を照射し、そこから発せられる回折・散乱光の強度分布パターンから計算によって粒度分布を求めるレーザー回折・散乱法を測定原理としており、粒子径に応じた粒子の分離は行っていない。
両者を比較すると、直径０．５μｍ以上の粒子径分布に大きな差がないことから、本手法では僅かに存在するリポソームの凝集体または融合体を検出することは難しいことが確認された。

（実施例２）
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した経時変化検証用の加熱処理済抗体医薬品（処理後０分）を２．４μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを１０μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき３つの各粒子回収流路１０２へ流入した粒子を１分間検出し、測定結果を１つのヒストグラムへまとめると図２０（ａ）の通りとなった。この時、抗体凝集体は比重１．３２μｇ／ｍＬの真球として重量濃度換算（μｇ／ｍＬ）し、ヒストグラムとしてまとめた。さらに、処理後１０分、１２０分の前記加熱処理済抗体医薬品についても同様に測定を行ったところ、各々図２０（ｂ）、（ｃ）の通りとなり、抗体凝集体量とピークトップ位置が経時的に増大していく様子を観察した。
また、未処理抗体医薬品についても同様にして実験を行ったところ、粒子の検出はほぼなく、未処理のものに関しては抗体凝集体または不純物は殆ど存在しないことを確認した。

（比較例２）
経時変化検証用の加熱処理済抗体医薬品の処理後０分、１０分、１２０分のサンプルを、比較例１と同様にして測定を行い、図２１（ａ）～（ｃ）に示す測定結果が得られた。これより、レーザー・回折散乱法においても抗体凝集体の経時変化を観察可能であることを確認した。しかしながら、ピーク幅が実施例２と比較してブロードであり、定量的な測定は難しいといえる。

（実施例３）
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した抗体凝集体量比較用の加熱処理済抗体医薬品Ａ、Ｂ、Ｃを２．４μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを１０μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき３つの各粒子回収流路１０２へ流入した粒子を１分間検出し、測定結果を１つのヒストグラムへまとめると図２２（ａ）～（ｃ）の通りとなった。この時、抗体凝集体は比重１．３２μｇ／ｍＬの真球として重量濃度換算（μｇ／ｍＬ）してヒストグラムとしてまとめた。また、積算した抗体凝集体量は、抗体医薬品Ａは７．３μｇ／ｍＬ、抗体医薬品Ｂは２．１μｇ／ｍＬ、抗体医薬品Ｃは０．７４μｇ／ｍＬとなった。
図２２の通り、抗体医薬品の種類により、生成する抗体凝集体の分布や量が異なる様子を確認した。

（比較例３）
抗体凝集体量比較用の加熱処理済抗体医薬品Ａ、Ｂ、Ｃを、比較例１と同様にして測定を行い、図２３に示す測定結果が得られた。これより、レーザー・回折散乱法においても異なる抗体医薬品における抗体凝集体の分布や量の違いを確認できるものの、図２３（ｃ）の抗体医薬品Ｃに関しては抗体凝集体を検出できず、正確な測定は難しいことが確認された。

（参考例１）
示差走査熱量計測定用抗体医薬品Ａ、Ｂ、Ｃについて、示差走査熱量計ＭｉｃｒｏＣａｌ（マルバーン社）により各々の抗体の熱安定性を測定した結果を図２４に示す。それぞれの吸熱ピークトップの位置は、抗体医薬品Ａは７２．３℃、Ｂは７２．８℃、Ｃは７５．０℃となり、熱安定性は抗体医薬品Ｃが最も高く、続いて抗体医薬品Ｂの安定性が高く、最も安定性が低いのは抗体医薬品Ｃと解釈される結果が得られた。
実施例３と参考例１の結果より、抗体医薬品の熱安定性が低いものほど抗体凝集体量が多いことが確認され、前記熱安定性と抗体凝集体量とが相関する様子を確認できた。従って、本発明を用いて抗体医薬品の安定性評価が可能であることを見出した。

（実施例４）
上述のマイクロチップ１０を用い、インレット１４ａへ調製した未処理リポソーム製剤を３．６μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを８００ｍｂａｒの圧力で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき、粒子回収流路１０２ａへ流入した粒子を２分間、粒子回収流路１０２ｃへ流入した粒子を４分間、粒子回収流路１０２ｂへ流入した粒子を１００秒間検出した。
また、大粒子検出用マイクロチップを用い、インレット１４ａへ調製した未処理リポソーム製剤を１６μＬ／ｈｏｕｒの流量で送液し、インレット１４ｂへ０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０含有の１×ＰＢＳを４００ｍｂａｒの圧力で送液した。続いて、上述の電気検出実施例に基づき、粒子回収流路１０２ａへ流入した粒子を２分間、粒子回収流路１０２ｃへ流入した粒子を４分間、粒子回収流路１０２ｂへ流入した粒子を４分間検出した。
マイクロチップ１０において検出した直径０．５μｍ未満の粒子と、大粒子検出用マイクロチップにおいて検出した直径０．５μｍ以上の粒子の測定結果をヒストグラムにまとめると図２５（ａ）の通りとなった。この時、リポソームは比重１．０５μｇ／ｍＬの真球として重量濃度換算（μｇ／ｍＬ）し、ヒストグラムとしてまとめた。
図２５（ａ）の通り、前記未処理リポソーム製剤は数十ｎｍから数μｍの幅広い分布を持つためマイクロチップ１０の他、より大径粒子の測定が可能な大粒子検出用マイクロチップを併用し、０．５μｍ未満の粒子についてはマイクロチップ１０での測定結果を、０．５μｍ以上の粒子については大粒子検出用マイクロチップでの測定結果を用いることで、図２５（ａ）に示すヒストグラムを得た。
さらに、同様にして保管リポソーム製剤を測定し、図２５（ｂ）に示すヒストグラムを得た。
両者を比較すると、０．５μｍ以上の領域に凝集体または融合体とみられる大粒子の分布が双方見られ、さらに保管リポソーム製剤においては、前記凝集体または融合体の量が０．６μｇ／ｍＬから１．２μｇ／ｍＬへ増加していることが確認できた。

（比較例４）
未処理リポソーム製剤と保管リポソーム製剤を動的光散乱法（大塚電子工業、ゼータ電位・粒径測定システム）を用いて測定し、図２６（ａ）、（ｂ）に示す測定結果が得られた。なお、動的光散乱法は、粒子群にレーザー光を照射し、そこから発せられる散乱光強度の時間変化から計算によって粒子径分布を求める手法であり、粒子径に応じた粒子の分離は行っていない。また、動的光散乱法はリポソーム製剤の粒子径測定時に一般に用いられる手法で、厚生労働省から発行されているリポソーム製剤の開発に関するガイドラインにおいても、主たる粒子径分布測定方法として記載されているため、比較例として用いた。
なお、図２６より動的光散乱法においては凝集体または融合体とみられる大粒子の分布が双方見られないことから、前記凝集体または融合体の検出が難しいことが確認された。

１０ マイクロチップ
１１ 基板
１３ 流路
１４、１４ａ、１４ｂ インレット
１６ 狭窄流路
１６ａ サンプル液側狭窄流路壁面
１６ｂ シース液側狭窄流路壁面
１７ 拡大流路
１７ａ サンプル液側拡大流路壁面
１７ｂ シース液側狭拡大路壁面
１８ａ、１８ｂ 入口側分岐流路
１９ 拡大開始点
２１ 領域
２２ ドレイン流路
２３ アウトレット
２４ａ、２４ｂ 角度
４０ スロープ部分
５０ 粒子
５１ 粒子の流れる方向
５２ アパーチャ形成構造
５３ アパーチャ
５４、５４ａ、５４ｂ 電極
５５ 導線
５６ 電気測定器
５７ 電源
５８ 導電性溶液
５９ 電極挿入口
６０ 中継流路
６１ 解析部
６２ 粒子検出流路
１００ 流体
１００Ｐ 流体
１００Ｎ 流体
１０１ 粒子導入流路
１０２ａ～ｃ 粒子回収流路
１０３ａ～ｃ 粒子検出部
１０４ａ～ｃ アウトレット
１１０ 粒子分離流路
１１０Ａ 分岐部
１１０Ｂ 粒子拡散流路

Claims (5)

1. ナノ粒子医薬品中に含まれる粒子を検出する方法であって、
   粒子をその粒子径に応じて流体の流れに対して垂直方向へ分離し、
   分離された粒子を２以上の流路に分断し、
   前記流路に設置されたアパーチャを挟んで配置された電極を含む電気検出器で前記粒子を検出し、
   前記アパーチャの断面積が異なることで、前記電気検出器で検出できる粒子径範囲が異なることを特徴とする、前記方法。
2. 前記電気検出器の検出できる粒子径範囲の一部が重複していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記流路の本数、分岐部の形状、幅、高さ、長さのうち少なくとも１つのパラメーターが調整され、ある一定以上の大きさの粒子が混入しない流路構造とすることで、粒子を２以上の流路に分断することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. ピンチドフローフラクショネーションの原理を利用して、粒子を分離することを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 請求項１～４のいずれかに記載の方法でナノ粒子医薬品中の粒子、凝集体、会合体、融合体のうち少なくとも１つを検出し、
   粒子径分布、平均粒径、モード径、中間粒子径、各粒子の体積割合、濃度、個数、積算濃度、積算個数のうち少なくとも１つのパラメーターまたは前記パラメーターの経時変化を測定する方法。