[go: up one dir, main page]

JP7296459B2 - Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する安定なワクチン - Google Patents

Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する安定なワクチン Download PDF

Info

Publication number
JP7296459B2
JP7296459B2 JP2021528951A JP2021528951A JP7296459B2 JP 7296459 B2 JP7296459 B2 JP 7296459B2 JP 2021528951 A JP2021528951 A JP 2021528951A JP 2021528951 A JP2021528951 A JP 2021528951A JP 7296459 B2 JP7296459 B2 JP 7296459B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
compound
pharmaceutically acceptable
saccharide
synthesis
conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021528951A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022516837A (ja
Inventor
エマディ マドゥ
ピー リジュボア マリルダ
ノップ ダニエル
モナンダ ボパンナ
フォン ボーニン アルネ
レベフ ペレイラ クラニー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Idorsia Pharmaceuticals Ltd
Original Assignee
Idorsia Pharmaceuticals Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Idorsia Pharmaceuticals Ltd filed Critical Idorsia Pharmaceuticals Ltd
Publication of JP2022516837A publication Critical patent/JP2022516837A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7296459B2 publication Critical patent/JP7296459B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)

Description

本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ細胞表面ポリサッカライド及びその結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関連する一般式（Ｉ）の合成サッカライドに関する。当該合成サッカライド、当該結合体及び当該合成サッカライド又は当該結合体を有する医薬組成物は、加水分解抵抗性、長期安定性、熱安定性を有し、現在ではＣｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅと呼ばれるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関連する疾患の予防及び／又は治療に有用である。さらに、一般式（Ｉ）の合成サッカライドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に対する抗体を検出するための免疫学的アッセイにおけるマーカーとして有用である。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、過去にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅとして知られていたが、グラム陽性胞子形成嫌気性菌であり、院内下痢症の最も重要な定義可能な原因と考えられている。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの語は、本明細書において、同義に使用され、両者ともＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅと略される。この菌はヒトの腸管に定着し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症（ＣＤＩ）を引き起こす。また、特に高齢及び免疫不全の患者並びに抗生物質治療を受けている患者を含む有リスク群において、ＣＤＩは、院内感染下痢症の最も一般的な原因として診断されている。過去１０年間にわたりＣＤＩの発生が急増していることから、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより引き起こされる感染症は重大な問題となっているが、これは主として、高毒性を有し、現在優占化している菌株であるリボタイプ０２７の出現によるものであり、疾病率、死亡率の増大及び高い再発率を伴う集団発生を引き起こす。特に再発ＣＤＩの場合には治療費が大幅に増大する。従って、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより引き起こされる感染症の予防が強く望まれており、有リスク群に予防接種を行うことが、コスト効率が最もよく、最も強力な手段である。しかしながら、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するワクチンは未だ開発されていない。
細菌の細胞表面に発現する炭水化物は、多くの場合免疫原性があり、ワクチン開発の重要な候補である。タンパク質と比較すると、炭水化物は進化的により安定であり、担体タンパク質に共有結合した場合、オリゴサッカライド抗原は、長期持続性のＴ細胞依存的保護を誘発することができる。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細胞が発現する細胞壁ポリサッカライドには、ＰＳ－Ｉ、ＰＳ－ＩＩ及びＰＳ－ＩＩＩと命名された３種の異なる構造が同定された（Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０１３、１２、４２１）。リボタイプ０２７において発現されている等、ＰＳ－Ｉサッカライドの発現がより限定的である一方、ＰＳ－ＩＩサッカライドは、試験を行ったすべてのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプのすべてにおいて見いだされ、このことは、ＰＳ－ＩＩサッカライドが保存された表面抗原である可能性を示している。
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩサッカライドの繰り返し単位は下記からなる：
Figure 0007296459000001
 Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩサッカライドは、マンノースのアノマー位においてＰＳ－ＩＩ繰り返し単位を相互に接続する（１→６）ホスホジエステル結合の化学的不安定性のために、水中で加水分解し、そのため一般的に使用される熱酢酸又は水／フェノールによる細胞からの抽出を複雑なものにする。Ｏ１－Ｃ１ホスホジエステル結合の開裂に続くホスホモノエステル基の除去により、ＰＳ－ＩＩヘキササッカライド単位が生じる。ＰＳ－ＩＩサッカライドのホスホジエステル結合開裂は、酸、塩基又は金属イオンの存在下で増大する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩサッカライドの溶液中における不安定性のため、ワクチンとして使用した場合、サッカライド又はその結合体は、液体製剤中では適切に緩衝されなければならず、又は、固体製剤としては凍結乾燥されなければならず、使用前に復元される。しかしながら、輸送、貯蔵及び取り扱いの間最適な温度を確保するコールドチェーンシステムが必要となるため、ワクチンの凍結乾燥及び冷蔵は、製造コストの増大とワクチン供給の複雑化を招く。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩサッカライドの不安定性については多くの記述がなされている。従って、液体製剤の形態の新規で安定なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅワクチンが求められている。
国際特許出願ＷＯ２００９／０３３２６８Ａ１は、菌株リボタイプ０２７、ＭＯＨ９００及びＭＯＨ７１８のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌からのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＰＳ－Ｉ及びＰＳ－ＩＩ細胞表面サッカライドの単離を開示する。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのＰＳ－ＩＩ細胞表面サッカライドの合成的アプローチは、Ｄａｎｉｅｌｉら（Ｏｒｇ．ｌｅｔ．２０１１、１３、３７８－３８１）、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（ＷＯ２０１２／０８５６６８Ａ２）、Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ（ＷＯ２０１２／１１９７６９Ａ１）及びＯｂｅｒｌｉら（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１、１８、５８０）により追及された。Ｍｏｎｔｅｉｒｏ（Ｍｅｔｈ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１６、３９７－４０８）は、熱水－フェノール処理を用いた、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅバイオマスからの水溶性ＰＳ－Ｉ及びＰＳ－ＩＩ並びに水及びフェノール溶解性ＰＳ－ＩＩＩポリサッカライドの単離について報告している。
本発明の目的は、一般式（Ｉ）に定義する合成サッカライドを提供することであり、一般式（Ｉ）の合成サッカライドは、代謝的に安定であり、加水分解抵抗性を有し、液体製剤中において貯蔵安定性を有し、かつ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより引き起こされる疾患から保護する抗体を誘導する。当該サッカライドは免疫原性担体と結合することができ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが関与する疾患の予防及び／又は治療に有用な結合体及びその医薬組成物を提供する。さらに、一般式（Ｉ）の合成サッカライドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイにおけるマーカーとして有用である。
本発明の目的は独立請求項の教示により解決される。本発明のさらなる有利な特徴、側面及び詳細は、本出願の従属請求項、明細書、図及び実施例から明らかである。
図１は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ細胞壁サッカライドの繰り返し単位の化学構造を示す。 図２は、本発明による相互接続分子の官能基Ｘの例を提供する。 図３は、本発明による相互接続分子の官能基Ｘの例を提供する。 図４は、本出願の好ましい化合物としての一般式（Ｖ－２）のＣＲＭ１９７結合体を示す。 図５は、ＮａＯＨ処理により化合物３３が開裂し得る２種の経路（Ｐａｔｈ）を示す。経路Ｉはホスフェート基における開裂を示し、ホスフェート基はリンカー部に残り、化合物ＬＡ、リン酸二水素５－アミノペンチル、が形成される。経路ＩＩは、ホスフェート基における開裂を示し、ホスフェート基はサッカライド部分に残り（化合物３３Ｂ）、化合物ＬＢ、５－アミノペンタン－１－オール、が形成される。 図６は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３（標準）、化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で４日処理した後の化合物３３、精製した化合物３３Ｂ、化合物ＬＢ。図７より、化合物３３は塩基性条件下で１日の間完全に安定であることが明らかである。ｒｔにてＮａＯＨで４日処理した後、化合物３３の５０％がなお完全である。 図７は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、化合物３３（標準）、水中において２℃－８℃で２月間保持した後の化合物３３、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）と同義であるＮａＰｉ中において２℃－８℃で２月間保持した後の化合物３３、アルハイドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）及びＰＢＳ中において２℃－８℃で２月間保持した後の化合物３３。図７より、化合物３３は２℃から８℃において２月間にわたって完全に安定であることが明らかである。 図８は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、化合物３３（標準）、水中において２５℃で２月間保持した後の化合物３３、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）と同義であるＮａＰｉ中において２５℃で２月間保持した後の化合物３３、アルハイドロゲル及びＰＢＳ中において２５℃で２月間保持した後の化合物３３。図８より、化合物３３は２５℃において２月間にわたって完全に安定であることが明らかである。 図９は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、化合物３３（標準）、水中において３７℃で２月間保持した後の化合物３３、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）と同義であるＮａＰｉ中において３７℃で２月間保持した後の化合物３３、アルハイドロゲル及びＰＢＳ中において３７℃で２月間保持した後の化合物３３。図９より、化合物３３は３７℃において２月間にわたって完全に安定であることが明らかである。 図１０は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、化合物３３（コントロール）、化合物９２（標準）、水中において２－８℃で１週間保持した後の化合物９２、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）と同義であるＮａＰｉ中において２－８℃で１週間保持した後の化合物９２、アルハイドロゲル及びＰＢＳ中において２－８℃で１週間保持した後の化合物９２。図１０より、化合物９２は２－８℃において１週間にわたって完全に安定であることが明らかである。 図１１は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、化合物３３（コントロール）、化合物９２（標準）、水中において２５℃で１週間保持した後の化合物９２、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）と同義であるＮａＰｉ中において２５℃で１週間保持した後の化合物９２、アルハイドロゲル及びＰＢＳ中において２５℃で１週間保持した後の化合物９２。図１１より、化合物９２は２５℃において１週間にわたって完全に安定であることが明らかである。 図１２は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、化合物３３（コントロール）、化合物９２（標準）、水中において３７℃で１週間保持した後の化合物９２、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）と同義であるＮａＰｉ中において３７℃で１週間保持した後の化合物９２、アルハイドロゲル及びＰＢＳ中において３７℃で１週間保持した後の化合物９２。図１２より、化合物９２は３７℃において１週間にわたって完全に安定であることが明らかである。 図１３は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウム溶液で１日処理した後、精製した化合物３３、化合物３３（コントロール）、化合物５４（標準）、水中において２５℃で１週間保持した後の化合物５４、水中において２－８℃で１週間保持した後の化合物５４、水中において３７℃で１週間保持した後の化合物５４。図１３より、化合物５４は３７℃において１週間にわたって完全に安定であることが明らかである。 図１４は、下から上に向かって、下記の化合物のＨＰＬＣプロットを示す：化合物３３Ａ（コントロール）、化合物５４（標準）、アルハイドロゲル中において２５℃で１週間保持した後の化合物５４、アルハイドロゲル中において２－８℃で１週間保持した後の化合物５４、アルハイドロゲル中において３７℃で１週間保持した後の化合物５４。図１４から、アルハイドロゲルと製剤化した場合、化合物５４は大部分が水酸化アルミニウムに吸着し、水酸化アルミニウムの存在下でＨＰＬＣにより検出可能である想定される開裂産物は形成されなかったことがわかる。従って、化合物５４は３７℃において１週間にわたって安定である。 図１５は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅサッカライド３３－ＣＲＭ１９７製剤（３６）で免疫化したウサギ（ｎ＝４）からのプール血清のＤａｙ－０（０日目）、Ｄａｙ－７及びＤａｙ－４２のＥＬＩＳＡ力価を示す。化合物３６で免疫化したウサギから得られた血清を１％ＢＳＡ－ＰＢＳで１：１００、１０００希釈した。希釈血清（１００μＬ）を、０．５μｇの対応する３３－ＢＳＡ結合体（化合物３７）でコートしたマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。検出は、１：１００００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて行い、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として用いて現像した。吸収を４５０ｎｍで測定し、データをＧｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。図１５から、第４２日目における顕著な免疫学的応答が明らかである。 図１６は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に対するウサギ抗血清（プール血清）のＥＬＩＳＡ力価を示す。示すように、ウサギ（試験アーム（ｓｔｕｄｙ ａｒｍ）当たり４動物）を、水酸化アルミニウム（アラム（Ａｌｕｍ））アジュバントを用い又は用いずに、１回の皮下注射当たり２．５μｇ又は１０μｇの糖鎖抗原を用いて４回免疫化した（第０、１４、２８、７７日目）。アラムを含むＰＢＳをネガティブコントロールとした。免疫原は結合体５６であった。異なる時点のプール血清（第０、７、２１、３５、７７及び８４日目）を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートしたホルマリン不活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌（菌株６３０）に対する総ＩｇＧについて試験した。ｔｇｃＢＩＯＭＩＣＳ ＧｍｂＨから購入したコート済みＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり２００μＬの市販のブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ．１１１１２５８９００１）で２時間ブロックした。血清を１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈し、１ウェル当たり１００μＬの体積で１時間インキュベートした。次いで、総ＩｇＧを、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｒｅｆ．Ａ４９１４）を用いて３０ｍｉｎ検出し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｒｅｆ．３４０２８）を用いて現像した。吸収をマイクロプレートリーダー内で４５０ｎｍで測定し、バックグラウンドを差し引いたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。図１６から、ウサギを結合体５６で予防接種すると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０の表面に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。さらに、アラムアジュバントを加えると、より高い全体ＩｇＧ力価が得られる。 図１７は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に対するウサギ抗血清（個別血清）のＥＬＩＳＡ力価を示す。示すように、ウサギ（試験アーム当たり４動物）を、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントを用い又は用いずに、１回の皮下注射当たり２．５μｇ又は１０μｇの糖鎖抗原を用いて４回免疫化した（第０、１４、２８、７７日目）。アラムを含むＰＢＳをネガティブコントロールとした。免疫原は結合体５６であった。異なる時点の血清（第０、７３５、７７及び８４日目）を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートしたホルマリン不活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌（菌株６３０）に対する総ＩｇＧについて試験した。ｔｇｃＢＩＯＭＩＣＳ ＧｍｂＨから購入したコート済みＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり２００μＬの市販のブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ．１１１１２５８９００１）で２時間ブロックした。血清を１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：３００に希釈し、１ウェル当たり１００μＬの体積で１時間インキュベートした。次いで、総ＩｇＧを、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｒｅｆ．Ａ４９１４）を用いて３０ｍｉｎ検出し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｒｅｆ．３４０２８）を用いて現像した。吸収をマイクロプレートリーダー内で４５０ｎｍで測定し、バックグラウンドを差し引いたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。図１７から、ウサギを結合体５６で予防接種すると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０の表面に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。さらに、アラムアジュバントを加えると、より高い全体ＩｇＧ力価が得られる。 図１８は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｒ２０２９１に対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ力価を示す。示すように、ウサギ（試験アーム当たり４動物）を、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントを用い又は用いずに、１回の皮下注射当たり２．５μｇ又は１０μｇの糖鎖抗原を用いて４回免疫化した（第０、１４、２８、７７日目）。アラムを含むＰＢＳをネガティブコントロールとした。免疫原は結合体５６であった。異なる時点のプール血清（第２１、３５、７７及び８４日目）を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートしたホルマリン不活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌（菌株Ｒ２０２９１）に対する総ＩｇＧについて試験した。市販のコート済みＥＬＩＳＡプレートを、１ウェル当たり２００μＬの市販のブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ．１１１１２５８９００１）で２時間ブロックした。血清を１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈し、１ウェル当たり１００μＬの体積で１時間インキュベートした。次いで、総ＩｇＧを、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｒｅｆ．Ａ４９１４）を用いて３０ｍｉｎ検出し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｒｅｆ．３４０２８）を用いて現像した。吸収をマイクロプレートリーダー内で４５０ｎｍで測定し、バックグラウンドを差し引いたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。図１８から、ウサギを結合体５６で予防接種すると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株Ｒ２０２９１の表面に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。さらに、アラムアジュバントを加えると、より高い全体ＩｇＧ力価が得られる。 図１９Ａは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株ＶＰＩ１０４６３に対するウサギ抗血清（第３５日目）のＥＬＩＳＡ力価を示す。示すように、ウサギ（試験アーム当たり４動物）を、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントを用い又は用いずに、１回の皮下注射当たり２．５μｇ又は１０μｇの糖鎖抗原を用いて４回免疫化した（第０、１４、２８、７７日目）。アラムを含むＰＢＳをネガティブコントロールとした。免疫原は結合体５６であった。第３５日目のプール血清を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートしたホルマリン不活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌（菌株ＶＰＩ１０４６３）に対する総ＩｇＧについて試験した。図１９Ａから、ウサギを結合体５６で予防接種すると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株ＶＰＩ１０４６３の表面に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。さらに、アラムアジュバントを加えると、より高い全体ＩｇＧ力価が得られる。図１９Ｂは、単離したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩポリサッカライドに対するウサギ抗血清（第３５日目）のＥＬＩＳＡ力価を示す。示すように、ウサギ（試験アーム当たり４動物）を、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントを用いて、１回の皮下注射当たり２．５μｇ又は１０μｇの糖鎖抗原を用いて４回免疫化した（第０、１４、２８、７７日目）。アラムを含むＰＢＳをネガティブコントロールとした。免疫原は結合体５６であった。第３５日目のプール血清を、単離したＰＳ－ＩＩポリサッカライドに対する総ＩｇＧについて試験した。図１９Ｂから、ウサギを結合体５６で予防接種すると、単離したＰＳ－ＩＩポリサッカライドに結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。図１９Ｃは、単離したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩポリサッカライドでプレインキュベーションを行った場合又はそうでない場合のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に対するウサギ抗血清（第３５日目）のＥＬＩＳＡ力価を示す。ウサギ（試験アーム当たり４動物）を、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントを用いて、１回の皮下注射当たり１０μｇの糖鎖抗原を用いて４回免疫化した（第０、１４、２８、７７日目）。免疫原は結合体５６であった。（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈した）第３５日目のプール血清を、１０又は５０μｇの単離したＰＳ－ＩＩポリサッカライド又はＰＢＳとともに、アイス上で３０ｍｉｎインキュベートした。次いで、血清を、あらかじめ１ウェル当たり２００μＬの市販のブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ、ｒｅｆ．１１１１２５８９００１）で２時間ブロックした市販のコート済みＥＬＩＳＡプレート（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０）上で１時間（１００μＬ／ウェル）インキュベートした。次いで、総ＩｇＧを、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１０，０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ｒｅｆ．Ａ４９１４）を用いて３０ｍｉｎ検出し、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｒｅｆ．３４０２８）を用いて現像した。吸収をマイクロプレートリーダー内で４５０ｎｍで測定し、バックグラウンドを差し引いたデータをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてプロットした。図１９Ｃから、ウサギ抗血清のＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌への結合が、ＰＳ－ＩＩポリサッカライドにより用量依存的にブロックされることが明らかであり、このことは、抗細菌抗体の応答がＰＳ－ＩＩポリサッカライドに特異的であることを示す。 図２０は、合成Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩヘキササッカライド５４に対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ力価を示す。示すように、ウサギ（試験アーム当たり４動物）を、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントを用い又は用いずに、１回の皮下注射当たり２．５μｇ又は１０μｇの糖鎖抗原を用いて４回免疫化した（第０、１４、２８、７７日目）。アラムを含むＰＢＳをネガティブコントロールとした。免疫原は結合体５６であった。異なる時点のプール血清（第０、２１、３５、７７及び８４日目）を、合成Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩヘキササッカライド５４に対する総ＩｇＧについて試験した。図２０から、ウサギを結合体５６で予防接種すると、合成免疫原５４に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。さらに、アラムアジュバントを加えると、より高い全体ＩｇＧ力価が得られる。 図２１は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０に対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ力価を示す。マウス（試験アーム当たり７又は８動物）を、１回の皮下注射当たり、０．５又は２μｇの糖鎖抗原の用量で、結合体９４又は結合体５６のいずれかを用いて２回免疫化した（第０、１４、２８日目）。ＰＢＳをネガティブコントロールとし、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントをすべての免疫化に使用した。第２１及び３５日目のプール血清を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートしたホルマリン不活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌（菌株６３０）に対する総ＩｇＧについて試験した。図２１から、マウスを結合体９４又は５６で予防接種すると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０の表面に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。 図２２は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株Ｒ２０２９１に対するウサギ抗血清のＥＬＩＳＡ力価を示す。マウス（試験アーム当たり７又は８動物）を、１回の皮下注射当たり、０．５又は２μｇの糖鎖抗原の用量で、結合体９４又は結合体５６のいずれかを用いて２回免疫化した（第０、１４、２８日目）。ＰＢＳをネガティブコントロールとし、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントをすべての免疫化に使用した。第２１及び３５日目のプール血清を、ＥＬＩＳＡプレート上にコートしたホルマリン不活性化Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌（菌株Ｒ２０２９１）に対する総ＩｇＧについて試験した。図２２から、マウスを結合体９４又は５６で予防接種すると、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株６３０の表面に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。 図２３は、合成Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ抗原に対するマウス抗血清のＥＬＩＳＡ力価を示す。マウス（試験アーム当たり７又は８動物）を、１回の皮下注射当たり、０．５又は２μｇの糖鎖抗原の用量で、結合体９４又は結合体５６のいずれかを用いて２回免疫化した（第０、１４、２８日目）。ＰＢＳをネガティブコントロールとし、水酸化アルミニウム（アラム）アジュバントをすべての免疫化に使用した。第２１及び３５日目のプール血清を、免疫化に使用した各合成Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖鎖抗原に対する総ＩｇＧについて試験した。図２３から、マウスを結合体９４又は５６で予防接種すると、合成免疫原に結合するＩｇＧ抗体を誘導することが明らかである。さらに、アラムアジュバントを加えると、より高い全体ＩｇＧ力価が得られる。 図２４は、免疫化実験に使用した２種の糖結合体９４及び５６のＳＥＣクロマトグラムを示す。非結合体化ＣＲＭ１９７タンパク質をコントロールとした。 図２５は、免疫化実験に使用したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ糖結合体９４及び５６（１ウェル当たり２．５μｇ）の１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて分離したＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。非結合体化ＣＲＭ１９７タンパク質をコントロールとした。
定義
本明細書で使用する「リンカー」という用語は、任意で少なくとも１個の相互接続分子に結合することにより、サッカライドの還元末端モノサッカライドを、免疫原性担体又は固体担体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）に接続することができる分子フラグメントを包含する。従って、リンカー自体又は相互接続分子を伴うリンカーの機能は、還元末端モノサッカライドと免疫原性担体又は固体担体の間の特定の距離を確立し、保ち、及び／又は、架橋することである。サッカライドと免疫原性担体の間の特定の距離を保つことにより、免疫原性サッカライドエピトープが、免疫原性担体の構造（例えば、担体タンパク質の二次構造）により遮蔽されることが避けられる。加えて、反応性基の立体障害を減少させることにより、リンカーはサッカライドとの結合の効率を大幅に上昇させる（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００３、８７、１５３－１７４）。より具体的には、リンカーの一方の末端を、還元末端モノサッカライドのアノマー中心において環外酸素原子に接続し、他方の末端を窒素原子を介して相互接続分子に、又は、免疫原性担体若しくは固体担体に直接的に接続する。
本発明においては、本技術分野において知られているサッカライド結合体（例えば、サッカライド－担体タンパク質結合体、抗体－薬剤結合体）用のいかなるリンカーをも使用することができる。サッカライド担体タンパク質結合体を対象とする多数の出版物から、当業者は、本明細書に開示するサッカライド及び結合体に適切なリンカーを容易に思い描くことができる（Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ２０１８、Ａｄｖａｎｃｅ Ａｒｔｉｃｌｅ、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ８ＣＳ００４９５Ａ中の「Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃ ａｎｄ ｍｏｄｅｒｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」；並びにＡｃｃ Ｃｈｅｍ Ｒｅｓ ２０１７、５０、１２７０－１２７９を参照されたい。）。というのは、使用されるリンカー、すなわちその長さ及び結合の型は、サッカライド結合体の免疫原性にそれほど影響を与えないからである（ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１７、１２（１２）：ｅ０１８９１００；Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１９９６、１９１、１－１０を参照されたい。）。そのような適切なリンカーは、無害（すなわち無毒）及び非免疫原性（すなわち、結合体を用いた免疫化において非防御抗体の形成を誘導しない。）であり、市販の二官能性のポリエチレングリコール（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１３、１７２、３８２－３８９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．１９９６、１９１、１－１０）、グルタル酸誘導体（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５、７０（１８）、７１２３－７１３２）、アジピン酸誘導体、スクアレート誘導体、アルキン、市販のＭＦＣＯ－ＮＨＳ（モノフルオロ－置換シクロオクチン Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）等のＮ－ヒドロキシ－スクシンイミド、（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１７、５０、１２７０－１２７９中に開示されているような）マレイミド又は（ＷＯ２０１４０８０２５１Ａ１中に記載されているような）親水性アルキルホスフィナート及びスルホニルを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使用される「相互接続分子」という用語は、官能基Ｘ及び官能基Ｙを有する二官能性分子を意味し、官能基Ｘは、リンカーＬ上の末端アミノ基と反応することができ、官能基Ｙは、免疫原性担体上又は固体担体上に存在する官能性基と反応することができる。図３は、市販の相互接続分子の例を示すが、本発明で使用することができる相互接続分子をそれらの例に限定するものではない。相互接続分子は、リンカー又は免疫原性担体若しくは固体担体の一部を形成するものではないものとする。
本明細書で使用する「アジュバント」という用語は、免疫学的アジュバント、すなわち、ワクチン中に含まれるある抗原に対する免疫応答を、それに抗原的に関与することなく増強することにより、当該ワクチンの効果を修飾し又は増大させる、ワクチン組成物中で使用される物質を意味する。古典的な意味で当業者に知られているアジュバントの例には：－ カルシウム塩及びアルミニウム塩（又は、それらの混合物）を有するミネラル含有組成物が含まれる。カルシウム塩にはリン酸カルシウムが含まれる。アルミニウム塩には水酸化物塩、リン酸塩、硫酸塩等が含まれ、上記塩は適切な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファス等）を取る。これらの塩に吸着させることが好ましい。ミネラル含有組成物は金属塩の粒子としてもよい。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムとして知られるアジュバントを使用してもよい。本発明においては、アジュバントとして一般的に使用されるいかなる「水酸化物塩」又は「リン酸塩」アジュバントを使用してもよい。「水酸化アルミニウム」として知られるアジュバントは、一般に、通常、少なくとも部分的に結晶である水酸化酸化アルミニウム塩である。「リン酸アルミニウム」として知られるアジュバントは、通常、水酸化リン酸アルミニウムであり、少量の硫酸塩を含むことも多い（すなわち、水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩）。これらは沈降法により得てもよく、沈降の際の反応条件及び濃度が、塩中のヒドロキシルに対するリン酸塩の置換の程度に影響を与える。水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムの混合物を、本発明の製剤において使用することができる；
－ サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根、そして花にさえも見い出される及びステロール配糖体及びトリテルペノイド配糖体の異種グループである。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ、Ｍｏｌｉｎａ樹の樹皮のサポニンについて、アジュバントとしての広範な研究がされてきた。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ）及びＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ）から市販で入手することもできる。サポニンアジュバント製剤には、ＱＳ２１等の精製製剤並びにＩＳＣＯＭ等の脂質製剤が含まれる。サポニン粗製物は、ＨＰＬＣ及びＲＰ－ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いた特異的な精製画分が特定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ－Ａ、ＱＨ－Ｂ及びＱＨ－Ｃが含まれる。サポニン製剤はコレステロール等のステロールをも包含する。サポニンとコレステロールを組み合わせて、免疫刺激結合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成させるために使用することができる。ＩＳＣＯＭは、一般に、ホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリン等のリン脂質を含む。知られているいかなるサポニンもＩＳＣＯＭ中で使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは１種又は２種以上のＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ及びＱＨＣを含む；
－ 生分解性で無毒の物質から形成されるマイクロパーティクル（すなわち、直径１００ｎｍ～１５０ｐｍ、より好ましくは直径２００ｎｍ～３０ｐｍ又は５００ｎｍ～１０ｐｍの粒子）。そのような無毒で生分解性の物質には、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリカプロラクトンが含まれるが、これらに限定されるものではない；
－ α－グリコシルセラミド、フィトスフィンゴシン含有α－グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００［（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－１－Ｏ－（α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－２－（Ｎ－ヘキサコサノイルアミノ）－１，３，４－オクタデカントリオール］、ＣＲＯＮＹ－１０１、３”－スルフォ－ガラクトシル－セラミド等のＣＤ１ｄリガンド；
－ 免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを有するもの（リン酸結合によってグアノシン残基に結合した非メチル化シトシン残基を有するジヌクレオチドシークエンス）、又は、ＣｐＩモチーフを有するもの（イノシンに結合したシトシンを有するジヌクレオチドシークエンス）、又は、二本鎖ＲＮＡ、又は、回文配列を有するオリゴヌクレオチド、又は、ポリ（ｄＧ）シークエンスを有するオリゴヌクレオチド）。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート修飾等のヌクレオチド修飾／類似体を含んでもよく、二本鎖又は（ＲＮＡを除いて）一本鎖であってよい；
－ ホスフェート含有非環式バックボーンに結合した脂質を含有する化合物（例えば、ＭＰＬＡ又はＴＬＲ４アンタゴニスト、Ｅ５５６４）；
－ 油分乳化物（例えば、フロイントアジュバント）。
理論的には、免疫学的事象のカスケードにおいて特定の状況を有利にしたり又は増幅することができ、最終的に、より顕著な免疫学的応答を引き起こす各分子又は物質は、アジュバントと定義することができる。
原則として、ワクチン製剤におけるアジュバントの使用により：
－ ワクチンにとって適切な又は望ましい免疫応答を方向づけ又は最適化することができ；
－ ワクチンの粘膜送達、すなわち、ワクチンの口腔又は胃又は肺上皮等の粘膜表面及び関連リンパ組織との接触を引き起こすような投与を可能にし；
－ 細胞介在免疫応答の促進を可能にし；
－ 高度に精製した又はリコンビナント抗原等の、弱い免疫原の免疫原性を増強することができ；
－ 保護免疫を提供するために必要な抗原の量又は免疫化の頻度を減らすことができ；及び
－ 新生児、高齢者及び免疫不全のワクチン接種者等の、免疫応答が減少した又は弱い個体におけるワクチンの効果を改善することができる。
それらの作用機作についてはほとんど知られていないが、現在のところ、アジュバントは下記のメカニズムの１つにより免疫応答を強化すると考えられている：
－ 抗原の生物学的又は免疫学的半減期の増大；
－ 例えば、ＡＰＣによる抗原－アジュバント結合体の取り込み後に、抗原がエンドソーム膜を通過してサイトゾル内に入ることができるようにすることによる、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への抗原送達、並びに、抗原のプロセッシング及びＡＰＣによる提示の改善；
－ ストレスを加えられた又は損傷を受けた細胞からの危険誘発シグナルを模倣することによる、免疫応答の開始；
－ 免疫調節性サイトカイン産生の誘導；
－ 免疫系の特異的サブセットへの免疫応答の傾斜；及び
－ 抗原攻撃の急速な分散の遮断。
サッカライドは、ＴＩ－２（Ｔ細胞依存性－２）抗原及び弱い免疫原として当業者に知られている。従って、サッカライドベースのワクチンの製造においては、当該サッカライドを免疫原性担体に結合させて、サッカライドに比べて増大した免疫原性を示す結合体を提供する。この文脈において、「免疫原性担体」という用語は、サッカライドに結合して、サッカライド自体に比べて増大した免疫原性を示す結合体を形成する構造体と定義される。従って、サッカライドを免疫原性担体、好ましくはタンパク質キャリアー、に結合させることにより、当該免疫原性担体に対する免疫応答を誘発することなく、当該サッカライドに対する免疫応答を刺激する効果がある。
従って、本発明は一般式（Ｉ）のサッカライド、又は、そのジアステレオ異性体若しくは薬学的に許容される塩を対象とする。
Figure 0007296459000002
 （式中、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数であり；
Ｔ＊－は、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚは、
Figure 0007296459000003
 を表し；
Ｌはリンカーを表し；
Ｅは、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’は、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す。）。
すべての一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及びまたすべての副一般式において、ｎは、好ましくは１～８からの整数であり、より好ましくは１～６からの整数であり、なおより好ましくは１、２、３、４又は５、なおより好ましくは１、２、３又は４、なおより好ましくは１、２又は３、なおより好ましくは１又は２、なおより好ましくは１を表す。
リンカーＬは、好ましくは２から４０個の間の炭素原子（任意の側鎖の炭素原子を含む。）、より好ましくは２から３０個の間、より好ましくは２から２０個の間、より好ましくは２から１４個の間、より好ましくは２から１２個の間、及びなおより好ましくは２から１０個の間の炭素原子を有する。
酸素原子（すなわち－Ｏ－Ｌ－ＮＨ２の酸素）とＮＨ２基の間の最も短い原子鎖は、好ましくは２から１４個の原子、より好ましくは２から１２個の原子、より好ましくは２から１０個の原子、より好ましくは２から８個の原子からなる。（アノマー中心における酸素とＮＨ２基の間の可能な最も短い接続である）最も短い鎖が２から６個の原子からなる場合には、これらは好ましくは炭素原子である。最も短い鎖が４から８個の原子からなる場合、上記鎖はＯ、Ｎ及びＳから選択される１又は２個のヘテロ原子を有してよい。最も短い鎖が９から１４個の原子からなる場合、上記鎖はＯ、Ｎ及びＳから選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子を有してよい。
リンカー－Ｌ－又は最も短い鎖は完全に又は部分的にフッ素化されていることも好ましい。リンカー－Ｌ－は、３員の、若しくは４員の、若しくは５員の、若しくは６員の飽和炭素環、又は、５員の部分的に不飽和の（芳香族ではない）炭素環、又は、４員の、若しくは５員の、若しくは６員の飽和酸素ヘテロ環、又は、４員の、若しくは５員の、若しくは６員の飽和窒素ヘテロ環、又は、６員の芳香族炭素環を有してよい。
リンカー－Ｌ－は、アミド（－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－）及び／又は尿素（－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－）残基、好ましくは唯一のアミド又は尿素残基を有してもよい。リンカーは、置換基、好ましくは２個の置換基（例えば、Ｒ１０及びＲ１１）又は４個の置換基（例えば、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５及びＲ１４）を有してもよく、これらの置換基は本明細書に定義した意味を有し、好ましくは：－Ｆ、－Ｃｌ、－ＣＨ３、－Ｃ２Ｈ５、－Ｃ３Ｈ７、－Ｃ５Ｈ９、－Ｃ６Ｈ１３、－ＯＣＨ３、－ＯＣ２Ｈ５、－ＣＨ２Ｆ、－ＣＨＦ２、－ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ２、－ＳＣＨ３、－ＳＣ２Ｈ５、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｎ（ＣＨ３）２及び－Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２から選択される。
リンカー－Ｌ－がフッ素化されている場合には、２個を超える置換基－Ｆが好ましい。
好ましくは、リンカー－Ｌ－は：－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－、－（ＣＨ２）７－、－（ＣＨ２）８－、－（ＣＨ２）９－、－（ＣＨ２）１０－、－ＣＦ２－、－（ＣＦ２）２－、－（ＣＦ２）３－、－（ＣＦ２）４－、－（ＣＦ２）５－、－（ＣＦ２）６－、－（ＣＦ２）７－、－（ＣＦ２）８－、－（ＣＦ２）９－、－（ＣＦ２）１０－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）３－Ｏ－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）２－Ｏ－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｏ－（ＣＨ２）４－、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｄ－Ｌｃ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－；から選択され、
－Ｌａ－は：－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＦ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２－、－（ＣＲ１０Ｒ１１）ｏ－、
Figure 0007296459000004
 から選択され；
－Ｌｂ－及び－Ｌｃ－は、互いに独立に：－Ｏ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－、－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－ＮＲ９－、－ＮＲ１８－、－ＳＯ２－、
Figure 0007296459000005
 から選択され；
－Ｌｄ－は、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＲ１２Ｒ１３）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－、
Figure 0007296459000006
 を表し；
－Ｌｅ－は：－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－、－（ＣＲ１４Ｒ１５）ｐ１－、－（ＣＲ１４Ｒ１５）ｐ１－Ｏ－（ＣＲ２１Ｒ２２）ｐ２－、
Figure 0007296459000007
 から選択され；
Ｒ９及びＲ１８は、互いに独立に：－ＣＨ３、－Ｃ２Ｈ５、－Ｃ３Ｈ７及び－Ｃ（Ｏ）ＣＨ３；から選択され；
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１及びＲ２２は、互いに独立に：－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－ＣＨ３、－Ｃ２Ｈ５、－Ｃ３Ｈ７、－Ｃ５Ｈ９、－Ｃ６Ｈ１３、－ＯＣＨ３、－ＯＣ２Ｈ５、－ＣＨ２Ｆ、－ＣＨＦ２、－ＣＦ３、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ２、－ＳＣＨ３、－ＳＣ２Ｈ５、－ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、－Ｎ（ＣＨ３）２及び－Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２；から選択され；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数である。
より好ましくは、－Ｌ－は、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－又は－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－を表し；
－Ｌａ－は、－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－又は、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２を表し；
－Ｌｂ-は－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－は、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＨ（ＯＨ））ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－を表し；
－Ｌｅ－は、－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－又は－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－を表し；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
最も好ましくは、式（Ｉ）のサッカライドは：
Figure 0007296459000008
 （Ｒ’は、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表し；
Ｘは、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＮ、－ＮＯ２又は－Ｓａｃを表す。）からなる群より選択される基－Ｏ－Ｌ－Ｅを有する。
リンカーＬは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩサッカライドの繰り返し単位又はそのフラグメント：
Figure 0007296459000009
 を有してもよい。
従って、リンカーＬは、好ましくは、下記の構造の１つから選択される：
Figure 0007296459000010
Figure 0007296459000011
Figure 0007296459000012
Figure 0007296459000013
Figure 0007296459000014
Figure 0007296459000015
Figure 0007296459000016
 からなる群より選択される基－Ｏ－Ｌ－Ｅ、又は、
好ましくはこの基のジスルフィド
Figure 0007296459000017
 を有する式（Ｉ）のサッカライドも好ましい。
本発明のサッカライドは吸湿性であってもよく、その種々の水和物を形成することができる。好ましくは、サッカライドに対する水分子のモル比は、１から２０、より好ましくは１から１０、最も好ましくは５－１０の範囲内である。
本発明のサッカライドは塩基性及び／又は酸性置換基を担持し、有機又は非有機酸又は塩基と塩を形成してもよい。
そのような酸付加塩形成の適切な酸の例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、ｐ－アミノサリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、スルホン酸、ホスホン酸、過塩素酸，硝酸、ギ酸、プロピオン酸、グルコン酸、乳酸、酒石酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、フェニル酢酸、安息香酸、ｐ－アミノ安息香酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、亜硝酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、エチレンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフチルスルホン酸、スルファニル酸、カンファースルホン酸、キナ酸（ｃｈｉｎａ ａｃｉｄ）、マンデル酸、ｏ－メチルマンデル酸、水素－ベンゼンスルホン酸、ピクリン酸、アジピン酸、ｄ－ｏ－トリル酒石酸、タルトロン酸、（ｏ、ｍ、ｐ）－トルイル酸、ナフチルアミンスルホン酸、及び当業者によく知られた他の鉱酸又はカルボン酸である。塩は、遊離塩基形態を十分量の所望の酸と接触させて、従来の方法で塩を精製させることにより製造される。
適切な無機又は有機塩基の例は、例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、水酸化テトラアルキルアンモニウム、リシン又はアルギニン等である。塩は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて、例えば、一般式（Ｉ）の化合物の溶液を上記の群から選択した塩基の溶液で処理することにより、従来の方法で製造してよい。
一般式（Ｉ）のサッカライドが、－Ｏ－Ｏ－結合及び又はアノマー若しくはＣ－１炭素を介して互いに接続若しくは結合した糖フラグメントを有していないことは、炭水化物化学分野の当業者には明らかである。
驚くべきことに、一般式（Ｉ）のサッカライドは、免疫原性保護エピトープを有し、ヒト及び／又は動物ホストにおいてＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に対する保護免疫応答を誘発することができることが見出された。一般式（Ｉ）のサッカライドは、天然Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ細胞表面サッカライドと交差反応し、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌を特異的に認識し、食細胞による殺害のためにそれらをオプソニン化し、それによりＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に対する保護を付与する抗体を誘導する。
驚くべきことに、一般式（Ｉ）のサッカライドは、酸性水性媒体、塩基性水性媒体並びに一般的に使用されるアジュバントであるアルハイドロゲル等の、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムを含む懸濁液中において安定であることも見出された。天然Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩサッカライドは、酸性水性媒体中、塩基性水性媒体中、又は、アルミニウム塩の存在下において、１日以内に加水分解するが、一般式（Ｉ）のサッカライド並びにその結合体は、高温下でも数日にわたって安定である。安定性の増大は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するワクチンにおけるそれらの使用に特に有利である。従って、一般式（Ｉ）のサッカライド並びにその結合体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する貯蔵安定性液体ワクチン製剤に特に有用であり、周囲温度で貯蔵することができる。
本発明のサッカライドは、純度及び製造容易性に関し、細菌源から産生されるサッカライド及びその結合体に関連するすべての課題を克服する。第一に、細胞壁サッカライドの製造には増殖条件の最適化が必要である。第二に、構成モノサッカライドの構造的完全性が維持される脱重合化条件を見つける必要がある。最後に、既定の長さ及び構造の純粋なサッカライドの単離を可能にする精製条件を決定する必要がある。さらに、細胞ポリサッカライド、核酸、脂質及びタンパク質等の通常の混入物、加えて脱重合化工程により得られた望ましくないサッカライドを除去しなければならない。従って、細菌源からの既定の構造及び長さの純粋なサッカライドの製造は、長く、ほとんど不可能なプロセスである。
Ｔ＊－がホスフェート基（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又は－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－）（ＯＨ）又は－ＰＯ３ ２－）を表す、式（Ｉ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の合成サッカライドが好ましい。従って、本発明は、
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数であり；
Ｔ＊－がホスフェート基を表し、すなわちＴ＊－が、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又は－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－）（ＯＨ）又は－ＰＯ３ ２－を表し；
Figure 0007296459000018
 Ｌがリンカー、好ましくは本明細書に開示されるリンカーを表し；
他の置換基が本明細書に定義される意味を有する；
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のサッカライドをも対象とする。
Ｔ＊－が、水素又はホスフェート基（－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又は－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－）（ＯＨ）又は－ＰＯ３ ２－）を表す、式（Ｉ）の合成サッカライドが好ましい。従って、本発明は、
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数であり；
Ｔ＊－が、－Ｈ又はホスフェート基を表し、すなわち、Ｔ＊－が、－Ｈ又は－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又は－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ－）（ＯＨ）又はＯ３ ２－を表し；
Figure 0007296459000019
 Ｌがリンカーを表し；
Ｅが、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’が、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す；
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のサッカライドをも対象とする。
一般式（ＩＩ）の合成サッカライドが好ましい。
Figure 0007296459000020
 （ｎ、Ｌ、Ｅ及びＴ＊は、本明細書に定義した意味を有する。）
従って、ｎ、Ｌ及びＥが本明細書に定義した意味を有する、一般式（ＩＩ－ａ）又は（ＩＩ－ｂ）のサッカライドが特に好ましい。
Figure 0007296459000021
 一般式（ＩＩＩ）の合成サッカライドもまた好ましい。
Figure 0007296459000022
 （式中、ｎ、Ｌ、Ｅ及びＴ＊は本明細書に定義した意味を有する。）
従って、ｎ、Ｌ及びＥが本明細書に定義した意味を有する、一般式（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドが特に好ましい。
Figure 0007296459000023
 ｎは、好ましくは１から１０、より好ましくは１から６、より好ましくは１から３、なおより好ましくは１から２より選択される整数を表す。従って、ｎが１から２より選択される整数を表す、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドが特に好ましい。
好ましくは、リンカー－Ｌ－は、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－又は－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－を表し；
－Ｌａ－は、－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２を表し；
－Ｌｂ－は－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－は、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＨ（ＯＨ））ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－を表し；
－Ｌｅ－は、－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－又は－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－を表し；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
従って、
－Ｌ－が、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－又は－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－を表し；
－Ｌａ－が、－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２を表し；
－Ｌｂ－が、－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＨ（ＯＨ））ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－を表し；
－Ｌｅ－が、－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－又は－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－を表し；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のいずれか１つのサッカライドが特に好ましい。
－Ｌ－が：－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－及び－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－から選択され；
－Ｌａ－が：－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２から選択され；
－Ｌｂ－が－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が：－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－から選択され；
－Ｌｅ－が：－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－及び－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－から選択され；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；ｎが１を表す；
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のいずれか１つのサッカライドもまた好ましい。
なおより好ましくは、－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドである。
－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり、ｎが１から２より選択される整数を表す、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドもまた好ましい。
最も好ましい態様において、－Ｏ－Ｌ－Ｅは、
Figure 0007296459000024
 （Ｒ’は、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す。）；からなる群より選択され：
Ｘは、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＮ、－ＮＯ２又は－ＳＡｃを表す。
基－Ｏ－Ｌ－Ｅが、
Figure 0007296459000025
Figure 0007296459000026
Figure 0007296459000027
Figure 0007296459000028
Figure 0007296459000029
 からなる群より選択される：一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドもまた好ましい。
－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり、Ｅがアミノ基を表す、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドもまた好ましい。
好ましくは、ｎが１であり、Ｅがアミノ基である、式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。より好ましくは、ｎが１であり、Ｅがアミノ基であり、リンカー－Ｌ－が、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－又は－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－を表し；
－Ｌａ－が、－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２を表し；
－Ｌｂ－が－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＨ（ＯＨ））ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－を表し；
－Ｌｅ－が、－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－又は－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－を表し；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である、式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。
特に好ましくは、ｎが１であり、Ｅがアミノ基であり、リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数である、式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。なおより好ましくは、ｎが１であり、Ｅがアミノ基であり、リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である、式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。
好ましくは、ｎが２であり、Ｅがアミノ基である、式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。より好ましくは、ｎが２であり、Ｅがアミノ基であり、リンカー－Ｌ－が、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－又は－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－を表し；
－Ｌａ－が、－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２を表し；
－Ｌｂ－が－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＨ（ＯＨ））ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－を表し；
－Ｌｅ－が、－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－又は－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－を表し；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。
特に好ましくは、ｎが２であり、Ｅがアミノ基であり、リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数である、式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。なおより好ましくは、ｎが２であり、Ｅがアミノ基であり、リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である、式（ＩＩ－ｂ）の合成サッカライドである。
なお別の好ましい態様において、本発明のサッカライドは、下記からなる群より選択される：
Figure 0007296459000030
Figure 0007296459000031
Figure 0007296459000032
Figure 0007296459000033
Figure 0007296459000034
Figure 0007296459000035
Figure 0007296459000036
Figure 0007296459000037
Figure 0007296459000038
Figure 0007296459000039
Figure 0007296459000040
Figure 0007296459000041
Figure 0007296459000042
Figure 0007296459000043
Figure 0007296459000044
Figure 0007296459000045
Figure 0007296459000046
 特に好ましくは、Ｚが
Figure 0007296459000047
 を表す、式（Ｉ’ａ－４）のサッカライドである。
特に好ましくは、Ｚが
Figure 0007296459000048
 を表す、式（Ｉ’ｂ－４）のサッカライドである。
化学合成
本発明の別の側面は一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法を対象とし、
Figure 0007296459000049
 （式中、ｎは１であり；
Ｔ＊－は、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚは、
Figure 0007296459000050
 を表し；
Ｌはリンカーを表し；
Ｅは、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’は、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す。）；
上記合成方法は下記の工程を有する：
Ａ１） 式１＊のモノサッカライドを提供する工程：
Figure 0007296459000051
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；及び
Ａ２） 式１＊のモノサッカライドを式２＊の化合物と反応させて、化合物３＊を得る工程：
Figure 0007296459000052
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４－Ｐ１０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ２は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ３） 化合物３＊の保護基Ｐ５の除去を行って、化合物４＊を得る工程
Figure 0007296459000053
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ４） 化合物４＊をモノサッカライド５＊と反応させて、化合物６＊を得る工程
Figure 0007296459000054
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ３は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ５） 化合物６＊の保護基Ｐ１３の除去を行って、化合物７＊を得る工程
Figure 0007296459000055
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ６） 化合物７＊をモノサッカライド８＊と反応させて、化合物９＊を得る工程
Figure 0007296459000056
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４－Ｐ１７及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ４は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ７） 化合物９＊の保護基Ｐ１５の除去を行って、化合物１０＊を得る工程
Figure 0007296459000057
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１７及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ８） 化合物１０＊をモノサッカライド１１＊と反応させて、化合物１２＊を得る工程
Figure 0007296459000058
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ５は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ９） 任意で、化合物１２＊の保護基Ｐ２１の除去を行って化合物１３＊を得、化合物１３＊をリン酸化剤と反応させて化合物１４＊を得る工程
Figure 0007296459000059
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ａ１０） 化合物１２＊又は１４＊の保護されたアミノ基を対応するアセトアミド基に変換して、化合物１５＊又は１６＊を得る工程
Figure 0007296459000060
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；及び
Ａ１１） 化合物１５＊又は１６＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物１７＊又は１８＊を得る工程。
Figure 0007296459000061
 本発明の別の側面は、工程Ａ６’を行うことにより、化合物７＊から直接中間体１２＊を得る、一般式（Ｉ）のサッカライド１７＊又は１８＊の合成を対象とする。
Ａ６’） 化合物７＊をジサッカライド１９＊と反応させて、化合物１２＊を得る工程
Figure 0007296459000062
 （式中、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２１は保護基を表し、ＬＧ６は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）。
従って、態様の１つにおいて、一般式（Ｉ）のサッカライド１７＊又は１８＊の合成方法は、工程Ａ１）、Ａ２）、Ａ３）、Ａ４）、Ａ５）、Ａ６’）、Ａ９）、Ａ１０）及びＡ１１）を有する。
本発明の別の側面は、工程Ａ２’を行うことにより、化合物１＊から直接ヘキササッカライド中間体１２＊を得る、一般式（Ｉ）のサッカライド１７＊又は１８＊の合成を対象とする。
Ａ２’） 化合物１をペンタサッカライド２０＊と反応させて、化合物１２＊を得る工程
Figure 0007296459000063
 （式中、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２１は保護基を表し、ＬＧ７は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）ペンタサッカライド２０＊は、化合物２＊をその後化合物５＊と、次いで化合物８＊と、その後化合物１１＊と反応させることから、又は、化合物２＊を化合物５＊と、その後化合物１９＊と反応させることにより得ることができる。
従って、態様の１つにおいて、一般式（Ｉ）のサッカライド１７＊又は１８＊の合成方法は、工程Ａ１）、Ａ２’）、Ａ９）、Ａ１０）及びＡ１１）を有する。
化合物１＊は、工程Ａ１ａ）、Ａ１ｂ）及びＡ１ｃ）により、対応する保護されたマンノース供与体（ｄｏｎｏｒ）２１＊から得てもよい。
Ａ１ａ） 化合物２１＊を提供し、
Figure 0007296459000064
 （式中、Ｐ１－Ｐ４は保護基を表し、ＬＧ１は、脱離基を表す。）；式２１＊の化合物を式２２＊のアルコールに変換する工程
Figure 0007296459000065
 （式中、Ｐ１－Ｐ４は保護基を表す。）；
Ａ１ｂ） 式２２＊の化合物をリン酸化剤の存在下でアルコールＨＯ－Ｌ－Ｃと反応させて、化合物２３＊を得る工程；
Figure 0007296459000066
 （式中、Ｐ１－Ｐ４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表す。）；及び
工程Ａ１ａ）のアルコール２２＊は、Ｌｅｗｉｓ酸（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１９８２、１０４、４９７６；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８５、２６、１４７９）の存在下で、化合物２１＊をアリルトリメチルシランと反応させ、その後、ビス（ベンゾニトリル）パラジウム（ＩＩ）クロリドを用いて還流トルエン中でプロペニルＣ－マンノシドに異性化し、過ヨウ素酸ナトリウム及び四酸化オスミウムを用いてオゾン分解又はＬｅｍｉｅｕｘ－Ｊｏｈｎｓｏｎ酸化し、ナトリウムアセトキシボロヒドリドを用いてアルコール２２＊に還元する（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ ２０１６、１４、３９１３も参照されたい。）、ことにより、Ｂｒｏｏｋｓら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５、５１、７９９９）に従って製造してもよい。
あるいは、工程Ａ１ａ）のアルコール２２＊は、ヨウ化銅（Ｉ）の存在下で、化合物２１＊を（ｉＰｒＯ）Ｍｅ２ＳｉＣＨ２ＭｇＣｌと反応させることにより製造してもよい（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４、６、１１９）。さらに、工程Ａ１ａ）のアルコール２２＊は、化合物２１＊をビニルＧｒｉｇｎａｒｄ試薬と反応させ、その後、四酸化オスミウム及び過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化し、ナトリウムアセトキシボロヒドリド等の水素化ホウ素ナトリウム試薬によりアルコール２２＊に還元することにより製造してもよい。
別の態様において、アルコール２２＊は、対応する配糖体から、トリメチルスルホキソニウムヨージド及び水素化ナトリウムと反応させることにより（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２、６７、７４３９）、又は、プロパルギルトリメチルシラン及びＢＦ３・ＯＥｔ２と反応させ、次いで、オゾン分解及び水素化ホウ素ナトリウム還元を行うことにより（Ｓｙｎｌｅｔｔ ２００５、７、１１４７）得られる。
Ａ１ｃ） 化合物２３＊の保護基Ｐ２の除去を行って、化合物１＊を得る工程
本発明の別の側面は、
ｎが、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数であり；
Ｔ＊－が、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚが、
Figure 0007296459000067
 を表し；
Ｌがリンカーを表し；
Ｅが、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’が、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す；
一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法を対象とし、
上記合成方法は下記の工程を有する：
Ｂ１） 化合物１３＊を提供する工程
Figure 0007296459000068
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；
及び、下記の工程をｎ－１回繰り返すか：
Ｂ１．１） リン酸化剤の存在下で、式２２＊の化合物と反応させる工程；
Ｂ１．２） 保護基Ｐ２の除去を行う工程；
Ｂ１．３） 工程Ａ２）－Ａ８）、又は、工程Ａ２）－Ａ５）及びＡ６’）、又は、工程Ａ２’）を行う工程；
Ｂ１．４） 保護基Ｐ２１の除去を行う工程；
又は、
Ｂ２．１） リン酸化剤の存在下で、化合物１３＊を下式の化合物と反応させる工程、
Figure 0007296459000069
 Ｂ２．２） 保護基Ｐ２１の除去を行う工程；
Ｂ２．３） 任意で、工程Ｂ２．１及びＢ２．２を１～８回繰り返して、対応するトリサッカライド（ｎ＝３）～デカサッカライド（ｎ＝１０）を合成する工程；
により化合物２４＊を提供する工程：
Figure 0007296459000070
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｂ２） 任意で、化合物２４＊をリン酸化剤と反応させて化合物２５＊を得る工程
Figure 0007296459000071
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｂ３） 化合物２４＊又は２５＊の保護されたアミノ基を対応するアセトアミド基に変換して、化合物２６＊又は２７＊を得る工程
Figure 0007296459000072
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｂ４） 化合物２６＊又は２７＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物２８＊又は２９＊を得る工程
Figure 0007296459000073
 （式中、ｎは２～１０からの整数を表し、Ｌ及びＥは本明細書に定義した意味を有する。）。
本発明の別の側面は一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法を対象とし、
Figure 0007296459000074
 （式中、
ｎは１であり；
Ｔ＊－は、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚは、
Figure 0007296459000075
 を表し；
Ｌはリンカーを表し；
Ｅは、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’は、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す。）；
上記合成方法は下記の工程を有する：
Ｃ１） Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１５、２１、７５１１－７５１９又はＳｙｎｌｅｔｔ、２００５、７、１１４７－１１５１に開示される手順に従って得ることができる式３０＊のモノサッカライドを提供する工程：
Figure 0007296459000076
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；及び
Ｃ２） 式３０＊のモノサッカライドを式２＊の化合物と反応させて、化合物３１＊を得る工程：
Figure 0007296459000077
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４－Ｐ１０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ２は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ３） 化合物３１＊の保護基Ｐ５の除去を行って、化合物３２＊を得る工程
Figure 0007296459000078
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ４） 化合物３２＊をモノサッカライド５＊と反応させて、化合物３３＊を得る工程
Figure 0007296459000079
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ３は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ５） 化合物３３＊の保護基Ｐ１３の除去を行って、化合物７＊を得る工程
Figure 0007296459000080
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ６） 化合物３４＊をモノサッカライド８＊と反応させて、化合物３５＊を得る工程
Figure 0007296459000081
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４－Ｐ１７及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ４は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ７） 化合物３５＊の保護基Ｐ１５の除去を行って、化合物３６＊を得る工程
Figure 0007296459000082
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１７及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ８） 化合物３６＊をモノサッカライド１１＊と反応させて、化合物３７＊を得る工程
Figure 0007296459000083
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ＬＧ５は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ９） 任意で、化合物３７＊の保護基Ｐ２１の除去を行って化合物３８＊を得、化合物３８＊をリン酸化剤と反応させて化合物３９＊を得る工程
Figure 0007296459000084
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ１０） 化合物３７＊又は３９＊の保護されたアミノ基を対応するアセトアミド基に変換して、化合物４０＊又は４１＊を得る工程
Figure 0007296459000085
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；及び
Ｃ１１） 化合物４０＊又は４１＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物４２＊又は４３を得る工程＊
Figure 0007296459000086
 本発明の別の側面は、工程Ａ６’）を行うことにより、化合物３４＊から直接ヘキササッカライド中間体３７＊を得る、一般式（Ｉ）のサッカライド４２＊又は４３＊の合成を対象とする。従って、態様の１つにおいて、一般式（Ｉ）のサッカライド４２＊又は４３＊の合成方法は、工程Ｃ１）、Ｃ２）、Ｃ３）、Ｃ４）、Ｃ５）、Ａ６’）、Ｃ９）、Ｃ１０）及びＣ１１）を有する。
本発明の別の側面は、工程Ａ２’を行うことにより、化合物３０＊から直接ヘキササッカライド中間体３７＊を得る、一般式（Ｉ）のサッカライド４２＊又は４３＊の合成を対象とする。従って、態様の１つにおいて、一般式（Ｉ）のサッカライド４２＊又は４３＊の合成方法は、工程Ｃ１）、Ａ２’）、Ｃ９）、Ｃ１０）及びＣ１１）を有する。
従って、一般式（Ｉ）のサッカライドの別の合成方法は下記の工程を有する：
Ｃ１） 式３０＊のモノサッカライドを提供する工程：
Figure 0007296459000087
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；及び
Ｃ２’） 化合物３０＊をペンタサッカライド２０＊と反応させて、化合物３７＊を得る工程
Figure 0007296459000088
 （式中、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２１は保護基を表し、ＬＧ７は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）、
Ｃ９） 任意で、化合物３７＊の保護基Ｐ２１の除去を行って化合物３８＊を得、化合物３８＊をリン酸化剤と反応させて化合物３９＊を得る工程
Figure 0007296459000089
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｃ１０） 化合物３７＊又は３９＊の保護されたアミノ基を対応するアセトアミド基に変換して、化合物４０＊又は４１＊を得る工程
Figure 0007296459000090
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；及び
Ｃ１１） 化合物４０＊又は４１＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物４２＊又は４３＊を得る工程
Figure 0007296459000091
 （式中、Ｌ及びＥは本明細書に定義した意味を有する。）、
化合物３０＊は、対応する保護されたマンノースドナー２１＊から、工程Ａ１ａ）、Ｃ１ｂ）、Ｃ１ｃ）及びＣ１ｄ）により得てもよい。
Ｃ１ｂ） 式２２＊の化合物を対応するハロゲン化物４４＊に変換する工程
Figure 0007296459000092
 （式中、Ｐ１－Ｐ４は保護基を表し、Ｈａｌは－Ｂｒ又は－Ｉから選択される。）；及び
Ｃ１ｃ） 式４４＊の化合物をホスファイト（ｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）の存在下でアルコール ＨＯ－Ｌ－Ｃと反応させて、化合物４５＊を得る工程；
Figure 0007296459000093
 （式中、Ｐ１－Ｐ４及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表す。）；及び
Ｃ１ｄ） 化合物４５＊の保護基Ｐ２の除去を行って、化合物３０＊を得る工程。
工程Ｃ１ｂ）におけるアルコール２２＊の対応するハロゲン化物４４＊への変換は、標準的手順に従って、すなわち、アルコール２２＊をＰＰｈ３の存在下でＣＢｒ４又はＩ２と反応させるか、又は、あるいはアルコール２２＊をメタンスルホネート又はトリフルオロメタンスルホネートに変換し、次いで、臭化テトラブチルアンモニウム又はヨウ化テトラブチルアンモニウムを用いて置換することにより行うことができる。
工程Ｃ１ｃ）において用いられるホスファイトは、好ましくはトリエチルホスファイト等のトリアルキルホスファイトであり、これは、ハロゲン化物４４＊と反応してホスホネートとなり、次いでブロモトリメチルシラン等のＬｅｗｉｓ酸、次いで水でホスホン酸に加水分解される（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５、５１、７９９９）。ホスホン酸は、トリクロロアセトニトリルの存在下でアルコールＨＯ－Ｌ－Ｃと反応し、化合物４５＊が得られる。
あるいは、工程Ｃ１ｃ）において用いられるホスファイトは、ジアルキル若しくはジベンジル Ｎ，Ｎ－ジエチルホスホロアミダイト等のホスホロアミダイト、又は、ビス（ジイソプロピルアミノ）ベンジルオキシホスフィンであってもよく、これは、Ａｒｂｕｚｏｗ反応において化合物４４＊と、及び、ジエチルアミンの放出下でアルコールＨＯ－Ｌ－Ｃと反応する。
本発明の別の側面は、
ｎが、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数であり；
Ｔ＊－が、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚが、
Figure 0007296459000094
 を表し；
Ｌがリンカーを表し；
Ｅが、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’が、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す；
一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法を対象とし、
上記合成方法は下記の工程を有する：
Ｄ１） 化合物３８＊を提供する工程
Figure 0007296459000095
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；
及び、下記の工程をｎ－１回繰り返すか：
Ｄ１．１） ホスファイトの存在下で、式４４＊の化合物と反応させる工程；
Ｄ１．２） 保護基Ｐ２の除去を行う工程；
Ｄ１．３） 工程Ｃ２）－Ｃ８）、又は、工程Ｃ２）－Ｃ５）及びＡ６’）、又は、工程Ａ２’）を行う工程；
Ｄ１．４） 保護基Ｐ２１の除去を行う工程；
又は、
Ｄ２．１） カップリング剤の存在下で、化合物３８＊を下式の化合物と反応させる工程、
Figure 0007296459000096
 Ｄ２．２） 保護基Ｐ２１の除去を行う工程；
Ｄ２．３） 任意で、工程Ｄ２．１及びＤ２．２を１～８回繰り返して、対応するトリサッカライド（ｎ＝３）～デカサッカライド（ｎ＝１０）を合成する工程；
により化合物４６＊を提供する工程：
Figure 0007296459000097
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｄ２） 任意で、化合物４６＊をリン酸化剤と反応させて、化合物４７＊を得る工程
Figure 0007296459000098
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｄ３） 化合物４６＊又は４７＊の保護されたアミノ基を対応するアセトアミド基に変換して、化合物４８＊又は４９＊を得る工程
Figure 0007296459000099
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｄ４） 化合物４８＊又は４９＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物５０＊又は５１＊を得る工程
Figure 0007296459000100
 （式中、ｎは２～１０からの整数を表し、Ｌ及びＥは本明細書に定義した意味を有する。）。
本発明の別の側面は、
ｎが１であり；
Ｔ＊－が、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚが
Figure 0007296459000101
 を表し；
Ｌがリンカーを表し；
Ｅが、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’が、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す；
一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法を対象とし、
上記合成方法は下記の工程を有する：
Ｅ１） 式５２＊のモノサッカライドを提供する工程：
Figure 0007296459000102
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４及びＰ２５は保護基を表す。）；及び
Ｅ２） 式５２＊のモノサッカライドを式２＊の化合物と反応させて化合物５３＊を得る工程：
Figure 0007296459000103
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４－Ｐ１０及びＰ２５は保護基を表し、ＬＧ２は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｅ３） 化合物５３＊の保護基Ｐ５の除去を行って、化合物５４＊を得る工程
Figure 0007296459000104
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１０及びＰ２５は保護基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｅ４） 化合物５４＊をモノサッカライド５＊と反応させて化合物５５＊を得る工程
Figure 0007296459000105
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４及びＰ２５は保護基を表し、ＬＧ３は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｅ５） 化合物５５＊の保護基Ｐ１３の除去を行って化合物５６＊を得る工程
Figure 0007296459000106
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ２５は保護基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｅ６） 化合物５６＊をジサッカライド１９＊と反応させて、化合物５７＊を得る工程
Figure 0007296459000107
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２５は保護基を表し、ＬＧ６は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｅ７） 化合物５７＊の保護されたアミノ基を対応するアセトアミド基に変換して化合物５８＊を得る工程
Figure 0007296459000108
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ２１及びＰ２５は保護基を表す。）；及び
Ｅ８） 化合物５８＊の保護基Ｐ２５の除去を行って化合物５９＊を得、化合物５９＊をリン酸化剤の存在下でアルコールＨＯ－Ｌ－Ｃと反応させて化合物１５＊を得る工程
Figure 0007296459000109
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２２は保護基を表す。）、及び
Ｅ９） 任意で、化合物１５＊の保護基Ｐ２１の除去を行って化合物６０＊を得、化合物６０＊をリン酸化剤と反応させて化合物１６＊を得る工程
Figure 0007296459000110
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表す。）；及び
Ｅ１０） 化合物１５＊又は１６＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物１７＊又は１８＊を得る工程
Figure 0007296459000111
 本発明の別の側面は、
ｎが、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０から選択される整数であり；
Ｔ＊－が、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚが、
Figure 0007296459000112
 を表し；
Ｌがリンカーを表し；
Ｅが、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’が、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す；
一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法を対象とし、
上記合成方法は下記の工程を有する：
Ｆ１） 化合物６０＊を提供する工程
Figure 0007296459000113
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；
Ｆ２．１） 化合物６０＊をリン酸化剤の存在下で下式の化合物と反応させる工程
Figure 0007296459000114
 Ｆ２．２） 保護基Ｐ２１の除去を行う工程；
Ｆ３） 任意で、工程Ｆ２．１及びＦ２．２をｎ－２回繰り返して対応するトリマー（ｎ＝３）～デカマー（ｎ＝１０）を合成して、化合物２６＊を提供する工程；
Figure 0007296459000115
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｆ４） 任意で、化合物２６＊をリン酸化剤と反応させて化合物２７＊を得る工程
Figure 0007296459000116
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ｎは２～１０からの整数を表す。）；及び
Ｆ５） 化合物２６＊又は２７＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物２８＊又は２９＊を得る工程
Figure 0007296459000117
 （ｎは２～１０からの整数を表し、Ｌ及びＥは本明細書に定義した意味を有する。）。
本発明の別の側面は、
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から選択される整数であり；
Ｔ＊－が、Ｈ－又はホスフェート基を表し；
Ｚが、
Figure 0007296459000118
 を表し；
Ｌがリンカーを表し；
Ｅが、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
Ｒ’が、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表す；
一般式（Ｉ）のサッカライドの合成方法を対象とし、
上記合成方法は下記の工程を有する：
Ｇ１） 式５２＊のモノサッカライドを提供する工程：
Figure 0007296459000119
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４及びＰ２５は保護基を表す。）；及び
Ｇ２） 式５２＊のモノサッカライドを式２＊の化合物と反応させて化合物３＊を得る工程：
Figure 0007296459000120
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４－Ｐ１０及びＰ２５は保護基を表し、ＬＧ２は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｇ３） 化合物５３＊の保護基Ｐ５の除去を行って化合物５４＊を得る工程
Figure 0007296459000121
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１０及びＰ２５は保護基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｇ４） 化合物５４＊をモノサッカライド５＊と反応させて化合物５５＊を得る工程
Figure 0007296459000122
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１４及びＰ２５は保護基を表し、ＬＧ３は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｇ５） 化合物５５＊の保護基Ｐ１３の除去を行って化合物５６＊を得る工程
Figure 0007296459000123
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ２５は保護基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｇ６） 化合物５６＊をジサッカライド１９＊と反応させて化合物５７＊を得る工程
Figure 0007296459000124
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４及びＰ１６－Ｐ２５は保護基を表し、ＬＧ６は脱離基を表し、Ｎｐは保護されたアミノ基を表す。）；及び
Ｇ７） 化合物５７＊の保護されたアミノ基を対応するアセトアミド基に変換して化合物５８＊を得る工程
Figure 0007296459000125
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ２１及びＰ２５は保護基を表す。）；及び
Ｇ８） 化合物５８＊の保護基Ｐ２５の除去を行って化合物５９＊を得、化合物５９＊をリン酸化剤の存在下でアルコールＨＯ－Ｌ－Ｃと反応させて、化合物１５＊を得る工程
Figure 0007296459000126
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２２は保護基を表す。）、及び
Ｇ９） 工程Ｇ９．１及びＧ９．２をｎ－１回繰り返して対応するダイマー（ｎ＝３）～デカマー（ｎ＝１０）を合成する工程；
Ｇ９．１） 保護基Ｐ２１の除去を行う工程；及び
Ｇ９．２） 工程Ｇ９．１）の生成物をリン酸化剤の存在下で下式の化合物と反応させて
Figure 0007296459000127
 化合物６１＊を提供する工程；
Figure 0007296459000128
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２２は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基である。）を表す。）；
Ｇ１０） 任意で、化合物６１＊又は化合物１５＊の保護基Ｐ２１の除去を行って化合物２６＊を得、化合物２６＊をリン酸化剤と反応させて化合物２７＊を得、化合物２６＊を提供する工程
Figure 0007296459000129
 （式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は保護基を表し、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、ｎは１～１０からの整数を表す。）；及び
Ｇ１１） 化合物２６＊又は２７＊からすべての残った保護基の除去を行って、一般式（Ｉ）の化合物２８＊又は２９＊を得る工程
Figure 0007296459000130
 （式中、ｎは１～１０からの整数を表し、Ｌ及びＥは本明細書に定義した意味を有する。）。
Ｅｐは、固体担体又は保護された末端基を表す。Ｅは、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；対応する保護された末端基Ｅｐは、－Ｎ（Ｐ２６）（Ｐ２７）、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－Ｎ（Ｐ２６）（Ｐ２７）、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨＮ（Ｐ２６）（Ｐ２７）、－ＳＰｓ又は－ＳＡｃを表す。
Ｎｐは保護されたアミノ基である。好ましくは、ＮＰは、－Ｎ３、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＣｌ３及び－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＣｌ３（Ｔｒｏｃ）から選択される。
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４、Ｐ２５、Ｐ２６及びＰ２７は保護基を表す。本明細書で使用する「保護基」という用語は、有機合成において通常使用される、好ましくはヒドロキシル基、アミノ基及びチオールの保護に使用される基を意味する。
保護基Ｐ２１は、分子内に存在する他の保護基が安定な条件下で除くことができることが好ましい。
アミノ保護基は、好ましくは、分子内に存在するヒドロキシル保護基を除くのに適用される条件下で安定である。
ヒドロキシル保護基、好ましくは保護基Ｐ２１以外は、好ましくは水素化により除くことができる。
より好ましくは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４及びＰ２５は、ヒドロキシル基の適切な保護基であり、より好ましくは脱保護反応の適切なシークエンスにより後に順次除くことができるヒドロキシル基の異なる適切な保護基である。ヒドロキシル基の好ましい保護基は、アセチル、フェニル、ベンジル、イソプロピリデン、ベンジリデン、ベンゾイル、ｐ－メトキシベンジル、ｐ－メトキシベンジリデン、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－ブロモベンジリデン、ｐ－ニトロフェニル、アリル、アセチル、イソプロピル、ｐ－ブロモベンジル、ジメトキシトリチル、トリチル、２－ナフチルメチル、ピバロイル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルメトキシ－フェニルシリル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、２－トリメチルシリルエトキシメチル、９－フルオレニル－メトキシカルボニル、ベンジルオキシメチル、メチルオキシメチル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシメチル、メトキシエチルオキシメチル、レブリノイル、ナフチリデン、クロロアセチル、ピコロイル（ｐｉｃｏｌｏｙｌ）、テキシルジメチルシリル（ＴＤＳ）、（２－ニトロフェニル）アセチル（ＮＰＡｃ）、２－（アジドメチル）ベンゾイル（ＡｚｍＢ）である。
保護基は常設（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）保護基と一時的（ｔｅｍｐｏｒａｒｙ）保護基に区別することができる。常設保護基は、合成の全体において安定であり、合成の後段階で効果的に除くことができる保護基である。この場合、常設保護基は、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０、Ｐ２２－Ｐ２６を含む。Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４は合成の全体においてヒドロキシル基をマスクしており、保護基Ｐ２６及びＰ２７は末端基Ｅｐ中に存在する末端アミノ基をマスクしている。好ましくは保護基Ｐ３、Ｐ４、Ｐ８－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４はベンジル基であり、保護基Ｐ１はベンゾイル基であり、保護基Ｐ７及びＰ１８はアセチル基であり、保護基Ｐ２６はベンジル基であり、保護基Ｐ２７はベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）である。
一時的保護基は一般にオルトゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基であり、合成の異なるレベルで選択的に除くことができ、モノサッカライド、他の保護基又は分子上に存在する他の残基を含む異なる置換基のその後の導入のためにヒドロキシル基を開放する。この場合、一時的保護基はＰ２、Ｐ５、Ｐ１３、Ｐ１５、Ｐ２１及びＰ２５を含む。
一時的保護基Ｐ２、Ｐ５、Ｐ１３、Ｐ１５、Ｐ２１及びＰ２５は、好ましくは、アリル、ｐ－メトキシベンジル、２－ナフチルメチル、トリ－イソプロピルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルメトキシフェニルシリル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、２－トリメチルシリルエトキシメチル、９－フルオレニルメトキシカルボニル、テキシルジメチルシリル、（２－ニトロフェニル）アセチル、２－（アジドメチル）ベンゾイル及びレブリノイルから選択されるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、保護基Ｐ２、Ｐ５、Ｐ１３、Ｐ１５、Ｐ２１及びＰ２５は、保護基Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０、Ｐ２２－Ｐ２４の存在下で選択的に除くことができる。好ましくは、Ｐ２、Ｐ５、Ｐ１３、Ｐ１５、Ｐ２１及びＰ２５は、９－フルオレニルメトキシカルボニル又はレブリノイルである。好ましい態様において、保護基Ｐ１３及びＰ２１は９－フルオレニルメトキシカルボニルを表し、保護基Ｐ１、Ｐ５及びＰ１５はレブリノイルを表す。好ましくは、Ｐ２１は、トリ－イソプロピルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルメトキシフェニルシリルから選択される。好ましくは、Ｐ２５は２－ナフチルメチルである。
保護基を巧みに選択することにより、免疫原性担体又は固体担体へのその後の結合のために、末端基で官能化された一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドのライブラリーへの簡便なアクセスが可能になる。さらに、脱離基の選択は、工程Ａ１ａ）、Ａ２）、Ａ２’）、Ａ４）、Ａ６）、Ａ６’）、Ａ８）、Ｂ１．３）、Ｃ２）、Ｃ４）、Ｃ６）、Ｃ８）、Ｄ１．３）、Ｅ２）、Ｅ４）及びＥ６）におけるグリコシル化反応の立体化学的帰結に影響する。
構成要素（Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋｓ）２＊、５＊、８＊、１１＊、１９＊、２０＊及び２１＊はグリコシル化剤である。本明細書で使用されるグリコシル化剤という用語は、アノマー位において脱離基で官能化されたモノサッカライドを意味し、上記脱離基は、適切な活性化剤による活性化により、オキソカルベニウム中間体を与え、ヒドロキシル基等の求核剤と反応することができる。従って、グリコシル化剤２＊、５＊、８＊、１１＊、１９＊、２０＊及び２１＊は、アノマー位において脱離基ＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４、ＬＧ５、ＬＧ６及びＬＧ７で官能化されている。本発明の合成に適切な脱離基の例は炭水化物化学の当業者に周知であり、ハライド、チオエーテル、イミデート、アセテート及びホスフェートを含む。
好ましくは、脱離基ＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４、ＬＧ５、ＬＧ６及びＬＧ７は、ハロゲン（－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｆ、－Ｉ）、－Ｏ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＣＣｌ３、－Ｏ－Ｃ（＝ＮＰｈ）－ＣＦ３、－ＯＡｃ、－ＳＲＬ、－ＳＯ-ＲＬ、－ＳＯ－Ｐｈ、－ＳＯ－ＣＨ２－Ｐｈ、－ＳＯ－Ｔｏｌ、－ＳＯ－Ｃ６Ｈ４－（パラ－ＯＣＨ３）、－Ｏ－（ＣＨ２）３－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｏ－Ｐ（ＯＲＬ）２、－Ｏ－ＰＯ（ＯＲＬ）２、－Ｏ－ＣＯ－ＯＲＬ、－Ｏ－ＣＯ－ＳＲＬ、－Ｏ－ＣＳ－ＳＲＬ、
Figure 0007296459000131
 －Ｏ－ＣＳ－ＯＲＬ（ＲＬは、任意のアルキル又はアリール基、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、フェニル又はトルイルであってよい。）から選択される。
好ましくは、脱離基ＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４、ＬＧ５、ＬＧ６及びＬＧ７は、下記からなる脱離基の群より選択される：ＳＢｏｘ、ＳＴａｚ、
Figure 0007296459000132
 （式中、チオエーテルは置換されていてもよい。）。
上記のように、オキソカルベニウム中間体の提供は、グリコシル化剤のアノマー位に適宜な又は適切な活性化剤を用いて導入された脱離基の活性化に依拠する。当業者の技術常識であるが、ホスフェート（すなわちホスフェート活性化剤）及びイミデート（すなわちイミデート活性化剤）に対する適切な活性化剤は、トリフルオロメタンスルホン酸シリル（シリルトリフレート（ｓｉｌｙｌ ｔｒｉｆｌａｔｅ））又はトリフルオロメタンスルホン酸銀（ｓｉｌｖｅｒ ｔｒｉｆｌａｔｅ）等のＬｅｗｉｓ酸であり、チオエーテルに対する適切な活性化剤、すなわちチオエーテル活性化剤は：ＮＩＳ／ＴｆＯＨ、ＮＩＳ／ＴＭＳＯＴｆ、ＮＩＳ／ＢＦ３ ．Ｅｔ２Ｏ、ＮＩＳ／ＡｇＯＴｆ、ＤＭＴＳＴ／Ｔｆ２Ｏ、ＩＤＰＣ、ＢＳＰ／Ｔｆ２Ｏ、Ｐｈ２ＳＯ／Ｔｆ２Ｏを含むが、これらに限定されるものではない。シリルトリフレートの例には、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルトリフルオロメタンスルホネート、トリイソプロピルトリフルオロメタンスルホネートが含まれるが、これらに限定されるものではない。
好ましくは、ＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４、ＬＧ５、ＬＧ６及びＬＧ７はチオエーテルであり、なおより好ましくは、ＬＧ１、ＬＧ２、ＬＧ３、ＬＧ４、ＬＧ５、ＬＧ６及びＬＧ７が下記からなる群より選択される場合である：
Figure 0007296459000133
 工程Ａ１ａ）、Ａ２）、Ａ２’）、Ａ４）、Ａ６）、Ａ６’）、Ａ８）、Ｂ１．３）、Ｃ２）、Ｃ４）、Ｃ６）、Ｃ８）、Ｄ１．３）、Ｅ２）、Ｅ４）及びＥ６）におけるサッカライド間のカップリング反応は、非極性溶媒及び極性非プロトン性溶媒の混合物中で、－１０℃から１０℃の間の温度で、ＮＩＳ／ＴｆＯＨ又はＴＭＳＯＴｆを用いた活性化により行われることが好ましい。なおより好ましくは、当該反応は、約０℃の温度でＮＩＳ／ＴｆＯＨを用いた処理により、非極性溶媒及び極性非プロトン性溶媒の混合物中で行われる。
好ましい極性非プロトン性溶媒は、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル及びジオキサンである。好ましい非極性溶媒は、トルエン、クロロホルム及び塩化メチレン等のハロゲン化溶媒である。好ましい非極性及び極性非プロトン性溶媒の混合物は：塩化メチレン／テトラヒドロフラン、塩化メチレン／ジエチルエーテル、トルエン／ジエチルエーテル、トルエン／テトラヒドロフランである。
工程Ａ１１）、Ｂ４）、Ｃ１１）、Ｄ４）、Ｅ１０）及びＦ５）において行われる保護基Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ６－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０、Ｐ２２－Ｐ２４、Ｐ２６及びＰ２７の除去は下記の通りである：
－ 溶媒混合物中、過酸化水素の存在下、塩基を用いた処理による塩基不安定性保護基の第１開裂。好ましくは、塩基はＮａＯＭｅ又はＬｉＯＨである；及び
－ 溶媒混合物中、パラジウム触媒の存在下、化合物を水素に付すことによる、水素化に感受性の保護基の第２開裂。
工程Ａ９）、Ｂ２）、Ｃ９）、Ｄ２）、Ｅ９）及びＦ２．１）において使用されるリン酸化剤は、化合物中の反応部位に、その遊離形又はモノエステルとしての基Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２を導入することができる化合物である。従って、ホスフェート基は、工程Ａ９）、Ｂ２）、Ｃ９）、Ｄ２）、Ｅ９）及びＦ２．１）においてヒドロキシル基に移る。本発明において使用される好ましいリン酸化剤は、１Ｈ－テトラゾール等の活性化剤並びに過酸化水素又は３－クロロ過安息香酸等の酸化剤によるその後の酸化と組み合わせた、亜リン酸ジフェニル、ビス（ジイソプロピルアミノ）ベンジルオキシホスフィン、ベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホンアミデート又はＮ，Ｎ－ジエチル－１，５－ジヒドロ－３Ｈ－２，３，４－ベンゾジオキサホスフェピン－３－アミンである。好ましい態様において、工程Ａ９）、Ｂ２）、Ｃ９）、Ｄ２）、Ｅ９）及びＦ２．１）では、リン酸化剤は、１Ｈ－テトラゾール及び３－クロロ過安息香酸と組み合わせたビス（ジイソプロピルアミノ）ベンジルオキシホスフィンである。好ましい態様において、工程Ａ９）、Ｂ２）、Ｃ９）、Ｄ２）、Ｅ９）及びＦ２．１）では、リン酸化剤は亜リン酸ジフェニルである。
工程Ａ１ｂ）において使用されるリン酸化剤は、好ましくはビス（ジイソプロピルアミノ）－ベンジルオキシホスフィン、ベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホンアミデート又はＮ，Ｎ－ジエチル－１，５－ジヒドロ－３Ｈ－２，３，４－ベンゾジオキサホスフェピン－３－アミンである。工程Ａ１ｂ）において使用される好ましい活性化剤は、１Ｈ－テトラゾール、４，５－ジシアノイミダゾール、２－ベンジルチオテトラゾール、５－エチルチオテトラゾール、ベンゾイミダゾリウムトリフレート又はイミダゾリウムトリフレートである。最も好ましくは、活性化剤としての１Ｈ－テトラゾールである。酸化反応は、好ましくは、過酸化水素又は３－クロロ過安息香酸等の酸化剤の存在下で行われる。
本発明のさらなる側面は、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドの製造のための中間体化合物に関し、上記中間体化合物は、一般式（Ｉ２ａ）、（Ｉ２ｂ）、（Ｉ２ｃ）、（Ｉ２ｄ）、（Ｉ２ｅ）、（Ｉ２ｆ）、（Ｉ４ａ）、（Ｉ４ｂ）、（Ｉ４ｃ）、（Ｉ４ｄ）、（Ｉ４ｅ）、（Ｉ４ｆ）、（Ｉ４ｇ）、（Ｉ４ｈ）、（Ｉ４ｉ）、（Ｉ４ｊ）、（Ｉ５ａ）、（Ｉ５ｂ）、（Ｉ５ｃ）、（Ｉ５ｄ）、（Ｉ５ｅ）、（Ｉ５ｆ）、（Ｉ５ｇ）、（Ｉ５ｈ）、（Ｉ５ｉ）、（Ｉ５ｊ）、（Ｉ６ａ）、（Ｉ６ｂ）、（Ｉ６ｃ）、（Ｉ６ｄ）、（Ｉ６ｅ）、（Ｉ６ｆ）、（Ｉ６ｇ）、（Ｉ６ｈ）、（Ｉ７ａ）、（Ｉ７ｂ）、（Ｉ７ｃ）、（Ｉ７ｄ）、（Ｉ７ｅ）、（Ｉ７ｆ）、（Ｉ７ｇ）、（Ｉ７ｈ）、（Ｉ７ｉ）、（Ｉ７ｊ）、（Ｉ７ｋ）、（Ｉ７ｍ）、（Ｉ７ｎ）、（Ｉ７ｏ）又は（Ｉ７ｐ）のいずれか１つである：
Figure 0007296459000134
Figure 0007296459000135
Figure 0007296459000136
Figure 0007296459000137
Figure 0007296459000138
Figure 0007296459000139
Figure 0007296459000140
Figure 0007296459000141
Figure 0007296459000142
Figure 0007296459000143
 （式中、Ｃは－Ｌ－Ｅｐ（Ｅｐは固体担体又は保護された末端基Ｅである。）を表し、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４及びＰ２５は保護基を表し、ＮＰは保護されたアミノ基を表し、ＬＧは脱離基を表し、Ｅ及びＬは先に定義したものと同じ意味を有する。）。
より好ましくは、中間体化合物が一般式（Ｉ２ａ）、（Ｉ２ｂ）、（Ｉ２ｃ）、（Ｉ２ｄ）、（Ｉ２ｅ）、（Ｉ２ｆ）、（Ｉ４ａ）、（Ｉ４ｂ）、（Ｉ４ｃ）、（Ｉ４ｄ）、（Ｉ４ｅ）、（Ｉ４ｆ）、（Ｉ４ｇ）、（Ｉ４ｈ）、（Ｉ４ｉ）、（Ｉ４ｊ）、（Ｉ５ａ）、（Ｉ５ｂ）、（Ｉ５ｃ）、（Ｉ５ｄ）、（Ｉ５ｅ）、（Ｉ５ｆ）、（Ｉ５ｇ）、（Ｉ５ｈ）、（Ｉ５ｉ）、（Ｉ５ｊ）、（Ｉ６ａ）、（Ｉ６ｂ）、（Ｉ６ｃ）、（Ｉ６ｄ）、（Ｉ６ｅ）、（Ｉ６ｆ）、（Ｉ６ｇ）、（Ｉ６ｈ）、（Ｉ７ａ）、（Ｉ７ｂ）、（Ｉ７ｃ）、（Ｉ７ｄ）、（Ｉ７ｅ）、（Ｉ７ｆ）、（Ｉ７ｇ）、（Ｉ７ｈ）、（Ｉ７ｉ）、（Ｉ７ｊ）、（Ｉ７ｋ）、（Ｉ７ｍ）、（Ｉ７ｎ）、（Ｉ７ｏ）又は（Ｉ７ｐ）のいずれか１つを有する、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）の中間体化合物である。
式（Ｉ２ａ）、（Ｉ２ｂ）、（Ｉ２ｃ）、（Ｉ２ｄ）、（Ｉ２ｅ）、（Ｉ２ｆ）、（Ｉ４ａ）、（Ｉ４ｂ）、（Ｉ４ｃ）、（Ｉ４ｄ）、（Ｉ４ｅ）、（Ｉ４ｆ）、（Ｉ４ｇ）、（Ｉ４ｈ）、（Ｉ４ｉ）、（Ｉ４ｊ）、（Ｉ５ａ）、（Ｉ５ｂ）、（Ｉ５ｃ）、（Ｉ５ｄ）、（Ｉ５ｅ）、（Ｉ５ｆ）、（Ｉ５ｇ）、（Ｉ５ｈ）、（Ｉ５ｉ）、（Ｉ５ｊ）、（Ｉ６ａ）、（Ｉ６ｂ）、（Ｉ６ｃ）、（Ｉ６ｄ）、（Ｉ６ｅ）、（Ｉ６ｆ）、（Ｉ６ｇ）、（Ｉ６ｈ）、（Ｉ７ａ）、（Ｉ７ｂ）、（Ｉ７ｃ）、（Ｉ７ｄ）、（Ｉ７ｅ）、（Ｉ７ｆ）、（Ｉ７ｇ）、（Ｉ７ｈ）、（Ｉ７ｉ）、（Ｉ７ｊ）、（Ｉ７ｋ）、（Ｉ７ｍ）、（Ｉ７ｎ）、（Ｉ７ｏ）又は（Ｉ７ｐ）において、好ましくは、
リンカー－Ｌ－は、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－又は－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－を表し；
－Ｌａ－は、－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２を表し；
－Ｌｂ－は－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－は、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＨ（ＯＨ））ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－を表し；
－Ｌｅ－は、－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－又は－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－を表し；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
特に好ましい中間体は、－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、ｏが２、５及び６から選択される整数である、式（Ｉ２ａ）、（Ｉ２ｂ）、（Ｉ２ｃ）、（Ｉ２ｄ）、（Ｉ２ｅ）、（Ｉ２ｆ）、（Ｉ４ａ）、（Ｉ４ｂ）、（Ｉ４ｃ）、（Ｉ４ｄ）、（Ｉ４ｅ）、（Ｉ４ｆ）、（Ｉ４ｇ）、（Ｉ４ｈ）、（Ｉ４ｉ）、（Ｉ４ｊ）、（Ｉ５ａ）、（Ｉ５ｂ）、（Ｉ５ｃ）、（Ｉ５ｄ）、（Ｉ５ｅ）、（Ｉ５ｆ）、（Ｉ５ｇ）、（Ｉ５ｈ）、（Ｉ５ｉ）、（Ｉ５ｊ）、（Ｉ６ａ）、（Ｉ６ｂ）、（Ｉ６ｃ）、（Ｉ６ｄ）、（Ｉ６ｅ）、（Ｉ６ｆ）、（Ｉ６ｇ）、（Ｉ６ｈ）、（Ｉ７ａ）、（Ｉ７ｂ）、（Ｉ７ｃ）、（Ｉ７ｄ）、（Ｉ７ｅ）、（Ｉ７ｆ）、（Ｉ７ｇ）、（Ｉ７ｈ）、（Ｉ７ｉ）、（Ｉ７ｊ）、（Ｉ７ｋ）、（Ｉ７ｍ）、（Ｉ７ｎ）、（Ｉ７ｏ）又は（Ｉ７ｐ）の中間体である。
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１０、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１３、Ｐ１４、Ｐ１５、Ｐ１６、Ｐ１７、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２０、Ｐ２１、Ｐ２２、Ｐ２３、Ｐ２４及びＰ２５は、ヒドロキシル基の適切な保護基であり、より好ましくは、脱保護反応の適切なシークエンスにより後に順次除くことができるヒドロキシル基の異なる適切な保護基である。ヒドロキシル基の好ましい保護基は、アセチル、フェニル、ベンジル、イソプロピリデン、ベンジリデン、ベンゾイル、ｐ－メトキシベンジル、ｐ－メトキシ－ベンジリデン、ｐ－メトキシフェニル、ｐ－ブロモベンジリデン、ｐ－ニトロフェニル、アリル、アセチル、イソプロピル、ｐ－ブロモベンジル、ジメトキシトリチル、トリチル、２－ナフチルメチル、ピバロイル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル、ｔｅｒｔ－ブチルメトキシ－フェニルシリル、トリエチルシリル、トリメチルシリル、２－トリメチルシリルエトキシメチル、９－フルオレニル－メトキシカルボニル、ベンジルオキシメチル、メチルオキシメチル、ｔｅｒｔ－ブチルオキシメチル、メトキシエチルオキシメチル、レブリノイルである。
従って、中間体（Ｉ２ａ）、（Ｉ２ｂ）、（Ｉ２ｃ）、（Ｉ２ｄ）、（Ｉ２ｅ）、（Ｉ２ｆ）、（Ｉ４ａ）、（Ｉ４ｂ）、（Ｉ４ｃ）、（Ｉ４ｄ）、（Ｉ４ｅ）、（Ｉ４ｆ）、（Ｉ４ｇ）、（Ｉ４ｈ）、（Ｉ４ｉ）、（Ｉ４ｊ）、（Ｉ５ａ）、（Ｉ５ｂ）、（Ｉ５ｃ）、（Ｉ５ｄ）、（Ｉ５ｅ）、（Ｉ５ｆ）、（Ｉ５ｇ）、（Ｉ５ｈ）、（Ｉ５ｉ）、（Ｉ５ｊ）、（Ｉ６ａ）、（Ｉ６ｂ）、（Ｉ６ｃ）、（Ｉ６ｄ）、（Ｉ６ｅ）、（Ｉ６ｆ）、（Ｉ６ｇ）、（Ｉ６ｈ）、（Ｉ７ａ）、（Ｉ７ｂ）、（Ｉ７ｃ）、（Ｉ７ｄ）、（Ｉ７ｅ）、（Ｉ７ｆ）、（Ｉ７ｇ）、（Ｉ７ｈ）、（Ｉ７ｉ）、（Ｉ７ｊ）、（Ｉ７ｋ）、（Ｉ７ｍ）、（Ｉ７ｎ）、（Ｉ７ｏ）又は（Ｉ７ｐ）は、保護基Ｐ３、Ｐ４、Ｐ８－Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６－Ｐ２０及びＰ２２－Ｐ２４がベンジル基又はアセチル基であり、保護基Ｐ１がベンゾイル基であり、保護基Ｐ７及びＰ１８がアセチル基であり、保護基Ｐ２６がベンジル基であり、そして保護基Ｐ２７がベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）である場合に、特に好ましい。好ましくは、保護基Ｐ２１はｐ－ブロモベンジル又はｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）である。好ましくは、保護基Ｐ２５は２－ナフチル－メチル基である。
好ましくは、ＮＰは、－Ｎ３、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＣｌ３及び－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＣｌ３（Ｔｒｏｃ）から選択される。従って、ＮＰが－Ｎ３、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＣｌ３及び－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＣｌ３（Ｔｒｏｃ）から選択される場合には、中間体（Ｉ２ａ）、（Ｉ２ｂ）、（Ｉ２ｃ）、（Ｉ２ｄ）、（Ｉ２ｅ）、（Ｉ２ｆ）、（Ｉ４ａ）、（Ｉ４ｂ）、（Ｉ４ｃ）、（Ｉ４ｄ）、（Ｉ４ｅ）、（Ｉ４ｆ）、（Ｉ４ｇ）、（Ｉ４ｈ）、（Ｉ４ｉ）、（Ｉ４ｊ）、（Ｉ５ａ）、（Ｉ５ｂ）、（Ｉ５ｃ）、（Ｉ５ｄ）、（Ｉ５ｅ）、（Ｉ５ｆ）、（Ｉ５ｇ）、（Ｉ５ｈ）、（Ｉ５ｉ）、（Ｉ５ｊ）、（Ｉ６ａ）、（Ｉ６ｂ）、（Ｉ６ｃ）、（Ｉ６ｄ）、（Ｉ６ｅ）、（Ｉ６ｆ）、（Ｉ６ｇ）、（Ｉ６ｈ）、（Ｉ７ａ）、（Ｉ７ｂ）、（Ｉ７ｃ）、（Ｉ７ｄ）、（Ｉ７ｅ）、（Ｉ７ｆ）、（Ｉ７ｇ）、（Ｉ７ｈ）、（Ｉ７ｉ）、（Ｉ７ｊ）、（Ｉ７ｋ）、（Ｉ７ｍ）、（Ｉ７ｎ）、（Ｉ７ｏ）又は（Ｉ７ｐ）が好ましい。ＮＰが－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－ＣＨ２－ＣＣｌ３（Ｔｒｏｃ）を表す場合には、中間体（Ｉ２ａ）、（Ｉ２ｂ）、（Ｉ２ｃ）、（Ｉ２ｄ）、（Ｉ２ｅ）、（Ｉ２ｆ）、（Ｉ４ａ）、（Ｉ４ｂ）、（Ｉ４ｃ）、（Ｉ４ｄ）、（Ｉ４ｅ）、（Ｉ４ｆ）、（Ｉ４ｇ）、（Ｉ４ｈ）、（Ｉ４ｉ）、（Ｉ４ｊ）、（Ｉ５ａ）、（Ｉ５ｂ）、（Ｉ５ｃ）、（Ｉ５ｄ）、（Ｉ５ｅ）、（Ｉ５ｆ）、（Ｉ５ｇ）、（Ｉ５ｈ）、（Ｉ５ｉ）、（Ｉ５ｊ）、（Ｉ６ａ）、（Ｉ６ｂ）、（Ｉ６ｃ）、（Ｉ６ｄ）、（Ｉ６ｅ）、（Ｉ６ｆ）、（Ｉ６ｇ）、（Ｉ６ｈ）、（Ｉ７ａ）、（Ｉ７ｂ）、（Ｉ７ｃ）、（Ｉ７ｄ）、（Ｉ７ｅ）、（Ｉ７ｆ）、（Ｉ７ｇ）、（Ｉ７ｈ）、（Ｉ７ｉ）、（Ｉ７ｊ）、（Ｉ７ｋ）、（Ｉ７ｍ）、（Ｉ７ｎ）、（Ｉ７ｏ）又は（Ｉ７ｐ）が特に好ましい。
糖結合体
本発明の別の側面は、－Ｏ－Ｌ－Ｅ基の末端基Ｅを介して免疫原性担体に共有結合的に結合し又は共有結合的に連結する一般式（Ｉ）のサッカライドを有する結合体に関する。換言すれば、本発明の別の側面は、－Ｏ－Ｌ－Ｅ基の末端基Ｅを介して免疫原性担体と結合した一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のいずれかのサッカライドを対象とする。－Ｏ－Ｌ－Ｅ基の末端基Ｅを介して免疫原性担体に共有結合的に結合した又は共有結合的に連結した一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）の合成サッカライドを有する結合体は、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のいずれかのサッカライドを免疫原性担体と反応させることにより得られる結合体と定義してもよい。驚くべきことに、当該結合体は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が関与する疾患に対する免疫化のためのワクチンとして効果的であることがわかった。
サッカライドは、一般的に、ＴＩ－２（Ｔ細胞依存性－２）抗原及び弱免疫原として当業者に知られている。ＴＩ－２抗原は、表面に露出した免疫グロブリンレセプターの架橋を介して成熟Ｂ細胞にのみ認識される抗原である。Ｔ細胞の補助なしでは、免疫記憶は形成されず、ＩｇＭから他のＩｇＧサブクラスへのアイソタイプスイッチもＢ細胞親和性成熟も起こらない。さらに、サッカライドは、ヒト糖脂質及び糖タンパク質との構造的相同性のためにヒトにおいて免疫原性が弱いことが知られている。その弱免疫原特性のために、サッカライドは、強力なワクチンの製造に必須の特徴である、Ｂ細胞による抗体産生及び記憶細胞の形成の両方において能力が低いことがわかっている。
従って、強力なサッカライドベースのワクチンを製造するために、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドを免疫原性担体に結合させて、サッカライドに比して強い免疫原性を示す結合体を提供する。従って、Ｏ原子を介して共有結合的に免疫原性担体に連結したサッカライドフラグメント
Figure 0007296459000144
 （式中、ｎ、Ｚ及びＴ＊は本明細書に定義した意味を有する。）を有する結合体も本出願の範囲に含まれる。
当該結合体は、少なくとも１種の一般式（Ｉ）の合成サッカライド及び少なくとも１種のサッカライド（Ｉ）が共有結合的に結合した免疫原性担体を有する。
驚くべきことに、免疫原性担体に共有結合的に連結した一般式（Ｉ）のサッカライドを有する結合体で免疫化することにより、一般式（Ｉ）のサッカライドの炭水化物部分に特異的な高力価の抗体が産生されることが見いだされた。当該抗体は天然Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ細胞壁サッカライドと交差反応し、オプソニン化貪食作用及び殺菌活性を示すため、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に対する保護が付与される。
これに関連し、「免疫原性担体」の語は、サッカライドに結合して、サッカライド自体と比して強い免疫原性を示す結合体を形成する構造体と定義される。従って、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のサッカライドの免疫原性担体への結合は、当該免疫原性担体に対する免疫応答を誘導することなく、一般式（Ｉ）のサッカライドに対する免疫応答を刺激するという効果を有する。
好ましい免疫原性担体は、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質又は担体タンパク質（ＣＰ）である。当業者にとって、担体タンパク質（ＣＰ）は、無毒性及び非反応源性で、十分な量と純度で入手することができるタンパク質である。担体タンパク質は：ＣＲＭ１９７等のジフテリアトキソイド、変異ジフテリアトキソイド、変性ジフテリアトキソイド、変異及び変性ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、変性破傷風トキソイド、変異破傷風トキソイド、無莢膜型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの非脂質修飾（ｎｏｎ－ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）細胞表面リポタンパク質（タンパク質Ｄ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＯＭＰ）複合体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＫＬＨ）又はコレラトキソイド（ＣＴ）を含む群又はこれらからなる群より選択される。本明細書で使用する「トキソイド」という用語は細菌毒素（通常、外毒素）を意味し、その毒性は化学（ホルマリン）又は熱処理のいずれかにより不活性化又は抑制されているが、他の特性、典型的には免疫原性は維持されている。本明細書で使用する変異トキソイドは組み換え細菌毒素であり、野生型アミノ酸シークエンスを変化させることにより、弱毒性又はさらには無毒性に変えたものである。そのような変異は１又は２以上のアミノ酸の置換により可能である。そのような変異トキソイドはその表面に相互接続分子の官能基Ｙと反応することができる官能基を有し、変性トキソイドを提供する。当該官能基は当業者に既知であり、活性化エステルと反応することができるリシン残基の１級アミノ官能基、還元剤の存在下におけるイソシアネート基若しくはアルデヒド、カルボジイミドにより活性化することができるグルタミン酸若しくはアスパラギン酸残基のカルボキシレート官能基、又は、システイン残基のチオール官能基を含むが、これらに限定されるものではない。
活性化エステルは、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（ｓｕｌｆｏ－ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓｕｌｆｏ－ＳＩＡＢ）、スクシンイミジル－３－（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）、グルタル酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、アジピン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＡ）、２－ピリジルジチオール－テトラオキサテトラデカン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＰＥＧ－４－ＳＰＤＰ）を含む（図２を参照されたい。）。
担体タンパク質上のシステイン残基は対応するデヒドロアラニンに変換することができ、それは、適切な相互接続分子とさらに反応することができ、その表面に相互接続分子の官能基Ｘを有する変性担体タンパク質を提供する。
一般式Ｉのサッカライドは、リシン残基の１級アミン官能基を官能基として有する無毒性変異ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７と結合されることが特に好ましい。
野生型ジフテリア毒素と同様に、ＣＲＭ１９７は、ジスルフィド架橋により連結された２個のサブユニットからなる、５３５アミノ酸（５８ｋＤ）の単ポリペプチド鎖であり、グルタミン酸のグリシンへの１個のアミノ酸置換を有する。ＣＲＭ１９７は、Ｐｒｅｖｎａｒ等の多くの承認された疾患用結合体ワクチンにおいて、担体タンパク質として使用されている。
従って、本発明の好ましい態様において、担体タンパク質はその表面上にリシン残基の１級アミノ官能基を有し、それは相互接続分子の官能基Ｙと反応することができ、相互接続分子の当該官能基Ｘをその表面に有する変性担体タンパク質を提供し、一般式（Ｉ）の化合物のリンカーの末端アミノ基と反応することができる。
相互接続分子の当該官能基Ｘは、マレイミド；α－ヨードアセチル；α－ブロモアセチル；及びＮ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、アルデヒド、イミドエステル、カルボン酸、スルホン酸アルキル、塩化スルホニル、エポキシド、無水物、カーボネートを含む群、又はこれらからなる群より選択される（図３を参照されたい。）。
好ましくは、一般式Ｉのサッカライドは、マレイミドにより変性された無毒性変異ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７に結合される。なお別の好ましい態様において、一般式Ｉのサッカライドは、α－ブロモアセタミドにより変性された無毒性変異ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７に結合される。最も好ましい態様において、一般式Ｉのサッカライドは、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドアジペートにより変性された無毒性変異ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７に結合される。
好ましくは一般式（ＩＶ）の結合体である。
Figure 0007296459000145
 （式中、ｃは２から１８までの間に含まれ；
－Ｅ１－は、共有結合、－ＮＨ－、－Ｏ－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯ－ＮＨＮＨ－、
Figure 0007296459000146
 ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数を表し；
ｂは、１、２、３及び４から選択される整数を表し；
ＣＰは担体タンパク質であり；
ｎ、Ｌ、Ｚ及びＴ＊は本明細書に定義した意味を有する。）。
好ましくは、Ｅ１は、共有結合、－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＮＨ－、
Figure 0007296459000147
 である。
好ましくはＣＰはＣＲＭ１９７である。従って、本発明の態様の１つにおいて、結合体は、ＣＰがＣＲＭ１９７であり、ｃ、－Ｅ１－、Ｗ、ｎ、Ｌ、Ｚ及びＴ＊が本明細書に定義した意味を有する、一般式（ＩＶ）のものである。
好ましくは、一般式（ＩＶ）において、リンカー－Ｌ－は：－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－及び－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－から選択され；
－Ｌａ－は：－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２から選択され；
－Ｌｂ－は－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－は：－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－から選択され；
－Ｌｅ－は：－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－及び－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－から選択され；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
－Ｗ－が
Figure 0007296459000148
 を表し；ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；一般式（ＩＶ）の結合体も好ましい。
リンカー－Ｌ－が：－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－及び－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－から選択され；
－Ｌａ－が：－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２から選択され；
－Ｌｂ－が－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が：－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－から選択され；
－Ｌｅ－が：－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－及び－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－から選択され；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が
Figure 0007296459000149
 を表し；ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；一般式（ＩＶ）の結合体が特に好ましい。
ｎが、１、２又は３から選択され；
リンカー－Ｌ－が：－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－及び－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－から選択され；
－Ｌａ－が：－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２から選択され；
－Ｌｂ－が－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が：－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－から選択され；
－Ｌｅ－が：－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－及び－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－から選択され；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000150
 を表し；ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（ＩＶ）の結合体がなおより好ましい。
特に好ましくは、リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し；
ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が
Figure 0007296459000151
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（ＩＶ）の結合体である。
特に好ましくは、ｎが、１、２又は３からの整数を表し；
リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し；
ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000152
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（ＩＶ）の結合体である。
特に好ましくは、ｎが、１、２又は３からの整数を表し；
リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し；
ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000153
 を表し；ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
Ｚが、
Figure 0007296459000154
 を表す；
一般式（ＩＶ）の結合体である。
好ましくは、ｃは２から１８の間に含まれ、より好ましくは５から１５までの間であり、なおより好ましくは８から１２までの間である。ｎが１を表すことも好ましい。
より好ましくは、式（ＩＶ－１）－（ＩＶ－４）のいずれか１つの結合体である：
Figure 0007296459000155
Figure 0007296459000156
 （式中、Ｌ、Ｅ１、Ｗ、ｃ、ＣＰ及びｎは、先に定義したものと同じ意味を有する。）。
特に好ましくは、Ｌが－（ＣＨ２）５－であり、Ｅ１が－ＮＨ－であり、ｎが１又は２から選択される整数であり、ｃ及びＷが、先に定義したものと同じ意味を有する、式（ＩＶ－２）の結合体である。
一般式（Ｖ）の結合体も好ましい：
Figure 0007296459000157
 （式中、ｃは２から１８までの間に含まれ；
－Ｅ１－は、共有結合、－ＮＨ－、－Ｏ－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯ－ＮＨＮＨ－、
Figure 0007296459000158
 ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数を表し；
ｂは、１、２、３及び４から選択される整数を表し；
ｎ、Ｌ、Ｚ及びＴ＊は本明細書に定義した意味を有する。）。
リンカー－Ｌ－が：－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－及び－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－から選択され；
－Ｌａ－が：－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２から選択され；
－Ｌｂ－が－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が：－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－から選択され；
－Ｌｅ－が：－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－及び－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－から選択され；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000159
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（Ｖ）の結合体が特に好ましい。
なおより好ましくは、
ｎが、１、２又は３から選択され；
リンカー－Ｌ－が：－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－及び－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－から選択され；
－Ｌａ－が：－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２から選択され；
－Ｌｂ－が－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－が：－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－及び－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－から選択され；
－Ｌｅ－が：－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－及び－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－から選択され；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000160
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（Ｖ）の結合体である。
特に好ましくは、リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、
ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000161
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（Ｖ）の結合体である。
特に好ましくは、ｎが、１、２又は３からの整数を表し；
リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、
ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000162
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（Ｖ）の結合体である。
特に好ましくは、ｎが、１、２又は３からの整数を表し；
リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し、
ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000163
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
Ｚが、
Figure 0007296459000164
 を表す；一般式（Ｖ）の結合体である。
特に好ましくは、ｎが、１、２又は３からの整数を表し；
リンカー－Ｌ－が－（ＣＨ２）ｏ－を表し；
ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
－Ｗ－が、
Figure 0007296459000165
 を表し；
ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
Ｔ＊がホスフェート基を表す；
一般式（Ｖ）の結合体である。
また、好ましくは、基－Ｏ－Ｌ－Ｅが下記からなる群より選択される：一般式（ＩＶ）の結合体である：
Figure 0007296459000166
Figure 0007296459000167
Figure 0007296459000168
Figure 0007296459000169
Figure 0007296459000170
 より好ましくは、式（Ｖ－１）－（Ｖ－４）のいずれか１つの結合体である：
Figure 0007296459000171
Figure 0007296459000172
 （式中、Ｌ、Ｅ１、Ｗ、ｃ及びｎは、先に定義したものと同じ意味を有する。）。
より好ましくは、ｎが１～３からの整数である、式（ＩＶ）、（ＩＶ－１）－（ＩＶ－４）、（Ｖ）及び（Ｖ－１）－（Ｖ－４）のいずれか１つの結合体である。
より好ましくは、ｃが４～１０から選択される、式（ＩＶ）、（ＩＶ－１）－（ＩＶ－４）、（Ｖ）及び（Ｖ－１）－（Ｖ－４）のいずれか１つの結合体である。
好ましくは、
－Ｗ－は、
Figure 0007296459000173
 を表し；ａは、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
従って、－Ｗ－が
Figure 0007296459000174
 を表し；ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である；
一般式（ＩＶ）、（ＩＶ－１）－（ＩＶ－４）、（Ｖ）及び（Ｖ－１）－（Ｖ－４）の結合体が特に好ましい。
好ましくは、リンカー－Ｌ－は、－Ｌａ－、－Ｌａ－Ｌｅ－、－Ｌａ－Ｌｂ－Ｌｅ－又は－Ｌａ－Ｌｄ－Ｌｅ－を表し；
－Ｌａ－は、－（ＣＨ２）ｏ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｏ－ＣＨ２を表し；
－Ｌｂ－は－Ｏ－を表し；
－Ｌｄ－は、－（ＣＨ２）ｑ－、－（ＣＨ（ＯＨ））ｑ－、－（ＣＦ２）ｑ－、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－Ｃ２Ｈ４－又は－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｑ－ＣＨ２－を表し；
－Ｌｅ－は、－（ＣＨ２）ｐ１－、－（ＣＦ２）ｐ１－、－Ｃ２Ｈ４－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－、－ＣＨ２－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｐ１－又は－（ＣＨ２）ｐ１－Ｏ－（ＣＨ２）ｐ２－を表し；
ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２は、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。
最も好ましい態様において、Ｅ１は、共有結合、－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＮＨ－、
Figure 0007296459000175
 である。
また好ましくは、基－Ｏ－Ｌ－Ｅが下記からなる群より選択される、一般式（ＩＶ）、（ＩＶ－１）－（ＩＶ－４）、（Ｖ）及び（Ｖ－１）－（Ｖ－４）の結合体である：
Figure 0007296459000176
Figure 0007296459000177
Figure 0007296459000178
Figure 0007296459000179
Figure 0007296459000180
 別の態様において、当該免疫原性担体は、好ましくは免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質であり、より好ましくは（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－１－（α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－２－ヘキサコサノイルアミノオクタデカン－３，４－ジオールである。本明細書で使用される免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質の語は、標的抗原に対する免疫系の応答を刺激することができるが、先に定義したようにそれ自体は免疫を付与しない適切なスフィンゴ糖脂質を意味する。
本明細書で使用されるスフィンゴ糖脂質は、スフィンゴ脂質にα－結合した炭水化物部分を有する化合物である。好ましくは、炭水化物部分はヘキソピラノースであり、最も好ましくはα－Ｄ－ガラクトピラノースである。当業者には、スフィンゴ脂質は、アミド結合を介して脂肪酸に繋がったＣ１８アミノアルコールを有する脂質のクラスである。Ｃ１８アミノアルコールは、好ましくは１、２個又は多数のヒドロキシル基で置換されている。特に好ましくは、Ｃ１８アミノアルコールがフィトスフィンゴシンである。脂肪酸は、好ましくは１６から２８までの、より好ましくは１８から２６までの範囲の炭素数の飽和アルキル鎖を有するモノカルボン酸である。免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質には、ナチュラルキラー（ＮＫ）活性及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞によるサイトカイン産生を刺激することができ、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を示す（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－１－（α－Ｄ－ガラクトピラノシル）－２－ヘキサコサノイルアミノオクタデカン－３，４－ジオール（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、５６９０）が含まれるが、これに限定されるものではない。
一般式Ｉのサッカライドの免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質との結合体は、熱に安定であるという利点を有する。結合に適切なものとするために、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質に官能基を導入する。当該官能基は、一般式Ｉのサッカライドのリンカーの末端アミノ基と直接反応する傾向があり、一般式Ｉのサッカライドの結合体を提供し、又は、相互接続分子の官能基Ｙと直接反応する傾向があり、免疫調節特性を有する変性スフィンゴ糖脂質を提供する。
好ましくは、当該官能基は、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質の炭水化物部分のＣ６に導入される。従って、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質は、サッカライドの末端アミノ基又は相互接続分子の官能基Ｙと反応する傾向がある官能基で官能化される。アミノ基と反応しやすい官能基は、活性化エステル、イソシアネート基、アルデヒド、エポキシド、イミドエステル、カルボン酸、スルホン酸アルキル及び塩化スルホニルを含むが、これらに限定されるものではない。相互接続分子の官能基Ｙと反応しやすく、従って相互接続分子の官能基Ｘを提示し、免疫調節特性を有する変性スフィンゴ糖脂質を提供する官能基は、アミン、アルコール、チオール、活性化エステル、イソシアネート基、アルデヒド、エポキシド、ビニル、イミドエステル、カルボン酸、スルホン酸アルキル、塩化スルホニル、ビニル基、アルキニル基及びアジド基を含むが、これらに限定されるものではない。
好ましくは、免疫調節特性を有するスフィンゴ糖脂質の炭水化物部分のＣ６に導入される官能基は、アミン、チオール、アルコール、カルボン酸、ビニル、マレイミド、α－ヨードアセチル、α－ブロモアセチル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、２－ピリジルジチオールを含む群又はこれらからなる群より選択される。
当該相互接続分子の官能基Ｘは、マレイミド、α－ヨードアセチル、α－ブロモアセチル、Ｎ－ヒドロキシ－スクシンイミドエステル（ＮＨＳ）、アルデヒド、カルボン酸、エポキシド、スルホン酸アルキル、塩化スルホニル、無水物、カーボネートを含む群又はこれらからなる群より選択される。
本明細書で使用される「相互接続分子」の語は、官能基Ｘ及び官能基Ｙを有する二官能性分子を意味し、官能基Ｘは、リンカー－Ｌ－上の末端アミノ基と反応することができ、官能基Ｙは、免疫原性担体又は固体担体上に存在する官能基と反応することができる。
少なくとも１種の本発明の結合体を有するワクチンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの莢膜ポリサッカライドの非選択的開裂により得られるサッカライドの単離された（かつ非合成的）混合物又はその結合体を有するワクチンと比較して、副作用及び／又は非保護的免疫応答を起こすことが少ない。さらに、本発明のワクチンは、非選択的に開裂した莢膜ポリサッカライドの単離された混合物を有するワクチンに比べて、ＧＭＰ規定に従って簡単に製造することができ、さらに、定性分析がより簡単であるため、安定性及び純度の制御並びに不純物の種類及び量の検出がより容易である。
一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のいずれか１つのサッカライドを有する結合体、特に一般式（ＩＶ）、（ＩＶ－１）－（ＩＶ－４）、（Ｖ）及び（Ｖ－１）－（Ｖ－４）のいずれか１つの結合体は、ヒト及び／又は動物ホストにおいて保護的免疫応答を誘発することが見い出されており、従って、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が関与する疾患の予防及び／又は治療に有用である。従って、免疫原性担体に結合した一般式（Ｉ）のサッカライドを有する結合体は、それらの細胞壁サッカライド中に下記のサッカライドフラグメントの１つを有するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が関与する疾患の予防及び／又は治療に有用である：
Figure 0007296459000181
 好ましくは、それらの細胞壁サッカライド中に上記のサッカライドフラグメントの１つを有する細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅである。
好ましい態様において、免疫原性担体に結合した一般式Ｉのサッカライドを有する結合体は、細菌が関与する疾患、特に、それらの細胞壁ポリサッカライド中に下記のサッカライドフラグメントの１つを有する細菌が関与する疾患の予防及び／又は治療に有用である：
－６）－β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，４）－α－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，４）－［β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）］－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，３）－α－Ｄ－Ｍａｎ－（１－；－３）－α－Ｄ－Ｍａｎ－（１，６）－β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，４）－α－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，４）－［β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）］－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１；－４）－［β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）］－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，３）－α－Ｄ－Ｍａｎ－（１，６）－β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，４）－α－Ｄ－Ｇｌｃ－（１；－４）－［β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）］－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，３）－α－Ｄ－Ｍａｎ－（１，６）－β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，４）－α－Ｄ－Ｇｌｃ－（１；－３）－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，４）－α－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，４）－［β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１，３）］－β－Ｄ－ＧａｌＮＡｃ－（１，３）－α－Ｄ－Ｍａｎ－（１，６）－β－Ｄ－Ｇｌｃ－（１、そして、好ましくは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅについては、当該疾患は、下痢、偽膜性大腸炎及び麻痺性イレウスを含む。
医薬組成物
本発明の別の側面は、免疫原性担体に結合した一般式（Ｉ）のサッカライドを有する少なくとも１種の結合体及び／又は少なくとも１種の一般式（Ｉ）のサッカライドを少なくとも１種の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は賦形剤とともに有する、医薬組成物又はワクチンを対象とする。当該医薬組成物はヒト及び／又は動物ホストにおいて保護的免疫応答を上昇させるために使用することができる。理想的には、上記医薬組成物はヒトにおける使用に適切である。
本発明の別の側面において、当該医薬組成物又はワクチンは、さらに、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株、０２７、ＭＯＨ７１８及びＭＯＨ９００を含む群又はこれらからなる群より選択されるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌の、少なくとも１種の細胞壁サッカライド又は細胞壁サッカライドフラグメント及び／又はそのタンパク質結合体をさらに有する。
本明細書で使用する「アジュバント」という用語は、免疫学的アジュバント、すなわち、ワクチン組成物において使用される物質であって、抗原として免疫応答に関与することなく、ワクチンに含まれる抗原に対する免疫応答を強化することにより、当該ワクチンの効果を変化させ又は強める物質を意味する。当業者に古典的に認識されている免疫学的アジュバントの例は、油分乳化物（例えば、フロイントアジュバント）、サポニン、アルミニウム又はカルシウム塩（例えばアラム）、非イオン性ブロックポリマー界面活性剤及びその他多数を含むが、これらに限定されるものではない。
医薬組成物は、特に投与時においては好ましくは水溶液形態であるが、非水溶液形態又は乾燥品形態、例えばゼラチンカプセル又は凍結乾燥品等であってもよい。
医薬組成物は、チメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ）又は２－フェノキシエタノール等の１又は２種以上の保存剤を有してもよい。水銀を含有しない組成物が好ましく、また、保存剤を含有しないワクチンを製造することもできる。
医薬組成物は、例えば浸透圧を制御するためにナトリウム塩等の生理的塩類を含んでもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が典型的であり、１から２０ｍｇ／ｍｌまでの間で含んでよい。含んでもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が含まれる。
医薬組成物は２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇまでの間の重量モル浸透圧濃度を有してよい。
医薬組成物は、淡水（例えばｗ．ｆ．ｉ．）中に化合物（不溶性金属塩とともに又は不溶性金属塩なしで）を含むものでもよいが、通常は１又は２種以上の緩衝液を含む。典型的な緩衝液には：リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントとともに）；又はクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝塩は通常５－２０ｍＭの範囲内で含まれる。
医薬組成物は通常５．０から９．５の間の、例えば６．０から８．０の間のｐＨを有する。
医薬組成物は好ましくは無菌であり、グルテンを含まない。
医薬組成物は動物（特にヒト）患者への投与に適切であり、従って、ヒト及び獣医的用途の両方を含む。医薬組成物は患者の免疫応答を上昇させる方法において使用してもよく、このような方法は患者に上記組成物を投与する工程を有する。
本発明の医薬組成物は、対象がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに暴露される前に及び／又は対象がＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌に暴露された後に投与してもよい。
本発明の別の側面において、本発明は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が関与する疾患の予防及び／又は治療のための当該医薬組成物又は当該ワクチンの製造のための、免疫原性担体に結合した少なくとも１種の一般式（Ｉ）のサッカライドを有する少なくとも１種の結合体及び／又は少なくとも１種の一般式（Ｉ）のサッカライドの使用を対象とし、特にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が関与する疾患は、下痢、偽膜性大腸炎及び麻痺性イレウスを含む群又はこれらからなる群より選択される。
好ましくは、本発明は、一般式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のいずれか１つの少なくとも１種のサッカライド、及び／又は、一般式（Ｉ）、（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ－ａ）、（ＩＩ－ｂ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ－ａ）又は（ＩＩＩ－ｂ）のいずれか１つの少なくとも１種のサッカライドを有する少なくとも１種の結合体の当該医薬組成物又は当該ワクチンの製造のための使用に関する。
より好ましくは、本発明は、少なくとも１種のサッカライド、Ｉ’ａ－１－Ｉ’ａ－１１、Ｉ’ｂ－１－Ｉ’ｂ－１１及びＩ’ｃ－１－Ｉ’ｃ－１１、及び／又は、少なくとも１種のサッカライド、Ｉ’ａ－１－Ｉ’ａ－１１、Ｉ’ｂ－１－Ｉ’ｂ－１１及びＩ’ｃ－１－Ｉ’ｃ－１１を有する少なくとも１種の結合体の、当該医薬組成物又は当該ワクチンの製造のための使用に関する。
特に、本発明は、当該医薬組成物又は当該ワクチンの製造のための、一般式（ＩＶ）、（ＩＶ－１）－（ＩＶ－４）、（Ｖ）及び（Ｖ－１）－（Ｖ－４）のいずれか１つの少なくとも１種の結合体の使用に関する。
医薬組成物は単位用量形態（ｕｎｉｔ ｄｏｓｅ ｆｏｒｍ）で製造してもよい。いくつかの態様において、単位用量は０．１－１．０ｍＬまでの間の体積、例えば約０．５ｍＬを有してよい。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を有する、例えば単位用量を有するデリバリー用デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザー、スプレー、吸入器、皮膚パッチ等）を提供する。このデバイスは、上記組成物を脊椎動物である対象に投与するために使用することができる。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を有する、例えば単位用量を有する無菌コンテナ（例えばバイアル）を提供する。
本発明はまた単位用量の本発明の医薬組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を有する密封コンテナを提供する。適切なコンテナには例えばバイアルが含まれる。
本発明の医薬組成物は種々の形態で製造してよい。例えば、上記組成物は溶液又は懸濁液のような注射剤として製造してよい。注射前に液体ベヒクル中の溶液又は懸濁液とするのに適切な固体形態を製造することもできる（例えば、凍結乾燥組成物又はスプレーフリーズドライ組成物）。上記組成物は局所投与用に、例えば軟膏、クリーム又は粉剤として製造してもよい。上記組成物は経口投与用に、例えば錠剤又はカプセル剤として、スプレー剤として、又はシロップ剤として（任意で風味を付して）製造してもよい。上記組成物は、例えば微細粉末を用いた吸入器又はスプレーによる肺内投与用に製造してもよい。上記組成物は坐薬として製造してもよい。上記組成物は、鼻噴、耳内投与又は点眼用に、例えばスプレー剤又はドロップ剤として製造してもよい。通常は筋肉内投与用の注射剤である。
上記医薬組成物は、効果的な量、すなわち、単回用量において又は一連の投与の一部として個体に投与した場合、同時に投与したＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩサッカライド抗原に対する免疫応答を強めるのに効果的な量のアジュバントを有してよい。
この量は、処置される個体の健康及び生理条件、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類等）、個々の免疫系の抗体合成能力、所望される保護の程度、ワクチンの剤型、処置を行う医師による医学的状態の評価及び他の関連因子によって変化し得る。この量は相対的に広い範囲となり、ルーティンの試験により決定することができる。
本発明のワクチンの製剤化及び投与は当該技術分野において既知のいかなる方法によって遂行してもよい。
本発明の結合体の１つ又は一般式（Ｉ）のサッカライドの１つの治療上効果的な用量は、疾患に対する少なくとも部分的な免疫化を起こす化合物の量を意味する。そのような化合物の毒性及び治療効率は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的、薬理学的及び毒性学的手法により決定することができる。毒性及び治療効果の用量比は治療指数である。投与される組成物の実際の量は、処置を受ける対象、対象の重量、疾患の重篤度、投与態様及び処方を行う外科医の判断による。
本発明の別の側面は、ヒト及び／又は動物ホストにおいて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する免疫応答を誘導する方法を対象とし、当該方法は、一般式（Ｉ）のサッカライド及び／又はその塩及び／又はその結合体又はその医薬組成物を、当該ヒト及び／又は動物ホストに投与することを有する。ヒト及び／又は動物ホストにおけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅにより引き起こされる疾患を治療又は予防する本発明の方法は、少なくとも１種の一般式（Ｉ）のサッカライド及び／又はその塩及び／又はその結合体又はその医薬組成物を当該ヒト及び／又は動物ホストに投与することを有する。
免疫学的アッセイ
本発明のなお別の側面は、細胞壁ポリサッカライド中に下記のサッカライドフラグメントの１つを有する細菌に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイにおけるマーカーとしての使用のための一般式（Ｉ）のサッカライドに関する：
Figure 0007296459000182
 そのようなアッセイは、例えば、細胞壁ポリサッカライド中に上記のサッカライドフラグメントの１つを有する細菌、例えばＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する抗体の検出のために有用なマイクロアレイ又はＥＬＩＳＡを含む。
本発明のサッカライドは容易に固体担体に結合させることができ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する抗体の検出に有用な免疫学的アッセイを提供する。当該固体担体は、それらの表面上に、一般式（Ｉ）のサッカライドのアミノ基と又は相互接続分子の官能基Ｙと反応しやすい官能基を有するため、表面上に相互接続分子の官能基Ｘを有する変性固体担体を提供し、これはさらに一般式（Ｉ）のサッカライドのアミノ基と反応することができる。本発明の態様の１つにおいて、固体担体はマイクロアレイスライドであり、これは表面上に相互接続分子の官能基Ｙと反応しやすい官能基を有するため、表面上に相互接続分子の官能基Ｘを有する変性マイクロアレイスライドを提供する。そのようなマイクロアレイスライドの例には、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）のエポキシドコートスライド又はＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）のＧＡＰＳ（登録商標）ＩＩコートスライドを含むが、これらに限定されるものではない。
好ましい態様において、固体担体は、表面上に一般式（Ｉ）のサッカライドのアミノ基と反応しやすい官能基を有するマイクロアレイスライドであり、より好ましくはＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化エステルである。そのようなマイクロアレイスライドは、例えばＣｏｄｅＬｉｎｋ（登録商標）のＮＨＳスライドである。
下記の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために記載されるものである。実施例中に開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することを発明者が見出した技術を示すものであり、従ってその実施に対する好ましいモードを構成するものと考えることができることが当業者に理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様において多くの改変が可能であり、本発明の本質及び範囲から逸脱することなく、なお同じ又は同様の結果を得ることができることを理解すべきである。
当業者には、本明細書に基づいて、本発明の種々の側面のさらなる改変及び別の態様が明らかであろう。従って、本明細書は単なる例証と理解されるべきであり、本発明を遂行する一般的な方法を当業者に教示する目的のためのものである。本明細書に開示され記載された本発明の形態は、態様例として理解されるべきである。要素及び物質は本明細書に例示され記載されたものに関して置き換えてもよく、部分及び方法は逆にしてもよく、本発明の特定の特徴は独立に使用してもよいが、本発明の記載を享受した後において、これらのことはすべて当業者には明らかであろう。下記の請求項に記載した本発明の本質及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載した要素に改変を行ってよい。
Ａ． 化学合成
全般的情報：
別段の記載がない限り市販のグレードの溶媒を使用した。乾燥溶媒はＷａｔｅｒｓ Ｄｒｙ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍから入手した。クロマトグラフィー用の溶媒は使用前に蒸留した。影響を受けやすい反応は加熱乾燥したガラス器具内で、かつ、アルゴン雰囲気下で行った。分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）は、０．２５ｍｍの厚さのシリカゲルで予めコートしたＫｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ガラスプレート上で行った。スポットは、バニリン溶液（９５％ＥｔＯＨ中６％（ｗ／ｖ）バニリン及び１０％（ｖ／ｖ）硫酸）又はＨａｎｅｓｓｉａｎ染色（５％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウム、１％（ｗ／ｖ）硫酸セリウム（ＩＩ）及び１０％（ｖ／ｖ）硫酸水溶液）で染色することにより可視化した。シリカカラムクロマトグラフィーはＦｌｕｋａ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０（２３０－４００メッシュ）上で行った。
１Ｈ、１３Ｃ及び二次元ＮＭＲスペクトルはＶａｒｉａｎ ４００－ＭＲ分光計を用いて２９６Ｋにて測定した。化学シフト（ｄ）は、各残留溶媒ピークに対する１００万分率（ｐｐｍ）でレポートする（ＣＤＣｌ３：ｄ ７．２７（１Ｈ ＮＭＲにおいて）及び７７．２３（１３Ｃ ＮＭＲにおいて）；ＣＤ３ＯＤ：ｄ ３．３１（１Ｈ ＮＭＲにおいて）及び４９．１５（１３Ｃ ＮＭＲにおいて）。ピークの多重度を示すために下記略語が使用される：ｓ 一重項；ｄ 二重項；ｄｄ 二重項の二重項；ｔ 三重項；ｄｔ 三重項の二重項；ｑ 四重項；ｍ 多重項。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）でレポートする。旋光（ＯＲ）の測定は、Ｓｃｈｍｉｄｔ＆Ｈａｅｎｓｃｈ ＵｎｉＰｏｌ Ｌ１０００旋光計を用いて、λ＝５８９ｎｍ及び括弧内に記載した溶媒中のｇ／１００ｍＬで表した濃度（ｃ）にて行った。高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０ ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析計を用いて、ベルリン自由大学、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。赤外線（ＩＲ）スペクトルはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １００ ＦＴＩＲ分光計を用いて測定した。
Ａ．１ 略語
ＡＣＮ アセトニトリル
ＡｃＯＨ 酢酸
ＡＩＢＮ アゾビスイソブチロニトリル
アルハイドロゲル 水酸化アルミニウムゲルアジュバント、Ａｌ：１０ｍｇ／ｍＬ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）
Ａｌｌｏｃ アリルオキシカルボニル
ａｑ． 水溶液
ＢＨ３ ボラン
ＢＢｒ３ 三臭化ホウ素
Ｂｏｃ ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＢｎＢｒ 臭化ベンジル
ｂｒ． 広域
ＣＡＳ ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｕｍｂｅｒ（ＣＡＳ＝Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）
ＣＨＣｌ３ クロロホルム
ｃＨｅｘ シクロヘキサン
ｄ 二重項
ｄｄ 二重項の二重項
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＤＱ ２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－１，４－ベンゾキノン
ＤＥＡＤ ジエチルアゾジカルボキシレート
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピル－エチルアミン
ＤＭＡＰ ジメチルアミノピリジン
ＤＭＥ ジメトキシエタン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ ジフェニルリン酸アジド
ＥＤＣ・ＨＣｌ Ｎ１－（（エチルイミノ）メチレン）－Ｎ３，Ｎ３－ジメチルプロパン－１，３－ジアミン塩酸塩
ＥＳ 電子スプレー
Ｅｔ２Ｏ ジエチルエーテル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＦＣＳ ウシ胎児血清
ＦｍｏｃＣｌ ９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド
ＧＳＤＭＤ Ｇａｓｄｅｒｍｉｎ－Ｄ
ｈ 時間
ＨＣｌ 塩酸
ＨＥＫ２９３Ｔ 胎児腎細胞線維芽細胞株
Ｈ２Ｏ 水
ＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ １Ｈ－ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール－１－オール水和物
ｈＰＢＭＣ ヒト末梢血単核細胞
ＩＣ５０ 半数阻害濃度
Ｋ２ＣＯ３ 炭酸カリウム
ＬＤＨ 乳酸脱水素酵素
ＬｉＡｌＨ４ 水素化リチウムアルミニウム
ｍ 多重項
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＭｅＯＨ メタノール
ＭｅＩ ヨウ化メチル
ＭｇＳＯ４ 硫酸マグネシウム
ｍｉｎ 分
ＭＳ 質量分析
Ｎａ２ＣＯ３ 炭酸ナトリウム
ＮａＣＮＢＨ３ シアノ水素化ホウ素ナトリウム
ＮａＨＣＯ３ 炭酸水素ナトリウム
ＮａＨ 水素化ナトリウム
ＮａＯＨ 水酸化ナトリウム
ＮＡＰ ２－ナフチルメチル
ＮａｐＢｒ ２－ナフチルメチルブロミド
ＮａＰｉバッファー リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
Ｎａ２ＳＯ４ 硫酸ナトリウム
ＮＢＳ Ｎ－ブロモスクシンイミド
ＮＣＳ Ｎ－クロロスクシンイミド
ＮＥＴ 好中球細胞外トラップ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ）
ＮＩＳ Ｎ－ヨードスクシンイミド
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＢＢＢｒ ｐ－ブロモベンジルブロミド
ＰＢＳ ＝ ＮａＰｉ リン酸緩衝食塩水
Ｐｄ／Ｃ パラジウム炭素
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４ テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）
ＰＭＡ ホルボール １２－ミリスタート １３－アセテート
ＰＰｈ３ トリフェニルホスフィン
ＰＴＦＥ ポリテトラフルオロエチレン
ｑ 四重項
ＲＢＦ 丸底フラスコ
ｒｔ 室温
ｓ 一重項
ｓａｔ． 飽和
ｓｅｐ 七重項
ｔ 三重項
ＴＢＡＦ フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＨＰ１ 急性単球性白血病癌細胞株
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＴＭＳＯＴｆ トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル
ＴｓＯＨ トシル酸
Ｗｔ 重量
Ａ．２ ヘキササッカライド３３の合成
Figure 0007296459000183
 ＮＩＳ（３．０ｅｑｕｉｖ．）を（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１４、２０、３５７８－３５８３に従って得られた）１のＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（４：１、２５ｍＬ／１ｇ）中の冷却した溶液に、０℃にて加えた。１０ｍｉｎ後、反応混合物をｒｔにし、２ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、ＴＨＦを減圧下で除き、得られた粗製残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解し、ａｑ．Ｎａ２Ｓ２Ｏ３及びａｑ．ＮａＨＣＯ３で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中０－６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のヘミアセタール２（８４％）をフォームとして得た。ＨＲＭＳ （ＥＳＩ＋） Ｃ３８Ｈ３８Ｏ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ６１３．２５６６、実測値 ６１３．２５７４。
Figure 0007296459000184
 Ａｃ２Ｏ（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びトリメチルアミン（６．０ｅｑｕｉｖ．）を、２のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の明澄な溶液に加え、ｒｔで４ｈ撹拌を続けた。出発物質が完全に消費された後、溶媒を真空下で除き、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物３（９４％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４０Ｈ４０Ｏ７Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ６５５．２６７２、実測値 ６５５．２６７９。
Figure 0007296459000185
 アリルトリメチルシラン（２．０ｅｑｕｉｖ．）を、３の乾燥アセトニトリル（２０ｍＬ／１ｇ）中の明澄な溶液に室温にて加え、次いでＴＭＳＯＴｆ（０．５ｅｑｕｉｖ．）を滴下により加えた。フラスコを密閉し、ＴＬＣにおいて反応が完結するまで（４０ｍｉｎ）、超音波洗浄浴中に置いた（周波数 ８０Ｈｚ、１００％出力 ２３０Ｖ、ｒｔ）。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をａｑ．ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈し、塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のＣ－配糖体４をオイル（９１％）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４１Ｈ４２Ｏ５Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ６３７．２９３０、実測値 ６３７．２９２９。
Figure 0007296459000186
 ＰｄＣｌ２（０．１ｅｑｕｉｖ．）を、４のトルエン（１００ｍＬ／１ｇ）中の脱気した（３０ｍｉｎ）溶液に加えた。ＰｄＣｌ２を加えた後、反応混合物を３０ｍｉｎ再び脱気し、撹拌を１２０℃にて２．５ｄ続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をセライトのパッドに通し、減圧下で濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、二重結合移動を行った化合物５（７０％）を黄色がかった液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４１Ｈ４２Ｏ５Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ６３７．２９３０、実測値 ６３７．２９４２。
Figure 0007296459000187
 ＤＤＱ（１．２ｅｑｕｉｖ．）を、５のＤＣＭ：Ｈ２Ｏ（１９：１、２０ｍＬ／１ｇ）中の二相溶液に０℃にて加えた。０℃で１０ｍｉｎ経過した後、反応混合物を室温に温め、室温で１ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ａｑ．ＮａＨＣＯ３及び塩水で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－８０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物６を白色のオイル（９４％）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３０Ｈ３４Ｏ５Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ４９７．２３０４、実測値 ４９７．２３１２。
Figure 0007296459000188
 Ａｃ２Ｏ（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びトリメチルアミン（６．０ｅｑｕｉｖ．）を、６のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の明澄な溶液に加え、ｒｔで４ｈ撹拌を続けた。出発物質が完全に消費された後、溶媒を真空下で除き、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－５０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物７（９０％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３２Ｈ３６Ｏ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ５３９．２４１０、実測値 ５３９．２４１９。
Figure 0007296459000189
 オゾンを、７のＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１：１、１７０ｍＬ／１ｇ）中の冷却した溶液に、青色が持続するまで－７８℃で通気した。残ったＯ３を除くために、純粋なＯ２を反応混合物に溶液が明澄になるまで通気した。次いで、ＮａＢＨ４を－７８℃で加え、反応混合物を同じ温度で３０ｍｉｎ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をａｑ．ＮＨ４Ｃｌで－７８℃にてクエンチし、ＤＣＭで洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物８（２工程で６０％）を黄色がかった液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３０Ｈ３４Ｏ７Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ５２９．２２０２、実測値 ５２９．２２２０。
Figure 0007296459000190
 ８のメタノール（１０ｍＬ／１ｇ）中の溶液に、ＭｅＯＨ中のナトリウムメトキシド（０．５Ｍ、１０ｍＬ）を加え、混合物の撹拌をｒｔで１ｈ続けた。８が完全に消費された後、反応混合物のｐＨが酸性になるまでＡｃＯＨ（１ｍＬ）を加えた。中和した後、反応混合物を濃縮し、粗製残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物９（９０％）をペーストとして得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ２８Ｈ３２Ｏ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ４８７．２０９７、実測値 ４８７．２１１１。
Figure 0007296459000191
 プロパルギルトリメチルシラン（９．１１ｍＬ、６１．５ｍｍｏｌ、２．０ｅｑｕｉｖ．）を、３（１９．５ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（３９０ｍＬ）中の明澄な溶液に室温にて加え、次いでＴＭＳＯＴｆ（２．８ｍＬ、１５．４ｍｍｏｌ、０．５ｅｑｕｉｖ．）を滴下により加えた。フラスコを密閉し、ＴＬＣにおいて反応が完結するまで（４０ｍｉｎ）、超音波洗浄浴中に置いた（周波数 ８０Ｈｚ、１００％出力 ２３０Ｖ、５－１０℃）。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をａｑ．ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈し、塩水で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のＣ－配糖体１０をオイル（１６．２ｇ、８６％）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４１Ｈ４０Ｏ５Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ６３５．２７７３、実測値 ６３５．２７８６。
Figure 0007296459000192
 ＤＤＱ（１８．７ｇ、８２．０ｍｍｏｌ、１．２ｅｑｕｉｖ．）を、１０（４２ｇ、６８．５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ：Ｈ２Ｏ（１９：１、９５０ｍＬ）中の二相溶液に０℃で加えた。０℃で１０ｍｉｎ置いた後、反応混合物を室温に温め、室温で１ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ａｑ．ＮａＨＣＯ３及び塩水で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－８０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物１１を白色のオイル（２４ｇ、７４％、α－異性体のみ）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３０Ｈ３２Ｏ５Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ４９５．２１４７、実測値 ４９５．２１５１。
Figure 0007296459000193
 オゾンを、１１（１０．６ｇ、２２．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１：１、１Ｌ）中の冷却した溶液に、青色が持続するまで－７８℃で通気した。残ったＯ３を除くために、純粋なＯ２を反応混合物に溶液が明澄になるまで通気した。次いで、ＮａＢＨ４（５．１ｇ、１３５．０ｍｍｏｌ、６．０ｅｑｕｉｖ．）を－７８℃で加え、反応混合物を３ｈにわたって徐々にＲＴにし、ＲＴで４５ｍｉｎ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をａｑ．ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＤＣＭで３回洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物９（８．４ｇ、２工程で８１％）をオイル（真空下で乾燥後、粘性の白色の固体）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ２８Ｈ３２Ｏ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ４８７．２０９７、実測値 ４８７．２１０６。
Figure 0007296459000194
 水素化ナトリウム（２．０ｅｑｕｉｖ．、鉱油中６０％）を、９のＴＨＦ（２０ｍＬ／１ｇ）中の溶液に、撹拌下、０℃で加えた。１０ｍｉｎ後、ＮａｐＢｒ（１．０５ｅｑｕｖｉ．）を加え、混合物を０℃で２４ｈ撹拌した。２４ｈ後、反応混合物を、ＭｅＯＨ、水でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物１２（５４％）をペーストとして得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３９Ｈ４０Ｏ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ６２７．２７２３、実測値 ６２７．２７４８。
Figure 0007296459000195
 Ｅｔ３ＳｉＨ（３．０ｅｑｕｉｖ．）、ＴｆＯＨ（３．３ｅｑｕｉｖ．）を、（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１１、１３、３７８－３８１に従って得られた）１３のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の冷却した溶液に、新たに活性化したモレキュラーシーブ（４Å）とともに－７８℃で加えた。反応混合物を同じ温度で４ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭで希釈した。溶液をａｑ．ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の４－ＯＨ化合物１４（８３％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ５１Ｈ５４Ｃｌ３ＮＯ１２ＮａＳ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １０３４．２３００、実測値 １０３４．２４０６。
Figure 0007296459000196
 ＦｍｏｃＣｌ（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びピリジン（３．０ｅｑｕｉｖ．）を、１４のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の明澄な溶液に加え、ｒｔで３．５ｈ撹拌を続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、それを塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物１５（９３％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ６６Ｈ６４Ｃｌ３ＮＯ１４ＮａＳ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １２５６．２９８１、実測値 １２５６．３１２５。
Figure 0007296459000197
 ＮＩＳ（１．４ｅｑｕｉｖ．）及びＴｆＯＨ（０．２６ｅｑｕｉｖ．）を、４ÅＭＳの存在下で、アクセプター１５（１．０ｅｑｕｉｖ．）及びドナー１２（１．２ｅｑｕｉｖ．）のＤＣＭ（０．０６Ｍ）中の冷却した溶液に－３０℃で加えた。１．５ｈ後、出発物質が完全に消費され、続いてＥｔ３Ｎ（１．４ｅｑｕｉｖ．）を加え、ｒｔで２ｈ撹拌を続けた。２ｈ後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＭＳをろ過した。有機層をａｑ．Ｎａ２Ｓ２Ｏ３で洗浄し、分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のトリサッカライドアクセプター１６（２工程で５８％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ８４Ｈ８８Ｃｌ３ＮＯ１８Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １５２８．４９３５、実測値 １５２８．５０３７。
Figure 0007296459000198
 ＮＩＳ（１．５ｅｑｕｉｖ．）及びＴｆＯＨ（０．４ｅｑｕｉｖ．）を、４ÅＭＳの存在下で、アクセプター１６（１．０ｅｑｕｉｖ．）及び（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１６、８１、１６２－１８４に従って得られた）ドナー１７（１．５ｅｑｕｉｖ．）のトルエン：ジオキサン（４：１、０．０３Ｍ）中の冷却した溶液に０℃で加えた。２ｍｉｎ後、反応混合物をｒｔに維持し、３０ｍｉｎ撹拌した。３０ｍｉｎ後、反応混合物をＥｔ３Ｎでクエンチし、ＤＣＭで希釈し、ＭＳをろ過した。有機層をａｑ．Ｎａ２Ｓ２Ｏ３で洗浄し、分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のテトラサッカライド１８（７６％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１１１Ｈ１１４Ｃｌ３ＮＯ２３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １９５８．６７４５、実測値 １９５８．６８７１。
Figure 0007296459000199
 Ｅｔ３ＳｉＨ（３．０ｅｑｕｉｖ．）、ＴｆＯＨ（３．３ｅｑｕｉｖ．）を、新たに活性化したモレキュラーシーブ（４Å）の存在下で、１８のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の冷却した溶液に－７８℃で加えた。反応混合物を同じ温度で４ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭで希釈した。溶液をａｑ．ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のテトラサッカライド１９（８２％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１１１Ｈ１１６Ｃｌ３ＮＯ２３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １９６０．６９０１、実測値 １９６０．７０２４。
Figure 0007296459000200
 水素化ナトリウム（２．０ｅｑｕｉｖ．、鉱油中６０％）を、（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、２０００、１１、４８１－４９２に従って得られた）２０のＤＭＦ（１０ｍＬ／１ｇ）中の溶液に、撹拌下、０℃で加えた。１０ｍｉｎ後、ＰＢＢＢｒ（１．１ｅｑｕｖｉ．）を加え、混合物をｒｔにした。ｒｔで１ｈ撹拌した後、反応混合物をＮＨ４Ｃｌでクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせて、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物２１（６２％）をペーストとして得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３６Ｈ３５ＢｒＯ７ＮａＳ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ７１３．１１８５、実測値 ７１３．１２２５。
Figure 0007296459000201
 ＮＢＳ（１．１ｅｑｕｉｖ．）及びＴＭＳＯＴｆ（０．１ｅｑｕｉｖ．）を、２１のＤＣＭ：Ｈ２Ｏ（２０：１、１０ｍＬ／１ｇ）中の冷却した溶液に０℃にて加えた。１０ｍｉｎ後、反応混合物をａｑ．ＮａＨＣＯ３でクエンチし、ＤＣＭで希釈した。有機層を塩水で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のヘミアセタール２２（７０％）をフォームとして得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３４Ｈ３１ＢｒＯ８Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ６６９．１１００、実測値 ６６９．１１３２。
Figure 0007296459000202
 Ｃｓ２ＣＯ３（３．０ｅｑｕｉｖ．）、ＣＦ３Ｃ（ＮＰｈ）Ｃｌ（３．０ｅｑｕｉｖ．）を、２２のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の溶液に、撹拌下、０℃で加えた。１０ｍｉｎ．後、混合物をｒｔにし、１ｈ撹拌した。２２が完全に消費された後、反応混合物をろ過し、ろ液を濃縮した。得られた粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－６０％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のイミデートドナー２３（８７％）をフォームとして得た。
Figure 0007296459000203
 チオ配糖体アクセプター２４を、Ｄａｎｉｅｌｉ、Ｅ．；Ｌａｙ、Ｌ．；Ｐｒｏｉｅｔｔｉ、Ｄ．；Ｂｅｒｔｉ、Ｆ．；Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ、Ｐ．；Ａｄａｍｏ、Ｒ． Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．２０１１、１３、３７８－３８１に従って合成した。
ＤＣＭ中のＴＭＳＯＴｆ（０．１Ｍ、０．２ｅｑｕｉｖ．）を、チオグリコシドアクセプター２４（１．０ｅｑｕｉｖ．）及び新たに乾燥した４ÅＭＳのＤＣＭ中の混合物に、－７８℃にて加えた。２ｍｉｎ後、イミデート２３（１．２ｅｑｕｉｖ．）のＤＣＭ中の溶液を加えた。１ｈ後、反応混合物をＥｔ３Ｎでクエンチし、次いで、Ｃｅｌｉｔｅのパッドを通してろ過した。ろ液を濃縮し、粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のジサッカライド２５（６１％）を固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ５６Ｈ５１ＢｒＣｌ３ＮＯ１３ＮａＳ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １１８６．１２０７、実測値 １１８６．１３１４。
Figure 0007296459000204
 Ｅｔ３ＳｉＨ（３．０ｅｑｕｉｖ．）、ＴｆＯＨ（３．３ｅｑｕｉｖ．）を、新たに活性化したモレキュラーシーブ（４Å）とともに、２５のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の冷却した溶液に－７８℃で加えた。反応混合物を同じ温度で４ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＥｔ３Ｎ（１ｍＬ）でクエンチし、ＤＣＭで希釈した。溶液をａｑ．ＮａＨＣＯ３及び塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の４－ＯＨ化合物２６（８０％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ５６Ｈ５３Ｃｌ３ＮＢｒＯ１３ＮａＳ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １１８８．１３６４、実測値 １１８８．１４３６。
Figure 0007296459000205
 ＡｃＣｌ（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びピリジン（３．０ｅｑｕｉｖ．）を、２６のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の明澄な溶液に０℃で加え、ｒｔで３．５ｈ撹拌を続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、それを塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物２７（７０％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ５８Ｈ５５Ｃｌ３ＮＢｒＯ１４ＮａＳ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １２３０．１４６９、実測値 １２３０．１５６３。
Figure 0007296459000206
 ＮＩＳ（１．８ｅｑｕｉｖ．）及びＴｆＯＨ（０．４ｅｑｕｉｖ．）を、４ÅＭＳの存在下で、アクセプター１９（１．０ｅｑｕｉｖ．）及びドナー２７（１．８ｅｑｕｉｖ．）のＤＣＭ（０．０２５Ｍ）中の冷却した溶液に－２０℃で加えた。次いで、反応混合物を３ｈの間に徐々に０℃に温めた。３ｈ後、反応混合物をＥｔ３Ｎでクエンチし、ＤＣＭで希釈し、ＭＳをろ過した。有機層をａｑ．Ｎａ２Ｓ２Ｏ３で洗浄し、分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のヘキササッカライド２８（６５％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６３Ｈ１６５Ｃｌ６Ｎ２ＢｒＯ３７Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ３０６０．８２５８、実測値 ３０６０．８２７５。
Figure 0007296459000207
 ２８のＥｔＯＡｃ中の明澄な溶液（２．０ｍＭ）に、Ｚｎ（１００ｅｑｕｉｖ．）及びＡｃＯＨ（１００ｅｑｕｉｖ．）を加え、反応混合物を室温で３ｈ撹拌し続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をセライトのパッドを通してろ過し、濃縮した。溶媒を除去した後、得られた残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解し（２．０ｍＭ）、Ｅｔ３Ｎ（０．５ｍＬ）及びＡｃ２Ｏ（０．５ｍＬ）を加えた。ｒｔで２．５ｄ撹拌した後、反応混合物を濃縮した。溶媒を除去した後、得られた粗製物をＴＨＦ及びメタノール中に溶解した。この明澄な溶液に、０．５Ｍ ＮａＯＭｅ（３ｍＬ）を加え、６５℃で還流を続けた。１６ｈ後、反応混合物をＡｃＯＨで中和し、溶媒を除いた。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のヘキササッカライド２９（３工程で７４％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１４３Ｈ１５５Ｎ２ＢｒＯ３１Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２５００．９７０８、実測値 ２５００．９７３９。
Figure 0007296459000208
 Ａｃ２Ｏ（８．０ｅｑｕｉｖ．）及びトリメチルアミン（８．０ｅｑｕｉｖ．）を、２９のＤＣＭ（１０ｍＬ／１ｇ）中の明澄な溶液に加え、ｒｔで１６ｈ撹拌を続けた。出発物質が完全に消費された後、溶媒を真空下で除き、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物３０（８３％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１５１Ｈ１６３Ｎ２ＢｒＯ３５Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２６６９．０１３１、実測値 ２６６９．０４０７。
Figure 0007296459000209
 ＤＤＱ（１．１ｅｑｕｉｖ．）を、３０のＤＣＭ：Ｈ２Ｏ中の冷却した溶液に０℃にて加えた。反応混合物を同じ温度で４ｈ撹拌した後、反応液をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液及び塩水で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物３１（６０％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１４０Ｈ１５５Ｎ２ＢｒＯ３５Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２５２７．９５５９、実測値 ２５２７．９７３１。
Figure 0007296459000210
 ３１のＤＣＭ中の溶液に、ビス（ジイソプロピルアミノ）－ベンジルオキシホスフィン（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びジイソプロピルアンモニウム テトラゾリド（１．５ｅｑｕｉｖ．）を加え、溶液をｒｔで１．５ｈ撹拌した。次いで、５－アジドペンタノール（８．０ｅｑｕｉｖ．）及びテトラゾール（９．０ｅｑｕｉｖ．、ＣＡＮ中の０．４５Ｍ溶液）を加え、室温で２ｈ撹拌を続けた。２ｈ後、ｔ－ブチルペルオキシド（６．０ｅｑｕｉｖ．、デカン中の５．０－６．０Ｍ溶液）を加え、反応混合物を１ｈ撹拌した。１ｈ後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチした。水層をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物３２（３工程で３７％）を粘性の液体として得た。ＭＡＬＤＩ Ｃ１５２Ｈ１７１Ｎ５ＢｒＯ３８ＰＨ＋［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値 ２７８６．０６３５、実測値 ２７８６．８７０。
Figure 0007296459000211
 Ｐｄ／Ｃ（６ｍｇ）を、３２（６ｍｇ）のＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＡｃＯＨ中の明澄な溶液に加えた。得られた不均質な混合物を水素雰囲気下においてｒｔで４０ｈ撹拌した。４０ｈ後、反応混合物をＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、ロータリーエバポレータのバス温度を３０℃にして真空下で１０ｍｉｎ濃縮して、メタノール、ＥｔＯＡｃ、ＡｃＯＨ及び水を除いた。溶媒を除いた後、得られた粗生成物をＭｅＯＨ、水中に溶解し、これにＬｉＯＨ（２Ｎ水溶液）を０℃で加えた。反応混合物を０℃で３ｈ撹拌した。３ｈ後、反応混合物をＡｃＯＨ（３０μＬ）でクエンチし、溶媒を減圧下で除き、得られた粗製残渣を、水及びアセトニトリルを溶媒として用いてＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、所望の最終化合物３３（２工程で８０％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４６Ｈ８２Ｎ３ＰＯ３４ ＋［Ｍ－Ｎａ＋２Ｈ］＋に対する計算値 １２５２．４５５１、実測値 １２５２．４５７８。
Figure 0007296459000212
 Ｐｄ／Ｃ（２ｍｇ）を、２９のＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＡｃＯＨ中の明澄な溶液に加え、得られた不均質な混合物を、水素雰囲気下においてｒｔで４０ｈ撹拌した。４０ｈ後、反応混合物をＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、ロータリーエバポレータのバス温度を３０℃にして真空下で１０ｍｉｎ濃縮して、メタノール、ＥｔＯＡｃ、ＡｃＯＨ及び水を除いた。粗生成物を、水及びアセトニトリルを溶媒として用いてＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、所望の最終化合物３４（８２％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４１Ｈ７０Ｎ２Ｏ３１ ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １１０９．３８６０、実測値 １１０９．３８５３。
Figure 0007296459000213
 抗原３３（１．０ｅｑｕｉｖ．）を、２ｍＬバイアル内でＤＭＳＯ－Ｈ２Ｏ中にｒｔで溶解した。トリエチルアミン（３５．０ｅｑｕｉｖ．）をそれに加えた。混合物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアル内で、ＤＭＳＯ中の活性化アジペート－ＮＨＳエステル（１０ｅｑｕｉｖ．）に加え、ｒｔで３ｈ撹拌した。１０体積のＥｔＯＡｃを加えることにより、抗原－ＮＨＳエステルを沈殿させ、遠心し、上清を注意深く除いた。沈殿物をＥｔＯＡｃ（１ｍＬＸ３）で洗浄し、乾燥し、次の工程で使用した。ＮａＰｉバッファー（～１００μＬ）中の１ｍｇのタンパク質を、５０μＬのＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．０）中の抗原－ＮＨＳエステル３５を入れた反応バイアルに、滴下により加えた。最後に、バイアルを５０μＬのバッファー溶液でリンスし、反応バイアルに完全に移した。反応混合物をｒｔで２２ｈ撹拌した。抗原－タンパク質結合体溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬに移し、室温で６分間遠心した。３００μＬのバッファーを反応バイアルに加え、リンスし、フィルターに移し、再び遠心した。さらなる洗浄を１ｘＰＢＳ溶液を用いてさらに３回行った。最後の洗浄の後、結合体を１ｘＰＢＳ溶液中で２－８℃にて貯蔵した。結合体は、ＭＡＬＤＩ（４－１２の抗原のタンパク質へのロードが得られた。）、ＳＤＳ－ｐａｇｅ、ＢＣＡ評価、ＳＥＣ－ＨＰＬＣを用いて分析した。
Ａ．３ ヘキササッカライド５４の合成
Figure 0007296459000214
 ＴＢＤＰＳＣｌ（１．１ｅｑｕｉｖ．）及びトリメチルアミン（２．８ｅｑｕｉｖ．）を、２０のＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ／１ｇ）中の明澄な溶液に加え、ｒｔで１０ｈ撹拌を続けた。出発物質が完全に消費された後、溶媒を真空下で除き、粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物４１（９３％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４５Ｈ４８Ｏ７ＳＳｉＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ７８３．２７８８、実測値 ７８３．２７６７。
Figure 0007296459000215
 化合物２２の合成について記載した手順を、化合物４２の合成に使用した（９４％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４３Ｈ４４Ｏ８ＳｉＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ７３９．２７０３、実測値 ７３９．２７００。
Figure 0007296459000216
 ４２のＤＣＭ中の冷却した溶液に、０℃で、トリクロロアセトニトリル（６．０ｅｑｕｉｖ．）及びＤＢＵ（０．２ｅｑｕｉｖ．）を加えた。０℃にて３ｈ後、反応が完結し、溶媒を蒸発させた。粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物４３（８３％）を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000217
 化合物２５の合成について記載した手順を、化合物４４の合成に使用した（４０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ６５Ｈ６４Ｏ１３ＳｉＳＮＣｌ３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １２５６．２８０１、実測値 １２５６．２６４５。
Figure 0007296459000218
 化合物２６の合成について記載した手順を、化合物４５の合成に使用した（６０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ６５Ｈ６６Ｏ１３ＳｉＳＮＣｌ３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １２５６．２９８７、実測値 １２５６．２９７４。
Figure 0007296459000219
 化合物２７の合成について記載した手順を、化合物４６の合成に使用した（６０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ６７Ｈ６８Ｏ１４ＳｉＳＮＣｌ３Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １３００．３０６４、実測値 １３００．３０９０。
Figure 0007296459000220
 化合物２８の合成について記載した手順を、化合物４７の合成に使用した（８２％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１７２Ｈ１７８Ｏ３７ＳｉＮ２Ｃｌ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ３１２７．９７２８、実測値 ３１２７．９７２８。
Figure 0007296459000221
 化合物２９の合成について記載した手順を、化合物４８の合成に使用した（５０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１５２Ｈ１６８Ｏ３１ＳｉＮ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２５６８．１２９８、実測値 ２５６８．１３２２。
Figure 0007296459000222
 化合物３０の合成について記載した手順を、化合物４９の合成に使用した（８０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６０Ｈ１７６Ｏ３５ＳｉＮ２Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２７３７．１７５４、実測値 ２７３７．２００１。
Figure 0007296459000223
 化合物３１の合成について記載した手順を、化合物５０の合成に使用した（７０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１４９Ｈ１６８Ｏ３５ＳｉＮ２Ｎａ＋ ［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２５９６．１０９５、実測値 ２５９５．９９５４及び２５９６．９９９７。
Figure 0007296459000224
 化合物３２の合成について記載した手順を、化合物５１の合成に使用した。
Figure 0007296459000225
 ＴＢＡＦ及びＡｃＯＨの予め混合した溶液を、５１のＴＨＦ中の明澄な溶液にｒｔで加え、反応混合物の撹拌をｒｔで３ｈを続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、真空下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を、ｎ－ヘキサン中のＥｔＯＡｃ（勾配、０～１００％）を溶出液として用いて、シリカゲル上の自動化カラムクロマトグラフィーで精製した。
Figure 0007296459000226
 ５２のＤＣＭ中の溶液に、ジベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びジイソプロピルアンモニウム テトラゾリド（１．５ｅｑｕｉｖ．）を加え、溶液をｒｔで１．５ｈ撹拌した。次いで、ｔ－ブチルペルオキシド（６．０ｅｑｕｉｖ．、デカン中の５．０－６．０Ｍ溶液）を加え、反応混合物を１ｈ撹拌した。１ｈ後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチした。水層をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせて、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物５３を得た。
Figure 0007296459000227
 化合物３３の合成について記載した手順を、化合物５４の合成に使用した。
Figure 0007296459000228
 糖結合体３６及び３７の合成について記載した手順を、５６及び５７の合成にも使用した。
Ａ．４ ヘキササッカライド５４の別の合成
Figure 0007296459000229
 亜リン酸ジフェニルを、４８のピリジン中の明澄な溶液に加え、反応混合物を、室温、窒素下で２ｈ撹拌した。２ｈ後、１Ｍ ＴＥＡＢ溶液を反応混合物に０℃で加えた。５ｍｉｎ後、アイスバスを除き、撹拌をｒｔでさらに２ｈ続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、有機層を１Ｍ ＴＥＡＢ溶液で順次洗浄し、減圧下で濃縮した。粗生成物を自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（２％Ｅｔ３Ｎを含むＥＡ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、純粋なＨ－ホスホネート誘導体５８（９０％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１５５Ｈ１８４Ｎ３ＰＳｉＯ３７ ＋［Ｍ］＋に対する計算値 ２７４０．２１８９、実測値 ２７４０．２１３２。
Figure 0007296459000230
 Ｈ－ホスホネート５８（１．０ｅｑｕｉｖ．）及びリンカー（４．０ｅｑｕｉｖ．）をピリジンと共蒸発させ（ｃｏ－ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをｐｙ中に溶解し、これにＰｉｖＣｌ（２．０ｅｑｕｉｖ．）を加えた。反応混合物の撹拌をｒｔで２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のＰｙ：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を加え、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物５９（７０％）を粘性の液体として得た。Ｍａｌｄｉ（ＥＳＩ＋） Ｃ１５４Ｈ１７８Ｎ５ＰＮａＳｉＯ３８ ＋［Ｍ－Ｅｔ３Ｎ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２７８９．１６３５、実測値 ２７８８．０。
Figure 0007296459000231
 ５９のＤＣＭ及びピリジン中の溶液に、０℃で、ＨＦ溶液（ピリジン中７０％、０．３ｍＬ）を滴下により加えた。反応混合物を同じ温度で１８ｈ撹拌した。次いで、反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及びＴＥＡＢバッファーで洗浄した。有機相を分離し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物６０を粘性の液体として得た。Ｍａｌｄｉ（ＥＳＩ＋） Ｃ１３８Ｈ１６０Ｎ５ＰＮａＯ３８ ＋［Ｍ－Ｅｔ３Ｎ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ２５５０．７５８５、実測値 ２５４９．６９８。
Figure 0007296459000232
 ６０のＤＣＭ中の溶液に、ジベンジル ジイソプロピルホスホロアミダイト（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びジイソプロピルアンモニウム テトラゾリド（２．０ｅｑｕｉｖ．）を加え、この溶液を室温で１．５ｈ撹拌した。次いで、デカン中のｔ－ブチルペルオキシドの５．０－６．０Ｍ溶液（６．０ｅｑｕｉｖ．）を室温で加え、反応混合物を１ｈ撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液及びＴＥＡＢバッファーで洗浄した。水層をＤＣＭ（２ｘ１０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４（０．５ｇ）上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を、２％のトリメチルアミンを含むＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨを用いて、自動化フラッシュクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物６１を粘性のオイル（９１％）として得た。表題化合物５４を、化合物３３の合成について記載した手順により、化合物６１から６０％の収率で得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４６Ｈ８３Ｎ３Ｐ２ＮａＯ３７ ＋［Ｍ＋Ｎａ］￣に対する計算値 １３５４．４０７８、実測値 １３５４．９６２３。
Ａ．５ ヘキササッカライド５４の別の合成
Figure 0007296459000233
 Ｍｅ３Ｎ・ＢＨ３（２１．２ｇ、２９１ｍｍｏｌ、５．４ｅｑｕｉｖ．）、ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（４２．２ｍＬ、２９１ｍｍｏｌ、５．４ｅｑｕｉｖ．）を、２４（２８．８ｇ、５４ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１．５Ｌ）中の冷却した溶液に０℃で加えた。反応混合物を同じ温度で１ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＥｔ３Ｎ（３０ｍＬ）及びＭｅＯＨ（５０ｍＬ）でクエンチした。次いで、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）で希釈し、１Ｍ ＨＣｌ（３回、２層を視認することが困難な場合には塩水を加えて改善する。）、次いで、有機層のｐＨが中性になるまでａｑ．ＮａＨＣＯ３で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。生成物６２（２２ｇ、７６％）である白色の固体は純粋であり、次の工程で使用した。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ２２Ｈ２４Ｃｌ３ＮＯ６ＳＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ５５８．０２８８、実測値 ５５８．０３３２。
Figure 0007296459000234
 化合物２の合成について記載した手順を、化合物６４の合成に使用した（８５％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３４Ｈ４０Ｏ６Ｎ＋［Ｍ＋ＮＨ４］＋に対する計算値 ５５８．２８５６、実測値 ５５８．２９７６。
Figure 0007296459000235
 ６４（２４．５ｇ、４５．３ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（３６０ｍＬ）中の溶液に、撹拌下で、無水ＤＭＦ（１ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ、０．３０ｅｑｕｉｖ．）及び（ＣＯＣｌ）２（１０．３ｍＬ、１１８．０ｍｍｏｌ、２．６ｅｑｕｉｖ．）を０℃で加えた。５ｍｉｎ後、反応混合物をｒｔにし、ｒ．ｔ．で２ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物を０℃に冷却し、Ｅｔ３Ｎでクエンチした。生成した塩をセライトのショートパッドを通してろ過し、ＤＣＭで洗浄した（塩が溶解し、セライトを通過するので、多量のＤＣＭで洗浄すべきではない）。次いで、ろ液を減圧下で濃縮し、酢酸エチル：シクロヘキサン（０－４０％、２％Ｅｔ３Ｎ含有）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、所望の塩化グリコシル６５（２４ｇ、９６％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ３４Ｈ３５Ｏ５ＣｌＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ５８１．２０７１、実測値 ５８１．２２０６。
Figure 0007296459000236
 塩化グリコシル６５（１６．２ｇ、２８．９ｍｍｏｌ、１．１５ｅｑｕｉｖ．）及びアクセプター６２（１３．５ｇ、２５．１ｍｍｏｌ）の、アセトニトリル（２００ｍＬ）及びＤＣＭ（８０ｍＬ）中の混濁液（ｔｕｒｂｉｄ）に、Ａｇ２Ｏ（８．８ｇ、３７．７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ．、使用前に、真空下、８０℃で３ｈ乾燥した。）及びジフェニルボリン酸２－アミノエチル（０．５７ｇ、２．５１ｍｍｏｌ、０．１ｅｑｕｉｖ．）を加えた。ｒｔ．で１６ｈ撹拌した後、混合物をＤＣＭ（８０ｍＬ）、アセトン（８０ｍＬ）で希釈し、セライト、砂（ｓａｎｄ）を通してろ過し、ろ液に生成物が見られなくなるまでＤＣＭ及びアセトンで洗浄した。ろ液画分をすべて合わせ、濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）中に溶解し、固体が溶解して明澄な溶液になるまで５５℃に保った。次いで、この明澄な溶液をフィルターペーパーを通してろ過し、熱ＥｔＯＡｃで洗浄し、再結晶化のために放置した。１ｈ後、白色の固体が結晶化し、それを溶液から分離して、所望のジサッカライド６６を白色の固体（２２ｇ、８３％）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ５６Ｈ５８Ｃｌ３ＮＯ１１ＳＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １０８０．２６９６、実測値 １０８０．２９０４。
Figure 0007296459000237
 ＦｍｏｃＣｌ（１６．８７ｇ、６３．２ｍｍｏｌ、２．０ｅｑｕｉｖ．）及びピリジン（７．６７ｍＬ、９５．０ｍｍｏｌ、３．０ｅｑｕｉｖ．）を、６６（３３．５ｇ、３１．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３３０ｍＬ）中の明澄な溶液に加え、ｒｔで２ｈ撹拌を続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、それを塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の化合物６７（３４．７ｇ、８６％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ７１Ｈ６８Ｃｌ３ＮＯ１３ＳＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １３０２．３３７５、実測値 １３０２．３６９４。
Figure 0007296459000238
 化合物２の合成について記載した手順を、化合物６９の合成に使用した（８０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ２９Ｈ３６Ｏ７Ｎ＋［Ｍ＋ＮＨ４］＋に対する計算値 ５１０．２４９２、実測値 ５１０．２５２７。
Figure 0007296459000239
 ６９（１８．０ｇ、３６．５ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（２９０ｍＬ）中の溶液に、撹拌下で、無水ＤＭＦ（０．８５ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ、０．３０ｅｑｕｉｖ．）及び（ＣＯＣｌ）２（８．３ｍＬ、９５．０ｍｍｏｌ、２．６ｅｑｕｉｖ．）を０℃で加えた。５ｍｉｎ後、反応混合物をｒｔにし、ｒ．ｔ．で２ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物を０℃に冷却し、Ｅｔ３Ｎでクエンチした。生成した塩をセライトのショートパッドを通してろ過し、ＤＣＭで洗浄した。次いで、ろ液を減圧下で濃縮し、酢酸エチル：シクロヘキサン（０－４０％、２％のＥｔ３Ｎを含有）を用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、所望の塩化グリコシル７０（１６．７ｇ、８９％）を粘性の液体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ２９Ｈ３１Ｏ６ＣｌＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ５３３．１７０７、実測値 ５３３．１７５２。
Figure 0007296459000240
 塩化グリコシル７０（１６．５ｇ、３２．３ｍｍｏｌ、１．１５ｅｑｕｉｖ．）及びアクセプター６２（１５．０７ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）の、アセトニトリル（２００ｍＬ）及びＤＣＭ（８０ｍＬ）中の混濁液に、Ａｇ２Ｏ（９．７６ｇ、４２．１ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ．、使用前に、真空下、８０℃で３ｈ乾燥した。）及びジフェニルボリン酸２－アミノエチル（０．６３ｇ、２．８１ｍｍｏｌ、０．１ｅｑｕｉｖ．）を加えた。ｒｔ．で１６ｈ撹拌した後、混合物をＤＣＭ（８０ｍＬ）、アセトン（８０ｍＬ）で希釈し、セライト、サンドを通してろ過し、ろ液に生成物が見られなくなるまでＤＣＭ及びアセトンで洗浄した。ろ液画分をすべて合わせ、濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）中に溶解し、固体が溶解して明澄な溶液になるまで５５℃に保った。次いで、この明澄な溶液をフィルターペーパーを通してろ過し、熱ＥｔＯＡｃで洗浄し、再結晶化のために放置した。１ｈ後、白色の固体が結晶化し、それを溶液から分離して、所望のジサッカライド７１を白色の固体（２３ｇ、８１％）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ５１Ｈ５４Ｃｌ３ＮＯ１２ＳＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １０３２．２３３０、実測値 １０３２．２４２３。
Figure 0007296459000241
 ＡｃＣｌ（４０ｍＬ）を、７１（１８．８７ｇ、１８．６６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２００ｍＬ）及びＤＣＭ（２００ｍＬ）中の混濁液に、０℃にて加えた。５分後、アイスバスを除き、ｒｔに保って撹拌した。室温で３ｈ撹拌した後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、水及びａｑ．ＮａＨＣＯ３で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ロータリーエバポレータで濃縮して、所望の化合物７２（１８．０９ｇ、定量的）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４９Ｈ５２Ｃｌ３ＮＯ１１ＳＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ９９０．２２２４、実測値 ９９０．２３０１。
Figure 0007296459000242
 ７２（１８．０５ｇ、１８．６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３７０ｍＬ）中の懸濁液に、イミダゾール（３．５６ｇ、５２．３ｍｍｏｌ、２．８ｅｑｕｉｖ．）及びＴＢＤＰＳＣｌ（７．２ｍＬ、２８．０ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ．）を加えた。５分後、反応混合物は完全に明澄となり、ｒｔで３０分撹拌したままにした。３０分後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、塩水で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。溶媒を除いた後、得られた粗製残渣を、酢酸エチル及びシクロヘキサンを溶出液として用いて、自動化シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、所望の生成物７３（２０．９ｇ、９３％）を固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ６５Ｈ７０Ｃｌ３ＮＯ１１ＳＳｉＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １２２８．３４０２、実測値 １２２８．３４８１。
Figure 0007296459000243
 ７３（１８．６９ｇ、１５．４７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２００ｍＬ）中の明澄な溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１９ｍＬ、１３９．０ｍｍｏｌ、９．０ｅｑｕｉｖ．）、酢酸無水物（４．４ｍＬ、４６．４ｍｍｏｌ、３．０ｅｑｕｉｖ．）及びＤＭＡＰ（０．１８９ｇ、１．５４７ｍｍｏｌ、０．１ｅｑｕｉｖ．）を加え、ｒｔで１８ｈ撹拌を続けた。１８ｈ後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ａｑ．ＮａＨＣＯ３で洗浄した。分離した有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。溶媒を除いた後、得られた粗製残渣を、シリカゲル上の自動化フラッシュクロマトグラフィー（シクロヘキサン－ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物７４をフォーム（１７．２ｇ、８９％）として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ６７Ｈ７２Ｃｌ３ＮＯ１２ＳＳｉＮａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １２７２．３４７８、実測値 １２７２．３５３０。
Figure 0007296459000244
 化合物１６の合成について記載した手順を、化合物７６の合成に使用した（２工程で６０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ８２Ｈ８６Ｏ１７ＮＮａＣｌ３ ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 １５７４．５３２９、実測値 １５７４．５６２４。
Figure 0007296459000245
 化合物１８の合成について記載した手順を、化合物７７の合成に使用した（８０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１１６Ｈ１２２Ｏ２２Ｎ２Ｃｌ３ ＋［Ｍ＋ＮＨ４］＋に対する計算値 ２０００．７５６５、実測値 ２０００．７５８８。
Figure 0007296459000246
 化合物１９の合成について記載した手順を、化合物７８の合成に使用した（８０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１１６Ｈ１２４Ｏ２２Ｎ２Ｃｌ３ ＋［Ｍ＋ＮＨ４］＋に対する計算値 ２００１．７７１１、実測値 ２００１．６４６９。
Figure 0007296459000247
 化合物２８の合成について記載した手順を、化合物７９の合成に使用した（７９％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１７７Ｈ１８６Ｏ３４Ｎ２Ｃｌ６Ｎａ＋［Ｍ＋Ｎａ］＋に対する計算値 ３１４７．０６８９、実測値 ３１４７．１１８４。
Figure 0007296459000248
 ７９のＥｔＯＡｃ中の明澄な溶液（２．０ｍＭ）に、Ｚｎ（１００ｅｑｕｉｖ．）、ＡｃＯＨ（１００ｅｑｕｉｖ．）、Ａｃ２Ｏを加え、反応混合物の撹拌を室温で２０ｈ続けた。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をセライトのパッドを通してろ過し、濃縮した。粗製残渣をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望のヘキササッカライド８０（６９％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１７５Ｈ１８８Ｎ２Ｏ３２Ｓｉ＋［Ｍ］＋に対する計算値 ２８５８．２９４８、実測値 ２８５８．３０６２。
Figure 0007296459000249
 化合物３１の合成について記載した手順を、化合物８１の合成に使用した（７３％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６４Ｈ１８０Ｏ３２Ｎ２Ｓｉ＋［Ｍ］＋に対する計算値 ２７１８．２３２２、実測値 ２７１８．２３４７。
Figure 0007296459000250
 化合物５８の合成について記載した手順を、化合物８２の合成に使用した（８７％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６４Ｈ１８１Ｏ３４Ｎ２ＳｉＰ＋［Ｍ－Ｅｔ３Ｎ］＋に対する計算値 ２７８２．２０３６、実測値 ２７８２．２０７７。
Figure 0007296459000251
 化合物５９の合成について記載した手順を、化合物８３の合成に使用した（８８％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６９Ｈ１９０Ｏ３５Ｎ５ＳｉＰ＋［Ｍ－Ｅｔ３Ｎ］＋に対する計算値 ２９１０．２８１５、実測値 ２９１０．２８４１。
Figure 0007296459000252
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物８４の合成に使用した（９０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１５３Ｈ１７２Ｏ３５Ｎ５Ｐ＋［Ｍ－Ｅｔ３Ｎ］＋に対する計算値 ２６７２．１６３８、実測値 ２６７２．１７５９。
Figure 0007296459000253
 ３２からの化合物３３の合成について記載した手順を、化合物３３の合成に使用した（５５％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４６Ｈ８２Ｎ３ＰＯ３４ ＋［Ｍ－Ｎａ＋２Ｈ］＋に対する計算値 １２５２．４５５１、実測値 １２５２．４５７４。
Figure 0007296459000254
 ８４のＤＣＭ中の溶液に、ジベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（２．０ｅｑｕｉｖ．）及びジイソプロピルアンモニウム テトラゾリド（１．５ｅｑｕｉｖ．）を加え、溶液をｒｔで２．５ｈ撹拌した。次いで、ｔ－ブチルペルオキシド（６．０ｅｑｕｉｖ．、デカン中の５．０－６．０Ｍ溶液）を加え、反応混合物を１ｈ撹拌した。１ｈ後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチした。水層をＤＣＭで抽出した。有機層を合わせて塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、ろ液を減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲル上の自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン中の０－１００％ＥｔＯＡｃ）で精製して、所望の生成物８５（８８％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６７Ｈ１８５Ｏ３８Ｎ５Ｐ２ ＋［Ｍ－Ｅｔ３Ｎ］＋に対する計算値 ２９３２．２２４０、実測値 ２９３２．２１４７。
Figure 0007296459000255
 Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を、８５（２０ｍｇ）のＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＤＣＭ中の明澄な溶液に加えた。得られた不均質な混合物を、水素雰囲気下、ｒｔで４０ｈ撹拌した。４０ｈ後、反応混合物をＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、ロータリーエバポレータのバス温度を３０℃にして真空下で１０ｍｉｎ濃縮して、メタノール、ＥｔＯＡｃ、ＤＣＭ及び水を除いた。溶媒を除いた後、得られた粗生成物をＭｅＯＨ、水中に溶解し、これにＬｉＯＨ（２Ｎ水溶液）を０℃で加えた。反応混合物を０℃で３ｈ撹拌した。３ｈ後、反応混合物をＡｃＯＨでクエンチし、溶媒を減圧下で除き、得られた粗製残渣を、水及びアセトニトリルを溶媒として用いてＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、所望の最終化合物５４を塩の形態で得た。次いで、トリエチルアミン塩をＤｏｗｅｘ樹脂で交換し、ナトリウム塩を有する所望の化合物（３工程で４０％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４６Ｈ８３Ｎ３Ｐ２Ｏ３７ ＋［Ｍ－Ｎａ＋Ｈ］＋に対する計算値 １３３２．４２１４、実測値 １３３２．４２４２。
Figure 0007296459000256
 化合物５８の合成について記載した手順を、化合物８６の合成に使用した（９４％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６５Ｈ２０３Ｏ３７Ｎ７Ｐ２ ＋［Ｍ－２ｘＥｔ３Ｎ＋Ｈ］＋に対する計算値 ２７３５．１３１８、実測値 ２７３５．１３５６。
Figure 0007296459000257
 Ｈ－ホスホネート８６（１．０ｅｑｕｉｖ．）及びベンジルアルコール（１０．０ｅｑｕｉｖ．）をピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをｐｙ中に溶解し、これにＰｉｖＣｌ（５．０ｅｑｕｉｖ．）を加えた。反応混合物の撹拌をｒｔで２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のＰｙ：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を加え、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物８７（８６％）を粘性の液体として得た。Ｍａｌｄｉ（ＥＳＩ＋） Ｃ１６０Ｈ１７９Ｎ５Ｐ２Ｏ３８ ＋［Ｍ＋Ｈ－２ｘＥｔ３Ｎ］＋に対する計算値 ２８４２．１７７０、実測値 ２８４２．１６３８。
Figure 0007296459000258
 Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を、８７（２０ｍｇ）のＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：ＤＣＭ中の明澄な溶液に加えた。得られた不均質な混合物を、水素雰囲気下、ｒｔで４０ｈ撹拌した。４０ｈ後、反応混合物をＰＴＦＥフィルターを通してろ過し、ロータリーエバポレータのバス温度を３０℃にして真空下で１０ｍｉｎ濃縮して、メタノール、ＥｔＯＡｃ、ＤＣＭ及び水を除いた。溶媒を除いた後、得られた粗生成物をＭｅＯＨ、水中に溶解し、これにＬｉＯＨ（２Ｎ水溶液）を０℃で加えた。反応混合物を０℃で３ｈ撹拌した。３ｈ後、反応混合物をＡｃＯＨでクエンチし、溶媒を減圧下で除き、得られた粗製残渣を、水及びアセトニトリルを溶媒として用いてＣ１８逆相カラムクロマトグラフィーで精製し、所望の最終化合物５４を塩の形態で得た。次いで、トリエチルアミン塩をＤｏｗｅｘ樹脂で交換し、ナトリウム塩を有する所望の化合物（３工程で７０％）を白色の固体として得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ４６Ｈ８３Ｎ３Ｐ２Ｏ３７ ＋［Ｍ－３Ｎａ＋４Ｈ］＋に対する計算値 １３３２．４２１４、実測値 １３３２．４２３２。
Ａ．６ ドデカサッカライド９２の合成
Figure 0007296459000259
 化合物３２の合成について記載した手順を化合物８８の合成に使用した。唯一の変更は第２工程において、リンカーの代わりに化合物５２を求核剤として使用したことである。
Figure 0007296459000260
 化合物５２の合成について記載した手順を、化合物８９の合成に使用した。
Figure 0007296459000261
 化合物３３の合成について記載した手順を、化合物９０の合成に使用した。
Figure 0007296459000262
 化合物５３の合成について記載した手順を、化合物９１の合成に使用した。
Figure 0007296459000263
 化合物３３の合成について記載した手順を、化合物９２の合成に使用した（６０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ８７Ｈ１５１Ｎ５Ｐ２Ｏ６７［（Ｍ－２Ｎａ＋２Ｈ）／２］に対する計算値 １１９９．９０１９、実測値 １１９９．８９５０。
Figure 0007296459000264
Figure 0007296459000265
Figure 0007296459000266
 糖結合体３６及び３７の合成について記載した手順を、９４及び９５の合成に使用した。
Ａ．７ ドデカサッカライド９２の別の合成
Figure 0007296459000267
 Ｈ－ホスホネート５８（１．２ｅｑｕｉｖ．）及びアクセプター６０（１．０ｅｑｕｉｖ．）をピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをｐｙ中に溶解し、これにＰｉｖＣｌ（１．３ｅｑｕｉｖ．）を加えた。反応混合物の撹拌をｒｔで３ｈ続けた。３ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のＰｙ：Ｈ２Ｏ（２５０μＬ、２０：１）中の新たに調製した溶液を加え、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物９６（７０％）を粘性の液体として得た。Ｍａｌｄｉ（ＥＳＩ＋） Ｃ２８７Ｈ３２５Ｋ２Ｎ７Ｏ７５Ｐ２Ｓｉ＋［Ｍ－２Ｅｔ３Ｎ＋２Ｋ］＋に対する計算値 ５２３７．０３５１、実測値 ５２３７．７１８。
Figure 0007296459000268
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物９７の合成に使用した（７０％）。Ｍａｌｄｉ（ＥＳＩ＋） Ｃ２７１Ｈ３０９Ｎ７Ｏ７５Ｐ２ ＋［Ｍ］＋に対する計算値 ４９２６．３７４５、実測値 ４９２６．３２３。
Figure 0007296459000269
 化合物６１の合成について記載した手順を、化合物９８の合成に使用した（８９％）。化合物５４の合成について記載した手順を、化合物９２の合成に使用した（６０％）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋） Ｃ８７Ｈ１５２Ｎ５Ｐ３ＮＨ４Ｏ７０ －［（Ｍ＋ＮＨ４－２Ｈ）／２］－に対する計算値 １２４７．８９４４、実測値 １２４７．８７９１。
Ａ．８ ヘキササッカライド１１２の合成
Figure 0007296459000270
 ＭｓＣｌ及びピリジン（ｐｙ）を、８のＤＣＭ中の明澄な溶液に０℃で加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いでＤＣＭで希釈し、ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮して、粗生成物を得た。残渣を自動化シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ）で精製して、化合物９９を得た。
Figure 0007296459000271
 ヨウ化ナトリウムを、９９の２－ブタノン中の明澄な溶液に加え、反応混合物を１００℃で一晩撹拌した。次いで、溶媒を除き、粗製残渣をＤＣＭ中に溶解し、ａｑ．ＮａＨＳＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮して、ヨードメチル誘導体１００を得た。このヨード誘導体を、新たに蒸留した亜リン酸トリメチル中に溶解し、この溶液を、真空下で（ウォータポンプ（ｗａｔｅｒ ｐｕｍｐ））１００℃に４８ｈ加熱した。濃縮及びシリカゲルクロマトグラフィーの後に、ホスホネート誘導体１０１を得た。
Figure 0007296459000272
 ＴＥＡ及びチオフェノールを、１０１のＴＨＦ中の明澄な溶液に加えた。反応混合物を室温で２４ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＴＥＡで希釈し、濃縮して、粗製残渣を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、１０２を得た。
Figure 0007296459000273
 ホスホネート１０２、リンカー及びトリフェニルホスフィンをＴＨＦ中に溶解し、溶液を０℃に冷却し、これにＤＩＡＤを加えた。混合物を室温で２４ｈ撹拌した。２４ｈ後、溶液を濃縮し、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、１０３を得た。
Figure 0007296459000274
 ＴＥＡ及びチオフェノールを、１０３のＴＨＦ中の明澄な溶液に加えた。反応混合物を室温で２４ｈ撹拌した。出発物質が完全に消費された後、反応混合物をＴＥＡで希釈し、濃縮して、粗製残渣を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、１０４を得た。
Figure 0007296459000275
 ホスホネート誘導体１０４を、ＮａＯＭｅのＭｅＯＨ中の０．０５Ｍ溶液に溶解し、ｒｔにて１０ｍｉｎ撹拌した。次いで、反応混合物をＡｃＯＨでクエンチし、溶媒を減圧下で除いた。得られた粗製残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、１０５を得た。
Figure 0007296459000276
 反応を化合物１６の合成に従って行った。
Figure 0007296459000277
 反応を化合物１８の合成に従って行った。
Figure 0007296459000278
 反応を化合物１９の合成に従って行った。
Figure 0007296459000279
 反応を化合物２８の合成に従って行った。
Figure 0007296459000280
 反応を化合物２９の合成に従って行った。
Figure 0007296459000281
 反応を化合物３０の合成に従って行った。
Figure 0007296459000282
 反応を化合物３３の合成に従って行った。
Figure 0007296459000283
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．８ ヘキササッカライド１１７の合成
Figure 0007296459000284
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１１６を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000285
 反応を化合物３１の合成に従って行った。
Figure 0007296459000286
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．９ ヘキササッカライド１２２の合成
Figure 0007296459000287
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１２１を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000288
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000289
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．１０ ヘキササッカライド１２７の合成
Figure 0007296459000290
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１２６を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000291
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000292
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．１１ ヘキササッカライド１３２の合成
Figure 0007296459000293
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１３１を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000294
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000295
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．１２ ヘキササッカライド１３７の合成
Figure 0007296459000296
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１３６を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000297
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000298
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．１３ ヘキササッカライド１４２の合成
Figure 0007296459000299
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１４１を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000300
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000301
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．１４ ヘキササッカライド１４７の合成
Figure 0007296459000302
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１４６を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000303
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000304
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．１５ ヘキササッカライド１５２の合成
Figure 0007296459000305
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１５１を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000306
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000307
 ＳＢＡＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（ブロモアセトアミド）プロピオネート）を、タンパク質のリン酸ナトリウムバッファー（ＮａＰｉ、ｐＨ７．４）中の溶液に、撹拌下、室温で加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌し、その後膜ろ過により濃縮し、ＮａＰｉ（ｐＨ８．０）中で再びバッファー化した。化合物１５２のＮａＰｉ中の溶液を、活性化タンパク質の上記溶液に加え、ｒ．ｔ．で１６時間撹拌した。次いで、糖結合体を滅菌水で洗浄し、滅菌水中でｌ－システインにより処理した。糖結合体の精製は膜ろ過により行った。
Ａ．１６ ヘキササッカライド１５７の合成
Figure 0007296459000308
 Ｈ－ホスホネート５８及びリンカーをピリジンと共蒸発させ、真空下で３０ｍｉｎ乾燥した。その後、それをピリジン中に溶解し、これにＰｉｖＣｌを加えた。反応混合物の撹拌をｒ．ｔ．で２ｈ続けた。２ｈ後、反応液を－４０℃に冷却し、Ｉ２のピリジン：Ｈ２Ｏ（２０：１）中の新たに調製した溶液を添加し、反応混合物を同じ温度にて１．５ｈ撹拌し続け、後にｒｔとし、ｒｔにて１５ｍｉｎ撹拌した。次いで、ＴＥＡＢ（１０ｍＬ）を混合物に加え、ジクロロメタンで希釈し、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液、１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＢ）で順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、濃縮した。残渣を、溶出液としての２％トリメチルアミンとともに自動化フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ）で精製して、所望の生成物１５６を粘性の液体として得た。
Figure 0007296459000309
 反応を化合物３３の合成及びＴＢＳ脱保護工程に従って行った。
Figure 0007296459000310
 反応を化合物３３の結合に従って行った。
Ａ．１７ オクタデカサッカライド１６２、１６３、１６４及び１６５の合成
Figure 0007296459000311
 化合物３２の合成について記載した手順を、化合物１６１の合成に使用した。唯一の変更は第２工程において、リンカーの代わりに化合物８９を求核剤として使用したことである。
Figure 0007296459000312
 化合物１６２を、化合物１６１から、化合物８９について記載した通りに（ＴＢＤＰＳ保護基の除去）、その後化合物９０について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000313
 化合物１６３を、化合物１６１から、化合物８９について記載した通りに（ＴＢＤＰＳ保護基の除去）、その後化合物９１及び９２について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000314
 ホスホネート化合物１６４を化合物１６２について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000315
 ホスホネート化合物１６５を化合物１６３について記載した通りに合成した。
Ａ．１８ オクタデカサッカライド１６２及び１６３の別の合成
Figure 0007296459000316
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物１６６の合成に使用した。
Figure 0007296459000317
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物１６７の合成に使用した。
Figure 0007296459000318
 化合物１６２を化合物１６７から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000319
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物１６８の合成に使用した。
Figure 0007296459000320
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物１６９の合成に使用した。
Figure 0007296459000321
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物１７０の合成に使用した。
Figure 0007296459000322
 化合物１６３を化合物１７０から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ａ．１９ テトラコササッカライド（ｔｅｔｒａｃｏｓａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）１７２及び１７３の合成
Figure 0007296459000323
 化合物１７２はドデカサッカライド８９から合成し、化合物８８について記載した手順に従いドデカサッカライド１７１に結合させ、次いで化合物８９について記載したＴＢＤＰＳ基の脱保護、その後に化合物９０について記載した完全な脱保護を行った。
Figure 0007296459000324
Figure 0007296459000325
 化合物１７３はドデカサッカライド８９から合成し、化合物８８について記載した手順に従いドデカサッカライド１７１に結合させ、次いで化合物８９について記載したＴＢＤＰＳ基の脱保護、化合物９１について記載したリン酸化、さらに化合物９２について記載した完全な脱保護を行った。
Ａ．２０ テトラコササッカライド１７２及び１７３の別の合成
Figure 0007296459000326
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物１７４の合成に使用した。
Figure 0007296459000327
 化合物１７２を化合物１７４から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000328
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物１７５の合成に使用した。
Figure 0007296459000329
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物１７６の合成に使用した。
Figure 0007296459000330
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物１７７の合成に使用した。
Figure 0007296459000331
 化合物１７３を化合物１７７から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ａ．２１ トリアコンタサッカライド（ｔｒｉａｃｏｎｔａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）１７９及び１８３の合成
Figure 0007296459000332
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物１７８の合成に使用した。
Figure 0007296459000333
 化合物１７９を化合物１７８から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000334
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物１８０の合成に使用した。
Figure 0007296459000335
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物１８１の合成に使用した。
Figure 0007296459000336
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物１８２の合成に使用した。
Figure 0007296459000337
 化合物１８３を化合物１８２から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ａ．２２ ヘキサトリアコンタササッカライド（ｈｅｘａｔｒｉａｃｏｎｔａｓａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）１８６及び１８７の合成
Figure 0007296459000338
 化合物１８５は、オクタデカサッカライド１６１から合成し、化合物８９に記載した手順に従って、オクタデカサッカライド１６１よりＴＢＤＰＳ保護基を選択的に除去した。その後、ＴＢＤＰＳ脱保護トリサッカライドを化合物１８４と反応させて、サッカライド１８５を得た。
Figure 0007296459000339
Figure 0007296459000340
 化合物１８６はサッカライド１８５から合成し、サッカライド１８５を、化合物８９（ＴＢＤＰＳ保護基の除去）、次いで化合物９０（ＴＢＤＰＳ保護基の除去）について記載した手順に従って変換した。
Figure 0007296459000341
 化合物１８７はサッカライド１８５から合成し、サッカライド１８５を、化合物８９について記載した手順（ＴＢＤＰＳ保護基の除去）、化合物９１について記載したリン酸化、さらに化合物９２について記載した完全な脱保護に従って変換した。
Ａ．２３ ヘキサトリアコンタササッカライド１８６及び１８７の別の合成
Figure 0007296459000342
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物１８８の合成に使用した。
Figure 0007296459000343
 化合物１８６を化合物１８８から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000344
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物１８９の合成に使用した。
Figure 0007296459000345
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物１９０の合成に使用した。
Figure 0007296459000346
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物１９１の合成に使用した。
Figure 0007296459000347
 化合物１８７を化合物１９１から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ａ．２４ オリゴサッカライド１９３及び１９７の合成
Figure 0007296459000348
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物１９２の合成に使用した。
Figure 0007296459000349
 化合物１９３を化合物１９２から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000350
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物１９４の合成に使用した。
Figure 0007296459000351
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物１９５の合成に使用した。
Figure 0007296459000352
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物１９６の合成に使用した。
Figure 0007296459000353
 化合物１９７を化合物１９６から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ａ．２５ オリゴサッカライド１９９及び２０３の合成
Figure 0007296459000354
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物１９８の合成に使用した。
Figure 0007296459000355
 化合物１９９を化合物１９８から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000356
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物２００の合成に使用した。
Figure 0007296459000357
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物２０１の合成に使用した。
Figure 0007296459000358
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物２０２の合成に使用した。
Figure 0007296459000359
 化合物２０３を化合物２０２から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ａ．２６ オリゴサッカライド２０５及び２０９の合成
Figure 0007296459000360
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物２０４の合成に使用した。
Figure 0007296459000361
 化合物２０５を化合物２０４から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000362
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物２０６の合成に使用した。
Figure 0007296459000363
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物２０７の合成に使用した。
Figure 0007296459000364
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物２０８の合成に使用した。
Figure 0007296459000365
 化合物２０９を化合物２０８から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ａ．２７ オリゴサッカライド２１１及び２１５の合成
Figure 0007296459000366
 化合物９６の合成について記載した手順を、化合物２１０の合成に使用した。
Figure 0007296459000367
 化合物２１１を化合物２１０から化合物３３について記載した通りに合成した。
Figure 0007296459000368
 化合物６０の合成について記載した手順を、化合物２１２の合成に使用した。
Figure 0007296459000369
 化合物８６の合成について記載した手順を、化合物２１３の合成に使用した。
Figure 0007296459000370
 化合物８７の合成について記載した手順を、化合物２１４の合成に使用した。
Figure 0007296459000371
 化合物２１５を化合物２１４から化合物５４について記載した通りに合成した。
Ｂ． 安定性試験
化合物３３中のリン酸結合のＮａＯＨによる開裂
次に、本発明の化合物の安定性を試験し、評価した。課題は化合物３３、５４、９０、９２、１１２、１１７、１６２、１６３、１６４、１６５、１７２及び１７３が製剤条件下でどの程度安定かを調べることであった。アルハイドロゲル、ＰＢＳバッファー及び水中における安定性に先立って、化合物３３を室温にて０．１Ｍ水酸化ナトリウムで処理した。化合物３３は、高度な塩基性条件下でのみ非常にゆっくりと開裂することが見出された。しかしながら、これらの厳しい条件下で４日後においてさえ（２００μＬ中に１０μｇの３３）、化合物３３の５０％のみが開裂し、なお５０％の化合物３３が損なわれていないことがＨＰＬＣクロマトグラムで観察された（図６及び７）。
ＰＢＳ中のアルハイドロゲル、ＰＢＳ及び水に対する化合物３３の安定性：
次に、製剤条件下における化合物３３の安定性を調べた。各製剤バイアルは、ｉ） ＰＢＳ中のアルハイドロゲル、又はｉｉ） ＰＢＳのみ、又はｉｉｉ） 水中に３０μｇの３３を有する（溶液全体の体積は５００μＬである。）。本明細書において、ＮａＰｉはＰＢＳの同義語として使用される。０．６ｍｇのアルミニウムを含む６０μＬのアルハイドロゲルを各実験に対して使用した。これらの３種の製剤溶液を３７℃、２５℃及び２－８℃で１４日間維持した。２４ｈごとに、３７℃、２５℃及び２－８℃における各バイアルｉ） ＰＢＳ中のアルハイドロゲル ｉｉ） ＰＢＳのみ、及びｉｉｉ） 水、から５０μＬの溶液を採取し、ＨＰＬＣで分析した（図８、９、１０）。これらの試験より、化合物３３は２℃から３７℃までの全温度範囲にわたって安定であることが明らかである。図８は、２－８℃における４日後の、図９は２－８℃における１４日後の、図１０は２５℃における４日後の、図１１は２５℃における１４日後の、図１２は３７℃における４日後の、図１３は３７℃における１４日後の安定性を示す。
上記したように、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの天然ポリサッカライド ＰＳＩＩと比較して、化合物３３、５４、９０、９２、１１２、１１７、１６２、１６３、１６４、１６５、１７２及び１７３は製剤条件下で十分に安定であることが見出された。
以下に示すようなヘキサグリコシルホスフェート繰り返し単位からなるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの天然ポリサッカライドＰＳＩＩは、
Figure 0007296459000372
 ＮａＯＨ処理下で安定ではなく、酢酸等の酸条件下で安定ではなく、さらに２－８℃、２５℃及び３７℃において溶液中で安定でないことも見出された。これらの条件下で、天然ＰＳＩＩは速やかに分解し、分解産物はもはや免疫学的効果を誘導しないことが見出された。
従って、上記の安定性試験により、本発明の化合物は、天然ＰＳＩＩがワクチンとしてもはや有用ではないフラグメントに分解する条件下で安定であることが明確に示され、本明細書に開示した化合物は溶液中で安定であり、凍結乾燥及び再溶解、低温貯蔵する必要がなく、従って高価なコールドチェーンシステムを適用した生産及び輸送を要しない。
Ｃ． 生物学的実験
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
試料を微量遠心管内で混合し、サーモサイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）上で９５℃にて５ｍｉｎ加熱した。室温に５ｍｉｎ冷却した後、約２，５μｇの試料を１０％ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに１０μＬのマーカーとともにロードした。試料を１２０Ｖの一定電圧で１ｈ流した。製造者取扱説明書に基づいて、ＧｅｌＣｏｄｅ（登録商標） Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎを用いて染色を行った。ゲルを脱イオン水で一晩洗浄し、ゲル撮影装置（ｇｅｌ ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてスキャンした。
糖結合体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
免疫化試験に使用した糖結合体をＳＥＣで分析し、結合及び非結合ＣＲＭタンパク質の間の質量の相違を観察した。試料を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７，２で希釈し、Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ Ｇ２０００カラム（ＳＷｘｌ、７．８ｍｍｘ３０ｃｍ、５μｍ）及びＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇｕａｒｄカラム（ＳＷｘｌ ６．０ｍｍｘ４ｃｍ、７μｍ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上に流した。流速は１ｍＬ／ｍｉｎに維持した。
糖結合体の製造
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ合成抗原を、免疫化実験のために担体タンパク質ＣＲＭ１９７に、及び、ＥＬＩＳＡ用のコート抗原としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させた（Ａ． 化学合成を参照されたい。）。使用に先立って、得られた結合体を０．２μＭのメンブレンフィルターを用いて滅菌ろ過した。結合体をＭＡＬＤＩ分析により分析した。担体タンパク質上へのサッカライドのロードを、ＭＡＬＤＩ分析を用いて、結合及び非結合タンパク質の間の質量を差し引くことにより具体的に算出した。タンパク質量をｍｉｃｒｏ ＢＣＡ法を用いて製造者プロトコルに従って推定した。
糖結合体３６（３３－ＣＲＭ１９７）、５６（５４－ＣＲＭ１９７）及び９４（９２－ＣＲＭ１９７）の定性分析
免疫化試験に使用するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原糖結合体３６、５６及び９４を、結合効率及び抗原含量について分析した。糖結合体のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析により結合効率が良好であることが明らかになった。結合及び非結合ＣＲＭ１９７タンパク質間の質量差から、ＣＲＭ１９７分子当たり約７．５（５６）及び約５（９４）抗原のロードであった。
糖結合体を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣによっても分析し、これにより非結合体化ＣＲＭ１９７タンパク質と比較した明確な質量のシフトが明らかになった（図２４及び２５）。
免疫化試験
試験Ｉ－ウサギに免疫化したＣ．ｄｉｆｆ抗原ＰＳ－ＩＩの半合成糖結合体の免疫学的評価
１． 本試験の目的：
Ｃ．ｄｉｆｆ抗原ＰＳ－ＩＩ半合成ＣＲＭ１９７結合体ワクチン３６で免疫化したウサギにおけるＩｇＧ抗体応答の評価
２． 材料：
－ ＥＬＩＳＡプレート（高結合能（ｈｉｇｈ－ｂｉｎｄｉｎｇ）、ＥＩＡ／ＲＩＡ Ｐｌａｔｅ、９６ウェル、低蒸発蓋（ｌｏｗ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｌｉｄ）付平底、会社：ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３３６１）
－ 検出抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ４９１４）
－ ブロッキング溶液：ＰＢＳ中の１％ＦＣＳ（ｖ／ｖ）
－ 抗体希釈液：ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）。
－ 洗浄バッファー：ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔ）
－ 発色液（Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：１ｓｔｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃：３４０２８）
－ 反応停止液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）：２Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）
－ プレートリーダー：Ａｎｔｈｏｓ ｈｔ２。
－ ソフトウェア：吸収測定にはＷｉｎＲｅａｄ２．３６、データのプロット及び分析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７。
－ 不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｃａｔ：ｖａｃ－ｉｆａ－１０、Ｂａｔｃｈ＃：ＩＦＡ－３９－０３；Ｅｘｐ Ｄｔ：Ｓｅｐｔ２０１９
－ ＱｕａｎｔｉＰｒｏ（登録商標） ＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ） Ｐｒｏｄｕｃｔ：ＱＰＢＣＡ－１ＫＴ；Ｌｏｔ＃：ＳＬＢＲ７４５１Ｖ；Ｐｃｏｄｅ：１００２２９６４６４
３． 方法：
免疫化用ワクチンの調合
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ糖結合体３６を、ウサギにおける免疫化のために不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に調合した。Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎの不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を、ウサギ免疫化試験用のワクチンの調合に使用した。製造はプロトコルに従った。抗原：ＩＦＡ濃度は１：１に維持した。動物当たりの抗原用量は２．５μｇ／２００μＬ／動物に維持した（１００μＬの抗原＋１００μＬ ＩＦＡ）。ＩＦＡを所望の算出体積で（最終免疫化体積の５０％）１５ｍＬ滅菌ｆａｌｃｏｎ中に取った。希釈抗原溶液の算出量（体積はＰＢＳで最終免疫化体積の５０％に調整した）を２０Ｇニードルを装着した３ｍＬ滅菌シリンジ中に取った。ＤＳ溶液をＩＦＡを含むｆａｌｃｏｎに加え、すぐに１５ｓｅｃ（５Ｘ）ボルテックスした。ボルテックス中に調合液の色が薄黄色から乳白色に変化し、安定な乳濁液が形成されたことがわかる。得られたワクチン調合物を短時間ボルテックスし、２ｍＬ滅菌チューブ内に所望の用量体積で小分けした。免疫化に先立って、ワクチン調合物を含むチューブをボルテックスし、次いで動物に注射した。
免疫化スケジュール
ウサギの免疫化は特定病原菌除去条件下で行い、餌と水は自由摂取させた。ウサギ（ｎ＝４）を２００μＬ／ウサギの注入体積でワクチン調合物で皮下注射により免疫化した。ウサギ用の抗原用量は２．５μｇ／動物のＰＳ－ＩＩ抗原又は対応する体積のネガティブコントロール用ＰＢＳに維持した。ウサギをデイ（ｄａｙ）０、１４及び３５に免疫化した。デイ０、７及び４２に血液を採取し、抗体力価の決定に用いた。
４． インハウス抗原コートプレートを用いた血清の酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）
抗原によるプレートのコート
抗原－ＢＳＡ結合体をコート抗原として使用した。抗原－ＢＳＡ結合体を、５μｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中に溶解した。ウェル当たり１００μＬをコートし、４℃で一晩インキュベートして、０．５μｇ／ウェルの抗原濃度を得た。
洗浄
抗原を一晩吸着させた後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
ブロッキング
プレートを、２００μＬの市販のブロッキング溶液を用いてブロックし、ＲＴにて２ｈインキュベートした。
洗浄
ブロッキングの後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
血清の希釈及びインキュベーション
異なる実験群の異なる時点からのプール血清（ｎ＝４ウサギ）を抗体希釈液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中に希釈し、それらの各希釈液とした。異なる実験群の希釈血清試料１００μＬを重複して対応するウェルに加え、振とう器を２５０ｒｐｍに設定してＲＴで２ｈインキュベートした。１００μＬ／ウェルの抗体希釈液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を実験ブランクとした。血清とともにインキュベーションした後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で４回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
インキュベーション（検出抗体）
対応する検出抗体、抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲートを抗体希釈液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で１：１０，０００希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、振とう器を２５０ｒｐｍに設定してＲＴで１ｈインキュベートした。検出抗体とともにインキュベーションした後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
基質の添加
各ウェルに、１００μＬの（４℃から室温化した）既製のＴＭＢ基質を加え、暗所で１５ｍｉｎインキュベートした。酵素反応を５０μＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を加えることにより停止し、青色の反応液が黄色の溶液となった。黄色の溶液の吸収をプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。
結果
吸収値をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてグラフにプロットすることにより分析した。
ＥＬＩＳＡデータは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩ結合体３６で免疫化したウサギの血清が対応する抗原を認識することを明確に示している（図１５を参照されたい。）。
試験ＩＩ－ウサギ及びマウスに免疫化したＣ．ｄｉｆｆ抗原ＰＳ－ＩＩの半合成糖結合体の免疫学的評価
１． 本試験の目的：
Ｃ．ｄｉｆｆ抗原ＰＳ－ＩＩ半合成ＣＲＭ１９７結合体ワクチン５６及び９４で免疫化したウサギおよびマウスにおけるＩｇＧ抗体応答の評価
２． 材料：
－ ＥＬＩＳＡプレート（高結合能、ＥＩＡ／ＲＩＡ Ｐｌａｔｅ、９６ウェル、低蒸発蓋付平底、会社：ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３３６１）
－ 検出抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ４９１４）及び抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ、Ｎｏｒｄｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｌｏｔ＃：６２７６
－ ブロッキング溶液：Ｒｏｃｈｅ、Ｒｅｆ：１１１１２５８９００１；Ｌｏｔ：２１４９５２００、Ｅｘｐ．Ｄｔ：Ｊｕｌｙ ２０１９。
－ 抗体希釈液：ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）
－ 洗浄バッファー：ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳ－Ｔ）
－ 発色液：１ｓｔｅｐ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｔ＃：３４０２８）
－ 反応停止液：２Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）
－ プレートリーダー：Ａｎｔｈｏｓ ｈｔ２
－ ソフトウェア：吸収測定にはＷｉｎＲｅａｄ２．３６、データのプロット及び分析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７
－ アラム：水酸化アルミニウムゲルアジュバント（アルハイドロゲル２％）、Ｂｒｅｎｎｔａｇ、Ｂａｔｃｈ＃：５４４７ Ｅｘｐ Ｄｔ：Ｆｅｂ ２０２０
－ ＱｕａｎｔｉＰｒｏ（登録商標） ＢＣＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＳＩＧＭＡ） Ｐｒｏｄｕｃｔ：ＱＰＢＣＡ－１ＫＴ；Ｌｏｔ＃：ＳＬＢＲ７４５１Ｖ；Ｐｃｏｄｅ：１００２２９６４６４
－ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（登録商標）Ｇｅｌｓ－１０％、１０ウェル（３０μＬ／ウェル）Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｒ：６４１７５７０８
－ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ、Ｃａｔ：１６１０３７４；Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｎｒ：６４１７９８８９９
－ Ｇｅｌ Ｃｏｄｅ（登録商標）Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｅｆ：１８６０９５７；Ｌｏｔ＃：ＴＡ２６０２６６
－ 菌株６３０（ｔｇｃ ＢＩＯＭＩＣＳ Ｌｏｔ＃：６３０－４３４１１）及びＲ２０２９１（ｔｇｃ ＢＩＯＭＩＣＳ Ｌｏｔ＃：Ｒ２０２９１－４３５５９）に対するＣ．ｄｉｆｆコートＥＬＩＳＡプレート Ｅｘｐ．Ｄｔ：０５／２０２０。
－ Ｃ．ｄｉｆｆ陽性患者の血漿。
３． 方法
水酸化アルミニウム（アラム）アジュバント中の免疫化用ワクチンの調合
すべての調合物は無菌条件下で製造した。糖結合体５６及び９４（薬剤物質；ＤＳ）及びＰＢＳは、予め算出した適切な比率で５０ｍＬＦａｌｃｏｎ（登録商標）チューブ内において混合し、これは必要とされるアラム（０．２５ｍｇ／ｍＬ）の体積を除いた最終的な調合物の体積に相当する。これによりＤＳ－ＰＢＳ混合物が形成された。動物当たりの抗原／ＤＳ用量は、２．５μｇ／５００μＬ／動物若しくは１０μｇ／５００μＬ／動物（ウサギを用いた試験）又は０．５μｇ／１００μＬ／動物若しくは２μｇ／１００μＬ／動物（マウスを用いた試験）に維持した。ＤＳ－ＰＢＳ混合物をセロロジカルピペット（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｉｐｅｔｔｅ）を用いて穏やかに混合した（５Ｘ）。このＤＳ－ＰＢＳ混合物に、対応する体積のストックアラム（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えて、１：４０又は０．２５０ｍｇ／ｍＬの最終アラム比とした。この混合物を、５ｍＬセロロジカルピペットを用いて穏やかにピペッティングすることにより（２０Ｘ）、速やかに混ぜた。Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）チューブに蓋をし、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で包み、振とう器を２５０ｒｐｍに設定して室温（ＲＴ）で２ｈ混ぜた。２ｈのインキュベーション時間の後、調合物をクリーンベンチ内で小分けし、さらなる使用まで４℃で貯蔵した。アラム中で調合した糖結合体を定性分析し、調合物の最終アラム濃度及びｐＨを決定した。
免疫化スケジュール
マウス及びウサギの免疫化は特定病原菌除去条件下で行い、動物には餌と水を自由摂取させた。マウス（ｎ＝試験アーム当たり７又は８）及びウサギ（試験アーム当たりｎ＝４）を１００μＬ／マウス及び５００μＬ／ウサギの注入体積で異なる抗原用量を用いてワクチン調合物により皮下注射により免疫化した。マウスをデイ０、１４及び２８に免疫化し、血液をデイ２１及び３５に採取した。ウサギはデイ０、１４、２８及び７７に免疫化し、デイ０、７、２１，３５、７７及び８４に血液を採取した。血液試料から血清を調製し、血清抗体分析に用いた。
４． インハウス抗原コートプレートを用いた血清の酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）
抗原によるプレートのコート：
結合体５４－ＢＳＡ及び９２－ＢＳＡをコート抗原として使用した。各結合体を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ウェル当たり１００μＬをコートし、４℃で一晩インキュベートして、０．５μｇ／ウェルの抗原濃度を得た。単離したＰＳ－ＩＩポリサッカライドのコートについては、ポリサッカライドを１０ｍＭのイミダゾールを含むＰＢＳで５０μｇ／ｍＬに希釈し、ウェル当たり１００μＬを５０℃で５時間コートした。
洗浄
抗原を吸着させた後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で１回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
ブロッキング
プレートを、２００μＬの市販のブロッキング溶液を用いてブロックし、ＲＴにて２ｈインキュベートした。
洗浄
ブロッキングの後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
血清の希釈及びインキュベーション：
異なる実験群の異なる時点からのプール血清（ｎ＝４ウサギ又は７－８マウス／群）を抗体希釈液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）中に希釈し、それらの各希釈液とした。異なる実験群の希釈血清試料１００μＬを重複して対応するウェルに加え、振とう器を２５０ｒｐｍに設定してＲＴで２ｈインキュベートした。競合ＥＬＩＳＡ実験のために、ＥＬＩＳＡプレートに加える前に、希釈血清を、１０又は５０μｇの単離したＰＳ－ＩＩポリサッカライド又はＰＢＳとともにアイス上で３０ｍｉｎインキュベートした。１００μＬ／ウェルの抗体希釈液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を実験ブランクとした。血清とともにインキュベーションした後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で４回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
検出抗体とのインキュベーション：
対応する検出抗体、抗ウサギ又は抗マウスＩｇＧ ＨＲＰコンジュゲートを抗体希釈液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）で１：１０，０００希釈し、１００μＬ／ウェルで加え、振とう器上で２５０ｒｐｍにてＲＴで３０ｍｉｎインキュベートした。検出抗体とともにインキュベーションした後、プレートをＰＢＳ－Ｔ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、各ウェルの余分の液体を、プレートを逆さまにし、清潔な乾燥ティッシュタオル上で軽く叩くことにより除いた。
基質の添加：
各ウェルに、１００μＬの（４℃から室温化した）既製のＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質を加え、暗所で１５ｍｉｎインキュベートした。酵素反応を５０μＬ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液を加えることにより停止し、青色の反応液が黄色の溶液となった。黄色の溶液の吸収をプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで測定した。
結果：
吸収値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてグラフにプロットすることにより分析した。
５． 市販のプレコートプレートを用いた血清の酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）
この手順は、コーティング工程を割愛したことを除いては、上記のＥＬＩＳＡプロトコルと同一であった。
結果：
免疫化したウサギからの血清ＩｇＧは、免疫原（図２０）、単離したＰＳ－ＩＩポリサッカライド（図１９Ｂ及び１９Ｃ）並びにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０（図１６及び１７）、Ｒ２０２９１（図１８）及びＶＰＩ１０４６３（図１９Ａ）を認識する。免疫化したマウスからの血清ＩｇＧは、各免疫原（図２３）並びにＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ株６３０（図２１）及びＲ２０２９１（図２２）を認識する。
本明細書に記載したデータは、本発明の結合体、特に結合体５６及び９４で免疫化した後、本発明のオリゴサッカライドに対する、並びに、単離された及び細菌の表面上の天然Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＰＳ－ＩＩポリサッカライドに対する機能性抗体がウサギ及びマウスにおいて誘導されたことを示す。これらの知見は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅによる感染に対する保護を付与するこれらの抗体の能力を示すものである。
ＥＬＩＳＡデータはさらに、本発明の結合体は免疫原性を有し、高い抗体力価を誘導することを証明している。従って、ＥＬＩＳＡ分析は、本発明のサッカライドがウサギ及びマウスにおいて免疫原性を有し、交差反応性抗体を生成させることを示している。

Claims (21)

  1. 一般式（Ｉ）のサッカライド
    Figure 0007296459000373
     （式中、
    ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数であり；
    Ｔ＊－は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ） ２ 、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ － ）（ＯＨ）又は－ＰＯ ３ ２－ を表し；
    Ｚは、
    Figure 0007296459000374
     を表し；
    Ｅは、－ＮＨ２、－Ｎ３、－ＣＮ、－Ｏ－ＮＨ２、－ＣＨ＝ＣＨ２、－Ｃ≡ＣＨ、－Ｂｒ、－Ｃｌ、－Ｉ、－ＣＯ２Ｒ’、－ＣＯＮＨ－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＯＨ又は－ＳＡｃを表し；
    Ｒ’は、－Ｈ、－Ｍｅ、－Ｅｔ、４－ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル又はＮ－スクシンイミジルを表し；
    －Ｌ－が、－Ｌ ａ －、－Ｌ ａ －Ｌ ｅ －、－Ｌ ａ －Ｌ ｂ －Ｌ ｅ －又は－Ｌ ａ －Ｌ ｄ －Ｌ ｅ －を表し；
    －Ｌ ａ －が、－（ＣＨ ２ ） ｏ －、－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｏ －Ｃ ２ Ｈ ４ －又は－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｏ －ＣＨ ２ －を表し；
    －Ｌ ｂ －が－Ｏ－を表し；
    －Ｌ ｄ －が、－（ＣＨ ２ ） ｑ －、－（ＣＨ（ＯＨ）） ｑ －、－（ＣＦ ２ ） ｑ －、－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｑ －Ｃ ２ Ｈ ４ －又は－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｑ －ＣＨ ２ －を表し；
    －Ｌ ｅ －が、－（ＣＨ ２ ） ｐ１ －、－（ＣＦ ２ ） ｐ１ －、－Ｃ ２ Ｈ ４ －（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ） ｐ１ －、－ＣＨ ２ －（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ） ｐ１ －又は－（ＣＨ ２ ） ｐ１ －Ｏ－（ＣＨ ２ ） ｐ２ －を表し；
    ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である。）；
    又は、その薬学的に許容される塩。
  2. －Ｌ－が、－（ＣＨ ２ ） ｏ －を表し、ｏが、１、２、３、４、５及び６から選択される整数である、請求項１に記載のサッカライド又はその薬学的に許容される塩。
  3. Ｅが、アミノ基である、請求項１又は２に記載のサッカライド又はその薬学的に許容される塩。
  4. 下記からなる群より選択される、請求項１に記載のサッカライド又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000375
    Figure 0007296459000376
    Figure 0007296459000377
    Figure 0007296459000378
    Figure 0007296459000379
    Figure 0007296459000380
    Figure 0007296459000381
    Figure 0007296459000382
    Figure 0007296459000383
    Figure 0007296459000384
     又は
    Figure 0007296459000385
     （式中、Ｚは、
    Figure 0007296459000386
     を表す。）
  5. 式（Ｉ’ａ－４）又は式（Ｉ’ｂ－４）の請求項４に記載のサッカライド又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000387
  6. 前記薬学的に許容される塩が、ナトリウム塩である、請求項１～５のいずれか１項に記載のサッカライド又はその薬学的に許容される塩。
  7. －Ｏ－Ｌ－Ｅ基の残基Ｅを介して免疫原性担体に共有結合的に連結する、請求項１～６のいずれか１項に記載のサッカライドを含む結合体又はその薬学的に許容される塩。
  8. 一般式（ＩＶ）の結合体又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000388
     （式中、ｃは２から１８までの間に含まれ；
    －Ｅ１－は、共有結合、－ＮＨ－、－Ｏ－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＣＯ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＮＨ－、－ＣＯ－ＮＨＮＨ－、
    Figure 0007296459000389
     ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数を表し；
    ｂは、１、２、３及び４から選択される整数を表し；
    ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０から選択される整数であり；
    Ｔ ＊ －は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ） ２ 、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ － ）（ＯＨ）又は－ＰＯ ３ ２－ を表し；
    Ｚは、
    Figure 0007296459000390
     を表し；
    －Ｌ－が、－Ｌ ａ －、－Ｌ ａ －Ｌ ｅ －、－Ｌ ａ －Ｌ ｂ －Ｌ ｅ －又は－Ｌ ａ －Ｌ ｄ －Ｌ ｅ －を表し；
    －Ｌ ａ －が、－（ＣＨ ２ ） ｏ －、－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｏ －Ｃ ２ Ｈ ４ －又は－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｏ －ＣＨ ２ －を表し；
    －Ｌ ｂ －が－Ｏ－を表し；
    －Ｌ ｄ －が、－（ＣＨ ２ ） ｑ －、－（ＣＨ（ＯＨ）） ｑ －、－（ＣＦ ２ ） ｑ －、－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｑ －Ｃ ２ Ｈ ４ －又は－（ＣＨ ２ －ＣＨ ２ －Ｏ） ｑ －ＣＨ ２ －を表し；
    －Ｌ ｅ －が、－（ＣＨ ２ ） ｐ１ －、－（ＣＦ ２ ） ｐ１ －、－Ｃ ２ Ｈ ４ －（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ） ｐ１ －、－ＣＨ ２ －（Ｏ－ＣＨ ２ －ＣＨ ２ ） ｐ１ －又は－（ＣＨ ２ ） ｐ１ －Ｏ－（ＣＨ ２ ） ｐ２ －を表し；
    ｏ、ｑ、ｐ１及びｐ２が、互いに独立に、１、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
    ＣＰはジフテリアトキソイド、変異ジフテリアトキソイド、変性ジフテリアトキソイド、変異及び変性ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、変性破傷風トキソイド、変異破傷風トキソイド、無莢膜型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの非脂質修飾細胞表面リポタンパク質（タンパク質Ｄ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク（ＯＭＰ）複合体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びコレラトキソイド（ＣＴ）からなる群より選択される
    担体タンパク質である。）。
  9. ＣＰが、ＣＲＭ １９７ である、請求項８に記載の結合体又はその薬学的に許容される塩。
  10. 下記の式（Ｖ）を有する、請求項８に記載の結合体又はその薬学的に許容される塩。
    Figure 0007296459000391
     （式中、Ｔ ＊ －は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ） ２ 、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ － ）（ＯＨ）又は－ＰＯ ３ ２－ を表し；
    ｎが、１、２及び３から選択される整数を表し；
    －Ｌ－が－（ＣＨ ２ ） ｏ －を表し、
    ｏが、２、３、４、５及び６から選択される整数であり；
    －Ｗ－が、
    Figure 0007296459000392
     を表し；
    ａが、２、３、４、５及び６から選択される整数である。）
  11. Ｅ １ が、共有結合、－ＮＨ－、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＯＮＨ－、
    Figure 0007296459000393
     を表す、請求項１０に記載の結合体又はその薬学的に許容される塩。
  12. 下記の式（Ｖ－２）を有する、請求項８～１１のいずれか１項に記載の結合体又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000394
     （式中、
    Ｌは－（ＣＨ２）５－であり；
    Ｅ１は－ＮＨ－であり；
    ｎは１又は２から選択される整数である。）。
  13. 下記の式（Ｖ－２）を有する、結合体又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000395
     （式中、
    ｃは２から１８までの間に含まれ；
    Ｌは－（ＣＨ ２ ） ５ －であり；
    Ｅ １ は－ＮＨ－であり；
    ｎは１であり；
    －Ｗ－が、
    Figure 0007296459000396
     を表し；
    ａが、４である。）。
  14. 下記の式（Ｖ－２）を有する、結合体又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000397
     （式中、
    ｃは２から１８までの間に含まれ；
    Ｌは－（ＣＨ ２ ） ５ －であり；
    Ｅ １ は－ＮＨ－であり；
    ｎは２であり；
    －Ｗ－が、
    Figure 0007296459000398
     を表し；
    ａが、４である。）。
  15. ｃが５から１５までの間に含まれる、請求項８～１４のいずれか１項に記載の結合体又はその薬学的に許容される塩。
  16. ｃが４から１０より選択される、請求項８～１４のいずれか１項に記載の結合体又はその薬学的に許容される塩。
  17. 下記の式を有する、結合体又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000399
     （式中、Ｒは、ＣＲＭ１９７である。）。
  18. 下痢、偽膜性大腸炎及び麻痺性イレウスからなる群より選択される、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が関与する疾患の予防用及び／又は治療用の、請求項７～１７のいずれか１項に記載の結合体又はその薬学的に許容される塩。
  19. 細胞壁サッカライド中に下記のサッカライドフラグメントの１つを有する細菌であるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌が関与する疾患の予防及び／又は治療において使用するための、請求項１～６のいずれか１項に記載のサッカライド若しくはその薬学的に許容される塩又は請求項７～１７のいずれか１項に記載の結合体若しくはその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000400
  20. 請求項７～１７のいずれか１項に記載の結合体若しくはその薬学的に許容される塩及び／又は請求項１～６のいずれか１項に記載のサッカライド若しくはその薬学的に許容される塩を、少なくとも１種の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は賦形剤とともに含む、医薬組成物。
  21. 細胞壁ポリサッカライド中に下記のサッカライドフラグメントの１つを有する細菌に対する抗体の検出のための免疫学的アッセイにおけるマーカーとしての使用のための請求項１～６のいずれか１項に記載のサッカライド又はその薬学的に許容される塩：
    Figure 0007296459000401
JP2021528951A 2018-11-22 2019-11-22 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する安定なワクチン Active JP7296459B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18207920.2 2018-11-22
EP18207920 2018-11-22
PCT/EP2019/082331 WO2020104697A1 (en) 2018-11-22 2019-11-22 Stable vaccine against clostridium difficile

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022516837A JP2022516837A (ja) 2022-03-03
JP7296459B2 true JP7296459B2 (ja) 2023-06-22

Family

ID=64650105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021528951A Active JP7296459B2 (ja) 2018-11-22 2019-11-22 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する安定なワクチン

Country Status (11)

Country Link
US (1) US12187756B2 (ja)
EP (1) EP3883944A1 (ja)
JP (1) JP7296459B2 (ja)
KR (1) KR20210094573A (ja)
CN (1) CN113166186B (ja)
AU (1) AU2019383549A1 (ja)
BR (1) BR112021008279A2 (ja)
CA (1) CA3120451A1 (ja)
EA (1) EA202191393A1 (ja)
MX (1) MX2021005949A (ja)
WO (1) WO2020104697A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022212827A2 (en) * 2021-04-02 2022-10-06 Matrivax, Inc. Methods and compositions for treating clostridiodes difficile infections

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19648681A1 (de) 1996-11-25 1998-05-28 Hoechst Ag Antiadhäsive Benzoesäure-Derivate
JP2010539256A (ja) 2007-09-11 2010-12-16 ユニバーシティ オブ グェルフ クロストリジウム・ディフィシル由来の多糖免疫原
WO2012119769A1 (en) 2011-03-08 2012-09-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. Oligosaccharides and oligosaccharide-protein conjugates derived from clostridium difficile polysaccharide ps-ii, methods of synthesis and uses thereof, in particular as a vaccine
US20130315959A1 (en) 2010-12-24 2013-11-28 Novartis Ag Compounds
WO2014130613A2 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Amgen Inc. Carbohydrate phosphonate derivatives as modulators of glycosylation
WO2017021549A1 (en) 2015-08-05 2017-02-09 Enterome Mannose derivatives useful for treating pathologies associated with adherent e. coli

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996027379A1 (en) * 1995-03-08 1996-09-12 The Scripps Research Institute Carbopeptoids and carbonucleotoids
AU2006245440B2 (en) 2005-05-06 2012-04-19 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Immunogens for meningitidis-A vaccines
US9815889B2 (en) 2011-08-02 2017-11-14 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Antibodies for prevention and treatment of diseases caused by clostridium difficile
CN105849086B (zh) 2012-11-24 2018-07-31 杭州多禧生物科技有限公司 亲水性链接体及其在药物分子和细胞结合分子共轭反应上的应用
EP3492482A1 (en) 2017-11-30 2019-06-05 Vaxxilon AG Vaccine against klebsiella pneumoniae
EP3492481A1 (en) 2017-11-30 2019-06-05 Vaxxilon AG Vaccine against klebsiella pneumoniae

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19648681A1 (de) 1996-11-25 1998-05-28 Hoechst Ag Antiadhäsive Benzoesäure-Derivate
JP2010539256A (ja) 2007-09-11 2010-12-16 ユニバーシティ オブ グェルフ クロストリジウム・ディフィシル由来の多糖免疫原
US20130315959A1 (en) 2010-12-24 2013-11-28 Novartis Ag Compounds
WO2012119769A1 (en) 2011-03-08 2012-09-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. Oligosaccharides and oligosaccharide-protein conjugates derived from clostridium difficile polysaccharide ps-ii, methods of synthesis and uses thereof, in particular as a vaccine
US20130344104A1 (en) 2011-03-08 2013-12-26 Peter H. Seeberger Oligosaccharides and oligosaccharide-protein conjugates derived from clostridium difficile polysaccharide ps-ii, methods of synthesis and uses thereof, in particular as a vaccine
WO2014130613A2 (en) 2013-02-22 2014-08-28 Amgen Inc. Carbohydrate phosphonate derivatives as modulators of glycosylation
WO2017021549A1 (en) 2015-08-05 2017-02-09 Enterome Mannose derivatives useful for treating pathologies associated with adherent e. coli

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemistry ＆ Biology，2011年，Vol.18，p.580-588
Journal of Organic Chemistry，1988年，Vol.53，p.3387-3389
Tetrahedron Letters，2001年，Vol.42，p.5305-5308

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022516837A (ja) 2022-03-03
US12187756B2 (en) 2025-01-07
MX2021005949A (es) 2021-07-06
CN113166186B (zh) 2024-11-26
CA3120451A1 (en) 2020-05-28
EA202191393A1 (ru) 2021-10-12
EP3883944A1 (en) 2021-09-29
KR20210094573A (ko) 2021-07-29
WO2020104697A1 (en) 2020-05-28
BR112021008279A2 (pt) 2021-08-03
CN113166186A (zh) 2021-07-23
US20230045939A1 (en) 2023-02-16
AU2019383549A1 (en) 2021-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102713536B1 (ko) 클렙시엘라 뉴모니아에 대한 백신
JP7512195B2 (ja) クレブシエラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するワクチン
EP3019513A1 (en) Synthetic vaccines against streptococcus pneumoniae type 1
EP3331556B1 (en) Synthetic vaccines against streptococcus pneumoniae serotype 2
JP6622804B2 (ja) ストレプトコッカス ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４に対するワクチン
EP3274358A1 (en) Vaccine against carbapenem-resistantklebsiella pneumoniae
JP7296459B2 (ja) Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する安定なワクチン
EA046159B1 (ru) Стабильная вакцина против clostridium difficile
EP3181148A1 (en) Synthetic vaccines against streptococcus pneumoniae serotype 2

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20211021

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230228

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20230523

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20230612

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7296459

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150